WO2012132913A1 - クロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤 - Google Patents

クロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤 Download PDF

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秀二 池上
伊藤　裕之
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Definitions

  • the present invention relates to a Clostridium difficile growth inhibitor, a prebiotic composition having a Clostridial difficile growth inhibitory action, a food and drink composition comprising the same, and a Clostridial difficile growth inhibition method.
  • Clostridium difficile is a major causative agent of diarrhea or enteritis caused by antibacterial drugs, and is well known as a causative agent of pseudomembranous colitis. Symptoms of Clostridium difficile infection range from mild diarrhea symptoms to severe pathological conditions such as intestinal obstruction. In addition, this infection often recurs and is difficult to treat. It is also important as a causative bacterium for nosocomial infections, and in-hospital outbreaks have been frequently reported in hospitalized cases and nursing home residents. Since treatment with drugs is difficult in the clinical field in such cases, there is a strong demand for symptom relief, infection control and prevention with foods and beverages and prebiotics that can be used particularly easily.
  • Patent Document 1 discloses a method of suppressing mammalian infection caused by Clostridium difficile by administering a therapeutically effective amount of an undigestible oligosaccharide comprising fructooligosaccharide.
  • Patent Document 2 discloses that a hop extract or the like is added or administered to a food or drink or a beverage to suppress the growth of Clostridium difficile, and further to treat or prevent a disease induced thereby. ing.
  • Patent Document 3 discloses a bacteriocin called thuricin CD having a Clostridial difficile growth inhibitory effect as a novel antibacterial compound against these diseases with the increase of nosocomial infectious diseases caused by Clostridium difficile and the like. .
  • the present inventors made extensive studies in view of the above-mentioned conventional problems, and found that culture supernatants such as Propionibacterium furedenreich, particularly ET-3 strain and ATCC 9614T strain, grew Clostridium difficile. It was found that it can be suppressed. In addition, 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) and / or organic acids, which are highly produced by Propionibacterium Freuddenreich ET-3 strain, ATCC 9614T strain, etc., remarkably inhibit the growth of Clostridium difficile. I found out.
  • DHNA 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid
  • organic acids which are highly produced by Propionibacterium Freuddenreich ET-3 strain, ATCC 9614T strain, etc., remarkably inhibit the growth of Clostridium difficile. I found out.
  • the present invention provides a prebiotic composition that significantly suppresses the growth of Clostridium difficile without affecting useful bacteria such as bifidobacteria and lactic acid bacteria, a food and beverage composition comprising the same, and Clostridium Provided is a method for inhibiting the growth of difficile.
  • a preferred embodiment of the present invention is a Clostridium difficile growth inhibitor containing propionic acid bacteria and / or a fermented product thereof as an active ingredient.
  • Another embodiment of the present invention is a prebiotic composition having a Clostridium difficile growth inhibitory action comprising propionic acid bacteria and / or a fermented product thereof.
  • the propionic acid bacterium in the above growth inhibitor or prebiotic composition is Propionibacterium Freudenreich ET-3 (Propionibacterium Freudenreichii ET-3) or Propionibacterium Freudenreich ATCC9614T (Propionibacterium grisdenTreic 14). Preferably there is.
  • a preferred embodiment of the present invention is a Clostridium difficile growth inhibitor containing 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) and / or an organic acid as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention is a prebiotic composition having a growth inhibitory action against Clostridium difficile comprising 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) and / or an organic acid. .
  • the 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) in the above growth inhibitor or prebiotic composition may be Propionibacterium fredenreich ET-3 (Propionibacterium fredenreichii ET-3) or Propionibacterium.
  • -It is preferable that it is a thing obtained from the fermented product of Freudenreich ATCC9614T (Propionibacterium furedenreichii ATCC9614T), or synthetic DHNA.
  • the organic acid include acetic acid, formic acid, and propionic acid, and propionic acid is particularly preferable.
  • Yet another embodiment of the present invention is a food or beverage composition having an inhibitory effect on the growth of Clostridium difficile comprising an effective amount of propionic acid bacteria and / or a fermented product thereof.
  • the propionic acid bacterium in the above-mentioned food and drink composition is preferably Propionibacterium Freudenreich ET-3 (Propionibacterium fredenreichii ET-3) or Propionibacterium Freudenreich ATCC 9614T (Propionibacterium fredenreich ATC14).
  • Yet another embodiment of the present invention provides a food and beverage composition having an inhibitory effect on the growth of Clostridium difficile comprising an effective amount of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) and / or an organic acid. It is a thing.
  • DHNA 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid
  • DHNA 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid
  • Propionibacterium Freudenreich ET-3 Propionibacterium furedenreichii ET-3
  • Propionibacterium Freudenreich ATCC 9614T It is preferable to be obtained from a fermented product of Propionibacterium fredenreichii (ATCC 9614T).
  • Still another aspect of the present invention is a method for inhibiting the growth of Clostridium difficile, characterized by ingesting or administering a prebiotic composition comprising an effective amount of propionic acid bacteria and / or a fermented product thereof. It is.
  • Propionibacterium Freudenreich ET-3 Propionibacterium furedenreichichi ET-3
  • Propionibacterium Freudenreich ATCC9614Tc14cProTiprecTicrecTiC96Tc14cProcThicre It is preferable that
  • Yet another aspect of the invention is characterized by ingesting or administering a prebiotic composition comprising an effective amount of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) and / or an organic acid.
  • DHNA 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid
  • a method for inhibiting the growth of Clostridium difficile examples include humans and non-human mammals.
  • the above-described growth inhibition method of the present invention includes, for example, in vivo, in vitro, and ex vivo methods.
  • DHNA 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid
  • Propionibacterium furedenreich ET-3 or Propionibacterium is used. It is preferably obtained from a fermented product of Umm Freudenreich ATCC 9614T (Propionibacterium fredenreichii ATCC 9614T).
  • the Clostridium difficile growth inhibitor of the present invention has an effect of remarkably suppressing the growth of Clostridium difficile without affecting useful bacteria such as bifidobacteria and lactic acid bacteria, as will be described later. Therefore, examples of the utilization mode of the growth inhibitor of the present invention include a mode in which the growth inhibitor is used in combination with an antibiotic or an antibacterial agent having an effect on the growth of useful bacteria such as bifidobacteria and lactic acid bacteria. That is, the growth inhibitor of the present invention is useful as a concomitant agent with antibiotics and antibacterial agents.
  • antibiotics used in combination with the growth inhibitor of the present invention include lincomycin antibiotics, ⁇ -lactam antibiotics, aminoglycoside antibiotics, macrolide antibiotics, tetracycline antibiotics, chloramphenicol.
  • antibacterial agents of the present invention include sulfa drugs, antituberculosis drugs, quinolone antibacterial drugs, new quinolone antibacterial drugs, antiviral drugs, and antifungal drugs. Can be mentioned. Since these antibiotics and antibacterial agents may cause the growth of Clostridium difficile, they are used together for the purpose of suppressing the growth of Clostridium difficile.
  • Clostridium difficile growth inhibitor of the present invention in combination with the effective action of an antibiotic effective against Clostridium difficile such as metronidazole, vancomycin, and fidaxomicin. It is included in the scope of the invention.
  • the present invention also relates to the use of propionic acid bacteria and / or fermented products thereof for the production of Clostridium difficile growth inhibitors.
  • the invention further relates to the use of 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) and / or organic acids for the production of Clostridium difficile growth inhibitors.
  • DHNA 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid
  • the present invention also relates to propionic acid bacteria and / or fermented products thereof for use in inhibiting the growth of Clostridium difficile.
  • the present invention further relates to 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) for use in inhibiting the growth of Clostridium difficile.
  • DHNA 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid
  • the prebiotic composition of the present invention promotes the growth of bifidobacteria, which are useful bacteria in the intestine, and does not affect the growth of lactic acid bacteria. Therefore, the prebiotic composition of the present invention including Propionibacterium Freuddenreich ET-3 and ATCC9614T and DHNA promotes the growth of Bifidobacterium and the like, while Clostridium difficile ( The growth of Clostridium difficile can be suppressed. Therefore, the present invention can provide a very useful prebiotic composition having a Clostridial difficile growth inhibitory action, a food and beverage composition comprising the same, and a Clostridial difficile growth inhibitory method.
  • Propionic acid bacteria have long been used as starters for Emmental cheese and the like, and their safety has been confirmed.
  • Examples of propionic acid bacteria contained in the Clostridium difficile growth inhibitor or the prebiotic composition according to the present invention include Propionibacterium Freudenreich ET-3, Propionibacterium Freuden Reich ATCC 9614T (Propionibacterium fredenreichii ATCC 9614T), Propionibacterium fredenreich IFO 12424 (Propionibacterium fredenreichii piopro Ipi 12424), Propionibacterium ipro 12 Examples include microorganisms belonging to the genus Cuterium. Of these, the Propionibacterium freudenreich ET-3 strain and the Propionibacterium freudenreich ATCC 9614T strain are particularly preferable. These bacterial cells may be used alone or in combination.
  • the propionic acid bacterium and / or its fermented product used in the Clostridium difficile growth inhibitor or prebiotic composition according to the present invention can be obtained by culturing the Propionibacterium microorganism according to a conventional method.
  • the obtained fermented product itself and / or a processed product thereof can be used as a growth inhibitor or prebiotic composition according to the present invention.
  • the treated product is, for example, a fermented product containing microbial cells, a filtrate obtained by filtering or sterilizing the fermented product, an extract extracted with a predetermined solvent, an evaporator or the like to obtain a fermented product, its filtrate, extract or supernatant. Concentrated concentrates and those obtained through processing steps such as dried products (freeze-dried, etc.) can be used.
  • Preferred addition amount of propionic acid bacteria and / or fermented product thereof varies depending on the concentration of the fermented product.
  • the growth inhibitor of the present invention or It is 0.1 to 10% by weight, preferably 0.3 to 5% by weight, based on the prebiotic composition.
  • the 1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid (DHNA) contained in the Clostridium difficile growth inhibitor or prebiotic composition according to the present invention can be used either by chemical synthesis or biosynthesis, but is preferably Is due to biosynthesis.
  • DHNA using Propionibacterium fredenreiich ET-3 strain and Propionibacterium fredenreiich ATCC 9614T (Propionibacterium fridenreichii ATCC 9614T) is particularly preferable.
  • the fermentation product itself obtained by culturing a Propionibacterium microorganism according to a conventional method and / or a processed product thereof can be used as DHNA.
  • the treated product is, for example, a fermented product containing bacterial cells, a filtrate obtained by filtering or sterilizing the fermented product, a crude product such as an extract extracted with a predetermined solvent, a purified product thereof, a fermented product by an evaporator, etc.
  • Concentrates obtained by concentrating the filtrate / extract / supernatant liquid and those obtained through processing steps such as dried products (freeze-dried, etc.) can be used.
  • the concentration of DHNA can be appropriately adjusted according to the application, but is 1 to 250 ⁇ g / ml, preferably 1 to 5 ⁇ g / ml.
  • the present invention also provides a food and beverage composition containing a prebiotic composition.
  • the food / beverage composition containing the prebiotic composition of the present invention is specifically a food / beverage composition, such as milk, soft drink, fermented milk (yogurt, yogurt drink), cheese, bread, biscuits, crackers. Even if the prebiotic composition of the present invention is added to a pizza crust, prepared milk powder, liquid food, food for the sick, food for infants, food such as milk powder for nursing women, nutritional food, etc. Good.
  • the properties of the foods and drinks usually used, for example, solid (powder, granule, etc.), paste, liquid or suspension, liquid food, jelly, tablet, granule, capsule It can take any form of food or drink that can normally be distributed. Among these, it is preferable to provide the food / beverage composition of this invention with the form of a drink from the point which can be ingested easily, an absorptive point, etc.
  • Other components are not particularly limited, but when the prebiotic composition of the present invention is used in a food or drink composition, water, protein, carbohydrates, lipids, vitamins, minerals, organic acids, Organic bases, fruit juices, flavors and the like can be used as main components.
  • the protein include whole milk powder, skim milk powder, partially skim milk powder, casein, whey powder, whey protein, whey protein concentrate, whey protein isolate, ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -casein, ⁇ -lactoglobulin , ⁇ -lactalbumin, lactoferrin, soy protein, chicken egg protein, meat protein, etc., and their hydrolysates; butter, whey minerals, cream, whey, non-protein nitrogen, sialic acid, phospholipid, lactose, etc.
  • saccharide examples include general saccharides, modified starch (in addition to dextrin, soluble starch, British starch, oxidized starch, starch ester, starch ether, etc.), dietary fiber, and the like.
  • lipid examples include animal oils such as lard, fish oil, etc., fractionated oils, hydrogenated oil, transesterified oil, etc .; palm oil, safflower oil, corn oil, rapeseed oil, coconut oil, fractionated oils thereof, Examples thereof include vegetable oils such as hydrogenated oils and transesterified oils.
  • vitamins include vitamin A, carotene, vitamin B group, vitamin C, vitamin D group, vitamin E, vitamin K group, vitamin P, vitamin Q, niacin, nicotinic acid, pantothenic acid, biotin, inositol, choline.
  • minerals include, for example, calcium, phosphorus, potassium, magnesium, chlorine, sodium, copper, iron, manganese, zinc, selenium, chromium, molybdenum, vanadium, and whey mineral.
  • the organic acid include malic acid, citric acid, lactic acid, tartaric acid, and the like. These components can be used singly or in combination of two or more, and a synthetic product and / or a food or drink containing a lot of these may be used.
  • the food and beverage composition can be produced according to a conventional method by mixing the prebiotic composition of the present invention and an appropriate amount of the necessary components.
  • the content of the prebiotic composition in the food / beverage product composition of the present invention can be arbitrarily determined according to its purpose, application and the like. Although this invention is not limited to this, As content, it is 5 weight% or more normally with respect to the whole quantity, More preferably, it is 10 weight% or more. By ingesting or administering this, it is possible to easily inhibit the growth of Clostridium difficile, and as a result, the symptoms can be alleviated and the infection can be suppressed or prevented. It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • Example 1 Preparation of culture supernatant of propionic acid bacteria, which is the prebiotic composition of the present invention
  • Propionibacterium flodenreich ET-3 strain (Incorporated administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, as of August 9, 2001) The deposit center (deposited as FERM BP-8115 at 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba, Ibaraki, Japan) (postal code 305-8565)), Propionibacterium Freudrenreich ATCC 9614T (Propionibacterium) Um Freudenreich reference strain, purchased from American Type Culture Collection (ATCC)), and Propionibacterium freudenreich strain (No.
  • Clostridium difficile JCM1296T strain (Clostridial difficile reference strain) was purchased from the RIKEN BioResource Center and restored according to the attached manual.
  • Inhibition test 1% inoculation was carried out on BHI medium previously maintained in an anaerobic state with Clostridium difficile prepared as described above.
  • the prebiotic composition of the present invention or DHNA was added and cultured under anaerobic conditions at 37 ° C. for 24 hours.
  • OD 650 was measured (Shimadzu spectrophotometer BioSpec 1600, manufactured by Shimadzu Corporation). The results are shown in FIG. 1 as a graph.
  • Example 2 Preparation of DHNA contained in the prebiotic composition of the present invention 100 mg of DHNA (manufactured by Sigma-Aldrich) was dissolved in 0.5 ml of DMSO to prepare a 1M DMSO solution. After 10-fold dilution with BHI medium to 100 mM, filter sterilization was performed. At the same time, a solution in which DMSO was diluted 10-fold with BHI medium was also prepared and sterilized by filter. All subsequent dilutions were performed with a 10-fold diluted DMSO solution so that 10% DMSO was included in the DHNA solution at all concentrations. Since 0.1% of these DHNA solutions were added to the bacterial culture as the prebiotic composition of the present invention, the final concentration of DMSO was 0.01%.
  • Example 2 The inhibition test similar to Example 1 was done about the growth inhibitory effect of the prebiotic composition of this invention with respect to Clostridium difficile used in Example 1.
  • FIG. Specifically, the prebiotic composition of the present invention containing DHNA was added to each sample at each concentration (1 ⁇ M, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M, 50 ⁇ M). The obtained results are shown in the graph of FIG. A multiple comparison test by the Tukey-Kramer method was performed, and each group n 3 and * p ⁇ 0.05. For 10 ⁇ M to 50 ⁇ M, ** p ⁇ 0.01 with respect to the DMSO group.
  • Example 3 -Preparation of culture supernatant of bifidobacteria and lactic acid bacteria longum OLB6001 strain (FERM P-13610) and "Meiji Bulgaria Yogurt” (trade name: manufactured by Meiji Dairies). bulgaricus was cultured under anaerobic conditions at 37 ° C. for 18 hours. S. thermophilus OLS3059 strain (FERM P-15487) was cultured for 30 hours under anaerobic conditions at 30 ° C. The culture was centrifuged (centrifugation conditions: 8000 rpm, 4 ° C., 10 minutes), the culture supernatant was collected, filter sterilized, and the obtained culture supernatant was stored at ⁇ 80 ° C. as a comparative composition ( Lactic acid bacteria are used in Example 4).
  • Example 4 Effect of the prebiotic composition of the present invention on the growth of lactic acid bacteria
  • the prebiotic composition containing the DHNA of the present invention (DHNA concentration: 1 ⁇ M to 50 ⁇ M) used in Example 3 bulgaricus and S.
  • DHNA concentration: 1 ⁇ M to 50 ⁇ M used in Example 3 bulgaricus and S.
  • the same test as in Example 3 was performed, and the results are shown in FIGS.
  • the addition of a prebiotic composition containing DHNA of the present invention resulted in L.P. bulgaricus and S. It was found that there is no effect on the growth of the thermophilus OLS3059 strain. Therefore, it was found that the useful bacteria have no influence on the growth when inhibiting the growth of Clostridium difficile.
  • Example 5 -Effect of propionic acid of the present invention on the growth of Clostridium difficile
  • a culture solution of Clostridium difficile C. difficile JCM1296 strain
  • Various organic acids were added to a final concentration of 100 ⁇ M, and the OD 650 value after 24 hours was measured.
  • the results are shown in FIG. 6 as a graph. As shown in FIG. 6, it was shown that the growth of Clostridium difficile was inhibited by the addition of propionic acid.
  • the Clostridium difficile growth inhibitor or prebiotic composition according to the present invention does not affect or is effective against the growth of bifidobacteria and lactic acid bacteria, which are useful bacteria in the intestine.
  • the growth of a certain Clostridium difficile can be suppressed. Therefore, based on the prebiotic composition of the present invention containing the Propionibacterium Freuddenreich ET-3 and ATCC9614T strains and DHNA, etc., a very useful prebiotic composition having a Clostridial difficile growth inhibitory action and It is possible to provide a food / beverage composition comprising the same and a method for inhibiting Clostridium difficile growth, and the industrial applicability is very high.

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Abstract

　プロピオン酸菌及び／又はその発酵物を有効成分とするクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤、およびクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害作用を有するプレバイオティクス組成物を提供する。また、１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）および／または有機酸を有効成分とするクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤、およびクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害作用を有するプレバイオティクス組成物、さらにこれらを含む食品組成物を提供する。また、これらを摂取又は投与するクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害方法を提供する。

Description

クロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤
　本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害剤、並びに、クロストリジウム・ディフィシル増殖阻害作用を有するプレバイオティクス組成物及びこれを含んでなる飲食品組成物並びにクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害方法に関する。
　クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）は抗菌薬が誘因となる下痢症あるいは腸炎の主要な原因菌であり、偽膜性大腸炎の原因菌としてよく知られている。クロストリジウム・ディフィシル感染症の症状は、軽度の下痢症状から、腸閉塞等死に至るような重篤な病態まで幅が広いことを特徴とする。さらに、本感染症は再発することが多く治療が困難で、院内感染の原因菌としても重要で、病院入院症例や老人ホームの入居者における院内集団発生が頻繁に報告されている。こうした場合の臨床現場においては薬剤による治療が困難であるため、特に簡便に用いることができる飲食品やプレバイオティクスによる症状緩和、感染症抑制やその予防が強く求められている。
　これまでも、様々なクロストリジウム・ディフィシル感染症に対する対応策が検討されている。例えば、特許文献１にはフラクトオリゴ糖からなる未消化性オリゴ糖の治療有効量を投与することでクロストリジウム・ディフィシルによる哺乳動物の感染症を抑制する方法が開示されている。また特許文献２にはホップ抽出物等を飲食品もしくは飲料に添加して又は投与してクロストリジウム・ディフィシルの増殖を抑制し、さらにはこれにより誘起される疾病の治療又は予防を行う事を開示している。さらに、特許文献３は、クロストリジウム・ディフィシル等による院内感染性の感染症の増加にともない、これらの疾患に対する新規抗菌化合物として、クロストリジウム・ディフィシル増殖阻害効果を有するツリシンＣＤというバクテリオシンについて開示している。
米国特許第５６８８７７７号明細書 特開平１１－２２１０６４号公報 特表２０１１－５０５１２６号公報
　しかし、上記特許文献に開示の技術においては、有用なビフィズス菌の増殖を促進しつつ、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の増殖を阻害するようなプレバイオティクス及びプレバイオティクス由来成分については開示されておらず、またこれについて報告した例はこれまで知られていなかった。
　したがって、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の増殖を抑制し、またこれによる症状緩和、さらにはこれによる感染症抑制やその予防が、より簡便な方法でかつ高い効果で達成しうる技術の開発が引き続き望まれていた。
　本発明者らは上記従来の問題点に鑑み鋭意研究を進めたところ、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、特にＥＴ－３株やＡＴＣＣ９６１４Ｔ株等の培養上清がクロストリジウム・ディフィシルの増殖を抑制しうることを見出した。また、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒＥＴ－３株やＡＴＣＣ９６１４Ｔ株等が高産生する１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）および／または有機酸がクロストリジウム・ディフィシルの増殖を顕著に阻害することを見出した。
　したがって、本発明はビフィズス菌、乳酸菌等の有用細菌に対して影響を及ぼすことなくクロストリジウム・ディフィシルの増殖を顕著に抑制するプレバイオティクス組成物及びこれを含んでなる飲食品組成物、並びにクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害方法を提供する。
　本発明の好ましい態様は、プロピオン酸菌及び／又はその発酵物を有効成分として含む、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害剤である。
　また、本発明の一態様は、プロピオン酸菌及び／又はその発酵物を含んでなるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害作用を有するプレバイオティクス組成物である。
　上記増殖阻害剤またはプレバイオティクス組成物における前記プロピオン酸菌としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）であることが好ましい。
　本発明の好ましい態様は、１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）および／または有機酸を有効成分として含む、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害剤である。
　また本発明の別の態様は、１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）および／または有機酸を含んでなるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害作用を有するプレバイオティクス組成物である。
　上記増殖阻害剤またはプレバイオティクス組成物における前記１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）の発酵物より得られるもの、あるいは、合成ＤＨＮＡであることが好ましい。ＤＨＮＡは、当業者であれば公知の手法によって適宜合成することが可能である。そして前記の有機酸は、酢酸、蟻酸、プロピオン酸などが挙げられ、特に好ましくはプロピオン酸である。
　本発明のさらに別の態様は、有効量のプロピオン酸菌及び／又はその発酵物を含んでなるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害作用を有する飲食品組成物である。
　上記飲食品組成物における前記プロピオン酸菌としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）であることが好ましい。
　また本発明のさらに別の態様は、有効量の１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）および／または有機酸を含んでなるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害作用を有する飲食品組成物である。
　上記飲食品組成物における前記１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）の発酵物より得られるものであることが好ましい。
　本発明のさらに別の態様は、有効量のプロピオン酸菌及び／又はその発酵物を含んでなるプレバイオティクス組成物を摂取又は投与することを特徴とするクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害方法である。
　上記クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害方法における前記プロピオン酸菌としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）であることが好ましい。
　また本発明のさらに別の態様は、有効量の１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）および／または有機酸を含んでなるプレバイオティクス組成物を摂取又は投与することを特徴とするクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害方法である。投与対象としては、例えば、ヒトあるいは非ヒト哺乳動物等が挙げられる。また本発明の上記増殖阻害方法には、例えば、インビボ、インビトロ、エクスビボの方法が含まれる。
　上記クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害方法における前記１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）の発酵物より得られるものであることが好ましい。
　また、本発明のクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤は、後述のように、ビフィズス菌、乳酸菌等の有用細菌に対して影響を及ぼすことなくクロストリジウム・ディフィシルの増殖を顕著に抑制する効果を有する。したがって、本発明の増殖阻害剤の利用態様としては、例えば、ビフィズス菌、乳酸菌等の有用細菌の増殖に影響を及ぼす作用を有する抗生物質や抗菌薬と併用して用いる態様が挙げられる。即ち、本発明の増殖阻害剤は、抗生物質や抗菌薬との併用剤として有用である。
　本発明の増殖阻害剤と併用される抗生物質としては、例えば、リンコマイシン系抗生物質、β－ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、クロラムフェニコール系抗生物質、ペプチド系抗生物質、ホスホマイシンなどが挙げられ、本発明の抗菌薬としては、例えば、サルファ剤、抗結核薬、キノロン系抗菌薬、ニューキノロン系抗菌薬、抗ウィルス薬、抗真菌薬などが挙げられる。これらの抗生物質や抗菌薬は、クロストリジウム・ディフィシルの増殖を引き起こす恐れがあるため、クロストリジウム・ディフィシルの増殖を抑制する目的で併用する。また、メトロニダゾール（metronidazole）やバンコマイシン(vancomycin)、フィダキソマイシン（Fidaxomicin）といったクロストリジウム・ディフィシルに有効な抗生物質の作用を補完する形で本発明のクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤を併用することも本発明の範囲に含まれる。
　また本発明は、プロピオン酸菌及び／又はその発酵物の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害剤の製造のための使用に関する。
　さらに本発明は、１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）及び／又は有機酸の、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害剤の製造のための使用に関する。
　また本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害に用いるためのプロピオン酸菌及び／又はその発酵物に関する。
　さらに本発明は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害に用いるための１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）に関する。
　本発明のプレバイオティクス組成物は腸内の有用な細菌であるビフィズス菌の増殖を促進し、また乳酸菌の増殖には影響を及ぼさない。そのため、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒＥＴ－３株及びＡＴＣＣ９６１４Ｔ株並びにＤＨＮＡ等を含む本発明のプレバイオティクス組成物はビフィズス菌等の増殖を促進する一方、極めて有害な細菌であるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の増殖を抑制することができる。したがって本発明は、非常に有用なクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害作用を有するプレバイオティクス組成物及びこれを含んでなる飲食品組成物並びにクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害方法を提供することが可能である。
本発明のプレバイオティクス組成物のクロストリジウム・ディフィシルの増殖阻害活性を示すグラフ図である。 本発明のプレバイオティクス組成物のクロストリジウム・ディフィシルの増殖阻害活性を示すグラフ図である。 本発明のプレバイオティクス組成物がビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ＯＬＢ６００１株）の増殖に及ぼす影響を示すグラフ図である。 本発明のプレバイオティクス組成物が乳酸菌（Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の増殖に及ぼす影響を示すグラフ図である。 本発明のプレバイオティクス組成物が乳酸菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ３０５９株）の増殖に及ぼす影響を示すグラフ図である。 本発明のプロピオン酸がクロストリジウム・ディフィシルの増殖に及ぼす影響を示すグラフ図である。 受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－８１１５（プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒＥＴ－３株）の受託証の写しである。 受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－８１１５（プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒＥＴ－３株）の生存に関する証明書の写しである。
　以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下に述べる個々の形態には限定されない。
　プロピオン酸菌は、古くからエメンタールチーズ等のスターターとして利用されており、その安全性は確認されている。本発明によるクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤またはプレバイオティクス組成物に含まれるプロピオン酸菌の例としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＩＦＯ　１２４２４（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＩＦＯ　１２４２４）、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ等プロピオニバクテリウム属に属する微生物が挙げられる。この中でも特に、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３株、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ株が好ましい。
　これらの菌体については単独または複数のものを組み合わせて使用しても良い。
　本発明によるクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤またはプレバイオティクス組成物で用いられるプロピオン酸菌及び／またはその発酵物としては、前記プロピオニバクテリウム属微生物を常法に従って培養することによって得られる。得られた発酵物それ自体、及び／又はその処理物を、本発明に係る増殖阻害剤またはプレバイオティクス組成物として使用できる。処理物は例えば、菌体を含む発酵物、発酵物を濾過あるいは除菌して得た濾液、所定の溶媒により抽出した抽出物、エバポレーター等により発酵物・その濾液・抽出物・上清液を濃縮した濃縮物、これらの乾燥物（凍結乾燥、他）等の処理工程を経たものを用いることができる。
　好ましいプロピオン酸菌及び／またはその発酵物の添加量としては、発酵物の濃縮度等によって異なる。例えば、国際公開パンフレット第ＷＯ２００５／０３３３２３号明細書の実施例１に記載の方法で製造したプロピオン酸菌の発酵物をＤＨＮＡ濃度１００μｇ／ｍｌとなるまで濃縮したものの場合、本発明の増殖阻害剤またはプレバイオティクス組成物に対して０．１～１０重量％、好ましくは０．３～５重量％である。
　本発明によるクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤またはプレバイオティクス組成物に含まれる１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）としては、化学合成または生合成によるもののいずれでも用いることができるが、好ましくは生合成によるものである。本発明においては特に、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＥＴ－３株やプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）、が高産生するＤＨＮＡを用いることが好ましい。たとえば、プロピオニバクテリウム属微生物を常法に従って培養することによって得られる発酵物それ自体、及び／又はその処理物をＤＨＮＡとして使用できる。処理物は例えば、菌体を含む発酵物、発酵物を濾過あるいは除菌して得た濾液、所定の溶媒により抽出した抽出物等の粗製物、またそれらの精製物、エバポレーター等による発酵物・その濾液・抽出物・上清液を濃縮した濃縮物、これらの乾燥物（凍結乾燥、他）等の処理工程を経たものを用いることができる。ＤＨＮＡの濃度としては、用途等に応じて適宜調整することができるが、１～２５０μｇ／ｍｌ、好ましくは１～５μｇ／ｍｌである。
　本発明はプレバイオティクス組成物を含有する飲食品組成物も提供する。
　本発明のプレバイオティクス組成物を含有する飲食品組成物は、具体的には、飲食品組成物、例えば、牛乳、清涼飲料、発酵乳（ヨーグルト、ヨーグルト飲料）、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、幼児用粉乳等食品、授乳婦用粉乳等食品、栄養食品等に本発明のプレバイオティクス組成物を添加し、これを摂取してもよい。また、その性状についても、通常用いられる飲食品の状態、例えば、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状、流動食状、ゼリー状、タブレット状、顆粒状、カプセル状等、通常流通し得るあらゆる飲食品形状をとることができる。この中でも、簡便に摂取しうる点、吸収性の点等から、本発明の飲食品組成物は飲料の形態で提供することが好ましい。
　その他の成分についても特に限定されないが、本発明のプレバイオティクス組成物を飲食品組成物に含ませて用いる場合には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α－カゼイン、β－カゼイン、κ－カゼイン、β－ラクトグロブリン、α－ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これら加水分解物；バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分等が挙げられる。糖質としては一般の糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維等が挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂等が挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸等が挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、リン、カリウム、マグネシウム、塩素、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、クロム、モリブデン、バナジウム、乳清ミネラル等が挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸等が挙げられる。これらの成分は、単独でも２種以上を組み合わせても使用することができ、合成品及び／またはこれらを多く含む飲食品を用いてもよい。
　上記飲食品組成物は、本発明のプレバイオティクス組成物と上記必要成分の適宜量とを混合し、常法に従って製造することができる。
　本発明の飲食品組成物におけるプレバイオティクス組成物の含有量は、その目的、用途等に応じて任意に定めることができる。本発明はこれに限定されないがその含有量としては、全量に対して通常、５重量％以上、より好ましくは１０重量％以上である。これを摂取または投与することで簡便にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害を行うことができ、ひいては症状緩和、感染症抑制やその予防ができる。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。なお、実施例において「％」表示は特に明記する場合を除き重量％を示すものとする。
［実施例１］
・本発明のプレバイオティクス組成物であるプロピオン酸菌培養上清の調製
　プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３株(平成１３年８月９日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５－８５６６））にＦＥＲＭ　ＢＰ－８１１５として寄託されている)、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ株（プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ基準株、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入）、市販のエメンタールチーズより分離したプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ株（Ｎｏ．３２－１）を３０℃嫌気条件下で４８時間賦活及び前培養した後、さらに３０℃嫌気条件下で７２時間培養した。培養物を遠心分離し（遠心分離条件：８０００ｒｐｍ、４℃、１０分）、培養上清を回収し、フィルター滅菌し、得られた培養上清を本発明のプレバイオティクス組成物として－８０℃で保存した。
・クロストリジウム・ディフィシルの培養
　クロストリジウム・ディフィシルＪＣＭ１２９６Ｔ株（クロストリジウム・ディフィシル基準株）は理研バイオリソースセンターより購入し、添付のマニュアルに従って復元した。
・阻害試験
　上記において調整したクロストリジウム・ディフィシルを予め嫌気状態に保ったＢＨＩ培地に１％接種した。これに本発明のプレバイオティクス組成物又はＤＨＮＡを添加し、３７℃嫌気条件下で２４時間培養した。培養液をよく攪拌した後、ＯＤ650を測定した（島津分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ１６００、（株）島津製作所製）。結果をグラフ図として図１に示す。なお得られたデータについては、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定を行い、各群ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１とした。なお、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ及びプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３についてはｃｏｎｔｒｏｌ群に対してｐ＜０．０１とした。
［結果］
　本発明のプレバイオティクス組成物を５％添加した系において、２４時間培養後のＯＤ650が有意に低下したことから、本発明のプレバイオティクス組成物が効果的にクロストリジウム・ディフィシルの増殖阻害をすることがわかった。
［実施例２］
・本発明のプレバイオティクス組成物に含むＤＨＮＡの調製
　ＤＨＮＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）１００ｍｇを０．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解し、１ＭのＤＭＳＯ溶液を作成した。ＢＨＩ培地で１０倍希釈し１００ｍＭとした後、フィルター滅菌した。同時にＤＭＳＯをＢＨＩ培地で１０倍希釈した溶液も作成し、フィルター滅菌した。その後の希釈は全て１０倍希釈ＤＭＳＯ溶液で行い、全濃度のＤＨＮＡ溶液にＤＭＳＯが１０％含まれるようにした。これらのＤＨＮＡ溶液を本発明のプレバイオティクス組成物として菌培養液に０．１％添加するため、ＤＭＳＯの最終濃度はいずれも０．０１％とした。
・阻害試験
　実施例１において用いたクロストリジウム・ディフィシルに対する本発明のプレバイオティクス組成物の増殖阻害効果について実施例１と同様の阻害試験を行った。具体的には各試料に対してＤＨＮＡ含有の本発明のプレバイオティクス組成物をそれぞれの濃度で添加した（１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ）。得られた結果を図２のグラフに示す。なお、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定を行い、各群ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５とした。なお、１０μＭ～５０μＭについてはＤＭＳＯ群に対して＊＊ｐ＜０．０１とした。
　図２に示すように１０μＭ以上のＤＨＮＡの添加により、クロストリジウム・ディフィシルの増殖が顕著に阻害されることが示された。
［実施例３］
・ビフィズス菌及び乳酸菌培養上清の調整
　Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ　ＯＬＢ６００１株（ＦＥＲＭ　Ｐ－１３６１０）及び「明治ブルガリアヨーグルト」（商品名：明治乳業社製）より分離したＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓは３７℃嫌気条件下で１８時間培養した。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ３０５９株（ＦＥＲＭ　Ｐ－１５４８７）は３０℃嫌気条件下で３０時間培養した。培養物を遠心分離し（遠心分離条件：８０００ｒｐｍ、４℃、１０分）、培養上清を回収し、フィルター滅菌して、得られた培養上清を比較組成物として－８０℃で保存した（乳酸菌は実施例４において使用）。
・本発明のプレバイオティクス組成物がビフィズス菌の増殖に及ぼす影響
　Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ　ＯＬＢ６００１株を実施例２において用いたＤＨＮＡもしくは０．０１％ＤＭＳＯを（対照）添加し、３７℃嫌気条件下で１２時間培養した。培養液をよく攪拌した後、ＯＤ650を測定した（島津分光光度計ＢｉｏＳｐｅｃ１６００、（株）島津製作所製）。結果をグラフ図として図３に示す。なお、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ法による多重比較検定を行い、各群ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５とした。なお、１０μＭ～５０μＭについてはＤＭＳＯ群に対して＊＊ｐ＜０．０１とした。
［結果］
　本発明のＤＨＮＡを含有するプレバイオティクス組成物の添加によりＯＬＢ６００１株の増殖が有意に促進されることがわかった。即ち、本発明のプレバイオティクス組成物は有用細菌に対して影響を及ぼさずむしろ増殖促進効果があることが示された。したがって、クロストリジウム・ディフィシルの増殖阻害を行う際には有用細菌についてその増殖に影響を及ぼさない（むしろ増殖促進効果がある）ことがわかった。
［実施例４］
・本発明のプレバイオティクス組成物が乳酸菌の増殖に及ぼす影響
　本発明のＤＨＮＡを含有するプレバイオティクス組成物（ＤＨＮＡ濃度：１μＭ～５０μＭ）の、実施例３で用いたＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ及びＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ３０５９株に対する影響を調べるため、実施例３と同様の試験を行い、結果を図４及び図５に示す。実施例３と同様に、本発明のＤＨＮＡを含有するプレバイオティクス組成物の添加によりＬ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ及びＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＯＬＳ３０５９株の増殖に対して影響を及ぼさないことがわかった。したがって、クロストリジウム・ディフィシルの増殖阻害する際には有用細菌についてその増殖に影響を及ぼさないことがわかった。
［実施例５］
・本発明のプロピオン酸がクロストリジウム・ディフィシルの増殖に及ぼす影響
　２４時間培養してＯＤ650が１．２まで増殖したクロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ　ＪＣＭ１２９６株）培養液を培地に１％添加すると同時に、各種有機酸を終濃度１００μＭとなるように添加し、２４時間後のＯＤ650値を測定した。結果をグラフ図として図６に示す。
　図６に示すようにプロピオン酸の添加により、クロストリジウム・ディフィシルの増殖が阻害されることが示された。
　本発明によるクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害剤またはプレバイオティクス組成物は腸内の有用細菌であるビフィズス菌や乳酸菌の増殖には影響を及ぼさないあるいは増殖に対して有効である一方、極めて有害な細菌であるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の増殖を抑制することができる。そのため、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒＥＴ－３株及びＡＴＣＣ９６１４Ｔ株並びにＤＨＮＡ等を含む本発明のプレバイオティクス組成物に基づき、非常に有用なクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害作用を有するプレバイオティクス組成物及びこれを含んでなる飲食品組成物並びにクロストリジウム・ディフィシル増殖阻害方法を提供することが可能であり、産業上の利用可能性は非常に高い。

Claims (9)

  1. 　プロピオン酸菌及び／又はその発酵物を有効成分として含む、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害剤。
  2. 　前記プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）である、請求項１に記載の薬剤。
  3. 　１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）および／または有機酸を有効成分として含む、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害剤。
  4. 　前記１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）の発酵物より得られるものである、請求項３に記載の薬剤。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載の薬剤を含んでなる、抗生物質もしくは抗菌薬との併用剤。
  6. 　有効量のプロピオン酸菌及び／又はその発酵物を含んでなるプレバイオティクス組成物を摂取又は投与することを特徴とするクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害方法。
  7. 　前記プロピオン酸菌が、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）であることを特徴とする請求項６に記載のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害方法。
  8. 　有効量の１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）および／または有機酸を含んでなるプレバイオティクス組成物を摂取又は投与することを特徴とするクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害方法。
  9. 　前記１，４－ジヒドロキシ－２－ナフトエ酸（ＤＨＮＡ）がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＥＴ－３（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＥＴ－３）またはプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ　ＡＴＣＣ９６１４Ｔ）の発酵物より得られるものであることを特徴とする請求項８に記載のクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）増殖阻害方法。
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