WO2012108297A1 - Ras部分ポリペプチド含有水溶液及びRas機能阻害剤のスクリーニング方法 - Google Patents

Ras部分ポリペプチド含有水溶液及びRas機能阻害剤のスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012108297A1
WO2012108297A1 PCT/JP2012/052078 JP2012052078W WO2012108297A1 WO 2012108297 A1 WO2012108297 A1 WO 2012108297A1 JP 2012052078 W JP2012052078 W JP 2012052078W WO 2012108297 A1 WO2012108297 A1 WO 2012108297A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ras
amino acid
polypeptide
acid sequence
substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2012/052078
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
徹 片岡
扶美 島
厚夫 田村
望嗣 荒木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kobe University NUC
Original Assignee
Kobe University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kobe University NUC filed Critical Kobe University NUC
Priority to JP2012556832A priority Critical patent/JPWO2012108297A1/ja
Priority to US13/984,027 priority patent/US20140024123A1/en
Publication of WO2012108297A1 publication Critical patent/WO2012108297A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4722—G-proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C337/00—Derivatives of thiocarbonic acids containing functional groups covered by groups C07C333/00 or C07C335/00 in which at least one nitrogen atom of these functional groups is further bound to another nitrogen atom not being part of a nitro or nitroso group
    • C07C337/02—Compounds containing any of the groups, e.g. thiocarbazates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01R—MEASURING ELECTRIC VARIABLES; MEASURING MAGNETIC VARIABLES
    • G01R33/00—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables
    • G01R33/20—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance
    • G01R33/44—Arrangements or instruments for measuring magnetic variables involving magnetic resonance using nuclear magnetic resonance [NMR]
    • G01R33/46—NMR spectroscopy
    • G01R33/465—NMR spectroscopy applied to biological material, e.g. in vitro testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/82—Translation products from oncogenes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N24/00—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects
    • G01N24/08—Investigating or analyzing materials by the use of nuclear magnetic resonance, electron paramagnetic resonance or other spin effects by using nuclear magnetic resonance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for selecting more effective Ras function inhibitory substances, characterized by using nuclear magnetic resonance (NMR) information. More specifically, the present invention relates to a method for screening a substance that inhibits Ras function using the three-dimensional structure information by NMR of a Ras polypeptide having a three-dimensional structure having a pocket on the molecular surface in Ras.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • Ras a ras oncogene product
  • Ras is a low molecular weight G protein.
  • H-Ras In mammals, there are three Ras isoforms: H-Ras, N-Ras, and K-Ras.
  • homologues such as M-Ras and Rap having similar amino acid sequences exist in Ras, and the Ras family is formed including these.
  • Ras In human cancer, Ras is a good molecular target for the development of anticancer drugs, because constant activation of Ras function by mutation of any of H-Ras, N-Ras, and K-Ras is frequently observed. It is thought that there is.
  • Ras controls signal transduction while going back and forth between an active GTP-bound Ras (Ras-GTP) and an inactive GDP-bound Ras (Ras-GDP).
  • a ligand extracellular signal
  • Ras-GTP binds to a receptor on the cell membrane
  • GDP in Ras-GDP is converted to GTP and activated, and Ras-GTP binds to the target molecule.
  • Ras-GTP returns to Ras-GDP by the action of a factor (GTPase-activating protein: GAP) that promotes GTP hydrolysis (GTPase) activity inherent in Ras, and is inactivated until the next signal is received.
  • GAP GTPase-activating protein
  • Ras mutation active mutation reduces the intrinsic GTP hydrolyzing ability of Ras and is no longer subject to GTP hydrolysis promoting action by GAP. It is estimated that cancer increases because the cell occupying ratio continues to transmit a signal of cell proliferation continuously.
  • Ras-GTP a GTP-linked type
  • state 1 and state 2 Two types of interconvertible three-dimensional structures
  • state 2 is a true active form that can bind to the target protein and perform signal transduction
  • state 1 is an inactive form that cannot bind to the target protein.
  • the three-dimensional structure of state 2 has been elucidated by X-ray crystal structure analysis and NMR analysis.
  • Non-patent Document 1 Although the elucidation of the three-dimensional structure of state 1 of H-Ras-GTP has been attempted, it has not yet been fully elucidated. X-ray crystal structure analysis has been performed on H-Ras T35S (1-189 amino acid residues) which is a mutant H-Ras (Non-patent Document 1). However, the three-dimensional structure of state 1 disclosed in Non-Patent Document 1 lacks the electron density of the main chain of a plurality of amino acid residues and cannot be said to be a complete three-dimensional structure. Such a defective site is a site contained in two switch regions (switch I, II) that are important for Ras to recognize and activate the target protein.
  • switch I, II switch regions
  • Non-patent Document 2 X-ray crystal structure analysis of state-type 1 of wild-type M-Ras-GTP has been conducted (PDB ID: 1X1S) (Non-patent Document 2).
  • PDB ID: 1X1S X-ray crystal structure analysis of state-type 1 of wild-type M-Ras-GTP.
  • Non-Patent Document 3 As a result of the X-ray crystal structure analysis of the mutant H-Ras H-Ras T35S (1-166 amino acid residue) under conditions different from Non-Patent Document 1 (Non-Patent Document 3), two types of The three-dimensional structure of state 1 (form 1, 2) has been determined. Form 2 lacked the electron density of the main chain of multiple amino acid residues of switch ⁇ ⁇ II and could not be said to be a complete three-dimensional structure, but for form 1, a complete state 1 structure with a clear electron density of the whole peptide Met. However, the specific amino acid residue information relating to the drug binding region was still unclear for form 1.
  • Ras function inhibitors are promising anticancer drugs, amino acid residues related to the drug binding region on the state 1 structure of Ras-GTP, which can be used in computer docking simulations to develop Ras function inhibitors Information is eager. In addition, there is an eager desire for three-dimensional structure information for constructing the most suitable lead compound based on a seed compound having a Ras function inhibitory action.
  • An object of the present invention is to provide a method for screening for a substance that inhibits Ras function. Another object of the present invention is to provide an amino acid residue at a site important for interaction with a Ras function-inhibiting substance.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above-mentioned problems, and have provided three-dimensional structure information by NMR of Ras polypeptide and three-dimensional structure by NMR of a complex of a seed compound and Ras polypeptide effective as a Ras function inhibitor.
  • a site important for the interaction between the Ras polypeptide and the Ras function inhibitor was confirmed, and the present invention was completed.
  • the inventors have found that compounds can be selected, and have completed the present invention relating to a method for screening for a Ras function inhibitor.
  • a screening method for a substance that inhibits Ras function comprising the following steps: 1) A step of obtaining an NMR signal of a Ras partial polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; 2) A step of bringing the Ras function inhibition candidate substance (a) into contact with the Ras partial polypeptide described in 1) above and obtaining an NMR signal of the resulting complex; 3) Analyzing the difference between the NMR signal obtained in the above step 1) and the NMR signal obtained in the step 2), the Ras function inhibiting substance (A) which is a derivative of the Ras function inhibiting candidate substance (a) ).
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 As a reference, the fifth lysine (K), the 37th glutamic acid (E), the 38th aspartic acid (D), the 39th serine (S), the 56th leucine (L ), 63rd glutamic acid (E), 64th tyrosine (Y), 66th alanine (A), 67th methionine (M), 70th glutamine (Q), 71st A substance capable of interacting with at least three amino acid residues selected from tyrosine (Y), 73rd arginine (R), and 74th threonine (T).
  • a Ras function inhibitor comprising, as an active ingredient, a Ras function inhibition candidate substance (a) represented by the following general formula (I):
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen group, a lower alkyl group, a nitro group, or a trifluoromethyl group.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen group, a lower alkyl group, a nitro group, or a trifluoromethyl group.
  • a Ras partial polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the following general formula (I): The complex with the Ras function inhibition candidate substance (a) represented.
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen group, a lower alkyl group, a nitro group, or a trifluoromethyl group.
  • the Ras partial polypeptide is a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which the 35th threonine is substituted with serine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the complex according to item 7 or 8 specified by an NMR signal. 10.
  • aqueous solution comprising a Ras partial polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, Ras partial polypeptide-containing aqueous solution characterized in that the three-dimensional structure of the Ras partial polypeptide is the following 1) and 2): 1) The three-dimensional structure of the Ras partial polypeptide consists of a three-dimensional structure having a pocket capable of binding to a specific substance; 2) When the specific substance is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the Ras partial polypeptide, the fifth lysine (K), the 37th glutamic acid (E), the 38th Aspartic acid (D), 39th serine (S), 56th leucine (L), 63rd glutamic acid (E), 64th tyrosine (Y), 66th alanine (A ), 67th methionine (M), 70th glutamine (Q),
  • a substance capable of interacting with at least three or more amino acid residues 11.
  • 12 12.
  • the Ras polypeptide could provide an amino acid residue at a site important for interaction with a Ras function inhibitor. Furthermore, by confirming the difference between the three-dimensional structure information by NMR of the Ras polypeptide and the three-dimensional structure information by NMR of the complex of the Ras polypeptide and the seed compound, it is possible to determine substituents and metabolic factors with high possibility of toxic expression.
  • a novel derivative can be designed and synthesized by substituting a chemically unstable chemical structure with a biological equivalent, and lead compounds that are more effective than the seed compound can be selected. By such a screening method, a lead compound having a more effective substituent can be constructed as a Ras function inhibitor based on a specific seed compound.
  • FIG. 3 is a view showing amino acid residues that can interact with compound (III) in a Ras partial polypeptide.
  • the present invention relates to a screening method for selecting a more effective Ras function inhibitor from a seed compound, characterized by using NMR information. More specifically, the present invention relates to a method for screening a substance that inhibits Ras function using the three-dimensional structure information by NMR of a Ras polypeptide having a three-dimensional structure having a pocket on the molecular surface in Ras.
  • the “candidate substance” may be either known or novel, and there is no particular limitation on the structure, origin, physical properties, etc., and natural compounds, synthetic compounds, polymer compounds, low molecular compounds, peptides, Any of the nucleic acid analogs may be used.
  • a known program may be used to coordinate the three-dimensional structure of the candidate substance.
  • CORINA http://www2.chemie.uni-er GmbH.de/software /corina/index.html
  • Concord http://www.tripos.com/sciTech/inSilicoDisc/chemInfo/concord.html
  • Converter http://www.tripos.com/sciTech/inSilicoDisc/chemInfo/concord.html
  • Converter or COFIMA (http://www.bpc.uni-frankfurt.de/ guentert / wiki / index.php / Software) etc.
  • COFIMA http://www.bpc.uni-frankfurt.de/ guentert / wiki / index.php / Software
  • CYANA http://www.las.jp/products/s08_cyana/index.html
  • CNS http://cns.csb.yale.edu/v1.1/
  • Ras function inhibition candidate substance (a) refers to a substance having Ras function inhibition action selected from the above candidate substances by primary screening, that is, a seed compound having Ras function inhibition action.
  • Ras function inhibitory substance (A) a derivative selected based on the information of the Ras function inhibition candidate substance (a), that is, a lead optimized from the Ras function inhibition candidate substance (a). Means a compound.
  • Ras function inhibitor (A) screening method One embodiment of the screening method for the Ras function inhibitor (A) of the present invention includes a screening method including the following steps. 1) obtaining an NMR signal of the Ras partial polypeptide; 2) A step of bringing the Ras function inhibition candidate substance (a) into contact with the Ras partial polypeptide described in 1) above and obtaining an NMR signal of the resulting complex; 3) A step of analyzing the difference between the NMR signal obtained in the step 1) and the NMR signal obtained in the step 2) and selecting a derivative of the Ras function inhibition candidate substance (a).
  • the Ras partial polypeptide of the present invention is preferably a mutant Ras partial polypeptide in which a mutation that forms a three-dimensional structure having a pocket on the molecular surface is introduced into the partial polypeptide of the Ras protein.
  • a mutation that forms a three-dimensional structure having a pocket on the molecular surface is introduced into the partial polypeptide of the Ras protein.
  • it is necessary to be a Ras partial polypeptide to which GTP or a GTP analog is bound that is, a GTP-linked Ras partial polypeptide.
  • GTP analogs have a GTP-like skeletal structure, include those that have been chemically modified and those that have formed salts, and can bind to the GTP binding site.
  • the crystal, X-ray crystal structure analysis result and NMR signal obtained for the Ras partial polypeptide are all GTP-linked Ras partial polypeptide (hereinafter also referred to as “Ras-GTP”), or Ras. It means that it is obtained from a complex of a function inhibiting candidate substance (a) and Ras-GTP.
  • the pocket on the molecular surface of Ras is not present on the molecular surface of the GDP-binding Ras partial polypeptide (hereinafter also referred to as “Ras-GDP”) and is known to exist in Ras-GTP. Yes.
  • the pocket is surrounded by a region called a switch region (including a switch I region and a switch II region) in the amino acid sequence of Ras.
  • the switch region is defined as two regions whose conformation changes greatly between the GDP-bound Ras partial polypeptide and the GTP-bound Ras partial polypeptide, and is an important region for Ras to recognize and activate the target molecule. GTP binds to this neighborhood.
  • the Ras partial polypeptide of the present invention constituting Ras-GTP is specifically a polypeptide consisting of the following amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (positions 1 to 166 of H-Ras), or SEQ ID NO: 1.
  • a mutant H-Ras partial polypeptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added from the amino acid sequence.
  • H-Ras (1-166 amino acid residues): MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHQYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLAARTVESRQAQDLARSYGIPYIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIH
  • the Ras partial polypeptide consisting of an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids are substituted, deleted or added from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 refers to the 27th to 43rd amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the mutation is a substitution of the 31st and / or 35th amino acid, particularly preferably a substitution of the 35th threonine.
  • the 35th threonine is preferably substituted with serine.
  • H-Ras T35S mutant H-Ras polypeptide in which the 35th threonine is substituted with serine.
  • the Ras partial polypeptide of the present invention is used in the meaning including H-RasRaT35S.
  • Amino acid mutations in a polypeptide can be introduced by site-directed mutagenesis methods well known to those skilled in the art, or may be introduced using a kit (eg QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE)). Such).
  • DNA fragments encoding amino acid mutations can be introduced and replaced using genetic engineering techniques well known to those skilled in the art.
  • a mutant Ras polypeptide can be prepared by combining PCR reaction, restriction enzyme reaction, ligation reaction and the like.
  • DNA corresponding to 1-166 amino acid residues by normal PCR using H-Ras T35S (pBR322H-Ras T35S (1-189 amino acid residues)) subcloned into vector pBR322 as a template
  • the fragment can be amplified and cloned into pGEX-6p-1 to create H-Ras T35S.
  • the Ras function inhibition candidate substance (a) used in the screening method for the Ras function inhibitory substance (A) of the present invention can be selected from the candidate substances by the following method.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as a reference, among the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the fifth lysine (K) and the 37th glutamic acid (E ), 38th aspartic acid (D), 39th serine (S), 56th leucine (L), 63rd glutamic acid (E), 64th tyrosine (Y), 66th Th alanine (A), 67 th methionine (M), 70 th glutamine (Q), 71 st tyrosine (Y), 73 th arginine (R), and 74 th threonine ( By selecting a substance capable of interacting with at least three or more amino acid residues selected from any of T) from candidate substances.
  • the present invention also extends to a method for screening the candidate substance for inhibiting Ras function (a) by selecting a substance capable of interacting with the specific amino acid residue described above.
  • interaction means that force acts between Ras protein and a specific substance, for example, Ras function inhibition candidate substance (a).
  • the interaction includes hydrophilic interaction (eg, hydrogen bond, salt bridge), hydrophobic interaction (eg, hydrophobic bond), electrostatic interaction, van der Waals interaction, etc., preferably hydrogen bond It is done.
  • the Ras function inhibition candidate substance (a) can be screened by a method including the following steps. 1) The 5th lysine (K), the 37th glutamic acid (E), the 38th aspartic acid (when the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as a reference in the Ras partial polypeptide of the present invention.
  • the Ras function inhibition candidate substance (a) is based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and on the basis of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the fifth lysine (K), 37th glutamic acid (E), 38th aspartic acid (D), 39th serine (S), 56th leucine (L), 63rd glutamic acid (E), 64th Tyrosine (Y), 66th alanine (A), 67th methionine (M), 70th glutamine (Q), 71st tyrosine (Y), 73rd arginine (R), And screening by screening for substances that can interact with at least 3 or more, preferably 4 or more, and most preferably 6 amino acid residues selected from the 74th threonine (T).
  • the screening is performed by selecting a substance capable of interacting with at least 3 or more, preferably 4 or more, and most preferably 6 amino acid residues selected.
  • the amino acid residues constituting the pocket present on the molecular surface of the Ras partial polypeptide are at least the fifth lysine and the 56th position when the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is used as a reference.
  • the Ras function inhibition candidate substance (a) exerts a Ras function inhibition action by interacting with an amino acid residue present in a pocket site present on the molecular surface of the Ras partial polypeptide.
  • the Ras function inhibition candidate substance (a) used in the screening method for the Ras function inhibitory substance (A) of the present invention is not limited to the above method, but by a method known per se or any method developed in the future. Can be sorted.
  • An example of a method for selecting a candidate substance for inhibiting Ras function (a) is a method using X-ray crystal structure analysis of a Ras partial polypeptide. Specifically, three-dimensional structure information including a pocket of Ras partial polypeptide is obtained by X-ray crystal structure analysis, and a candidate substance for Ras function inhibition (a) is designed or selected based on the three-dimensional structure information. Can do. In order to analyze the X-ray crystal structure of the Ras partial polypeptide, it is necessary to obtain a cocrystal of the Ras partial polypeptide and GTP or a GTP analog, that is, a Ras-GTP cocrystal as described above.
  • a Ras function inhibition candidate substance (a) that binds to the pocket of the Ras partial polypeptide can be designed or selected.
  • the Ras function inhibition candidate substance (a) may be brought into contact with the Ras or Ras partial polypeptide.
  • the Ras partial polypeptide for co-crystallization of Ras-GTP is not limited as long as it is included in the Ras family.
  • Three Ras isoforms, H-Ras, N-Ras, and K-Ras, and M- It may be a homologue such as Ras or Rap.
  • the Ras protein is not particularly limited as long as it is derived from a mammal, and examples thereof include those derived from humans, cows and pigs.
  • Ras includes H-Ras and M-Ras.
  • the most suitable Ras partial polypeptide for obtaining the three-dimensional structure information including the Ras pocket includes a mutant Ras polypeptide, that is, H-Ras T35S.
  • GTP analogs include guanosine 5 '-( ⁇ -thio) -triphosphate (GTP ⁇ S) and (guanosine 5'-[ ⁇ , ⁇ -imido] triphosphate (Gpp (NH) p), but Gpp ( NH) p is preferable, and Gpp (NH) p can be purchased from CALBIOCHEM, for example.
  • the co-crystal of the present invention can be produced by the following method.
  • a Ras-GTP solution is prepared.
  • the Ras partial polypeptide of Ras-GTP is preferably a mutant H-Ras polypeptide, that is, H-Ras T35S.
  • Ras-GTP is present in a solution consisting of buffer, salt, reducing agent and the like.
  • the buffer, salt, and reducing agent may be any as long as they do not affect the three-dimensional structure of the Ras polypeptide.
  • the buffer is 1 to 500 ⁇ mM Na-HEPES, phosphoric acid.
  • the Ras partial polypeptide solution may contain dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the solution containing the Ras partial polypeptide has a pH of 4 to 11, preferably a pH of 6 to 9.
  • Such a polypeptide solution may be used for crystallization as it is, or may be further used for crystallization by adding a preservative, a stabilizer, a surfactant or the like as necessary.
  • a general protein crystallization method such as a vapor diffusion method, a batch method, or a dialysis method can be used.
  • a general protein crystallization method such as a vapor diffusion method, a batch method, or a dialysis method.
  • it is important to determine physical and chemical factors such as protein concentration, salt concentration, pH, type of precipitant, and temperature.
  • the vapor diffusion method is a method in which a droplet of a protein solution containing a precipitating agent is placed in a container containing a buffer solution (external solution) containing a higher concentration precipitating agent, and is allowed to stand after sealing.
  • a buffer solution external solution
  • the hanging drop method is a method in which a small droplet of a protein solution is placed on a cover glass, and the cover glass is inverted and sealed in a reservoir.
  • the sitting drop method is a method in which a suitable droplet stage is placed inside the reservoir, a small drop of the protein solution is placed on the droplet stage, and the reservoir is sealed with a cover glass or the like.
  • the solution in the reservoir contains a precipitant. If appropriate, a small amount of a precipitating agent may be contained in the protein droplet.
  • the reservoir solution used in the vapor diffusion method is a solution composed of a buffer solution, a precipitant, a salt, and the like. Any buffer, precipitating agent, and salt may be used as long as they can efficiently produce crystals.
  • the buffer is pH 4-9, 1-500 MmM Na-HEPES, phosphoric acid.
  • Precipitating agents such as sodium, potassium phosphate, Tris-HCl, sodium acetate, citric acid, etc.
  • Precipitating agents have a molecular weight of 400-10000, 1-50% by volume polyethylene glycol (PEG), 0.2-3M ammonium sulfate, 1-20 volumes
  • PEG polyethylene glycol
  • Examples of the salt include 0.05% to 0.3% sodium chloride, lithium chloride, magnesium chloride and the like, such as% MPD (methylpentanediol) and 5 to 10% by volume isopropanol.
  • the components of the reservoir solution are not limited to the above.
  • Electron density data can be obtained by crystal structure analysis using X-ray diffraction using crystals.
  • An electron density diagram can be created from the electron density data.
  • Ras-specific Ras function inhibition from a large number of candidate substances by selecting compounds that can affect pockets on the molecular surface of Ras partial polypeptides and compounds with structures that can fill the pockets by calculation
  • the candidate substance (a) can be efficiently selected.
  • the atomic coordinates representing the three-dimensional structure having the pocket and the atomic coordinates representing the three-dimensional structure of any candidate substance are matched on a computer.
  • the fitness state is quantified by using, for example, an empirical scoring function as an index, and the binding ability of the candidate substance to the pocket of the Ras partial polypeptide is evaluated.
  • the atomic coordinates having the pocket of the Ras partial polypeptide the entire atomic coordinates of the Ras partial polypeptide, derivatives thereof including the pocket, and a part thereof can be used.
  • a program comprising means for calculating molecular structural energy based on molecular coordinates and means for calculating free energy in consideration of solvent molecules such as water molecules.
  • InsightII and QUANTA which are computer programs commercially available from Accelrys are suitable for use in the screening method of the present invention, but those used in the present invention are not limited to these programs.
  • the process of superimposing the atomic coordinates of the candidate substance and the atomic coordinates having the pocket of the Ras partial polypeptide on the same coordinate system and evaluating the compatibility state of both can be operated using the commercial package software as described above and the software.
  • the computer system includes, for example, a storage unit that stores a structural formula of a compound, a unit that coordinates a three-dimensional structure of a compound, a storage unit that stores atomic coordinates of a compound, a storage unit that stores atomic coordinates of Ras, and an evaluation result.
  • Various means necessary for operating the target software such as storage means for storing, means for displaying the contents of each storage means, input means such as a keyboard, display means such as a display, and central processing unit, are appropriately included.
  • any software that can dock a ligand to a protein on a computer may be used.
  • DOCK DOCK
  • FlexX Tripos
  • LigandFit Accelrys
  • Ludi Acelrys
  • interactive display using molecular display software such as Insight II is also possible.
  • the free energy calculation value of the whole complex empirical scoring function, evaluation of shape complementarity, etc. can be arbitrarily selected and used. Can do. This indicator makes it possible to objectively evaluate the quality of the bond
  • Ras function inhibition candidate substance (a) examples of the Ras function inhibition candidate substance (a) of the present invention include compounds represented by the following general formula (I).
  • R 1 , R 2 , R 3 and R 4 are independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, a halogen group, a lower alkyl group (1 to 6 carbon atoms), a nitro group, or a trifluoromethyl group.
  • Specific examples of the compound represented by the general formula (I) include compounds represented by the following formulas (II) to (IV) (compounds (II) to (IV)).
  • the NMR signal of the Ras partial polypeptide, and the NMR of the complex obtained by contacting the Ras function inhibitor candidate substance (a) with the Ras partial polypeptide obtained by contacting the Ras function inhibitor candidate substance (a) with the Ras partial polypeptide.
  • the difference from the signal can be analyzed as follows.
  • NMR measurement of Ras partial polypeptide in aqueous solution NMR signal (1) obtained from Ras partial polypeptide, and complex obtained by contacting Ras function inhibiting candidate substance (a) with Ras partial polypeptide
  • the NMR measurement can be carried out by comparing the NMR signals of the NMR signal (2) obtained from the complex.
  • the Ras function inhibitor candidate substance (a ) May interact with the Ras partial polypeptide.
  • the aqueous solution may contain an organic solvent.
  • the interaction means that a force works between Ras protein and a specific substance, for example, Ras function inhibition candidate substance (a).
  • the interaction include hydrophilic interaction (for example, hydrogen bond, salt bridge), hydrophobic interaction (for example, hydrophobic bond), electrostatic interaction, van der Waals interaction, and the like.
  • hydrophilic interaction for example, hydrogen bond, salt bridge
  • hydrophobic interaction for example, hydrophobic bond
  • electrostatic interaction van der Waals interaction
  • van der Waals interaction and the like.
  • CCP4 program suit (Collaborative Computational Project Number # 4. (1994)) from information based on nuclear overhauser effect (NOE) through space and 3D structure model obtained based on NMR signal ) Acta Crystallogr.
  • a program called CONTACT can be used to identify interacting amino residues, or can be judged by visual information.
  • the three-dimensional structure model for the Ras partial polypeptide can refer to FIG. 1, and the three-dimensional structure model for the complex of the Ras function inhibiting candidate substance (a) and the Ras partial polypeptide can refer to FIG. be able to.
  • structural fluctuations related to protein function are observed due to the nature of the protein, structural fluctuations are also observed for the Ras partial polypeptide and the complex of Ras partial polypeptide and Ras function inhibitor candidate substance (a). 1 to 3 also show structural changes due to fluctuations.
  • the Ras for forming a more stable complex on the complex model by visual observation or using docking simulation software
  • the structural modification of the compound with respect to the function inhibiting candidate substance (a) can be performed. Further, in the structure of the structure-modified compound modified with respect to the Ras function inhibiting candidate substance (a), a substituent having high possibility of toxic expression or a metabolically unstable chemical structure is replaced with a biological equivalent. In this way, a novel derivative having higher activity and lower toxicity can be designed and synthesized, and a Ras function inhibitor (A) that can be a lead compound can be derived.
  • the Ras function inhibitory substance (A) selected by using such simulation can be further verified for activity and toxicity by wet assay using in vitro or in vivo.
  • the amino acid with which the Ras function inhibitor candidate substance (a) interacts with the Ras partial polypeptide Residues can also be specified.
  • SEQ ID NO: 1 the 5th lysine (K) and the 37th glutamic acid (E ), 38th aspartic acid (D), 39th serine (S), 56th leucine (L), 63rd glutamic acid (E), 64th tyrosine (Y), 66th Th alanine (A), 67 th methionine (M), 70 th glutamine (Q), 71 st tyrosine (Y), 73 th arginine (R), and 74 th threonine ( T), at least the fifth lysine, the 56th leucine, the 67th methionine, the 70th Th glutamine, 71 th tyrosine, and 74 th threonine.
  • the NMR measurement of the present invention is carried out by measuring the complex of Ras partial polypeptide and Ras function inhibiting candidate substance (a) in an aqueous solution containing DMSO (10-30%) at 3 to 10 ° C., preferably 5 ⁇ 1 ° C. Can be measured.
  • DMSO aqueous solution containing DMSO
  • homonuclear multidimensional NMR measurement or heteronuclear multidimensional NMR measurement is preferably used.
  • it can be performed by an NMR measurement method called 1 H- 15 NHSQC.
  • Such a measurement is a technique known to those skilled in the art.
  • 1 H- 15 NHSQC is a correlation spectrum between hydrogen atoms and nitrogen atoms in peptide bonds in proteins, that is, a 1 H- 15 N correlation spectrum, and is derived from a 1 H- 15 N signal derived from the main chain. Information on individual residues can be obtained.
  • Such an NMR measurement method enables a three-dimensional structure analysis of a target polymer substance such as a protein, and enables a protein interaction analysis.
  • a fusion polypeptide to which a purification tag is added can be prepared.
  • the fusion polypeptide can be efficiently produced by affinity chromatography using the ligand as a carrier. Can be purified.
  • 6X histidine tag, FLAG tag, GST (glutathione S-transferase) tag, maltose binding protein, protein A and the like are used as purification tags.
  • the fusion polypeptide is cleaved to obtain only the target polypeptide. It can be recovered.
  • the Ras function-inhibiting substance (A) obtained by the screening method of the present invention is considered to have an action for treating and preventing various diseases that may occur due to an abnormal function of Ras, such as an anticancer action. Therefore, it can be used as a therapeutic drug for tumors such as a medicament containing the Ras function inhibitor (A) of the present invention as an active ingredient, for example, an anticancer agent.
  • the antitumor effect of the Ras function inhibitory substance (A) of the present invention is determined by culturing cancer cells in the presence of the Ras function inhibitory substance (A) and examining whether the canceration trait is suppressed, or a tumor bearing model This can be done using animals.
  • Ras function inhibition candidate substance (a) As the Ras function inhibition candidate substance (a) of the present invention, compounds represented by the following formulas (II) to (IV) (compound (II), compound ( III) and compound (IV)) were obtained by in silico screening from the three-dimensional structure information of X-ray structural analysis. Specifically, compound (II) is obtained by screening by docking simulation (MMPB-SA method), and compound (III) and compound (IV) are searched for analogs of compound (II) (Tanimoto coefficient as an index). ) In silico screening. These compounds were identified through biochemical and cytological activity verification tests shown in Experimental Examples 1 and 2 below.
  • Example 1 Biochemical Activity Verification Test
  • the Ras-Raf binding inhibitory activity of compound (II), compound (III) and compound (IV) obtained in Example 1 was confirmed by a biochemical activity verification test. It was confirmed.
  • a human H-Ras polypeptide (1-166 amino acid residues) was used as Ras, and a GTP analog (GTP ⁇ S (Roche Diagnotics)) was used as GTP.
  • GTP ⁇ S Roche Diagnotics
  • human c-Raf-1 51-130 amino acid residues
  • Raf was used as Raf which is a target protein of Ras.
  • Example 2 Cytological activity verification test
  • the compound (II), the compound (III) and the compound (IV) obtained in Example 1 were confirmed to be anchorage-independent by the cytological activity verification test.
  • the cell growth inhibitory activity was confirmed.
  • the colony formation inhibitory activity (anchorage-independent cell growth inhibitory activity) of the compound was evaluated. As a result, these compounds were confirmed to have an inhibitory effect on colony formation for each cell and interacted with the above three types of Ras (FIG. 5).
  • Example 2 Measured NMR data of complex of Ras and compound (III)
  • measured NMR data of a complex of Ras and compound (III) are shown.
  • H-Ras T35S (1-166 amino acid residue) which is a mutant H-Ras was used as Ras
  • a GTP analog Gpp (NH) p: CALBIOCHEM
  • Ras-GTP was prepared by dissolving 3.6 mg of Ras and 1.1 mg of GTP in 1 mL of neutral pH buffer. Next, 3.6 mg of Ras-GTP was dissolved in 0.16 mL of a deuterated buffer solution (pH 6.8) to prepare a Ras-GTP solution. Compound (III) 0.3 mg was dissolved in deuterated DMSO (dimethyl sulfoxide) 0.04 mL to prepare a compound (III) solution. The Ras-GTP solution and the compound (III) solution were mixed, and a complex of Ras-GTP and compound (III) was prepared under conditions of 20% DMSO and 5 ° C.
  • KOB316 means the compound (III).
  • Example 3 Distance information of amino acids adjacent to Ras and compound (III) Regarding a complex of Ras-GTP and compound (III) prepared by the same method as in Example 2, it is close to Ras and compound (III). Amino acid distance information (NOE information) was confirmed.
  • the complex of Ras-GTP and compound (III) was subjected to NMR analysis by 13 C-separated NOESY-HSQC spectrum in the same manner as in Example 2. Since the integrated intensity of cross peaks in 13 C-separated NOESY-HSQC depends on the distance between hydrogen, it can be converted into distance information between compound (III) and Ras-GTP.
  • Table 1 shows the distance information of Ras amino acids adjacent to compound (III) obtained based on each cross peak.
  • a plurality of distance information for one amino acid means that there are several hydrogen nuclides in each amino acid and corresponding distance information exists for each of them.
  • Example 4 Distance information of amino acids adjacent to Ras and compound (III) Regarding the complex of Ras-GTP prepared by the same method as in Example 2 and compound (III) (kobe2601), 15 types of complexes Based on the NMR structure, the calculation was performed with the program CONTACT in the CCP4 program suit (Collaborative Computational Project Number 4. (1994) Acta Crystallogr. D 50, 760-763). As a result, a residue group (1) in which interaction with the compound (III) has been confirmed and a residue group (2) selected so as to fill the pocket gap are shown below.
  • a derivative of the Ras function inhibition candidate substance (a) It is possible to efficiently estimate the structure of the Ras function inhibitor (A). In other words, in the structure of the structure-modified compound modified with respect to the Ras function-inhibiting candidate substance (a), a substituent having a high possibility of toxic expression or a metabolically unstable chemical structure is replaced with a biological equivalent. Thus, a new derivative can be designed and synthesized, and a Ras function inhibitor (A) that can be a lead compound can be derived.
  • the obtained Ras function-inhibiting substance (A) is considered to have a therapeutic / preventive action for various diseases that may occur due to an abnormal function of Ras, such as an anticancer action. Therefore, it can be used as a therapeutic drug for tumors such as a medicament containing the Ras function inhibitor (A) of the present invention as an active ingredient, for example, an anticancer agent.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

より効果的なRas機能阻害物質をスクリーニングする方法を提供する。さらに、Rasポリペプチドについて、Ras機能阻害物質との相互作用に重要な部位のアミノ酸残基を提供する。RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Rasポリペプチドとシード化合物との複合体のNMRによる立体構造情報との差異を確認することで、当該シード化合物よりもさらに効果的なリード化合物を選別しうる。RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報に基づき解析した結果、本発明のRas機能阻害候補物質（ａ）と相互作用しうるアミノ酸残基は、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、K5, E37, D38, S39, L56, E63, Y64, A66, M67, Q70, Y71, R73, T74である。

Description

Ras部分ポリペプチド含有水溶液及びRas機能阻害剤のスクリーニング方法
　本発明は、核磁気共鳴法（NMR）情報を用いることを特徴とする、より効果的なRas機能阻害物質を選別するためのスクリーニング方法に関する。より詳しくは、Rasにおいて分子表面にポケットを有する立体構造をとるRasポリペプチドのNMRによる立体構造情報を利用してRas機能阻害物質をスクリーニングする方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願特願２０１１－２３６９５号優先権を請求する。
　ras癌遺伝子産物であるRasは低分子量Ｇタンパク質であり、哺乳動物では、H-Ras、N-Ras、K-Rasという３つのRasのアイソフォームが存在する。またRasには、アミノ酸配列の類似したM-RasやRapなどのホモログが存在し、これらを含めてRasファミリーが形成されている。ヒトの癌においては、H-Ras、N-Ras、K-Rasのいずれかの突然変異によるRas機能の恒常的活性化が高頻度に認められるため、Rasは抗癌剤の開発における格好の分子標的であると考えられている。
　Rasは、活性型であるGTP結合型Ras（Ras-GTP）と、不活性型であるGDP結合型Ras（Ras-GDP）を行き来しながら、シグナル伝達を制御する。細胞膜にある受容体に細胞増殖因子のようなリガンド（細胞外シグナル）が結合したのに応じ、Ras-GDPにおけるGDPがGTPに変換されて活性化され、Ras-GTPが標的分子と結合して細胞増殖シグナルを伝達する。その後、Rasに内在するGTP加水分解（GTPase）活性を促進する因子（GTPase-activating protein: GAP）の働きによって、Ras-GTPはRas-GDPに戻り、次のシグナルがくるまで不活性化の状態となって存在する。ヒトの癌においては、Rasの突然変異（活性型変異）によりRasの内在性GTP加水分解能が低下することと、GAPによるGTP加水分解促進作用を受けなくなることにより、細胞内でのGTP結合型Rasの占有比率が増加することにより、持続的に細胞増殖のシグナルを発信し続けるため、癌になると推定されている。
　さらに、GTP結合型であるRas-GTPには、相互変換可能な２種類の立体構造（state 1、state 2）が存在することが、31P-核磁気共鳴法（NMR）によって従来より指摘されていた。state 2は、標的タンパク質と結合してシグナル伝達を行うことのできる真の活性型であり、state 1は、標的タンパク質と結合できない不活性型である。Ｘ線結晶構造解析及びNMR解析によって、state 2の立体構造が解明されている。
　H-Ras-GTPのstate 1の立体構造については解明が試みられているものの、いまだ完全な解明には至っていない。変異型H-RasであるH-Ras T35S（1-189アミノ酸残基）についてＸ線結晶構造解析が行われている（非特許文献１）。しかしながら、非特許文献１に開示されたstate 1の立体構造は、複数のアミノ酸残基の主鎖の電子密度が欠損しており完全な立体構造とはいえない。またかかる欠損部位は、Rasが標的タンパク質を認識・活性化する上で重要である２つのswitch領域（switch I, II）に含まれる部位である。
　Rasファミリーの一員であるM-Rasに着目し、野生型M-Ras-GTPのstate 1についてのＸ線結晶構造解析が行われている（PDB ID: 1X1S）（非特許文献２）。その結果、M-Ras-GTPのstate 1の分子表面に、Ras-GDPや、Ras-GTPのstate 2には全く認められないポケットが存在すること、かかるポケットは、switch I領域及びswitch II領域によって囲まれていることが判明した。しかしながら、非特許文献２に示されたM-Ras-GTP state 1の立体構造は、ポケット周辺の電子密度が一部欠失した不完全なものであった。
　変異型H-RasであるH-Ras T35S（1-166アミノ酸残基）について、非特許文献１とは異なる条件でＸ線結晶構造解析が行われた結果（非特許文献３）、2種類のstate 1の立体構造（form 1, 2）が決定された。Form 2はswitch IIの複数のアミノ酸残基の主鎖の電子密度が欠損しており完全な立体構造とはいえなかったが、form 1についてはペプチド全体の電子密度が明瞭な完全なstate 1構造であった。しかしながらform 1についても、薬剤の結合領域に係る具体的なアミノ酸残基情報については依然として不明であった。
　Ras機能阻害物質は抗癌剤の有力な候補であるため、Ras機能阻害物質を開発するためのコンピュータドッキングシミュレーションに用いられ得るような、Ras-GTPのstate 1構造上の薬剤結合領域に係るアミノ酸残基情報が熱望されている。また、Ras機能阻害作用を有するシード化合物を基にして、最も好適なリード化合物を構築するための立体構造情報についても、熱望されている。
Spoerner, M., et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Apr24;98(9):4944-9. Ye M., et al., J Biol Chem. 2005 Sep 2;280(35):31267-75. Shima F., et al., J Biol Chem. 2010 May 17;285(29):22696-705.
　本発明は、Ras機能阻害物質をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。さらに、Rasポリペプチドについて、Ras機能阻害物質との相互作用に重要な部位のアミノ酸残基を提供することを課題とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行い、RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Ras機能阻害物質として有効なシード化合物とRasポリペプチドとの複合体についてのNMRによる立体構造情報に基づき解析した結果、RasポリペプチドとRas機能阻害物質との相互作用に重要な部位を確認することができ、本発明を完成した。さらには、当該RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Rasポリペプチドとシード化合物との複合体のNMRによる立体構造情報との差異を確認することで、当該シード化合物よりもさらに効果的なリード化合物を選別しうることを見出し、Ras機能阻害物質をスクリーニングする方法に係る本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下よりなる。
１．以下の工程を含む、Ras機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法：
１）配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドのNMRシグナルを得る工程；
２）Ras機能阻害候補物質（ａ）を、上記１）に記載のRas部分ポリペプチドと接触させ、得られた複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと、２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いを解析し、Ras機能阻害候補物質（ａ）の誘導体であるRas機能阻害物質（Ａ）を選別する工程。
２．配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することを特徴とする、Ras機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法。
３．以下の工程を含む、前項２に記載のRas機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法：
１）前項２に記載の部分ポリペプチドのうち、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基をNMR測定可能な同位体で標識したポリペプチドを作製し、当該標識ポリペプチドについてのNMRシグナルを得る工程；
２）候補物質を、１）の工程で作製した標識ポリペプチドと接触させて、候補物質と標識ポリペプチドとの複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いに基づいて、標識ポリペプチドと相互作用しうる物質を、Ras機能阻害候補物質（ａ）として選別する工程。
４．Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、前項１に記載のRas機能阻害物質（Ａ）又は前項２～３のいずれか１に記載のRas機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法。
５．Ras機能阻害候補物質（ａ）が、以下の一般式(I)で表される、前項１に記載のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
６．以下の一般式(I)で表されるRas機能阻害候補物質（ａ）を有効成分とするRas機能阻害剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
７．配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドと、以下の一般式(I)で表されるRas機能阻害候補物質（ａ）との複合体。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
８．Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、前項７に記載の複合体。
９．NMRシグナルにより特定される前項７又は８に記載の複合体。
１０．配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドを含む水溶液であって、
当該Ras部分ポリペプチドの立体構造が、以下の１）及び２）であること特徴とするRas部分ポリペプチド含有水溶液：
１）当該Ras部分ポリペプチドの立体構造が、特定の物質と結合しうるポケットを有する立体構造からなり；
２）当該特定の物質が、当該Ras部分ポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質である。
１１．Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、前項１０に記載のRas部分ポリペプチド含有水溶液。
１２．特定の物質が、一般式(I)に示されるＲａｓ機能阻害剤(a)であることを特徴とする、前項１０又は１１に記載のRas部分ポリペプチド含有水溶液。
　本発明において、Rasポリペプチドについて、Ras機能阻害物質との相互作用に重要な部位のアミノ酸残基を提供することができた。さらに当該RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Rasポリペプチドとシード化合物との複合体のNMRによる立体構造情報との差異を確認することで、毒性発現の可能性が高い置換基や代謝的に不安定な化学構造を、生物学的等価体と置換する形で新規誘導体をデザイン・合成することができ、当該シード化合物よりもさらに効果的なリード化合物を選別しうる。このようなスクリーニング方法により、ある特定のシード化合物に基づいて、さらに効果的な置換基を有するリード化合物をRas機能阻害物質として、構築することができる。
NMRシグナルを基に構築して得られたRas部分ポリペプチドについての立体構造モデルを示す図である。タンパク質機能に関係した構造揺らぎをも含む概念図である。 NMRシグナルを基に構築して得られた立体構造モデルから推定されるポケットの部位を模式的に示す図である。タンパク質機能に関係した構造揺らぎをも含む概念図である。 NMRシグナルを基に構築して得られたRas機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドの複合体についての立体構造モデルを示す図である。タンパク質機能に関係した構造揺らぎをも含む概念図である。 化合物(II)、化合物(III)、化合物(IV)についての生化学活性検証試験結果を示す図である。（実験例１） 化合物(II)、化合物(III)、化合物(IV)についての細胞生物学的活性検証試験を示す図である。（実験例２） Ras部分ポリペプチドと化合物(III)との複合体のNMRの実測データを示す図である。（実施例２） Ras部分ポリペプチドにおける化合物(III)と相互作用しうるアミノ酸残基を示す図である。（実施例４）
　本発明は、NMR情報を用いることを特徴とする、シード化合物から、さらにより効果的なRas機能阻害物質を選別するためのスクリーニング方法に関する。より詳しくは、Rasにおいて分子表面にポケットを有する立体構造をとるRasポリペプチドのNMRによる立体構造情報を利用してRas機能阻害物質をスクリーニングする方法に関する。
　本発明において「候補物質」は、公知又は新規いずれであっても差し支えなく、その構造、由来、物性等にも特に制限はなく、天然化合物、合成化合物、高分子化合物、低分子化合物、ペプチド、核酸類似物のいずれでもよい。候補物質の立体構造の座標化は公知のプログラムを用いればよいが、例えば、低分子化合物の立体構造を座標化するプログラムとして、CORINA(http://www2.chemie.uni-erlangen.de/software/corina/index.html)、Concord(http://www.tripos.com/sciTech/inSilicoDisc/chemInfo/concord.html)、Converter、あるいはCOFIMA(http://www.bpc.uni-frankfurt.de/guentert/wiki/index.php/Software)等を利用することができる。ペプチド、核酸に対しては、CYANA(http://www.las.jp/products/s08_cyana/index.html)、あるいはCNS(http://cns.csb.yale.edu/v1.1/)を利用することができる。
　本発明において、「Ras機能阻害候補物質（ａ）」とは、上述の候補物質から一次スクリーニングによって選別されたRas機能阻害作用を有する物質、即ちRas機能阻害作用を有するシード化合物をいう。また、「Ras機能阻害物質（Ａ）」という場合は、Ras機能阻害候補物質（ａ）の情報を基に選別される誘導体、即ち、Ras機能阻害候補物質（ａ）からより最適化されたリード化合物を意味する。
（Ras機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法）
　本発明のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法の一態様として、以下の工程を含むスクリーニング方法が挙げられる。
１）Ras部分ポリペプチドのNMRシグナルを得る工程；
２）Ras機能阻害候補物質（ａ）を、上記１）に記載のRas部分ポリペプチドと接触させ、得られた複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと、２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いを解析し、Ras機能阻害候補物質（ａ）の誘導体を選別する工程。
　本発明のRas部分ポリペプチドは、Rasタンパク質の部分ポリペプチドに、分子表面にポケットを有する立体構造を形成するような変異を導入した変異型Ras部分ポリペプチドが好適である。ここで、Ras部分ポリペプチドが分子表面にポケットを有する立体構造を形成するためには、GTP若しくはGTPアナログが結合したRas部分ポリペプチド、即ちGTP結合型Ras部分ポリペプチドであることが必要である。GTPアナログは、GTP様の骨格構造を持ち、化学修飾が施されたものや塩を形成させたものが含まれ、GTP結合部位に結合しうるものである。従って、本発明において、Ras部分ポリペプチドについて得られる、結晶、Ｘ線結晶構造解析結果及びNMRシグナルは、すべてGTP結合型Ras部分ポリペプチド（以下、「Ras-GTP」ともいう。）、あるいはRas機能阻害候補物質（ａ）とRas-GTPの複合体より得られるものであることを意味する。Rasにおける分子表面上のポケットは、GDP結合型Ras部分ポリペプチド（以下、「Ras-GDP」ともいう。）の分子表面には存在しないものであり、Ras-GTPに存在することが知られている。当該ポケットは、Rasのアミノ酸配列における、switch領域（switch I領域及びswitch II領域を含む）と呼ばれる領域によって囲まれている。switch領域は、GDP結合型Ras部分ポリペプチドとGTP結合型Ras部分ポリペプチドで大きく立体構造が変化する二つの領域と定義され、Rasが標的分子を認識・活性化する上で重要な領域であり、この近傍にGTPが結合する。
　Ras-GTPを構成する本発明のRas部分ポリペプチドは、具体的には、以下の配列番号１（H-Rasの１～１６６番目）のアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は、配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなる変異型H-Ras部分ポリペプチドをいう。
配列番号１：H-Ras (1-166アミノ酸残基):
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHQYREQIKRVKDSDDVPMVLVGNKCDLAARTVESRQAQDLARSYGIPYIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQH
　配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドとは、配列番号１に示すアミノ酸配列において、２７～４３番目のアミノ酸からなる領域、好ましくは３０～４１番目のアミノ酸からなる領域における、１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたポリペプチをいう。好ましくは当該変異は、３１及び／又は３５番目のアミノ酸の置換であり、特に３５番目のトレオニンの置換であることが好ましい。当該３５番目のトレオニンはセリンに置換されていることが好ましい。以下、当該３５番目のトレオニンはセリンに置換されている変異型H-Rasポリペプチドを「H-Ras T35S」と称する。本発明のRas部分ポリペプチドは、H-Ras T35Sも包含する意味で用いられる。
　ポリペプチドにおけるアミノ酸の変異は、当業者に周知の部位特異的突然変異誘発法により導入することができ、キットを使用して導入してもよい（例えばQuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE社）など）。また、当業者に周知の遺伝子工学的手法を用いて、アミノ酸変異をコードするDNA断片を導入・置換することができる。例えば、PCR反応や制限酵素反応、ライゲーション反応等を組み合わせることで変異型Rasポリペプチドを作製することができる。具体的には、例えばベクターpBR322にサブクローニングしたH-Ras T35S（pBR322H-Ras T35S（1-189アミノ酸残基））を鋳型に使用して、通常のPCRで1-166アミノ酸残基に対応するDNAフラグメントを増幅し、pGEX-6p-1にクローニングして、H-Ras T35Sを作製することができる。
　本発明のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法に用いられるRas機能阻害候補物質（ａ）は、以下の方法により候補物質から選別することができる。
　本発明のRas部分ポリペプチドのうち、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)のいずれかから選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を、候補物質から選別することによる。好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンから選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を、候補物質から選別することによる。
　本発明は、上述の特定のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することによる、当該Ras機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法にも及ぶ。上記において、相互作用とは、Rasタンパク質と特定の物質、例えばRas機能阻害候補物質（ａ）との間に力が働きあうことをいう。相互作用としては、親水性の相互作用（例えば、水素結合、塩橋）、疎水性の相互作用（例えば、疎水結合）、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用など、好ましくは水素結合が挙げられる。
　より具体的には、以下の工程を含む方法により、Ras機能阻害候補物質（ａ）をスクリーニングすることができる。
１）本発明のRas部分ポリペプチドのうち配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上、好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンから選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基をNMR測定可能な同位体で標識したポリペプチドを作製し、当該標識ポリペプチドについてのNMRシグナルを得る工程；
２）候補物質を、１）の工程で作製した標識ポリペプチドと接触させて、候補物質と標識ポリペプチドとの複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いに基づいて、標識ポリペプチドと相互作用しうるRas機能阻害候補物質（ａ）を選別する工程。
　上記において、NMR測定可能な同位体で標識するアミノ酸残基数は４個以上、より好ましくは６個以上である。
　上記において、Ras機能阻害候補物質（ａ）は、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上、好ましくは４個以上、最も好ましくは６個のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することにより、スクリーニングされる。好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンから選択される少なくとも３個以上、好ましくは４個以上、最も好ましくは６個のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することにより、スクリーニングされる。
　Ras部分ポリペプチドの分子表面に存在するポケットを構成するアミノ酸の一部が、上述のアミノ酸残基であると考えられるからである。具体的には、Ras部分ポリペプチドの分子表面に存在するポケットを構成するアミノ酸残基としては、上記配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、少なくとも第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンを含むと考えられる。さらに第３７番目のグルタミン酸、第３８番目のアスパラギン酸、第３９番目のセリン、第６３番目のグルタミン酸、第６４番目のチロシン、第６６番目のアラニン、第７３番目のアルギニンを含むと考えられる。Ras機能阻害候補物質（ａ）は、Ras部分ポリペプチドの分子表面に存在するポケット部位に存在するアミノ酸残基と相互作用することによって、Ras機能阻害作用を発揮する。
　本発明において、本発明のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法に用いられるRas機能阻害候補物質（ａ）は、上記の方法によらず、自体公知の方法、又は今後開発されるあらゆる方法により選別することができる。
　Ras機能阻害候補物質（ａ）の選別方法の例として、例えばRas部分ポリペプチドのＸ線結晶構造解析を用いる方法が挙げられる。具体的には、Ｘ線結晶構造解析により、Ras部分ポリペプチドのポケットを含む立体構造情報を得、当該立体構造情報に基づいて、Ras機能阻害候補物質（ａ）を設計し、又は選択することができる。Ras部分ポリペプチドのＸ線結晶構造解析を行うためには、上記説明したようにRas部分ポリペプチドとGTP若しくはGTPアナログとの共結晶、即ちRas-GTPの共結晶を得ることが必要である。Ras-GTPの共結晶から得られた立体構造情報を用いて、Ras部分ポリペプチドのポケットに結合するRas機能阻害候補物質（ａ）を設計又は選択することができる。得られたRas機能阻害候補物質（ａ）によるRasの機能阻害活性を調べるために、前記Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas又はRas部分ポリペプチドとを接触させてもよい。
　Ras-GTPの共結晶化のためのRas部分ポリペプチドは、Rasファミリーに含まれるものであればよく、H-Ras、N-Ras、K-Rasという３つのRasのアイソフォーム、及び、M-RasやRapなどのホモログであってもよい。Rasタンパク質は、哺乳動物由来であれば特に限定されず、例えばヒト、ウシ、ブタ由来のものなどが含まれる。好ましくはRasは、H-Ras、M-Rasが挙げられる。Rasのポケットを含む立体構造情報を取得するために最も好適なRas部分ポリペプチドとして、変異型Rasポリペプチド、即ちH-Ras T35Sが挙げられる。
　GTPアナログとしては、グアノシン5'-(γ-チオ)-トリホスフェート（GTPγS）や（グアノシン 5'-[β, γ-イミド]トリホスフェート（Gpp(NH)p）が例示されるが、Gpp(NH)pであることが好ましい。Gpp(NH)pは、例えばCALBIOCHEM社のものを購入して用いることができる。
　本発明の共結晶は、以下の方法により作製することができる。まずRas-GTP溶液を作製する。この場合において、Ras-GTPのうち、Ras部分ポリペプチドは、変異型H-Rasポリペプチド、即ちH-Ras T35Sであるのが好適である。Ras-GTPを、緩衝液、塩、還元剤などからなる溶液中に存在させる。緩衝液、塩、還元剤は、Rasポリペプチドの立体構造に影響を与えないものであればいかなるものであってもよいが、例えば、緩衝液は、1～500 mMのNa-HEPES、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Tris-HClなど、塩は、1 mM～1 Mの塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウムなど、還元剤は、0.1～10 mMのβ-メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT)などが例示される。またRas部分ポリペプチド溶液には、ジメチルスルホキシド(DMSO)が含まれていてもよい。Ras部分ポリペプチドを含む溶液は、pH 4～11、好ましくはpH 6～9である。かかるポリペプチド溶液は、そのまま結晶化に用いてもよいし、必要に応じて更に、保存剤や安定化剤、界面活性剤等を添加して、結晶化に用いてもよい。
　タンパク質（ポリペプチド）を結晶化する方法としては、蒸気拡散法、バッチ法、透析法などの一般的なタンパク質結晶化手法を用いることができる。また、タンパク質の結晶化においては、タンパク質の濃度、塩濃度、pH、沈殿剤の種類、温度等の物理的及び化学的因子の決定が重要である。
　蒸気拡散法とは、沈殿剤を含むタンパク質溶液の液滴を、より高濃度の沈殿剤を含む緩衝液（外液）の入った容器中に置き、密封後静置する方法である。液滴の置き方によって、ハンギングドロップ法及びシッティングドロップ法があるが、本発明ではいずれの方法も採用することが可能である。ハンギングドロップ法は、タンパク質溶液の小さな液滴をカバーグラス上に配置し、カバーグラスをリザーバー内で反転させ、密封する方法である。一方、シッティングドロップ法は、リザーバー内部に適切な液滴台を設置し、タンパク質溶液の小滴を液滴台上に配置し、カバーグラス等でリザーバーを密封する方法である。いずれの方法においても、リザーバー中の溶液（リザーバー溶液）には沈殿剤を含有させる。適宜、沈殿剤をタンパク質小滴中に少量含有させてもよい。
　蒸気拡散法で使用するリザーバー溶液は、緩衝液、沈殿剤、塩などからなる溶液である。緩衝液、沈殿剤、塩は、効率よく結晶を作製可能なものであればいかなるものであってもよいが、例えば緩衝液は、pH 4～9、 1～500 mMのNa-HEPES、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、Tris-HCl、酢酸ナトリウム、クエン酸など、沈殿剤は、分子量400～10000、1～50容量％のポリエチレングリコール（PEG）又は0.2～3 Mの硫酸アンモニウムや、1～20容量％のMPD（メチルペンタンジオール）、5～10容量％のイソプロパノールなど、塩は0.05～0.3 Mの塩化ナトリウム、塩化リチウム、塩化マグネシウムなどが例示される。リザーバー溶液の成分は上記に限られるわけではない。
　結晶を用いたＸ線回折による結晶構造解析の手法により電子密度のデータが得られる。電子密度のデータから、電子密度図を作成することができる。電子密度を得て、特定の結晶について特定のＸ線回折装置を用いることにより、立体構造情報が得られる。
　Ras部分ポリペプチドの分子表面にあるポケットに影響を与え得る化合物や、ポケットを埋めることの可能な構造を有する化合物を計算により選択することで、多数の候補物質からRasに特異的なRas機能阻害候補物質（ａ）を効率的に選択することが可能となる。
　上記一次スクリーニング方法では、Ras部分ポリペプチドの立体構造情報を用いて、まずポケットを有する立体構造を表す原子座標と、任意の候補物質の立体構造を表す原子座標とをコンピュータ上で適合させる。次に、その適合状態を、例えば経験的スコアリング関数を指標とすることで数値化して、該候補物質のRas部分ポリペプチドのポケットに対する結合能を評価する。Ras部分ポリペプチドのポケットを有する原子座標としては、Ras部分ポリペプチドの原子座標の全体、ポケットを含むその派生物、及びこれらの一部を利用することができる。またスクリーニングに適するように、ポケット部分の原子座標をコンピュータ上で適宜改変したものを利用してもよい。
　Ras部分ポリペプチドの立体構造情報のうち原子座標を、分子の原子座標を表現するコンピュータプログラムが動作するコンピュータ又はそのコンピュータの記憶媒体に入力することで、Ras-GTPの三次元的な化学的相互作用の様式を詳細に表現することが可能になる。分子の原子座標を表現するコンピュータプログラムは多数市販されているが、これらプログラムは、一般に、分子の原子座標の入力手段、該座標をコンピュータ画面に視覚的に表現する手段、表現された分子内における各原子間の距離や結合角などを測定する手段、該座標の追加修正を行う手段などを備える。さらに、分子の座標を元に分子の構造エネルギーを計算する手段、水分子などの溶媒分子を考慮して自由エネルギーを計算する手段を備えたプログラムを用いることも可能である。アクセルリス社から市販されているコンピュータプログラムであるInsightIIやQUANTAは、本発明のスクリーニング方法に用いるのに好適であるが、本発明に用いられるものはこれらのプログラムに限定されるものではない。
　候補物質の原子座標及びRas部分ポリペプチドのポケットを有する原子座標を同一座標系上で重ね合わせて、両者の適合状態を評価する段階は、上述のような市販パッケージソフトウェアと、該ソフトウェアを作動可能なコンピュータシステムを用いることにより実施可能である。当該コンピュータシステムは、例えば、化合物の構造式を格納する記憶手段、化合物の立体構造を座標化する手段、化合物の原子座標を格納する記憶手段、Rasの原子座標を格納する記憶手段、評価結果を格納する記憶手段、各記憶手段の内容を表示させる手段、キーボード等の入力手段、ディスプレイ等の表示手段、中央処理装置等の、目的のソフトウェアを作動させるのに必要な各種手段を適宜含むものである。
　解析用ソフトウェアとしては、コンピュータ上でタンパク質にリガンドをドッキングさせる操作が可能なソフトウェアであれば何を用いても良く、例えばDOCK、FlexX（トライポス社）、LigandFit（アクセルリス社）、Ludi（アクセルリス社）等を用いてもよい。その他、InsightII等の分子表示ソフトウェアを用いて対話的に行うことも可能である。その際、これらのプログラムを用いて適合状態を評価する際の指標としては、複合体全体の自由エネルギー計算値、経験的スコアリング関数、形の相補性の評価などを任意に選んで使用することができる。この指標により、結合の良否を客観的に評価することが可能となる
　Ras部分ポリペプチドを含むRas-GTPについての原子座標を用いたRas機能阻害候補物質（ａ）の設計又は選択は、コンピュータ上での迅速なスクリーニングを可能とする。
（Ras機能阻害候補物質（ａ））
　本発明のRas機能阻害候補物質（ａ）として、以下の一般式(I)に示す化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基（炭素数１～６）、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
　上記、一般式(I)に示される化合物としては、具体的には、以下の式(II)～(IV)に示す化合物（化合物(II)～(IV)）が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（NMR解析）
　本発明のRas機能阻害物質のスクリーニング方法を行うに際し、Ras部分ポリペプチドについてのNMRシグナル、並びに、Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドと接触させ、得られた複合体についてのNMRシグナルとの違いは、以下のようにして解析することができる。
　水溶液中のRas部分ポリペプチドについてNMR測定を行い、Ras部分ポリペプチドより得られたNMRシグナル（１）と、Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドと接触させて得られた複合体について同様にNMR測定を行い、当該複合体より得られたNMRシグナル（２）、の各NMRシグナルを比較することにより行うことができる。Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドとの複合体についてのシグナル（２）が、Ras部分ポリペプチド単独でのシグナル（１）と異なる場合には、該Ras機能阻害候補物質（ａ）がRas部分ポリペプチドと何らかの相互作用をすると判断することができる。前記水溶液は、有機溶剤を含んでいてもよい。
　上記において、相互作用とは、Rasタンパク質と特定の物質、例えばRas機能阻害候補物質（ａ）との間に力が働きあうことをいう。相互作用としては、親水性の相互作用（例えば、水素結合、塩橋）、疎水性の相互作用（例えば、疎水結合）、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用などを例示することができる。NMRシグナルから、相互作用を有する部位を確認する方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられる。例えば、空間を通じての核オーバーハウザー効果(nuclear overhauser effect: NOE)に基づく情報や、NMRシグナルを基に構築して得られた立体構造モデルから、例えばCCP4 program suit（Collaborative Computational Project Number 4. (1994) Acta Crystallogr. D 50, 760-763）にあるCONTACTというプログラムを使用して、相互作用するアミノ残基を同定することができ、あるいは目視で得られる情報により、判断することができる。Ras部分ポリペプチドについての立体構造モデルは、図１を参照することができ、Ras機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドの複合体についての立体構造モデルは、図２又は３を参照することができる。なお、タンパク質の性質上、タンパク質機能に関係した構造揺らぎが認められるが、Ras部分ポリペプチド並びにRas部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）の複合体についても構造揺らぎが認められる。図１～３各図は、揺らぎによる構造変化も示されている。
　Ras部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）の複合体の立体構造情報に基づき、複合体モデル上で目視あるいはドッキングシミュレーションソフトを利用して、より安定な複合体を形成させるための当該Ras機能阻害候補物質（ａ）に対する化合物の構造修飾を行うことができる。さらに、Ras機能阻害候補物質（ａ）に対して修飾された構造修飾化合物の構造において、毒性発現の可能性が高い置換基や代謝的に不安定な化学構造を、生物学的等価体と置換する形でより高活性でなおかつ低毒性の新規誘導体をデザイン・合成することができ、リード化合物となり得るRas機能阻害物質（Ａ）を導き出すことができる。かかるシミュレーションを利用して選別されたるRas機能阻害物質（Ａ）は、さらにin vitro又はin vivoによるウェットのアッセイによる活性・毒性検証を行うこともできる。
　ここで、上記２つのシグナルのうち、変化したシグナルがどのアミノ酸残基であるかを特定することにより、Ras部分ポリペプチドに対して、Ras機能阻害候補物質（ａ）が相互作用しているアミノ酸残基を特定することもできる。
　具体的には、本発明において、上述の一般式(I)に示すRas機能阻害候補物質（ａ）、より具体的には式(II)～(IV)に示す化合物(II)～(IV)であるRas機能阻害候補物質（ａ）とRas部分ポリペプチドとの相互作用を有する部位は、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)のいずれか１以上であり、少なくとも第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンが挙げられる。また、タンパク質の性質上、タンパク質機能に関係した構造揺らぎが認められるが、Ras部分ポリペプチドについても、構造揺らぎが認められる。揺らぎに応じて、Ras部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）との相互作用により結合しているアミノ酸残基についても違いが認められる。揺らぎに応じて得た１５種類の構造について解析した結果、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)のいずれか１以上であり、少なくとも第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンがRas部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）との相互作用に関連するアミノ酸残基であることが認められた。
　また、本発明のNMRの測定はRas部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）の複合体を、3～10℃、好ましくは5±1℃でDMSO（10-30％）を含む水溶液中で測定することができる。NMR測定法としては、同種核多次元NMR測定若しくは異種核多次元NMR測定等が好ましく用いられる。例えば、1H-15NHSQCと呼ばれるNMR測定法により行うことができる。かかる測定は当業者に既知の技術である。簡単にいうと、1H-15NHSQCは、タンパク質中のペプチド結合における水素原子と窒素原子との相関スペクトル、すなわち1H-15N相関スペクトルであり、主鎖由来の1H-15Nシグナルから個々の残基の情報を得ることができる。かかるNMR測定方法により、タンパク質等の標的高分子物質の立体構造解析が可能となり、タンパク質の相互作用解析が可能となる。
　「Ras部分ポリペプチド」又は「Ras部分ポリペプチドとRas機能阻害候補物質（ａ）の複合体」のNMR測定のための試料としての、Ras部分ポリペプチドを遺伝子組み換えの手法により作製する場合には、発現させたポリペプチドの精製を容易にするために精製用のタグを付加した融合ポリペプチドを作製することができる。特定のリガンドに親和性を持ったタンパク質やペプチド配列（アフィニティー精製用タグ）との融合ポリペプチドとして生産することにより、該融合ポリペプチドを該リガンドを担体に用いたアフィニティークロマトグラフィー等により効率的に精製することができる。例えば精製用タグとして、6Xヒスチジンタグ、FLAGタグ、GST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）タグ、マルトース結合タンパク質やプロテインAなどがある。また、目的とするポリペプチドと精製用タグとの間に特異的プロテアーゼにより認識され、切断を受けるアミノ酸配列を予め挿入しておくことにより、該融合ポリペプチドを開裂させて目的ポリペプチド質のみを回収することが可能である。例えば、PreScissionプロテアーゼ、ファクターXa、トロンビン、エンテロキナーゼやコラゲナーゼ等を特異的プロテアーゼとして用いたものがある。これらのプロテアーゼで切断した後、数個のアミノ酸が目的ポリペプチドの末端に残存することがあるが、活性に影響を及ぼさない限りは目的ポリペプチドとして本発明のNMRシグナルを得るための試料とすることができる。
　本発明のスクリーニング方法により得られたRas機能阻害物質（Ａ）は、Rasの機能異常により発生しうる種々の疾患を治療、予防する作用、例えば抗癌作用を有すると考えられる。従って、本発明のRas機能阻害物質（Ａ）を有効成分とする医薬、例えば抗癌剤等の腫瘍の治療薬として使用することができる。本発明のRas機能阻害物質（Ａ）の抗腫瘍効果は、当該Ras機能阻害物質（Ａ）の存在下で、癌細胞を培養し癌化形質が抑制されるかを調べ、あるいは、担癌モデル動物を用いて行うことができる。
　以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
（実施例１）Ras機能阻害候補物質（ａ）について
　本発明のRas機能阻害候補物質（ａ）として、以下の式(II)～(IV)に示す化合物（各々、化合物(II)、化合物(III)、化合物(IV)）をＸ線構造解析の立体構造情報から、インシリコ(in silico)スクリーニングにより得た。具体的には、化合物(II)はドッキングシミュレーション（MMPB-SA法）によりスクリーニングして得られ、化合物(III)及び化合物(IV)は、化合物(II)の類縁体探索（Tanimoto係数を指標に）でインシリコスクリーニングし、得られた。これらの化合物は、下記実験例１及び２に示す生化学・細胞学的活性検証試験を通じて同定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（実験例１）生化学活性検証試験
　本実験例では、生化学活性検証試験により、実施例１で得た化合物(II)、化合物(III)及び化合物(IV)について、Ras-Raf結合阻害活性を確認した。本実験例において、RasとしてヒトH-Rasポリペプチド（1-166アミノ酸残基）を用い、GTPとしてGTPアナログ（GTPγ S(Roche Diagnotics)）を用いた。また、Rasの標的蛋白質であるRafとして、ヒトc-Raf-1（51-130アミノ酸残基）を用いた。
１）GST-Raf融合蛋白質
　Rasの標的蛋白質であるRafとGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）との融合蛋白質を、GST融合蛋白質発現用ベクター（pGEX-6P-1 vector (GE Healthcare)）を用いて大腸菌で発現させた。発現したGST-Raf融合蛋白質を精製用アフィニティー担体（glutathione Sepharose 4B：レジン (GE Healthcare)）に固定した。
２）Ras放射性ラベル体
　GST融合蛋白質切断用プロテアーゼ（PreScission protease (GE Healthcare)）を用いてGSTタグを切断したRasに、GTPアナログの一つであるGTPγ[35S]（Perkin Elmer）を付加し、Ras放射性ラベル体を作製した。
３）Ras-Raf結合阻害活性の測定
　上記１）でレジンに固定したGST-Raf融合蛋白質と２）のRas放射性ラベル体を、10% DMSOに可溶化した種々の濃度の化合物（化合物(II)、化合物(III)又は化合物(IV)）存在下でインキュベートし、RasとRafとの結合反応を促した。反応液中のレジンを洗浄後、グルタチオンの添加によりGST-Raf融合蛋白質とRas放射性ラベル体との複合体を溶出した。溶出液の放射活性をシンチレーションカウンティングすることにより、RasとRafとの結合活性を測定し、各種化合物によるRas-Raf結合阻害活性を評価した。その結果、これらの化合物はRasに相互作用することが確認された（図４）。
（実験例２）細胞学的活性検証試験
　本実験例では、細胞学的活性検証試験により、実施例１で得た化合物(II)、化合物(III)及び化合物(IV)について、足場非依存性細胞増殖阻害活性を確認した。
　0.6% SeaPlaque(R) agarose (Lonza, Rockland, Inc., ME, USA)を含む細胞培地の上に、H-Ras, N-Ras, K-Rasのいずれかの活性型変異を有する各種培養細胞株を各々懸濁した培地と、化合物（化合物(II)、化合物(III)又は化合物(IV)）を混合した培地を、培養容器に播種し、３７℃で２週間培養し、出現した直径50 μm以上のサイズのコロニー数を測定した。化合物を含まない系で培養細胞株を懸濁した培地について、同様にコロニー数を測定し、コントロール（100%）とした。コントロールに対する化合物投与群でのコロニー形成の阻害率を算出することにより、化合物のコロニー形成阻害活性（足場非依存性細胞増殖阻害活性）を評価した。その結果、これらの化合物は、各細胞についてコロニー形成阻害効果が認められ、上記３種類のRasに相互作用することが確認された（図５）。
（実施例２）Rasと化合物(III)との複合体のNMRの実測データ
　本実施例では、Rasと化合物(III)との複合体についてNMRの実測データを示す。本実施例では、Rasとして変異型H-RasであるH-Ras T35S（1-166アミノ酸残基）を用い、GTPとしてGTPアナログ（Gpp(NH)p：CALBIOCHEM社）を用いた。以下の実施例でも同様である。
１）Ras-GTPと化合物(III)との複合体の作製
　NMRによりRasのポケットを含む立体構造情報を取得するために、まず初めにRasを含むRas-GTPを作製することが必要である。Ras 3.6mgとGTP 1.1mgをpH中性の緩衝液1 mLに溶解し、Ras-GTPを作製した。次に、Ras-GTP 3.6mgを重水素化された緩衝溶液（pH6.8）0.16mLに溶解し、Ras-GTP溶液を調製した。化合物(III) 0.3 mgを重水素化されたDMSO（ジメチルスルホキシド）0.04 mLに溶解し、化合物(III)溶液を調製した。前記Ras-GTP溶液と化合物(III)溶液を混合し、20％DMSO、5℃条件でRas-GTPと化合物(III)の複合体を作製した。
２）13C-separeted NOESY-HSQCスペクトルによるNMR解析
　Ras-GTPと化合物(III)の複合体について、13C-separeted NOESY-HSQCスペクトルによるNMR解析を行った。13C-separated NOESY-HSQCスペクトルでは、化合物(III)及びRas-GTPに由来する特定の水素同士が空間的に接近していると、両者の化学シフトが交差する位置にピークを生じる。スペクトルは炭素の化学シフトによって分離されている為、交差ピークを与える水素がどのアミノ酸あるいは原子団に由来しているかを帰属する事が可能である。従って、本方法によると、Ras-GTPと化合物(III)との間の相互作用を直接的にかつ原子レベルで示す事ができる。図６では化合物(III)に由来する水素と、Ras-GTP中のRas部分のポリペプチドにおける第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、及び第７４番目のトレオニンの側鎖に由来する水素との間に出現した交差ピークを示した。なお、図６中KOB316は化合物(III)を意味する。
（実施例３）Rasと化合物(III)に近接するアミノ酸の距離情報
　実施例２と同手法により作製したRas-GTPと化合物(III)との複合体に関し、Rasと化合物(III)に近接するアミノ酸の距離情報（NOE情報）を確認した。Ras-GTPと化合物(III)との複合体について、実施例２と同様に13C-separated NOESY-HSQCスペクトルによるNMR解析を行った。13C-separated NOESY-HSQCにおける交差ピークの積分強度は水素間の距離に依存するため、化合物(III)とRas-GTPの間の距離情報に変換する事が可能である。各々の交差ピークを基にして得られた、化合物(III)に近接するRasのアミノ酸の距離情報を表１に示した。具体的には、Ras-GTP中のRasにおける第５番目のリジン、第５６番目のロイシン、第６７番目のメチオニン、第７０番目のグルタミン、第７１番目のチロシン、及び第７４番目のトレオニンから選択されるアミノ酸残基の側鎖に由来する水素原子と化合物(III)の特定の水素原子との距離情報を示した。１種のアミノ酸に対して、複数の距離情報が認められるのは、各アミノ酸の中に幾つかの水素核種が存在し、その各々に対して相当する距離情報が存在する事を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（実施例４）Rasと化合物(III)に近接するアミノ酸の距離情報
　実施例２と同手法により作製したRas-GTPと、化合物(III)(kobe2601)との複合体に関し、１５種類の複合体のNMR構造に基づき、CCP4 program suit（Collaborative Computational Project Number 4. (1994) Acta Crystallogr. D 50, 760-763）にあるCONTACTというプログラムで計算を行った。その結果、化合物(III)との相互作用が確認できた残基群（１）及びポケットの隙間を埋める形で選んだ残基群（２）を以下に示す。配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合、（１）第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)であり、（２）は、第６番目のロイシン(L)、第７番目のバリン(V)、第３６番目のイソロイシン(I)、第４１番目のアルギニン(R)、第５４番目のアスパラギン酸(D)、第５５番目のイソロイシン(I)、第５７番目のアスパラギン酸(D)、第５８番目のトレオニン(T)、第５９番目のアラニン(A)、第６５番目のセリン(S)、第７５番目のグリシン(G)である。以下、１５種類の複合体モデルについて、算出されたCONTACT情報を、表２～表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000060
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000062
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000063
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000064
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000065
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000066
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000067
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000068
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000069
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000070
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000071
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000072
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000073
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000074
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000075
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000076
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000077
　以上説明したように、RasポリペプチドとRas機能阻害物質との相互作用に重要な部位のアミノ酸残基を確認することができた。当該重要なアミノ酸残基と相互作用しうる物質をスクリーニングすることで、効果的にスクリーニングを行うことができる。さらには、当該RasポリペプチドのNMRによる立体構造情報と、Rasポリペプチドとシード化合物との複合体のNMRによる立体構造情報との差異を確認することで、Ras機能阻害候補物質（ａ）の誘導体であるRas機能阻害物質（Ａ）の構造を効率的に推定することができる。つまり、Ras機能阻害候補物質（ａ）に対して修飾された構造修飾化合物の構造において、毒性発現の可能性が高い置換基や代謝的に不安定な化学構造を、生物学的等価体と置換する形で新規誘導体をデザイン・合成することができ、リード化合物となり得るRas機能阻害物質（Ａ）を導き出すことができる。
　得られたRas機能阻害物質（Ａ）は、Rasの機能異常により発生しうる種々の疾患の治療・予防作用、例えば抗癌作用を有すると考えられる。従って、本発明のRas機能阻害物質（Ａ）を有効成分とする医薬、例えば抗癌剤等の腫瘍の治療薬として使用することができる。

Claims (12)

  1. 以下の工程を含む、Ras機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法：
    １）配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドのNMRシグナルを得る工程；
    ２）Ras機能阻害候補物質（ａ）を、上記１）に記載のRas部分ポリペプチドと接触させ、得られた複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
    ３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと、２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いを解析し、Ras機能阻害候補物質（ａ）の誘導体であるRas機能阻害物質（Ａ）を選別する工程。
  2. 配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質を選別することを特徴とする、Ras機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法。
  3. 以下の工程を含む、請求項２に記載のRas機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法：
    １）請求項２に記載の部分ポリペプチドのうち、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基をNMR測定可能な同位体で標識したポリペプチドを作製し、当該標識ポリペプチドについてのNMRシグナルを得る工程；
    ２）候補物質を、１）の工程で作製した標識ポリペプチドと接触させて、候補物質と標識ポリペプチドとの複合体についてのNMRシグナルを得る工程；
    ３）上記１）の工程で得られたNMRシグナルと２）の工程で得られたNMRシグナルとの違いに基づいて、標識ポリペプチドと相互作用しうる物質を、Ras機能阻害候補物質（ａ）として選別する工程。
  4. Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載のRas機能阻害物質（Ａ）又は請求項２～３のいずれか１に記載のRas機能阻害候補物質（ａ）のスクリーニング方法。
  5. Ras機能阻害候補物質（ａ）が、以下の一般式(I)で表される、請求項１に記載のRas機能阻害物質（Ａ）のスクリーニング方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
  6. 以下の一般式(I)で表されるRas機能阻害候補物質（ａ）を有効成分とするRas機能阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
  7. 配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドと、以下の一般式(I)で表されるRas機能阻害候補物質（ａ）との複合体。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は独立して水素原子、ハロゲン基、低級アルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基からなる群から選択される。）
  8. Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項７に記載の複合体。
  9. NMRシグナルにより特定される請求項７又は８に記載の複合体。
  10. 配列番号１に示すアミノ酸配列、又は配列番号１に示すアミノ酸配列から１～３個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるRas部分ポリペプチドを含む水溶液であって、
    当該Ras部分ポリペプチドの立体構造が、以下の１）及び２）であること特徴とするRas部分ポリペプチド含有水溶液：
    １）当該Ras部分ポリペプチドの立体構造が、特定の物質と結合しうるポケットを有する立体構造からなり；
    ２）当該特定の物質が、当該Ras部分ポリペプチドにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列を基準とした場合に、第５番目のリジン(K)、第３７番目のグルタミン酸(E)、第３８番目のアスパラギン酸(D)、第３９番目のセリン(S)、第５６番目のロイシン(L)、第６３番目のグルタミン酸(E)、第６４番目のチロシン(Y)、第６６番目のアラニン(A)、第６７番目のメチオニン(M)、第７０番目のグルタミン(Q)、第７１番目のチロシン(Y)、第７３番目のアルギニン(R)、及び第７４番目のトレオニン(T)から選択される少なくとも３個以上のアミノ酸残基と相互作用しうる物質である。
  11. Ras部分ポリペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち、３５番目のトレオニンがセリンに置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１０に記載のRas部分ポリペプチド含有水溶液。
  12. 特定の物質が、一般式(I)に示されるＲａｓ機能阻害剤(a)であることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載のRas部分ポリペプチド含有水溶液。
PCT/JP2012/052078 2011-02-07 2012-01-31 Ras部分ポリペプチド含有水溶液及びRas機能阻害剤のスクリーニング方法 Ceased WO2012108297A1 (ja)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012556832A JPWO2012108297A1 (ja) 2011-02-07 2012-01-31 Ｒａｓ部分ポリペプチド含有水溶液及びＲａｓ機能阻害剤のスクリーニング方法
US13/984,027 US20140024123A1 (en) 2011-02-07 2012-01-31 Aqueous Solution Containing Partial Ras Polypeptide and Method for Screening Inhibitor of Ras Function

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011023695 2011-02-07
JP2011-023695 2011-02-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012108297A1 true WO2012108297A1 (ja) 2012-08-16

Family

ID=46638513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/052078 Ceased WO2012108297A1 (ja) 2011-02-07 2012-01-31 Ras部分ポリペプチド含有水溶液及びRas機能阻害剤のスクリーニング方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20140024123A1 (ja)
JP (1) JPWO2012108297A1 (ja)
WO (1) WO2012108297A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021172326A1 (en) * 2020-02-24 2021-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited Determination of modification degree of therapeutic proteins using 1h-nmr spectroscopy

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016176338A1 (en) * 2015-04-30 2016-11-03 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Small molecule ras ligands

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11513498A (ja) * 1995-11-14 1999-11-16 アボツト・ラボラトリーズ 生体分子の標的用リガンドを同定するための核磁気共鳴の使用
JP2010169694A (ja) * 2003-11-28 2010-08-05 Hitachi Ltd 核磁気共鳴法を用いた、標的タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、およびこの方法に用いるプログラム
WO2011007773A1 (ja) * 2009-07-14 2011-01-20 国立大学法人神戸大学 変異型Rasポリペプチドの結晶

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11513498A (ja) * 1995-11-14 1999-11-16 アボツト・ラボラトリーズ 生体分子の標的用リガンドを同定するための核磁気共鳴の使用
JP2010169694A (ja) * 2003-11-28 2010-08-05 Hitachi Ltd 核磁気共鳴法を用いた、標的タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、およびこの方法に用いるプログラム
WO2011007773A1 (ja) * 2009-07-14 2011-01-20 国立大学法人神戸大学 変異型Rasポリペプチドの結晶

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHIMA F ET AL.: "Structural Basis for Conformational Dynamics of GTP-bou Ras Protein", J BIOL CHEM, vol. 285, no. 29, 16 July 2010 (2010-07-16), pages 22696 - 22705 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021172326A1 (en) * 2020-02-24 2021-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited Determination of modification degree of therapeutic proteins using 1h-nmr spectroscopy
JP2023515515A (ja) * 2020-02-24 2023-04-13 武田薬品工業株式会社 １ｈ－ｎｍｒ分光法を使用した治療用タンパク質の修飾度の決定方法
JP7684982B2 (ja) 2020-02-24 2025-05-28 武田薬品工業株式会社 １ｈ－ｎｍｒ分光法を使用した治療用タンパク質の修飾度の決定方法
US12553842B2 (en) 2020-02-24 2026-02-17 Takeda Pharmaceutical Company Limited Determination of modification degree of therapeutic proteins using 1H-NMR spectroscopy

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2012108297A1 (ja) 2014-07-03
US20140024123A1 (en) 2014-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dixon et al. Predicting the structural basis of targeted protein degradation by integrating molecular dynamics simulations with structural mass spectrometry
Oxley et al. An integrin phosphorylation switch: the effect of β3 integrin tail phosphorylation on Dok1 and talin binding
des Georges et al. Structural basis for gating and activation of RyR1
Pappa et al. Crystal structure of the C2 domain from protein kinase C-δ
Carafoli et al. Crystallographic insight into collagen recognition by discoidin domain receptor 2
Venselaar et al. Homology modelling and spectroscopy, a never-ending love story
Kumar et al. Short linear sequence motif LxxPTPh targets diverse proteins to growing microtubule ends
Huang et al. Structural basis for the activation of platelet integrin αIIbβ3 by calcium-and integrin-binding protein 1
Liu et al. The structure of the Tiam1 PDZ domain/phospho-syndecan1 complex reveals a ligand conformation that modulates protein dynamics
Duffy et al. Discovery of a new chemical series of BRD4 (1) inhibitors using protein-ligand docking and structure-guided design
Piazza et al. Structural studies of a complex between endothelial nitric oxide synthase and calmodulin at physiological calcium concentration
Huang et al. Symmetry and asymmetry of the RING–RING dimer of Rad18
de Barros et al. Structural and calorimetric studies demonstrate that xeroderma pigmentosum type G (XPG) can be imported to the nucleus by a classical nuclear import pathway via a monopartite NLS sequence
Brosey et al. NADH-bound AIF activates the mitochondrial CHCHD4/MIA40 chaperone by a substrate-mimicry mechanism
US20110166032A1 (en) Design and Use of Sortilin Specific Molecular Imaging Ligands
Yu et al. The Crystal Structure of Calmodulin Bound to the Cardiac Ryanodine Receptor (RyR2) at Residues Phe4246–Val4271 Reveals a Fifth Calcium Binding Site
Lorenz et al. Structural analysis of the interactions between paxillin LD motifs and α-parvin
Chua et al. Structure and binding interface of the cytosolic tails of αXβ2 integrin
Satoh et al. Crystal structures of inhibitor complexes of human T-cell leukemia virus (HTLV-1) protease
WO2012108297A1 (ja) Ras部分ポリペプチド含有水溶液及びRas機能阻害剤のスクリーニング方法
US20040197893A1 (en) HDM2-inhibitor complexes and uses thereof
Huang et al. Solution structures of Ca2+-CIB1 and Mg2+-CIB1 and their interactions with the platelet integrin αIIb cytoplasmic domain
Mariasina et al. Williams-Beuren syndrome related methyltransferase WBSCR27: from structure to possible function
Banasik et al. Structural dynamics of the TPR domain of the peroxisomal cargo receptor Pex5 in Trypanosoma
Guttman et al. The structure, dynamics, and binding of the LA45 module pair of the low-density lipoprotein receptor suggest an important role for LA4 in ligand release

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12745257

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012556832

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13984027

Country of ref document: US

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12745257

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1