WO2012104461A1 - Desarrollo y uso de nanopartículas poliméricas que comprenden poli (epsilón-caprolactona) y doxorrubicina - Google Patents

Desarrollo y uso de nanopartículas poliméricas que comprenden poli (epsilón-caprolactona) y doxorrubicina Download PDF

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José Carlos PRADOS SALAZAR
Antonia ARÁNEGA JIMÉNEZ
Consolación MELGUIZO ALONSO
Raúl ORTIZ QUESADA
Adolfina RUÍZ MARTÍNEZ
Visitación GALLARDO LARA
José Luís ARIAS MEDIANO
Ana Rosa Rama Ballesteros
Juan Ramón DELGADO PÉREZ
Raquel LUQUE CARO
Encarnación GONZÁLEZ FLORES
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Universidad de Granada
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Universidad de Granada
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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to polymeric nanoparticles with an average size of less than 200 nm, comprising one or more biodegradable polymers, one or more active ingredients and at least one surfactant, where at least one biodegradable polymer is poly (£ -caprolactone) and where at least one active ingredient is doxorubicin, and the use of said nanoparticles for the preparation of medicaments for the treatment of cancer, preferably breast cancer. Therefore, the present invention is encompassed in the field of pharmaceutical art.
  • Doxorubicin is an anticancer drug belonging to the group of nucleoside analogues, whose antitumor efficacy has been widely demonstrated in the treatment of a wide variety of solid tumors.
  • this chemotherapeutic agent has numerous drawbacks that seriously condition a wide clinical use. Specifically, the development of resistance by cancer cells, and a very poor pharmacokinetic profile (very short plasma half-life, due to its rapid metabolism). All this determines that large doses are necessary to obtain an adequate therapeutic effect, which is associated with the occurrence of severe adverse effects (Grosse PY, Bresolle F, Rouanet P, Joulia JM, Pinguet F. Int. J. Pharm. 180 (1999 ) 215).
  • Relay 100 (2004) 29 describes PEG-coated poly (hexylcyanoacrylate) nanoparticles and loaded with doxorubicin. They have a loading capacity ⁇ drug loading) of doxorubicin between only 5.7 and 9.4%. In addition, its average size is between 150 and 200 nm. Due to the average sizes, these nanoparticles have the same drawbacks as those described by N. Chiannilkulchai et al.
  • nanoparticles described in the work entitled Nano-Sized Micelles of Block Copolymers of Methoxy Poly (ethylene glycol) -Poly (e-caprolactone) -Graft-2- Hydroxyethyl Cellulose for Doxorubicin Delivery (J. Nanosci. Nanotechnol. 8 (2008) 2362 ) are composed of a copolymer of methoxy-PEG, ⁇ ( ⁇ -caprolactone) and hydroxyethylcellulose loaded with doxorubicin. Its average size is much larger (340.7 nm).
  • Doxorubicin associated with nanoparticles has also been studied to improve its biological characteristics in tumor cells by Shuaia and cois. (Micellar carriers based on block copolymers of poly (e-caprolactone) and poly (ethylene glycol) for doxorubicin delivery (J. Controlled Re ⁇ . 98 (2004) 415)). This study is conducted in the MCF-7 line of breast cancer. The results of the authors demonstrate that by using the copolymer poly (£ -caprolactone) and PEG there is an increase in the entry of doxorubicin inside the tumor cell. However, Shuaia and cois. indicates that most of the drug is located in the cytoplasm.
  • the inhibitory dose (IC50) of the nanoparticle bound doxorubin (0.033-0.048 ⁇ ) is higher than that determined for free doxorubicin (0.001 ⁇ ).
  • copolymers of poly (varepsilon-caprolactone) -polyphosphoester associated with doxorubicin for the treatment of tumor cells Doxorubicin-Loaded Nanosized Micelles of a Star-Shaped Poly (varepsilon-Caprolactone) -Polyphosphoester Block Co-treatment for Co-treatment Human Breast Cancer, J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2010, doi: 10.1 163 / 092050610X510533).
  • the present invention relates to polymeric nanoparticles comprising poly (£ -caprolactone) and doxorubicin, henceforth the nanoparticles of the invention.
  • the present inventors have discovered that surprisingly the nanoparticles of the invention behave as an excellent doxorubicin transport system.
  • the nanoparticles of the invention allow a high vehiculization of the anticancer agent, achieve a very high extravasation in the tumor mass and, in turn, a more controlled release of it.
  • studies of in vitro antitumor efficacy have demonstrated a very significant increase in the antitumor activity of this drug when it is vehiculized through the nanoparticles of the invention.
  • the nanoparticles of the invention modulate the IC50, that is the concentration of drug that is capable of reducing by 50% the number of tumor cells when applied to a cell culture, of doxorubicin in breast cancer cells and help to the incorporation of this agent into the tumor cell.
  • IC50 concentration of drug that is capable of reducing by 50% the number of tumor cells when applied to a cell culture
  • doxorubicin in breast cancer cells help to the incorporation of this agent into the tumor cell.
  • a first aspect of the invention relates to a polymeric nanoparticle with an average size of less than 200 nm, preferably less than 190 nm, comprising one or more biodegradable polymers, one or more active ingredients and at least one surfactant, where at least one biodegradable polymer is poly (£ -caprolactone) and where at least one active ingredient is doxorubicin.
  • a second aspect of the invention relates to a process for the synthesis of a polymeric nanoparticle with an average size of less than 200 nm, preferably less than 190 nm, comprising one or more biodegradable polymers, one or more active ingredients and at least one surfactant, where at least one biodegradable polymer is poly (£ -caprolactone) and where at least one active ingredient is doxorubicin.
  • the polymeric nanoparticles of the invention are preferably synthesized by the interfacial arrangement method of the polymer, consisting of: i) dissolving poly (£ -caprolactone) in an organic solvent, preferably dichloromethane;
  • a third aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the nanoparticles of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a fourth aspect of the invention relates to the therapeutic use of the nanoparticle of the invention or of the pharmaceutical composition comprising the nanoparticle of the invention according to the first and / or second aspects or any of its particular embodiments of said aspects.
  • nanoparticles that include drugs such as, for example, the continuous emulsion polymerization method in the aqueous phase, the continuous emulsion polymerization method in the organic phase, the interfacial polymerization, the arrangement Interfacial polymer with solvent evaporation, macromolecule desolvation and dialysis methods (Marty et al. Nanoparticles - a new colloidal drug delivery system (Pharm Acta Helv 53 (1978) 17)).
  • the nanoparticles of the invention are preferably synthesized by means of interfacial arrangement method of the polymer.
  • the interfacial arrangement of polymers is a process for the preparation of biodegradable nanoparticles, or nanospheres.
  • the biodegradable polymer is first dissolved in an organic solvent, for example acetone or dichloromethane.
  • the resulting organic solution is poured under stirring into the water containing surfactant, such as a polaxamer, with which the aqueous phase immediately becomes a milky solution, indicating the formation of nanoparticles.
  • the organic solvent is removed under reduced pressure.
  • the colloidal suspension formed is concentrated to the desired volume.
  • the use of the interfacial arrangement of polymers for the synthesis of the nanoparticles of the invention entails several advantages. In addition to being a simple and fast synthesis, it allows nanoparticles with very relevant characteristics to be obtained such as: a very small size colloidal system with very low average sizes, and also very low polydispersions (reaching average diameters of up to 95 ⁇ 7 nm). The process allows a much higher drug load, which among other advantages makes it possible for the amount of polymeric material administered to be less.
  • the nanoparticle synthesis process of the invention of poly (£ -caprolactone) is based on the method of interfacial arrangement of polymers.
  • the polymeric nanoparticle is obtained by the process comprising the following steps:
  • the superficial association consists in the incorporation by adsorption of the antitumor drug doxorubicin on the surface of the previously obtained polymeric nanoparticles.
  • the chemotherapeutic agent is incorporated into the nanoparticles by absorption. This process is very similar with the only difference that the antisolvent also comprises doxorubicin, normally dissolved at a molar concentration of drug up to 0.01.
  • the process further comprises an evaporation step of the organic solvent, preferably under reduced pressure.
  • Step (iii) can be carried out by centrifugation, preferably at less than 30,000 rpm, more preferably between 5,000 and 15,000 rpm.
  • the process can also comprise consecutive stages of redispersion of the polymeric nanoparticles and new centrifugation, up to the conductivity of the supernatant is less than or equal to 10 ⁇ / ⁇ .
  • the conductivity of the supernatant obtained was determined at 25.0 ⁇ 0.5 ° C using a Crison micropH 2001 conductivity meter (Spain).
  • the redispersion of the sediment obtained after centrifugation of the nanoparticles can be performed by adding double distilled water to this sediment and exposing this mixture (at 25.0 ⁇ 0.5 ° C) to ultrasound (450 W, Branson 5200E4 ultrasonic bath , USA).
  • Step (i) of the process is preferably performed sequentially.
  • the preferred solvents used in step (i) are water or mixtures of water and an organic solvent, preferably a Ci-C 4 alcohol. More preferably the antisolvent is water.
  • the temperature at which the association is carried out inside the polymer matrix during step (i) is preferably below 60 ° C, more preferably below 35 ° C, and even more preferably at about 25 ° C .
  • the surface adsorption procedure usually lasts 24 hours. Incorporation in matrix (absorption) can be done in 1 hour (noticeably shorter time). It is interesting to note that the drug absorption procedure inside the nanoparticles allows to obtain a greater doxorubicin vehiculization. Good results have been obtained with nanoparticles having an average particle size between 65 and 150 nm, more preferably between 75 and 125 nm, even more preferably between 85 and 15 nm, and still more preferably about 95 nm.
  • the surfactant and the poly (£ -caprolactone) are not covalently bound, that is the surfactant and the poly (£ -caprolactone) are two different and independent chemical compounds.
  • the size of the biodegradable polymer of poly (£ -caprolactone) is not restricted, but good results are obtained when it has a molecular weight of less than 100,000 Daltons, preferably between 5,000 and 45,000 Daltons, and even more preferably between 7,000 and 20,000 Daltons, and even more preferably it is about 10,000 Dantons.
  • Poly (£ -caprolactone) and doxorubicin are in a sufficient ratio to remain associated.
  • the ratio sufficient to remain associated with ⁇ ( ⁇ -caprolactone) and doxorubicin normally varies between 1000: 1 and 1: 50 p / p respectively, more preferably it is a ratio between 1: 5 and 1: 15 p / p.
  • the polymeric nanoparticle comprises a biodegradable polymer consisting of poly (£ -caprolactone), that is, exclusively caprolactone polymers and never copolymers are used. It preferably comprises only as a biodegradable polymer ⁇ ( ⁇ -caprolactone).
  • the polymeric nanoparticle comprises only doxorubicin as the active ingredient, and more preferably the nanoparticle further comprises a biodegradable polymer consisting of poly (--caprolactone).
  • the polymeric nanoparticle comprises only a biodegradable polymer consisting of poly (£ -caprolactone).
  • the amount of doxorubicin in the polymeric nanoparticle of the invention is preferably comprised between 0.1% and 25% w / w, more preferably between 15% and 20% w / w.
  • the amount of poly (£ -caprolactone) in the polymeric nanoparticle of the invention is preferably between 70% and 99.8% w / w, more preferably between 79% and 84.5% w / w.
  • the amount of surfactant in the polymeric nanoparticle of the invention is preferably comprised between 0.1% and 2% w / w, more preferably between 0.5% and 1% w / w.
  • Another embodiment of the present invention refers to a polymeric nanoparticle with an average size of between 65 and 150 nm, comprising between 70% and 99.8% w / w poly (£ -caprolactone), between 0, 1% and 25% w / w doxorubicin, and between 0.1% and 2% w / w surfactant, where the surfactant and the poly (£ -caprolactone) are not covalently bound.
  • Another embodiment of the present invention refers to a polymeric nanoparticle obtainable by the process comprising the following steps: i) the dissolution of poly (£ -caprolactone) in an organic solvent, preferably dichloromethane;
  • composition of the invention comprises:
  • the pharmaceutical compositions of the present invention comprise at least one pharmaceutically acceptable excipient that is a diluent.
  • a diluent is water.
  • the diluent is microcrystalline cellulose, lactose or any combination thereof.
  • the pharmaceutical composition of the invention is particularly adapted for parental use, preferably for intravenous, intraarterial, intratumoral, intramuscular or subcutaneous use.
  • Parenteral compositions preferably comprise water. Even more preferably the nanoparticles of the invention are dispersed in an aqueous solution.
  • the pharmaceutical composition of the invention is in oral solid form, preferably in tablets or capsules.
  • the pharmaceutical composition preferably further comprises microcrystalline cellulose, lactose or any combination thereof.
  • Another embodiment of the present invention refers to a pharmaceutical composition for parental use which comprises: a polymeric nanoparticle with an average size between 65 and 150 nm, comprising between 70% and 99.8% w / w poly (£ -caprolactone), between 0.1% and 25% w / w doxorubicin, and between 0.1% and 2% w / w surfactant; and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a polymeric nanoparticle with an average size between 65 and 150 nm comprising between 70% and 99.8% w / w poly (£ -caprolactone), between 0.1% and 25% w / w doxorubicin, and between 0.1% and 2% w / w surfactant; and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a polymeric nanoparticle with an average size between 65 and 150 nm comprising between 70% and 99.8% w / w poly (£ -caprolactone), between 0.1% and 25% w / w doxor
  • a medicament for the treatment of cancer preferably Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma, breast cancer, ovarian cancer, testicular cancer, acute leukemia, soft tissue sarcoma, lung cancer, cancer of urinary bladder, gastric cancer, thyroid cancer, hepatocarcinoma, Wilms tumor or neuroblastoma, among others, and more preferably breast cancer.
  • cancer preferably Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma, breast cancer, ovarian cancer, testicular cancer, acute leukemia, soft tissue sarcoma, lung cancer, cancer of urinary bladder, gastric cancer, thyroid cancer, hepatocarcinoma, Wilms tumor or neuroblastoma, among others, and more preferably breast cancer.
  • the method used for the measurement of the particle size of the nanoparticles of the invention is photon correlation spectroscopy (PCS: Photon Correlation Spectroscopy).
  • biodegradable polymer refers to an organic macromolecule (consisting of small molecules called monomers) that is capable of being destroyed (degraded) in vivo under certain physiological conditions. In this way, it is metabolized and eliminated from the body. This destruction occurs mainly under the action of certain enzymes or enzymatic systems, e.g. eg, phospholipase A 2 , phospholipase C specific for phosphatidylinositol, transglutaminase, alkaline phosphatase, metalloproteinase, esterases, etc.
  • Some biodegradable polymers are also sensitive to slightly acidic pHs (e.g., pH ⁇ 6.6 characteristic of tumor interstitium) or temperature.
  • organic solvent refers to any organic compound, or mixtures of organic compounds, capable of dissolving poly (caprolactone). Representative examples include alcohols, hydrocarbons, halogenated compounds, ethers and acetone. Particular examples of organic solvents are ethyl acetate, acetone, acetonitrile (MeCN), benzene, chloroform, methylene chloride, dichloromethane (DCM), 1: 1 mixtures of dichloromethane: chloroform, dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), 1,4-dioxane, protic polar solvents, diethyl ether, tetrahydrofuran (THF), toluene and (ethanol, methanol, n-butanol, n-propanol and isopropanol (IPA)).
  • the organic solvent is dichloromethane.
  • anti-solvent refers to a liquid that when mixed with a solvent in which a solute dissolves, that is, poly (£ -caprolactone), reduces the ability of the organic solvent to dissolve the solute.
  • a solvent in which a solute dissolves that is, poly (£ -caprolactone)
  • miscibility can be controlled by varying one or more parameters, within which the solvency between the system and the solvent can be kept at a sufficiently low temperature so that the two liquids are not particularly miscible (during storage , for example), and as the temperature rises the two liquids become miscible and so the nanoparticles can be formed.
  • the preferred antisolvent is an aqueous solution, although acidified aqueous solutions, such as a 2% (v / v) acetic acid solution in water, may also be preset.
  • Ci-C 4 alcohol refers to a linear or branched alkyl chain, comprising from 1 to 4 carbon atoms and one or more hydroxyl groups.
  • Examples of “Ci-C 4 alcohol” are methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, n-butanol, isobutanol or fe / f-butanol, among others.
  • surfactant agent refers to surface active agents that have a structure characterized by a hydrophilic polar group and a hydrophobic tail. These active surface molecules have generally a long chain with at least eight carbon atoms. Surfactants are effective in modifying the properties of the inferred, such as interfacial tension, at very low concentrations. Surfactants are also characterized by being able to modify surface thermodynamic properties (eg, hydrophobia), light scattering properties and solute solubilization. Specifically, an increase in surfactant concentration tends to significantly reduce surface tension, until a breakpoint known as the critical micellar concentration (CMC) is reached.
  • CMC critical micellar concentration
  • any effective surfactant can be used in the practice of the present invention, including anionic, nonionic and cationic surfactants.
  • Specific surfactants useful for the present invention are polysorbate 20, polysorbate 60, polysorbate 80, polyvinyl alcohol of high or low molecular weight, polyvinyl pyrrolidone, phosphatidyl choline, lecithins, poloxamers, solutol HS15, sodium glycocholate, sodium taurocholate, sodium tacholactodeoxychoicodium , cholesteryl hemisilocinate and tyloxapol, preferably polysorbate 80 .
  • the most preferred surfactants are polaxamers, preferably a copolymer of poly (propylene oxide) and poly (ethylene oxide), and more preferably pluronic ® F-68.
  • Figure 1 (a) SEM photomicrograph of the nanoparticles of poly (£ -caprolactone) with matrix incorporated doxorubicin prepared according to the procedure described in the examples. Inserted figure: detail of a nanoparticle. Bar length: 100 nm. (b) Efficiency of doxorubicin vehiculization (%) of poly (£ -caprolactone) nanoparticles prepared according to the procedure described in the examples based on the concentration of drug in the equilibrium. Doxorubicin vehiculization was performed by surface adsorption ( ⁇ ) or by incorporation into the polymer matrix (absorption, ⁇ ).
  • FIG. 3 A. Analysis by FASCcan of the presence of doxorubicin inside MCF-7 cells after treatment with free doxorubicin (DOX) and doxorubicin associated with ⁇ -caprolactone nanoparticle (DOX + POL) prepared according to the procedure described in Examples of matrix absorption for 0.5 (a and b), 1.5 (c and d), 2 (e and f) and 4 hours (gyh).
  • DOX free doxorubicin
  • DOX + POL doxorubicin associated with ⁇ -caprolactone nanoparticle
  • IC50 50 inhibitory dose
  • MTT 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazole bromide
  • PCS photon correlation spectroscopy
  • p / p weight / weight
  • p / v weight / volume
  • r.p.m revolutions per minute.
  • SEM scanning electron microscopy.
  • Poly (£ -caprolactone) nanoparticles were prepared by the polymer interfacial arrangement method (Arias et al., Colloids Surf. B: Biointerfaces 75 (2010) 204) A 2% (w / v) solution of biodegradable polymer in dichloromethane by mechanical stirring. This organic phase is added sequentially to 50 mL of an aqueous solution containing 1 gram of pluronic ® F-68 surfactant [poloxamer: copolymer of poly (propylene oxide) and poly (ethylene oxide)]. Under these conditions instantaneous formation of the nanoparticles occurs.
  • the organic solvent is removed by evaporation at 37.0 ⁇ 0.5 ° C and under reduced pressure, using a rotary evaporator.
  • the aqueous suspension of poly (£ -caprolactone) nanoparticles is finally subjected to repeated cycles of centrifugation (10700 rpm for 30 minutes) and redispersion in double-distilled water until the conductivity of the supernatant is ⁇ 10 ⁇ / ⁇ .
  • the characterization of the morphology (shape and size) of the nanoparticles is performed by photon correlation spectroscopy (PCS).
  • PCS photon correlation spectroscopy
  • the nanoparticles obtained have an average size of 95 ⁇ 7 nm).
  • the drug load is 64, 1 ⁇ 2.9%)
  • the quantification of the amount of vehiculized drug was performed using a previously validated spectrophotometric procedure (to demonstrate its linearity, precision and accuracy).
  • the measured wavelength was the maximum absorbance (481 nm).
  • Two strategies were developed for the incorporation of the antitumor drug doxorubicin in polymeric nanoparticles. The first of these, surface adsorption, consists in bringing the nanoparticles already formed into contact with the antitumor drug for 24 hours at room temperature. On the contrary, the second of the strategies, absorption inside the polymer matrix, involves the incorporation of the chemotherapeutic molecule into the organic phase containing the dissolved biodegradable polymer, before its addition to the aqueous surfactant solution.
  • a suspension of polymer nanoparticles (2% concentration (w / v)) is incubated with increasing concentrations of doxorubicin (up to 0.01 M), for 24 hours at 25.0 ⁇ 0.5 ° C and low mechanical agitation (50 rpm).
  • the second methodology matrix absorption
  • Matrix absorption is very similar to Preparation process for the polyparticles of poly (£ -caprolactone) described above, with the only difference that an appropriate amount of drug (up to 0.01 M) is incorporated into the organic polymer solution before being added to the aqueous solution of surfactant.
  • dialysis bags were introduced into the release medium at 25.0 ⁇ 0.5 ° C. The characteristics of these bags (pore size: 2000 Daltons, Spectrum ® Spectra / Por ® 6 dialysis membrane tubing, USA) make the polymeric nanoparticles retained inside and that only the active substance is able to diffuse towards The means of release.
  • the amount of vehiculized doxorubicin is much higher when the matrix absorption method (vehicle efficiency ⁇ 64%) is used, compared to the surface adsorption method (efficiency of vehiculization «26%).
  • the release profile of doxorubicin from the poly (£ -caprolactone) nanoparticles is biphasic (Figure 1 C): in the first stage the release occurs rapidly (up to ⁇ 37% after 6 hours, probably as a result of the release of the drug located at the superficial level), while the remaining amount is released very slowly in the next 90 hours.
  • the release of the vehicularized antitumor by surface adsorption is much faster, being this total after less than 12 hours. This may be due to a very poor physical adsorption of this hydrophilic drug on the hydrophobic surface of the polymer.

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Abstract

La presente invención se refiere a nanopartículas poliméricas con un tamaño medio inferior a 200 nm, que comprende uno o más polímeros biodegradables, uno o más principios activos y al menos un tensoactivo, donde al menos un polímero biodegradable es poli(£-caprolactona) y donde al menos un principio activo es doxorrubicina, y al uso de dichas nanopartículas para la preparación de medicamentos para el tratamiento de cáncer, preferiblemente cáncer de mama.

Description

DESARROLLO Y USO DE NANOPARTÍCULAS POLIMÉRICAS QUE
COMPRENDEN POLI (EPSILON-CAPROLACTONA) Y DOXORRUBICINA
La presente invención se refiere a nanopartículas poliméricas con un tamaño medio inferior a 200 nm, que comprende uno o más polímeros biodegradables, uno o más principios activos y al menos un tensoactivo, donde al menos un polímero biodegradable es poli(£-caprolactona) y donde al menos un principio activo es doxorrubicina, y al uso de dichas nanopartículas para la preparación de medicamentos para el tratamiento del cáncer, preferiblemente cáncer de mama. Por lo tanto, la presente invención se engloba en el campo de la técnica de productos farmacéuticos.
ESTADO DE LA TÉCNICA La doxorrubicina es un fármaco anticancerígeno perteneciente al grupo de los análogos de los nucleósidos, cuya eficacia antitumoral ha sido ampliamente demostrada en el tratamiento de una amplia variedad de tumores sólidos. Sin embargo, a pesar de su gran eficacia terapéutica, este agente quimioterápico presenta numerosos inconvenientes que condicionan seriamente una amplia utilización clínica. En concreto, el desarrollo de resistencias por las células cancerosas, y un perfil farmacocinético muy deficiente (muy corta semivida plasmática, consecuencia de su rápido metabolismo). Todo esto determina que sean necesarias grandes dosis para obtener un efecto terapéutico adecuado, lo que lleva asociada la aparición de efectos adversos severos (Grosse PY, Bresolle F, Rouanet P, Joulia JM, Pinguet F. Int. J. Pharm. 180 (1999) 215).
La enorme necesidad de encontrar nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento del cáncer ha determinado el desarrollo de coloides biodegradables para el transporte selectivo de fármacos al tejido tumoral.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26) Por ejemplo, N. Chiannilkulchai et al. (Doxorubicin-Loaded Nanoparticles: Increased Efficiency in Murine Hepatic Metastases. Sel. Cáncer Ther. 5 (1989) 1 ) desarrollan partículas de poli(isohexilcianoacrilato) de un tamaño de 250 nm, por lo que las dichas nanopartículas pueden tener problemas en la extravasación en la masa tumoral (ver Maeda et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 71 (2008) 409; y Decuzzi et al. , Pharm. Res. 26 (2009) 235). Además, en la bibliografía se ha descrito la enorme toxicidad de los poli(alquilcianoacrilatos) in vivo. Este trabajo no incluye ningún tipo de estudio preclínico in vitro realizado sobre cultivos celulares y el único dato aportado en relación a la asociación de la nanopartícula-doxorrubicina es el de la modificación del número de metástasis que las células pueden originar pero no con el efecto de este compuesto sobre la propia célula tumoral ni siquiera con el del volumen de la masa tumoral primaria. Por otro lado, Loredana Serpe (Conventional Chemotherapeutic Drug Nanoparticles for Cáncer Treatment. Nanotechnologies for the Life Sciences, vol. 6, Nanomaterials for Cáncer Therapy. 2006 Wiley-Vch Verlay GmbH y Co. KGaA, Weinheim) describe el uso nanopartículas de: copolímeros de poli(D,L- lactida) y polietilén glicol (PEG); copolímeros de PEG y poli(isobutil-2- cianoacrilato); y copolímeros metoxiPEG y hexadecilcianoacrilato. En este documento se hace referencia a la utilización de caprolactona como transportador de fármacos. Sin embargo, el polímero biodegradable ha sido ensayado con tamoxifeno y no con doxorrubicina (ver referencia Charla y Amiji. Cellular uptake and concentrations of tamoxifen upon administration in poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles, AAPS Pharm. Sci. 5 (2003) E3; y también la referencia Shenoy y Amiji. Poly(ethylene oxide)-modified poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles for targeted delivery of tamoxifen in breast cáncer, Int. J. Pharm. 293 (2005) 261 ). Otros trabajos que describen nanopartículas poliméricas son el artículo titulado Toxicological studies of doxorubicin bound to poly sórbate 80-coated poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles in healthy rats and rats with intracranial glioblastoma (Toxicol. Lett. 126 (2002) 131 ), donde se describen nanopartículas de poli(butilcianoacrilato) recubiertas con polisorbato 80 y cargadas con doxorrubicina. Su tamaño medio es 270 ± 30 nm. En el artículo titulado In vltro and In vivo antl-tumor actlvltles of nanoparticles based on doxorubicin-PLGA conjugates (J. Control. Reléase 68 (2000) 419) se describen nanopartículas de poli(D,L-lactida-co-gl¡col¡da) (PLGA) cargadas con doxorrubicina, siendo su tamaño medio de 200 nm. En Negative preclinical results with stealth nanospheres-encapsulated doxorubicin in an orthotopic murine brain tumor model (J. Control. Reléase 100 (2004) 29) se describen nanopartículas de poli(hexilcianoacrilato) recubiertas con PEG y cargadas con doxorrubicina. Presentan una capacidad de carga {drug loading) de doxorrubicina de entre solamente 5,7 y 9,4 %. Además, su tamaño medio se encuentra entre 150 y 200 nm. Debido a los tamaños medios, estas nanopartículas presentan los mismos inconvenientes que las descritas por N. Chiannilkulchai et al.
En Proceedings of the 3rd International Conference on the Development of BME (Vietnam, 1 1 -14 enero 2010, 158-161 ) se describe un trabajo titulado Doxorubicin Delivery by Copolymeric Nanoparticle for Treatment of Breast Cáncer, donde se describe una compleja metodología para preparar un copolímero de metoxi-PEG y poli(£-caprolactona). En concreto, en el caso de este trabajo es necesario neutralizar el clorhidrato de doxorrubicina con trietilamina para poder incorporarla en este copolímero. Esto obliga a, una vez finalizada la síntesis, eliminar la trietilamina mediante diálisis durante 24 horas.
En el trabajo titulado Folate-decorated poly(lactide-co-glycolide)-vitamin E TPGS nanoparticles for targeted drug delivery (Biomaterials 28 (2007) 1889) se describen nanopartículas de PLGA cargadas con doxorrubicina y cuya superficie ha sido modificada con restos de folato y de vitamina E. Además de ser una síntesis compleja, la vehiculización de doxorrubicina obtenida mediante esta estrategia es baja y la carga de fármaco es muy baja teniendo una carga nunca superior al 3,97 % (en el caso de este polímero). Por último, el tamaño de partícula (« 360 nm) resultaría en los mismos problemas como los descritos en N. Chiannilkulchai et al. Las nanopartículas descritas en el trabajo titulado Nano-Sized Micelles of Block Copolymers of Methoxy Poly(ethylene glycol)-Poly(e-caprolactone)-Graft-2- Hydroxyethyl Cellulose for Doxorubicin Delivery (J. Nanosci. Nanotechnol. 8 (2008) 2362) están compuestas de un copolímero de metoxi-PEG, ροΝ(ε- caprolactona) e hidroxietilcelulosa cargado con doxorrubicina. Su tamaño medio es mucho mayor (340,7 nm).
También se ha estudiado la doxorrubicina asociada a nanopartículas para mejorar sus características biológicas en células de estirpe tumoral por Shuaia y cois. (Micellar carriers based on block copolymers of poly(e-caprolactone) and poly(ethylene glycol) for doxorubicin delivery (J. Controlled Reí. 98 (2004) 415)). Este estudio está realizado en la línea MCF-7 de cáncer de mama. Los resultados de los autores demuestran que mediante el uso del copolímero poli(£-caprolactona) y PEG se produce un incremento de la entrada de la doxorrubicina en el interior de la célula tumoral. Sin embargo, Shuaia y cois. indica que la mayor parte de la droga se localiza en el citoplasma. Según estos autores, la dosis inhibitoria (IC50) de la doxorrubina unida a la nanopartícula (0,033-0,048 μΜ) es mayor que la determinada para la doxorrubicina libre (0,001 μΜ). Cuong y cois, utilizan copolímeros de poli(varepsilon-caprolactona)- polifosfoester asociados a doxorrubicina para el tratamiento de células tumorales (Doxorubicin-Loaded Nanosized Micelles of a Star-Shaped Poly(varepsilon-Caprolactone)-Polyphosphoester Block Co-polymer for Treatment of Human Breast Cáncer. J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 2010, doi: 10.1 163/092050610X510533). En esta misma situación se encuentran los estudios realizados con PEG-¿>-pol¡(2-h¡droxiet¡lmetacr¡lato-g-pol¡(£- caprolactona) (Zhang et al. Amphiphilic Toothbrushlike Copolymers Based on Poly(ethylene glycol) and Poly(£-caprolactone) as Drug Carriers with Enhanced Properties (Biomacromolecules 1 1 (2010) 1331 ) ya que siguen utilizando copolímeros para los ensayos con doxorrubicina y en células de carcinoma de vejiga urinaria y no en células de carcinoma de ovario. La acumulación máxima de doxorrubicina en el núcleo de las células en cultivo tras el tratamiento con el complejo nanopartícula-droga ocurre a las 24 horas, medido mediante fluorocitometría. Además, como indica el autor, la concentración de doxorrubicina unida a las nanopartículas con el que se alcanza la IC50 fue relativamente más alta que la dosis de doxorrubicina libre con la que se consigue el mismo efecto.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención trata de nanopartículas poliméricas que comprenden poli(£-caprolactona) y doxorrubicina, de ahora en adelante las nanopartículas de la invención. Los presentes inventores han descubierto que sorprendentemente las nanopartículas de la invención se comportan como un excelente sistema transportador de doxorrubicina. Las nanopartículas de la invención permiten una elevada vehiculización del agente anticanceroso, alcanzan una muy elevada extravasación en la masa tumoral y, a su vez, una liberación de éste más controlada. Además, los estudios de eficacia antitumoral in vitro han demostrado un incremento muy significativo de la actividad antitumoral de este fármaco cuando es vehiculizado a través de las nanopartículas de la invención. Una de las razones de la efectividad de las nanopartículas contra el cáncer es la gran cantidad de droga real (en este caso, doxorrubicina) que se incorpora al interior celular tumoral una vez administrado el fármaco, determinación que es cuantitativa gracias a la aplicación de la técnica de fluorocitometría. Además, los resultados demuestran un fácil intercambio de droga hacia el núcleo en donde este agente posee su acción esencial. Otra ventaja asociada a la invención es que se consigue una liberación controlada y prolongada del principio activo, reduciendo los efectos secundarios asociados al tratamiento.
Además, las nanopartículas de la invención modulan la IC50, o sea la concentración de fármaco que es capaz de reducir al 50 % el número de células tumorales cuando se aplica a un cultivo celular, de la doxorrubicina en células de cáncer de mama y ayudan a la incorporación de este agente al interior de la célula tumoral. Estos resultados son ventajosos en comparación con otros sistemas similares, permitiendo reducir la cantidad necesaria para alcanzar la IC50 en la línea MCF-7 hasta más de 5 veces en algunas realizaciones. Incluso las nanopartículas de la invención permiten una alta capacidad de carga de doxorrubicina {drug loading) de hasta en algunos casos el 18,7 + 0,9 %. Por lo tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una nanopartícula polimérica con un tamaño medio inferior a 200 nm, preferiblemente inferior a 190 nm, que comprende uno o más polímeros biodegradables, uno o más principios activos y al menos un tensoactivo, donde al menos un polímero biodegradable es poli(£-caprolactona) y donde al menos un principio activo es doxorrubicina.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a un proceso para la síntesis de una nanopartícula polimérica con un tamaño medio inferior a 200 nm, preferiblemente inferior a 190 nm, que comprende uno o más polímeros biodegradables, uno o más principios activos y al menos un tensoactivo, donde al menos un polímero biodegradable es poli(£-caprolactona) y donde al menos un principio activo es doxorrubicina. Las nanopartículas poliméricas de la invención son sintetizadas preferiblemente mediante el método de disposición interfacial del polímero, consistente en: i) la disolución de poli(£-caprolactona) en un disolvente orgánico, preferiblemente diclorometano;
¡i) la adición de la disolución obtenida en (i) sobre una mezcla que comprende un antisolvente y un tensoactivo;
iii) el aislamiento de la partícula obtenida;
donde se incorpora el principio activo doxorrubicina mediante asociación superficial sobre la nanopartícula obtenida después de la etapa (iii) o mediante asociación en el interior de la matriz polimérica durante la etapa (i). Un tercer aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una de las ventajas de las composiciones de la presente invención es que se reduce la toxicidad del medicamento al prevenir sus efectos en los tejidos no cancerosos.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso terapéutico de la nanopartícula de la invención o de la composición farmacéutica que comprende la nanopartícula de la invención según los aspectos primero y/o segundo o cualquiera de sus realizaciones particulares de dichos aspectos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Diferentes métodos han sido descritos en la literatura para la preparación de nanopartículas que incluyen drogas como por ejemplo, el método de polimerización en emulsión continua en la fase acuosa, el método de polimerización en emulsión continua en la fase orgánica, la polimerización interfacial, la disposición interfacial del polímero con evaporación de disolventes, la desolvatación de macromoléculas y los métodos de diálisis (Marty et al. Nanoparticles - a new colloidal drug delivery system (Pharm Acta Helv 53 (1978) 17)). Como ya se ha comentado con anterioridad las nanopartículas de la invención son sintetizadas preferiblemente mediante el método de disposición interfacial del polímero. La disposición interfacial de polímeros es un procedimiento para la preparación de nanopartículas, o nanoesferas, biodegradables. En este método, el polímero biodegradable se disuelve primero en un disolvente orgánico, por ejemplo acetona o diclorometano. La solución orgánica resultante se vierte bajo agitación en el agua que contiene surfactante, como por ejemplo un polaxámero, con que la fase acuosa de inmediato se convierte en una solución lechosa, indicando la formación de nanopartículas. El disolvente orgánico es eliminado a presión reducida. La suspensión coloidal formada se concentra al volumen deseado.
El uso de la disposición interfacial de polímeros para la síntesis de las nanopartículas de la invención conlleva varia ventajas. Además de ser una síntesis sencilla y rápida, permite obtener nanopartículas con unas características muy relevantes como: un sistema coloidal de tamaño muy pequeño con tamaños medios muy bajos, y polidispersiones también muy bajas (llegando a diámetros medio de hasta 95 ± 7 nm). El proceso permite una carga de fármaco muy superior, lo que entre otras ventajas posibilita que la cantidad de matenal polimé co administrada sea menor. Todo esto permite: i) que la masa a administrar de sistema transportador no sea muy elevada para obtener un efecto antitumoral significativo (p. ej., con sólo 200 mg de polímero biodegradable se logra la vehiculización de un 64, 1 ± 2,9 % de la cantidad de fármaco utilizada), en comparación con lo que ocurre con otros coloides previamente propuestos en otros trabajos; y, además, ¡i) un contacto íntimo y muy prolongado entre la molécula anticancerosa y las células tumorales.
En concreto, el procedimiento de síntesis de nanopartículas de la invención de poli(£-caprolactona) se basa en el método de disposición interfacial de polímeros. En una realización particular del primer aspecto de la invención, la nanopartícula polimérica se obtiene por el procedimiento que comprende las siguientes etapas:
i) la disolución de poli(£-caprolactona) en un disolvente orgánico, preferiblemente diclorometano;
¡i) la adición de la disolución obtenida en (i) sobre una mezcla que comprende un antisolvente y un tensoactivo;
i¡¡) el aislamiento de la partícula obtenida;
donde se incorpora el principio activo doxorrubicina mediante asociación superficial sobre la nanopartícula obtenida después de la etapa (iii) o mediante asociación en el interior de la matriz polimérica durante la etapa (i).
La asociación superficial consiste en la incorporación mediante adsorción del fármaco antitumoral doxorrubicina en la superficie de las nanopartículas poliméricas previamente obtenidas.
En la asociación en el interior de la matriz polimérica, el agente quimioterápico es incorporado en el interior de las nanopartículas mediante absorción. Este proceso es muy similar con la única diferencia de que el antisolvente también comprende doxorrubicina, normalmente disuelta a una concentración molar de fármaco hasta 0,01 .
En una realización preferida el procedimiento además comprende una etapa de evaporación del disolvente orgánico, preferiblemente a presión reducida.
La etapa (iii) se puede llevar a cabo mediante una centrifugación, preferiblemente a menos de 30.000 r.p.m., más preferiblemente de entre 5.000 y 15.000 r.p.m. El procedimiento además puede comprender etapas consecutivas de redispersion de las nanopartículas poliméricas y nueva centrifugación, hasta que la conductividad del sobrenadante sea menor o igual a 10 μβ/αη. La conductividad del sobrenadante obtenido se determinó a 25,0 ± 0,5 °C utilizando un conductímetro Crison micropH 2001 (España). La redispersión del sedimento obtenido tras la centrifugación de las nanopartículas se puede realizar mediante adición de agua bidestilada a este sedimento y exposición de esta mezcla (a 25,0 ± 0,5 °C) a ultrasonidos (450 W, baño de ultrasonidos Branson 5200E4, EE. UU.).
La etapa (¡i) del procedimiento se realiza preferiblemente de manera secuencial.
Los antisolventes utilizados en la etapa (¡i) preferidos son agua o mezclas de agua y un disolvente orgánico, preferiblemente un Ci-C4 alcohol. Más preferiblemente el antisolvente es agua.
La temperatura a la que se lleva a cabo la asociación en el interior de la matriz polimérica durante la etapa (i) es preferiblemente inferior a 60 °C, más preferiblemente inferior a 35 °C, y aun más preferiblemente a aproximadamente a 25 °C. El procedimiento de adsorción en superficie suele tener una duración de 24 horas. La incorporación en matriz (absorción) se puede realizar en 1 hora (tiempo notablemente más corto). Es interesante resaltar que el procedimiento de absorción de fármaco en el interior de las nanopartículas permite obtener una mayor vehiculización de doxorrubicina. Buenos resultados se han obtenido con nanopartículas que tienen un tamaño de partícula medio de entre 65 y 150 nm, más preferiblemente entre 75 y 125 nm, aun más preferiblemente de entre 85 y 1 15 nm, y todavía aun más preferiblemente de aproximadamente 95 nm. Preferiblemente el tensoactivo y la poli(£-caprolactona) no están unidos covalentemente, es decir el tensoactivo y la poli(£-caprolactona) son dos compuestos químicos diferentes e independientes. El tamaño del polímero biodegradable de poli(£-caprolactona) no esta restringido, pero buenos resultados se obtienen cuando este tiene un peso molecular inferior a 100.000 Daltons, prefenblemente entre 5.000 y 45.000 Daltons, y aun más preferiblemente de entre 7.000 y 20.000 Daltons, y todavía más preferiblemente es de aproximadamente unos 10.000 Dantons.
La poli(£-caprolactona) y la doxorrubicina están en un ratio suficiente para mantenerse asociados. El ratio suficiente para mantenerse asociados la ροΝ(ε- caprolactona) y la doxorrubicina varia normalmente de entre 1000: 1 y 1 :50 p/p respectivamente, más prefenblemente es un ratio de entre 1 :5 y 1 : 15 p/p.
En una realización preferida, la nanopartícula polimérica comprende un polímero biodegradable que consiste en poli(£-caprolactona), es decir, se utilizan exclusivamente polímeros de caprolactona y nunca copolímeros. Prefenblemente comprende únicamente como polímero biodegradable ροΝ(ε- caprolactona).
En otra realización preferida la nanopartícula polimérica comprende únicamente doxorrubicina como principio activo, y más preferiblemente la nanopartícula además comprende un polímero biodegradable que consiste en poli(£-caprolactona).
En otra realización preferida la nanopartícula polimérica comprende únicamente un polímero biodegradable que consiste en poli(£-caprolactona). La cantidad de doxorrubicina en la nanopartícula polimérica de la invención está preferiblemente comprendida entre un 0, 1 % y un 25 % p/p, más preferiblemente entre un 15 % y un 20 % p/p. La cantidad de poli(£-caprolactona) en la nanopartícula polimérica de la invención está preferiblemente comprendida entre un 70 % y un 99,8 % p/p, más preferiblemente entre un 79 % y un 84,5 % p/p.
La cantidad de tensoactivo en la nanopartícula polimérica de la invención está preferiblemente comprendida entre un 0, 1 % y un 2 % p/p, más preferiblemente entre un 0,5 % y un 1 % p/p.
Otra realización de la presente invención hace referencia a una nanopartícula polimérica con un tamaño medio de entre 65 y 150 nm, que comprende entre un 70 % y un 99,8 % p/p de poli(£-caprolactona), entre un 0, 1 % y un 25 % p/p de doxorrubicina, y entre un 0, 1 % y un 2 % p/p de tensoactivo, donde el tensoactivo y la poli(£-caprolactona) no están unidos covalentemente.
Otra realización de la presente invención hace referencia a una nanopartícula polimérica obtenible por el procedimiento que comprende las siguientes etapas: i) la disolución de poli(£-caprolactona) en un disolvente orgánico, preferiblemente diclorometano;
¡i) la adición de la disolución obtenida en (i) sobre una mezcla que comprende un antisolvente, donde el antisolvente es agua o mezclas de agua y un disolvente orgánico, preferiblemente un Ci-C4 alcohol, y un tensoactivo;
i¡¡) el aislamiento de la partícula obtenida;
donde se incorpora donde se incorpora doxorrubicina mediante asociación en el interior de la matriz polimérica durante la etapa (i) se lleva a cabo a temperatura inferior a 60 °C. La composición farmacéutica de la invención comprende:
- una nanopartícula polimérica según se ha descrito en la invención; preferiblemente una nanopartícula obtenida por el procedimiento de la invención descrito;
- al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización particular de la presente invención, las composiciones farmacéuticas de la presente invención comprenden al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable que es un diluyente. Preferentemente, el diluyente es agua. En otra realización el diluyente es celulosa microcristalina, lactosa o cualquiera de sus combinaciones.
En otra realización particular, la composición farmacéutica de la invención está particularmente adaptada para su uso parental, preferiblemente para su uso intravenoso, intraarterial, intratumoral, intramuscular o subcutáneo. Las composiciones parenterales preferiblemente comprenden agua. Aún más preferiblemente las nanopartículas de la invención se encuentran dispersadas en una solución acuosa. En otra realización la composición farmacéutica de la invención está en forma sólida oral, preferiblemente en comprimidos o cápsulas. En este caso, la composición farmacéutica preferiblemente además comprende celulosa microcristalina, lactosa o cualquiera de sus combinaciones. Otra realización de la presente invención hace referencia a una composición farmacéutica para su uso parental que comprende: una nanopartícula polimérica con un tamaño medio de entre 65 y 150 nm, que comprende entre un 70 % y un 99,8 % p/p de poli(£-caprolactona), entre un 0, 1 % y un 25 % p/p de doxorrubicina, y entre un 0, 1 % y un 2 % p/p de tensoactivo; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tanto la nanopartícula polimérica de la invención y la composición farmacéutica de la invención son útiles en métodos terapéuticos. Preferiblemente, son útiles para elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer, preferiblemente linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, cáncer de mama, cáncer de ovarios, cáncer de testículos, leucemia aguda, sarcoma de los tejidos suaves, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga urinaria, cáncer gástrico, cáncer de las tiroides, hepatocarcinoma, tumor de Wilms o neuroblastoma, entre otros, y más preferiblemente cáncer de mama. Definiciones:
El método utilizado para la medición del tamaño de partícula de la nanopartículas de la invención es la espectroscopia de correlación de fotones (PCS: Photon Correlation Spectroscopy).
El término polímero biodegradable hace referencia a una macromolécula orgánica (constituida por pequeñas moléculas llamadas monómeros) que es susceptible de ser destruida (degradada) in vivo bajo determinadas condiciones fisiológicas. De esta manera, es metabolizada y eliminada del organismo. Esta destrucción se produce principalmente bajo la acción de determinados enzimas o sistemas enzimáticos, p. ej., fosfolipasa A2, fosfolipasa C específica para fosfatidilinositol, transglutaminasa, fosfatasa alcalina, metaloproteinasa, esterasas, etc. Algunos polímeros biodegradables son sensibles también a pHs ligeramente ácidos (p. ej., pH ~ 6,6 característico del intersticio tumoral) o a la temperatura.
Como se utiliza aquí, el término "disolvente orgánico" se refiere a cualquier compuesto orgánico, o mezclas de compuestos orgánicos, capaz de disolver la poli(£-caprolactona). Los ejemplos representativos incluyen alcoholes, hidrocarburos, compuestos halogenados, éteres y acetona. Ejemplos particulares de disolventes orgánicos son acetato de etilo, acetona, acetonitrilo (MeCN), benceno, cloroformo, cloruro de metileno, diclorometano (DCM), mezclas 1 : 1 de diclorometano:cloroformo, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO), 1 ,4-dioxano, disolventes polares próticos, éter dietílico, tetrahidrofurano (THF), tolueno y (etanol, metanol, n-butanol, n- propanol e isopropanol (IPA)). Preferiblemente el disolvente orgánico es diclorometano.
El término "antisolvente" se refiere a un líquido que al mezclarse con un disolvente en el que un soluto se disuelve, es decir la poli(£-caprolactona), reduce la capacidad del solvente orgánico para disolver el soluto. Así, cuando un antisolvente se mezcla con una solución de un soluto en un disolvente orgánico, la solubilidad del soluto se puede reducir hasta el punto en el que precipita en la solución. El antisolvente debe ser lo suficientemente miscible con el disolvente orgánico. Se apreciará que la miscibilidad puede ser controlada mediante la variación de uno o más parámetros, dentro de los que la solvencia entre el sistema y el antisolvente podrá mantenerse a una temperatura suficientemente baja como para que los dos líquidos no sean particularmente miscibles (durante el almacenamiento, por ejemplo), y al aumentar la temperatura los dos líquidos pasen a ser miscibles y así puedan formarse las nanopartículas. El antisolvente preferido es una solución acuosa, si bien también pueden ser prefijadas soluciones acuosas aciduladas, como por ejemplo una solución de ácido acético al 2 % (v/v) en agua.
El término "Ci-C4 alcohol" hace referencia a una cadena de alquílica lineal o ramificada, que comprende de 1 a 4 de átomos de carbono y uno o más grupos hidroxilo. Ejemplos de "Ci-C4 alcohol" son metanol, etanol, 1 -propanol, 2- propanol, n-butanol, isobutanol o fe/f-butanol, entre otros.
El término agente "tensoactivo", o surfactante, hace referencia a los agentes activos de superficie que tienen una estructura caracterizada por un grupo polar hidrófilo y una cola hidrófoba. Estas moléculas superficiales activas tienen generalmente una cadena larga con al menos ocho átomos de carbono. Los tensoactivos son eficaces en la modificación de las propiedades de la inferíase, como la tensión interfacial, a concentraciones muy bajas. Los tensoactivos también se caracterizan por ser capaces de modificar las propiedades termodinámicas superficiales (p. ej., hidrofobia), las propiedades de dispersión de la luz y la solubilización de solutos. En concreto, un aumento en la concentración de tensoactivo tiende a reducir significativamente la tensión superficial, hasta alcanzar un punto de interrupción conocido como concentración micelar crítica (CMC).
Cualquier agente tensoactivo eficaz puede ser utilizado en la práctica de la presente invención, incluyendo los tensoactivos aniónicos, no iónicos y catiónicos. Tensoactivos específicos útiles para la presente invención son polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 80, polivinil alcohol de peso molecular alto o bajo, polivinil pirrolidona, fosfatidil colina, lecitinas, poloxámeros, solutol HS15, glicocolato sódico, taurocolato sódico, tauroglicocolato sódico, taurodeoxicolato sódico, hemisuccinato de colesterilo y tiloxapol, preferiblemente polisorbato 80.. Los tensoactivos más preferidos son los polaxámeros, preferiblemente un copolímero de poli(óxido de propileno) y de poli(óxido de etileno), y más preferiblemente pluronic® F-68.
A lo largo de la descripción y de las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1 . (a) Microfotografía SEM de las nanopartículas de poli(£-caprolactona) con doxorrubicina incorporada en matriz preparada según el procedimiento descrito en los ejemplos. Figura insertada: detalle de una nanopartícula. Longitud de barra: 100 nm. (b) Eficiencia de vehiculización de doxorrubicina (%) de las nanopartículas de poli(£-caprolactona) preparadas según el procedimiento descrito en los ejemplos en función de la concentración de fármaco en el equilibrio. La vehiculización de doxorrubicina se realizó mediante adsorción superficial (□) o mediante incorporación en el interior de la matriz polimérica (absorción, ■). (c) Liberación de doxorrubicina adsorbida (□) o absorbida (■) desde las nanopartículas de poli(£-caprolactona) en un medio de incubación (tampón de fosfatos, pH = 7,4 ± 0,1 ) y a 37,0 ± 0,5 °C. Figura 2. Imagen representativa de la microscopía de fluorescencia de células de cáncer de mama MCF-7 expuestas a doxorrubicina en la que se puede observar la incorporación de esta droga al citoplasma y núcleo de las células tumorales cuando es asociada a la nanoparticula (polímero de ε-caprolactona) (A) preparada según el procedimiento descrito en los de ejemplos de absorción en matriz y cuando se administra de forma libre (B). Como se aprecia en la imagen, la intensidad de la fluorescencia fue claramente superior en las células expuestas a doxorrubicina asociada a polímero que en las células expuestas al fármaco libre. Figura 3. A. Análisis mediante FASCcan de presencia de doxorubicina en el interior de las células MCF-7 tras tratamiento con doxorrubicina libre (DOX) y doxorrubicina asociada a nanopartícula de ε-caprolactona (DOX+POL) preparada según el procedimiento descrito en los ejemplos de absorción en matriz durante 0,5 (a y b), 1 ,5 (c y d), 2 (e y f) y 4 horas (g y h). B. Representación gráfica de la modulación de la media de intensidad de fluorescencia emitida por la doxorrubicina en células MCF-7 tratadas con doxorrubicina libre o doxorrubicina asociada a nanopartícula de ε-caprolactona preparada según el procedimiento descrito en los ejemplos de absorción en matriz. EJEMPLOS
En los ejemplos se han utilizado las siguientes abreviaturas: IC50: dosis inhibitoria 50; MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol; PCS: espectroscopia de correlación de fotones; p/p: peso/peso; p/v: peso/volumen; r.p.m: revoluciones por minuto. SEM: microscopía electrónica de barrido.
Procedimiento de obtención de nanopartículas de poli(£-caprolactona) mediante el método de disposición interfacial de polímeros
Las nanopartículas de poli(£-caprolactona) se prepararon mediante el método de disposición interfacial del polímero (Arias et al., Colloids Surf. B: Biointerfaces 75 (2010) 204) Se prepara una disolución al 2 % (p/v) de polímero biodegradable en diclorometano mediante agitación mecánica. Esta fase orgánica se añade secuencialmente a 50 mL de una disolución acuosa que contiene 1 gramo de agente tensioactivo pluronic® F-68 [poloxámero: copolímero de poli(óxido de propileno) y de poli(óxido de etileno)]. En estas condiciones se produce la formación instantánea de las nanopartículas. La eliminación del disolvente orgánico se realiza mediante evaporación a 37,0 ± 0,5 °C y a presión reducida, utilizando un rotavapor. La suspensión acuosa de nanopartículas de poli(£-caprolactona) se somete finalmente a ciclos repetidos de centrifugación (10700 r.p.m. durante 30 minutos) y redispersión en agua bidestilada hasta que la conductividad del sobrenadante es < 10 μβ/αη. La caracterización de la morfología (forma y tamaño) de las nanopartículas se realiza mediante espectroscopia de correlación de fotones (PCS). Las nanopartículas obtenidas tienen un tamaño medio de 95 ± 7 nm). La carga de fármaco es de 64, 1 ± 2,9 %)
La cuantificación de la cantidad de fármaco vehiculizada se realizó mediante un procedimiento espectrofotométrico previamente validado (para demostrar su linealidad, precisión y exactitud). La longitud de onda de medida fue la de máxima absorbancia (481 nm). Se desarrollaron dos estrategias para la incorporación del fármaco antitumoral doxorrubicina en las nanopartículas poliméricas. La primera de ellas, adsorción superficial, consiste en la puesta en contacto de las nanopartículas ya formadas con el fármaco antitumoral durante 24 horas a temperatura ambiente. Por el contrario, la segunda de las estrategias, absorción en el interior de la matriz polimérica, implica la incorporación de la molécula quimioterápica en la fase orgánica que contiene el polímero biodegradable disuelto, antes de su adición a la solución acuosa de agente tensioactivo. El estudio de la liberación de doxorrubicina desde las nanopartículas se realizó mediante el método de diálisis, y su cuantificación se llevó a cabo mediante el método espectrofotométrico previamente mencionado. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. El tamaño de partícula se determinó por triplicado y a temperatura ambiente mediante espectroscopia de correlación de fotones (PCS), y fue confirmado mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). La determinación de la cantidad de fármaco vehiculizado se realizó mediante una técnica analítica espectrofotométrica previamente validada (λ = 481 nm). La incorporación de doxorrubicina en las nanopartículas de poli(£-caprolactona) se ensayó mediante dos procedimientos de vehiculización. El primero de ellos consiste en la adsorción del fármaco antitumoral en la superficie de las nanopartículas. En concreto, se incuba una suspensión de nanopartículas de polímero (concentración del 2 % (p/v)) con concentraciones crecientes de doxorrubicina (hasta 0,01 M), durante 24 horas a 25,0 ± 0,5 °C y bajo agitación mecánica (50 r.p.m.). La segunda metodología (absorción en matriz) es muy parecida al procedimiento de preparación de las nanopartículas de poli(£-caprolactona) arriba descrito, con la única diferencia de que una cantidad apropiada de fármaco (hasta 0,01 M) es incorporada en la disolución orgánica de polímero antes de su adición a la solución acuosas de agente tensioactivo. En cuanto a la liberación in vitro de fármaco, el método utilizado fue el de diálisis, utilizando como medio de liberación un tampón de fosfatos de pH = 7,4 ± 0,1 (Arias JL et al., J. Drug Target. 17 (2009) 586). Para ello, 12 horas antes del experimento se introdujeron las bolsas de diálisis en el medio de liberación a 25,0 ± 0.5 °C. Las características de estas bolsas (tamaño de poro: 2000 Daltons, Spectrum® Spectra/Por® 6 dialysis membrane tubing, EE.UU.) hacen que las nanopartículas poliméricas queden retenidas en su interior y que sólo el principio activo sea capaz de difundir hacia el medio de liberación. Tras esas 12 horas, 2 ml_ de la suspensión de nanopartículas (conteniendo 3 mg/ml_ de doxorrubicina) se introdujeron en las bolsas de diálisis, cuyos extremos se cerraron con pinzas. Las bolsas (con la suspensión en su interior) se depositaron en un vaso de precipitado que contenía 100 mL de medio de disolución bajo agitación mecánica (200 r.p.m.). La temperatura se mantuvo a 37,0 ± 0.5 °C durante todo el ensayo de liberación (realizado por triplicado). A partir de este momento, y a intervalos prefijados (0,25, 0,5, 0,75, 1 , 1 ,5, 2, 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 horas), se tomaron 2 mL de medio para analizar su contenido mediante la técnica espectrofotométrica previamente validada (λ = 481 nm). Un volumen igual de medio de liberación (calentado a 37,0 ± 0.5 °C) se añadió al vaso de precipitado tras cada toma de muestra. En la figura 1 (a) se pueden observar que las nanopartículas de ροΝ(ε- caprolactona) obtenidas son estables, de morfología esférica y con una distribución de tamaños dentro del rango coloidal (tamaño medio: 95 + 7 nm).
La cantidad de doxorrubicina vehiculizada es mucho mayor cuando se utiliza el método de absorción en matriz (eficiencia de vehiculización ~ 64 %), en comparación con el método de adsorción superficial (eficiencia de vehiculización « 26 %). Como puede apreciarse en la figura 1 b, existe un efecto beneficioso de la cantidad de fármaco utilizada sobre la capacidad de vehiculización. El perfil de liberación de la doxorrubicina desde las nanopartículas de poli(£-caprolactona) es bifásico (figura 1 C): en una primera etapa la liberación ocurre de forma rápida (hasta ~ 37 % tras 6 horas, probablemente consecuencia de la liberación del fármaco localizado a nivel superficial), mientras que la cantidad restante se libera muy lentamente en las siguientes 90 horas. La liberación del antitumoral vehiculizado mediante adsorción superficial es mucho más rápida, siendo ésta total tras menos de 12 horas. Esto puede deberse a una muy pobre adsorción física de este fármaco hidrófilo en la superficie hidrófoba del polímero.
Los ensayos in vitro han sido realizados utilizando la línea de cáncer de mama humana MCF-7. En está línea se determinó la toxicidad de las nanopartículas y la IC50 de la doxorrubicina libre y de la doxorrubicina encapsulada en ροΝ(ε- caprolactona). El estudio se realizó a las 72 horas y la inhibición del crecimiento se determinó utilizando el ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2- ilo)-2,5-difeniltetrazol). El estudio de incorporación de doxorrubicina a la célula cancerosa fue realizado utilizando citometría de flujo y microscopía de fluorescencia tras la incubación de MCF-7 durante 0,5, 1 , 1 ,5, 2 y 4 horas a una concentración de 25 μΜ.
Los ensayos in vitro han demostrado que la doxorrubicina asociada a nanopartículas de poli(£-caprolactona), tiene una IC50 cinco veces inferior en la línea de cáncer de mama MCF-7 a la de la doxorrubicina libre, siendo la IC50 de 0, 1 y 0,5 mM, respectivamente. Por tanto, la doxorrubicina unida al ροΝ(ε- caprolactona) disminuye su IC50. El análisis de la incorporación celular de doxorrubicina también mostró que la incorporación fue 6,7 veces superior en el caso de la doxorrubicina asociada a las nanopartículas (media de fluorescencia de 1222 a las 4 h) que cuando se incubó con doxorrubicina libre (media de fluorescencia de fluorescencia 181 a las 4h). Estos resultados sugieren que la encapsulación de doxorrubicina en las nanopartículas de poli(£-caprolactona) incrementa la actividad antitumoral del fármaco, por lo que podría utilizarse para disminuir su toxicidad (figura 2). Además, la incorporación celular es superior cuando se usa poli(£-caprolactona) comparada a cuando se usan otros polímeros como poli(butilcianoacrilato).

Claims

REIVINDICACIONES
1 . - Una nanopartícula polimérica con un tamaño medio inferior a 200 nm, preferiblemente inferior a 190 nm, que comprende uno o más polímeros biodegradables, uno o más principios activos y al menos un tensoactivo, donde al menos un polímero biodegradable es poli(£-caprolactona) y donde al menos un principio activo es doxorrubicina.
2. - La nanopartícula polimérica según la reivindicación anterior, obtenible por el procedimiento que comprende las siguientes etapas:
i) la disolución de poli(£-caprolactona) en un disolvente orgánico, preferiblemente diclorometano;
¡i) la adición de la disolución obtenida en (i) sobre una mezcla que comprende un antisolvente y un tensoactivo;
i¡¡) el aislamiento de la partícula obtenida;
donde se incorpora el principio activo doxorrubicina mediante asociación superficial sobre la nanopartícula obtenida después de la etapa (iii) o mediante asociación en el interior de la matriz polimérica durante la etapa (i).
3.- La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la nanopartícula tiene un tamaño de partícula medio de entre 65 y 150 nm.
4. - La nanopartícula polimérica según la reivindicación anterior, caracterizada porque la nanopartícula tiene un tamaño de partícula medio de de entre 75 y
125 nm, preferiblemente de entre 85 y 1 15 nm, y más preferiblemente de aproximadamente 95 nm.
5. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tensoactivo y la poli(£-caprolactona) no están unidos covalentemente.
6. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polímero biodegradable de poli(£-caprolactona) tiene un peso molecular inferior a 100.000 Daltons, preferiblemente entre 5.000 y 45.000 Daltons, y aun más preferiblemente de entre 7 y 20.000 Daltons, y todavía más preferiblemente es de aproximadamente unos 10.000 Dantons.
7. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende un polímero biodegradable que consiste en ροΝ(ε- caprolactona).
8. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la poli(£-caprolactona) y la doxorrubicina están en un ratio suficiente para mantenerse asociados.
9.- La nanopartícula polimérica según la reivindicación anterior, donde el ratio suficiente para mantenerse asociados la poli(£-caprolactona) y la doxorrubicina es un ratio de entre 1000: 1 y 1 :50 p/p respectivamente, preferiblemente es un ratio de entre 1 :5 y 1 : 15.
10.- La nanopartícula polimérica según la reivindicación anterior, que comprende un polímero biodegradable que consiste en poli(£-caprolactona).
1 1 . - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende únicamente doxorrubicina como principio activo.
12. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende únicamente un polímero biodegradable que consiste en poli(£-caprolactona).
13.- La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende entre un 0, 1 % y un 25 % p/p de doxorrubicina, preferiblemente entre un 15 % y un 20 % p/p.
14.- La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende entre un 70 % y un 99,8 % p/p de ροΝ(ε- caprolactona), preferiblemente entre un 79 % y un 84,5 % p/p.
15. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende entre un 0, 1 % y un 2 % p/p de tensoactivo, preferiblemente entre un 0,5 % y un 1 % p/p.
16. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tensoactivo se selecciona entre polisorbato 20, polisorbato 60, polisorbato 80, polivinil alcohol de alto o bajo peso molecular, polivinil pirrolidona, fosfatidil colina, lecitinas, poloxameros de distintos tipos, solutol HS15, glicocolato sódico, taurocolato sódico, tauroglicocolato sódico, taurodeoxicolato sódico, hemisuccinato de colesterilo y tiloxapol, preferiblemente polisorbato 80.
17. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tensoactivo es un poloxámero, preferiblemente un copolímero de poli(óxido de propileno) y de poli(óxido de etileno).
18.- La nanopartícula polimérica según la reivindicación 2, donde el procedimiento además comprende una etapa de evaporación del disolvente orgánico, preferiblemente a presión reducida.
19.- La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 2 o anterior, donde la etapa (iii) se lleva a cabo mediante una centrifugación, preferiblemente a menos de 30.000 r.p.m., más preferiblemente de entre 5.000 y 15.000 r.p.m.
20. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 2, 18 ó 19, donde el procedimiento además comprende una etapa de redispersión de la nanopartícula polimérica hasta que la conductividad del sobrenadante sea menor o igual a 10 μβ/αη.
21 . - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 18-20, donde la etapa (¡i) del procedimiento se realiza de manera secuencial.
22. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 18-21 , donde el antisolvente es agua o mezclas de agua y un disolvente orgánico, preferiblemente un Ci-C4 alcohol.
23. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 18-22, donde el antisolvente es agua.
24. - La nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 18-23, donde la incorporación de doxorrubicina mediante asociación en el interior de la matriz polimérica durante la etapa (i) se lleva a cabo a temperatura inferior a 60 °C, preferiblemente inferior a 35 °C, y aun más preferiblemente a aproximadamente a 25 °C.
25.- Un procedimiento para la síntesis de una nanopartícula polimérica con un tamaño medio inferior a 200 nm, preferiblemente inferior a 190 nm, que comprende uno o más polímeros biodegradables, uno o más principios activos y al menos un tensoactivo, donde al menos un polímero biodegradable es poli(£-caprolactona) y donde al menos un principio activo es doxorrubicina: i) la disolución de poli(£-caprolactona) en un disolvente orgánico, preferiblemente diclorometano; ii) la adición de la disolución obtenida en (i) sobre una mezcla que comprende un antisolvente y un tensoactivo;
iii) el aislamiento de la partícula obtenida;
donde se incorpora el principio activo doxorrubicina mediante asociación superficial sobre la nanopartícula obtenida después de la etapa (iii) o mediante asociación en el interior de la matriz polimérica durante la etapa (i).
26. - Una composición farmacéutica que comprende:
- una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24; y
- un excipiente farmacéuticamente aceptable.
27. - La composición farmacéutica según la reivindicación anterior, caracterizada porque comprende un diluyente.
28. - La composición farmacéutica según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende agua.
29. - La composición farmacéutica según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizada porque está en forma para su uso parental, preferiblemente para su uso intravenoso, intraarterial, intratumoral, intramuscular o subcutáneo.
30. - La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 27, caracterizada porque comprende celulosa microcristalina, lactosa o cualquiera de sus combinaciones.
31 . - La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 26, 27 o anterior, caracterizada porque está en forma sólida oral, preferiblemente en comprimidos o cápsulas.
HOJA DE REEMPLAZO (Regla 26)
32.- Uso de una nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31 para la elaboración de un medicamento.
33.- Uso de una nanopartícula polimérica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 o de una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 26 a 31 para elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer, preferiblemente cáncer de mama.
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