WO2012127094A1

WO2012127094A1 - Células aisladas de sangre del seno coronario y usos

Info

Publication number: WO2012127094A1
Application number: PCT/ES2012/070194
Authority: WO
Inventors: Eduardo DE TERESA GALVAN; Noela RODRIGUEZ LOSADA
Original assignee: Universidad de Malaga; Servicio Andaluz de Salud; Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
Current assignee: Universidad de Malaga; Servicio Andaluz de Salud; Instituto Mediterraneo para el Avance de la Biotecnologia y la Investigacion Sanitaria (Fundacion Imabis)
Priority date: 2011-03-23
Filing date: 2012-03-23
Publication date: 2012-09-27
Anticipated expiration: 2013-09-23

Abstract

La presente invención se encuentra dentro del campo de la de la biología celular y la medicina, y se refiere a una célula y/o población celular que presenta un nuevo fenotipo celular, y que realiza un proceso contráctil sin inductores externos, no fisiológicos, en un medio de cultivo no específico subóptimo, de manera que pueden contraerse incluso en medios no favorecedores. Se refiere también a la metodología adecuada para aislar, cultivar, expandir y caracterizar dicha población celular, con características de células embrionarias como son nanog, Oct3/4, y cMyc, a las composiciones farmacéuticas que comprenden dichas poblaciones celulares, y al uso de dichas composiciones en la regeneración de tejidos, y particularmente para la regeneración de tejido cardiaco dañado, como miocardio.

Description

Células aisladas de sangre del seno coronario y usos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

ESTADO DE LA TÉCNICA

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de mortalidad en los países desarrollados. La OMS calcula que en 2005 murieron por esta causa 17,5 millones de personas, lo cual representa un 30% de todas las muertes registradas en el mundo; 7,6 millones de esas muertes se debieron a la cardiopatía coronarias.

La cardiopatía isquémica (Ischemic heart disease -IHD-) y la insuficiencia cardiaca (heart failure -HF-) son dos de las tres principales causas de mortalidad en mujeres y hombres. Ambas comparten un mismo substrato fisiopatológico: la pérdida de cardiomiocitos debido a la necrosis y/o apoptosis. La muerte de los cardiomiocitos da lugar a un impedimento a la capacidad del miocardio de bombear sangre, que se traduce en una disminución de la fracción de eyección ventricular izquierda (left ventricular ejection fraction - LVEF-). De hecho, una LVEF residual después de un infarto agudo de miocardio (IAM) es un fuerte predictor de una supervivencia de un año (Jimenez-Quevedo et al., 2008. Rev.Esp.Cardiol. 61 , 635-639). Se pensaba que una vez que el cardiomiocito había muerto, el corazón era incapaz de reemplazarlo. Hasta hace poco, esto se atribuía a la naturaleza terminal de diferenciación del corazón, considerándolo un órgano postmitótico. Sin embargo, este concepto ha cambiado recientemente, y se acepta que el corazón tiene capacidad regenerativa, pensando que esta capacidad es limitada, y probablemente incapaz de regenerar/remplazar el corazón en una extensión significativa (Nadal-Ginard et al., 2003. Circ.Res. 92,139-150; Barile et ai, 2007. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 4 Suppl 1 , S9-S14)

El tratamiento médico ha mejorado significativamente la supervivencia de los pacientes, y se basa fundamentalmente en terapias farmacológicas y quirúrgicas. Éstas se dirigen a prevenir la progresión de la enfermedad, descargando el corazón, o revertiendo las consecuencias de la enfermedad, pero no solucionan el problema subyacente, esto es, la pérdida funcional de miocardio. El único tratamiento que contempla reemplazar el tejido es el trasplante de corazón, pero esta aproximación está limitada por la disponibilidad de donantes. Existen evidencias de que las células madre de varios orígenes pueden diferenciarse en cardiomiocitos, vasos sanguíneos o tejido conectivo, y son, por tanto, potencialmente capaces de regenerar tejido miocárdico (Ellison et al., 2007. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 4 Suppl 1 , S52-9). En general, los grupos de investigación que trabajan en la terapia regenerativa cardiovascular utilizan o bien células progenitoras de circulación periférica (Leone 2009, Eur Heart J. 2009; 30: 890-899), células residentes en el corazón (Beltrami et al., 2001 . N. Engl. J. Med. 344, 1750-1757; Beltrami et al., 2003. Cell 1 14, 763-776; Torella et al., 2007 Cell Mol. Life Sci. 64, 661 -673) o células residentes en la medula ósea (Psaltis et al., 2008. Stem Cells 26, 2201 -2210) ó derivados mesenquimales como la grasa (Gwak et al., 2009. Cell Biochem. Funct. 27, 148-154). En los últimos años se han desarrollado nuevas estrategias dirigidas a estimular la regeneración del músculo cardíaco o a su sustitución por células con capacidad miogénica (Kessler and Byrne, 1999. Annu Rev Physiol 61 , 219- 42). Las células madre han sido estudiadas intensamente como fuente de cardiomiocitos. Los cardiomiocitos se generan a partir de un precursor celular que se divide y da lugar a grupos de células del mismo tipo. Durante la vida fetal, estas células empiezan a diferenciarse y aparecen en su citoplasma las miofibrillas contráctiles. Estos cardiomiocitos fetales contráctiles conservan todavía la capacidad de dividirse a pesar de encontrarse en un estado diferenciado y, en el caso de los seres humanos, esta capacidad se mantiene hasta los 3-4 meses de vida posnatal (Gupta et al,. 1991 Biochem Biophys Res Commun. 1991 Feb 14;174(3):1 196-203). En general, se supone que a los pocos meses del nacimiento ya poseemos el número máximo de miocitos cardíacos que podemos llegar a tener, y que a partir de este momento las células que se pierdan ya no van a poder ser reemplazadas, lo que conduce a una disminución progresiva de su número hasta la muerte. Éste es el modelo de crecimiento que se ha considerado válido para las células musculares cardíacas y para las neuronas del sistema nervioso central. Por el contrario, el resto de las células del organismo conservan la capacidad de dividirse después de haber alcanzado un estado estacionario diferenciado.

Sin embargo, existen resultados demuestran que el corazón es un órgano en regeneración continua que aumenta la producción de nuevas células musculares en respuesta a diferentes estímulos fisiológicos y patológicos (Olivetti et al., 1996, J Mol Cell Cardiol. Sep;28(9):2005-16). Esta capacidad regenerativa ofrece nuevas oportunidades para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, como el empleo de células madre embrionarias como fuente de cardiomiocitos para reparar el miocardio dañado y mejorar la función cardiaca (Emanueli et al., 2005. Thromb. Haemost. 94, 738-749). Se ha investigado el beneficio potencial del transplante de células madre en modelos animales, usando células de médula ósea (Fukuda. & Fujita, 2005. Kidney Int. 68, 1940-1943; Orlic et al., 2001 . Nature 410, 701 -705), células madre cardiacas (Beltrami et al., 2003. Cell 1 14, 763-776), células madre embrionarias (ES)( Behfar et al., 2002. FASEB J. 1 6, 1 558-1566; Menard et al., 2005. Lancet 366, 1005-1012), y cardiomiocitos fetales (Rubart et al., 2003. Circ. Res. 92, 1217-1224), inyectados en el sitio del daño cardiaco.

Recientemente se han identificado poblaciones de células madre en el corazón (Leri et al., 2005. Physiol Rev. 85, 1373-1416), entre ellas, células expresando el receptor de células madre c-Kit (Beltrami et al., 2003. Cell 1 14, 763-776), Sca-1 (Oh et al., 2003. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A 100, 12313-12318), o el factor de transcripción islet-1 (Laugwitz et al., 2005. Nature 433, 647-653) en la superficie celular, side population cells (SP)(Pfister et al., 2005. Circ. Res. 97, 52-61 ), y células capaces de crecer en cardioesferas (Messina et al., 2005. Circ. Res. 95, 91 1 -921 ).

Sin embargo, a pesar de la observación de la existencia de células con capacidad de subdividirse y convertirse en cardiomiocitos, la tasa de proliferación/regeneración es tan baja, que no es suficiente para regenerar el tejido isquémico muerto, y es inevitable el reemplazo del tejido funcional muerto por tejido no funcional como son los fibroblastos no contráctiles. Además, en el caso de las células madre de origen embrionario, existe un serio problema de histocompatibilidad, ya que es evidente que no hay dos embriones iguales, y menos los que se quiere utilizar para la terapia, que serán aquellos desechados para fertilización, de lo que surge otro gran problema ético-moral.

Es necesario, por tanto, desarrollar un método de aislamiento de poblaciones celulares adultas, que posean las características adecuadas para la regeneración tisular, y particularmente, que sean capaces de secretar factores de crecimiento y citoquinas que son capaces de proteger el miocardio de daño isquémico, inhibiendo la respuesta inflamatoria que sigue a la muerte de células del miocárdio, y actuando como células madre residentes cardíacas, células progenitoras y precursoras, contribuyendo a la regeneración de las células contráctiles dañadas, y a la microvascularización.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1 . Imagen del cultivo de las células adherentes de sangre periférica: 1 a) cultivo de 15 días; 1 b) cultivo de 30 días de células periféricas adherentes; 1 c) cultivo de 60 días de las células periféricas adherentes. Figura 1 d) cultivo de células flotantes, no adherentes procedentes del seno coronario en pacientes con infarto agudo de miocardio con una temporalidad en cultivo de 15 días ; 1 e) cultivo de 30 días de células flotantes; 1 f) cultivo de 60 días de células flotantes.

Fig. 2. Imagen en detalle, de células flotantes procedentes del seno coronario formadoras de cluster de 60 días de cultivo celular (2a, 4x). En la fig. 2c) se observa la división asimétrica originando células pequeñas (40 x aumentos) y células de mayor tamaño (2b, 20 x aumentos).

Fig. 3. Imagen de un cluster celular con un tamaño de 1 00 μιτι cuya estructura morfológica ha sido preservada con el fijador Paraformaldehido al 4%. En esta figura se puede observar el aspecto esferoidal de las células que conforman la estructura.

Fig.4. Imagen de una célula cuyo tamaño celular se encuentra entre las 10-20 μιτι, prefijada con paraformaldehido y procedente de un cluster donde se muestra la morfología esferoidal .

Fig.5. Imagen de tres células con tamaño inferior a 10 μιτι. prefijadas con paraformaldehido y procedentes de un cluster celular. Fig. 6. Muestra cultivos celulares in vivo. Fig. 6a, muestra un cultivo celular en un estadio temprano del cultivo después de haber subdividido las células. En los primeros 7 días de cultivo se observan cluster formados por un número de células comprendido entre 17-20. Fig. 6b, se observa un cultivo entre los 7-15 días formado por 80-200 células, cuyo tamaño de cluster tiene un diámetro de 100 μιτι. Fig . 6c Cultivo de cluster de 15 d ías cuyo tamaño ha aumentado a las 200 μιτι. Fig6.d. Cultivo de cluster celulares entre los 15-30 días de cultivo cuyo tamaño se encuentra entre las 500 μιτι.

Fig 7. Tabla que muestra el tiempo de doblaje de las células cultivadas en 3 experimetnos independientes. En la tabla se muestran los resultados de los resgistros obtenidos entre las 0 y 48 horas de cultivo Y las 120h - 144 horas de cultivo. En la tabla se muestran los parámetros como el ratio de crecimiento= el numero de doblajes que ocurren por unidad de tiempo, la ecuación que genera el software empleado: http://www.doublinq-time.com/compute.php.

Fig. 8. Gráfica de la curva de crecimiento en relación al número de células y días de cultivo ( 0, 1 , 3, 5, 7 días de cultivo cuantificados). Los experimentos se realizaron empleando tres condiciones 1 : contaje de células cultivadas con medio de preincubacion y medio de novo, en relación 1 vol:1 vol.2: células cuantificadas pero cultivadas en medio totalmente reemplazado. 3: células cuantificadas y cultivadas en medio de preincubacion y medio de novo 2n realicen 1 vol: 2 vol. Los datos representan el promedio de 3 experimentos independientes por duplicado en cultivos celulares con una antigüedad de 5 meses de mantenimiento en incubación.

Fig .9. Gráfica de la curva de crecimiento del número de célula cuantificadas a lo largo de 30 días tomando como puntos de corte: a los 0 días, 5 , 10 , 1 5 y 30 días respectivamente. En la gráfica se muestra la media ± desviación estándar de 3 experimentos independientes en cultivos celulares tras 5 meses de mantenimiento. Fig .10. Imagen de cultivo in vivo, de células formadoras de cluster, donde las células han sido tripisinizadas y subcultivadas, se muestran los registros fotográficos a las 24, 48 y 3 días posteriores al subcultivo. Fig. 11. Imagen de células del cultivo in vivo, a los 6, 7 y 15 días post subcultivo ( figura consecutiva a la Figura 10). Fig.12. Imagen de la morfología estructural de la disposición y forma de los núcleos dulares dispuestos dentro del cluster. Se muestran en azul marcador nuclear Dapi de un cluster prefijados con paraformaldehido . Las imágenes fueron obtenidas en microscopio confocal LEICA, mod. SP5 II y se analizaron en el software Leica LAS AF (60x aumentos).

Fig. 13. Imagen de un cluster prefijado con paraformaldehido celular donde se muestra con detalle la formación de una oquedad central. Las imágenes fueron obtenidas en microscopio confocal LEICA, mod. SP5 II y se analizaron en el software Leica LAS AF (60x aumentos).

Fig. 14. Imagen del mareaje de un cluster celular previamente fijado con paraformaldehido y marcador con a) Phalloidin que tiñe filamentos de f- actina y b) Dapi como marcador nuclear. Fig.15. Imagen del mareaje realizado con phalloidin en células prefijadas con paraformaldehido. En la figura se observa el citoesqueleto marcado con pahlloidin en verde, visualizando el detalle de la oquedad ó poro encontrado en los cluster celulares. Células procedentes de cultivos celulares de 3 meses en cultivo

Fig.16. Imagen del mareaje realizado con phalloidin en céluals prefijadas con paraformaldehido donde se detalla la estructura y morfología del citosqueleto celular. Células procedentes de cultivos celulares de 3 meses en cultivo. Fig.17. Imagen del detalle de los núcleos celulares marcados con Dapi, como marcador nucelar, donde se observan los nucléos estructuralemente sin anomalías producto de necrosis celular. Células procedentes de cultivos celulares de 3 meses en cultivo. Imágenes obtenidas con microscopio Nikon model TE2000-U de fluorescencia y las imágenes se realizaron con la cámara Nikon modelo DS5MC. Fig. 18. Imagen de la superposició ( merge) del mareaje nuclear (DAPI) con el mareaje citoesquelético (Phalloidin). Las imágenes se realizaron con el microscopio Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC.

Fig.19. Mareaje con Calceína AM y se detalla en la Fig.19-1 la Imagen en 20x aumentos, del mareaje en azul : DAPI como marcador nuclear y verde: Calceina AM ( green-Calcein AM) mostrando la viabilidad celular y metabolismo activo , en cultivos de 2 meses de incubación . Fig19-2: Imagen en 4x aumentos del cultivo celular de 2 meses de incubación. Fig. 19-3 Imágenes de cultivos de 5 meses de incubación cuyo mareaje con Rojo es Calceina AM. Observándose en b) figura de microcopia en campo claro 10x aumentos, b-1 ) se muestra el mareaje con rojo Calceína AM (10x aumentos). La figura 19-3c) muestra un cluster (20x aumentos) de 5 meses de incubación. Fig. 19-4 a) muestra en campo claro un cluster celular y en detalle se muestra en luz normal a-1 ) un detalle 40x aumentos, de la región central del cluster. fig. a-2) Se observa en rojo la región central metabólicamente activa (40x aumetnos) .Las imágenes se realizaron con el microscopio Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC.

Figura 20. Imagen de una célula transfectada con p-eGFP-C1 empleando con Fugene 6 Transfection Reagent (Roche) in vivo, Fig 20.a) microscopía en campo claro con contraste de fases. Fig. 20. B) GFP señal verde fluorescente. . Las imágenes fueron obtenidas ccon microscopio invertido Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC. Fig. 21 .- Imagen de inmunofluorescencia de un clon de células, in vivo tras cuatro días en crecimiento clonal en verde se muestra el mareaje con p-eGFP- C1 (Fig 21 c) y en campo claro se observa las células in vivo. Las imágenes fueron obtenidas con microscopio invertido Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC.

Fig. 22.- Imagen de inmunofluorescencia de Bromodeoxiuridina BrdU en Rojo y en Azul el marcador nuclear Dapi. Fig 22 a) 10 x amentos cluster DAPI ; Fig.22 b) Mezcla 10x de Azul Dapi nuclear y BrdU en rojo mostrando la proliferación celular positiva.; Fig 22 c) 20 x aumentos Dapi nuclear. Fig 22 d) Mezcla de azul Dapi y rojo BrdU positiva para la proliferación celular ( 20 x aumentos) . Las imágenes se realizaron con el microscopio Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC.

Fig. 23.- Imagen de inmunofluorescencia de un mareaje con verde phalloidina mostrando en verde los filamentos de f-actina. La imágen 40 x aumentos se obtuvo empleando el microscopio invertido modelo Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC.

Fig. 24. Imagen de inmunofluorescencia mostrando en azul el macaje nuclear verde. 40x aumentos, microscopio invertido modelo Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC.

Fig 25. Imagen del Mareaje por inmunofluorescencia en 40 x aumentos del mareaje DAPI (Fig 25a), Nanog (Fig 25b). OCT3/4 (Fig 25c) y mezcla (merge) (Fig. 25d) se empleó el microscopio modelo Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC.

Fig 26. Imagen en 20 x aumentos del mareaje DAPI (Fig 26a), Nanog (Fig 26b). OCT3/4 (Fig 26c) y mezcla (merge) (Fig. 26d) se empleó el microscopio modelo Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC. Fig 27. Imagen del mareaje DAPI (Fig 27a), Nanog (Fig 27b). OCT3/4 (Fig 27c) y mezcla (merge) (Fig. 27d) se empleó el microscopio confocal LEICA, mod. SP5 II y las imágenes se realizaron con el software Leica LAS AF. (20x aumentos).

Fig 28. Imagen del mareaje DAPI (Fig 28a), Nanog (Fig 28b). OCT3/4 (Fig 28c) y mezcla (merge) (Fig. 28d) se empleó el microscopio Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC

Fig 29. Imagen de Inmunoflurescencia con células fijadas en paraformaldehido al 4% En verde se observa el mareaje positivo para Ssea-4 , en rojo para Ssea-3 y en azul el marcador nuclear dapi.el microscopio confocal LEICA, mod. SP5 II y las imágenes se realizaron con el software Leica LAS AF. (20x aumentos).

Fig 30. Imagen de Inmunoflurescencia con células fijadas en paraformaldehido al 4% En verde se observa el mareaje positivo para Ssea-4 y en azul el marcador nuclear dapi. Las imágenes fueron obtenidas con el microscopio confocal LEICA, mod. SP5 II y las imágenes se realizaron con el software Leica LAS AF. (20x aumentos).

Fig. 31. Mareaje c-Kit (4a) y DAPI (4b) se empleó el microscopio Nikon model TE2000-U de fluorescencia y las imágenes se realizaron con la cámara Nikon modelo DS5MC. (20x aumentos). Fig.32 . Figura que muestra la citometría de flujo realizada en el citómetro Dako-cytomation Cyan (software Summit v3.4) empleando los marcadores de membrana y factores de transcripción: Fig. 32a) Oct3/4-FITC; Fig. 32b) Nanog- PE; Fig 32. c) CD15-PerCP; Fig 32.d) cKit-PeCY7; Fig 32.e) CD105-APC; Fig 32.f) CD90-APC; Fig 32.g) KDR-APC; Fig 32.h) CXCR4-PE; Fig 32.i) CD34- FITC. Fig.33. RT-PCR. Imagen de la expresión de genes implicados en pluripotencia: Nanog, Oct4; SSEA1 ; SOX-2, Sox-7; Brachyury; Runx-1 ; Slc; GATA-1 ; c-Myc; genes en diferenciación hacia cardiomiocito: GATA-4; Isl1 +; Mef2c; Nkx2.5; Tnl; genes implicados en neurogénesis y endodermo NeruroDI , Foxa2/HNF3 y otros genes implicados en la diferenciación del tejido endotelial o muscular liso como CXCR4, KDR y Sma. Se ha utilizado como gen constitutivo ó houskeeping el gen codificante para la b-actina.

Fig.34. qRT-PCR . Gráfico del incremento de la expresión relativa (ddCt) de los genes obtenidos de la cuantificación a través de qRT-PCR comparando la expresión génica de células formadoras de cluster del seno coronario y las células de sangre periférica. Los datos han sido relativizados utilizando como calibrador la muestra sangre periférica. El gen houskeeping utilizado para la normalización de los datos ha sido b-actina.

Fig. 35. Ensayo de angiogénesis (BD matrigel-angiogénsis assay) donde se comparan las células endoteliales adherentes procedentes de sangre periférica (35a, 35b, 35c, 35d) y las células flotantes procedentes del seno coronario (35e, 35f, 35g, 35h). La fig. 35a) muestra la morfología adherente de las células de sangre periférica cultivadas adherentes; utilizadas en el ensayo la fig. 35b) muestra las células de sangre periférica en el sistema de matrigel- angiogénesis marcadas con verde Calceina AM (Sigma Aldrich) un marcador de viabilidad celular positivo La figura 35d) muestra la sangre periférica tras 5 días de cultivo. La fig. 35g) muestra las células flotantes del seno coronario en el sistema de matrigel/angiogénesis (BD bioscience) marcadas con verde Calceina AM (Sigma Aldrich) tras 5 días de cultivo. La figura 35d) muestra la formación de estructuras vasculares tras 15 días de cultivo, típica de células endoteliales, de la sangre periférica sin embargo, en comparación con las células de la sangre periférica (fig. 35d), la fig. 35h muestra como tras 15 días en condiciones inducidas de angiogénesis, las células del seno coronario mantienen su estructura de cluster no observándose un compromiso celular aparente de formar una estructura vascular como ocurre en las células de sangre periférica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado la metodología apropiada para aislar y cultivar células con características de células embrionarias expresando factores de transcripción pluripotentes específicos de células embrionarias, como son Nanog u Oct3/4 y en ciertas poblaciones además otros como SSEA-1 o cMyc (Belmonte et al., 2009. Nat Rev Genet. 10: 878-883. 9; Kalmar 2009. PLoS Biol. 7: e1000149). Estas células se han obtenido de tejido adulto maduro, no de tejido embrionario, y se localizan en la sangre que drena del corazón procedente del seno coronario, y no en el nicho cardiaco como las células progenitoras residentes cardiacas descritas hasta la fecha (Urbanek 2006. Nati Acad Sci U S A. 103: 9226-9231 ). Si bien, se han descrito células de origen embrionario en tejido cardiaco de ratón como aquellas que marcan para Isl1 +, Sca1 + (Laugwit et al., Nature. 2005; 433: 647- 653, Liang et al., 2010. Int J Cardiol. 2010; 138: 40-49) no ha sido reproducible en tejido cardiaco humano. Son células aisladas cultivadas no adherentes formadoras de clusters, procedentes del seno coronario.

Según los criterios actuales, una célula embrionaria debe de poseer la capacidad clonogénica de sudividirse o clonarse hasta 8 veces ó subcultivos. Los autores de la presente invención han podido subcultivar las células hasta 15 veces, siendo capaces de amplificar en tres días hasta 56 veces más.

En base a estos experimentos, se han desarrollado los aspectos inventivos que se explican en detalle a continuación.

CÉLULAS ADULTA AISLADAS DE SANGRE PROCEDENTE DEL SENO

CORONARIO DE UN MAMÍFERO Un primer aspecto de la invención se refiere a una célula adulta aislada que es positiva para los marcadores Nanog y Oct3/4, y negativa para los marcadores CD34, los de célula adulta endotelial CD31 , CD146, y el de célula adulta sanguínea CD45, y que no muestra la expresión del factor de transcripción de célula adulta muscular lisa Sma. Morfológicamente, las células de la invención no se encuentran adheridas sino flotando y formando clusters o agrupaciones celulares, que se propagan por saltación desprendiéndose de un "cluster madre". Estos clusters, son muy parecidos morfológicamente a los descritos por otros autores para cuerpos embrionarios o células progenitoras cardiacas o cardiosferas, mostrando además una división asimétrica de las células, por lo que se genera una célula madre (grande) y células pequeñas de menor tamaño, rodeándolas. En una realización preferida de este primer aspecto de la invención, las células aisladas están además caracterizadas por ser capaces de experimentar contracción sincrónica en cultivo con un factor adrenérgico, preferiblemente con Norepinefrina. Por tanto, preferiblemente las células de la invención son células no adherentes formadoras de cluster, procedentes del seno coronario, que muestran inmunorreacción positiva para los mareajes de citometría de flujo: Nanog+, Oct3/4+, y que sin embargo no se observa inmunorreacción para los marcadores de citometría CD34 -, CD45- , CD31 - , CD146- y Sma y se caracterizan porque son capaces de experimentar contracción sincrónica en cultivo con un factor adrenérgico, preferiblemente con norepinefrina. En el contexto de la presente invención, se entiende por factor adrenérgico toda sustancia que ejerce efectos similares o idénticos a los de la epinefrina (adrenalina).

Las célula adultas aisladas del primer aspecto de la invención, además son positivas para el marcador Sox2. Por tanto, en una realización preferida, la célula aislada adulta, esto es, las células cultivadas no adherentes formadoras de clusters procedentes del seno coronario, además muestran la expresión positiva natural de Sox2.

Las célula adultas aisladas del primer aspecto de la invención, además son positivas para los marcadores CD90 y CD105. Por tanto, en una realización preferida, la célula aislada adulta, esto es, las células cultivadas no adherentes formadoras de clusters procedentes del seno coronario, además muestran la expresión positiva natural de CD90 y CD105. En otra realización preferida, la célula adulta aislada del primer aspecto de la invención además expresa naturalmente los factores de transcripción IsM , NeuroDI y Foxa2.

En otra realización más preferida, la célula de la invención además muestra inmunorreaccion positiva a los marcadores CD1 17 (c-kit), Sox7 y Runxl . En otra realización aún más preferida, la célula del primer aspecto de la invención además muestra inmunorreaccion positiva para CXCR4 y CD15(SSEA1 ), y expresa naturalmente los factores de transcripción SSEA4 y cMyc. En una realización todavía más preferida de la invención, la célula del primer aspecto de la invención además expresa los factores de transcripción CD133(Propina 1 ), KDR, GATA4, Mef2c, Tnl y NKx2.5.

Un segundo aspecto de la invención, se refiere a una célula adulta aislada que es positiva (muestra inmunorreaccion positiva para los marcadores de citometría de flujo) para los marcadores: Nanog, Oct3/4, CD15 (SSEA1 ), CD133 (Propina 1 ), y negativa para los marcadores CD34, los de célula adulta endotelial CD31 , CD146, y el de célula adulta sanguínea CD45. Tal como sucedía en el primer aspecto de la invención, las células no se encuentran adheridas sino flotando y formando clusters o agrupaciones celulares, que se propagan por saltación desprendiéndose de un "cluster madre". Estos clusters, son morfológicamente muy parecidos a los descritos por otros autores para cuerpos embrionarios o células progenitoras cardiacas o cardiosferas, mostrando además una división asimétrica de las células, por lo que se genera una célula madre (grande) y células pequeñas de menor tamaño, rodeándolas. Por tanto, preferiblemente las células del segundo aspecto de la invención son células no adherentes. Las células cultivadas no adherentes formadoras de cluster procedentes del seno coronario del segundo aspecto de la invención muestran, por tanto, inmunorreaccion positiva para los mareajes de citometría de flujo: Nanog+, Oct3/4+, CD15 (SSEA1 )+, CD133+, sin embargo no se observa inmunorreaccion para los marcadores de citometría CD34 -, CD45- , CD31 - , CD146-

Las células adultas aisladas del segundo aspecto de la invención, además expresan naturalmente los factores de transcripción: SSEA4, Sox2, Sox7, Brachyury, Runxl , Slc, cMyc no observándose expresión génica de los genes que transcriben para tejido muscular liso: Sma. Por tanto, en una realización preferida, la célula aislada adulta, esto es, las células cultivadas no adherentes formadoras de clusters procedentes del seno coronario, muestran la expresión positiva natural de los factores de transcripción: Nanog, Oct3/4, CD15 (SSEA1 )+, CD133+, SSEA4, Sox2, Sox7, Brachyury, Runxl , Slc, cMyc y no muestra la expresión del factor de transcripción de célula adulta muscular lisa Sma ni se observa inmunorreaccion para los marcadores de citometría CD34 -, CD45- , CD31 - , CD146-.

En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención, la célula adulta aislada del segundo aspecto de la invención además expresa naturalmente el factor de transcripción NeuroDI y Foxa2.

En otra realización más preferida del segundo aspecto de la invención, la célula de la invención además muestra inmunorreaccion positiva los marcadores CD90, CD105, CXCR4 y KDR. En otra realización aún más preferida, la célula del segundo aspecto de la invención además muestra inmunorreaccion positiva para el marcador CD1 17 (c-kit), y expresa naturalmente el factor de transcripción IsM . En una realización todavía más preferida de la invención, la célula del segundo aspecto de la invención además expresa los factores de transcripción GATA4, Mef2c, Tnl y NKx2.5.

Estas células, tanto las del primer como las del segundo aspecto de la invención, aunque son células adultas, esto es, no se han obtenido de un embrión sino de tejido post-natal y adulto, expresan naturalmente una serie de marcadores bioquímicos a nivel de mRNA y de proteína, muchos de los cuales han sido asociados previamente con capacidad de pluripotencia, e incluso han mostrado capacidad de conferir totipotencia cuando son transfectados a fibroblastos adultos somáticos, como son Oct4, Sox2 y c-Myc (Takahashi et al., Cell 2007, 131 pg.1 -12). Las células también expresan Nanog, que es uno de los genes mejor estudiados que contribuyen al estado multipotente. Por tanto, las células de cualquiera de los aspectos de la presente invención, a pesar de estar presentes en el tejido post-natal y adulto, poseen muchas de las características bioquímicas que se asocian clásicamente con las células madre embrionarias. Es decir, la presencia de factores de transcripción en una célula indica que las células tienen el potencial de diferenciarse en otros tipos celulares, cuando se crecen en un medio de cultivo específico de esos otros tipos celulares, esto es, son células madre adultas.

El término "célula madre adulta" significa que la célula madre es aislada de un tejido o un órgano de un animal en un estado de crecimiento posterior al estado embrionario. Preferiblemente, las células madre de la invención han sido aisladas en un estado post-natal. Preferiblemente han sido aisladas de un mamífero, y más preferiblemente de un humano, incluyendo neonatos, juveniles, adolescentes y adultos.

Las células adultas aisladas de la invención también se caracterizan por no expresar naturalmente una serie de marcadores (CD34, CD31 , CD146, CD45), principalmente asociados con diferenciación celular.

En la presente invención se entiende por "marcador" a una proteína que distingue una célula (o grupo de células) de otra célula (o grupo de células). Por ejemplo, una proteína que se expresa en la superficie de células precursoras pero no en otras células de una población celular actúa como proteína marcadora para las células precursoras.

Las células de la invención son positivas para ciertos marcadores fenotípicos y negativos para otros. "Positivo" significa que la célula expresa el marcador. Para considerar que el marcador es expresado, debe estar presente a un "nivel detectable". En esta memoria, por "nivel detectable" se entiende que el marcador pede detectarse por uno de las metodologías estándar, tales como PCR, blotting o FACS. Se considera que un gen es expresado por una célula de la invención si puede ser razonablemente detectada tras 20 ciclos, preferiblemente 25 ciclos, y más preferiblemente 30 ciclos de PCR, que corresponde a un nivel de expresión en la célula de al menos 100 copias por célula. Se considera que un marcador no es expresado por una célula de la invención, si la expresión no puede ser detectada a un nivel de alrededor de 10 - 20 copias por célula. Entre estos niveles de positivo/negativo, la célula puede ser débilmente positiva para un determinado marcador. El término "expresión natural", o "expresa naturalmente" significa que las células no han sido manipuladas por tecnología recombinante, de ninguna forma, Esto es, por ejemplo, que las células no han sido inducidas artificialmente a expresar estos marcadores o a modular la expresión de estos marcadores mediante la introducción en las células de material exógeno, como la introducción de promotores heterólogos, u otras secuencias unidas operativamente a cualquiera de los genes endógenos, o mediante la introducción de genes exógenos.

Más preferentemente, la célula adulta aislada de cualquiera de los aspectos de la invención se obtiene de sangre procedente del seno coronario de un sujeto, preferiblemente un mamífero, o de sus hemoderivados. En otra realización más preferida, el mamífero presenta una afección cardíaca. En otra realización más preferida, la afección cardíaca es una cardiopatía isquémica (Ischemic heart disease -IHD-) o una insuficiencia cardiaca. En otra realización aún más preferida, la afección cardíaca es el síndrome coronario agudo, y más preferiblemente, el síndrome coronario agudo con elevación di segmento ST (IAM).

El término "sujeto" incluye a cualquier animal, en particular, animales vertebrados, preferentemente mamíferos, tales como ratones, ratas, caballos, cerdos, conejos, gatos, ovejas, perros, vacas, seres humanos, etc. El término mamífero, tal como se entiende en esta memoria, hace referencia a cualquier organismo del superreino Eukaryota, reino Metazoa, Phylum Chordata, clase Mammalia. Así, la sangre puede obtenerse del seno coronario de ratón, rata, cerdo y humano. En otra realización aún más preferida, el mamífero es el ser humano.

En la literatura actual, sólo las células embrionarias o derivadas de líneas embrionarias como son las células Isl1 +, Sca1 + de ratón, son capaces de latir espontáneamente. Sin embargo actualmente, no se describe ninguna especie celular de tejido adulto, que tenga la capacidad de latir, sin inducciones. En todo caso, para que una célula experimente la contracción o el latido, se necesitan cultivos de células embrionarias o iPS con 5-Azitidina (Nelson et al., 2009. Circulation 1 20: 408-416, Deng 2010. EMBO Rep. 1 1 : 161 -165) durante cuatro o cinco semanas de tratamiento. Sin embargo, en las células progenitoras mesenquimales, sólo se ha observado a microscopía de fluorescencia filamentos de miosina o troponina I cardiaca, pero no el latido celular (Toma et al., 2002. Circulation 105:93-8; Peran et al., 2010. Cytotherapy). Otro mecanismo de diferenciación es mediante el co-cultivo con cardiomiocitos fetales de rata, siendo criticado por diversos autores por considerarlo una fusión y no una diferenciación, (Quaini et al.. 2002. N EngI J Med. 346: 5-15.). Recientemente se ha conseguido mediante ondas de baja frecuencia estimular la contracción en células progenitoras cardiacas (Gaetani et al., 2009. Cardiovascular research. 82:41 1 -20 ). Sin embargo, los autores de la presente invención han comprobado que las células de cualquiera de los aspectos de la invención eran capaces de contraerse sincrónicamente (cada 3 segundos) tras 12 horas en cultivo con Noerepinefrina, con un amplio periodo refractario, probablemente por la carencia de ATP y Calcio en el medio, que son dos moléculas implicadas directamente en la contracción y que no emplearon, ya que querían ver si surgía la contracción espontánea. Por tanto, en otra realización preferida, la célula de cualquiera de los aspectos de la invención además presenta la capacidad de contraerse sincrónicamente en un medio con norepinefrina o cualquier otro factor adrenérgico.

Si se desea, la célula de cualquiera de los aspectos de la invención puede ser modificada genéticamente por cualquier método convencional incluyendo, a modo ilustrativo, no limitativo, procesos de transgénesis, deleciones o inserciones en su genoma que modifiquen la expresión de genes que sean importantes para sus propiedades básicas (proliferación, migración, diferenciación, etc.), o mediante la inserción de secuencias de nucleótidos que codifiquen proteínas de interés como, por ejemplo, proteínas con propiedades terapéuticas. Por tanto, en otra realización preferida, la célula de cualquiera de los aspectos de la invención ha sido modificada genéticamente.

Como se ha dicho anteriormente, la progenie de una sola célula clonal puede expandirse mediante numerosos pases, sin aparentemente sufrir ninguna anormalidad cromosómica, o la pérdida de sus propiedades de crecimiento y diferenciación.

Por tanto, si se desea, las células de cualquiera de los aspectos de la invención pueden expandirse clonalmente usando un procedimiento adecuado para clonar poblaciones celulares. Por ejemplo, una población proliferada de células puede recogerse físicamente y sembrarse en una placa separada (o los pocilios de una placa "multi-pocillo"). Otra opción es que la células pueden subclonarse en una placa "multi-pocillo" en una relación estadística para facilitar la operación de colocar una única célula en cada pocilio (por ejemplo, desde aproximadamente 0,1 a cerca de una célula/pocilio o incluso de unas 0,25 a 0,5 células/pocilio, como por ejemplo 0,5 células/pocilio). Por supuesto, las células pueden clonarse a baja densidad (por ejemplo, en una placa de Petri u otro sustrato adecuado) y aislarlas de otras células usando dispositivos tales como anillos de clonación. La producción de una población clonal puede expandirse en cualquier medio de cultivo adecuado. En cualquier caso, las células aisladas pueden cultivarse hasta un punto adecuado cuando su fenotipo de desarrollo pueda evaluarse. Otro aspecto de la invención se refiere a una población celular aislada, de ahora en adelante población celular de la invención, que comprende al menos una célula adulta de cualquiera de los aspectos de la invención. En una realización preferida la población celular de la invención comprende al menos un 20%, preferiblemente un 40%, y aún más preferiblemente un 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, o un 99% de células adultas de la invención.

La población celular de la invención es positiva para un determinado marcador si, al menos, el 20% de las células de la población muestra una expresión detectable del marcador, preferiblemente del 70%, 80%, 90%, 95%, y mucho más preferiblemente, del 98%. A veces, el 99% o el 100% de las células de la invención muestran una expresión detectable del marcador. Como en el caso de las células, la expresión puede ser detectada, por ejemplo pero sin limitarse, mediante técnicas de PCR, usando FACS (fluorescence activated cell sorting), o mediante inmunohistoquímica empleando anticuerpos específicos.

El término "aislada" indica que la célula o la población celular de la invención a la que se refiere, no se encuentran en su ambiente natural. Esto es, la célula o la población celular ha sido separada de su tejido circundante. Particularmente significa que dicha célula o la población celular está sustancialmente exenta (libre) de otras células normalmente presentes en la sangre, o en un hemoderivado de la misma, de un sujeto del que se haya extraído la sangre para el aislamiento de dicha célula o la población celular. En general, una célula procedente de sangre, o de un hemoderivado de la misma, está esencialmente libre de otras células presentes normalmente en dicha sangre o hemoderivado de la misma cuando se separa de, al menos, el 60%, preferentemente de al menos el 80%, preferentemente de, al menos, el 90%, más preferentemente de, al menos, el 95%, aún más preferentemente de, al menos, el 96%, 97%, 98% o incluso 99%, de otras células presentes normalmente en dicha sangre o hemoderivado de la misma.

También se refiere a las células o poblaciones celulares que han sido aisladas del organismo en el que se originan. El término también incluye células que han sido aisladas de un organismo y re-introducidas en el mismo organismo, o en otro.

En otra realización preferida, la población celular de cualquiera de los aspectos de la invención es obtenible por un método que comprende:

a. obtener una muestra de sangre del seno coronario de un mamífero,

b. aislar las células de la muestra de sangre del paso (a),

Preferiblemente, el método además comprende

c. purificar las células aisladas de (b)

Más preferiblemente, además comprende:

d. cultivar las células purificadas del paso (c), hasta que se generen células flotantes,

e. subcultivar las células flotantes del paso (d),

Aún más preferiblemente, además comprende:

f. mantenerlas en cultivo hasta su confluencia y subcultivarlas nuevamente.

Preferiblemente, la muestra de sangre del seno coronario el paso (a) se diluye, en una proporción aproximada de 1 : 6 en una solución de PBS al 5% de FBS y 1 % de antibióticos. En otra realización preferida, la muestra diluida del paso (a) se centrifuga con Ficoll. En otra realización preferida, posteriormente a la centrifugación, se lavan las células mononucleadas con PBS al 5% de FBS y al 1 % de antibiótico mediante centrifugación. En otra realización preferida, posteriormente al lavado, se re-suspenden las células en FBS y EBM-2G. En otra realización preferida, las células re-suspendidas se siembran en pocilios con 1 ml de medio EBM-2G. Más preferiblemente, al 7^o día de incubación se recoge la fase sobrenadante donde se encuentran las células flotantes, y se incuban en un nuevo plato de cultivo con un medio que comprende DMEM y HamF12 en proporción 4:6, FBS, antibiótico, hidrocortisona, EFG, FGF-B, IGF- 1 , glutamina, Hepes 1 M y ácido ascórbico, en placas recubiertas con fibronectina. Más preferiblemente, al 12° día se subdividen las células en placas tratadas con fibronectina. Aún más preferiblemente, se realizan, al menos, 8 subcultivos de las células en placas tratadas con fibronectina.

En esta memoria se entiende por Nanog un factor de transcripción de pluripotencia (Kalmar et al., 2009. PLoS Biol. Jul;7(7):e1000149. Epub 2009 Jul 7; Pan & Thomson 2007. Cell Res. Jan;17(1 ):42-9). También se denomina hNanog; homeobox protein NANOG; homeobox transcription factor Nanog. El gen humano se encuentra en el cromosoma 12 (12p13.31 ), y su secuencia se encuentra recogida en el GeneBank NP_079141 .2 NM_024865.2 (mRNA)

En esta memoria se entiende por Oct3/4 un factor de transcripción de pluripotencia (Kim et al., 2009. Cell. Feb 6;136(3):41 1 -9), también denominado como POU5F1 , OTTHUMP00000221 150; OTTHUMP00000221 151 ; POU domain, class 5, transcription factor 1 ; POU-type homeodomain-containing DNA-binding protein; octamer-binding protein 3; octamer-binding protein 4; octamer-binding transcription factor 3; octamer-binding transcription factor-3. El gen humano se encuentra en el cromosoma 6 (6p21 .31 ), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_976034.4 y NM_024865.2 (mRNA) En esta memoria se entiende por CD15 (Pruszak et al., 2009. Stem Cells. Dec;27(12):2928-40; Kucia et al., 2006. Leukemia. May;20(5):857-69) también denominado como FUT4, ELFT, FCT3A, FUC-TIV, FUTIV, LeX, SSEA-1 , ELAM ligand fucosyltransferase; ELAM-1 ligand fucosyltransferase; Lewis X; alpha- (1 ,3)-fucosyltransferase; fucT-IV; fucosyltransferase IV; galactoside 3-L- fucosyltransferase; stage-specific embryonic antigen 1 . El gen humano se encuentra en el cromosoma 1 1 (1 1 q21 ), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_002024.1 y NM_002033.3 (mRNA). En esta memoria se entiende por CD133 también llamado Propina 1 , MSTP061 , AC133, PROM1 , CORD12, MCDR2, PROML1 , RP41 , STGD4, ΟΤΤΉΙΙΜΡ00000217744; OTTHUMP00000217745; ΟΤΤΉΙΙΜΡ00000217746; antigen AC133; hProminin; hematopoietic stem cell antigen; prominin-1 ; prominin-like 1 ; prominin-like protein 1 . Es un marcador de célula progenitora temprano (Rufaihah et al., 2010. Regen Med. Mar;5(2):231 -44). El gen humano se encuentra en el cromosoma 1 1 (1 1 q21 ), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_002024.1 y NM_002033.3 (mRNA)

En esta memoria se entiende por CD34, un marcador hematopoyético y de célula progenitora (Aiuti et al., 1997. J.Exp.Med. 185, 1 1 1 -120). También se denomina RP1 1 -328D5.2, CD34 antigen; hematopoietic progenitor cell antigen CD34. El gen humano se encuentra en el cromosoma 1 (1 q32), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_001020280.1 y NC_000001 .10 (mRNA).

En esta memoria se entiende como CD31 un marcador de célula endotelial (Pfister et al., 2005. Circ.Res. 97, 52-61 ). También se denomina PECAM1 , FLJ34100, FLJ58394, PECAM-1 , CD31 antigen; CD31 /EndoCAM; GPIIA'; PECA1 ; PECAM-1 , CD31 /EndoCAM; adhesión molecule; endoCAM; platelet endothelial cell adhesión molecule. El gen humano se encuentra en el cromosoma 17 (17q23), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_000433.3 y NM_000442.3 (mRNA). En esta memoria se entiende como CD146 un marcador de célula endotelial diferenciada (Kebir et al., 2010. Circ Res. Jul 9;107(1 ):66-75). También se denomina MCAM (melanoma cell adhesión molecule), Gicerin; S-endo 1 endothelial-associated antigen; cell surface glycoprotein MUC18; cell surface glycoprotein P1 H12; melanoma adhesión molecule; melanoma-associated antigen A32; melanoma-associated antigen MUC18. El gen humano se encuentra en el cromosoma 1 1 (1 1 q23.3), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_006491 .2 y NM_006500.2 (mRNA).

En esta memoria se entiende como CD45 un marcador hematopoyético y de linfocito (Timmermans et al., 2007. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27, 1572- 1579; Reyes et ai, 2002.. J. Clin. Invest. 1 09, 337-346). También se denomina PTPRC (protein tyrosine phosphatase, receptor type, C), RP1 1 -553K8.4, B220, CD45, CD45R, GP180, LCA, LY5, T200, CD45 antigen; L-CA; OTTHUMP00000033816; OTTHUMP00000038575; T200 glycoprotein; T200 leukocyte common antigen; glycoprotein; leukocyte common antigen; leukocyte- common antigen; protein tyrosine phosphatase, receptor type, c polypeptide; receptor-type tyrosine-protein phosphatase C. El gen humano se encuentra en el cromosoma 1 (1 q31 -q32), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_563580.1 y NM_080923.2 (mRNA).

En esta memoria se entiende como SSEA-4 el marcador celular originariamente descrito como: Stage-specific embryonic antigen-4. Es un marcador de la superficie de las células embrionarias, sólo expresándose en estadios embrionarios y en concreto en el estado de mórula en la división 2-8 y estadios de preimplante del embrión (Draper et al., 2002, J Anat. Mar (Pt 3):249-58; Rao et al., 2007. Methods Mol Biol. 407:51 -61 ). También se denomina MSGb5 (Monosialosyl globopentaosylceramide), SIAT4B; ST3GALII; Gal-NAc6S; ST3GalA.2; ST3GAL2. (Saito et al., 2003. J Biol Chem. Jul 18;278(29):26474-9). En el gen humano se encuentra en el cromosoma 16 (16q22.1 ), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NM_006927.3 mRNA).

En esta memoria se entiende como Sox2 un factor de transcripción de pluripotencia (Kashyap et al., 2009. Stem Cells Dev. Sep;18(7):1093-108). También se denomina SRY (sex determining región Y)-box 2, NOP3, MCOPS3, MGC2413, SRY-related HMG-box gene 2; transcription factor SOX-2; transcription factor SOX2. El gen humano se encuentra en el cromosoma 3(3q26.3-q27), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_003097.1 y NM_003106.2 (mRNA).

En esta memoria se entiende como Sox7 un factor de transcripción implicado en el desarrollo embrionario y en el destino celular. También se denomina SRY (sex determining región Y)-box 7, MGC10895, SOX7 transcription factor; transcription factor SOX-7. El gen humano se encuentra en el cromosoma 8, y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_1 13627.1 y NM_031439.2 (mRNA).

En esta memoria se entiende como Brachyury un factor de transcripción de la familia de los T-box que regula el desarrollo del mesodermo temprano controla procesos tan importantes como la determinación del eje izquierdo y derecho del cuerpo. (Wardle & Papaioannou, 2008. Curr Opin Genet Dev. 2008 Oct;18 (5):418-25. Epub 2008 Sep 7). También se denomina RP1 1 -459F1 .1 , MGC104817, TFT, OTTHUMP00000017588; T brachyury homolog; brachyury protein; protein T. En el gen humano se encuentra en el cromosoma 6(6q27), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_033335.1 y NM_009309.2 (mRNA)

En esta memoria se entiende como Runxl un factor de transcripción perteneciente a los genes box Run que se relaciona con procesos de desarrollo (Coffman 2003. Cell Biol Int. 27(4):315-24). También se denomina AML1 , AML1 -EVI-1 , AMLCR1 , CBFA2, EVI-1 , PEBP2aB, ML1 -EVI-1 fusión protein; CBF-alpha-2; OTTHUMP00000108697; OTTHUMP00000108700; OTTHUMP00000108702; PEA2-alpha B; PEBP2-alpha B; SL3-3 enhancer factor 1 alpha B subunit; SL3/AKV core-binding factor alpha B subunit; acute myeloid leukemia 1 protein; amll oncogene; core-binding factor subunit alpha- 2; core-binding factor, runt domain, alpha subunit 2; oncogene AML-1 ; polyomavirus enhancer-binding protein 2 alpha B subunit. El gen humano se encuentra en el cromosoma 21 (21 q22.3), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_001 1 16079.1 y NM_001 122607.1 (mRNA).

En esta memoria se entiende como Slc uno de los genes del cluster de la familia de citoquinas CC, involucrada en procesos inflamatorios e inmunoregulatorios. También se denomina CCL21 (chemokine (C-C motif) ligand 21 ), RP1 1 -195F19.22-001 , 6Ckine, CKb9, ECL, MGC34555, SCYA21 , SLC, TCA4, C-C motif chemokine 21 ; Efficient Chemoattractant for Lymphocytes; OTTHUMP00000021303; beta chemokine exodus-2; beta- chemokine exodus-2; exodus-2; secondary lymphoid tissue chemokine; secondary lymphoid-tissue chemokine; small inducible cytokine subfamily A (Cys-Cys), member 21 ; small-inducible cytokine A21 . El gen humano se encuentra en el cromosoma 9(9p13), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_002980.1 y NM_002989.2 (mRNA)

En esta memoria se entiende cMyc como un factor de transcripción regulador de diferenciación hacia cardiomiocito (Conacci-Sorrell et al., 2010. Cell. Aug 6;142(3):480-93; So et al., 2010. Int J Cardiol. Sep 24; Nelson et al., 2009. Clin. Transí Sci. Apr;2(2):1 18-26). También se denomina MRTL, bHLHe39, c-Myc. El gen humano se encuentra en el cromosoma 8 (8q24.21 ) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_002458.2 y NM_002467.4 (mRNA).

En esta memoria se entiende Sma un marcador de célula muscular lisa (Coco et al., 2009. Am J Surg Pathol. Dec;33 (12): 1795-80). También se denomina ACTG2, ACT, ACTA3, ACTE, ACTL3, ACTSG, OTTHUMP00000202509; actin, gamma-enteric smooth muscle; actin-like protein; alpha-actin 3; alpha-actin-3; gamma-2-actin; smooth muscle gamma actin; smooth muscle gamma-actin. En el gen humano se encuentra en el cromosoma 2 (2p13.1 ) su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_001606.1 y NM_001615.3 (mRNA).

En esta memoria se entiende NeuroDI como un factor de transcripción implicado en el desarrollo del endodermo así como la neurogénesis. (Lee et al., 1995. Science May 12;268 (5212):836-44). También se denomina neurogenic differentiation 1 , BETA2; BHF-1 ; MODY6; NEUROD1 ; bHLHa3. El gen humano se encuentra en el cromosoma 2 (2q32) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_002491 .2 y NM_002500.2 (mRNA).

En esta memoria se entiende como FOXA2 ó HNF-3-beta2 -3 factor 3 beta 2 hepático nuclear como un factor de transcripción implicado en el desarrollo del endodermo, así como sus tejidos derivados, pulmón, páncreas, e hígado y neurogénesis. (Lee CS, Sund NJ, Behr R, Herrera PL, Kaestner KH. Foxa2 is required for the differentiation of pancreatic alpha-cells. Dev Biol. 2005 Feb 15;278(2):484-95.) También se denomina RP23-207P16.2, HNF3-beta, HNF3beta, Hnf-3b, Hnf3b, Tcf-3b, Tcf3b . El gen humano se encuentra en el cromosoma 20 y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NC_000020.10 NT_01 1387.8 (mRNA).

En esta memoria se entiende CD90 un marcador de célula mesenquimal y del tipo celular cardiac derived stem cells (Ricke et al., 2010. Cell Mol Life Sci. Jun 18; Davis et al., 2009. PLoS One. Sep 25;4(9):e7195; Smith et al., 2007. Circulation. 1 15, 896-908. También se denomina THY1 (Thy-1 cell surface antigen), FLJ33325, CDw90; Thy-1 T-cell antigen; thy-1 antigen; thy-1 membrane glycoprotein. El gen humano se encuentra en el cromosoma 1 1 (1 1 q23.3) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_006279.2 y NM_006288.3 (mRNA) En esta memoria se entiende CD105 ó también llamado endoglina 1 , un marcador de células mesenquimal y de médula ósea mesenquimal y del tipo celular cardiac derived stem cells (Bayes-Genis et al., 2009. Ann N YAcad Sci. Sep;1 176:1 18-23; Smith et ai, 2007. Circulation. 1 15, 896-908).También se denomina RP1 1 -228B15.2, CD105, END, FLJ41744, HHT1 , ORW, ORW1 . El gen humano se encuentra en el cromosoma 1 1 (1 1 q23.3) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_001 108225.1 y NM_001 1 14753.1 (mRNA) para la isoforma 1 , y NP_000109.1 y NM_0001 18.2 (mRNA) para la isoforma 2.

En esta memoria se entiende CXCR4 (chemokine (C-X-C motif) receptor 4), un marcador de células madre y receptor de la chemoquina SDF-1 (Penn 2009. Circ.Res. 104, 1 133-1 135; Wojakowski et al., 2006. Eur.Heart J., 27, 283-289). El gen humano se encuentra en el cromosoma 9 y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_000109.1 y NM_0001 18.2 (mRNA)

En esta memoria se entiende KDR (kinase inserí domain receptor) un receptor de tirosin quinasa de tipo I II (Yang et al., 2008. Nature May 22;453(7194):524- 8). También se llama CD309, FLK1 , VEGFR, VEGFR2, fetal liver kinase 1 ; fetal liver kinase-1 ; protein-tyrosine kinase receptor Flk-1 ; soluble VEGFR2; tyrosine kinase growth factor receptor; vascular endothelial growth factor receptor 2. El gen humano se encuentra en el cromosoma 4 (4q1 1 -q12) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_002244.1 y NM_002253.2 (mRNA)

En esta memoria se entiende CD1 17 (v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog), un marcador de cardiac stem cells, cardiosferas, resident cardiac stem cells (Zamba et al., 2010. Circulation. May 1 1 ;121 (18):1992-2000. Epub 2010 Apr 26; Xaymardan et al., 2009. Stem Cells. Aug;27(8):191 1 -20; Miyamoto et al., 2010. Stem Cells Dev. Jan;19(1 ):105-16. PubMed PMID: 19580375; Barile et al., 2007. Prog Cardiovasc Dis. 2007 Jul- Aug;50(1 ):31 -48; Tallini et al., 2009. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 106, 1808- 1813). También se llama C-Kit, CD1 17, PBT, SCFR, mast/stem cell growth factor receptor; proto-oncogene c-Kit; proto-oncogene tyrosine-protein kinase Kit; soluble KIT variant 1 ; tyrosine-protein kinase Kit; v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene-like protein. El gen humano se encuentra en el cromosoma 4 (4q1 1 -q12) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_001087241 .1 y NM_001093772.1 (mRNA)

En esta memoria se entiende por Isl1 como un factor de transcripción homeobox implicado en la diferenciación hacia las células que conforman el corazón (Bu et al., 2009 Nature. Jul 2;460(7251 ):1 13-7; Laugwitz et al., 2005. Nature. 433, 647-653; Moretti et al., 2007. Cell Mol. Life Sci. 64, 674-682). También se denomina ISL1 transcription factor, LIM/homeodomain; OTTHUMP00000221834; insulin gene enhancer protein ISL-1; islet-1. El gen humano se encuentra en el cromosoma 5 (5q1 1 .1 ), y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_002193.2 y NM_002202.2 (mRNA)

En esta memoria se entiende GATA4 (GATA binding protein 4) un factor de transcripción que regula la expresión de los genes implicados en el desarrollo del corazón. (Durocher et al., 1997. EMBO J. 16: 5687-5696). También se llama MGC126629, GATA-binding factor 4; GATA-binding protein 4; transcription factor GATA-4. El gen humano se encuentra en el cromosoma 8 (8p23.1 -p22) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_002043.2 y NM_002052.3 (mRNA)

En esta memoria se entiende Mef2c (myocyte enhancer factor 2C) como un factor de transcripción implicado en la miogénesis (McDermott et al., 1993. Molec. Cell. Biol. 13: 2564-2577). También se llama C5DELq14.3; DEL5q14.3. El gen humano se encuentra en el cromosoma 13 (13 45.0 cM) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_079558.1 y NM_025282.3 (mRNA).

En esta memoria se entiende por NKx2.5 un marcador de linaje cardiomiocitario (Prall et ai, 2007. Cell. Mar9;128(5):947-59). También se llama CHNG5, CSX, CSX1 , FLJ52202, FLJ97166, FLJ97195, FLJ97197, FLJ99536, NKX2.5, NKX2E, NKX4-1 , cardiac-specific homeobox 1 ; homeobox protein CSX; homeobox protein NK-2 homolog E; homeobox protein Nkx-2.5; tinman paralog. El gen humano se encuentra en el cromosoma 5 (5q34) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_001 159648.1 y NM_001 166176.1 (mRNA).

En esta memoria se entiende por Tnl un marcador de linaje cardiomiocitario (Homo sapiens troponin I type 3 (cardiac) (Parmacek et al., 2004 Nov- Dec;47(3):159-76; Robertson et al., J Mol Cell Cardiol. Dec;49(6):1031 -41 . Epub 2010 Aug 27). También se llama TNNI3, CMD1 FF, CMD2A, CMH7, MGC1 16817, RCM1 , TNNC1 , cTnl. El gen humano se encuentra en el cromosoma 19 (19q13.4) y su secuencia se encuentra recogida en el GenBank NP_000354.4 y NM_ NM_000363.4 (mRNA).

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición de células adultas de cualquiera de los aspectos de la invención, de ahora en adelante composición de la invención, que comprende una célula aislada ó una población aislada de la invención. Preferiblemente, las células de la composición de células adultas de la invención tiene, al menos, el 50%, al menos, el 60%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, aún más preferiblemente, el 90%, y, todavía aún más preferiblemente, el 95% de las células adultas son células adultas de la invención.

Dicha composición de células adultas de la invención puede contener un medio en el que se encuentran las células de la invención; dicho medio debe ser compatible con dichas células. Por ejemplo, pero sin limitarse a, soluciones isotónicas, opcionalmente suplementadas con suero; medios de cultivo celular o, alternativamente, un medio soporte sólido, semisólido, gelatinoso o viscoso.

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA DE LA INVENCIÓN

Las células adultas de cualquiera de los aspectos de la invención, la población celular de la invención, así como la composición de la invención, pueden formar parte de una composición farmacéutica para su administración a un sujeto. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica, de ahora en adelante composición farmacéutica de la invención, que comprende una célula adulta aislada de cualquiera de los aspectos de la invención ó una población celular de la invención. En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que debe estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense o la Farmacopea Europea, u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más concretamente en humanos.

El término "vehículo" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se deben administrar las células o la población celular de la invención o de dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención; obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con dichas células. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dicho vehículo incluyen cualquier vehículo fisiológicamente compatible, por ejemplo, soluciones isotónicas (e.g., solución salina estéril al 0,9% NaCI, solución salina tamponada con fosfatos (PBS), solución Ringer- lactato, etc.), opcionalmente suplementadas con suero, preferiblemente con suero autólogo; medios de cultivo celular (e.g., DMEM, etc.); o, alternativamente, un medio soporte sólido, semisólido, gelatinoso o viscoso, tal como colágeno, colagen-glicosamino-glicano, fibrina, cloruro de polivinilo, poliaminoácidos, tales como polilisina, o poliornitina, hidrogeles, agarosa, sulfato de dextrano silicona. Asimismo, si se desea, el medio de soporte puede, en realizaciones específicas, contener factores de crecimiento u otros agentes. Si el soporte es sólido, semisólido, o gelatinoso, las células pueden ser introducidas en una fase líquida del vehículo que es tratada posteriormente de forma tal que se convierte en una fase más sólida. La composición farmacéutica de la invención, si se desea, puede contener también, cuando sea necesario, aditivos para aumentar, controlar o dirigir de otro modo el efecto terapéutico deseado de las células, los cuales comprenden dicha composición farmacéutica, y/o sustancias auxiliares o sustancias farmacéuticamente aceptables, tales como agentes tamponantes, tensioactivos, codisolventes, conservantes, etc. También, para estabilizar la suspensión celular, es posible añadir quelantes de metales. La estabilidad de las células en el medio líquido de la composición farmacéutica de la invención puede mejorarse mediante la adición de sustancias adicionales, tales como, por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, etcétera. Dichas sustancias farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en la composición farmacéutica de la invención son conocidas, en general, por los técnicos en la materia y se usan normalmente en la elaboración de composiciones celulares. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E.W. Martin. Puede encontrarse información adicional sobre dichos vehículos en cualquier manual de tecnología farmacéutica (Farmacia Galénica).

Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio químico en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

USOS DE LAS CÉLULAS DE LA INVENCIÓN

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una célula o de una población de células de la invención, o de una composición farmacéutica de cualquiera de los aspectos de la invención, en la elaboración de un medicamento. Alternativamente, se refiere a una célula o una población de células de cualquiera de los aspectos de la invención para su uso como medicamento. Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una célula o de una población de células de cualquiera de los aspectos de la invención, o de una composición farmacéutica de la invención, en la elaboración de un medicamento para la reparación y regeneración de tejidos. Alternativamente, se refiere a una célula o una población de células de cualquiera de los aspectos de la invención para su uso en la elaboración de un medicamento para la reparación y regeneración de tejidos. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el tejido es el miocardio.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una célula o de una población de células de cualquiera de los aspectos de la invención, o de una composición farmacéutica de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Alternativamente, se refiere a una célula o una población de células de cualquiera de los aspectos de la invención para su uso en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad cardiovascular se selecciona del grupo que comprende: infarto de miocardio, hipertrofia cardiaca y arritmia cardíaca, o cualquiera de sus combinaciones. En otra realización aún más preferida, la enfermedad cardiovascular es la isquemia cardíaca.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales. En el contexto de la presente invención, la enfermedad es una enfermedad cardiovascular, y más preferiblemente es un infarto cardiaco. La composición farmacéutica de la invención contendrá una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de las células de la invención o de la población celular de la invención, preferentemente, una población celular sustancialmente homogénea, para proporcionar el efecto terapéutico deseado. Tal como se usa en la presente descripción, el término "cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva" se refiere a la cantidad de células de la invención contenida en la composición farmacéutica que es capaz de producir el efecto terapéutico deseado y, en general, se determinará, entre otros factores, por las propias características de las células y el efecto terapéutico deseado que se persigue. En general, la cantidad terapéuticamente efectiva de células de la invención que debe administrarse dependerá, entre otros factores, de las propias características del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la forma de administración, etc. Por este motivo, las dosis mencionadas en esta invención deben tenerse en cuenta sólo como guía para la persona conocedora de la técnica, que debe ajustar esta dosis dependiendo de los factores anteriormente descritos. Como ejemplo ilustrativo y no limitativo, la composición farmacéutica de la invención puede administrarse como una dosis única, que contenga aproximadamente entre 1 x10⁵ y 10x10⁶ células de la invención por kilo de peso corporal del receptor, y más preferentemente entre 5x10⁵ y 5x10⁶ células de la invención por kilo del peso corporal del receptor, en una forma de realización más preferente aún dicha composición farmacéutica contendrá aproximadamente entre 1 x10⁶ y 2x10⁶ células de la invención por kilo del peso corporal del receptor, dependiendo de los factores descritos anteriormente. La dosis de células de la invención puede repetirse, dependiendo del estado y evolución del paciente, en intervalos temporales de días, semanas o meses que debe establecer el especialista en cada caso.

La composición farmacéutica de la invención se formulará de acuerdo con la forma de administración elegida. La composición farmacéutica de la invención puede preparase en un modo de dosificación líquido o gel, por ejemplo, en forma de suspensión, para ser inyectada o perfundida al individuo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, incluyen la formulación de la composición farmacéutica de la invención en una suspensión estéril con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como una solución isotónica, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfatos (PBS), o cualquier otro vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado, para la administración a un sujeto vía parenteral, e.g., un ser humano, preferentemente vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, etc., aunque también son posibles otras rutas alternativas de administración. La administración de la composición farmacéutica de la invención al individuo se llevará a cabo por los medios convencionales. Por ejemplo, dicha composición farmacéutica se puede administrar a dicho individuo por vía intravenosa utilizando los dispositivos adecuados, tales como jeringas, catéteres (un catéter intravenoso periférico estándar, un catéter venoso central o un catéter arterial pulmonar, etc.), trocares, cánulas, etc. El flujo de las células se puede controlar por inflado y desinflado en serie de globos distales y proximales ubicados dentro de la vasculatura del paciente, creando así zonas temporales sin flujo que promueven la acción terapéutica celular. En todos los casos, la composición farmacéutica de la invención se administrará utilizando los equipos, aparatos y dispositivos adecuados a la administración de composiciones celulares y conocidos por el experto en la técnica.

Como entiende el experto en la materia, en ocasiones la administración directa de la composición farmacéutica de la invención al sitio que se pretende beneficiar puede ser ventajosa. De este modo, la administración directa de la composición farmacéutica de la invención al órgano o tejido deseado se puede lograr por administración directa (e.g., por inyección, etc.) en la superficie externa del órgano o tejido afectado por medio de inserción de un dispositivo adecuado, e.g., una cánula apropiada, por perfusión arterial o venosa (incluyendo mecanismos de flujo retrógrado) o por otros medios mencionados en esta descripción o conocidos en la técnica. La composición farmacéutica de la invención, si se desea, se puede almacenar hasta el momento de su aplicación mediante los procedimientos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. Esta composición farmacéutica también se puede almacenar junto a medicamentos adicionales, útiles en el tratamiento en enfermedades, en una forma activa que comprende una terapia combinada. Para el almacenamiento a corto plazo (menos de 6 horas), la composición farmacéutica de la invención puede almacenarse a temperatura ambiente o por debajo de ésta en un recipiente sellado complementándola o no con una solución nutriente. El almacenamiento a medio plazo (menos de 48 horas) se realiza preferentemente a 2-8°C, y la composición farmacéutica de la invención incluirá una solución iso-osmótica y tamponada en un contenedor compuesta de, o revestida de, material que previene la adhesión celular. El almacenamiento a más largo plazo se lleva a cabo preferentemente por medio de crioconservación adecuada y almacenamiento en condiciones que promueven la retención de la función celular.

La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse en una terapia combinada como se ha descrito previamente de utilidad en la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad que vaya a ser tratada. Dichos compuestos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o se pueden suministrar, de forma alternativa, en forma de una composición aparte para la administración simultánea o sucesiva (secuencial en el tiempo) con respecto a la administración de la composición farmacéutica de la invención. Otra opción es que puede mezclarse cualquiera de estos componentes en la misma composición y otros principios activos. La célula adulta aislada de la invención, o la población celular de la invención, puede ser de origen autólogo, alogénico o xenogénico. Preferiblemente, son de origen autólogo. La administración puede, así mismo, realizarse con la ayuda de un "scaffold" o andamiaje bioactivo, esto es, de una estructura de soporte que sirve para transportar las células y/o factores de crecimiento o diferenciación, y que suelen consistir en una estructura bastante rígida, cubierta o impregnada con un fármaco que ayuda a las células a establecerse y construir un tejido igual al que se desea remplazar. Diferentes scaffoid son conocidos en el estado de la técnica. Como se ha dicho previamente, si se desea, la célula adulta de la invención puede ser modificada genéticamente por cualquier método convencional incluyendo, a modo ilustrativo, no limitativo, procesos de transgénesis, deleciones o inserciones en su genoma que modifiquen la expresión de genes que sean importantes para sus propiedades básicas (proliferación, migración, transdiferenciación, etc.).

Otro aspecto de la invención se refiere a su uso en un método de screening o selección de medicamentos que comprende:

a) Poner en contacto una célula o una población de células adultas aisladas de cualquiera de los aspectos de la invención con una sustancia a testar,

b) Evaluar el efecto de dicha sustancia en el fenotipo de la célula o población de células de cualquiera de los aspectos de la invención. MÉTODO DE OBTENCIÓN DE CÉLULAS DE LA INVENCIÓN

Los autores de la invención han desarrollado también un método de aislamiento e identificación de las células y poblaciones celulares de células adultas aisladas de cualquiera de los aspectos de la invención. Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para el aislamiento de las células de cualquiera de los aspectos de la invención, a partir de sangre del seno coronario de un mamífero, o de sus hemoderivados, en adelante "método de la invención", que comprende:

a. obtener una muestra de sangre del seno coronario de un mamífero,

b. aislar las células de la muestra de sangre del paso (a), Preferiblemente, además comprende:

c. purificar las células aisladas de (b),

e. subcultivar las células flotantes del paso (d) en un medio enriquecido,

y aún más preferiblemente, comprende:

f. mantenerlas en cultivo hasta su confluencia y subcultivarlas nuevamente.

Posteriormente, las células adultas aisladas de cualquiera de los aspectos de la invención, o la población celular de la invención, puede ser identificada por cualquier método conocido en el estado de la técnica. En la presente invención, se entiende por "identificación" al proceso que permite reconocer a una célula adulta aislada de la invención presente en una muestra y distinguirla del resto de células presentes en dicha muestra.

En una realización particular, la muestra de sangre utilizada se selecciona del grupo que consiste en sangre del seno coronario de un mamífero, fresca o criopreservada, sangre movilizada fresca o criopreservada, sangre del seno coronario de un mamífero movilizada y sin movilizar obtenida por técnicas de aféresis fresca o criopreservada, fracción CD34- fresca o criopreservada obtenida de sangre del seno coronario de un mamífero movilizada, "buffy coats" (fracción de una muestra de sangre anticoagulada, después de una centrifugación en gradiente de densidad, que contiene la mayoría de los leucocitos y plaquetas) y combinaciones de las mismas.

Una vez que se ha obtenido la muestra de sangre, preferiblemente del seno coronario de un mamífero, ésta debe tratarse para aislar las células mononucleares. Cualquiera de los métodos existentes en el estado de técnica para aislar células mononucleares de sangre o de sus hemoderivados puede emplearse en la puesta en práctica de la presente invención, por ejemplo, mediante centrifugación en Ficoll-Hypaque (GE Healthcare Bio-Science), Percoll, sacarosa, etc.

Para la identificación de las células adultas aisladas de cualquiera de los aspectos de la invención se pueden emplear los marcadores descritos anteriormente. Estos marcadores son proteínas, y en algunas de ellas el marcador es un antígeno celular de superficie, de manera que pueden utilizarse anticuerpos que se enlazan con la proteína marcadora en métodos de selección celular, por ejemplo, para producir una población celular rica en células que expresan la proteína marcadora. La detección del marcador de la invención y el posterior aislamiento de las células que expresen dicho marcador, puede realizarse mediante cualquier método que permita la separación de células en función de una característica fenotípica o genotípica dada.

En los ensayos de identificación y/o aislamiento, la célula o la población celular se pone en contacto con un reactivo específico, marcado o no, en función de si el ensayo se realiza mediante un método de detección directa o indirecta, respectivamente.

El término "reactivo específico" hace referencia a un miembro de una pareja específica de unión. Como miembros de una pareja específica de unión se incluyen además de parejas de unión compuestas por antígenos y anticuerpos, parejas compuestas por antígenos MHC y receptores de células T, secuencias nucleotídicas complementarias, así como parejas de ligandos peptídicos y su receptor. Las parejas de unión específicas incluyen análogos, fragmentos y derivados de un miembro específico de la pareja de unión.

Resulta de particular interés, el uso de anticuerpos como reactivos de afinidad. La producción de anticuerpos monoclonales específicos resultará evidente para cualquier experto medio en la materia. En experimentos de identificación o separación de poblaciones celulares, se procede al mareaje de los anticuerpos. Para ello, se utilizan etiquetas que incluyen pero no se limitan a: partículas magnéticas, biotina y fluorocromos que permitirán la identificación o separación de aquel tipo celular al que se haya unido el anticuerpo. Así, por ejemplo, el análisis de la población celular mediante citometría de flujo permite utilizar en una misma muestra distintos anticuerpos marcados con fluorocromos que emiten a una longitud de onda distinta. De este modo, se puede conocer el perfil específico de la población celular para esos marcadores de superficie, así como llevar a cabo una separación por el conjunto de marcadores utilizados.

La separación de las poblaciones que presentan el fenotipo de interés se puede llevar a cabo mediante técnicas de separación por afinidad, entre las que se incluyen: separación magnética (utilizando partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos específicos), cromatografía de afinidad, agentes citotóxicos unidos a anticuerpos monoclonales o usados junto a anticuerpos monoclonales, y "panning" con el anticuerpo asociado a un soporte sólido, así como mediante otras técnicas que resulten adecuadas. Se puede btener una separación más precisa mediante citometría de flujo.

La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo de luz láser. En el análisis por citometría de flujo, se coloca a las células en presencia un compuesto que se une específicamente a dicho marcador, como por ejemplo, un anticuerpo, y en función del compuesto las células son clasificadas. Si el compuesto está marcado con fluorescencia, hablamos estrictamente de citofluorímetros de flujo, los conocidos como "citómetros" o "FACS" (por "Fluorescence Analizer Cell Sorter'). Los citómetros de flujo pueden analizar partículas en función de su fluorescencia y tamaño. Los conocidos como separadores o "sorters" pueden también purificar poblaciones en función de unas características determinadas.

En citometría de flujo, para que un marcador se considere positivo, la señal específica observada debe ser más fuerte que la intensidad de la señal de fondo, típicamente debe ser al menos un 10%, preferiblemente 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, o incluso 100% superior a la intensidad de la señal de fondo, usando métodos y aparatos convencionales. La señal de fondo se define como la intensidad de la señal dada por un anticuerpo no específico del mismo isotipo que el anticuerpo específico usado para detectar el marcador de superficie en análisis FACS convencionales.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

EJEMPLOS

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores.

Materiales y métodos

Ejemplo 1.- ESTUDIO MORFOLÓGICO IN VITRO DEL CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO DE PACIENTES CON INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO.

Los estudios in vitro del cultivo de células flotantes se obtuvieron mediante extracción de sangre procedente del seno coronario a través de cateterismo de n= 9 pacientes con síndrome coronario agudo y elevación del ST. La sangre periférica se obtuvo a través de punción venosa de los mismos pacientes. Para el aislamiento de las células se utilizó como anticoagulante la heparina (BD- Vacutainer). Las células mononucleares fueron aisladas mediante gradiente con Ficoll (Sigma-Aldrich) a 800g, 15 minutos RT. Las células fueron lavadas con PBS al 1 % de FBS. El cultivo se realizó previamente en medio EBM-2G suplementado con FGF, EGF , IGF , glucagon, anfotericina D, penicilina- streptomicina , 20% de FBS (Cambrex, Lonza) durante 7 días las células fueron incubadas a 37 °C en una atmósfera húmeda al 5% CO2. Se obtuvieron las células flotantes que fueron sembradas en HamF12: DMEM al 10% FBS, 0,01 % penicilina-streptomicina.

Ejemplo 2.- ESTUDIO DEL TAMAÑO CELULAR DE LAS CELULAS FORMADORAS DE COLONIAS.

Se realizaron fotografías in vivo para analizar el tamaño y la morfología externa de los cluster y células adhyacentes (Fig7-a-7-d). Se empleó un microscopio Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC Así mismo, se realizaron fotografías con células y cluster previamente fijados con paraformaldehido al 4% con el fin de preservar su morfología (Fig3-4). Con microscopía Normanski en microscopio Nikon modelo Eclipse E800. Ejemplo 3- ESTUDIO DE LA CAPACIDAD PROLIFERATIVA.

Las células formadoras de cluster fueron recogidas, tripsinizadas y subcultivadas durante 5 meses. Los estudios se realizaron por triplicado a los 14 pases de cultivo. Estos estudios se realizaron sembrando un total de 5.105 células por cm2 y se realizó el contaje empleando una cámara de Neubauer y el microscopio Nikon modelo TE2000-U. Se realizaron contajes de los cuatro campos en cada cuadrante se contaron los 16 cuadradros correspondientes, de los contajes totales se realizó la media aritmética. Para el contaje total se consideraron que las células fueron resuspendidas en 1 ml de medio celular y se emplearon 10μΙ de suspensión celular para la realización del contaje.

Para comprobar la capacidad proliferativa a lo largo de 30 días, en cultivos de largo periodo de incubación ( 5 meses y más de 14 pases) se realizó una siembra de un número total de células: 5.105 por cm2 en el tiempo cero t =0, posteriormente se recogieron en t= 1 : 24 horas, t=2: 48 horas, t =3 : 3 días, t=4: 6 días, t=5 : 7 días, t= 15 días, t=8 30 días de cultivo. Se realizó por triplicado. Se realizó un seguimiento fotográfico in vivo, empleando el microscopio Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC. El contaje celular en cámara de Neubauer dio lugar a una curva de crecimiento (donde se mostraron los datos medios del contaje y la desviación de la media de cada contaje) y al estudio del doubling-time.

Para el estudio del tiempo que tarda una célula en dividirse a la mitad se empleó el siguiente software gratuito obtenido de la siguiente dirección web http://mathworld.wolfram.com/LeastSquaresFittinqExponential.html abalada por las siguientes referencias bibliográficas: Roth V. 2006 <http://www.doubling-time.com/compute.php>

Weisstein, Eric W. "Least Squares Fitting— Exponential." From MathWorld— A

Wolfram Web

Para estudiar la velocidad de la proliferación celular dependiente del medio celular, se sembraron células a una concentración por pocilio de: 5.105 por cm2 realizando un contaje celular de los días 0, 1 , 3, 5 y 7. Los medios utilizados para resuspender las células variaron de la siguiente manera: se sembró un experimento donde el medio de cultivo constaba de medio "donde las células fueron pre-incubadas previamente filtrado (0,22μηη) y medio floating (Hamf12:DMEM 20% FBS) Los volúmenes utilizados fueron 1 vol:1 vol para medio de pre-cultivo y medio de reemplazo ( floating médium).

EL segundo experimento fue sembrar el mismo número de células por cm2 empleando medio floting renovado en su totalidad. Y el tercer experimento fue la siembra del mismo número de células pero reemplazando a un volumen 1 vol:3vol. Todos los experimentos se realizaron en el mismo tiempo. Se contaron el mismo día y se realizó el contaje a los 0, 1 3, 5 y 7 días de cultivo.

Ejemplo 4- ESTUDIO MORFOLÓGICO DE LAS CELULAS FORMADORAS DE COLONIAS EMPLEANDO PHALLOIDIN COMO MARCADOR DE CITOESQUELETO.

Los cluster fueron recogidos empleando una pipeta pasteur de 3ml y depositados en un tubo falcon de cuello cónico. Los clusters se lavaron dos veces con un buffer the fosfato salino atemperado, pH7.4. Los clusters se introdujeron en una solución de paraformaldehido durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron dos veces una vez realizada la tinción con Phalloidina con PBS. Los clusters se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara humedificada. Se volvieron a lavar dos veces con solución PBS y se realizó la tinción nuclear con Dapi (Sigma-Aldrich) 1 :200. Las imágenes se realizaron con el microscopio Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC.

Ejemplo 5- ESTUDIO DE LA VIABILIDAD CELULAR EN CULTIVOS DE LARGO TIEMPO (MAYORES A 5 MESES) MEDIANTE CALCEINA AM

Se emplearon cultivos celulares con células formadoras de cluster que fueron tripsinizadas (Tripsina/Edtta 1 x) durante 1 minuto en incubador celular ( 37°C, 5%CO2) y resuspendidas a una concentración de : 5.105 por cm2. Durante 7 días se realizó el seguimiento de la viabilidad celular, en cultivos de 1 mes de incubación como en cultivos de 3 meses de incubación o de 5 meses de incubación. El registro fotográfico se realizó en microscopio de fluorescencia Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC.

Ejemplo 6- ESTUDIO DE CLONOGÉNESIS EMPLEANDO BRDU

Se tomaron cluster previamente tripsinizados y se sembraron las células individualizadas en un multipocillo de 96 (in 2000 cel/well ) en medio floating: medio preincubación (1 vol: 1 vol) durante 4 días se trataron las células con BrdU ( 10μΜ) posteriormente se recogieron con una pipeta pasteur de 3 mi se centrifugaron suavemente y se mezclaron con células no tratadas con BrdU, en medio (1 vol: 1 vol, en medio floating : medio preincubación) con la finalidad de observar si se formaban agregados mixtos o se mantenía la capacidad clonogénica. Tras 15 días de incubación se realizó la inmunofluorescencia. Se fijaron los cluster con paraformaldehido al 4% durante 10 minutos, se lavó con PBS durante 10 minutos 3 veces y se incubó con HCI 4M durante 5 minutos posteriormente se realizó una permeabilización con HCI, posteriormente se bloqueó con BSA ( Sigma Aldrich) y PBS durante 20 minutos, y se lavó con PBS 3 veces, durante 2 horas se incubó el 1 ^o anticuerpo ( Becton and Dickinson, BD Ref: 555627) a una concentración de 1 : 75 , se lavó con PBS durante 10 minutos en 3 lavados sucesivo de cada uno. Se incubó durante 1 hora con el anticuerpo policlonal secundario TRIC (1 :200) y Dapi como marcador nuclear (concentración 1 :200). Se montó la inmunofluorescencia con gel montain médium y se visualizó en microscopio invertido Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC

Ejemplo 7- ESTUDIO DE CLONOGÉNESIS EMPLEANDO GFP ( p-eGFP- C1 )

Para observar el crecimiento clonal mediante el plásmido e-GFP-C1 que expresa la proteína verde fluorescente GFP. Los cluster celulares fueron disgredados con Trispina/Edta (1 x, Sigma-Aldrich) durante 1 minutos y posteriormente se lavaron las células con medio floating (DMEM: HamF12 20% FBS). Y se mantuvieron en un falcon de 15ml en el incubador celular (37°C, 5% CO2 en atmósfera húmeda) hasta el momento de su transfeccion. Se utilizó el plásmido p-eGFP-C1 (Clontech, Spain) previamente preincubado durante 30 minutos con Fugene 6 Transfection Reagent (Roche) con una relación DNA: Fugene de 3:2. Se incubaron las células con el Fugene: p-eGFP-C1 durante 1 hora en incubador para favorecer la transfeccion del plásmido y posteriormente se sembraron a una proporción de 5.105 por cm2, siendo el 50% de las células sembradas por cada pocilio las células positivamente transfectadas y el otro 50% de células no transfectadas. Las imágenes con e-GFP-C1 se obtuvieron a tiempo real in vivo tras 4 días en incubación, con microscopio invertido Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC. La proporción de células transfectadas con el plásmido GFP se visualizan como la formación de clones celulares.

Ejemplo 8- Visualización DE LA DISIÓN ASIMÉTRICA

Para poder valorar el tamaño celular se fijaron células y cluster celulares con paraformaldehido. Se emplearon cultivos de 14 pases, las cuales fueron recogidas y fijadas con paraformaldehido al 4% durante 10 minutos y lavados con PBS durante 10 minutos en tres incubaciones independientes. Posteriormente se utilizó cloruro de amonio al 50mM como neutralizador y se repitieron os lavados. Las células fijadas y resuspendidas en PBS fueron visualizadas y fotografiadas en el Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC. Para poder comprobar la integridad estructural y visualizar los cuerpos polares productos de la división asimétrica de las células típicamente stem, se realizó una fijación con Paraformaldehido al 4% posteriormente se tiñeron las células con phalloidin a una concentración 5 μΙ:200μΙ PBS posteriormente se tiñeron con Dapi para el mareaje nuclear ( 1 :200) . Las imágenes fueron obtenidas en el microscopio invertido modelo Nikon modelo TE2000-U y con cámara fría modelo Nikon DS5MC. Ejemplo 9- ESTUDIO FENOTÍPICO DEL LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO EMPLEANDO LA TÉCNICA DE BIOLOGÍA CELULAR: INMUNOFLUORESCENCIA (Oct3/4, Nanog,Ssea-1 , Ssea4, Tra81 -1 , cKit ).

Las células procedentes de sangre del seno coronario de pacientes con infarto, formadoras de cluster cultivadas en medio (DMEM: HamF12, 10%FBS), fueron recogidas en tubo falcon 15ml, se fijaron con paraformaldehido al 4% (Sigma Aldrich) durante 20 minutos, posteriormente se realizaron 3 lavados sucesivos con PBS, centrifugando las células a 400 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Las células fueron teñidas con Faloidina (Sigma Aldrich) como marcador citoplasmático (1 :50) durante 35 minutos de incubación y 15 minutos con DAPI (1 :200) como marcador nuclear. Posteriormente fueron lavadas y se montó la inmunofluorescencia con Gel Montain Médium incubándolas 30 minutos en oscuridad antes de ser visualizadas (Fig.2). Se utilizó también el marcador c-Kit (BD bioscience) como marcador de célula residente cardiaca, incubándose a una concentración 1 :10 durante 1 hora (Fig. 3). Para el mareaje de Oct3/4 y Nanog se siguieron los protocolos de manufactura de la casa comercial (BD bioscience) y tras la fijación con paraformaldehido al 4% las células fueron lavadas y fijadas con Metanol (- 20°C) durante 5 minutos, posteriormente se centrifugaron y se aspiró el sobrenadante, posteriormente se incubaron 10 minutos con Tritón x-100 (0,01 %) y se lavaron con PBS. Posteriormente las células fueron bloqueadas durante 1 hora a temperatura ambiente con BSA al 1 % y Tween20 (0,05%). Se realizó el lavado y la incubación durante 1 hora de Oct4 conjugado con FITC (1 :10) en PBS posteriormente se realizó el lavado (3 lavados con incubaciones de 10 minutos de 10 minutos en PBS 0,05% Tween20) y la incubación con Nanog conjugado con PE durante 1 hora (1 :10) y se realizó el último lavado (3 lavados con 3 incubaciones de 10 minutos en PBS 0,05% Tween20) y se montó la inmunofluorescencia con una solución gel Montain Médium (TissueTeK) durante 30 minutos permanecieron incubándose en oscuridad (Fig.4). Las imágenes fueron obtenidas en microscopio confocal LEICA, mod. SP5 II y se analizaron en el software Leica LAS AF.

Ejemplo 10.- ESTUDIO FENOTÍPICO DEL LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO EMPLEANDO LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE FLUJO

Las células fueron marcadas durante 30 minutos a temperatura ambiente con los siguientes anticuerpos conjugados: CD15-PerCeP, OCT3/4-FITC, Nanog- APC (BDbioscience), CD105-APC, CD34-FITC, CD133-PE, cKit-PeCy7, CD90- APC, CD146-FITC, CD31 -FITC, CD45-FITC, KDR-APC, CXCR4-PE (R&D Systems), se utilizaron los isotipos control negativos para cada inmunoglobulina correspondiente IgG-PerCep, IgG-FITC, IgG-APC, IgG-PE (R&Dsystems) . Para el inmnunomarcaje de Oct-4 y Nanog se siguieron los consejos de manufactura de la casa comercial BD biosystems, por lo que las células fueron fijadas en paraformaldehido durante 4 minutos, posteriormente 5 minutos de incubación con 0,1 % triton-x100, bloqueadas con BSA, PBS al 0,5% durante 1 hora. Los resultados de citometría de flujo obtenido con el citómetro Dako- cytomation Cyan (software Summit v3.4).

Ejemplo 11.- ESTUDIO FENOTÍPICO DEL LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO EMPLEANDO LA TÉCNICA DE BIOLOGÍA MOLECULAR: RT-PCR end-point y qRT-PCR a tiempo real.

El ARN total fue extraído de células flotantes humanas procedentes del seno coronario mediante el kit RNeasy total RNA (Quiagen). La cantidad y pureza de las muestras de ARN fueron realizadas en el Nanodrop (Thermo Scientific D- 1000). Sólo las muestras con un ratio 260/280 nm de 2.0 fueron aceptadas para el análisis. 2 g de muestra de ARN total se utilizaron para realizar el témplate (ADNc) utilizando la enzima reverso transcriptasa MMLV (Promega, Madison, USA). 200 ng de ADNc se usaron para la detección semicuantitativa de PCR con primers específicos de genes humanos que se detallan en la tablal .

El gen endógeno de la b-actina fue utilizado como control endógeno para la normalización de los niveles de expresión génica. Las secuencias de los primers se determinaron a través de las secuencias de GenBank, y publicadas en estudios previos ( Kennedy et al ., 2007. Blood. Apr 1 ;109(7):2679-87; Tomescot et al ., 2007. Stem Cells. Sep;25(9):2200-5. Epub 2007 May 31 ; Gaetani et al., 2009. Cardiovascular research 82:41 1 -20).

Las condiciones de temperatura del ciclo de la PCR end-Point, comenzaron con un primer ciclo de desnaturalización de 95° durante 2 minutos y 25 ciclos de etapas consecutivas de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, apareamiento de los primers se realizó a 55°C durante 30 segundos, la extensión a 72°C durante 2 minutos y finalmente 72°C durante 7 minutos. Estas reacciones se llevaron a cabo en Termociclador (Applied Biosystems). Se utilizó como soporte físico para la separación de los diferentes fragmentos de ADN por electroforesis, un gel al 2% de Agarosa teñido con Bromuro de Etidio. Se utilizó la reveladora de geles ChemiDoc™ XRS (Bio-Rad Laboratories) para la visualización de los productos de PCR. El software empleado para análisis fue la versión 460.

Para el estudio de expresión cuantitativa de los genes en las células flotantes extraídas de sangre venosa del seno coronario en comparación con las células extraídas de sangre venosa periférica, se utilizaron cultivos tratados con el mismo medio y el mismo tiempo de incubación (30 días). La PCR a tiempo real cuantitativa se realizó en el equipo 7500 Fast (Applied Biosystems). Para la reacción de qRT-PCR se utilizó una concentración de 50 ng de ADNc y un volumen final de reacción de 20 μΙ. Se empleo SYBR Green (Roche, FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) Applied Science, Germany) para la detección de los productos de la PCR se utilizaron los siguientes genes: b- actina, Nanog, Oct4, GATA-1 , Brachyury, SOX-1 , SSEA1 , Runxl , cMyc, Mef2c, Nkx2.5, IsM +, CXCR4 y KDR, NeuroD, Foxa2/NHF-3 .

Para la amplificación se utilizo el siguiente programa: desnaturalización a 55° C durante 20 segundos y una segunda desnaturalización a 95°C durante 10 minutos, se emplearon 40 ciclos subdivididas en dos etapas: primera etapa a 95°C durante 15 segundos y la segunda etapa a 55°C durante 1 minuto. Las condiciones de la curva de melting fueron a 95°C durante 15 segundos; a 60° durante 1 minuto; a 95°C durante 30 segundos y a 60°C durante 1 5 segundos. El software utilizado para el análisis fue el 7500 fast versión SDS 2.0.5.

Los datos se analizaron de acuerdo con el método de análisis de expresión relativa ddCT, descrito previamente por Pfaffl (Pfaffl et al., 2002. Nucleic Acids Res. May 1 ;30(9):e36) Los datos de la expresión de los genes de las células flotantes procedentes del seno coronario se encuentran normalizados en función de la sangre periférica en escala Log10.

Tabla 1 .- Genes

Oct3/4 FW: SEQ ID NO: 1 RW: SEQ ID NO: 2

NANOG FW: SEQ ID NO: 3 RW: SEQ ID NO: 4

B-ACTIN FW: SEQ ID NO: 5 RW: SEQ ID NO: 6

GATA1 FW: SEQ ID NO: 7 RW: SEQ ID NO: 8

KDR FW: SEQ ID NO: 9 RW: SEQ ID NO: 10

NeuroDI FW: SEQ ID NO: 1 1 RW: SEQ ID NO: 12

RUNX1 FW: SEQ ID NO: 13 RW: SEQ ID NO: 14

SCL FW: SEQ ID NO: 15 RW: SEQ ID NO: 16

SOX7 FW: SEQ ID NO: 17 RW: SEQ ID NO: 18

BRACHYURI FW: SEQ ID NO: 19 RW: SEQ ID NO: 20

TNI FW: SEQ ID NO: 21 RW: SEQ ID NO: 22

SMA FW: SEQ ID NO: 23 RW: SEQ ID NO: 24

SSEA-1 FW: SEQ ID NO: 25 RW: SEQ ID NO: 26 CXCR4 FW: SEQ ID NO: 27 RW SEQ ID NO: 28

SOX2 FW: SEQ ID NO: 29 RW SEQ ID NO: 30

C.Myc FW: SEQ ID NO: 31 RW SEQ ID NO: 32

GATA 4 FW: SEQ ID NO: 33 RW SEQ ID NO: 34

MEF2C FW: SEQ ID NO: 35 RW SEQ ID NO: 36

ISL1 + FW: SEQ ID NO: 37 RW SEQ ID NO: 38

* Los oligonucleótidos han sido publicadas previamente (Kennedy et al Blood. 2007 Apr 1 ; 109(7):2679-87; Tomescot A et al Stem Cells. 2007 Sep;25(9):2200-5. Epub 2007 May 31 ; Gaetani et al Cardiovascular research. 2009;82:41 1-20)

Las secuencias SEQ ID NO: 39 y 40 representan los cebadores fw y rw respectivamente de GATA4-h.

Las secuencias SEQ ID NO: 41 y 42 representan los cebadores fw y rw respectivamente de C-KIT

Las secuencias SEQ ID NO: 43 y 44 representan los cebadores fw y rw respectivamente de FOXA2/HNF-3 Las secuencias utilizadas en la presente invención han sido previamente descritas en la literatura tal y como se representa a continuación:

- SMA, Nkx2.5, Tnl from Gaetani R, Ledda M, Barile L et al. Differentiation of human adult cardiac stem cells exposed to extremely low-frequency electromagnetic fields. Cardiovasc Res 2009; 82: 41 1 -20.

- FOXA2, GATA-1 , KDR, NeuroD, RUNX1 , SOX7, SCLb, b-actin:

Kennedy M, D'Souza SL, Lynch-Kattman M, Schwantz S, Keller G. Development of the hemangioblast defines the onset of hematopoiesis in human ES cell differentiation cultures. Blood 2007; 109: 2679-87.

- Nanog, c-KIT from Kalmar T, Lim C, Hayward P, Munoz-Descalzo S, Nichols J, Garcia-Ojalvo J, Martínez Arias A. Regulated fluctuations in nanog expression medíate cell fate decisions in embryonic stem cells. PLoS Biol 2009; 7.: Adamo L, Naveiras O, Wenzel PL et al. Biomechanical forces promote embryonic haematopoiesis. Nature 2009; 459: 1 131 -5

- Mef2c, Isl1+, Brachyury, GATA4: Tomescot A, Leschik J, Bellamy V et al. Differentiation in vivo of cardiac committed human embryonic stem cells in postmyocardial infarcted rats. Stem Cells 2007; 25: 2200-5.

- cMyc , SSEA-1 : Conacci-Sorrell M, Ngouenet C, Eisenman RN. Myc- nick: a cytoplasmic cleavage product of Myc that promotes alpha-tubulin acetylation and cell differentiation. Cell. 2010 Aug 6;142(3):480-93.

- SSEa-4: Kashyap V, Rezende NC, Scotland KB, Shaffer SM, Persson JL, Gudas LJ, MonganNP. Regulation of stem cell pluripotency and differentiation involves a mutualn regulatory circuit of the NANOG, OCT4, and SOX2 pluripotency transcription factors with polycomb repressive complexes and stem cell microRNAs. Stem Cells Dev. 2009 Sep;18(7):1093-108

- Oct3/4: Kim JB, Sebastiano V, Wu G, Araúzo-Bravo MJ, Sasse P, Gentile L, Ko K, Ruau D,Ehrich M, van den Boom D, Meyer J, Hübner K, Bernemann C, Ortmeier C, Zenke M,Fleischmann BK, Zaehres H, Schóler HR. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 2009 Feb 6;136(3):41 1 -9.

Ejemplo 12- ESTUDIO FUNCIONAL DE LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO: ESTUDIO DE CONTRACTILIDAD

Las células flotantes formadoras de cluster fueron recogidas en tubo falcon de 15ml y centrifugadas a 250g durante 10 minutos. Se aspiró el sobrenadante y se añadió 1 ml de tripsina al 1 X de tripsina (Sigma Aldrich) incubándolas durante 3 minutos en incubación (37°C, 5% CO2 y atmósfera húmeda). Posteriormente se cuantificaron y se sembraron 500.000 células en cada pocilio (multipocillo de 24). Se sembraron en medio medio GelTrex-DMEM- HamF12 a una proporción 1 : 29, por lo cual la textura de la matriz gelatinosa era baja) y 5% FBS (sin suplementar). Las células permanecieron 24 horas en incubación, antes de ponerle el tratamiento de la NE, para favorecer la adaptación celular al nuevo medio de cultivo. Al cabo de ese tiempo, se trataron con Norepinefrina (100μΜ) y transcurridas 12 horas, se observó con microscopía de contraste de fases si las células poseían la capacidad de contraerse utilizándose el microscopio Nikon model TE2000-U y las imágenes fueron realizadas con la cámara Nikon modelo DS5MC.

Ejemplo 13- ESTUDIO FUNCIONAL DE LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO: ESTUDIO DE ANGIOGÉNESIS.

Las células flotantes del seno coronario y las células de sangre periférica de 30 días de cultivo, fueron recogidas y tripsinizadas con tripsina 1 X, sembradas a una concentración de 50.000 células por pocilio en el sistema de matrigel Angiogenesys Systems (BD bioscience) previamente teñidas con Calceina AM (1 hora en oscuridad). Se incubaron durante 15 días atmósfera húmeda al 5% de C02, 37°C. Se realizó un seguimiento continuo de la formación de vasos empleando el microscopio Nikon model TE2000-U, las fotografías se realizaron con la cámara modelo Nikon modelo DS5MC. Obteniéndose resultados de los 5 días y 15 días respectivamente.

Ejemplo 14- RESULTADOS DEL ESTUDIO IN VITRO, DEL CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO DE PACIENTES CON INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO.

A través del cultivo primario de dos fuentes de sangre distintas: células procedentes de sangre periférica y sangre procedente del seno coronario de pacientes con infarto agudo de miocardio, comprobamos un comportamiento celular diferente.

Si bien es cierto que las células procedentes de sangre circulante se adherían y formaban estructuras semejantes a túbulos (Figura 1 a-1 c) como típicamente se ha descrito en la literatura, las células del seno coronario se agrupaban en cluster y no se diferenciaban a ningún otro tejido (Fig. 1 d-1f), Tanto las células progenitoras descubiertas en tejido residente cardiaco por Messina y colaboradores (Messina et al., 2004 Circ Res. 95: 91 1 -921 ), como las células progenitoras embrionarias humanas o de ratón (Davis et al., 2010. J Mol Cell Cardiol. Aug;49(2):312-21 ), como las células progenitoras neuronales (Reynolds et al., 1992. Science. Mar27; 255(5052):1707-10) poseen la característica común de formar cluster celulares semejantes a los descritos en este estudio. La división asimétrica de las células, dando lugar a células de mayor tamaño y células más pequeñas (Snippert et al., 201 1 . EMBO Rep. Feb;12(2):1 13-22) es una característica inherente de las células progenitoras que comparten las células de la invención (Fig.2).

Ejemplo 15- RESULTADOS DEL ESTUDIO DEL TAMAÑO CELULAR DE LAS CELULAS FORMADORAS DE COLONIAS.

Las células se multiplican dando lugar a división asimétrica, con células de tamaño aproximado entre las 1 1 y 20 μιτι (figura 4) y células de menor tamaño que no superan las 6 μιτι (figura 5). En el estudio de división asimétrica utilizando phalloidina (figura 23-24) como marcador citoesquelético se observa en el mareaje nuclear la presencia del desarrollo de un cuerpo secundario (figura 24)

Las imágenes obtenidas con microscopía invertida, muestran un tamaño de cluster variable entre 50μηη y 500μηη de diámetro. En los estadios iniciales del cultivo celular, (fig 6-a) se observan cluster in vivo, con número comprendido entre las 17 y 20 células por cluster, que aumentan de tamaño progresivamente (40 células por cluster, Fig 6b) posteriormente (80 células por cluster, observesé en la Fig. 3 en muestras fijadas con paraformaldehido con un diámetro de 100 μιτι), duplicando su tamaño alcanzando un diámetro de 200 μιτι (fig 6c ). Este incremento celular llega a superar las 500 μιτι de diámetro en cultivos con 60 días de incubación. Ejemplo 16- RESULTADOS DEL ESTUDIO DE LA PROLIFERACION CELULAR IN VITRO DE CÉLULAS PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO DE PACIENTES CON INFARTO AGUDO DE MIOCARDIO

Como resultado del estudio de la proliferación, se observo como las células formadoras de cluster tienen como característica particular la secreción de factores estimuladores de la proliferación. Por ello el recambio del medio, total o de novo, provoca un cambio en las características iniciales del medio de cultivo que retardan el proceso proliferativo. Los cluster formadores de colonias tardan 72 horas en alcanzar la actividad proliferativa exponencial (fig 10-1 1 ).

Desde el tiempo 0 hasta las 48 horas (figura 10) de cultivo las células tienen un Doubling Time Medio igual a 57 horas (figura 7). Sin embargo a partir de las 48 horas hasta las 72 horas y posteriores el tiempo medio de doblaje es de 18 horas aprox. Entre las 120 y 144 horas (figura 1 1 ) el tiempo de doblaje es de 19 horas aprox. (figura 7). Este fenómeno se encuentra potenciado cuando se realiza cultivos cuyo porcentaje de recambio del medio no es total sino parcial. Sin embargo en aquellos cultivos cuyo reemplazo del medio de cultivo es total, la velocidad de crecimiento y la tasa de crecimiento se ven disminuida como muestra la figura 8.

El análisis a lo largo de 30 días de tres muestras de células procedentes de pacientes distintos, muestra en la gráfica 9, la media de los contajes realizados en cada punto del estudio, muestran una Doubling Time = 29.31 horas. En la figura 8 se muestra como, para la amplificación exponencial de los cluster, se requiere del cultivo celular en una relación de células de 5.105 por cm2 y con una fracción de medio celular donde han sido previamente generados ó cultivados. En la figura 8 también se muestra el cultivo con una ventana estacionaria de proliferación, cuya tasa de crecimiento es menor, provocada por un recambio total del medio de cultivo por medio de cultivo "floating " de novo . Ejemplo 17- RESULTADOS DEL ESTUDIO MORFOLÓGICO DE LAS CELULAS FORMADORAS DE COLONIAS EMPLEANDO PHALLOIDIN COMO MARCADOR DE CITOESQUELETO. Mediante el empleo de Phalloidina y marcador nuclear DAPI se ha podido comprobar que los cluster celulares tienen una morfología particular ya que presentan una oquedad central, hasta ahora no ha sido observada por células formadoras de cardiosferas, ni células madre mesenquimales, ni células madre hematopoyéticas (figura 12 y 13).

Los resultados sobre la preservación de la estructura empleando phalloidin , en cultivos durante largo tiempo han permitido observar como el tiempo de permanencia en cultivo no produce una desorganización de la estructura citoesquelética como sucede en procesos de necrosis o apoptoticos, ni tampoco se observan anomalías estructurales del DNA como pudieran ser los cuerpos apoptoticos, de heterocromatina condensada, etc. Por el contrario en estos cluster de 3 meses de cultivo permanecen morfológica y estructuralmente bien organizados (figura 15, 16 y 17 en detalle). El mareaje con phalloidina permite observar la distribución citoesquelética de las células (figura 15, 16), observándose un núcleo central (figura 17) y un cistoesqueleto circular (figura 18-merge) que ocupa menos del 20% de la superficie celular. Tanto los mareajes nucleares (Figura 12,13 y 14-b) como el mareaje con phalloidin figura 14-a) muestran la presencia del orificio presente en el cluster celular. En la figura 15, se observa en detalle como se configura este poro, no descrito en la literatura de stem cells cardiacas ni células derivadas de stem cells cardiacas. En la figura 18 y 23 se puede observar como el núcleo celular es monoclonal y ocupa más del 80% de la superficie celular. El citoesqueleto se encuentra organizado, y posee densidades diferentes de acumulación de mareaje de f-actina, presuponiendo una mayor densidad citoesquelética por ciertas zonas claramente mas intensamente marcadas, y otras menos marcadas con verde phalloidin tal como se observa en la figura 23. Se puede observar tanto en la figura 16 como en la 23 que el citoplasma es circuncéntrico y el núcleo esférico. Las células formadoras de cluster son moríologicamentes esferoidales, con un núcleo central , tal y como se observa en la figura 17- 18 y 23-24.

Ejemplo 18- ESTUDIO DE LA VIABILIDAD CELULAR EN CULTIVOS DE LARGO TIEMPO (MAYORES A 5 MESES) MEDIANTE CALCEINA AM

El mareaje con calceína AM (verde o roja, Invitrogen) permite conocer la viabilidad de la célula, y si es metabólicamente activa. Los resultados muestran como en cultivos iniciales como en células formadoras de cluster (figura 19) permanecen activas y viables (Figura 19-2 cultivos de 2 meses de incubación).

En cultivos de 5 meses de incubación, se observa como la estructura del cluster permanece marcado positivamete con Calceina Red AM. De igual manera se observa como el centro de los cluster de tamaños superiores a las δΟΌμιτι también poseen actividad metabólica y viabilidad como muestra la figura 19-4.

Ejemplo 19- RESULTADOS DEL ESTUDIO DE CLONOGÉNESIS EMPLEANDO GFP ( p-eGFP-C1)

Los resultados con la transfeccion positiva con GFP muestran células positivas para GFP (Fig 20-b y Fig 21 d) y células proliferativas clónales ( figura 21 ). Al incorporar células transfectadas con GFP vs no transfectadas con GFP, se puede observar como aquellas células que incorporaron el vector forman clones y las células que no incorporaron el vector no se encuentran marcadas y no forman los clones.

Ejemplo 20- RESULTADOS ESTUDIO DE CLONOGÉNESIS EMPLEANDO BRDU

Esta es otra prueba confirmativa que los cluster proceden de estructuras clónales. Para descartar la formación de agregados por adhesión se cultivaron tanto células sometidas a un tratamiento con BrdU como no tratadas, en las mismas condiciones y en los mismos pocilios. El resultado es el que muestra la figura 22, un crecimiento clonal, con un incremento de la capacidad proliferativa en el interior del cluster, que es donde se observa mayor señal de BrdU (Fig b y d).

Ejemplo 21 - RESULTADOS DEL ESTUDIO FENOTÍPICO DEL LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO MEDIANTE INMUNOFLUORESCENCIA. Los resultados de microscopía confocal muestran como las células formadoras de cluster forman una estructura compacta formada por células cuyo núcleo (marcador nuclear DAPI: fig. 22 y 23) ocupa gran parte de la región citoplásmica de la célula. Se demuestra la colocalización positiva (Figura 25d) de los marcadores pluripotentes: Nanog ( 25b) y Oct 3/4 (25c). Por lo que observamos que estas células no adherentes, encontradas en sangre venosa que previamente ha irrigado en corazón hay células que son capaces de expresar tanto marcadores pluripotentes típicos de células madre embrionarias. Encontramos la expresión de células en estadios tempranos de cultivo, individualizadas (figura 25 a -d) como en cluster de <20Όμηη de tamaño de diámetro, realizadas con microscopio invertido fluorescente Nikon.

Sin embargo cuando realizamos en cluster de mayor tamaño >200 μιτι, observamos en microscopía confocal cómo la distribución de los marcadores pluripotentes no es aleatoria, al contrario parece albergar una estructura organizada (figura 26 a-d) de los marcadores pluripotentes, muestrando una significativa señal interna dentro del cluster celular. Por lo que presupone que el interior del cluster celular que coincide con la mayor captación de BrdU (fig. 22b y d ) son las células más pluripotentes. En la fig. 32 se observa el mareaje positivo para cKit compartiendo este marcador con las células residentes en tejido cardiaco. Ejemplo 22- RESULTADOS DEL ESTUDIO FENOTÍPICO DEL LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO EMPLEANDO LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE FLUJO. (Fig. 33 a- 33 i).

Las células cultivadas no adherentes procedentes del seno coronario con capacidad de formar cluster celulares poseen una expresión mayoritaria de los marcadores pluripotentes Nanog+, Oct3/4 , como se muetra en la figura 33 a y b. Igualmente se observa un porcentaje mayoritario ( <80%) de las células inmunoreactivas para los marcadores mesenquimales CD90+CD105+ como muestran las figuras 32e y 32f. Sin embargo en un porcentaje del 20% de las células formadores de cluster expresan de cKit+, como marcador de célula madre cardiaca (Fig32d) y así como CD133, CXCR4+, CD15 (SSEA1 )+. La expresión de KDR + es menor al 5% de las células. Se ha observado inmunorreacion negativa para los marcadores CD34 -, CD45-, CD31 - y CD146- por lo que se demuestra que este tipo celular no comparte los marcadores específicos de célula hematopoyética progenitora ni adulta, ni tampoco de célula endotelial adulta. Ejemplo 23- RESULTADOS DEL ESTUDIO DE EXPRESIÓN GÉNICA Y CUANTIFICACIÓN RELATIVA DE LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO.

Los resultados de PCR End Point muestran como las células cultivadas flotantes procedentes del seno coronario expresan los genes codificantes para los factores de transcripción y homeobox pluripotentes: Nanog, Oct3/4, SSEA- 1 , Sox-2, Sox-7, Brachyury, Runxl , Slc, cMyc (Fig. 34). La literatura actual describe que la de actividad de los factores de transcripción embrionarios cMyc, Klf-4, SSEA1 , Otc3/4, Nanog facilitan la adquisición de la capacidad pluripotente de transformar células fibrobláticas de ratón en células pluripotentes que son capaces de adquirir el fenotipo cardiaco (Martínez- Fernandez et al., 2009. Circ Res. 105: 648-656; Nelson et al., 2009, Circulation. 120: 408-416). Los estudios en células no residentes circulantes periféricas observan la presencia de células circulantes que poseen la característica de expresar factores de transcripción como Oct3/4, Nanog y SSEA1 como son las células VSEL, que se ven incrementadas tras un síndrome coronario agudo. En este estudio se ha encontrado en circulación venosa del seno coronario un tipo celular que comparte las características de las células residentes formadoras de cardiosferas y con capacidad de expresar factores de transcripción implicados en el mantenimiento de la pluripotencia (Brachyury, Runxl , cMyc, SSEA1 , SSEA4, SSEA3, Oct3/4, Nanog, SOX2, SOX7, GATA-1 ) típica de células humanas embrionarias y en el desarrollo de células embrionarias hacia tejido cardiaco como son Nkx2.4, cMef, Isl 1 +, GATA4, Tnl. Los resultados de PCR-End Pont muestran expresión de genes implicados en el linaje cardiaco: GATA4, lsl-1 , Mef2c, Nkx2.5. En el estudio de las características pluripotentes y de indiferenciación de las células flotantes formadoras de cluster del seno coronario encontramos la expresión de marcadores propios de neurosferas como es NeuroDI (NeurDI ). Abogando la capacidad pluripotencial de las células aisladas del seno coronario se observó expresión del gen NeuroDI . Se encontró expresión de los transcriptos para el receptor de la chemokina 4 CXCR4/CXCL12 y del receptor tipo 2 de VEGF denominado KDR ó VEGFR2. No obstante no se observó expresión del transcrito codificante para la SMA-alfa, por lo que se deduce que no se trata de células musculares lisas. Al igual que las cardiosferas, y las neurosferas son células que permanecen formando cluster flotantes en el cultivo y no permanecen en adherencia. Pero a diferencia de las células que forman cardiosferas, estas células no se han extraído de un explante cardiaco sino de la sangre que ha drenado el corazón y queda residual en el seno coronario.

Los resultados de la PCR cuantitativa a tiempo real (fig. 35) muestran los resultados en escala logarítmica. Se observa cuando se comparan los niveles de expresión de las células flotantes del seno coronario con las células de sangre periférica, las células flotantes poseen una expresión genes implicados en el desarrollo y con características pluripotentes entre 103 y 10-106 veces mayor que las células de sangre periférica. Así mismo se ha comprobado que las células del seno coronario flotantes poseen una expresión entre 103 y 102 veces mayor de genes implicados en la diferenciación hacia cardiomiocito que las células de sangre periférica. No se observan cambios importantes en la expresión de CXCR4 pero sin embargo, si se observa un incremento de la expresión en células de sangre periférica del receptor KDR (VEGFR2) asociado a procesos de angiogénesis.

Ejemplo 24- RESULTADOS DEL ESTUDIO FUNCIONAL DE LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO: ESTUDIO DE CONTRACTILIDAD.

Se comprobó la capacidad de contracción y generar latido de las células flotantes del seno coronario de manera sincrónica (cada 3 segundos) con un amplio periodo refractario, probablemente por la carencia en el medio de los dos sustratos fundamentales para la maquinaria contráctil: ATP y Calcio. Ya que en el estudio no se ha enriquecido el medio con estos dos factores. Hasta la fecha actual, los experimentos realizados sobre la capacidad de latencia o contracción exigen el cocultivo con cardiomiocitos fetales de rata, o bien añadiéndole durante 4 ó 5 semanas azitidina (5-AZA) al medio y tras ese periodo de tiempo, se puede observar a microscopía de fluorescencia filamentos de miosina o troponina (Zhang et al., 2009. Interact Cardiovasc Thorac Surg. Dec;9(6):943-6). Otros investigadores muy recientemente acaban de publicar un estudio donde se demuestra que la utilización de ondas de baja frecuencia, estimula la contractilidad de células progenitoras cardiacas. En la literatura actual, sólo las células embrionarias o derivadas de líneas embrionarias como son las células Isl1 +, Sca1 + de ratón, son capaces de latir espontáneamente (Liang et al., 2010. Int J Cardiol. Jan 7;138(1 ):40-9). Sin embargo actualmente, no se describe ninguna especie celular de tejido adulto, que posea la capacidad de latir, sin inducciones farmacológicas. La Norepinefrina, es un estimulador de la contractilidad, y actúa sobre los receptores de la NE estimulando el impulso. Si bien las células de la invención son capaces en 12 horas de desarrollar la maquinaria adecuada para la contracción, es porque probablemente posean la maquinaria adecuada para la contractilidad y los receptores adecuados de NE para desencadenar el estímulo. Los resultados de expresión génica confirman la presencia de los genes implicados en el linaje cardiaco (Mef2c, GATA4, Nkx2.5) y contráctil como son TNI (cardiaca) que expresan las proteínas implicadas en la maquinaria contráctil.

Ejemplo 25- ESTUDIO FUNCIONAL DE LOS CLUSTER DE CÉLULAS FLOTANTES PROCEDENTES DEL SENO CORONARIO: ESTUDIO DE ANGIOGÉNESIS.

El ensayo de angiógénesis (figura 36) es un ensayo que se compone de un soporte físico formado por una matriz gelatinosa en un medio esencial suplementado con inductores para la angiógénesis. Los resultados del ensayo muestran como tanto las células de sangre periférica (36 b) como las células de la sangre del seno coronario (36f), son positivas para el mareaje vital de calceína AM. Por lo tanto, las células sembradas en la matriz gelatinosa suplementada, son metabolitamente activas y funcionales en este medio inductor para la angiógénesis. Sin embargo, tal como muestran las figuras 9 c y 9d, las células procedentes de sangre periférica son capaces de formar estructuras vasculares como las ya descritas previamente por la literatura en células endoteliales adultas y progenitoras (EPC). Sin embargo las células procedentes del seno coronario que forman clusters (fig. 36 e) y que son metabólicamente activas y viables (fig. 36f) pero incapaces de formar estructuras vasculares (fig. 36g y 36h). Estos datos corroboran lo previamente descrito en nuestro estudio de expresión génica, donde los datos obtenidos por qPCR (fig 34) muestran un detrimento de la expresión de KDR (receptor de VEGF) un receptor fundamental en la angiógénesis, en las células procedentes del seno coronario.

Claims

Una célula adulta aislada que es positiva para los marcadores Nanog y Oct3/4, y negativa para los marcadores CD34, los de célula adulta endotelial CD31 , CD146, y el de célula adulta sanguínea CD45, y que no muestra la expresión del factor de transcripción de célula adulta muscular lisa Sma, caracterizada porque es capaz de experimentar contracción sincrónica en cultivo con un factor adrenérgico.

La célula adulta aislada según la reivindicación anterior, que además es positiva para los marcadores CD90 y CD105.

La célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, que además expresa naturalmente los factores de transcripción IsM , NeuroDI y Foxa2.

La célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, que además es positiva para los marcadores CD1 17 (c-kit), y expresa naturalmente los factores de transcripción Sox2, Sox7 y Runxl .

Una célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, que además es positiva para lo marcadores CXCR4, CD15(SSEA1 ), y que además expresa naturalmente los factores de transcripción SSEA4 y cMyc.

Una célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, que además es positiva para lo marcadores CD133(Propina 1 ), KDR, GATA4, Mef2c, Tnl y NKx2.5.

Una célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, donde el factor adrenérgico es Norepinefrina.

Una célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, donde la célula se caracteriza por tener un citoplasma circuncéntrico, por ser mononucleadas y porque dicho núcleo ocupa más del 70% de la superficie celular total.

9. Una célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, donde la célula se caracteriza por poseer la capacidad clonogénica de subdividirse o clonarse al menos 8 veces sin sufrir ninguna anormalidad cromosómica o la perdida de sus propiedades de diferenciación.

10. Una célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, donde la célula se caracteriza por presentar una división asimétrica.

1 1 . Una célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, que ha sido modificada genéticamente.

12. Una población celular aislada que comprende células adultas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 .

13. Una población celular aislada según la reivindicación anterior, que comprende al menos, un 80% de células según cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 .

14. Una célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 , o una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 12-13, obtenibles por un método que comprende: a. obtener una muestra de sangre del seno coronario de un mamífero, b. aislar las células de la muestra de sangre del paso (a),

c. purificar las células aisladas de (b),

15. Una célula adulta aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, o una población celular según cualquiera de las reivindicaciones 13-14, obtenibles por el método según la reivindicación 15, que además comprende:

d. cultivar las células purificadas del paso (c), hasta que se generen células flotantes, e. subcultivar las células flotantes del paso (d),

16. La célula aislada de cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15, donde el mamifero presenta una cardiopatía.

17. La célula aislada de la reivindicación anterior donde la cardiopatía es el síndrome coronario agudo.

18. La célula aislada de cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, donde el mamifero es un humano.

19. Una composición que comprende una célula adulta aislada ó una población aislada de células adultas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -18.

20. Una composición farmacéutica que comprende una célula adulta aislada ó una población aislada de células adultas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -18, o una composición según la reivindicación 19.

21 . La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

22. La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20- 21 , que además comprende otro principio activo.

23. Uso de una célula adulta aislada ó una población celular aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -18, o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en la elaboración de un medicamento.

24. Uso de una célula adulta aislada ó una población celular aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -18, o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en la elaboración de un medicamento para la reparación y regeneración de tejidos.

25. Uso de una célula adulta aislada ó una población celular aislada según cualquiera de las reivindicaciones 1 -18, o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 19-22, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

26. Uso de una célula adulta aislada, una población celular aislada o una composición según la reivindicación anterior, donde la enfermedad cardiovascular se selecciona del grupo que comprende: infarto de miocardio, isquemia cardíaca, hipertrofia cardiaca y arritmia cardíaca, o cualquiera de sus combinaciones.

27. Uso de una célula o de una población aislada de células adultas según la reivindicación 26, donde la enfermedad cardiovascular es la isquemia cardíaca.

28. Un método de selección de medicamentos que comprende:

a. Poner en contacto una célula o una población aislada de células adultas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -18 con una sustancia a testar, y

b. evaluar el efecto de dicha sustancia en el fenotipo de la célula o población aislada de células adultas.

29. Un método de obtención de una célula o de una población aislada de células adultas según cualquiera de las reivindicaciones 1 -18, que comprende: a. Obtener una muestra de sangre del seno coronario de un mamífero, b. aislar las células de la muestra de sangre del paso (a),

c. purificar las células aisladas de (b),

e. subcultivar las células flotantes del paso (d).

30. El método de obtención de una célula o de una población aislada de células adultas según la reivindicación anterior, que además comprende: f. Mantener las células flotantes del paso (d) en cultivo hasta su confluencia y subcultivarlas nuevamente.