WO2012099375A2 - ｐ47ｐｈｏｘ 또는 ｐ67ｐｈｏｘ를 표적으로 하는 스트레스 장애 치료제 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

ｐ47ｐｈｏｘ 또는 ｐ67ｐｈｏｘ를 표적으로 하는 스트레스 장애 치료제 및 이의 스크리닝 방법 Download PDF

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    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7004—Stress

Definitions

  • the present invention provides a method for preparing a stress sensitive response mitigator, a food or feed for improving stress containing the stress sensitive response mitigator, a pharmaceutical composition for preventing or treating stress disorders, a method for preventing or treating a stress disorder, a method for screening a stress sensitive response mitigator,
  • the present invention relates to a method for providing information for diagnosing a stress disorder caused by a stress sensitive reaction or chronic stress, and a stress level diagnosis kit.
  • LC-NE leuco ceruleus norepinephrine
  • CRH corticotropin releasing hormone
  • LC-NE activates the sympathetic nervous system and inhibits the work of the parasympathetic nervous system, increasing blood pressure, heart rate, and breathing, as well as expanding the bronchus and increasing the sweating caused by hair creeping on the skin.
  • CRH secreted by the hypothalamus releases the adrenal corticotropic hormone (ACTH) from the anterior pituitary gland into the body.
  • ACTH adrenal corticotropic hormone
  • HPA hypothalamus-pituitary gland-adrenal gland
  • Glucocorticoids regulate carbohydrate metabolism in the liver, including glucose synthesis (gluconeogenesis), glycogen storage, and elevated blood sugar levels.
  • glucocorticoids have anti-inflammatory effects by inhibiting the expression of various immune substance generating genes of immune cells responsible for immunity.
  • negative feedback acts on the pituitary gland to suppress ACTH secretion.
  • the body's tolerable stress acts as an appropriate stimulant for our body, but strong and sustained psychological and physical stress outside the permissible range leads to excessive secretion of glucocorticoids for extended periods of time.
  • This long-term excessive secretion of glucocorticoids reduce the body's immunity, thereby reducing the resistance to external infections, causing various diseases in our body.
  • it specifically inhibits brain cell damage and regeneration, causing insomnia, lethargy, memory loss, depression, as well as suicidal thoughts.
  • Depression is classified as a type of mood disorder along with mood swings and has psychological and physical symptoms, including stagnant mood, anesthesia, sleep disorders, nonsocialism, fatigue and decreased concentration (DSM-IV-TR).
  • DSM-IV-TR decreased concentration
  • Depression is a lifelong prevalence of 15%, especially about 25% in women, and is a serious condition that causes changes in feelings, thoughts, physical condition, and behavior.
  • the World Health Organization (WHO) predicts that by 2020, depression will be the number one disease of all ages. Also, depression rarely leads to suicide, and if depression rises to the number one ⁇ future disease '' in 2020, it is likely that death rates from depression may be higher than death rates from physical illnesses such as cancer. Pathophysiology is not known.
  • Serotonin is a neurometabolic compound found in cerebrospinal fluid, and when lacking, anxiety, anxiety, and impulsive tendency appear. Thus, antidepressants are often associated with the action of serotonin.
  • Antidepressants currently used in clinical practice are drugs (SSRI, SNRI, SDRI, TCAs, MAOIs, etc.) that have the property of increasing the pharmacological action of monoamine-based neurotransmitters in the nerve synaptic region.
  • drugs SSRI, SNRI, SDRI, TCAs, MAOIs, etc.
  • the antidepressant effect of these drugs is apparent in some patients, paradoxically, their pharmacological mechanisms are unclear from the perspective of neuroscience from the viewpoint of their long-term administration over 2-3 weeks.
  • the antidepressant effect may be reduced in response to the anti-inflammatory agent when administered together with the anti-inflammatory agent.
  • the drugs may cause side effects such as vomiting, decreased libido, insomnia, fatigue, obesity, suicidal thoughts, and 30% of depressed patients have limitations in which the drug currently in use has no effect.
  • the inventors have found that the expression of p47phox or p67phox genes in neurons or blood is consistently increased when compared to the control group without stress, based on the p47phox or The present invention has been completed by confirming that a p67phox-targeting stress sensitive response mitigator can be screened and that a stress disorder can be prevented or treated using a substance that inhibits the expression, function, or activity of p47phox or p67phox. .
  • Another object of the present invention is to provide a food or feed for improving stress, and a method for producing the same.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating a stress disorder, a method for preparing the same, and a method for preventing or treating a stress disorder.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for screening a stress sensitizer.
  • Still another object of the present invention is to provide an information providing method for diagnosing stress disorder caused by a stress sensitive reaction or chronic stress.
  • Another object of the present invention is to provide a stress level diagnostic kit.
  • drugs using mechanisms that inhibit the expression of p47phox or p67phox can be developed, and the drugs screened by the method of the present invention can be triggered or worsened by stress, especially chronic stress, depression, degenerative brain diseases, etc. Can be prevented or treated.
  • stress especially chronic stress, depression, degenerative brain diseases, etc.
  • p47phox or p67phox can be reversibly regulate the mechanism of stress generation.
  • Figure 1 shows the results of experiments with a chronic behavior test to establish a mouse model showing depression and anxiety-like behavior due to chronic stress.
  • A is an experimental design of imipramine (30 mg / kg) during 7 weeks old male C57BL / 6 mice treated with repeated body detention stress (RST) (2 hours daily, 2h-14d daily for 14 days). / day) Describe the experimental procedure for conducting a series of behavioral tests (tested in order of SIT, NSF, OF, MBT, TST, FST) after administration.
  • RST repeated body detention stress
  • B shows an example of the SIT test method and video tracking results for three groups: the control group (CON), mice treated with 2h-14d stress (RST), and imipramin-administered RST mice (RST + Imi). .
  • FIG. 1 graphs the results of (B), indicating that stressed mice spend more time in the corner area, which is the avoidance area, than in the interaction area.
  • Figure 1b (D) shows the TST and FST results show that the immobility of 2h-14d stressed mice (RST) increased compared to the control, but this immobilization was reduced by imipramine treatment.
  • Figure 1C (F) shows that the time taken to feed was increased in RST mice as a result of NSF experiments, but decreased by imipramine treatment.
  • (G) indicates that the amount of feed consumed for 5 minutes was increased by imipramine treatment.
  • H shows that the number of beads hidden by RST mice was increased as a result of MBT (Bead Hide Experiment), but the number of beads hidden by imipramine treatment increased.
  • I shows that the motor activity in the central region was markedly reduced in RST mice as a result of OFT and partially recovered by imipramine treatment.
  • J) shows the total accumulated moving distance in the open space and (K) shows the
  • Figure 2 shows that lipid peroxidation and protein carbonylation increased in the hippocampus of the brain depending on the stressed time and the number of repetitions.
  • (A) and (B) of Figure 2a is an experimental design according to the time of stress
  • Figure 2b (C) is a control (CON) and the stress in the hippocampus of mice (2h, 4h, 6h) for a certain time Shows the malondialdehyde (MDA) concentration and the degree of protein carbonylation
  • MDA malondialdehyde
  • D shows the experimental design for the number of repeated 2 h stresses over a period of time
  • (E) and (F) for each malondi in the hippocampus Aldehyde (MDA) concentration and protein carbonylation degree are shown.
  • FIG. 3 is a result showing the increase in ROS stress depending on the dose and duration of the glucocorticoid, a stress hormone in SH-SY5Y cells.
  • (A) of FIG. 3A shows that SH-SY5Y cells are treated with glucocorticoids (CORT: 400 or 800 ng / ml) for 2 hours, then removed and retreated after 22 hours of incubation for 1 (24h) to 3 days.
  • CORT 400 or 800 ng / ml
  • 4 is a result showing that the expression pattern of the gene regulating ROS concentration in the brain of the mouse has been changed due to repetitive stress.
  • 4A and 4B show the results of real-time RNA quantitative analysis of the expression of genes controlling ROS concentration in prefrontal cortex (PFCX; A) and hippocampus (HP; B) in stressed mice (2h-14d) and controls.
  • 4C schematically shows the composition of NADPH oxidase
  • FIG. 4D shows control (C) and stressed mice (2h-14d) as a result of the upregulation of NADPH oxidase subunit expression due to repetitive physical stress.
  • Figure 5a shows that the expression of p47phox and p67phox can be upregulated in the blood of repetitive detention stressed mice
  • Figure 5b shows that the expression of PRX3 and TRX2 in the blood of repetitive detention stressed mice It can be shown.
  • FIG. 6 shows in SH-SY5Y cells ORT production induced by CORT was blocked by NADPH oxidase inhibitor treatment.
  • 6a shows increased ROS concentrations in SH-SY5Y cells treated with glucocorticoids (400 ng / ml) for 48 h. Blocking by vitamin C (Vit C, 200 ⁇ M) was observed by DCF (10 ⁇ M) staining, expressed as% of control.
  • FIG. 6B shows that aposinin inhibits the NADPH oxidase subunit p47phox from being activated by glucocorticoids and transported to the cell membrane. SY5Y cells, post-treatment aposinin treated cells were observed with anti-p47phox antibody and DAPI staining.
  • Figure 7 shows that the expression of p47phox was up-regulated by glucocorticoid treatment in SH-SY5Y cells.
  • A shows p47phox expression in real-time quantitative RNA analysis of SH-SY5Y cells treated with glucocorticoids (400 ng / ml) or H 2 O 2 (200 ⁇ M) for 24 hours. Each sample was expressed in multiples of the control group.
  • B shows DCF (B) showing that ROS production induced with glucocorticoids (400 ng / ml) was completely blocked by cyclohexamide (CHX; 1 or 10 ⁇ M) treatment (48 hours), a protein synthesis inhibitor ) And DHE (C) staining. Each value is expressed in% relative to the 24h control group.
  • FIG. 9 is a result showing that ROS production due to stress is suppressed in the brain when the mouse was administered aposinin NADPH oxidase inhibitor.
  • A represents the experimental design, imipramine (Imi; 20 mg / kg), aposinine (Apo; 15 mg / kg), or vitamin 1 hour before the stress of detention (2h, 3-14 days) C (Vit C; 15 mg / kg) was administered intraperitoneally.
  • (B) is the result showing the MDA concentration by each drug administration
  • C) and (D) is the behavioral test TST (C) and FST (D) results by each drug administration.
  • FIG. 10 is a result showing that when knocking down p47phox expression in the brain, depression behavior due to chronic stress was blocked.
  • A shows the results of GFP expression in HeLa and A549 cells 8 hours after infection with Lenti-p47phox-shRNA expressing GFP.
  • B Experimental design into the dentate gyrus (DG) of the bilateral hippocampus of the brain. Microinjection of Lenti-p47phox-shRNA (also expressed in GFP) or Lenti-GFP, showing the duration of stress and the time of testing.
  • C) and (D) show TST (C) and FST (D) test results when infected with each of the above virus in stressed (RST) and control (CON) mice.
  • Figure 11 shows mice with only one copy of p47phox (p47phox +/-) Results show no depression-like behavior due to chronic stress (2h-14d stress).
  • (A) shows genotypes of mice that normally have two copies (+ / +) of the p47phox gene (gel picture lane 2-3) and a gene hit mouse having only one copy (lane picture 4-5 lanes), and the p47phox gene by PCR. After amplification, it was analyzed by MspI restriction enzyme digestion. M: marker; 100 bp ladder, lanes 3 and 4 show that additional bands were generated by p47phox gene deletion.
  • (B) was subjected to 2h-14d stress in p47phox heterozygote mouse (+/-) and wild type (+ / +) mice as experimental design.
  • (C) and (D) are the results of TST (C) and FST (D) performed the day after the last stress treatment.
  • the present invention provides a method for producing a stress sensitive reaction relaxant; And (2) extracting some of the produced stress sensitive response mitigators to determine whether to inhibit one or more of expression, activity and function of p47phox or p67phox. do.
  • the present invention provides a method of identifying a test substance comprising (1) identifying whether a test substance inhibits one or more of expression, activity, and function of p47phox or p67phox; And (2) mass-producing a test substance identified to inhibit one or more of p47phox or p67phox expression, activity, and function in the step.
  • P47phox of the present invention is a subunit of NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) oxidase, and NCBI Accession No. is preferably NM_010876.2 for mice and NM_000265.4 for humans.
  • NADPH Natural Acidamide Adenine Dinucleotide Phosphate
  • P67phox of the present invention is one subunit of NADPH oxidase. It is preferable that NCBI Accession No. is NM_010877.4 for mice and NM_001127651.2 for humans.
  • the NADPH oxidase is a protein complex that transmits electrons through a biofilm, and transfers electrons from NADPH to oxygen molecules to generate peroxides (superoxide, Reactive Oxygen Species, ROS).
  • the NADPH oxidase complex comprises Rho guanosine triphosphatase (GTPase) (Rac1 or Rac2 (Rho-related C3 botulinum toxin substrate) and gp91-phox (Nox2), p22phox, p40phox containing five "phox" (phagocytic oxidase) regions.
  • stress sensitive response refers to a response that can be caused by stress, for example, by stress, locus ceruleus norepinephrine (LC-NE) or corticosteroid hormone free hormone (CRH). : Reacts directly or indirectly by glucocorticoid hormone secreted by direct or indirect reaction or stress caused by corticotropin releasing hormone.
  • LC-NE locus ceruleus norepinephrine
  • CH corticosteroid hormone free hormone
  • depression anxiety, fear memory, mental panic, obsessive-compulsive disorder, post-traumatic stress disorder, schizophrenia, headaches caused by stress, neurodegenerative diseases, fatigue syndrome, eating disorders, nervousness, which can ultimately be caused by stress Anorexia, gastritis, gastric ulcers, Alzheimer's dementia, Parkinson's disease, stroke or stress-related responses that occur before reaching the disease, which occur before the onset of ALS, are all included.
  • the "stress sensitive response alleviator” means a substance capable of reducing and alleviating the "stress sensitive response” described above, and may also be collectively referred to as an antistress agent.
  • chronic (severe) stress refers to a physiological response and its consequences that, when given stress repeatedly over a medium to long term, cause sustained neurological and mental brain damage.
  • the chronic stress that is repeatedly given causes depression and anxiety
  • a large amount of oxidative stress accumulates in the cranial nerve, and causes a severe mitochondrial dysfunction for the first time by a molecular mechanism called activation of p47phox or p67phox caused by stress. It was clarified.
  • p47phox or p67phox it was found that by controlling p47phox or p67phox, it is possible to suppress the overproduction and depression of ROS in the cranial nervous system.
  • the present invention mitigates the stress-sensitive response by inhibiting the expression, function, or activity of p47phox or p67phox at a stage before the reaction caused by the stress or the stress disorder induced by the progressive accumulation of stress.
  • stress mitigating agents can be prepared, including determining whether to inhibit the expression, function, or activity of p47phox or p67phox.
  • the present invention after mass-producing a stress-sensitive response mitigator, extracts some of the mass-produced stress-sensitive response mitigators to determine whether to inhibit one or more of the expression, activity, and function of p47phox or p67phox, that is, alleviation
  • a stress-sensitive response mitigator can be prepared.
  • the present invention can select a test substance identified to inhibit one or more of the expression, activity, and function of p47phox or p67phox, and mass-produce it, thereby preparing a stress sensitive reaction alleviator.
  • inhibiting at least one of the expression, activity, and function of p47phox or p67phox also includes an inhibitor of expression / activation / function enhancement of p47phox or p67phox or a substance which inhibits expression / activation / function of enhanced p47phox or p67phox. .
  • the expression of p47phox or p67phox in the blood of a chronically stressed animal is up-regulated, on the basis of which it inhibits one or more of the expression, activity, function of p47phox or p67phox
  • Checking whether or not inhibiting one or more of the expression, activity, and function of p67phox of the test substance can be performed by measuring one or more of the expression, activity, and function of p47phox or p67phox in the blood of the animal.
  • the "test substance” is a substance that specifically inhibits the expression and / or activity of p47phox and / or p67phox or a combination thereof.
  • the test substance includes at least 10 base single or double stranded nucleic acids, such as 10, 11, 12, 14, 15 or more nucleic acid molecules, for example siRNA, shRNA or miRNA.
  • the test substance may also be a polypeptide having two or more amino acid residues, such as 6, 8, 10, 12, 20 or less, or more than 20 such as 50 amino acid residues.
  • expression refers to transcription of a gene and expression of a transcript into a protein
  • activity refers to a biological action that allows the expressed protein to function.
  • whether to inhibit one or more of the expression, activity, and function of p47phox or p67phox is not limited thereto, but may be determined by measuring the expression level of p47phox or p67phox.
  • the expression level of p47phox or p67phox mRNA can be measured by RT-PCR, quantitative or semi-quantitative RT-PCR, quantitative or semi-Quentitative real-time PCR, It may be measured using any one method selected from the group consisting of a northern blot and a DNA or RNA chip, but is not limited thereto.
  • the expression level of p47phox or p67phox protein may be measured using any one method selected from the group consisting of western blot, tissue immunostaining, and tissue fluorescence staining, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a food or feed for improving stress which contains a stress sensitive response mitigator that inhibits one or more of the expression, activity and function of p47phox or p67phox.
  • the present invention provides a method for producing a stress-improving food or feed comprising the step of identifying whether the stress-improving food or feed inhibits one or more of the expression, activity and function of p47phox or p67phox. To provide.
  • the present invention is to provide a food or feed for improving stress, containing a stress-sensitive response mitigator exhibiting properties that inhibit one or more of the expression, activity, function of p47phox or p67phox.
  • the stress-enhancing food or feed can improve the symptoms appearing before all the reactions caused by stress, or stress disorders induced by repetitive stress, and can prevent stress disorders.
  • the stress-sensitive response mitigating agent is not limited to compounds, natural products, novel proteins, etc., as long as the substance exhibits a property of inhibiting at least one of p47phox or p67phox expression, activity, and function.
  • p47phox or p67phox also includes a substance that does not move to the cell membrane and is not active.
  • Substances that inhibit the expression, activity or function of p47phox or p67phox are preferably aposinine, 4-hydroxy-3'-methoxy-acetophenone, N-vanillylnonanamide, star Urosporin, neopreterin, diphenylene iodonium or combinations thereof, but is not limited thereto.
  • RNA interference to, for example, short-length interfering RNA (siRNA) to sequence-specifically bind to a transcript, forming an RNA induced silencing complex (RISC), whereby the transcribed RNA is a protein in the cell. It should not be expressed as (silencing).
  • siRNA, shRNA or miRNA target the p47phox gene, which is one of the subunits of NADPH oxidase.
  • siRNA, shRNA or miRNA have a sequence that is significantly complementary to its target sequence.
  • highly complementary sequence is meant at least about 70% complementarity, at least about 80% complementarity, at least about 90% complementarity, or about 100% complementarity with at least consecutive 15 base length sequences of the target gene.
  • the p47phox siRNA or shRNA may include, but is not limited to, siRNA, shRNA, Lenti-p47phox-shRNA, which is used for p47phox silencing in the examples herein, but is not limited thereto.
  • siRNAs, shRNAs and / or miRNAs targeting p47phox from various origins can be used, including their biological equivalents, derivatives and analogs.
  • the siRNA, shRNA and / or miRNA are from the human p47phox gene.
  • the siRNA, shRNA, and / or miRNA are between about 600 and 1200 bases, between about 700 and 1200 bases, between about 800 and 1200bases, and between about 900 and 1200bases based on the human derived gene NM_000265.4 sequence. It is from 35 bases in length and can be designed using commercial siRNA, shRNA or miRNA target design software.
  • the agent that inhibits one or more of the expression, activity and function of p47phox or p67phox is an antibody capable of recognizing p47phox, p67phox or a combination thereof.
  • an antibody is intended to include intact antibodies, antigen-binding fragments of antibody molecules, and antibodies or fragments functionally equivalent to these.
  • the antibody of the present invention may be of the IgG, IgM, IgD, IgE, IgA or IgY type, and may be of the IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 or IgA2 class or subclass thereof.
  • Antibodies of the invention include monoclonal, polyclonal, chimeric, single chain, bispecific, amatogenic and humanized antibodies and active fragments thereof.
  • a stress sensitive response alleviator that inhibits one or more of the expression, activity and function of p47phox or p67phox may interfere with, interfere with and / or inhibit the activity and / or action / function of p47phox, p67phox.
  • It can be a polypeptide.
  • polypeptide refers to a polymer of amino acids and does not refer to a particular length as long as it has this action.
  • peptides, oligopeptides, proteins, enzymes are also included in the scope.
  • Polypeptides include those that are naturally or artificially modified, such as glycosylation, acetylation, phosphorylation, and the like.
  • stress-sensitive response mitigators that inhibit one or more of the expression, activity and function of p47phox or p67phox are aposinine, 4-hydroxy-3'-methoxy-acetophenone, N-vanylylnonanamide (N- Vanillylnonanamide), Staurosporine, Neoopterin, Diphenylene Idonium or combinations thereof are preferred, but not limited thereto.
  • the stress-sensitive reaction relaxing agent contained in the food or feed is prepared by the method for preparing the stress-sensitive reaction relaxing agent described above.
  • the kind of food there is no particular limitation on the kind of food.
  • examples of the food to which the substance can be added include dairy products including meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, ice cream, various soups, drinks, tea, drinks, Alcoholic beverages and vitamin complexes, and the like and include all of the health foods in the conventional sense.
  • the health beverage of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates and the like as additional ingredients, as in general beverages.
  • the above-mentioned natural carbohydrates are glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • sweetening agent natural sweetening agents such as tautin and stevia extract, synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 ml of the composition of the present invention.
  • the food of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, And a carbonation agent used for the carbonated beverage.
  • the proportion of such additives is not critical but is usually selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the food of the present invention.
  • the composition of the present invention may contain a flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. The proportion of such pulp is not critical, but is generally selected in the range of 0.01 to 10 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the feed may be classified into various kinds according to nutritional value, main ingredient, distribution, moisture content, blending state, processing form, etc., and the feed is a feed, a rich feed, a supplementary feed, a protein feed, a starch feed, a fat feed or a fiber. Feed is available, but is not limited to this concept includes a feed additive.
  • the feed may additionally contain a carrier that is acceptable to poultry and livestock.
  • the feed may be added as it is or a known carrier, stabilizer, etc., and various nutrients such as vitamins, amino acids, minerals, antioxidants, antibiotics, antibacterial agents, and other additives may be added as necessary.
  • the shape may be in a suitable state such as powder, granules, pellets or suspension.
  • the feed of the present invention is supplied to the poultry and livestock, etc. can be supplied alone or mixed in the feed, the feed can reduce the stress received by the poultry and livestock.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating stress disorder, comprising as an active ingredient a substance that inhibits one or more of the expression, activity and function of p47phox or p67phox.
  • the present invention provides a method for preventing or preventing a stress disorder comprising determining whether the pharmaceutical composition for preventing or treating a stress disorder or an active ingredient thereof inhibits the expression, activity and function of p47phox or p67phox.
  • the invention provides a method of preventing or treating a stress disorder by administering to a subject a substance that inhibits one or more of the expression, activity, and function of p47phox or p67phox.
  • lipid peroxidation of the brain accumulates over time when continuous stress is applied to the mouse, and the expression of p47phox or p67phox increases with chronic stress, and siRNA against p47phox inhibits its expression.
  • ROS production induced by glucocorticoid and production of peroxide decreased depending on the amount of siRNA treated (Example 6).
  • depressive behavior was reduced in stressed mice by the treatment of apocyanin and the antidepressant imipramine, which inhibits the expression of p47phox or p67phox, and also in the p47phox gene-targeted mutant (+/-) mice.
  • the composition As an active ingredient of the composition, as long as it is a substance that inhibits the expression, activity or function of p47phox or p67phox, its kind is not limited.
  • the substance which inhibits the expression, activity or function of p47phox or p67phox is preferably aposinine, 4-hydroxy-3'-methoxy-acetophenone, N-vanylylnonanamide, Staurosporine, neopreterin, diphenylene idonium or combinations thereof, including but not limited to.
  • prophylaxis means any action that inhibits or delays the symptoms of a stress related disease by administration of a composition.
  • treatment means any action that improves or beneficially changes the symptoms of stress-related diseases by administration of the composition.
  • the stress disorder refers to a condition in which symptoms may be triggered or worsened by mental and / or physical chronic stress, and specifically, depression, anxiety, fear memory, mental panic, and compulsion caused by mental and / or physical chronic stress.
  • Disorder, post-traumatic stress disorder, schizophrenia, stress-induced headache, neurodegenerative disease, fatigue syndrome, eating disorders, anorexia nervosa, gastritis, gastric ulcer, Alzheimer's dementia, Parkinson's disease, stroke and ALS The above diseases are included, but are not limited to these.
  • composition of the present invention in addition to a substance which inhibits one or more of the above-mentioned 47phox or p67phox expression, activity and function, an active ingredient that exhibits the same or similar function in addition to one or more of the active ingredient or the solubility and / or absorption of the active ingredient is maintained. It may further contain a compound to increase / increase.
  • composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, liquid solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. It may have a formulation of.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to the type and severity of the subject, the severity, age, sex and activity of the drug. , Drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrently used drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the method of administering the composition of the present application is not particularly limited thereto, and a method of administering a substance that inhibits one or more of the known expression, activity, and function of 47phox or p67phox may be applied, and parenteral administration may be performed according to a desired method ( For example, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topical) or oral administration, parenteral administration via patch-type, nasal / respiratory adhesion to the skin, and intravenous for rapid therapeutic effect. Administration by internal injection may be preferred.
  • the dosage may vary widely depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, method of administration, rate of excretion and severity of the patient.
  • the present invention provides a method for preparing a cell, comprising the steps of: (1) providing a cell expressing p47phox or p67phox; (2) a second step of contacting the test substance with the cells; And (3) a third step of selecting as a candidate a test substance in which at least one of the expression, activity and function of p47phox or p67phox is inhibited in a cell in contact with the test substance as compared with a cell not in contact with the test substance. It includes, provides a screening method of the stress sensitizer.
  • the cells used in the first step various cell lines having neuronal characteristics may be used, for example, SH-SY5Y (human neuroblastoma cell line), HT22 (mouse hippocampal cell line) May be used, but is not limited thereto, and non-neural cell lines A549 (human lung adenocarcinoma epithelial cell line), KEK 293 (human embryonic kidney-derived cell line) may be used, but are not limited thereto.
  • SH-SY5Y human neuroblastoma cell line
  • HT22 mouse hippocampal cell line
  • A549 human lung adenocarcinoma epithelial cell line
  • KEK 293 human embryonic kidney-derived cell line
  • Cells in which p47phox or p67phox are normally expressed and functioning can be used on their own and, if necessary, for example These cell lines are treated with hormones such as glucocorticoids as described in the Examples to express, overexpress (compared to) and / or activate p47phox and / or p67phox genes, or to express p47phox and / or p67phox genes.
  • the cells After delivery to the plasmid, the cells may be contacted with the test substance for a period of time, such as 48 hours.
  • the cells used in the first step may be provided in the form of an experimental animal, in which case the screening method of the present invention further comprises the step of applying chronic and / or persistent stress to the experimental animal, the test substance Contact with may include, but is not limited to, parenteral or oral administration, orthopedic injection, and one of ordinary skill in the art will be able to select an appropriate method for testing a test substance in an animal.
  • rats, mice, fruit flies, worms may be included, but is not limited thereto.
  • Chronic / persistent stress as used herein includes those defined above, and in the case of mice or rats, for example, the methods described in the Examples herein, electroshock treatment, exposure to aggressive mice, cryopreservation, forced swimming, food / water deprivation , Treble sounds and strong flashing light exposure, sleep deprivation, circadian disturbance, formalin, chemical / pain stress treatment with other drugs, infection of LPS-containing microorganisms, isolation, etc., fruit flies and nematodes
  • a reporter gene system that detects an increase in ROS in the cerebral nervous system may be selected, and candidates may be selected by confirming the expression of reporter genes as a result of increasing or decreasing ROS after treatment of the test substance.
  • changes in p47phox or p67phox activity will, in principle, be directed to the cranial nervous system or neurons, but due to the nature of stress hormones such as glucocorticoids (e.g., cortisol in humans, and corticosteroids in mice / rats). Because it can act on tissues, all organs, tissues, and cells can be investigated. In this case, the increase / decrease of p47phox or p67phox activity by treatment of the test substance can be measured by the biochemical changes of the cranial nervous system, for example, the generation of ROS.
  • stress hormones such as cortisol in humans, and corticosteroids in mice / rats.
  • the second step is to contact the test substance with a cell expressing p47phox or p67phox.
  • the test substance may not only inhibit the expression or activity of p47phox or p67phox, but also includes a substance which is expected to be inhibited due to the characteristics of the test substance.
  • the test substance is a substance which is expected to specifically inhibit the expression and / or activity of p47phox and / or p67phox or a combination thereof.
  • a low molecular weight compound, a high molecular weight compound, a nucleic acid molecule for example, DNA, RNA, PNA, and APP) Tamers
  • proteins sugars, lipids, and the like.
  • the test substance includes at least 10 base single or double stranded nucleic acids such as 10, 11, 12, 14, 15 or more nucleic acid molecules such as siRNA, shRNA or miRNA.
  • the test substance may also be a polypeptide having two or more amino acid residues, such as 6, 8, 10, 12, 20 or less, or more than 20 such as 50 amino acid residues.
  • compounds having a low molecular weight therapeutic effect may be used.
  • compounds of about 1000 Da in weight such as 400 Da, 600 Da or 800 Da can be used.
  • such compounds may form part of a compound library, and the number of compounds constituting the library may vary from tens to millions.
  • Such compound libraries include peptides, peptoids and other cyclic or linear oligomeric compounds, and small molecule compounds based on templates such as benzodiazepines, hydantoin, biaryls, carbocycles and polycycle compounds (such as naphthalene, phenoty) Azine, acridine, steroids, and the like), carbohydrate and amino acid derivatives, dihydropyridine, benzhydryl and heterocycles (such as triazine, indole, thiazolidine, etc.), but these are merely illustrative. It is not limited to this.
  • test substance depends on the specific test method used and the type of test substance, and a person skilled in the art can select an appropriate amount. Candidates were those that reduced the production of ROS compared to controls that were not in contact with the test results. For example, in the presence of the test substance, about 99% or less, about 95% or less, about 90%, about 85%, about 80%, about 75%, about 70%, or about 65% less than the control. Less than%, less than about 60%, less than about 55%, less than about 50%, less than about 45%, but does not exclude a range beyond this.
  • the generation of ROS can be detected by a variety of known methods, for example as described in the Examples, and those skilled in the art will be able to select an appropriate one.
  • contact with the test substance means adding the test substance to the cell culture medium and culturing the cells for a predetermined time.
  • contact with the test substance is not limited to those involving parenteral or oral administration or stereotactic injection, and those skilled in the art will select an appropriate method for testing the test substance in the animal.
  • contact with the test substance is not limited to those involving parenteral or oral administration or stereotactic injection, and those skilled in the art will select an appropriate method for testing the test substance in the animal.
  • contact with the test substance is not limited to those involving parenteral or oral administration or stereotactic injection, and those skilled in the art will select an appropriate method for testing the test substance in the animal.
  • the third step of the present invention includes comparing the expression level of p47phox or p67phox in the cells contacted with the test substance and the expression level of p47phox or p67phox in the cells not contacted with the test substance. Increasing / decreasing the expression and / or activity of p47phox or p67phox by treatment of the test substance can select candidates for biochemical changes in the cranial nervous system. In one embodiment, detection of the expression or activity of p47phox or p67phox can be measured by the generation of Reactive Oxygen Species (ROS).
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • ROS sensitive drugs such as DCF and / or DHE.
  • a decrease in the production of ROS can be interpreted as a decrease in p47phox or p67phox expression or activity.
  • the expression level of 47phox or p67phox mRNA in step 3 can be measured by RT-PCR, quantitative or semi-quantitative RT-PCR (Quantitative or semi-Quentitative RT-PCR), or quantitative or semi-quantitative real time PCR (Quentitative or semi-Quentitative real).
  • -time PCR quantitative or semi-quantitative RT-PCR
  • quantitative or semi-quantitative real time PCR Quantentitative or semi-Quentitative real time PCR
  • the method may further include selecting a test substance having a lower expression level of p47phox or p67phox in the cells contacted with the test substance as a stress sensitive response mitigator than the expression level of p47phox or p67phox in cells not contacted with the test substance.
  • the present invention provides a method for diagnosing stress disorder caused by a stress sensitive response or chronic stress, comprising measuring any one of expression, activity and function of p47phox or p67phox in a biological sample isolated from an individual. Provide information
  • the present invention provides a stress level diagnostic kit, characterized by measuring the concentration of p47phox or p67phox in a biological sample isolated from an individual.
  • the present invention targets a subject to be diagnosed as a stress disorder caused by a stress sensitive reaction or chronic stress, and measures the expression level of p47phox or p67phox to diagnose a stress sensitive response or a stress disorder.
  • a stress disorder caused by a stress sensitive reaction or chronic stress
  • measures the expression level of p47phox or p67phox to diagnose a stress sensitive response or a stress disorder.
  • the diagnostic kit can diagnose the stress level by measuring the concentration of p47phox or p67phox, it can diagnose whether the stress disorder. Using the kit, the concentration of p47phox or p67phox is higher than the normal value, it can be diagnosed as a relatively high stress level.
  • Information providing method of the present invention may further comprise the step of measuring any one of the expression, activity and function of PRX3 or TRX2 of the biological sample isolated from the subject.
  • the inventors have found that the expression of PRX3 or TRX2 is reduced in the brain of mice that are repeatedly stressed (Korean Patent Application No. 10-2011-0067571).
  • the expression of PRX3 or TRX2 in the blood as well as the brain of the mouse repeatedly stressed Fig. 5b.
  • the present invention targets a subject to be diagnosed as a stress disorder caused by a stress sensitive reaction or chronic stress, and measures the expression level of PRX3 or TRX2 to diagnose the stress sensitive response or stress disorder. Can be.
  • the diagnostic kit of the present invention can additionally measure the concentration of PRX3 or TRX2 in the biological sample.
  • the diagnostic kit may diagnose the stress level by measuring the concentration of PRX3 or TRX2, and may diagnose whether the stress disorder.
  • the kit may be used to diagnose that the stress level is relatively high when the concentration of PRX3 or TRX2 is lower than normal.
  • the biological sample of the present invention is not limited thereto, but may preferably be blood, tissue, cells, saliva, sputum, cerebrospinal fluid, urine or hair to be diagnosed with stress disorder, and more preferably, blood.
  • mice Seven week old male C57BL6 mice were purchased from Biolink. Mice were allowed to adapt to the environment by raising two birds in cages one week before the experiment in a controlled environment of humidity and temperature. All animals were treated according to experimental animal care guidelines of Ewha Womens University College of Medicine. P47phox gene targeting mice (+/ ⁇ ) were as described in Huang et al., 2000 and were purchased from Jackson Laboratories (USA). Genotyping The genotype of mice isolated genomic DNA from the tail of the mouse was carried out PCR using the following primers; 5-TGG AAG AAG CTG AGA GTT GAG G-3 (SEQ ID NO: 1), 5-TCC AGG AGC TTA TGA ATG ACC-3 (SEQ ID NO: 2). After amplification by PCR, MspI was digested and analyzed by agarose gel electrophoresis.
  • mice were placed from the head into individually ventilated 50 ml polypropylene conical tubes, plugged into medium tubes about 3 cm long, and capped on a 50 ml tube. The mouse was completely detained in this instrument by filling. These detention experiments were conducted at regular times (10 am), followed by 2 hours per day and repeated over 14 days. After detention experiments, mice were housed in cages under normal conditions and water and feed were freely consumed.
  • the name, source, and route of administration used were as follows: imipramine hydrochloride, Sigma (St. Louis, MO), dosage 20 mg / kg (i.p.); Apocynin (Sigma), dosage 15 mg / kg (i.p.); Vitamin C (L-Ascorbic acid, Sigma), dose 15 mg / kg (i.p.).
  • Aposinine was dissolved in DMSO and then diluted with saline, and other drugs were used after being dissolved in saline. Finally, each drug diluted with 100 ⁇ l of 0.9% saline was administered according to the above-mentioned administration method and dosage.
  • mice were transferred to the examination room 30 minutes before the start of each behavioral assessment test and allowed to stay in the same room throughout the test. The test was performed as described in FIG. 1A (A). Behavioral assessments were performed using a computer video-tracking system (SMART; Panlab S.I., Barcelona, Spain) and mice were analyzed 1 hour after the last injection. In all rounds, the sound was blocked with 55-60 dB white noise (noise).
  • SMART computer video-tracking system
  • mice were analyzed 1 hour after the last injection. In all rounds, the sound was blocked with 55-60 dB white noise (noise).
  • mice to be tested were placed in an open field and the trajectories were tracked twice consecutively (5 min each time, optimal sensitivity / throughput ratio).
  • first session non-target conditions
  • mice to be tested were placed in an open space with an empty plexiglass mesh cage (15 x 8 x 17 cm) without target animals.
  • target conditions uses the same conditions as the first session or social interaction by placing the target animal (at least an aggressive B6 / SJL male mouse at least older than the test animal) in an open space with a plexiglass mesh cage.
  • the subject mice were transferred from the open field to the home cage and left for about 1 minute.
  • mice to be examined were taped to a metal rod 50 cm above the surface of the table and suspended for 6 minutes to suspend the mice.
  • the experiment was conducted in a quiet room and the safety mats were placed on the table (Steru et al., 1985, Bilkei-Gorzo et al., 2002).
  • mice were placed in a bucket filled with water at 24 ° C. in a Plexiglass cylinder (height; 27 cm, diameter; 15 cm) at a depth of 14 cm to allow preliminary swimming for 15 minutes under conditions such that they would not escape or touch the floor. After 15 minutes the mouse was removed, wiped dry with a towel, and returned to the home cage. One day later, mice were forced to swim for 6 minutes. The mice were allowed to acclimate for the first 1 minute and the behavior was observed for the next 5 minutes. Immobility time is defined as the sum of the times the animal is floating without any movement of the limbs. Detailed recording methods are described in Kim et al., 2006.
  • This experiment measures anxiety caused by stress and measures how long the animal hesitates to eat the first food it had previously eaten in an unfriendly environment. This test is very sensitive to the efficacy test for chronic depression treatment.
  • feed was removed from the cage for ⁇ 24 hours and water was allowed to drink arbitrarily. After the end of this period, one oval feed pellet of size 2 x 2.5 cm was placed on a circular white filter paper (150 mm in diameter) and centered in the open field (45 x 45 x 40 cm).
  • Each mouse was removed from the home cage and placed in an air cage without water and feed for 30 minutes and then placed in an open space illuminated by 1400 lux illumination. At this point, the intake over five minutes in the retarded and home cages from which the food was first eaten was recorded. As soon as the mice began to feed, the animals were transferred to home cages for 5 minutes of premeasured weight. At the end of 5 minutes, the weight of the feed placed in the cage was measured to calculate the amount of feed ingested.
  • the bead concealment test is used to measure anxiety and is basically performed according to the existing method (Deacon, 2006, de Kloet ER et al, 2005) with a slight modification.
  • the empty home cage was filled with a rug up to 5 cm high from the bottom, twelve beads were placed in a grid, and the mice were released and left free for 30 minutes. After that, the number of hidden marbles was counted. If the beads were seen ⁇ 25%, they were considered hidden. Mice pre-administered antidepressant had less oral hiding compared to control mice.
  • Test animals were placed in the center of the open space of a white Plexiglas chamber (45 ⁇ 45 ⁇ 40; 70 lux) and the mobility was measured for a defined time.
  • the horizontal mobility was determined by the moving distance of the test animal.
  • Lipid peroxidation is assessed by measuring malondialdehyde (MDA) levels using the Bioxytech MDA-586 kit, as previously described (Im et al., 2006; Seo et al., 2010a-c; 2011a-b). It was.
  • MDA malondialdehyde
  • brain tissue was homogenized with four volumes of ice-cold 20 mM PBS, pH 7.4, containing 5 mM butylated hydroxytoluene. The homogenate was then centrifuged at 3,000 g at 4 ° C. for 10 minutes, and the supernatant was used for each assay.
  • 10 ⁇ l of probucol and 640 ⁇ l of diluted R1 reagent (1: 3 methanol: N-methyl-2-phenylindole) were added and mixed with 150 ⁇ l of 12N HCl. After reacting at 45 DEG C for 60 minutes, it was centrifuged at 10,000 g for 10 minutes. The supernatant was separated and the absorbance was measured at 586 nm.
  • MDA data was normalized to protein concentration and values were expressed as percentages of sham control. Protein-bound MDA content was obtained by subtracting.
  • Protein carbonyl content is described in Lee et al. It was quantified by the method described in (2009). Supernatants (500 ⁇ l) of brain homogenate were precipitated with 500 ⁇ l of 20% Trichloracetic acid (TCA). After centrifugation at 10,000 g for 15 minutes, the pellet was resuspended at 50 ° C. with 0.5 ml of 10 mM 2,4-dinitrophenylhydrazine of 2M HCl. After periodic stirring every 10 minutes, the reaction was allowed to react at room temperature in the dark for 1 hour before the sample was precipitated with 0.5 ml of 20% TCA. This process was repeated three times using 10% TCA. The resulting precipitate was dissolved in 2 mM NaOH at 37 ° C. Protein carbonyl content was determined by measuring absorbance at 360 nm and expressed in units of nmol / mg protein.
  • Mouse blood cells were prepared from blood taken from the abdominal aorta of mice anesthetized with a 1 ml disposable plastic syringe. Supernatants and pellets obtained by collecting whole blood into tubes and centrifuging at 1,500 rpm for 15 minutes at room temperature were referred to as serum and blood cells, respectively.
  • RNA sample preparation and real-time PCR were performed as previously described (Ha et al., 2008).
  • RNA quantification the superior prefrontal cortex, hippocampus and blood cells of chronically treated RTS mice were collected. Total RNA was purified using Trizol (Invitrogen Carlsbad, CA, USA) reagent and treated with DNaseI to prevent genetic contamination. Reverse transcription was performed according to the manufacturer's instructions using a reverse transcription system (Promega, Madison, Wis., USA). The first-stranded cDNA was synthesized with 1 ⁇ g of total RNA in a total volume of 20 ⁇ l using a Promega RT PCR kit.
  • PCR reactions were final volume containing 10 ⁇ l 2 ⁇ iQ SYBR Green supermix (Bio-Rad, Richmond, Calif., USA), 1 ⁇ l each of 5 pmol / ⁇ l forward and reverse primers, and 5 ⁇ l cDNA (1/100 dilution) At 20 ⁇ l, it was performed using a CFX 96 Real-Time PCR System Detector The reaction cycle was as follows: after 5 min treatment at 95 ° C., 20 sec at 95 ° C., 20 sec at 56 ° C. 40 cycles of treatment for 20 seconds at 72 ° C. The specificity of the amplification was determined by DNA fusion curves for autofluorescence data captured during gradual temperature increase (0.5 ° C.) from 55 ° C.
  • the amount of cDNA was measured using real time PCR.
  • the primers used to amplify the specific sites of the transcript measured in the experiment are as follows:
  • the gp91-phox, p22-phox, p40-phox, p47-phox and p67-phox primers were used as previously described (Tammariello et al., 2000).
  • GAPDH and beta actin ( ⁇ -actin) were used as internal controls for titration. PCR reactions were performed three times independently.
  • Recombinant lentiviruses were produced as previously described (Min et al., 2010).
  • three plasmids comprising a transfer vector (Lenti-p47phox-shRNA, purchased from OpenBiosystems, RMM4431-98723759), a membrane glycoprotein expressing lentivirus vector (Macrogene., Korea), and a packaging vector were transferred to 293T cells.
  • Nucleus was injected with lipofectamine plus (Invitrogen Corp., CA, USA) at a molar ratio of 1: 1: 1.
  • Culture supernatants containing viral vector particles were collected 48 hours after infusion into the nucleus, filtered through a 0.45 ⁇ m membrane and stored in a -70 ° C. freezer.
  • the expression level of the lentiviral vector was analyzed by RT-PCR, Western blot, and ELISA. Titers (titration) were determined by p24 ELISA after infection with HeLA cells. The obtained value of about 10 6 -10 7 Transduction unit (transduction unit, TU) / ml, respectively. GFP expression was confirmed after nuclear injection into HeLA cells or A594 cells and photographed using a fluorescence microscope (Nikone TE2000U, Japan). Virus was filtered with centricon (Centricon, Millipore Corp., Billerica, Mass., USA). The virus particles were further concentrated by ultracentrifugation at 80,000 g for 2 hours, and this concentration was repeated twice. Finally an amount of about 10 10 -10 12 TU / ml was obtained.
  • mice Male C57BL / 6 mice (20-25 g) were anesthetized by intraperitoneal injection of a 3.5: 1 mixture of ketamine (50 mg / ml) and xylazine hydrochloride (23.3 mg / ml) in an amount of 1.0 ⁇ l per g body weight. , Position on the stereotactic device as described in previous studies (Kim and Han, 2006).
  • a 3 ⁇ l volume of lenti shRNA was injected into the right lateral ventricle into each dental gyrus at a rate of 0.5 ⁇ l / min using a 28 G needle (vertical coordinates in mm relative to the bregma: front-back ( anterior-posterior, -2.4; midlateral, 2.0; dorsal-ventral, -2.1) (Franklin and Paxinos, 1997).
  • the needle was removed in 3 steps for 3 minutes to minimize backflow, and the mouse was kept on a warm pad to prevent breaking. Mice waking up from anesthesia were placed in home cages until used for analysis. Depression-like behavioral tests were performed 14 days after injection.
  • brain was fixed by perfusion 4% paraformaldehyde and fixed in the same solution overnight at 4 ° C.
  • brain sections were prepared by cutting brains at 40 ⁇ m intervals using vibratome. Alexa Fluor 488-conjugated antibody or rabbit IgG against mouse IgG after reaction with anti-p47phox antibody (Santa Cruz, USA), anti-HNE (HNE11-S) antibody (Alpha Diagnostic Intl.
  • SH-SY5Y neuroblastoma cell line is as described in previous studies (Seo et al., 2010b-c; 2011a).
  • SH-SY5Y cells were wet incubator (95%) at 37 ° C. with Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) containing 10% heat-inactivated FBS, penicillin (20 units / ml) and streptomycin (20 mg / ml). Air and 5% carbon dioxide).
  • DMEM Dulbeccos modified Eagles medium
  • CORT, H 2 O 2 , MnTBAP, and Vitamin C were dissolved in PBS at a concentration of 100 ⁇ M.
  • Aposinine and RU486 were dissolved in DMSO at a concentration of 100 ⁇ M and then diluted with PBS.
  • Glucocorticoids and H 2 O 2 were used for cells cultured in serum free DMEM.
  • siRNA-p47phox was synthesized from Bioneer (Korea). SiRNA-p47phox sequence of the sense strand: 5'-CUA UUU CCC AUC CAU GUA U-3 '(SEQ ID NO: 43); And antisense strand: 5'-AUA CAU GGA UGG GAA AUA G-3 '(SEQ ID NO: 44). At the 3 ′ end of each siRNA strand, four deoxyribose nucleotide overhangs (dTdT) were added.
  • Oligonucleotides siGLO Green [D-001630-0105] and [D-001210-0205] labeled with the non-target control siRNA, 6-carboxyfluorescein fluorophore, were purchased from Dharmacon Inc (USA). Cells were transfected using Lipofectamine reagent (Invitrogen) at the concentration of 100 nM siRNA diluted with DMEM using the manufacturer's instructions. p47phox knockdown was confirmed by immunocytochemistry using anti-p47phox antibody.
  • CM-H2DCFDA 5- (and-6) -chloromethyl-2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate
  • CM-H2DCFDA 5- (and-6) -chloromethyl-2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate
  • SH-SY5Y cells were washed with HEPES buffer (120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl 2 , 1.8 mM CaCl 2 , 20 mM HEPES, 10 mM NaOH, 15 mM glucose) and used for fluorescence level analysis. Fluorescence levels were determined using a spectrofluorometer (SpectraMaxM5, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA. USA), excitation at 488 nm and emission at 510 nm for DCF, excitation at 540 nm and 590 nm for DHE. Luminescence was measured at. Three measurements were taken and averaged, and used as one data.
  • HEPES buffer 120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl 2 , 1.8 mM CaCl 2 , 20 mM HEPES, 10 mM NaOH, 15 mM glucose
  • Fluorescence levels
  • the cells were fixed for 10 minutes with 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer (ph 7.4) at room temperature, then treated with 0.2% Triton X-100 in 0.1 M PBS for 10 minutes to make permeabilities, followed by 1% with 5% goat serum. Block for time. After block, cells were incubated overnight at room temperature in 3% BSA solution containing anti-p47phox antibody (1: 1000). Cells were washed with 0.1 M PBS and then incubated with fluorescein-conjugated secondary antibody (TRITC, 1: 100, Sigma) for 1 hour, followed by washing and 30 in fluorescein mounting solution (DAKO, Denmark). Mounted for minutes. The stained images were then photographed / analyzed using a DP71 camera and an Olympus BX 51 microscope (Olympus Co.) equipped with DP-manager and DP-Controller software.
  • TRITC fluorescein-conjugated secondary antibody
  • Imipramine was administered for 15 days from the day after the last detention stress, and the time spent in the interaction zone was increased, while the time spent in the corner zone was decreased (Fig. 1a, C). These results indicate that the symptoms induced by detention are improved by the drug, and the symptoms induced are depression.
  • MBT was performed with other behavioral tests related to anxiety. MBT was performed 18 days after 2h-14d stress, and the stressed mice had a significantly lower number of hidden dictations compared to the control group, indicating that the mice are unstable. In this case too, when imipramine was administered, the MBT result was restored to the control level (FIG. 1C, H). In the case of the open field test, the stressed mice had less movement distance than the control group in the central part of the open field, indicating anxiety symptoms, and this behavior was partially recovered by the administration of imipramine. (FIG. 1C, I). There was no difference in the total distance traveled in the open field (FIGS. 1C, J and K). Taken together, the results indicate that detention stress caused persistent depression and anxiety behavior. In FIG.
  • hippocampus increased malondialdehyde (MDA) and protein carbonylation as a result of lipid peroxidation. Since then, ROS significantly increased.
  • Example 3 Induction of glucocorticoid concentration and treatment time-dependent increase in ROS concentration in SH-SY5Y cells
  • SH-SY5Y human neuroblastoma cells were treated with glucocorticoids (CORT) and the production of ROS was investigated.
  • Experimental designs with varying doses and times of glucocorticoids to administer are described in FIGS. 3A and A.
  • the SH-SY5Y cells were treated with low concentrations (400 ng / ml or 1.15 ⁇ M) or high concentrations (800 nm / ml) of glucocorticoids for 2 hours, then removed and treated again after 22 hours of culture for 1 to 3 days. Repeated experiments were performed.
  • PRX1 peroxiredoxin
  • SOD1 cytoplasmic Cu / Zn superoxide dismutase
  • CAT catalase
  • HO-1 heme oxygenase- Heme oxygenase-1
  • COX2 cyclooxygenase-2
  • iNOS inducible nitric oxide synthase
  • NF- ⁇ B nuclear factor-kappa
  • NADPH oxidases include subunits p47phox, p67phox, p40phox, gp91phox (NOX2), and p22phox having “phox” regions. NOX2 and p22phox are located in the cell membrane, and p47phox is present in the cytoplasm and, when phosphorylated, moves to the membrane with p67phox and p40phox to form an active NOX2 complex.
  • the activated complex undergoes exchange of Rac's GDP and GTP, in the process of transferring electrons from NADPH to oxygen and generating H + and peroxides as by-products, where the reaction scheme is: NADPH + 2O 2 ⁇ NADP + + 2O 2 °- + H +. (FIG. 4C).
  • RT-PCR increased the expression of p47phox and p67phox in the expression of HP and PFCX in the mice under stress of detention of the five subunits constituting the NADPH oxidase (FIG. 4D).
  • Mouse blood cells were obtained from the blood of the mice subjected to repeated detention stress (2h-14d) and the mice not subjected to detention stress, and the expression levels of p47phox, p67phox, PRX3 and TRX2 in the blood were confirmed by real-time PCR.
  • repetitive stress not only increases the expression of p47phox and p67phox in the mitochondria of the brain, but also increases the expression of p47phox and p67phox in blood cells in the blood, from which blood is collected to measure the expression of p47phox or p67phox.
  • Repetitive stress can be used to diagnose stress disorders such as depression.
  • repetitive stress not only reduces the expression of PRX3 and TRX2 in the mitochondria of the brain, but also reduces the expression of PRX3 and TRX2 in blood cells in blood, from which blood is collected to obtain PRX3 or TRX2.
  • stress disorders such as depression, can be diagnosed by repeated stress.
  • glucocorticoids were treated with cyclohexamide (CHX), a protein synthesis inhibitor, and stained with DCF and DHE, which are sensitive to ROS, to completely block the production of ROS and peroxides (FIGS. 7, B and C). ).
  • CHX cyclohexamide
  • DHE DCF and DHE
  • Glucocorticoid-induced ROS production (FIG. 8, B) and peroxide production (FIG. 8, C) in transfected cells with p47phox-siRNA (50 or 100 ⁇ M) decreased depending on the amount of siRNA treated
  • This phenomenon indicates that upregulation of p47phox is a major factor in ROS and peroxide production by glucocorticoids.
  • One-way ANOVA, Newman-Keuls multiple comparison test was used.
  • Example 7 Behavioral Control in Response to Chronic Detention Stress by p47phox
  • aposinin resolves the symptoms of depression and anxiety caused by chronic stress, its neuroanatomical target sites are not known exactly. Therefore, the expression of p47phox in specific brain regions was specifically blocked using shRNA using a lentiviral vector system.
  • a nonviral vector control group a Lenti shRNA-GFP control group, and a Lenti-p47phox-shRNA experimental group were used. Lenti-GFP control or Lenti-p47phox-shRNA were infused into the dentate gyrus independently of each other.
  • FIG. A shows the expression of GFP in HeLa and A549 cells at 8 hours after infection with Lenti-p47phox-shRNA expressing GFP
  • B is a graphical representation of the stress and duration of the test in the experimental design.
  • Lenti-p47phox-shRNA (GFP expression) or Lenti-GFP into the dentate gyrus (DG) of the hippocampus on either side of the section is shown to be infiltrated. After 15 days of infestation mice were subjected to 2h-14d detention stress and behavior was observed 15 days later.
  • mice p47phox +/ ⁇ mice.
  • Genotypes of mice that normally had two copies (+ / +) of the p47phox gene and a mouse that had only one copy of the p47phox gene were analyzed by MspI restriction enzyme digestion after amplifying the p47phox gene by PCR.
  • TST and FST behavior evaluation was performed.
  • Experimental results are shown in Figure 11, C (TST) and D (FST).
  • Non-GMO mice exhibited depression-like behavior in TST and FST, but this phenomenon was not observed in p47phox +/- mice.
  • the present invention provides a major depression, anxiety, fear memory, mental panic, obsessive compulsive disorder, post-traumatic stress disorder, schizophrenia or degenerative disorder among mental illnesses whose symptoms may be triggered or worsened by chronic stress targeting NADPH oxidase.
  • drugs that can prevent the disease before the onset of a brain disease (Alzheimer's dementia, Parkinson's disease, stroke, ALS, etc.) or mental illness that can be triggered or worsened by chronic stress Can be.

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Abstract

본 발명은 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법, 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료, 스트레스 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물, 스트레스 장애의 예방 또는 치료방법, 스트레스 민감반응 완화제의 스크리닝 방법, 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법, 및 스트레스 수준 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명에서는 p47phox 또는 p67phox의 발현을 억제시키는 기전을 이용한 약물들을 개발할 수 있으며, 본 발명의 방법으로 스크리닝된 약물들은 스트레스, 특히 만성 스트레스에 의해 그 증상이 촉발되거나 악화될수 있는 우울증, 퇴행성 뇌질환 등을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

ｐ47ｐｈｏｘ 또는 ｐ67ｐｈｏｘ를 표적으로 하는 스트레스 장애 치료제 및 이의 스크리닝 방법
본 발명은 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법, 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료, 스트레스 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물, 스트레스 장애의 예방 또는 치료방법, 스트레스 민감반응 완화제의 스크리닝 방법, 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법, 및 스트레스 수준 진단 키트에 관한 것이다.
현대 산업 사회는 구조적으로나 기능적으로 빠르고 복잡하게 변화하고 있다. 뿐만 아니라 개인이 소화하기 어려울 정도의 엄청난 양의 정보가 매일 쏟아지고 있다. 새로운 기술, 새로운 환경에 계속 적응해 나가야 하는 현대인들의 대부분은 많은 신체적·심리적 부담감을 느끼게 된다. 이런 부담감을 일명 스트레스(stress)라 한다.
인간이 내외적 환경의 자극에 의해 신체적·심리적인 스트레스를 받게 되면 인체는 스트레스에 적응하기 위해 뇌에서 청반 노르에피네프린(LC-NE: locus ceruleus norepinephrine)과 부신피질 자극 호르몬 유리 호르몬(CRH: corticotropin releasing hormone)을 분비한다. LC-NE는 교감 신경계를 활성화시키고 부교감 신경계의 작용을 억제하여 혈압, 심박동, 호흡을 증가시키며, 기관지를 확장시킬 뿐 아니라 피부에 소름이 끼치면서 털이 일어나는 발한 작용을 증가시킨다. 시상하부에서 분비된 CRH는 뇌하수체 전엽으로부터 부신피질 자극 호르몬 (Adrenocorticotropic hormone: ACTH)을 일반 체순환으로 방출한다. 이 ACTH가 혈액을 따라 옮겨가서 부신피질의 ACTH 수용체에 결합하게 되면, cAMP라고 불리는 2차 신호전달자를 합성하게 된다. cAMP에 의해 활성화된 단백질 인산화 효소 PKA(protein kinase A)는 미토콘드리아에 위치한 글루코코르티코이드(Glucocorticoid) 합성 단백질을 활성화시킨다. 그러면 글루코코르티코이드 합성 단백질이 콜레스테롤을 이용하여 스트레스 호르몬들을 만들어 낸다. 코르티졸(cortisol), 코르티코스테론(corticosterone), 코르티손(cortisone) 등이 대표적인 글루코코르티코이드의 예이다. CRH-ACTH-글루코코르티코이드까지 연결되는 스트레스 경로를 일반적으로 시상하부-뇌하수체-부신(Hypothalamus-Pituitary gland-Adrenal gland: HPA) 축이라고 한다. 글루코코르티코이드는 간에서 포도당 신합성(gluconeogenesis)과 글리코겐의 저장, 혈당치 상승 등의 탄수화물 대사조절을 한다. 그밖에 글루코코르티코이드는 면역을 담당하는 면역세포의 각종 면역물질 생성 유전자의 발현을 억제함으로써 항염증 작용을 한다. 또한 혈액 내 이 호르몬 함량이 높아지면 음성 피드백(negative feedback)으로 뇌하수체에 작용하여 ACTH 분비를 억제한다.
신체가 허용할 수 있는 수준의 스트레스는 우리 몸의 적절한 자극제로 작용을 하게 되지만, 허용 범위를 벗어난 강하고도 지속적으로 가해지는 심리적 육체적 스트레스는 글루코코르티코이드를 장시간 동안 과량 분비하게 유도한다. 이렇게 장기간 과량 분비되는 글루코코르티코이드는 몸의 면역력을 떨어뜨리게 되므로, 외부 감염에 의한 저항성을 떨어뜨리게 되고, 우리 몸에 다양한 질병을 유발하게 된다. 면역력 감퇴뿐만 아니라 특별히 뇌세포 손상 및 재생을 억제하여 불면증, 무기력증, 기억력 감퇴, 우울증 유발은 물론 자살 충동까지 일으킨다.
한편, 우울증은 조울증과 함께 기분장애의 한 종류로 분류되며, 침체된 기분, 무쾌감증, 수면장애, 비사교성, 피로 및 집중력 저하(DSM-IV-TR)를 포함한 심리적이고 육체적인 증상을 갖는 정신질환의 가장 일반적인 형태 중 하나이다. 우울증은 평생 유병율이 15%, 특히 여자에서는 25% 정도에 이르며, 감정, 생각, 신체 상태, 그리고 행동 등에 변화를 일으키는 심각한 질환이다. 세계보건기구(WHO)는 2020년에 이르면 우울증이 모든 연령에서 나타나는 질환 중 1위를 차지할 것으로 내다보고 있다. 또한, 우울증은 자살로 이어지는 경우가 적지 않아, 만약 우울증이 2020년 '미래 질병 1위'로 급상한다면 암과 같은 육체적 질병으로 인한 사망률보다 우울증에 의한 사망률이 더 높아질 수 있을 것이라고 하였으나, 우울증의 정확한 병태생리는 밝혀지지 않았다.
우울증의 주된 원인으로는 호르몬의 불균형을 주목하고 있는데 그중에서도 세로토닌을 주된 원인으로 보고 있다. 세로토닌은 뇌척수액에서 발견되는 신경대사물질로, 부족하면 근심, 걱정이 많아지고 충동적인 성향이 나타난다. 따라서 우울증 치료제는 세로토닌의 작용과 관련이 많다.
현재 임상에서 사용하는 항우울제는 대부분 신경 시냅스 부위에서 모노 아민계 신경전달물질의 약리작용을 증가시키는 특성을 갖는 약물(SSRI, SNRI, SDRI, TCAs, MAOIs 계열 등)들이다. 이들 약물의 경우 환자에 따라 항우울 효과가 분명하게 나타나기도 하지만 역설적이게도 신경과학적 관점에서 이들의 약효는 대체로 2-3 주 이상 장기 투여시 나타나는 점을 고려하면 그 약리작용 기전이 불분명하다. 상기 약물들의 경우, 항염증제와 함께 투여할 경우, 항염증제제와 반응하여 항우울제 효과가 감소될 수 있다는 보고가 있다. 또한, 상기 약물들은 구토, 성욕 감소, 불면, 피로, 비만, 자살 충동 등의 부작용이 발생할 수 있으며, 우울증 환자의 30%의 경우에는 현재 사용 중인 약물이 전혀 효과가 없는 한계를 가지고 있다.
모노 아민계 신경전달물질의 약리 작용을 증가시켜 우울증을 치료하는 기존의 치료제에서는 상기 살펴본 바와 같이 부작용이 다수 발생하고 있으며, 그 치료 효과에도 한계가 발생하는 바, 이와는 다른 새로운 기전의 우울증 치료 및 이에 기반을 둔 약물을 포함하는 치료 시스템의 개발이 절실히 요구된다.
본 발명자들은 만성 스트레스를 받은 동물 모델 또는 스트레스 호르몬을 투여한 경우, 신경세포 또는 혈액에서 p47phox 또는 p67phox 유전자의 발현이 스트레스를 받지 않은 대조군에 비해 지속적으로 증가되어 나타남을 확인하여, 이를 바탕으로 p47phox 또는 p67phox를 타겟으로 하는 스트레스 민감 반응 완화제를 스크리닝 할 수 있고, 또한 p47phox 또는 p67phox의 발현, 기능, 또는 활성을 억제하는 물질을 사용하여 스트레스 장애 예방 또는 치료할 수 있다는 점을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
한편, 본 발명자들의 출원인 대한민국 특허출원 제10-2011-0067571호의 내용은 모두 본 발명의 일부분으로서 통합된다.
본 발명의 목적은 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 스트레스 개선용 식품 또는 사료, 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트레스 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물, 이의 제조방법, 및 스트레스 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트레스 민감반응 완화제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트레스 수준 진단 키트를 제공하는 것이다.
본 발명에서는 p47phox 또는 p67phox의 발현을 억제시키는 기전을 이용한 약물들을 개발할 수 있으며, 본 발명의 방법으로 스크리닝된 약물들은 스트레스, 특히 만성 스트레스에 의해 그 증상이 촉발되거나 악화될수 있는 우울증, 퇴행성 뇌질환 등을 예방 또는 치료할 수 있다. 아울러, 스트레스가 축적되면 비가역적인 메카니즘이 진행되나, p47phox 또는 p67phox의 발현을 잘 조절하면 스트레스 발생기전을 가역적으로 조절할 수 있다.
도 1은 만성적 스트레스로 인한 우울증 및 불안증 유사 행동을 보이는 마우스 모델 확립을 만성적 행동 검사로 실험한 결과이다. 도 1a의 (A)는 실험 디자인으로 7주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 반복적인 신체구금 스트레스(RST) (14일 동안 매일 2시간, 2h-14d)를 처치하는 동안 이미프라민 (30mg/kg/day) 투여한 후 일련의 행동 시험(SIT, NSF, OF, MBT, TST, FST 순서로 검사)을 수행하는 실험 과정을 설명한다. (B)는 세 그룹, 즉 대조군(CON), 2h-14d 스트레스를 처치한 마우스(RST), 이미프라민 투여한 RST 마우스 (RST+Imi)에 대한 SIT 검사 방법 및 비디오추적 결과의 예를 보여준다. (C)는 (B)의 결과를 그래프로 나타낸 것으로 스트레스를 받은 마우스는 상호작용 영역보다 회피 영역인 코너영역에서 더 많은 시간을 보내는 것을 나타낸다. 도 1b의 (D)는 TST 및 FST 결과를 보여주는 것으로 대조군과 비교하여 2h-14d 스트레스가 가해진 마우스 (RST)의 부동성이 증가하였으나 이미프라민 처리에 의해 이러한 부동성이 감소했음을 나타낸다. 도 1c의 (F)는 NSF 실험 결과로 먹이를 먹기까지 걸리는 시간이 RST 마우스에서 증가하였으나, 이미프라민 처리에 의해 감소하였음을 나타낸다. (G)는 5분간 섭취한 사료의 양이 이미프라민 처리에 의해 증가하였음을 나타낸다. (H)는 MBT (구슬 감추기 실험) 결과로 RST 마우스가 감춘 구슬의 수가 적으나 이미프라민 처리에 의해 감춘 구슬의 수가 증가하였음을 보여준다. (I)는 OFT 결과로 중앙 영역에서의 운동 활성이 RST 마우스에서 현저하게 감소하였으며, 이미프라민 처리에 의해 부분적으로 회복되었음을 보여준다. (J)는 개방공간에서의 총 누적 이동거리를 나타내고 (K)는 시간 경과에 따른 이동거리를 보여준다.
도 2는 스트레스를 가한 시간 및 반복횟수에 의존적으로 뇌의 해마에서 지질과산화 및 단백질 카르보닐화가 증가하였음을 보여주는 결과이다. 도 2a의 (A) 및 (B)는 스트레스를 가한 시간에 따른 실험 디자인이고, 도 2b의 (C)는 대조군 (CON) 및 스트레스를 일정시간 받은 마우스 (2h, 4h, 6h)의 해마에서 각 말론디알데하이드(MDA) 농도 및 단백질 카르보닐화 정도를 보여주고, (D)는 2h 스트레스를 일정 기간 반복해서 가한 횟수에 대한 실험 디자인을 나타내고, (E) 및 (F)는 해마에서 각 말론디알데하이드(MDA) 농도 및 단백질 카르보닐화 정도를 보여준다.
도 3은 SH-SY5Y 세포에서 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드의 투여량 및 투여기간에 의존적으로 ROS 스트레스가 증가하는 것을 보여주는 결과이다. 도 3a의 (A)는 SH-SY5Y 세포를 글루코코르티코이드 (CORT: 400 또는 800 ng/ml)으로 2시간 동안 처리한 후, 제거하고 22시간 배양 후에 다시 처리하는 과정을 1(24h) 내지 3일(72h)간 반복하는 실험디자인을 나타내고, (B)는 SH-SY5Y 세포에서 MDA 농도 (24h 대조군에 대한 %로 나타냄)를 나타내고, 도 3b의 (C) 및 도 3c의 (D)는 각각 실험 디자인과 같이 처리된 SH-SY5Y 세포의 ROS를 검출하기 위해 DCF (10μM) 및 DHE(10μM)로 염색한 결과이고, 각 사진 아래의 그래프는 형광의 양을 나타낸 것이다. CON: 대조군 세포; CORT: 글루코코르티코이드 처리세포 (800ng/ml, 48시간); 아래 패널: 고해상도, scale bar: 20μm.
도 4는 반복적인 스트레스로 인해 마우스의 뇌에서 ROS 농도를 조절하는 유전자의 발현 양상이 변화되었음을 보여주는 결과이다. 도 4a 및 4b는 스트레스가 가해진 마우스 (2h-14d) 및 대조군의 전전두엽 피질 (PFCX;A) 및 해마 (HP;B)에서 ROS 농도를 조절하는 유전자의 발현을 실시간 RNA 정량 분석으로 관찰한 결과이고, 도 4c는 NADPH 옥시다제의 구성을 도식적으로 나타낸 것이고, 도 4d는 반복적 신체적 스트레스로 인해 NADPH 옥시다제 서브유니트의 발현이 상향 조절되었음을 보여주는 결과로 대조군(C) 및 스트레스를 가한 마우스 (2h-14d)(R)의 PFCX 및 HP 부위에서 NOX2 서브유니트 (p91phox, p22phox, p47phox, p67phox, and p40phox) 및 베타엑틴에 대한 RT-PCR 결과이다.
도 5a는 반복적인 구금 스트레스를 받은 마우스의 혈액에서 p47phox 및 p67phox의 발현이 상향 조절될 수 있음을 나타낸 것이며, 도 5b는 반복적인 구금 스트레스를 받은 마우스의 혈액에서 PRX3 및 TRX2의 발현이 하향 조절될 수 있음을 나타낸 것이다. 데이터는 평균±표준오차 (n=4-6)로 표현했다. **은 표시된 그룹 사이에 p<0.01에서 유의한 차이를 의미한다(Student t-검정).
도 6은 SH-SY5Y 세포에서 CORT에 의해 유도된 ROS 생성이 NADPH 옥시다제 억제제 처리에 의해 차단되었음을 보여주는 결과이다. 6a는 글루코코르티코이드(400ng/ml)로 48시간 동안 처리된 SH-SY5Y 세포에서의 ROS 농도 증가가 아포사이닌 (Apo, 500μM), RU486 (RU, 20μM), SOD 모방체 MnTBAP (Mn, 100μM), 또는 비타민 C (Vit C, 200 μM)에 의해 차단된 것을 DCF (10μM) 염색으로 관찰한 결과로, 대조군에 대한 %로 나타내었다. 도 6b는 아포사이닌이 NADPH 옥시다제 서브유니트 p47phox가 글루코코르티코이드에 의해 활성화되어 세포막으로 이동하는 것을 차단하는 것을 보여주는 결과로, 미처리 대조군, 글루코코르티코이드 (400ng/ml)로 48시간 동안 처리된 SH-SY5Y 세포, 처리 후 아포사이닌 처리 세포를 항-p47phox 항체 및 DAPI 염색으로 관찰하였다.
도 7은 SH-SY5Y 세포에서 글루코코르티코이드 처리로 인해 p47phox의 발현이 상향되었음을 보여주는 결과이다. (A)는 글루코코르티코이드 (400ng/ml) 또는 H2O2 (200μM)로 24시간 처리된 SH-SY5Y 세포에서 p47phox 발현을 실시간 정량 RNA 분석으로 관찰한 결과로 각 시료는 대조군에 대한 배수로 나타냈다. (B) 및 (C)는 글루코코르티코이드 (400ng/ml)로 유도된 ROS 생성이 단백질 합성 억제제인 사이클로헥사마이드 (CHX; 1 또는 10μM) 처리(48시간)에 의해 완전히 차단되었음을 보여주는, DCF (B) 및 DHE (C) 염색으로 관찰한 결과이다. 각 수치는 24h 대조군에 대한 %로 나타내었다.
도 8은 SH-SY5Y 세포에서 p47phox 유전자의 발현을 siRNA를 사용하여 감소시킨 경우 글루코코르티코이드에 의해 유도되는 ROS 생성이 차단되었음을 보여주는 결과이다. (A)는 대조군으로 siGLO를 세포내에 전달이입하여 대부분의 SH-SY5Y 세포가 그린 형광을 나타내는 것으로 보여주고, (B) 및 (C)는 SH-SY5Y 세포를 siRNA(50 또는 100μM)로 전달이입 한 후 72시간째에 글루코코르티코이드(400ng/ml)로 처리한 후, ROS의 생성을 DCF(B) 및 DHE (C) 염색으로 관찰한 결과이다.
도 9는 마우스에 NADPH 옥시다제 억제제인 아포사이닌을 투여한 경우, 뇌에서 스트레스로 인한 ROS 생성이 억제되었음을 보여주는 결과이다. (A)는 실험디자인을 나타내며, 구금 스트레스 (2h, 3 내지 14일)를 가하기 1시간 전에 이미프라민 (Imi; 20 mg/kg), 아포사이닌 (Apo; 15 mg/kg), 또는 비타민 C (Vit C; 15 mg/kg)를 복강에 투여하였다. (B)는 상기 각 약물 투여에 의한 MDA 농도를 보여주는 결과이고, (C) 및 (D)는 각 약물 투여에 의한 행동검사 TST (C) 및 FST (D) 결과이다.
도 10은 뇌에서 p47phox 발현을 낙다운(knockdown) 한 경우, 만성적 스트레스로 인한 우울증 행동을 차단하였음을 보여주는 결과이다. (A)는 GFP를 발현하는 Lenti-p47phox-shRNA로 감염시킨 후 8시간에 HeLa 및 A549 세포에서 GFP의 발현을 보여주는 결과이다 (B)는 실험디자인으로 뇌의 양측 해마의 치아이랑(DG)으로 Lenti-p47phox-shRNA (GFP도 발현) 또는 Lenti-GFP를 미세주입하고, 스트레스를 가한 기간 및 검사 시기를 보여준다. (C) 및 (D)는 스트레스가 가해진 마우스 (RST)와 대조군 (CON) 마우스에서 상기 각 바이러스로 감염된 경우 TST (C) 및 FST (D) 검사 결과를 보여준다.
도 11은 p47phox (p47phox+/-) 한 카피만을 갖는 마우스는 만성 스트레스 (2h-14d 스트레스)로 인한 우울증 유사 행동을 나타내지 않음을 보여주는 결과이다. (A)는 p47phox 유전자를 정상적으로 두 카피 (+/+)(젤 사진 레인 2-3) 갖는 마우스 및 한 카피(젤 사진 4-5 레인)만을 갖는 유전자 적중 마우스의 유전자형을, p47phox 유전자를 PCR로 증폭한 후 MspI 제한효소 절단으로 분석한 결과이다. M: 마커;100bp ladder, 레인 3 및 4는 p47phox 유전자 결손으로 추가의 밴드가 생성되었음을 보여준다. (B)는 실험디자인으로 p47phox 이형접합체(heterozygote) 마우스 (+/-) 및 야생형 (+/+) 마우스에 2h-14d 스트레스를 가하였다. (C) 및 (D)는 마지막 스트레스 처치 다음 날 수행한 TST (C) 및 FST (D) 결과이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 스트레스 민감 반응 완화제를 대량생산하는 단계; 및 (2) 상기 생산된 스트레스 민감 반응 완화제 중 일부를 추출하여, p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법을 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 시험물질이 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부를 확인하는 단계; 및 (2) 상기 단계에서 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 것으로 확인된 시험물질을 대량생산하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 p47phox는 NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate) 옥시다제의 일 서브유닛(subunit)으로, NCBI Accession No.가 마우스는 NM_010876.2, 인간은 NM_000265.4 인 것이 바람직하다.
본 발명의 p67phox는 NADPH 옥시다제의 일 서브유닛(subunit)으로, NCBI Accession No.가 마우스는 NM_010877.4, 인간은 NM_001127651.2 인 것이 바람직하다.
상기 NADPH 옥시다제는 생물막을 통해 전자를 전달하는 단백질 복합체로 NADPH로부터 전자를 산소분자로 전달하여 과산화물(superoxide, Reactive Oxygen Species, ROS)을 생성한다. NADPH 옥시다제 복합체는 Rho 구아노신 트리포스파타제(GTPase)(Rac1 또는 Rac2 (Rho-related C3 botulinum toxin substrate)와 5개의 "phox"(phagocytic oxidase) 영역을 포함하는 gp91-phox (Nox2), p22phox, p40phox, p47phox 및 p67phox로 구성되는 6개의 서브유니트로 이루어져 있다. 활성화를 위해서는 세포질에 존재하는 p40phox, p47phox 및 p67phox의 막으로의 이동이 필요하며, 이때 p47phox의 인산화가 필수적이며 막으로 이동 후 p67phox가 NOX2와 결합한다(도 4c 참조).
본 발명에서 용어, "스트레스 민감 반응"은 스트레스에 의해 발생할 수 있는 반응을 의미하며, 예를 들어서, 스트레스에 의해 청반 노르에피네프린(LC-NE: locus ceruleus norepinephrine) 또는 부신피질 자극 호르몬 유리 호르몬(CRH: corticotropin releasing hormone)이 분비되어 직접 또는 간접적으로 발생되는 반응 또는 스트레스에 의해 분비된 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 호르몬에 의해 직접 또는 간접적으로 발생되는 반응을 의미한다. 또한, 스트레스로 인해서 최종적으로 발생할 수 있는 질환인, 우울증, 불안증, 공포기억, 정신적 공황, 강박장애, 외상후 스트레스 장애, 정신분열증, 스트레스로 인한 두통, 신경변성 질병, 피로 증후군, 식사장애, 신경성 식욕부진, 위염, 위궤양, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 뇌졸중 또는 ALS이 발생되기 전에 나타나는, 상기 질환에 도달하기 전에 나타나는 스트레스 관련 반응을 모두 포함한다.
상기 "스트레스 민감 반응 완화제"는 상기 설명한 "스트레스 민감 반응"을 감소시키고 완화시킬 수 있는 물질을 의미하며, 항스트레스제로 통칭될 수도 있다.
본원에서 사용된 용어 "만성(적) 스트레스"란 중장기적인 기간동안 스트레스가 반복적으로 주어질 경우 그 영향으로 지속적인 신경적 및 정신적 뇌손상을 유발하는 신체 생리 반응 및 그 결과를 지칭하는 것이다.
본 발명에서는, 반복적으로 주어지는 만성 스트레스가 우울증 및 불안증을 유발하고, 뇌신경 내에 다량의 산화성 스트레스가 축적되고 심한 미토콘드리아의 기능저하를 유발하는 원인이 스트레스에 의한 p47phox 또는 p67phox의 활성화라는 분자기전을 처음으로 규명하였다. 또한, p47phox 또는 p67phox를 제어함으로써 뇌신경계 내에 ROS의 과대 생성 및 우울증 유발을 억제할 수 있다는 것을 규명하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 마우스에 지속적인 스트레스를 가했을 때 뇌의 지질과산화 및 산화성 스트레스가 시간에 따라 축적되는 것을 확인하였고(실시예 3), 만성적 스트레스에 따라 p47phox 또는 p67phox의 발현이 증가되고(실시예 4, 5), p47phox 또는 p67phox의 발현/기능/활성을 억제하는 물질을 스트레스를 가하기 전에 미리 처리하거나 스트레스를 가한 후에 처리한 경우 만성적 스트레스에 의한 우울증적 행동이 사라진 것을 확인하였다(실시예 6, 7). 이를 바탕으로 본 발명은 스트레스에 의해 발생하는 반응, 또는 스트레스가 점차 축적됨으로써 유도되는 스트레스 장애가 발생하기 전 단계에서, p47phox 또는 p67phox의 발현, 기능, 또는 활성을 억제시킴으로써 스트레스 민감 반응을 완화시키고, 스트레스 장애의 발생을 미리 예방할 수 있을 뿐만 아니라, p47phox 또는 p67phox의 발현, 기능, 또는 활성을 억제시키는지 여부를 확인하는 단계를 포함하여 스트레스 민감 반응 완화제를 제조할 수 있다.
본 발명은 스트레스 민감 반응 완화제를 대량생산한 후, 대량생산된 스트레스 민감 반응 완화제 중 일부를 추출하여, p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부를 확인하는, 즉, 상기 완화제가 스트레스 민감 반응을 완화시킬 수 있는 기능을 가지고 있는지를 확인하는 단계를 수행함으로써, 스트레스 민감 반응 완화제를 제조할 수 있다. 또는, 본 발명은 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 억제하는 것으로 확인된 시험물질을 선별하고, 이를 대량생산함으로써, 스트레스 민감 반응 완화제를 제조할 수 있다.
본 발명에서 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 억제한다는 것에는 p47phox 또는 p67phox의 발현/활성/기능 증진 억제제 또는 증진된 p47phox 또는 p67phox의 발현/활성/기능을 억제시키는 물질도 포함한다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 만성 스트레스를 받은 동물의 혈액 내에서 p47phox 또는 p67phox의 발현이 상향조절됨을 확인하였는 바, 이를 기초로 상기 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부를 확인하는 단계 또는 시험물질의 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부는 동물의 혈액 내의 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 측정하여 수행될 수 있다.
본 발명에서, "시험물질"은 p47phox 및/또는 p67phox 또는 그 조합의 발현 및/또는 활성을 특이적으로 억제하는 물질로, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 10 base 이상의 단일 또는 이중 가닥의 핵산, 예컨대, 10개, 11개, 12개, 14개, 15개 이상의 핵산 분자, 예를 들면 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 포함한다. 또한 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 8개, 10개, 12개, 20개 이하, 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명에서 발현이란 유전자의 전사 및 전사체의 단백질로의 발현을 의미하며, 활성이란 발현된 단백질이 기능할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다.
본 발명에서 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부는 이에 제한되지는 않으나, p47phox 또는 p67phox의 발현량을 측정하여 판단할 수 있다. p47phox 또는 p67phox mRNA의 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, p47phox 또는 p67phox 단백질의 발현량 측정은 웨스턴 블롯, 조직면역염색법, 조직형광염색법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 스트레스 개선용 식품 또는 사료가 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스트레스 개선용 식품 또는 사료의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 만성적 스트레스를 가한 마우스에서 ROS 생성이 증가되고, 우울증적 행동이 나타나는 것을 확인하였고, 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드를 처리한 인간 뉴로블라스토마 세포주에서 ROS 생성이 증가되었으며, 상기 마우스 및 세포주에서 p47phox 또는 p67phox의 발현이 증가됨을 확인하였다(실시예 4). 또한, p47phox 에 대한 siRNA을 주입한 결과, 글루코코르티코이드에 의해 유도된 ROS 생성 및 과산화물의 생성이 처리한 siRNA의 양에 의존적으로 감소하였으며(실시예 6), p47phox 또는 p67phox의 발현을 억제한다고 알려진 아포시아닌, 항우울제인 이미프라민을 만성 스트레스를 가하기 전 및 스트레스를 가하면서 투여한 결과, 우울증적 행동 및 지질과산화가 스트레스를 가하지 않은 군과 유사하게 감소됨을 확인하였다(실시예 7).
상기 실험 내용을 바탕으로, 본 발명은 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 억제시키는 특성을 나타내는 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는, 스트레스 개선용 식품 또는 사료를 제공하는 것이다. 상기 스트레스 개선용 식품 또는 사료는 스트레스에 의해 발생하는 모든 반응, 또는 반복적인 스트레스로 인해 유도되는 스트레스 장애가 발생하기 전에 나타나는 증상을 개선시킬 수 있으며, 스트레스 장애를 예방할 수 있다. 상기 스트레스 민감 반응 완화제는 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 억제시키는 특성을 나타내는 물질이라면 화합물, 천연물, 신규 단백질 등 그 종류가 제한되지 않는다. 특히, p47phox 또는 p67phox가 세포막으로 이동하지 못하여 활성을 갖지 못하게 하는 물질도 포함한다. 상기 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 또는 기능을 억제하는 물질은 바람직하게는, 아포사이닌, 4-하이드록시-3'-메톡시-아세토페논, N-바닐릴노난아미드(N-Vanillylnonanamide), 스타우로스포린 (Staurosporine), 네오프테린, 디페닐렌 아이도늄 또는 그 조합을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성, 기능 중 하나 이상을 억제시키는 물질은 p47phox, p67phox 유전자의 전사 및/또는 전사체의 단백질 합성을 특이적으로 억제할 수 있는 siRNA(small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA) 또는 miRNA (microRNA)일 수 있다. 이들은 RNA 간섭 (interference) 작용을 통해, 예를 들면 짧은 길이의 간섭 RNA (siRNA)가 서열 특이적으로 전사체에 결합하여, RISC(RNA Induced Silencing Complex)를 형성하여, 전사된 RNA가 세포내에 단백질로 발현될 수 없도록 (silencing) 한다. 한 구현예에서, siRNA, shRNA 또는 miRNA는 NADPH 옥시다제의 서브유니트 중 하나인 p47phox 유전자를 표적으로 한다. siRNA, shRNA 또는 miRNA는 그 표적 서열에 상당히 상보적인 서열을 갖는다. 상당히 상보적 서열이란, 표적 유전자의 적어도 연속적인 15 베이스 길이의 서열과 적어도 약 70% 상보성, 적어도 약 80% 상보성, 적어도 약 90% 상보성, 또는 약 100% 상보성을 의미한다. 한 구현예에서 p47phox siRNA 또는 shRNA는 본원의 실시예에서 p47phox 사일런싱(silencing)에 사용된 siRNA, shRNA 인 Lenti-p47phox-shRNA가 포함될 수 있으나 이로 한정되는 것은 아니며, 표적 핵산에 결합하여 사일런싱의 기능을 하는 한 다양한 유래의 p47phox를 표적으로 하는 siRNA, shRNA 및/또는 miRNA가 사용될 수 있으며, 이들의 생물학적 동등체, 유도체 및 유사체도 포함하는 것이다. 한 구현예에서 siRNA, shRNA 및/또는 miRNA은 인간 p47phox 유전자 유래이다. 다른 구현예에서, siRNA, shRNA 및/또는 miRNA는 인간 유래 유전자 NM_000265.4 서열을 기준으로 약 600 내지 1200 base 사이, 약 700 내지 1200 base 사이, 약 800 내지 1200base 사이, 약 900 내지 1200base 사이의 15 내지 35 base 길이이며, 시중의 siRNA, shRNA 또는 miRNA 표적 디자인 소프트웨어를 사용해서 디자인할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질은 p47phox, p67phox 또는 그 조합을 인식할 수 있는 항체이다. 본원에서 사용된 용어, 항체는 완전한 항체, 항체분자의 항원결합 단편 및 이들과 기능적으로 동등한 항체 또는 단편을 포함하는 것이다. 또한 본 발명의 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, IgA 또는 IgY 타입일 수 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 클래스 또는 그 하부클래스일 수 있다. 본 발명의 항체는 모노클로날, 폴리클로날, 키메라, 단쇄, 이특이성, 유인원화 및 인간화된 항체 및 이의 활성 단편을 포함하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 스트레스 민감 반응 완화제는 p47phox, p67phox의 활성 및/또는 작용/기능을 간섭, 방해 및 또는 억제할 수 있는 폴리펩타이드이다. 본원에서 사용된 용어 폴리펩타이드는 아미노산의 중합체를 일컫는 것으로 이러한 작용을 갖는 한 특정 길이를 지칭하는 것은 아니다. 따라서 예를 들면 펩타이드, 올리고펩타이드, 단백질, 효소도 본 범위에 포함된다. 폴리펩타이드는 자연적 또는 인위적으로 변형된 것, 예를 들면 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등으로 변형된 것도 포함한다.
또한, 상기 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 스트레스 민감 반응 완화제는 아포사이닌, 4-하이드록시-3'-메톡시-아세토페논, N-바닐릴노난아미드(N-Vanillylnonanamide), 스타우로스포린 (Staurosporine), 네오프테린, 디페닐렌 아이도늄 또는 그 조합이 바람직하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
상기 식품 또는 사료에 함유되는 스트레스 민감 반응 완화제는 상기 설명한 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법에 의해 제조된 것이 바람직하다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 식품에는 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 과육의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 10 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분 함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며, 상기 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료 또는 섬유질사료가 사용가능하나, 이에 한정하지 않으며, 사료첨가제도 포함하는 개념이다. 또한 상기 사료에는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료를 공급하는 경우는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있으며, 상기 사료는 가금류 및 가축 등이 받은 스트레스를 감소시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 스트레스 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 스트레스 장애 예방 또는 치료용 약학조성물 또는 이의 유효성분이 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것이 특징인 스트레스 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질을 개체에 투여하여 스트레스 장애를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시에에서는 마우스에 지속적인 스트레스를 가했을 때 뇌의 지질과산화가 시간에 따라 축적되는 것을 확인하였고, 만성적 스트레스에 따라 p47phox 또는 p67phox의 발현이 증가되고, 이의 발현을 억제하는 p47phox 에 대한 siRNA을 주입한 결과, 글루코코르티코이드에 의해 유도된 ROS 생성 및 과산화물의 생성이 처리한 siRNA의 양에 의존적으로 감소하였음을 확인하였다(실시예 6). 또한, 스트레스를 받는 마우스에 p47phox 또는 p67phox의 발현을 억제하는 아포시아닌, 항우울제인 이미프라민을 처리한 결과 우울증적 행동이 감소되었으며, p47phox 유전자 적중 돌연변이 (+/-) 마우스에서도 대조군인 야생(+/+)의 경우와 달리 만성스트레스에 의해 우울증 행동이 생성되지 않는 것을 또한 확인하였다(실시예 7). 따라서, p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질은 스트레스 장애가 발생하기 전 단계에서 상기 장애를 예방할 수 있고, 이미 스트레스 장애가 발생한 경우 PRX3 또는 TRX2의 발현을 증진시킴으로써 스트레스 장애를 치료할 수 있다.
상기 조성물의 유효성분으로서, p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 또는 기능을 억제하는 물질이라면 화합물, 천연물, 신규 단백질 등 그 종류가 제한되지 않는다. 상기, p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 또는 기능을 억제하는 물질은 바람직하게는, 아포사이닌, 4-하이드록시-3'-메톡시-아세토페논, N-바닐릴노난아미드(N-Vanillylnonanamide), 스타우로스포린 (Staurosporine), 네오프테린, 디페닐렌 아이도늄 또는 그 조합을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, 예방이란, 조성물의 투여에 의해 스트레스 관련 질환의 증상을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 용어, 치료란, 조성물의 투여에 의해 스트레스 관련 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
상기 스트레스 장애는 정신적 및/또는 신체적 만성 스트레스에 의해 증상이 촉발되거나 악화될 수 있는 질환을 의미하며, 구체적으로는 정신적 및/또는 신체적 만성 스트레스로 인한, 우울증, 불안증, 공포기억, 정신적 공황, 강박장애, 외상후 스트레스 장애, 정신분열증, 스트레스로 인한 두통, 신경변성 질병, 피로 증후군, 식사장애, 신경성 식욕부진, 위염, 위궤양, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 뇌졸중 및 ALS로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환이 포함되나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에는 상기 언급한 47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질의 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위하여 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직할 수 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (1) p47phox 또는 p67phox을 발현하는 세포를 제공하는 제1단계; (2) 시험물질을 상기 세포에 접촉시키는 제2단계; 및 (3) 상기 시험물질과 접촉되지 않은 세포와 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상이 억제된 시험물질을 후보물질로 선별하는 제3단계를 포함하는, 스트레스 민감반응 완화제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서, 상기 제1단계에서 사용되는 세포는, 신경세포의 특성을 갖는 다양한 세포주가 사용될 수 있으며, 예를 들면 SH-SY5Y(인간 뉴로블라스토마 세포주), HT22(마우스 해마 세포주)가 사용될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 비신경세포주인 A549(인간 폐 아데노카시노마 상피 세포주), KEK 293(인간 배아신장 유래 세포주)가 사용될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. p47phox 또는 p67phox가 정상적으로 발현되고 기능하는 세포는 그 자체로 사용될 수 있으며, 필요한 경우, 예를 들면 이러한 세포주에 실시예에 기재된 바와 같이 글루코코르티코이드와 같은 호르몬을 처리하여 p47phox 및/또는 p67phox 유전자를 발현, 과발현(비처리 세포와 비교) 및/또는 활성화시키거나, p47phox 및/또는 p67phox 유전자를 발현하는 플라스미드로 전달이입 후, 일정 시간, 예를 들면 48시간 경과 후에 세포를 시험물질과 접촉할 수 있다.
또한, 상기 제1단계에서 사용되는 세포는 실험동물의 형태로 제공될 수 있으며, 이 경우 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 실험동물에게 만성적 및/또는 지속적 스트레스를 가하는 단계를 추가로 포함하며, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다. 본원의 한 구현예에서 상기 실험동물은 래트, 마우스, 초파리, 꼬마선충을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 본원에서 사용된 만성적/지속적 스트레스란 앞서 정의한 것을 포함하며, 마우스나 래트의 경우, 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방법, 전기충격 처치, 공격적 마우스에 노출, 저온보관, 강제수영, 음식/물 박탈, 고음의 소리 및 강한 점멸성 빛 노출, 수면박탈, 일주기성 교란, 포르말린, 기타 약물을 이용한 화학적/통증 스트레스 처치, LPS 포함 미생물의 감염 처치, 고립 등이 가능하며, 초파리 및 꼬마선충의 경우는 배양세포시스템과 동일하게 뇌신경계 내에 ROS 증가를 탐지하는 리포터유전자 시스템을 활용하여, 시험물질 처리 후에 ROS의 증감을 리포터 유전자의 발현상태로 확인하여 후보물질을 선정할 수 있다. 실험동물 모델을 사용할 경우, p47phox 또는 p67phox 활성의 변화는 원칙적으로 뇌신경계 내지는 신경세포를 대상으로 할 것이나 글루코코르티코이드(예, 사람에서는 코티졸, 마우스/래트에서는 코티코스테론)와 같은 스트레스 호르몬의 특성상 모든 조직에 작용할 수 있기 때문에 모든 장기, 조직, 세포가 조사대상이 될 수 있다. 이 경우도 시험물질의 처리에 의한 p47phox 또는 p67phox 활성 증가/감소는 이에 의한 뇌신경계의 생화학적 변화 예를 들면 ROS의 생성여부로 측정할 수 있다.
상기 제2단계는 시험물질을 p47phox 또는 p67phox을 발현하는 세포에 접촉시키는 단계이다.
상기 시험물질은 p47phox 또는 p67phox의 발현 또는 활성을 억제시킬 수 있는 것은 물론, 시험물질의 특성상 억제할 것으로 기대되는 물질을 포함하는 것이다. 상기 시험물질은 p47phox 및/또는 p67phox 또는 그 조합의 발현 및/또는 활성을 특이적으로 억제할 것으로 기대되는 물질로, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함하나 이로 한정하는 것은 아니다. 상기 시험물질은 10 base 이상의 단일 또는 이중 가닥의 핵산, 예컨대, 10개, 11개, 12개, 14개, 15개 이상의 핵산 분자예를 들면 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 포함한다. 또한 상기 시험물질은 2개 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 6개, 8개, 10개, 12개, 20개 이하, 또는 20개 초과 예컨대 50개 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
스트레스 관련 질환 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.
시험물질의 양은 사용하는 구체적인 실험방법 및 시험물질의 종류에 따라 달라지며, 당업자라면 적절한 양을 선택할 수 있을 것이다. 후보물질은 실험결과 시험물질과 접촉되지 않은 대조군과 비교하여 ROS의 생성을 감소시킨 물질이다. 예를 들면 시험물질의 존재 하에서 대조군과 비교 약 99% 이하 감소, 약 95% 이하 감소, 약 90% 감소, 약 85% 감소, 약 80% 감소, 약 75% 감소, 약 70% 감소, 약 65% 이하 감소, 약 60% 이하 감소, 약 55% 감소, 약 50% 이하 감소, 약 45% 이하 감소를 의미하나, 이를 벗어나는 범위를 제외하는 것은 아니다. ROS의 생성여부는 예를 들면 실시예에 기재된 것과 같은 공지된 다양한 방법에 의해 검출할 수 있으며, 당업자라면 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.
상기 제2단계에서 세포주를 사용하는 경우, 시험물질과의 접촉은 시험물질을 세포 배양 배지에 추가한 후 세포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 또는 상기 세포가 실험동물로 형태로 제공될 때, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하는 이로 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 제3단계에서는 시험물질을 접촉시킨 세포에서의 p47phox 또는 p67phox의 발현량과 시험물질을 접촉시키지 않은 세포에서의 p47phox 또는 p67phox의 발현량을 비교하는 단계를 포함한다. 시험물질의 처리에 의한 p47phox 또는 p67phox의 발현 및/또는 활성 증가/감소는 이에 의한 뇌신경계의 생화학적 변화를 대상으로 후보물질을 선별할 수 있다. 한 구현예에서 p47phox 또는 p67phox의 발현 또는 활성의 검출은 ROS(Reactive Oxygen Species) 생성여부로 측정할 수 있다. ROS 검출 방법은 공지되어 있으며, 당업자라면 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이며, 예를 들면 실시예에 기재된 방법과 같이 지질 과산화 수준의 측정, DCF 및/또는 DHE와 같은 ROS 민감 약물을 사용할 수 있다. 본원의 실시예에 기재된 바와 같이, ROS의 생성의 감소는 p47phox 또는 p67phox 발현 또는 활성의 감소로 해석될 수 있다.
상기 3단계의 47phox 또는 p67phox의 mRNA의 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 3단계의 47phox 또는 p67phox 단백질의 발현량 측정은 웨스턴 블롯, 조직면역염색법, 조직형광염색법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
시험물질을 접촉시킨 세포에서의 p47phox 또는 p67phox의 발현량이 시험물질을 접촉시키지 않은 세포에서의 p47phox 또는 p67phox 발현량보다 낮은 시험물질을 스트레스 민감 반응 완화제로 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리된 생체 시료의 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 어느 하나를 측정하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리된 생체 시료에서 p47phox 또는 p67phox의 농도를 측정하는 것이 특징인, 스트레스 수준 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 반복적인 스트레스르 받은 마우스의 뇌 뿐만 아니라, 혈액에서도 p47phox 또는 p67phox의 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 5a). 상기 실험결과를 바탕으로 본 발명은 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 여부를 진단받고자 하는 개체를 대상으로, p47phox 또는 p67phox의 발현 레벨을 측정하여 스트레스 민감 반응 또는 스트레스 장애 여부를 진단할 수 있다. 상기 방법에서는 진단받고자 하는 개체의 p47phox 또는 p67phox 발현 레벨이 스트레스를 받지 않은 개체의 p47phox 또는 p67phox 발현 레벨에 비해 증가된 경우, 스트레스 민감 반응이 발생하고 있거나, 스트레스 장애 질환으로 진단하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 진단 키트는 p47phox 또는 p67phox의 농도를 측정함으로써 스트레스 수준을 진단할 수 있으며, 스트레스 장애 여부를 진단할 수 있다. 상기 키트를 이용하여 정상치보다 p47phox 또는 p67phox의 농도가 높은 경우 스트레스 수준이 상대적으로 높은 것으로 진단할 수 있다.
본 발명의 정보제공방법은 상기 개체로부터 분리된 생체 시료의 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성 및 기능 중 어느 하나를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명자들은 반복적인 스트레스를 받은 마우스의 뇌에서 PRX3 또는 TRX2의 발현이 감소됨을 확인하였다(대한민국 특허출원 제10-2011-0067571호). 뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에서는 반복적인 스트레스를 받은 마우스의 뇌뿐만 아니라, 혈액에서도 PRX3 또는 TRX2이 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 5b). 상기 실험결과를 바탕으로 본 발명은 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 여부를 진단받고자 하는 개체를 대상으로, PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨을 측정하여 스트레스 민감 반응 또는 스트레스 장애 여부를 진단할 수 있다. 상기 방법에서는 진단받고자 하는 개체의 PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨이 스트레스를 받지 않은 개체의 PRX3 또는 TRX2의 발현 레벨에 비해 감소된 경우, 스트레스 민감 반응이 발생하고 있거나, 스트레스 장애 질환으로 진단하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 진단 키트는 상기 생체 시료의 PRX3 또는 TRX2의 농도를 추가적으로 측정할 수 있다. 상기 진단 키트는 PRX3 또는 TRX2의 농도를 측정함으로써 스트레스 수준을 진단할 수 있으며, 스트레스 장애 여부를 진단할 수 있다. 상기 키트를 이용하여 정상치보다 PRX3 또는 TRX2의 농도가 낮은 경우 스트레스 수준이 상대적으로 높은 것으로 진단할 수 있다.
본 발명의 상기 생체 시료는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 스트레스 장애 진단을 받고자 하는 혈액, 조직, 세포, 타액, 객담, 뇌척수액, 뇨 또는 모발일 수 있으며, 보다 바람직하게는 혈액일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험재료 및 방법
동물
7주령의 수컷 C57BL6 마우스를 대한 바이오링크에서 구입했다. 마우스는 습도와 온도가 조절되는 환경에서 실험 전 1주일 동안 두 마리씩 우리(케이지)에서 키워 환경에 적응하도록 하였다. 모든 동물은 이화여자대학교 의과대학의 실험동물관리지침에 따라 다루었다. P47phox 유전자 적중 마우스(+/-)는 Huang et al., 2000에 기재된 바와 같으며, Jackson Laboratories(USA)에서 구입하였다. 유전자 적중 마우스의 유전자형은 마우스의 꼬리에서 게놈 DNA(genomic DNA)을 분리하여 다음의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다; 5-TGG AAG AAG CTG AGA GTT GAG G -3(서열번호 1), 5-TCC AGG AGC TTA TGA ATG ACC-3(서열번호 2). PCR로 증폭한 후 MspI으로 절단하여 아가로스젤 전기영동으로 분석하였다.
신체 구금 스트레스(Restraint Stress)
본 실험에 사용된 구금 스트레스 관련 실험은 종전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Kim and Han, 2006; Lee et al., 2009). 요약하면, 약 20 내지 23g의 7주령 수컷 C57BL/6 마우스를 개별적으로 환기가 잘되는 50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브에 머리부터 넣고, 약 3 cm 길이의 중간 크기의 튜브로 막은 후, 50 ml 튜브의 뚜껑을 채워서 마우스를 이 기구 안에 완전히 구금시켰다. 이러한 구금 실험은 일정한 시각(오전 10)에 시작하여 하루에 2시간씩 수행하였으며 14일에 걸쳐 반복하였다. 구금 실험 후, 마우스는 케이지에 담아 평상시의 환경에서 사육하였으며 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
약물 투여
2 시간 감금 시작하기 1 시간 전에 관심 약물을 마우스에 복강 내 주사하였고, 이 과정을 구금 실험이 진행되는 동안 반복하였다. 사용된 약물의 명칭, 출처, 및 투여 경로는 다음과 같았다: 이미프라민 염산염(Imipramine hydrochloride, Sigma (St. Louis, MO)), 투여량 20 mg/kg(i.p.); 아포사이닌(Apocynin, Sigma), 투여랑 15 mg/kg(i.p.); 비타민 C (L-Ascorbic acid, Sigma), 투여량 15 mg/kg(i.p.). 아포사이닌은 DMSO에 용해한 후, 식염수로 희석하였으며, 다른 약물은 식염수에 용해하여 사용하였다. 최종적으로 0.9% 식염수 100 ㎕로 희석된 각각의 약물은 상기 언급한 투여방법 및 투여량에 따라 투여하였다.
행동실험을 위해서 주사에 의한 스트레스 발생을 배제하기 위해 위의 경우와 독립적으로 실험실 사료(Lab chow) 또는 30mg/kg/day 양의 이미프라민을 포함하는 실험실 사료를 섭취하는 방법도 병행하였다. 이러한 사료는 일반 실험실 사료를 분쇄하고 여기에 이미프라민을 혼합한 후, 모양을 만들고, 감마선을 조사하여 제조하였다. 대조군으로 사용된 사료도 이미프라민을 제외하고는 동일하게 제조하였다(Seo et al. 2010).
행동 평가 실험
마우스는 각 행동 평가 시험을 시작하기 30분 전에 검사 방으로 옮겨와 시험하는 내내 같은 방에 머물도록 하였다. 시험은 도 1a (A)에 기재된 바와 같이 수행하였다. 행동 평가는 컴퓨터 비디오-추적 시스템 (SMART; Panlab S.I., Barcelona, Spain)을 사용하여 수행하였으며, 마지막 주사 1시간 후에 마우스를 분석하였다. 모든 회차에서 소리는 55-60 dB 백색소음(잡음)으로 차단하였다.
사회적 상호작용 검사(Social Interaction Test, SIT)
SIT는 약간의 변형을 제외하고는 기본적으로 종전에 기술된 바와 같이 수행하였다(Berton et al., 2006). 각 검사 대상 마우스를 개방 필드에 놓고 궤적을 2회 연속 추적하였다(각 회 5분, 최적의 민감도/처리량 비). 첫 번째 세션(비표적 조건)의 경우, 검사하고자 하는 마우스를 표적동물이 없는 빈 플렉시글라스 메시 케이지(15 x 8 x 17cm)를 둔 개방공간에 두어 적응하게 하였다. 두 번째 세션(표적 조건)은 첫 번째 세션과 동일한 조건이나 사회적 상호작용 표적 동물(주령이 적어도 시험대상 동물보다는 많은 공격성 B6/SJL 수컷 마우스)을 플렉시글라스 메시 케이지를 둔 개방공간에 넣어 사회적 상호작용을 조사하는 것이었다. 두 세션 사이에 실험 대상 마우스는 개방 필드로부터 홈 케이지로 옮겨놓고 약 1분간 두었다. 비-표적 및 표적의 각 세션에서는 비디오 추적 데이터를 사용하여 실험 대상 마우스가 상호작용 지역(표적 동물 케이지 주위로 8cm 폭 영역) 및 케이지가 위치한 반대편에 있는 코너 지역(18 x 18 cm)에서 보내는 시간(초단위)을 측정하였다. 이동도는 표적 동물 B6/SJL 마우스 없이 5분간 모니터링 한 후, 이어서 5분간은 케이지에 표적 동물을 넣어둔 상태에서 측정하였다. 측정치는 SMART 소프트웨어를 사용하여 얻은 값이다.
꼬리 매달기 검사 (tail suspension test; TST)
조사하려는 마우스의 꼬리를 탁자 표면에서 50cm 위에 위치하는 금속 봉에 테이프로 고정시켜 마우스를 매달아 6분간 부동성을 측정하였다. 실험은 소음이 없는 방에서 수행하였으며 탁자에는 안전매트를 깔았다(Steru et al.,1985, Bilkei-Gorzo et al., 2002).
강제 수영 검사 (forced swim test; FST)
플렉시글라스 실린더(높이; 27 cm, 지름; 15 cm)에 14 cm 깊이로 24℃의 물을 채운 통에 마우스를 넣어, 탈출하거나 바닥에 닿지 않도록 하는 조건에서 15분간 예비 수영을 하도록 두었다. 15분 후 마우스를 꺼내 수건으로 물기를 닦고, 홈케이지로 돌려보냈다. 하루 뒤 마우스를 6분간 강제로 수영하게 하였다. 처음 1분간 마우스들이 적응하도록 두고, 다음 5분간 행동을 관찰하였다. 부동성 시간은 모든 팔다리의 움직임 없이 동물이 떠있는 시간의 합으로 정의된다. 자세한 기록방법은 참조문헌(Kim et al., 2006)에 기재되어 있다.
새로운 환경에서 먹이 섭취 억제성 검사(Novelty Suppressed Feeding, NSF)
본 실험은 스트레스로 인한 불안감을 측정하는 것으로, 비친화적 환경에서 동물이 종전에 섭취하던 먹이를 처음으로 섭취하기까지 망설이는 시간을 측정하는 것이다. 본 검사는 만성적 우울증 치료제의 약효 검사에 매우 민감하다. 검사 전에, 케이지에서 사료를 ~24시간 동안 제거하고, 물은 임의로 마시게 하였다. 이 기간 종료 후, 2 x 2.5cm 크기의 타원형 사료 펠렛 1개를 원형의 흰색 필터페이퍼(직경 150mm) 위에 놓아 개방 필드(45 x 45 x 40 cm)의 중앙에 두었다. 각 마우스를 홈케이지에서 꺼내 물과 사료 없이 대기 케이지에 30분간 둔 후, 1400 lux 조명이 비추는 개방 공간에 넣었다. 이때부터 먹이를 처음으로 먹기까지 소요되는 지체성 및 홈케이지에서 5분간에 걸친 섭취량을 기록하였다. 마우스가 먹이를 섭취하기 시작하자마자 동물은 홈케이지로 옮겨 미리 측정된 중량의 사료를 5분간 섭취하도록 하였다. 5분 종료시, 케이지에 넣어준 사료의 무게를 측정하여, 섭취한 사료의 양을 계산하였다.
구슬 감추기 검사(Marble Burying Test, MBT)
구슬 감추기 검사는 불안감을 측정하기 위한 것으로 약간의 변형을 제외하고는 기본적으로 기존의 방법(Deacon, 2006, de Kloet ER et al, 2005)대로 수행하였다. 요약하면, 빈 홈케이지에 바닥으로부터 5cm 높이까지 깔개를 채우고, 여기에 12개의 구슬을 격자로 배치한 후, 마우스를 풀어놓고 30분 동안 자유롭게 두었다. 그 후 숨겨진 구슬의 수를 세었다. 구슬이 < 25% 보이면 숨겨진 것으로 간주하였다. 항우울제를 미리 투여한 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 구술 숨기는 현상이 덜하였다.
개방 공간 검사(Open Field, OF)
흰색 플렉시글라스 챔버(45 x 45 x 40; 70 lux)의 개방 공간 중앙에 시험 동물을 넣고 정해진 시간 동안 운동성을 측정하였다. 수평 이동도는 시험 동물이 움직인 이동거리로 판단하였다. 개방 공간의 30%를 차지하는 내부의 사각형 영역을 중앙부분으로 정하였다.
지질 과산화의 측정
지질 과산화는 종전에 기술된(Im et al., 2006; Seo et al., 2010a-c; 2011a-b) 바와 같이, Bioxytech MDA-586 kit를 사용하여 말론디알데히드 (MDA) 수준을 측정하여 평가하였다.
요약하면, 뇌 조직을 5 mM 부틸화 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene)을 포함하는, 4배 부피의 빙냉의 20 mM PBS(pH 7.4)로 균질화하였다. 이어 균질물은 4℃ 에서 3,000 g로 10분간 원심분리 했고, 상층액은 각각의 분석에 사용되었다. 각각의 반응에 10 ㎕의 프로부콜과 640 ㎕의 희석된 R1 시약 (1:3 메탄올:N-메틸-2-페닐인돌)을 첨가하고, 150 ㎕의 12N HCl과 혼합하였다. 45℃ 에서 60분간 반응시킨 후, 10,000 g로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 분리하여, 586 nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA 데이터는 단백질 농도에 대해 적정화(normalization)하였고, 값은 대조군(sham control)에 대한 백분율로 나타냈다. 단백질-결합된 MDA 함량은 차감하여 수득하였다.
단백질 카르보닐화의 함량 측정
단백질 카르보닐 함량은 Lee et al. (2009)에 기재된 방법으로 정량화하였다. 뇌 균질물의 상층액 (500 ㎕)을 500 ㎕의 20% 트리클로르아세트산 (TCA)로 침전시켰다. 10,000g에서 15분간 원심분리 후, 펠렛을 50℃ 에서 2M HCl의 10 mM 2,4-디니트로페닐히드라진 0.5 ml로 재부유시켰다. 매 10분마다 주기적으로 교반하면서, 암실의 실온에서 한 시간 동안 반응시킨 후, 시료를 0.5 ml의 20% TCA로 침전시켰다. 이 과정을 10% TCA를 사용하여 3회 반복하였다. 결과로 얻은 침전물은 37℃ 에서 2 mM NaOH에 용해시켰다. 단백질 카르보닐 함량은 360 nm에서 흡광도를 측정하여 결정했고, nmol/mg 단백질의 단위로 표시했다.
혈액 분리
1 ml 일회용 플라스틱 주사기로 마취한 쥐의 복부 대동맥에서 채취한 혈액으로부터 마우스 혈구를 준비하였다. 전혈을 튜브에 수집하고 1,500 rpm으로 15분간 실온에서 원심분리하여 얻어진 상층액과 펠렛을 각각 혈청과 혈구라 지칭했다.
실시간 PCR에 의한 mRNA의 정량
RNA 시료 준비와 실시간 PCR은 종전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Ha et al., 2008). RNA 정량을 위해, 만성적으로 RTS를 처리한 마우스의 상전 전두엽 피질(Superior prefrontal cortex)과 해마(Hippocampus), 혈구를 수집했다. 총 RNA 는 Trizol (Invitrogen Carlsbad, CA, USA) 시약을 이용하여 정제하였고, 유전자적 오염을 막기 위해 DNaseI을 처리하였다. 역전사는 역전사 시스템(Promega, Madison, WI, USA)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 첫-가닥 cDNA는 Promega RT PCR kit를 사용하여, 총 부피 20 ㎕에서 1 μg의 총 RNA로 합성하였다.
PCR 반응은 10 ㎕ 2X iQ SYBR Green supermix(Bio-Rad, Richmond, CA, USA), 5 pmol/㎕의 정방향과 역방향 프라이머 각각 1 ㎕, 및 5 ㎕ cDNA (1/100 희석)을 포함하는 최종 부피 20 ㎕에서, CFX 96 실시간 PCR 시스템 검출기(Real-Time PCR　System Detector）를 사용하여 수행하였다. 반응 주기는 다음과 같았다; 95℃ 에서 5분간 처리 후, 95℃ 에서 20초, 56℃ 에서 20초, 72℃ 에서 20초간 처리를 40회 반복. 증폭의 특이성은 장비에 내장된 소프트웨어를 사용하여 55℃ 에서 95℃ 까지 점진적인 온도증가 (0.5℃) 동안 담아낸 자동 형광 데이터에 대한 DNA 융해 곡선에 의해 결정하였다. 증폭 배수의 차이는 Bio-Rad CFX Manager에 대해 유전자 발현 분석(Gene Expression Analysis)이라는 내장된 소프트웨어를 사용하였고, 참고로 사용한 GAPDH 및 베타 액틴(β-actin)에 대해 표적 유전자의 실시간 PCR 증폭을 기초로 하여 계산하였다. 실시간 PCR 분석은 표 1 (실시간 PCR 프라이머 세트(마우스: 서열번호 3 내지 28))및 2(실시간 PCR 프라이머 세트(인간: 서열번호 3 내지 6, 서열번호 29 내지 32))에 기재된 실시간 PCR 프라이머 세트의 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR은 각각의 그룹과 각각의 부위에 대해 6번씩 시행하였다.
표 1
Figure PCTKR2012000395-appb-T000001
표 2
Figure PCTKR2012000395-appb-T000002
RT-PCR을 사용하여 cDNA 농도 측정
cDNA의 양은 실시간 PCR을 사용하여 측정하였다. 실험에서 측정한 전사체의 특정 부위 증폭에 사용한 프라이머는 다음과 같다:
gp91-phox, 5'-GGTTTATGATGATGGGCCTAA-3' (서열번호 33) 및 5'-GCACTGGAACCCCTGAGAAA-3'(서열번호 34); p22-phox, 5'-CCCCGGGGAAAGAGGAAAAA-3' (서열번호 35) 및 5'-AGGACAGCCCGGACGTAGTA-3'(서열번호 36); p67-phox, 5'-GGGAACCAGCTGATAGACTA-3'(서열번호 37) 및 5'-TCCATTCCTCYTTCTTGGCA-3'(서열번호 38); p47-phox, 5'-CAGCCAGCACTATGTGTACA-3'(서열번호 39) 및 5'-GAACTCGTAGATCTCGGTGAA-3'(서열번호 40); 및 p-40-phox, 5'-TGGCCCAGCAGCTGCG-3'(서열번호 41) 및 5'-CGRTAGCGGCGGTAGATGAG-3'(서열번호 42). gp91-phox, p22-phox, p40-phox, p47-phox 및 p67-phox 프라이머는 종전(Tammariello et al., 2000)에 기술된 바와 같이 사용하였다. GAPDH 및 베타 액틴(β-actin)을 내부 대조군으로 사용하여 적정화를 하였다. PCR 반응은 3회 독립적으로 수행하였다.
렌티바이러스를 포함하는 벡터(Lentiviral vector)의 생성과 농축
재조합 렌티바이러스는 종전 (Min et al., 2010)에 기술된 대로 생산하였다. 요약하면, 전이 벡터(Lenti-p47phox-shRNA, OpenBiosystems에서 구입, RMM4431-98723759), 막 당단백질 발현 렌티바이러스 벡터(Macrogene., Korea) 및 패키징(packaging) 벡터를 포함하는 3개의 플라스미드를 293T 세포에 1:1:1의 몰비율로 리포펙타민 플러스(Invitrogen Corp., CA, USA)와 함께 핵내 주입하였다. 바이러스 벡터 입자를 포함한 배양 상층액을 핵내 주입한 후 48시간에 수집하고, 0.45 μm 막으로 여과 후 -70℃ 냉동고에 보관했다. 렌티바이러스 벡터의 발현 정도는 RT-PCR, 웨스턴 블롯, 및 ELISA로 분석하였다. 역가(적정량)는 HeLA 세포에 감염 후 p24 ELISA에 의해 결정하였다. 이렇게 얻어진 값은 약 106-107 형질도입 단위 (transduction unit, TU)/ml이었다. GFP 발현은 HeLA 세포 또는 A594 세포에 핵내주입 후 확인되었고, 형광 현미경(Nikone TE2000U, Japan)을 사용하여 사진으로 찍었다. 바이러스는 센트리콘(Centricon, Millipore Corp., Billerica, MA, USA)으로 여과하였다. 바이러스 입자를 80,000g에서 2시간 동안 초원심분리하여 보다 농축하였으며, 이러한 농축과정을 2번 반복했다. 마침내 약 1010-1012 TU/ml의 양으로 얻어졌다.
렌티바이러스-shRNA의 정위 주사 (stereotaxic injection)
수컷인 C57BL/6 마우스(20-25 g)에 케타민(50 mg/ml) 및 자일라진 염산염 (23.3 mg/ml)의 3.5:1 혼합물을 g 체중 당 1.0 ㎕의 양으로 복강내 주사하여 마취시키고, 종전 연구에서 기술된 바와 같이 정위 장치에 위치시켰다(Kim and Han, 2006). 3 ㎕ 부피의 렌티 shRNA를 28 G 바늘을 사용하여 0.5 ㎕/min의 속도로 각각의 치아이랑으로 우측 측뇌실로 주입했다(정수리점(bregma)을 기준으로 한 mm 단위의 정위 좌표: 앞-뒤(anterior-posterior), -2.4; 측면중앙(midlateral), 2.0; 등-배(dorsal-ventral), -2.1) (Franklin and Paxinos, 1997). 5분 후 역류를 최소화 하기 위해 3분간 3단계를 거쳐 바늘을 제거하였고, 마우스는 깨지 않도록 따뜻한 패드에 계속 두었다. 마취에서 깨어난 마우스는 분석에 사용될 때까지 홈케이지에 두었다. 주사 14일 후 우울증 유사 행동 검사를 수행하였다. shRNA 대조군; 마우스 pGIPZ 렌티바이러스 shRNXmir (RMM4431), 렌티 shRNA-p47phox (RMM4431-98723759, V2LMM_3405)는 Open Biosystems, Inc. (USA)에서 구입하였다.
조직면역화학
뇌는 경심관류로 4% 파라포름알데히드로 고정하였으며, 동일 용액에 4℃에서 하룻밤 후고정하였다. 종전의 연구에서 기술된 바와 같이(Lee et al., 2009), 바이브라톰(vibratome)을 이용하여 뇌를 40 μm 간격으로 잘라 뇌 절편을 준비했다. 일차항체로서 항-p47phox 항체 (Santa Cruz, USA), 항-HNE (HNE11-S) 항체 (Alpha Diagnostic Intl. Inc, USA)와 반응시킨 후, 마우스 IgG에 대한 Alexa Fluor 488-conjugated 항체 또는 토끼 IgG에 대한 Texas Red 594-conjugated 항체(Invitrogen Corp., USA) 및 FITC (Fluorescein isothiocyanate) 및 TRITC (tetramethylrhodamine isothiocyanate) (Jackson ImmunoResearch, USA)에 커플링된 제2항체를 사용하여 가시화하고, 발색은 바이오티닐화된 HRP (Vector Laboratories, USA)를 제조자의 지시대로 사용하여 수행하였다. 발색 후 슬라이드에 벡타쉴드용액 (Vector Laboratories)을 넣고 현미경으로 관찰 후 내장된 카메라 및 소프트웨어로 분석하였다 (Olympus BX 51 microscope equipped with a DP71 camera 및 DP-manager 및 DP-Controller software ,Olympus Co., Japan). 세포수는 염색부위를 촬영한 영상을 디지털이미지로 변환한 후 TOMORO ScopeEye 3.6 program (Techsan Community, Korea)을 사용하여 맹검방식으로 측정하였다.
세포 배양과 약물 처리
SH-SY5Y 뉴로블라스토마(neuroblastoma cell) 세포주의 세포 배양은 종전 연구에서 기재된 바와 같다(Seo et al., 2010b-c; 2011a). 요약하면, SH-SY5Y 세포를 10% 열-비활성화 FBS, 페니실린(20 units/ml)및 스트렙토마이신 (20 mg/ml)을 포함하는 Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM)로 37℃에서 습식인큐베이터(95% 공기와 5% 이산화탄소)에서 배양하였다. 세포가 배양디쉬를 70-80% 채울 정도(confluence)로 자랐을 때, 실험에 사용하였다. 글루코코르티코이드 (CORT), H2O2. RU486 (mifepristone), MnTBAP, 아포시아닌 및 비타민 C는 Sigma에서 구입하였다. CORT, H2O2, MnTBAP, 및 비타민 C는 PBS에 100μM 농도로 용해하였다. 아포사이닌 및 RU486은 DMSO에 100μM 농도로 용해한 후 PBS로 희석하였다. 글루코코르티코이드 및 H2O2는 무혈청 DMEM에서 배양된 세포에 사용하였다.
전달이입 및 siRNA (Small Interference RNA)
p47phox를 낙다운(knockdown)하기 위해, SH-SY5Y 세포를 전달이입 24시간 전에 시딩(seeding)하여 전달이입시 배양 디쉬를 70% 정도 채울 정도(confluence)가 되도록 하였다. siRNA (siRNA-p47phox)는 바이오니어(한국)에서 합성하였다. 센스가닥의 siRNA-p47phox 서열: 5'-CUA UUU CCC AUC CAU GUA U-3'(서열번호 43); 및 안티센스 가닥: 5'-AUA CAU GGA UGG GAA AUA G-3'(서열번호 44). 각 siRNA 가닥의 3‘ 말단에는 4개의 데옥시리보스뉴클레오타이드 오버행(dTdT)을 추가하였다. 비표적 대조군 siRNA인 6-카복시플루오레신 플루오로포어로 표지된 올리고뉴클레오타이드 siGLO Green [D-001630-0105] 및 [D-001210-0205]은 Dharmacon Inc (USA)에서 구입하였다. 세포는 DMEM로 희석된 100nM siRNA의 농도로 Lipofectamine 시약 (Invitrogen)을 제조자의 지시대로 사용하여 전달이입하였다. p47phox 낙다운여부는 항-p47phox 항체를 이용한 면역세포화학법으로 확인하였다.
배양된 세포에서 ROS 측정
96-웰 플레이트의 SH-SY5Y 세포를, 10 μM DCF를 포함한 배지에서 37℃ 로30분간 인큐베이션했다. 종전 기술에 기재된 바와 같이, 과산화수소 관련 ROS에 민감한 세포막투과성 형광 색소인 CM-H2DCFDA[5-(and-6)-chloromethyl-2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate]를 사용하여 ROS를 가시화하였다(Im et al., 2006; Seo et al., 2011a).
요약하면, SH-SY5Y 세포를 HEPES 완충액으로(120 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.8 mM MgCl2, 1.8mM CaCl2, 20mM HEPES, 10mM NaOH, 15mM 글루코즈) 세척하여 형광 수준 분석에 사용하였다. 형광수준은 분광형광계(SpectraMaxM5, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA. USA)를 사용하여, DCF에 대해 488 nm에서 여기(excitation)와 510 nm에서 발광(emission)을, DHE에 대해 540nm에서 여기와 590nm에서 발광을 측정했다. 3회 측정하여 평균값을 내어, 하나의 데이터로서 사용하였다. 염색 영상은 DP71 카메라 및 DP-manager와 DP-Controller 소프트웨어가 장착된 Olympus BX 51 현미경(Olympus Co.)을 사용하여 분석하였다. 콘포칼 영상은 Zeiss LSM510/META/NLO 레이저 스캐닝 현미경과 Zeiss Plan-Neofluar 소프트웨어 (Carl Zeiss, USA)로 분석하였다. 세포수는 염색부위를 촬영한 영상을 디지털이미지로 변환한 후 TOMORO ScopeEye 3.6 program (Techsan Community, Korea)을 사용하여 맹검방식으로 측정하였다. 각 시료의 형광은 막대그래프를 사용하여 24h 대조군(sham)의 퍼센트의 막대그래프로 나타냈다.
면역세포화학법
세포를 실온에서 0.1M 인산완충액 (ph 7.4) 중의 4% 파라포름알데하이드로 10분간 고정한 후, 0.1M의 PBS 중의 0.2% Triton X-100로 10분간 처리하여 투과성있게 만든 후 5% 염소 혈청으로 1시간 동안 블락(block)하였다. 블락 후에, 세포를 실온에서 하룻밤 항-p47phox 항체 (1:1000)가 들어있는 3% BSA 용액에서 인큐베이션 하였다. 0.1 M PBS로 세포를 세척한 후 플루오레신-컨주게이트된 2차 항체 (TRITC, 1:100, Sigma)와 1시간 동안 인큐베이션한 후, 세척하고 플루오레신 마운팅 용액 (DAKO, Denmark)에서 30분간 마운팅하였다. 이어 염색된 영상을 DP71 카메라 및 DP-manager와 DP-Controller 소프트웨어가 장착된 Olympus BX 51 현미경(Olympus Co.)을 사용하여 촬영/분석하였다.
통계처리
일분량변이분석(ANOVA)과 Newman-Keuls 다중검사방법을 사용하여 수 개 시료의 결과를 비교분석 하였으며, 통계분석은 GraphPad PRISM software 4.0 (GraphPad Software Inc., USA)를 사용하였다. 모든 데이터는 평균± S.E.M.이고, 다른 언급이 없는 한 유의한 통계적 차이는 5% 수준을 사용하였다.
실시예 1: 반복적인 구금 스트레스로 인한 지속적 우울증 관련 행동 관찰
반복적인 구금 스트레스(2h-14d, 실험 방법 참조)와 같은 만성적 스트레스가 가져오는 영향을 알아보기 위해, 도 1a의 (A)에 도식화된 내용으로 실험을 수행하였다. 구체적인 실험방법은 상기 실험방법에서 자세히 설명하였다.
2h-14d 구금 개시 15일째 실시한 사회적 상호작용은 비디오 추적 시스템 (도 1a, B)을 사용하였으며, 실험결과 대조군 마우스는 총 300초의 관찰기간 중 125초를 표적 마우스에 근접하거나 상호작용을 하였으나, 스트레스가 가해진 마우스는 표적 마우스와 보내는 시간이 감소하였으며, 코너 지역에서 시간을 보냈다 (도 1a, C). 반면 표적 마우스가 없는 경우에는 대조군과 시험군간에 별차이가 없었다. 이러한 지속적 비사회적 행동이 사람에서 스트레스에 의해 유도되는 우울증과의 유사여부를 확인하기 위해 항우울증 치료제로 널리 사용되는 이미프라민을 구금이 가해진 마우스에 처리하고 위와 동일한 시험을 수행하였다. 마지막 구금 스트레스를 가한 다음 날부터 15일간 이미프라민을 투여한 결과 상호작용 지역에서 지내는 시간이 증가하였으며, 동시에 코너 지역에서 보내는 시간은 감소하였으며(도 1a, C). 이러한 결과는 구금에 의해 유도된 증상이 약물에 의해 개선된 것으로, 유도된 증상이 우울증에 의한 것임을 나타낸다.
사회적 상호작용 결과는 아래에서 언급하는 다양한 행동 검사에서도 검증된다. 우선 TST (도 1b, D)의 경우, TST는 2h-14d 구금 스트레스 후 16일째 수행되었으며, 스트레스를 받은 마우스의 경우 대조군과 비교하여 부동성 시간이 유의적 (p < 0.01)으로 증가하였다. 이러한 증상은 2h-14d 구금 스트레스 후 15일간 이미프라민을 투여한 경우는 관찰되지 않았으며, 이는 상기 증상이 우울증과 관련된 것임을 제시한다. FST (도 1b, E)의 경우도 위와 일치하는 결과를 나타냈으며, FST는 2h-14d 구금 스트레스 후 17일째 수행되었으며, 스트레스를 받은 마우스의 경우 대조군과 비교하여 부동성 시간이 상당히 유의적 (p < 0.01)으로 증가하였다. 반면 이러한 증상은 2h-14d 구금 스트레스 후 16일간 이미프라민을 투여한 경우는 관찰되지 않았으며, 이는 상기 증상이 우울증과 관련된 것임을 제시한다. 이러한 결과는 2h-14d 구금 스트레스가 항우울증제인 이미프라민의 투여로 완화될 수 있는 지속적인 우울증 행동을 유발할 수 있음을 나타내는 것이다.
스트레스로 인한 우울증은 지속적인 불안관련 행동 변이와 밀접한 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 (Kim and Han, 2006). 따라서 2h-14d 구금 스트레스가 이러한 현상을 초래하는지를 조사하였다. 새로운 환경하에 먹이 섭취 망설임 시간을 측정하는 NSF 검사를 수행하였으며, 2h-14d 스트레스 후 16일째 수행한 NSF 검사 결과, 대조군 마우스와 비교하여 구금 스트레스가 가해진 마우스의 경우 사료를 섭취하기 까지 걸린 시간이 훨씬 길었으며 (p < 0.01), 이는 구금 스트레스가 불안 장애를 초래하며, 이러한 장애가 스트레스를 가한 후 17일째까지 장기간 지속되는 것을 나타낸다. 이러한 불안 장애는 항우울제인 이미프라민을 스트레스를 가한 후 17일 동안 투여한 경우 대조군 수준으로 회복되었다 (도 1c, F 및 G).
불안증과 관련된 다른 행동 검사로 MBT를 수행하였다. MBT는 2h-14d 스트레스 후 18일 경과 후 수행하였으며, 스트레스를 받은 마우스는 대조군과 비교하여 숨긴 구술의 갯수가 현저하게 낮았으며, 이는 마우스가 불안하다는 것을 나타내는 것이다. 이 경우도 이미프라민을 투여한 경우, MBT 결과가 대조군 수준으로 회복되었다 (도 1c, H). 개방 필드 검사의 경우도 스트레스를 받은 마우스는 개방 필드의 30%를 구성하는 중앙부위에서 이동거리가 대조군에 비하여 적었으며, 이는 불안 증상을 나타내는 것이며, 이러한 행동은 이미프라민의 투여에 의해 부분적으로 회복되었다 (도 1c, I). 개방 필드에서의 총 이동거리에는 차이가 없었다 (도 1c, J 및 K). 종합하면, 상기 결과는 구금 스트레스로 인해 지속적인 우울증 및 불안 행동이 유발되었음을 나타낸다. 도 1에서 데이터는 평균± SEM (n=20-22)로 나타내었으며, * 및 ** 는 각각 p<0.05 및 p<0.01로 두 그룹간의 차이를 나타낸다. One-Way ANOVA< Newman-Keuls 멀티플 비교 테스트를 사용하였다.
실시예 2: 구금 스트레스로 인한 뇌에서의 ROS(Reactive Oxygen Species) 증가
본 발명자들은 스트레스로 유도된 지속적인 우울증 관련 행동이 뇌의 ROS 조절 시스템과 관련되어 있는지를 확인해보았다.
반복적 스트레스는 혈액 중 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드(glucocorticoid)를 통하여 뇌에서 높은 산화성 스트레스를 가져온다. 그러나 글루코코르티코이드가 ROS를 증가시키는 기전 및 ROS가 우울증 및 불안 유사 행동을 야기시키는지에 관하여는 알려진 바 없다.
글루코코르티코이드로 인한 ROS 생성 기전을 밝히기 위해서, 우선 상이한 기간 동안 구금 스트레스에 노출된 마우스의 뇌에서 산화성 스트레스의 지표로 지질 과산화 및 단백질 카르보닐화 정도를 조사하였다. 구금 스트레스를 받은 시간을 2시간, 4시간, 6시간으로 나누어 실험하고(도 2a, A), 구금 스트레스를 1, 3, 5. 7, 10 또는 14일 동안 매일 2시간씩 행해진 그룹으로 나누어 실험하였다(도 2b, D).
스트레스를 받은 시간(B, C) 및 반복횟수(E, F)에 의존적으로 해마에서 지질과산화 결과인 말론디알데하이드 (MDA) 및 단백질 카르보닐화 정도가 증가하였으며, 특히 2h 구금 스트레스를 7회 가한 후부터 ROS가 현저히 증가하였다.
도 2에서 데이터는 평균± SEM (n=4-8)로 나타내었으며, * 및 ** 는 각각 p<0.05 및 p<0.01로 대조군과 그룹간의 차이를 나타낸다. One-Way ANOVA< Newman-Keuls 멀티플 비교 테스트를 사용하였다.
실시예 3: SH-SY5Y 세포에서 글루코코르티코이드로의 농도 및 처치 시간 의존적인 ROS 농도 증가 유도
글루코코르티코이드로 인한 ROS 생성 기전을 밝히기 위해서, SH-SY5Y 인간 뉴로블라스토마 세포를 글루코코르티코이드(corticosterone; CORT)로 처리하고 ROS의 생성을 조사하였다. 투여하는 글루코코르티코이드의 용량 및 시간을 달리한 실험 디자인은 도 3a, A에 기재되어 있다. 구체적으로, SH-SY5Y 세포를 글루코코르티코이드의 저농도(400ng/ml 또는 1.15 μM) 또는 고농도(800nm/ml)로 2시간 동안 처리한 후, 제거하고 22시간 배양 후에 다시 처리하는 과정을 1 내지 3일 반복하는 실험을 수행하였다.
그 결과 도 3a, B에서 보는 바와 같이 글루코코르티코이드의 양 및 처리 기간에 의존적으로 MDA 농도가 증가하였다. 다음으로 이에 관여하는 인자를 규명하기 위하여 글루코코르티코이드로 처리된 세포를 각 과산화수소에 민감한 염색제인 DCF 및 과산화물 음이온 특이적 염색제인 DHE로 염색한 후, 현미경 및 분광형광측정기로 관찰하였다. 결과는 각각 도 3b 및 도 3c에 있다. 처리되지 않은 대조군과 비교하여 고농도의 글루코코르티코이드로 3일간 반복 처리된 SH-SY5Y 세포에서 높은 DCF 반응성 형광이 검출되었다. 이러한 결과는 글루코코르티코이드의 농도 및 시간 의존적으로 세포에서 ROS 및 과산화물을 증가시킴을 나타내는 것이다. 도 3에서 데이터는 평균± SEM로 나타내었으며, * 및 ** 는 각각 p<0.05 및 p<0.01로 대조군과 실험 그룹간의 유의적 차이를 나타낸다. One-Way ANOVA< Newman-Keuls 멀티플 비교 테스트를 사용하였다.
실시예 4: 만성적 스트레스로 인한 뇌에서의 NADPH 옥시다제 발현 증가
앞서 언급한 바와 같이 구금 스트레스는 마우스에서 장기간 지속되는 우울증 및 불안 유사 행동을 야기하고, 뇌에서 ROS 농도 증가를 가져왔는데, 본 실험에서는 이에 관여하는 세포내 인자를 규명하였다. 인자 규명을 위해 ROS 생성에 중요한 것으로 알려진 인자를 구금을 가한 마우스와 비처리 대조군 마우스의 뇌조직에서 실시간 PCR 방법으로 조사하였다. 조사한 유전자는 퍼록시리독신(peroxiredoxin (PRX1)), 사이토플라즈믹 Cu/Zn 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(cytoplasmic Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1)), 카탈라아제(catalase (CAT)), 헴 옥시게나아제-1(heme oxygenase-1 (HO-1)), p47phox, p67phox, 시클로옥시제네이즈-2(cyclooxygenase-2 (COX2)), 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase (iNOS)), 핵 인자-카파 B(nuclear factor-kappa B (NF-κB)), 종양 괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha (TNF-α)), 및 인터루킨-1 베타(interleukin-1 beta (IL-1β))이었다. 결과는 도 4a(전전두엽 피질, prefrontal cortex, PFCX) 및 4b(해마, HP)에 나타내었다. 조사한 유전자의 발현 양상이 PFCX와 HP에서 서로 다르게 나타났으며, 특히 NADPH 옥시다제 서브유니트인 p47phox 및 p67phox의 경우 대조군과 비교하여 스트레스를 받은 마우스에서 발현양이 상당히 증가하였다. 데이터는 평균± SEM (n=6-9)로 나타내었으며, * 및 ** 는 각각 p<0.05 및 p<0.01로 그룹간의 유의적 차이를 나타낸다 (Student's t-test).
NADPH 옥시다제는 "phox" 영역을 갖는 서브유니트 p47phox, p67phox, p40phox, gp91phox (NOX2), 및 p22phox을 포함한다. NOX2 및 p22phox는 세포막에 위치하고, p47phox는 세포질내 존재하다가 인산화되면 p67phox, p40phox와 함께 막으로 이동하여 활성 NOX2 복합체를 형성한다. 활성화된 복합체는 Rac의 GDP와 GTP의 교환을 수행하고 이 과정에서 NADPH로부터 산소로 전자를 전달하고 부산물로 H+와 과산화물을 생성하며 반응식은 다음과 같다: NADPH + 2O2↔ NADP++2O2 °- + H+. (도 4c).
NADPH 옥시다제를 구성하는 5종류의 서브유니트의 구금 스트레스를 받은 마우스의 HP 및 PFCX에서의 발현여부를 RT-PCR로 조사한 결과, p47phox 및 p67phox 발현이 증가하였다 (도 4d). 이러한 결과는 도 4a 및 4b에서 관찰된 결과와 일치하는 것으로 만성적 스트레스로 인한 ROS의 생성에 NADPH 옥시다제가 관여하고 있음을 나타내는 것이다. 보다 자세한 기전 규명을 위해 이하에서는 p47phox의 인산화 및 막으로의 전이에 의한 NADPH 옥시다제 활성화를 조사하였다. 도 4에서 데이터는 평균± SEM(n=6-9)로 나타내었으며, * 및 ** 는 각각 p<0.05 및 p<0.01로 그룹간의 유의적 차이를 나타낸다(Student's t-test).
실시예 5: 만성 스트레스 받은 마우스의 혈액에서 p47phox, p67phox의 발현증가 및 PRX3, TRX2의 발현 감소 확인
반복적인 스트레스가 마우스의 뇌 뿐만 아니라 혈액에서도 p47phox 및 p67phox의 발현을 증가시키는지와 PRX3 및 TRX2의 발현을 감소시키는지 알아보았다.
반복적인 구금 스트레스(2h-14d)를 가한 마우스와 구금 스트레스를 가하지 않은 마우스의 혈액으로부터 마우스 혈구를 얻어, 혈액 내 p47phox, p67phox, PRX3 및 TRX2의 발현 정도를 실시간 PCR으로 확인하였다.
그 결과, 구금 스트레스를 가하지 않은 마우스의 혈액에 비하여, 반복적인 구금 스트레스를 받은 마우스의 혈액에서 p47phox 및 p67phox의 발현이 현저히 증가되고(도 5a), PRX3 및 TRX2의 발현이 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다(도 5b).
상기 결과로부터, 반복적인 스트레스가 뇌의 미토콘드리아 내 p47phox 및 p67phox의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라, 혈액 내 혈구에서도 p47phox 및 p67phox의 발현을 증가시키며, 이로부터 혈액를 채취하여 p47phox 또는 p67phox의 발현을 측정하여 스트레스의 영향을 받았는지, 반복적인 스트레스로 인해 우울증과 같은 스트레스 장애를 진단할 수 있다. 또한, PRX3 및 TRX2의 경우에는 반복적인 스트레스가 뇌의 미토콘드리아 내 PRX3 및 TRX2의 발현을 감소시킬 뿐만 아니라, 혈액 내 혈구에서도 PRX3 및 TRX2의 발현을 감소시키며, 이로부터 혈액을 채취하여 PRX3 또는 TRX2의 발현을 측정하여 스트레스의 영향을 받았는지, 반복적인 스트레스로 인해 우울증과 같은 스트레스 장애를 진단할 수 있다.
또한, 혈액 내 p47phox 또는 p67phox의 발현 증가를 억제시키거나, 이의 활성을 억제시킴으로써 스트레스 민감 반응을 완화시키고, 만성적 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애를 치료할 수 있다.
실시예 6: NADPH 옥시다제의 상향 발현에 의하여 글루코코르티코이드로 처리된 SH-SY5Y 세포에서의 ROS 증가
SH-SY5Y 세포를 글루코코르티코이드로 처리한 후, ROS 생성을 NADPH 옥시다제 억제제 중 하나인 아포사이닌의 존재 및 부재하에서 DCF 염색으로 조사하였다. 결과는 도 6a 및 6b에 나타내었다. 글루코코르티코이드에 의하여 증가된 ROS가 아포사이닌의 처리(Apo, 500 μM)에 의해서 완전히 차단되었음을 알 수 있다. 또한 글루코코르티코이드 수용체 길항제인 RU486 (RU, 20 μM), SOD 모방체 MnTBAP (Mn, 100 μM), 및 비타민 C (Vit C, 200 μM)에 의해서도 ROS 상승효과가 차단되었다. 데이터는 평균± SEM(n=6)로 나타내고, * 및 ** 는 각각 p<0.05 및 p<0.01로 두 그룹간의 유의적 차이를 나타낸다. One-way ANOVA, Newman-Keuls 멀티플 비교 테스트를 사용하였다.
이러한 결과는 NADPH 옥시다제의 활성이 글루코코르티코이드에 의해 유도된 ROS 생성에 중요한 인자임을 나타내는 것이다.
NADPH 옥시다제 활성에 있어 p47phox의 역할을 규명하기 위하여, 활성의 필수 전단계인 p47phox의 막으로의 전이(Suh et al., 2007; 2008)를 글루코코르티코이드로 처리된 SH-SY5Y 세포에서 항-p47phox 항체를 이용한 염색으로 조사하였다. 결과는 도 6b에 나타내었다. 비처리 세포의 경우 p47phox가 세포질에 머물러 있었으나, 글루코코르티코이드로 처리된 경우, 세포막으로 이동하였음을 알 수 있었으며, 이러한 현상은 아포시아닌의 처리에 의해 사라졌다.
이러한 결과는 NADPH 옥시다제가 글루코코르티코이드에 의한 ROS 증가를 매개하였음을 증명하는 것이다.
글루코코르티코이드에 의한 p47phox 증가가 간접적으로나마 ROS로 인한 것인지를 알아보기 위해 세포를 200 μM 과산화수소로 처리하였다. 그 결과 p47phox 발현량에는 변화가 없었으며, 이는 p47phox 발현 증가가 ROS와 독립적인 현상임을 나타내었다 (도 7, A). 도 6에서 데이터는 평균± SEM(n=5-6)로 나타내고, * 는 p<0.05로 CORT 단독처리군과 비교한 유의적 차이를 나타낸다. One-way ANOVA, Newman-Keuls 멀티플 비교 테스트를 사용하였다.
글루코코르티코이드에 의한 ROS의 증가에 신규 단백질 합성이 필요한지, 또는 글루코코르티코이드 대사의 결과인지를 조사하였다. 이를 위해 글루코코르티코이드 처리과정에서 단백질 합성 억제제인 사이클로헥사마이드 (CHX)를 처리하였으며, ROS에 민감성 염색제인 DCF 및 DHE로 염색한 결과, ROS 및 과산화물의 생성을 완전히 차단하였다 (도 7, B 및 C).
이러한 결과는 글루코코르티코이드로 처리된 SH-SY5Y 세포에서 ROS 및 과산화물의 생성에 NADPH 옥시다제 서브유니트의 합성이 필요하다는 것을 암시하는 것이다. 또한 이러한 결과는 SH-SY5Y 세포에서 ROS 및 과산화물의 생성에 장기간 (>24h)의 글루코코르티코이드 처리가 필요하다는 결과(도 3)와, 마우스에서 높은 산화성 스트레스를 유도하기 위해 만성적 스트레스가 요구되는 결과(도 2)와 일치하는 것이었다.
글루코코르티코이드에 의한 p47phox 증가와 ROS 증가 및 과산화물 생성과의 연관성을 재확인하기 위해서, p47phox 발현을 p47phox-siRNA를 사용하여 하향 조절하는 실험을 수행하였다. 결과는 도 8에 나타내었다. SH-SY5Y 세포를 si-GFP (100 μM siRNA 농도에서, 87.32 ± 1.73% 이상이 GFP-양성)로 전달이입 한 결과, 거의 모든 세포에 siRNA가 전달되었다(도 8, A). SH-SY5Y 세포를 p47phox-siRNA로 전달이입 72시간 후에 세포를 글루코코르티코이드 (400ng /ml)로 48시간 처리한 후, ROS를 DCF 및 DHE 염색으로 분석하였다. p47phox- siRNA (50 또는 100 μM)로 전달이입된 세포에서 글루코코르티코이드에 의해 유도된 ROS 생성 (도 8, B) 및 과산화물의 생성 (도 8, C)은 처리한 siRNA의 양에 의존적으로 감소하였으며, 이러한 현상은 p47phox의 상향 발현조절이 글루코코르티코이드에 의한 ROS 및 과산화물 생성에 있어 주요 인자임을 나타내는 것이다. 도 8에서 데이터는 평균± SEM(n=4-6)로 나타내고, * 및 ** 는 각각 p<0.05 및 p<0.01로 두 그룹간의 유의적 차이를 나타낸다. One-way ANOVA, Newman-Keuls 멀티플 비교 테스트를 사용하였다.
실시예 7: p47phox 에 의한 만성적 구금 스트레스에 반응한 행동 조절
뇌에서 스트레스에 의해 유도된 p47phox의 상향 발현 현상을 보다 자세히 이해하기 위하여, 뇌의 해마에서 p47phox 활성과 ROS 생성 및 우울증 행동의 관련성을 조사하였다. 실험 디자인은 도 9, A에 도식화하였다. 구금 스트레스 (2h, 3 내지 14일)를 가하기 1시간 전에 이미프라민 (Imi; 20 mg/kg), 아포사이닌 (Apo; 15 mg/kg), 또는 비타민 C (Vit C; 15 mg/kg)를 복강에 투여하였다.
그 결과, 3, 7, 또는 14 일간 반복적으로 신체적 스트레스 (2-h 구금)를 가한 경우, 반복횟수에 따라 ROS가 증가하였다 (MDA 분석). 그러나 아포사이닌 (15 mg/kg)을 스트레스를 가하기 전에 매일 복강 투여할 결과, 대상 마우스의 뇌에서는 지질 과산화현상이 완전히 차단되었으며, 이미프라민(20 mg/kg)을 투여한 대상 마우스의 해마에서도 지질 과산화 현상이 차단되었다. 반면 비타민 C (15 mg/kg)는 ROS 생성을 부분적으로 억제하였다(도 9, B).
행동 관찰 결과는 도 9, C 및 D에 나타내었다. 스트레스를 받은 마우스의 경우, TST 및 FST에서 부동성 시간의 증가가 나타났으나, 이러한 현상은 아포사이닌 (15 mg/kg) 및 이미프라민(20 mg/kg)의 투여에 의해 사라졌다. 이 경우 비타민 C(15 mg/kg)는 효과가 없었다. 이러한 결과는 아포사이닌이 스트레스로 인한 ROS 증가를 억제하였을 뿐 아니라, 동물모델에서 항우울증 효과가 있음을 보여주는 것이다. 또한, p47phox 또는 p67phox의 활성 또는 발현을 억제시킬 수 있는 물질을 투여하게 되면, 반복적인 스트레스에 의해 우울증이 형성되는 것을 방지할 수 있음을 알 수 있었다. 데이터는 평균± SEM(n=8-10)로 나타내고, * 및 ** 는 각각 p<0.05 및 p<0.01로 두 그룹간의 유의적 차이를 나타낸다. One-way ANOVA, Newman-Keuls 멀티플 비교 테스트를 사용하였다.
아포사이닌이 만성스트레스로 인한 우울증, 불안 증상을 해소하기는 하지만 이의 신경해부학적 표적 부위는 정확하게 알려지지 않았다. 따라서 렌티바이러스 벡터 시스템을 사용하여 특정 뇌영역에 있는 p47phox의 발현을 shRNA를 사용하여 특이적으로 차단하였다. 이를 위해 비바이러스성 벡터 대조군, Lenti shRNA-GFP 대조군, 및 Lenti-p47phox-shRNA 실험군을 사용하였다. Lenti-GFP 대조군 또는 Lenti-p47phox-shRNA 는 각각 독립적으로 치아이랑 부위로 침제(infusion)하였다.
결과는 도 10에 나타내었다. A는 GFP를 발현하는 Lenti-p47phox-shRNA로 감염 후 8시간에 HeLa 및 A549 세포에서 GFP의 발현을 보여주는 결과이며, B는 실험디자인으로 스트레스를 가한 기간 및 검사 시기를 도식적으로 나타낸 것이고, 관상뇌 섹션의 양측의 해마의 치아이랑(DG)으로의 Lenti-p47phox-shRNA (GFP 발현) 또는 Lenti-GFP가 침제되었음을 보여준다. 침제 15일 후에 마우스에 2h-14d 구금 스트레스를 가한 후, 15일 후에 행동을 관찰하였다. Lenti-shRNA-GFP 대조군은 비바이러스성 벡터가 전달된 대조군과 비교하여 TST 및 FST에서 전형적인 우울증 유사 행동을 나타냈으나, Lenti-47phox-shRNA 실험군은 우울증 행동을 나타내지 않았다(도 10, C 및 D). 이러한 결과는 뇌의 특정 영역에서의 p47phox 발현 억제만으로도 스트레스로 인한 우울증 행동의 치료 및 예방이 가능함을 나타내는 것이다. 데이터는 평균± SEM(n=5-6)로 나타내고, * 및 ** 는 각각 p<0.05 및 p<0.01로 24시간 대조군과의 유의적 차이를 나타낸다. One-way ANOVA, Newman-Keuls 멀티플 비교 테스트를 사용하였다.
p47phox 유전자적중 마우스 (p47phox +/-)를 사용하여 위와 유사한 실험을 수행하였다. p47phox 유전자를 정상적으로 두 카피 (+/+) 갖는 마우스 및 한 카피만을 갖는 유전자 적중 마우스의 유전자형을, p47phox 유전자를 PCR로 증폭한 후 MspI 제한효소 절단으로 분석한 결과를 도 11, A에 기재하였다. 상기의 유전자형을 가지는 마우스에 2h-14d 스트레스를 가한 후, TST및 FST 행동평가를 수행하였다. 실험결과는 도 11, C(TST) 및 D(FST)에 나타내었다. TST 및 FST에서 비유전자변형 마우스는 우울증 유사 행동을 나타냈으나, 이러한 현상이 p47phox +/- 마우스에서는 관찰되지 않았다. 데이터는 평균± SEM(n=12-15)로 나타내고, ** 는 p<0.01로 대조군 마우스와의 유의적 차이를 나타낸다. One-way ANOVA, Newman-Keuls 멀티플 비교 테스트를 사용하였다. 이러한 결과는 모두 p47phox의 결손이 항우울증 효과를 나타내는 것을 뒷받침하는 것이다.
본 실시예의 실험결과를 요약하면 다음과 같다. 만성스트레스를 받은 동물모델에 아포시아닌을 처리한 결과 우울증 치료제인 이미프라민의 효과와 유사한 항스트레스 및 항우울증 효과를 확인하였다. 또한 Lenti-p47phox-shRNA를 해마에 미세주입한 결과 NADPH 옥시다제 활성을 억제하는 경우 대조군의 경우와 달리 만성스트레스에 의해 우울증 행동이 생성되지 않는 것을 확인하였다. p47phox 유전자 적중 돌연변이 (+/-) 마우스에서도 대조군인 야생(+/+)의 경우와 달리 만성스트레스에 의해 우울증 행동이 생성되지 않는 것을 또한 확인하였다. 뇌신경계 내에 산화성 스트레스의 증가 프로파일을 규명하였으며, 만성스트레스 동물모델에서 산화성스트레스의 유발 후보 유전자로서 NADPH 옥시다제 발현증가를 확인하였으며, SH-SY5Y 인간 신경세포주에 스트레스 호르몬인 글루코코르티코이드를 처리하는 in vitro 스트레스 모델에서 NADPH 옥시다제 발현증가, 산화성스트레스의 증가 및 미토콘드리아 기능 손상 증가를 확인하였으며, 새로운 단백질 합성을 억제하여 NADPH 옥시다제 발현 억제 및 산화성스트레스가 차단된다는 것을 확인하였다. 또한 뇌 뿐만 아니라 만성 스트레스를 받은 동물의 혈액 내 혈구에서도 NADPH 옥시다제 발현증가, p47phox 및 p67phox 의 발현증가를 확인하였다.
또한 SH-SY5Y 인간 신경세포주에 글루코코르티코이드를 처리한 경우 아포시아닌에 의해 NADPH 옥시다제의 핵심 서브유니트인 p47phox의 세포막 이동 억제 (효소 활성화 억제) 현상을 규명하였다. 글루코코르티코이드 처리 조건에서 p47phox 유전자에 대한 siRNA에 의해 세포내 산화성 스트레스 증가가 억제되는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명은 NADPH 옥시다제를 표적으로 하는 만성 스트레스에 의해 그 증상이 촉발되거나 악화될 수 있는 정신질환 중 주요우울증, 불안증, 공포기억, 정신적 공황, 강박장애, 외상후 스트레스장애, 정신분열증 또는 퇴행성 뇌질환 (알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 뇌졸중, ALS 등) 치료제 또는 만성 스트레스에 의해 그 증상이 촉발되거나 악화될 수 있는 정신질환이 발병하기 전 단계에서 상기 질환을 예방할 수 있는 제제 개발에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (23)

  1. (1) 스트레스 민감 반응 완화제를 대량생산하는 단계; 및
    (2) 상기 생산된 스트레스 민감 반응 완화제 중 일부를 추출하여, p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부를 확인하는 단계
    를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법.
  2. (1) 시험물질이 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는지 여부를 확인하는 단계; 및
    (2) 상기 단계에서 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 것으로 확인된 시험물질을 대량생산하는 단계
    를 포함하는, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스트레스 민감 반응은 스트레스에 의해 청반 노르에피네프린(LC-NE: locus ceruleus norepinephrine) 또는 부신피질 자극 호르몬 유리 호르몬(CRH: corticotropin releasing hormone)이 분비되어 직접 또는 간접적으로 발생되는 반응인 것인, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스트레스 민감 반응은 스트레스에 의해 분비된 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 호르몬에 의해 직접 또는 간접적으로 발생되는 반응인 것인, 스트레스 민감 반응 완화제의 제조방법.
  5. p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 스트레스 민감 반응 완화제를 함유하는 스트레스 개선용 식품 또는 사료.
  6. 제5항에 있어서, 상기 스트레스 민감 반응 완화제는 제1항 또는 제2항에 기재된 제조방법에 의해 제조된 것인 스트레스 개선용 식품 또는 사료.
  7. p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 스트레스 장애 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질은 p47phox 또는 p67phox에 대한 siRNA, shRNA, miRNA 또는 항체, 또는 폴리펩타이드인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질은 아포사이닌(apocynin), 4-하이드록시-3'-메톡시-아세토페논, N-바닐릴노난아미드(N-Vanillylnonanamide), 스타우로스포린 (Staurosporine), 네오프테린, 디페닐렌 아이도늄 또는 그 조합인 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 스트레스 장애는 정신적 또는 신체적 만성 스트레스로 인한, 우울증, 불안증, 공포기억, 정신적 공황, 강박장애, 외상후 스트레스 장애, 정신분열증, 스트레스로 인한 두통, 신경변성 질병, 피로 증후군, 식사장애, 신경성 식욕부진, 위염, 위궤양, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병, 뇌졸중 및 ALS로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 조성물.
  11. p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상을 억제하는 물질을 개체에 투여하여 스트레스 장애를 예방 또는 치료하는 방법.
  12. (1) p47phox 또는 p67phox을 발현하는 세포를 제공하는 제1단계;
    (2) 시험물질을 상기 세포에 접촉시키는 제2단계; 및
    (3) 상기 시험물질과 접촉되지 않은 세포와 비교하여 상기 시험물질과 접촉된 세포에서 상기 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 하나 이상이 억제된 시험물질을 후보물질로 선별하는 제3단계를 포함하는,
    스트레스 민감반응 완화제의 스크리닝 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1단계는 글루코코르티코이드를 처리하여 세포의 p47phox 또는 p67phox의 발현을 증가시키는 것이 특징인, 스크리닝 방법.
  14. 제12항에 있어서, p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 또는 기능의 억제 여부는 ROS(Reactive Oxygen Species) 생성을 측정하여 확인하는 것이 특징인, 스크리닝 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 제1단계의 세포는 실험동물의 형태로 제공되는 것이 특징인, 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 실험동물에게 만성 스트레스를 가하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인, 스크리닝 방법.
  17. 개체로부터 분리된 생체 시료의 p47phox 또는 p67phox의 발현, 활성 및 기능 중 어느 하나를 측정하는 단계를 포함하는, 스트레스 민감 반응 또는 만성 스트레스로 인해 발생하는 스트레스 장애 진단을 위한 정보제공방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 생체 시료의 PRX3 또는 TRX2의 발현, 활성 및 기능 중 어느 하나를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 정보제공방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액인 것인 정보제공방법.
  20. 개체로부터 분리된 생체 시료에서 p47phox 또는 p67phox의 농도를 측정하는 것이 특징인, 스트레스 수준 진단 키트.
  21. 제20항에 있어서, 상기 생체 시료의 PRX3 또는 TRX2의 농도를 추가적으로 측정하는 것이 특징인 진단 키트.
  22. 제21항에 있어서, 정상치보다 p47phox 또는 p67phox의 농도가 높거나, 정상치보다 PRX3 또는 TRX2의 농도가 낮은 경우, 스트레스 수준이 상대적으로 높은 것으로 진단하는 것인 진단 키트.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액인 것인 진단 키트.
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DONG KUG CHOI ET AL.: 'Recent developments in the inhibitors of neuroinflammation and neurodegeneration: inflammatory oxidative enzymes as a drug target' EXPERT OPIN. THER. PATENTS vol. 20, no. 11, 2010, ISSN 1354-3776 pages 1531 - 1546 *
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