WO2012076823A1 - Methode de diagnostic in vitro intra-tissulaire pour diagnostiquer les tumeurs du cerveau - Google Patents

Methode de diagnostic in vitro intra-tissulaire pour diagnostiquer les tumeurs du cerveau Download PDF

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WO2012076823A1
WO2012076823A1 PCT/FR2011/052910 FR2011052910W WO2012076823A1 WO 2012076823 A1 WO2012076823 A1 WO 2012076823A1 FR 2011052910 W FR2011052910 W FR 2011052910W WO 2012076823 A1 WO2012076823 A1 WO 2012076823A1
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mir
hsa
sample
ratio
tissue
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PCT/FR2011/052910
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Jean-Paul Issartel
François Berger
Elodie Lages
Audrey Guttin
Michèle EL ATIFI-BOREL
Hélène IPAS
Original Assignee
Universite Joseph Fourier
Centre Hospitalier Universitaire De Grenoble
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • Intra-tissue in vitro diagnostic method for diagnosing brain tumors Intra-tissue in vitro diagnostic method for diagnosing brain tumors
  • the present invention relates to an intra-tissue in vitro diagnostic method for diagnosing brain tumors using miRNAs as biomarkers.
  • CNS tumors of the central nervous system are mostly gliomas (50%), including glioblastoma (GBM) and oligodendroglioma (ODG). These tumors are a major cause of morbidity and mortality and represent a major public health problem. In fact, CNS tumors are the second leading cause of cancer death in children and the third leading cause in adult men (15-34 years). The overall incidence of CNS tumors is close to 7000 new cases detected each year in France. Finally, of the 6 million annual deaths worldwide due to some form of cancer, 1-2% are attributable to CNS tumors (World Health Organization data).
  • Gliomas or glial tumors are classified by the World Health Organization
  • RNAs can regulate gene expression either by degradation of target messenger RNAs or by repression of their translation depending on the degree of complementarity between the RNAs. miRNA and its target mRNA.
  • the microRNAs represent a relatively recent identification class of single-stranded (21 to 25nt), endogenous, non-coding RNAs.
  • the genes responsible for the expression of these miRNAs are previously transcribed in the form of long precursors, themselves cleaved into pre-miRNAs by RNAse III Drosha.
  • the processing of these pre-miRNAs is performed by another RNAse, Dicer, which gives rise to an RNA duplex noted [miRNA: miRNA *].
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • RNAs Since these RNAs play an important role in translational regulation, they are therefore strongly involved in many cellular processes such as development, differentiation, proliferation, apoptosis and stress response, processes often deregulated in tumors.
  • miRNA precursors In humans, the number of genes encoding miRNA precursors currently identified is 1048 (Sanger miRBase version 16, September 2010). Some of these miRNAs have been detected as tumor markers in the context of breast and prostate cancer and are therefore considered to be oncogenic or tumor suppressor miRNAs depending on their expression in tumors and their post-transcriptional role.
  • a method for distinguishing a glioblastoma (GBM) from an oligodendroglioma (ODG) brings a different public health interest than a method that can distinguish only two high-grade tumors of the same nature. Moreover, such a method is not generalizable in the mode of distinguishing tumors of different nature.
  • the present invention relates to a method for in vitro diagnosis of a brain tumor belonging to the group consisting of 2 types of tumors: ODG and GBM, and of tumor type identification, comprising:
  • the present invention is based on the unexpected finding made by the inventors during a scan for measuring the expression levels of 847 human microRNAs in healthy brain tissue and brain tumor tissue (GBM, ODG).
  • the inventors have succeeded in identifying 23 miRNAs which constitute biological indicators (biomarkers) which make it possible, by means of the method described in the present invention, to distinguish a healthy brain tissue, a tissue originating from a glioblastoma tumor. or tissue derived from an oligodendroglioma tumor.
  • nucleotide sequences as well as the accession numbers of 23 miRNAs are present in Table 1 below.
  • the present invention is based on assaying levels of expression of microRNAs in healthy brain tissue, or tissue from a glioblastoma tumor or tissue from an oligodendroglioma tumor. Then the ratios of the expression levels of these microRNAs are calculated by pair of microRNAs. The inventors have found that 21 ratios among those that can be calculated are specific signatures of one or two of the different types of tissue (see Example 1).
  • ratios that are specific for an ODG tumor tissue ratios 1 and 2 of Table 2.
  • the values of the ratios obtained for the ODG tissue are always at least 4 times higher than the values of these ratios calculated in a healthy brain tissue or a tissue originating from a tumor of the glioblastoma type,
  • ratios that are specific for GBM tumor tissue ratios 3 and 4 in Table 2.
  • the values of the ratios obtained for the GBM tissue are always at least 4 times higher than the values of these ratios calculated in healthy brain tissue or tissue derived from an oligodendroglioma tumor.
  • ratios that are specific for glial tumor tissue (GBM or ODG) (ratios 5 to 10 in Table 2).
  • the values of the ratios obtained for the glial tumor tissue are always at least 4 times higher than the values of these ratios calculated in a healthy brain tissue.
  • ratios that are specific for an ODG tumor tissue ratios 11 to 18 in Table 2.
  • the values of the ratios obtained for the ODG tissue are always at least 4 times higher than the values of these ratios calculated in a healthy brain tissue,
  • ratios that are specific for a GBM tumor tissue ratios 19 to 21 in Table 2.
  • the values of the ratios obtained for the GBM tissue are always at least 4 times higher than the values of these ratios calculated in a healthy brain tissue,
  • the presented invention is thus based on the analysis of the expression levels of microRNAs in a tissue suspected to be tumor, then to calculate the values of ratios per pair of microRNAs and to compare the values obtained for the ratios with those of a reference table (see Example 2) which collects the values of the specific ratios calculated for healthy reference tissues, reference GBM tissues, reference ODG tissues.
  • microRNAs in a tissue suspected to be tumor allows, thanks to the present invention, to specify the nature of the tissue analyzed.
  • the present invention relates to a method of in vitro diagnosis of a brain tumor belonging to the group consisting of 2 types of tumors: ODG, GBM, and tumor type identification, comprising :
  • n ° 2 of the expression levels of miRNA pairs selected from group 2 consisting of hsa-miR-210 / hsa-miR-193b and hsa-miR-210 / hsa-miR-423-5p,
  • the miRNAs used in the present invention are referenced in the miRBase database (http://www.mirbase.org/) (miRBase: tools for microRNA genomic, Griffiths-Jones et al., NAR 2008 36 (Database Issue): D154-D158) where the nucleic sequence of a miRNA can be traced by a MIMAT accession number or a uniform annotation.
  • An annotation system was put in place to name the different miRNAs (A uniform ystem for microRNA annotation, Ambros et al, RNA 2003 9 (3): 277-279). In this system, microRNAs are designated by a number.
  • microRNA This identification number is preceded by the abbreviation "miR” or “mir”, which allows a distinction between the mature microRNA (miR) and the precursor loop (hairpin) of the microRNA (mir), respectively corresponding to a number of MIMAT and MI accession.
  • miR mature microRNA
  • shsa-miR-126 means that this mature miRNA comes from the human genome.
  • mature microRNAs can be very close (only one difference basis). In this case, the microRNAs bearing the same number are distinguished from each other by a lower case letter such as a, b, c, for example hsa- miR-26b.
  • a precursor loop can generate, on its side 5 'and its side 3', two mature microRNAs which are distinguished from each other by the annotation "5p” or "3p".
  • "hsa-miR-151-3p” means a mature miRNA from the 3 'side of its precursor.
  • a microRNA precursor loop can derive two mature miRNAs, namely a major product and a minor product. Such a minor miRNA is distinguished from the major miRNA derived from the same precursor by a star followed by the identification number, for example "hsa-miR-425 *" or hsa-miR-425-star.
  • RNA and microRNA may be replaced by each other.
  • the terms glial tumors or gliomas are equivalent.
  • Glioblastomas and oligodendrogliomas are two types of gliomas.
  • Healthy tissue or healthy sampling means non-tumor tissue or non-tumor sample.
  • the measurement of miRNA expression levels can be performed by any conventional method, such as
  • the measurement of the microRNAs can be performed individually and independently or simultaneously without affecting the analysis method described by the present invention.
  • the level of expression of miRNAs can be measured by the "microarray” technique.
  • the technique of the "DNA chip” is well known to those skilled in the art. This is the hybridization of miRNAs extracted on a solid support composed of a nylon membrane, a surface of silicon or glass, optionally nano-beads or particles, comprising oligonucleotides of known sequences fixed on the support or adherents to it.
  • oligonucleotides fixed with the sequences of microRNAs or their conversion products makes it possible to generate a signal (fluorescence, luminescence, radioactivity, electrical signal, etc.) according to the techniques of labeling used at the level of immobilized oligonucleotides (DNA chips).
  • This signal is detected by a specific device and a value of intensity of this own signal for each miRNA is thus recorded.
  • chips for miRNA detection are already on the market, such as GeneChip® miRNA marketed by Affymetrix, miRcury arrays by Exiqon, miRXplore microarrays by Miltenyi.
  • the miRNAs are extracted and purified from a sample, isolated from each other by methods provided by sequencing equipment suppliers such as Roche, Invitrogen.
  • This kind of analysis consists in individualizing the molecules of the various microRNAs, performing an amplification step and sequencing the products ("nucleic acid clones") thus generated.
  • the realization of many sequences to identify each of these "clones" makes it possible to generate a listing of the microRNAs present in a sample and to quantify each of these miRNAs simply by counting how many times each sequence is found in the listing. detailed.
  • biological sample is meant a tissue sample, including brain tissue obtained by excision.
  • the sample can be frozen or fixed in paraffin (tissue fragment fixed by chemical treatment and included in a paraffin block according to standard anatomopathology techniques).
  • the biological sample may also be a sample of biological fluids, including a blood sample (in non-coagulated form or its derivatives, plasma or serum).
  • a brain tissue sample may be central nervous system tissue from the cerebral cortex, cerebellar cortex, basal ganglia, or brainstem nuclei.
  • a biological sample from a patient suspected of having one of the above brain tumors is a brain tissue sample, it is tissue that has been removed, biopsied or excised from the operating room or any other intratumoral sampling method adapted from the tumor site suspected of a patient.
  • the suspected tumor site is previously identified by a conventional method, such as an MRI, a Pet Scan, or a conventional CT scanner.
  • a biological sample from a patient suspected of having one of the above brain tumors is a blood sample
  • this sample is obtained from a patient by blood sampling according to conventional methods.
  • a healthy reference tissue can be a brain tissue devoid of any tumor character after histological analysis by anatomopathologists.
  • the reference healthy tissue may be central nervous system tissue from the cerebral cortex, cerebellar cortex, basal ganglia, or brainstem nuclei.
  • the healthy tissue of reference is preferably taken from the same patient (healthy tissue peripheral zone to the tumor). Alternatively it may consist of encephalic fragments obtained after surgery called cortectomy performed on individuals without brain tumors but in the context of intervention for the treatment of epilepsy or following traumatic brain injury.
  • Reference healthy tissue may also be a sample of body fluids, including blood serum or blood plasma taken from a healthy person, including a person with no cancer.
  • Reference ODG tissue is a tissue from a patient in which the presence of oligodendrogliomas has been certified by pathological analysis.
  • a reference GBM tissue is a tissue from a patient in which the presence of glioblastomas has been diagnosed by pathological analysis.
  • Reference ODG tissue or “reference GBM tissue” may be a glial tumor fragment obtained by excision in a patient and whose tumor type has been certified by pathology analysis.
  • oligodendrogliomas or glioblastomas can also be confirmed by molecular analyzes such as, for example, the analysis of the gene expression profiles of these tumor tissues.
  • the tumors are then characterized using the Li et al classification method (Li A, Walling J, Ahn S, Kotliarov Y, Su Q, Quezado M, Oberholtzer JC, Park J, Zenklusen JC, Fine HA, Cancer Res. Mar. 69 (5): 2091-9) which relies on the use of the expression levels of a set of 54 genes.
  • Glioblastomas or oligodendrogliomas are classified respectively in groups G and O of the resulting publication.
  • a ratio of the expression levels of two microRNAs measured in a sample is considered to be significantly different from a corresponding ratio previously established in a reference tissue, when the ratio obtained in said sample is 4 times greater or 4 times lower than the ratio previously established in said reference tissue.
  • a ratio obtained in a sample is not considered as different from a corresponding ratio previously established in a reference tissue, when the ratio obtained in said sample is not 4 times greater or 4 times lower than the ratio previously established in said reference tissue.
  • the ratio of the expression levels of a pair of miRNAs belonging to group 1 obtained from an ODG tissue is at least 4 times greater than that obtained from a healthy tissue, or that obtained from a GBM tissue while this ratio is not different from the ratio obtained from a reference ODG tissue.
  • the ratio of the expression levels of a pair of miRNAs belonging to group 2 obtained from GBM tissue is at least 4 times greater than that obtained from healthy tissue, or that obtained from a tissue of GBM tissue. ODG while this ratio is not different from the ratio obtained from a reference GBM tissue.
  • the deduction of the presence of GBM in the sample from a patient suspected of having one of the above-mentioned tumors is made
  • the in vitro diagnostic method according to the invention additionally comprises the measurement of a ratio of the group 3 of expression levels of miRNA pairs extracted from a biological sample originating from a suspected patient.
  • said ratio being the ratio of expression levels of couples selected from hsa-miR-423-5p / hsa-miR-491-5p, hsa-miR-210 / hsa- miR-491-5p, hsa-miR-92a / hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a / hsa-miR-132, hsa-miR-320a / hsa- miR-491-5p and hsa-miR- 320c / hsa-miR-491-5p.
  • This advantageous embodiment is based on the fact that the inventors, in addition to the groups 1 and 2 of the miRNA pairs, have been able to identify a group 3 of miRNA pairs whose ratios of expression levels in gliomas, otherwise Oligodendrogliomas and glioblastomas, are said to be significantly different from those measured in healthy tissue.
  • the ratio of expression levels of such a pair of miRNAs namely hsa-miR-423-5p / hsa-miR-491-5p, hsa-miR-210 / hsa-miR-491-5p, hsa-miR -92a / hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a / hsa-miR-132, hsa-miR-320a / hsa-miR-491-5p and hsa-miR-320c / hsa-miR-491-5p , obtained in an ODG tissue or GBM tissue is at least 4 times higher than that obtained in healthy tissue.
  • this ratio obtained from a sample from a patient makes it possible to indicate the possible presence of a glioma in the above sample.
  • the aforesaid method according to the invention comprises:
  • n ° 3 of the expression levels of couples selected from hsa-miR-423-5p / hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210 / hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a / hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a / hsa- miR-132, hsa-miR-320a / hsa-miR-491-5p and hsa-miR-320c / hsa-miR-491-5p,
  • the deduction of the presence of ODG in the sample from a patient suspected of having one of the above-mentioned tumors is made when the ratio No. 1 measured in said sample is not at least 4 times greater or at least 4 times lower than that obtained in a reference ODG tissue, or when the ratio No. 2 measured in said sample is at least 4 times lower than that obtained in a reference GBM tissue, and
  • the deduction of the presence of GBM in the sample from a patient suspected of having one of the above-mentioned tumors is made
  • the in vitro diagnostic method according to the invention further comprises the measurement of a group 4 ratio of expression levels of miRNA pairs extracted from a biological sample from a suspected patient.
  • said ratio being the ratio of the expression levels of couples selected from hsa-miR-320a / hsa-miR-127-3p, hsa-miR-320b / hsa- miR-127-3p, hsa-miR-320c / hsa-miR-127-3p, hsa-miR-17 / hsa-miR-107, hsa-miR-106a / hsa- miR-23b, hsa-miR-17 / hsa-miR-23b, hsa-miR-345 / hsa-miR-574-3p, hsa-miR-191 /
  • the value of a ratio of group 4 obtained for the ODG tissue is always at least 4 times higher than the values of this ratio calculated in a healthy brain tissue. This value allows to indicate the possible presence of an ODG tissue in a sample from a patient suspected of having a glial tumor.
  • the aforesaid method according to the invention comprises:
  • n ° 3 of the expression levels of couples selected from hsa-miR-423-5p / hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210 / hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a / hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a / hsa- miR-132, hsa-miR-320a / hsa-miR-491-5p and hsa-miR-320c / hsa-miR-491-5p,
  • n ° 2 of the expression levels of couples selected from hsa-miR-210 / hsa- miR-193b and hsa-miR-210 / hsa-miR-423-5p,
  • the in vitro diagnostic method according to the invention further comprises measuring a ratio of the group of expression levels of miRNA pairs extracted from a biological sample from a patient. suspected to have one of the above brain tumors, said ratio being the ratio of expression levels of couples selected from hsa-miR-345 / hsa-miR-324-5p, hsa-miR-345 / hsa-miR-185 and hsa -mir-345 / hsa-miR-320d.
  • the value of a ratio of the group 5 obtained for the GBM tissue is always at least 4 times greater than the values of this ratio calculated in a healthy brain tissue. This value indicates the possible presence of GBM tissue in a sample from a patient suspected of having a glial tumor.
  • the aforesaid method according to the invention comprises:
  • n ° 3 of the expression levels of couples selected from hsa-miR-423-5p / hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210 / hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a / hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a / hsa- miR-132, hsa-miR-320a / hsa-miR-491-5p and hsa-miR-320c / hsa-miR-491-5p
  • the in vitro diagnostic method of the invention further comprises the measurement in a biological sample from a patient suspected of having one of the above brain tumors:
  • the aforesaid method according to the invention comprises:
  • n ° 3 of the expression levels of couples selected from hsa-miR-423-5p / hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210 / hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a / hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a / hsa- miR-132, hsa-miR-320a / hsa-miR-491-5p and hsa-miR-320c / hsa-miR-491-5p
  • n ° 2 of the expression levels of couples selected from hsa-miR-210 / hsa- miR-193b and hsa-miR-210 / hsa-miR-423-5p,
  • FIG. 1a illustrates the comparison of the values of the 21 ratios of the microRNA pairs assayed in the suspected sample A (shown in Table 3) plotted on the ordinate, with the values of the ratios in a reference healthy tissue (values of the Table 2) reported on the abscissa.
  • the ratio values for the suspected sample A are correlated with the respective values for a reference healthy tissue.
  • the line shown in the graph illustrates the theoretical situation of perfect correlation between the values obtained for the sample A suspected and those of the reference sample.
  • Figure 1b illustrates the comparison of the values of the 21 ratios of the microRNA pairs assayed in the suspected sample A (shown in Table 3) plotted on the ordinate, with the values of the ratios in a reference ODG tissue (values of the Table 2) reported on the abscissa.
  • the ratio values for the suspected sample A are correlated with the respective values for a reference ODG tissue.
  • the line shown in the graph illustrates the theoretical situation of perfect correlation between the values obtained for the sample A suspected and those of the reference sample.
  • FIG. 1 illustrates the comparison of the values of the 21 ratios of the microRNA pairs assayed in the suspected sample A (shown in Table 3) plotted on the ordinate, with the values of the ratios in a reference GBM tissue (values of the Table 2) reported on the abscissa.
  • the ratio values for the suspected sample A are correlated with the respective values for a reference GBM fabric.
  • the line shown in the graph illustrates the theoretical situation of perfect correlation between the values obtained for the sample A suspected and those of the reference sample.
  • FIG. 2a illustrates the comparison of the values of the 21 ratios of the microRNA pairs assayed in the suspected sample B (shown in Table 3) plotted on the ordinate, with the values of the ratios in a reference healthy tissue (values of the Table 2) reported on the abscissa.
  • the ratio values for the suspected sample B are correlated with the respective values for a reference healthy tissue.
  • the line shown in the graph illustrates the theoretical situation of perfect correlation between the values obtained for the suspect sample B and those of the reference sample.
  • Figure 2b illustrates the comparison of the 21 ratios of the microRNA pairs assayed in the suspected sample B (shown in Table 3) plotted on the ordinate, with the values of the ratios in a reference ODG tissue (values from Table 2) reported on the abscissa.
  • the ratio values for the suspected sample B are correlated with the respective values for a reference ODG tissue.
  • the right reported in the graph illustrates the theoretical situation of perfect correlation between the values obtained for the suspected sample B and those of the reference sample.
  • Figure 2c illustrates the comparison of the 21 ratios of the microRNA pairs assayed in the suspected sample B (shown in Table 3) plotted on the ordinate, with the values of the ratios in a reference GBM tissue (values of Table 2) reported on the abscissa.
  • the ratio values for the suspected sample B are correlated with the respective values for a reference GBM fabric.
  • the line shown in the graph illustrates the theoretical situation of perfect correlation between the values obtained for the suspect sample B and those of the reference sample.
  • FIG. 3a illustrates the comparison of the values of the 21 ratios of the microRNA pairs assayed in the suspected sample C (shown in Table 3) plotted on the ordinate, with the values of the ratios in a reference healthy tissue (values of the Table 2) reported on the abscissa.
  • the ratio values for the suspected sample C are correlated with the respective values for a reference healthy tissue.
  • the line shown in the graph illustrates the theoretical situation of perfect correlation between the values obtained for the sample C suspected and those of the reference sample.
  • Figure 3b illustrates the comparison of the 21 ratios of the microRNA pairs assayed in the suspected sample C (shown in Table 3) plotted on the ordinate, with the values of the ratios in a reference ODG tissue (values of Table 2) reported on the abscissa.
  • the ratio values for the suspected sample C are correlated with the respective values for a reference ODG tissue.
  • the line shown in the graph illustrates the theoretical situation of perfect correlation between the values obtained for the sample C suspected and those of the reference sample.
  • FIG. 3cc illustrates the comparison of the values of the 21 ratios of the microRNA pairs assayed in the suspected sample C (shown in Table 3) plotted on the ordinate, with the values of the ratios in a reference GBM tissue (values of the Table 2) reported on the abscissa.
  • the ratio values for the suspected sample C are correlated with the respective values for a reference GBM fabric.
  • the line shown in the graph illustrates the theoretical situation of perfect correlation between the values obtained for the sample C suspected and those of the reference sample.
  • Figure 4 shows a two-dimensional graph, in which the hsa-miR-210 / hsa-miR-491-5p ratio values measured in the different samples are plotted as abscissa; and the hsa-miR-92a / hsa-miR-127-3p ratio values measured in these samples are plotted on the ordinate.
  • the diamonds represent the tissue samples healthy. Squares represent ODG samples. The triangles represent GBM samples.
  • Figure 5 shows a two-dimensional graph, in which the hsa-miR-320c / hsa-miR-127-3p ratio values measured in the different samples are plotted as abscissa; and the hsa-miR-210 / hsa-miR-491-5p ratio values measured in these samples are plotted on the ordinate.
  • the diamonds represent samples of healthy tissue. Squares represent ODG samples. The triangles represent GBM samples.
  • Figure 6 shows a two-dimensional graph, in which the hsa-miR-17 / hsa-miR-494 ratio values measured in the different samples are plotted as abscissa; and the hsa-miR-210 / hsa-miR-193b ratio values measured in these samples are plotted on the ordinate.
  • the diamonds represent samples of healthy tissue. Squares represent ODG samples. The triangles represent GBM samples.
  • Figure 7 shows a two-dimensional graph, in which the hsa-miR-320c / hsa-miR-127-3p ratio values measured in the different samples are plotted as abscissa; and the hsa-miR-92a / hsa-miR-127-3p ratio values measured in these samples are plotted on the ordinate.
  • the diamonds represent samples of healthy tissue. Squares represent ODG samples. The triangles represent GBM samples.
  • Figure 8 shows a two-dimensional graph, in which the hsa-miR-210 / hsa-miR-491-5p ratio values measured in the different samples are plotted as abscissa; and the hsa-miR-106a / hsa-miR-23b ratio values measured in these samples are plotted on the ordinate.
  • the diamonds represent samples of healthy tissue. Squares represent ODG samples. The triangles represent GBM samples.
  • Tumor samples of glioblastoma, oligodendrogliomas and meningiomas, as well as samples of healthy tissue (cortectomies) are obtained after excision by neurosurgeons in the operating theater of Grenoble University Hospital and are immediately frozen at -80 ° C. Tissue sections approximately 40 ⁇ m thick are then made using a cryotome in sufficient number to obtain about 80mg of tissue and stored at -80 ° C until RNA extraction.
  • RNA samples are taken from patients on PAXGene Blood RNA sampling tubes (PreAnalytix-Qiagen - BD company). The total lysis of the circulating cells is carried out and the RNAs are collected by centrifugation and purified according to the indications of the supplier.
  • the method used is directly based on that described by Skog et al (Skog J, Wiingering T, van Rijn S, Meijer DH, Gainche Sena-Esteves M, Curry WT Jr, Carter BS, Krichevsky AM, Breakefield XO Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers (Skog et al., Nat Cell Biol., 2008 Dec; 12): 1470-6, Epub 2008 Nov 16).
  • the microvesicles are purified from the sera by centrifugation and microfiltration.
  • the sera are centrifuged a first time for 10 min at 300 g, then the supernatants are then centrifuged for 20 min at 17000 g and filtered through a 0.22 micron filter.
  • the micro vesicles are obtained by ultracentrifugation of the filtrate at 110000g for 70 min.
  • the pellet is finally resuspended in phosphate buffer (PBS) and the RNAs are extracted according to the protocol described below.
  • PBS phosphate buffer
  • RNAs are extracted using the hsa-miRVana TM kit (Ambion, ABI) to separate long RNAs (size> 25 Ont) from short RNAs (size ⁇ 25 Ont) according to the supplier's recommendations. Briefly, the tissue is first lyzed, the RNA is then precipitated after addition of sodium acetate and ethanol, extracted in the presence of a phenol / chloroform mixture, separated according to their size on chromatographic columns and then eluted.
  • RNAs are then quantified by measuring the OD at 260 nm using the Nanodrop ND-1000 spectrophotometer and a quality control of these RNAs is carried out by electrophoretic migration in a polymer gel on the Bio Analyzer 2100 using the RNA 6000 kit. nano LabChip® (Agilent).
  • RNA assay by DNA hybridization The short RNAs (less than 250 bases in size) obtained in the previous step are used for the GeneChip miRNA Affymetrix DNA microarray analysis.
  • the first step is to add a poly-A end at the 3 'position of the RNAs.
  • the second step is to carry out the labeling of the RNAs. For this, a ligation reaction will be made to add biotinylated DNA to the RNAs (for example with the labeling and detection reagents of the Flash Tag HSR kit from Genisphere, Hatfield, USA). Once this step is completed, hybridization can take place with the probes on the chip. After the hybridization, there is a step of amplification of the marking and washing that are done before the chip is scanned. Finally the chip will be scanned and we get an image of each chip that will have to be processed to have an intensity value corresponding to the RNA / probe hybridization for each micro RNA.
  • the results can also be generated by assaying with RT-Q-PCR, any other type of DNA chip from any vendor or any other assay method.
  • the analyzes can be performed on biological fluids (blood or subfraction for example).
  • miRNAs The expression of miRNAs is quantified by the quantitative PCR technique using the Applied Biosystems distributed kits, specific for mature miRNAs. Initially, 80ng short rRNAs are inversely transcribed (in single-stranded cDNA) in the presence of loop primers, which confer specificity for the quantification of mature miRNA expression. Real-time PCR is then performed using the primers provided in the kits.
  • One of the primers comprises fluorescent groups (so-called Taqman® probe) which makes it possible to perform a quantitative measurement using a suitable fluorimeter such as the Stratagene Mx3005 station.
  • the detection threshold is determined initially by the user at the beginning of exponential phase. The value of Ct corresponds to the number of cycles from which the fluorescence exceeds this detection threshold.
  • This Ct value is proportional to the amount of cDNA initially present in the sample.
  • An abacus of ratios of miRNA pair expression levels (Table 2 below) is derived from the ratios measured in a reference healthy tissue (N), a reference ODG tissue (ODG), a tissue of GBM reference (GBM)
  • the reference healthy tissue, the reference ODG tissue and the reference GBM tissue are obtained as described in Example 1 (Part 1.1).
  • the expression levels of the miRNAs are measured according to the method described in Example 1. To increase readability and in order to have ratio values greater than 1 in most cases, the calculated values were multiplied by a factor of 10 .
  • group 1 type of glioma :: ODG
  • group 2 type of glioma:: GBM
  • group 3 glioma markers
  • group 4 glioma markers (ODG)
  • group5 glioma markers (GBM)
  • Table 2 The use of the reference values established in the chart (Table 2) in carrying out analyzes in order to characterize a sample suspected of being tumor is illustrated in Examples 3 to 5 below.
  • Example 3
  • Example 3 three separate samples (A, B or C) are analyzed. The respective levels of each of the 23 miR A of Table 1 are measured in these samples. The values of the 21 ratios described in Table 2 between microRNAs assayed in the same sample are then calculated. The results obtained are presented in Table 3. By comparing the values of Table 3 with those shown in Table 2, the values of the ratios in the sample A are very close to the values of the characteristic ratios of a normal sample. It can be concluded that Sample A is normal brain tissue.
  • the respective values of the microRNA ratios for sample B are very similar to the characteristic values of the ODGs. Sample B is therefore diagnosed as ODG.
  • the respective values of the microRNA ratios for sample C are very similar to the characteristic values of GBMs. Sample C is therefore diagnosed as GBM.
  • Example 4 the exploration is conducted in the same manner as in Example 3 above.
  • a graphical representation of the results obtained preferred by the inventors is proposed as an example.
  • the values of the ratios between microRNA pairs assayed in the same sample are plotted in two-dimensional graphs ( Figures 1a, 1b, 1c for sample A, Figure 2a, 2b, 2c for sample B, Figure 3a, 3b, 3c for sample C) in which the values of the ratios of the reference samples (values in Table 2) are plotted as abscissa and the values of identical ratios obtained for the analyzed samples (Table 3) are plotted on the ordinate.
  • the ratio values for a suspected sample are correlated with the respective values for a reference healthy tissue, a reference ODG tissue and a reference GBM tissue.
  • the visual reading of the graphs in FIG. 1 clearly shows that the sample A is very similar to the reference healthy tissue and is clearly distinguishable from the ODG or GBM tissues. It is therefore deduced that sample A is healthy brain tissue.
  • sample B is ODG tissue
  • sample C is GBM tissue.
  • Example 5 the values of two ratios between microRNAs from the same sample are used to create a graph that can distinguish very quickly tissue types.
  • the value obtained for a given ratio between a pair of microRNAs and the ordinate values is plotted on the abscissa.
  • a second ratio for another pair of microRNAs is plotted on the abscissa.
  • Each sample is represented by a dot on the graph.
  • This graph makes it possible to constitute, as shown in FIGS. 4-8, clouds of points grouped in a coherent manner according to the type of fabric.
  • healthy tissues form a set of coordinate points very distinct from glial tumors and ODG tissues are grouped together in a very distinct coordinate zone of the cloud of points corresponding to GBM tissues.
  • any unknown sample it is possible on the basis of the values of a pair of ratios between miRNA to specify by this graphical representation whether the sample shows characteristics identical to those of a healthy tissue, an ODG tissue or a GBM fabric and therefore to deduce the nature of this sample analyzed.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro d'une tumeur cérébrale appartenant au groupe constitué de 2 types de tumeurs : ODG, GBM, et d'identification du type de la tumeur, comprenant la mesure d'au moins deux ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales.

Description

Méthode de diagnostic in vitro intra-tissulaire pour diagnostiquer les tumeurs du cerveau
La présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro intra-tissulaire pour diagnostiquer les tumeurs du cerveau, utilisant des miARNs comme biomarqueurs.
Les tumeurs du système nerveux central (SNC) sont pour la plupart des gliomes (50%), regroupant les glioblastomes (GBM) et les oligodendrogliomes (ODG). Ces tumeurs constituent une cause importante de morbidité et de mortalité et représentent un problème important de santé publique. En effet, les tumeurs du SNC constituent la deuxième cause de décès par cancer chez les enfants et la troisième cause chez l'homme adulte (15-34 ans). L'incidence globale des tumeurs du SNC est voisine de 7000 nouveaux cas dépistés chaque année en France. Enfin, sur 6 millions de décès annuels dans le monde à cause d'une forme quelconque de cancer, 1 à 2 % sont imputables aux tumeurs du SNC (Données de l'Organisation Mondiale de la Santé).
Les gliomes ou tumeurs gliales sont classés par l'Organisation Mondiale de la Santé
(OMS) en 4 grades histologiques, le grade indiquant principalement le degré de malignité. Les oligodendrogliomes (ODG) de grade II, développés à partir des oligodendrocytes, sont des gliomes de bas grade. En revanche, les glioblastomes (GBM) de grade IV, développés à partir des astrocytes, sont des gliomes de haut grade. Pour les oligodendrogliomes, la médiane de survie est d'environ 7 ans alors qu'elle n'est que d'environ 1 an pour les glioblastomes après traitement ; diagnostiquer précisément la nature de la tumeur est donc d'une importance décisive. L'exérèse de la tumeur constitue un moyen, a priori radical, pour éradiquer une tumeur mais dans la pratique clinique, cette stratégie reste imparfaite. L'ablation de la tumeur se doit d'être exhaustive, ce qui est loin d'être le cas soit parce que les tumeurs au caractère infiltrant ont « irradié» des cellules pré-tumorales dans les régions cérébrales voisines à la tumeur primitive, soit parce que les limites de la tumeur sont mal évaluées lors du diagnostic.
A l'heure actuelle, en dehors de l'analyse histologique réalisée par l'anatomo- pathologiste, il n'existe que quelques rares tests-diagnostics basés sur des approches moléculaires. Les observations microscopiques de la morphologie des cellules sont complétées dans quelques laboratoires par la recherche de certains marqueurs protéiques à l'aide d'anticorps spécifiques. Ces tests immunohistochimiques présentent néanmoins de nombreux inconvénients pour l'instant. Ils n'ont qu'un faible débit de productivité (ils ne permettent la détection que d'un seul antigène à la fois), ne permettent pas de distinguer sans ambiguïté les différents types de cellules tumorales et n'offrent que de médiocres possibilités de détection quantitative des marqueurs. Les diagnostics réalisés sur la détection de marqueurs génétiques (tels que les pertes d'hétérozygotie lp et 19q dans les oligodendrogliomes) sont actuellement peu usités ou lourd à mettre en oeuvre.
Ces dernières années, les scientifiques ont découvert qu'une classe d'ARN, désignés miARNs ou microARNs, peut réguler l'expression des gènes soit par dégradation d'ARN messagers cibles, soit par répression de leur traduction suivant le degré de complémentarité entre le miARN et son ARNm cible.
Les microARNs (miARN) représentent une classe d'ARN simple brin de petite taille (21 à 25nt), endogènes, non codants, d'identification relativement récente. Les gènes responsables de l'expression de ces miARNs sont préalablement transcrits sous forme de longs précurseurs, eux-mêmes clivés en pré-miARN par la RNAse III Drosha. La maturation de ces pré-miARN est effectuée par une autre RNAse, Dicer, qui donne lieu à un duplex d'ARN noté [miARN : miARN*]. Seul l'un des 2 brins, le brin mature, participe au complexe ribonucléoprotéique RISC (RNA-induced silencing complex) pour fonctionner comme régulateur post-transcriptionnel (Bartel et al., Cell, 2004. 116(2) : 281-97).
Ces ARNs jouant un rôle important dans la régulation traductionnelle, ils sont donc fortement impliqués dans de nombreux processus cellulaires tels que le développement, la différenciation, la prolifération, l'apoptose et la réponse aux stress, processus souvent dérégulés dans les tumeurs.
De nombreux travaux scientifiques ont été consacrés au rôle des miARN dans les processus d'oncogenèse (Benard, J. and S. Douc-Rasy, Bull Cancer, 2005. 92(9) : p. 757-62; Hammond Curr Opin Genêt Dev, 2006. 16(1) : p. 4-9). Maintenant, il est reconnu que des miARNs sont activement impliqués dans le développement des cancers.
Chez l'Homme, le nombre de gènes codant les précurseurs de miARNs actuellement identifiés est de 1048 (Sanger miRBase version 16, septembre 2010). Certains de ces miARNs ont été détectés comme marqueurs tumoraux dans le contexte des cancers du sein et de la prostate et sont donc considérés comme des miARNs oncogènes ou suppresseurs de tumeur suivant leur expression dans les tumeurs et leur rôle post-transcriptionnel.
Dans les dernières années, l'altération éventuelle des niveaux d'expression des miARNs dans les tumeurs gliales a déjà fait l'objet de plusieurs publications scientifiques.
Une publication de Ciafre et al. en 2005 (Biochem Biophys Res Commun. 2005. Sep
9 ; 334(4) : 1351-8) compare les niveaux d'expression de 245 miARNs dans les glioblastomes et dans les tissus normaux, et met en évidence un profil d'expression distinct de ces miARNs dans les glioblastomes par rapport au profil d'expression dans les tissus normaux. Cette publication décrit que miR-221 est surexprimé dans les glioblastomes par rapport aux tissus normaux, alors que miR-128, miR-181a, miR181b et miR181c sont sous exprimés dans les glioblastomes.
Au même moment, Chen (N Engl J Med, 2005. 353 (17) : 1768-71) décrit que miR-21 est fortement surexprimé dans les glioblastomes par rapport aux tissus normaux.
Un autre balayage des niveaux d'expression de 192 miARNs, dans les tissus de tumeurs gliales et des tissus normaux, a été effectué par Silber et al. en 2008 (BMC Med. 2008. Jun 24 ; 6 : 14.). Cette étude vise à analyser une modification éventuelle du profil d'expression des miARNs dans les astrocytomes anaplasiques (grade III) ou les glioblastomes (grade IV), de tumeurs de différents grades ayant les mêmes origines cellulaires. Cette étude montre un profil d'expression modifié des miARNs dans les astrocytomes anaplasiques et les glioblastomes, par rapport aux tissus normaux. Les miARNs mentionnés dans cette publication, dont l'expression est modifiée, ne sont pas identiques à ceux déjà mentionnés dans les publications antérieures.
Cependant, jusqu'à présent, d'une part aucune étude antérieure n'a fait un balayage exhaustif, car l'ensemble des microARNs exprimés dans les cellules humaines n'est jamais exploré, et d'autre part l'enseignement de l'art antérieur est divergent.
De plus, dans la plupart des cas, ces études ne permettent que de diagnostiquer un gliome vis-à-vis de tissu sain ou tissu péritumoral, mais ne permettent pas de distinguer un glioblastome d'un oligodendrogliome, deux tumeurs dont les origines cellulaires et pronostics sont très différents, et nécessitant également des traitements bien distincts.
Bien que l'étude de Silber et al. (BMC Med. 2008. Jun 24 ; 6 : 14.) ait montré que les profils d'expression de miARNs mesurés dans les astrocytomes anaplasiques et ceux mesurés dans les glioblastomes sont différents, ces tumeurs, respectivement en grade III et grade IV, sont en effet des tumeurs de même nature, car elles sont développées toutes les deux à partir des astrocytes. En effet, les astrocytomes anaplasiques peuvent évoluer rapidement vers un glioblastome.
Une méthode permettant de distinguer un glioblastome (GBM) d'un oligodendrogliome (ODG) apporte un intérêt sur le plan de santé publique différent de celui d'une méthode ne permettant de distinguer que deux tumeurs de grade élevé et de même nature. Par ailleurs, un tel procédé n'est pas généralisable dans le mode de distinction de tumeurs de nature différente.
En effet, aucune de ces études antérieures ne permet de diagnostiquer précisément et rapidement la présence d'un glioblastome, d'un oligodendrogliome,chez un patient, à partir de l'analyse d'un groupe de biomarqueurs. Il existe une grande nécessité de développer une méthode de diagnostic capable de distinguer entre un oligodendrogliome et un glioblastome, permettant à un patient de recevoir des soins correspondant à son état physique et d'augmenter ses chances de survie. La présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro d'une tumeur cérébrale appartenant au groupe constitué de 2 types de tumeurs : ODG et GBM, et d'identification du type de la tumeur, comprenant :
(i) la mesure d'au moins deux ratios des niveaux d'expression de couples de miAR s extraits d'un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, lesdits deux ratios des niveaux d'expression étant notamment :
1- un ratio des niveaux d'expression d'un couple de miR A, ledit ratio étant spécifique des ODG, et
2- un ratio des niveaux d'expression d'un couple de miRNA, ledit ratio étant spécifique des GBM,
(ii) la comparaison des susdits ratios mesurés dans ledit échantillon avec ceux obtenus respectivement dans un tissus sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
La présente invention repose sur la constatation inattendue faite par les Inventeurs au cours d'un balayage destiné à mesurer les niveaux d'expression de 847 microARNs humains dans des tissus de cerveaux sains et des tissus de tumeurs cérébrales (GBM, ODG).
A partir de ce balayage, les Inventeurs ont réussi à identifier 23 miARNs qui constituent des indicateurs biologiques (biomarqueurs) qui permettent grâce à la méthode décrite dans la présente invention de distinguer un tissu cérébral sain, un tissu provenant d'une tumeur de type glioblastome ou un tissu provenant d'une tumeur de type oligodendrogliome.
Les séquences nucléotidiques ainsi que les numéros d'accession de 23 miARNs sont présents dans le tableau 1 ci-dessous.
De manière générale, la présente invention repose sur le dosage des niveaux d'expression des 23 microARNs dans un tissu cérébral sain, ou un tissu provenant d'une tumeur de type glioblastome ou un tissu provenant d'une tumeur de type oligodendrogliome. Ensuite les ratios des niveaux d'expression de ces microARN sont calculés par couple de microRNAs. Les inventeurs ont fait la constatation que 21 ratios parmi ceux qui peuvent être calculés constituent des signatures spécifiques d'un seul ou de deux des différents types de tissus (cf exemple 1).
Ainsi, parmi ces 21 ratios, on distingue :
1. des ratios qui sont spécifiques d'un tissu de tumeur ODG (ratios 1 et 2 du tableau 2). Les valeurs des ratios obtenus pour le tissu ODG sont toujours 4 fois supérieures au moins aux valeurs de ces ratios calculés dans un tissu cérébral sain ou un tissu provenant d'une tumeur de type glioblastome,
2. des ratios qui sont spécifiques d'un tissu de tumeur GBM (ratios 3 et 4 du tableau 2). Les valeurs des ratios obtenus pour le tissu GBM sont toujours 4 fois supérieures au moins aux valeurs de ces ratios calculés dans un tissu cérébral sain ou un tissu provenant d'une tumeur de type oligodendrogliome.
3. des ratios qui sont spécifiques d'un tissu de tumeur gliale (GBM ou ODG) (ratios 5 à 10 du tableau 2). Les valeurs des ratios obtenus pour le tissu de tumeur gliale est toujours 4 fois supérieure au moins aux valeurs de ces ratios calculés dans un tissu cérébral sain.
4. des ratios qui sont spécifiques d'un tissu de tumeur ODG (ratios 11 à 18 du tableau 2). Les valeurs des ratios obtenus pour le tissu ODG sont toujours 4 fois supérieures au moins aux valeurs de ces ratios calculés dans un tissu cérébral sain,
5. des ratios qui sont spécifiques d'un tissu de tumeur GBM (ratios 19 à 21 du tableau 2). Les valeurs des ratios obtenus pour le tissu GBM sont toujours 4 fois supérieures au moins aux valeurs de ces ratios calculés dans un tissu cérébral sain,
L'invention présentée repose donc sur l'analyse des niveaux d'expression des microARN dans un tissu suspecté d'être tumoral, puis de calculer les valeurs des ratios par couples de microARN et de comparer les valeurs obtenus pour les ratios avec celles d'un tableau de référence (cf exemple 2) qui collige les valeurs des ratios spécifiques calculées pour des tissus sains de référence, des tissus GBM de référence, des tissus ODG de référence.
L'analyse des niveaux d'expression des microARN dans un tissu suspecté d'être tumoral permet grâce à la présente invention de spécifier la nature du tissu analysé.
(i) Lorsque les valeurs calculées pour les ratios 5 à 10 sont signifïcativement différentes de celles des ratios obtenus pour les tissus sains, mais voisines de celles des ratios pour les GBM ou les ODG, alors le tissu est confirmé comme tumoral (sans précision du type de tumeur).
(ii) Lorsque les valeurs calculées pour les ratios 1 et 2 sont signifïcativement différentes de celles des ratios obtenus pour les tissus sains et les GBM, mais voisines de celles des ratios pour les ODG, alors le tissu est confirmé comme tumoral et présentant un ODG.
(iii) Lorsque les valeurs calculées pour les ratios 3 et 4 sont signifïcativement différentes de celles des ratios obtenus pour les tissus sains et les ODG, mais voisines de celles des ratios pour les GBM, alors le tissu est confirmé comme tumoral et présentant un GBM.
(iv) Lorsque les valeurs calculées pour les ratios 11 à 21 sont signifïcativement différentes de celles des ratios obtenus pour les tissus sains, et sont voisines de celles des ratios pour les ODG, alors le tissu est confirmé comme tumoral et présentant un ODG (ratios 11 à 18), ou sont signifïcativement différentes de celles des ratios obtenus pour les tissus sains, et sont voisines de celles des ratios pour les GBM, alors le tissu est confirmé comme tumoral et présentant un GBM (ratios 19 à 21).
Dans un mode de réalisation de l'invention, la présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro d'une tumeur cérébrale appartenant au groupe constitué de 2 types de tumeurs : ODG, GBM, et d'identification du type de la tumeur, comprenant :
(i) la mesure d'au moins deux ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, lesdits deux ratios des niveaux d'expression étant :
- un ratio N°l des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 1 constitué de hsa-miR-106a/hsa-miR-494 et hsa-miR-17/hsa-miR-494,
- un ratio N°2 des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 2 constitué de hsa-miR-210/hsa-miR-193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p, ,
(ii) la comparaison des susdits ratios mesurés dans ledit échantillon avec ceux obtenus respectivement dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
Les miARNs utilisés dans la présente invention sont référencés dans la base de données miRBase (http://www.mirbase.org/) (miRBase : tools for microRNA genomic, Griffïths- Jones et al, NAR 2008 36(Database Issue):D154-D158) où la séquence nucléique d'un miARN peut être retrouvée par un numéro d'accession MIMAT ou une annotation uniforme. Un système d'annotation a été mis en place pour nommer les différents miARNs (A uniform ystem for microRNA annotation, Ambros et al, RNA 2003 9(3):277-279). Dans ce système, les microARNs sont désignés par un numéro. Ce numéro d'identification est précédé de l'abréviation « miR » ou « mir », qui permet une distinction entre le microARN mature (miR) et la boucle précurseur (hairpin) du microARN (mir), correspondant respectivement à un numéro d'accession MIMAT et MI. Un préfixe de trois ou quatre lettres est utilisé pour distinguer les origines génomiques de ce miARN. Par exemple « hsa-miR-126» signifie que ce miARN mature provient du génome humain. Parfois, les microARN matures peuvent être très proches (une seule base de différence). Dans ce cas, les microARNs portant un même numéro sont distingués entre eux par une lettre minuscule comme a, b, c .par exemple hsa- miR-26b. Parfois une boucle précurseur peut générer, de son côté 5' et son coté 3', deux microARNs matures qui sont distingués l'un de l'autre par l'annotation « 5p » ou « 3p ». Par exemple « hsa-miR-151-3p » signifie un miARN mature provenant du côté 3' de son précurseur. Parfois, une boucle précurseur du microARN peut dériver deux miARNs matures, à savoir un produit majeur et un produit mineur. Un tel miARN mineur est distingué du miARN majeur dérivé du même précurseur par une étoile suivie du numéro d'identification, par exemple « hsa-miR-425* » ou hsa-miR-425-star.
Dans la présente invention, les expressions « miARN » et « microARN » peuvent être remplacées l'une par l'autre. Les expressions tumeurs gliales ou gliomes sont équivalentes. Glioblastomes et oligodendrogliomes sont deux types de gliomes. Tissu sain ou échantilllon sain signifient tissu non tumoral ou échantillon non tumoral. Ces expressions au singulier peuvent s'entendre au pluriel et réciproquement.
Les séquences d'acides nucléiques des miARNs mentionnés ci-dessus et utilisés dans la présente invention ainsi que leurs numéros d'accession sont présentés dans l'exemple 1
(tableau 1).
intitulés des N° de séquence N° d'accession miARN Séquence miRBase Sanger hsa-miR-320c SEQ ID NO : : 1 AAAAGCUGGGUUGAGAGGGU MIMAT0005793 hsa-miR-320a SEQ ID NO : : 2 AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA MIMAT0000510 hsa-miR-320b SEQ ID NO : : 3 AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCAA MIMAT0005792 hsa-miR-491-5p SEQ ID NO : : 4 AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG MIMAT0002807 hsa-miR-127-3p SEQ ID NO : : 5 UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU MIMAT0000446 hsa-miR-132 SEQ ID NO : : 6 UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG MIMAT0000426 hsa-miR-574-3p SEQ ID NO : : 7 CACGCUCAUGCACACACCCACA MIMAT0003239 hsa-miR-494 SEQ ID NO : : 8 UGAAACAUACACGGGAAACCUC MIMAT0002816 hsa-miR-107 SEQ ID NO : : 9 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA MIMAT0000104 hsa miR-23b SEQ ID NO 10 AUCACAUUGCCAGGGAUUACC IMAT0000418 hsa miR-425-star SEQ ID NO 1 1 AUCGGGAAUGUCGUGUCCGCCC MIMAT0003393 hsa miR-345 SEQ ID NO 12 GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC MIMAT0000772 hsa miR-423-5p SEQ ID NO 13 UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU MIMAT0004748 hsa miR-193b SEQ ID NO 14 AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU IMAT0002819 hsa miR-320d SEQ ID NO 15 AAAAGCUGGGUUGAGAGGA MI AT0006764 hsa miR-1207-5p SEQ ID NO 16 UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG MIMAT0005871 hsa miR-210 SEQ ID NO 17 CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA MIMAT0000267 hsa- miR-92a SEQ ID NO 18 UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU I AT0000092 hsa- miR-106a SEQ ID NO 19 AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG I AT0000103 hsa- miR-17 SEQ ID NO 20 C AAAG UGCUUACAGUGCAGGUAG IMAT0000070 hsa- miR-191 SEQ ID NO 21 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG MIMAT0000440 hsa- miR-324-5p SEQ ID NO 22 CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU MIMAT0000761 hsa- miR-185 SEQ ID NO 23 UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA MIMAT0000455
Tableau 1
La mesure des niveaux d'expression des miARNs peut être réalisée par toute méthode conventionnelle, telle que
- l'hybridation sur « puces à ADN »,
- des méthodes de séquençage à haut débit d'un grand nombre de miARN individualisés,
- la PCR en temps réel,
- le Northern blot,
ou encore par toute autre méthode spécifique des miARNs.
La mesure des 23 microARN peut être réalisée de manière individuelle et indépendante ou de manière simultanée sans que cela altère le procédé d'analyse décrit par la présente invention.
Le niveau d'expression des miARNs peut être mesuré par la technique de la « puce à ADN ». La technique de la « puce à ADN » est bien connue de l'homme du métier. Il s'agit de l'hybridation de miARNs extraits sur un support solide composé d'une membrane nylon, d'une surface de silicium ou de verre, éventuellement de nano-billes ou particules, comportant des oligonucléotides de séquences connues fixés sur le support ou adhérents à celui-ci. La complémentarité des oligonucléotides fixés avec les séquences des microARNs ou de leurs produits de conversion (produits d'amplification, cDNA, ARN ou cARN) permet de générer un signal (fluorescence, luminescence, radioactivité, signal électrique...) selon les techniques de marquage employées, au niveau des oligonucléotides immobilisés sur les supports (puces à ADN). Ce signal est détecté par un équipement spécifique et une valeur d'intensité de ce signal propre pour chaque miARN est ainsi enregistrée. Plusieurs types de puces destinées à la détection des miARNs sont déjà mis sur le marché, comme par exemple les GeneChip® miRNA commercialisés par Affymetrix, miRcury arrays par Exiqon, miRXplore microarrays par Miltenyi.
Dans le cas de l'analyse haut débit par séquençage, les miARNs sont extraits et purifiés d'un échantillon, isolés les uns des autres par des méthodes proposées par les fournisseurs d'équipements de séquençage tels que Roche, Invitrogen. Ce genre d'analyse consiste à individualiser les molécules des différents microARNs, de procéder à une étape d'amplification et de séquencer les produits (« clones d'acides nucléiques ») ainsi générés. La réalisation de très nombreuses séquences pour identifier chacun de ces « clones » (plusieurs milliers) permet de générer un listing des microARNs présents dans un échantillon et de quantifier chacun de ces miARNs en comptant tout simplement combien de fois chaque séquence est retrouvée dans le listing détaillé.
Par « échantillon biologique », on entend un échantillon tissulaire, notamment un tissu cérébral obtenu par exérèse. L'échantillon peut être congelé ou fixé dans la paraffine (fragment tissulaire fixé par traitement chimique et inclus dans un bloc de paraffine selon les techniques classiques de l'anatomo-pathologie). L'échantillon biologique peut être également un échantillon de liquides biologiques, notamment un échantillon sanguin (sous forme non coagulé ou ses dérivés, plasma ou sérum).
Un échantillon tissulaire cérébral peut être un tissu du système nerveux central provenant du cortex cérébral, du cortex cérébelleux, des noyaux gris centraux ou des noyaux du tronc cérébral.
Lorsque « un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales » est un échantillon tissulaire cérébral, il s'agit d'un tissu prélevé, par biopsie ou par exérèse au bloc opératoire ou toute autre méthode de prélèvement intratumoral adapté, du siège tumoral soupçonné d'un patient. Le siège tumoral soupçonné est repéré préalablement par une méthode classique, telle qu'une IRM, un Pet Scan (Scanner par image de rayons gamma), ou un scanner classique.
Lorsque « un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales » est un échantillon sanguin, cet échantillon est obtenu d'un patient par prélèvement du sang selon les méthodes conventionnelles.
« Un tissu sain de référence » peut être un tissu cérébral dépourvu de tout caractère tumoral d'après une analyse histologique réalisée par les anatomopathologistes. Le tissu sain de référence peut être un tissu du système nerveux central provenant du cortex cérébral, du cortex cérébelleux, des noyaux gris centraux ou des noyaux du tronc cérébral. Le tissu sain de référence est préférentiellement prélevé à partir d'un même patient (tissu sain de zone périphérique à la tumeur). Alternativement il peut être constitué de fragments encéphaliques obtenus après chirurgie dite de cortectomie réalisée sur des individus ne présentant pas de tumeurs du cerveau mais dans le cadre d'intervention pour traitement de l'épilepsie ou suite à des traumatismes crâniens.
« Un tissu sain de référence » peut être aussi un échantillon de liquides biologiques, notamment un sérum sanguin ou un plasma sanguin prélevé d'une personne saine, et notamment d'une personne ne présentant aucun cancer.
« Un tissu d'ODG de référence » est un tissu provenant d'un patient, dans lequel la présence des oligodendrogliomes a été certifiée par l'analyse anatomo-pathologique.
« Un tissu de GBM de référence » est un tissu provenant d'un patient, dans lequel la présence des glioblastomes a été diagnostiquée par l'analyse anatomo-pathologique.
« Un tissu d'ODG de référence » ou « un tissu de GBM de référence » peut être un fragment de tumeur gliale obtenu par exérèse chez un patient et dont le type de tumeur a été certifié par l'analyse anatomo-pathologique.
Idéalement, le diagnostic des oligodendrogliomes ou des glioblastomes peut également être confirmé par des analyses moléculaires telles que par exemple l'analyse des profils d'expression de gènes de ces tissus tumoraux. Les tumeurs sont ensuite caractérisées en utilisant la méthode de classification de Li et al (Li A, Walling J, Ahn S, Kotliarov Y, Su Q, Quezado M, Oberholtzer JC, Park J, Zenklusen JC, Fine HA. Cancer Res. 2009 Mar l;69(5):2091-9) qui repose sur l'utilisation des niveaux d'expression d'un jeu de 54 gènes. Les glioblastomes ou oligodendrogliomes sont classés respectivement dans les groupes G et O de la publication suscitée.
Un ratio des niveaux d'expression de deux microARN mesurés dans un échantillon est considéré comme signifïcativement différent d'un ratio correspondant préalablement établi dans un tissu de référence, lorsque le ratio obtenu dans ledit échantillon est 4 fois supérieur ou 4 fois inférieur au ratio préalablement établi dans ledit tissu de référence.
En revanche, un ratio obtenu dans un échantillon n'est pas considéré comme différent d'un ratio correspondant préalablement établi dans un tissu de référence, lorsque le ratio obtenu dans ledit échantillon n'est pas 4 fois supérieur ou 4 fois inférieur au ratio préalablement établi dans ledit tissu de référence.
Le ratio des niveaux d'expression d'un couple de miARNs appartenant au groupe 1 obtenu d'un tissu d'ODG est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu d'un tissu sain, ou celui obtenu d'un tissu de GBM alors que ce ratio n'est pas différent du ratio obtenu d'un tissu d'ODG de référence.
En revanche, le ratio des niveaux d'expression d'un couple de miARNs appartenant au groupe 2 obtenu d'un tissu de GBM est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu d'un tissu sain, ou celui obtenu d'un tissu d'ODG alors que ce ratio n'est pas différent du ratio obtenu d'un tissu de GBM de référence.
Dans un mode de réalisation particulier, laquelle la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
- lorsque le ratio N° l mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, ou lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, ou lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence.
Dans un mode de réalisation avantageux, la méthode de diagnostic in vitro selon l'invention comprend en outre la mesure d'un ratio du groupe 3 de niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, ledit ratio étant le ratio des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa- miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa-miR-132, hsa-miR-320a/hsa- miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p.
Ce mode de réalisation avantageux est basé sur le fait que les Inventeurs, en plus des groupes 1 et 2 des couples de miARNs, ont réussi à identifier un groupe 3 de couples de miARNs dont les ratios des niveaux d'expression dans les gliomes, autrement dit les oligodendrogliomes et les glioblastomes, sont signifïcativement différents de ceux mesurés dans un tissu sain.
Le ratio des niveaux d'expression d'un tel couple de miARNs, à savoir hsa-miR-423- 5p/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR- 92a/hsa-miR-132, hsa-miR-320a/hsa-miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p, obtenu dans un tissu d'ODG ou un tissu de GBM est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain.
Par conséquent, ce ratio obtenu d'un échantillon provenant d'un patient permet d'indiquer la présence éventuelle d'un gliome dans le susdit échantillon.
Dans un mode de réalisation particulier, la susdite méthode selon l'invention comprend :
(i) la mesure de trois ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, lesdits trois ratios des niveaux d'expression étant :
- le ratio N°3 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa- miR-132, hsa-miR-320a/hsa-miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p,
- le ratio N°l des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-106a/hsa- miR-494 et hsa-miR- 17/hsa-miR-494,
- le ratio N°2 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-210/hsa- miR-193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p,
(ii) la comparaison des susdits ratios obtenus dans ledit échantillon avec ceux obtenus respectivement dans un tissus sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
Dans un mode de réalisation particulier, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite - lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, ou lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence.
Dans un autre mode de réalisation particulier, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, ou lorsque le ratio N° 1 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence.
Dans un mode de réalisation avantageux, la méthode de diagnostic in vitro selon l'invention comprend en outre la mesure d'un ratio du groupe 4 de niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, ledit ratio étant le ratio des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-320a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-320b/hsa- miR-127-3p, hsa-miR-320c/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-17/hsa-miR-107, hsa-miR-106a/hsa- miR-23b, hsa-miR-17/hsa-miR-23b, hsa-miR-345/hsa-miR-574-3p, hsa-miR-191/hsa-miR- 425 -star.
La valeur d'un ratio du groupe 4 obtenu pour le tissu ODG est toujours 4 fois supérieure au moins aux valeurs de ce ratio calculé dans un tissu cérébral sain. Cette valeur permet d'indiquer la présence éventuelle d'un tissu d'ODG dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une tumeur gliale.
Dans un mode de réalisation particulier, la susdite méthode selon l'invention comprend :
(i) la mesure de quatre ratios des niveaux d'expression de couples de miA Ns extraits d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, lesdits quatre ratios des niveaux d'expression étant :
- le ratio N°3 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa- miR-132, hsa-miR-320a/hsa-miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p ,
- le ratio N°l des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-106a/hsa- miR-494 et hsa-miR-17/hsa-miR-494,
- le ratio N°2 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-210/hsa- miR- 193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p,
- le ratio N°4 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-320a/hsa- miR-127-3p, hsa-miR-320b/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-320c/hsa-miR-127-3p, hsa-miR- 17/hsa-miR-107, hsa-miR-106a/hsa-miR-23b, hsa-miR-17/hsa-miR-23b, hsa-miR-345/hsa- miR-574-3p, hsa-miR- 19 l/hsa-miR-425-star.
Dans ce mode de réalisation particulier, la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est confirmée :
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, ou lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le ratio N°4 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence. Dans un autre mode de réalisation avantageux, la méthode de diagnostic in vitro selon l'invention comprend en outre la mesure d'un ratio du groupe 5 de niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, ledit ratio étant le ratio des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-345/hsa-miR-324-5p, hsa-miR-345/hsa-miR- 185 et hsa-miR-345/hsa-miR-320d.
La valeur d'un ratio du groupe 5 obtenu pour le tissu GBM est toujours 4 fois supérieure au moins aux valeurs de ce ratio calculé dans un tissu cérébral sain. Cette valeur permet d'indiquer la présence éventuelle d'un tissu de GBM dans un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une tumeur gliale.
Dans un mode de réalisation particulier, la susdite méthode selon l'invention comprend :
(i) la mesure de quatre ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, lesdits quatre ratios des niveaux d'expression étant :
- le ratio N°3 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa- miR-132, hsa-miR-320a/hsa-miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p
- le ratio N°l des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-106a/hsa- miR-494 et hsa-miR- 17/hsa-miR-494,
- le ratio N°2 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-210/hsa- miR-193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p, et
- le ratio N°5 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-345/hsa- miR-324-5p, hsa-miR-345/hsa-miR-185 et hsa-miR-345/hsa-miR-320d,
(ii) la comparaison des susdits ratios obtenus dans ledit échantillon avec ceux obtenus respectivement dans un tissus sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
Dans ce mode de réalisation particulier, la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est confirmée :
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, ou lorsque le ratio du groupe 1 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et - lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence,
- lorsque le ratio N°5 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, la méthode de diagnostic in vitro de l'invention comprend en outre la mesure dans un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales :
- d'un ratio N°4 des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 4 constitué de hsa-miR-320a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-320b/hsa-miR-127-3p, hsa- miR-320c/hsa-miR-127-3p, hsa-miR- 17/hsa-miR- 107, hsa-miR- 106a/hsa-miR-23b, hsa-miR- 17/hsa-miR-23b, hsa-miR-345/hsa-miR-574-3p, hsa-miR- 19 l/hsa-miR-425-star, et
- d'un ratio N°5 des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 5 constitué de hsa-miR-345/hsa-miR-324-5p, hsa-miR-345/hsa-miR-185 et hsa-miR- 345/hsa-miR-320d.
Dans un mode de réalisation particulier, la susdite méthode selon l'invention comprend :
(i) la mesure de cinq ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, lesdits cinq ratios des niveaux d'expression étant :
- le ratio N°3 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa- miR-132, hsa-miR-320a/hsa-miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p
- le ratio N°l des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR- 106a/hsa- miR-494 et hsa-miR- 17/hsa-miR-494,
- le ratio N°2 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-210/hsa- miR- 193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p,
- le ratio N°4 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-320a/hsa- miR-127-3p, hsa-miR-320b/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-320c/hsa-miR-127-3p, hsa-miR- 17/hsa-miR-107, hsa-miR- 106a/hsa-miR-23b, hsa-miR- 17/hsa-miR-23b, hsa-miR-345/hsa- miR-574-3p, hsa-miR- 19 l/hsa-miR-425-star, et - le ratio N°5 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-345/hsa- miR-324-5p, hsa-miR-345/hsa-miR-185 et hsa-miR-345/hsa-miR-320d,
(ii) la comparaison des susdits ratios obtenus dans ledit échantillon avec ceux obtenus respectivement dans un tissu sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
Dans ce mode de réalisation particulier, la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite :
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, ou lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le ratio N°4 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
En revanche, la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite :
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, ou lorsque le ratio du groupe 1 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence,
- lorsque le ratio N°5 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
La présente invention est illustrée à titre d'exemple par les exemples suivants. Ces exemples ne visent en aucun cas à limiter le mode de réalisation éventuel de l'invention. Figure la : la figure la illustre la comparaison des valeurs des 21 ratios des couples de microARN dosés dans l'échantillon suspecté A (montrées dans le Tableau 3) reportées en ordonnées, avec les valeurs des ratios dans un tissu sain de référence (valeurs du Tableau 2) reportées en abscisses. Les valeurs de ratios pour l'échantillon suspecté A sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu sain de référence. La droite reportée dans le graphique illustre la situation théorique de parfaite corrélation entre les valeurs obtenues pour l'échantillon A suspecté et celles de l'échantillon de référence.
Figure lb : la figure lb illustre la comparaison des valeurs des 21 ratios des couples de microARN dosés dans l'échantillon suspecté A (montrées dans le Tableau 3) reportées en ordonnées, avec les valeurs des ratios dans un tissu ODG de référence (valeurs du Tableau 2) reportées en abscisses. Les valeurs de ratios pour l'échantillon suspecté A sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu ODG de référence. La droite reportée dans le graphique illustre la situation théorique de parfaite corrélation entre les valeurs obtenues pour l'échantillon A suspecté et celles de l'échantillon de référence.
Figure le : la figure le illustre la comparaison des valeurs des 21 ratios des couples de microARN dosés dans l'échantillon suspecté A (montrées dans le Tableau 3) reportées en ordonnées, avec les valeurs des ratios dans un tissu GBM de référence (valeurs du Tableau 2) reportées en abscisses. Les valeurs de ratios pour l'échantillon suspecté A sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu GBM de référence. La droite reportée dans le graphique illustre la situation théorique de parfaite corrélation entre les valeurs obtenues pour l'échantillon A suspecté et celles de l'échantillon de référence.
Figure 2a : la figure 2a illustre la comparaison des valeurs des 21 ratios des couples de microARN dosés dans l'échantillon suspecté B (montrées dans le Tableau 3) reportées en ordonnées, avec les valeurs des ratios dans un tissu sain de référence (valeurs du Tableau 2) reportées en abscisses. Les valeurs de ratios pour l'échantillon suspecté B sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu sain de référence. La droite reportée dans le graphique illustre la situation théorique de parfaite corrélation entre les valeurs obtenues pour l'échantillon B suspecté et celles de l'échantillon de référence.
Figure 2b : la figure 2b illustre la comparaison des valeurs des 21 ratios des couples de microARN dosés dans l'échantillon suspecté B (montrées dans le Tableau 3) reportées en ordonnées, avec les valeurs des ratios dans un tissu ODG de référence (valeurs du Tableau 2) reportées en abscisses. Les valeurs de ratios pour l'échantillon suspecté B sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu ODG de référence. La droite reportée dans le graphique illustre la situation théorique de parfaite corrélation entre les valeurs obtenues pour l'échantillon B suspecté et celles de l'échantillon de référence.
Figure 2c : la figure 2c illustre la comparaison des valeurs des 21 ratios des couples de microARN dosés dans l'échantillon suspecté B (montrées dans le Tableau 3) reportées en ordonnées, avec les valeurs des ratios dans un tissu GBM de référence (valeurs du Tableau 2) reportées en abscisses. Les valeurs de ratios pour l'échantillon suspecté B sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu GBM de référence. La droite reportée dans le graphique illustre la situation théorique de parfaite corrélation entre les valeurs obtenues pour l'échantillon B suspecté et celles de l'échantillon de référence.
Figure 3a : la figure 3a illustre la comparaison des valeurs des 21 ratios des couples de microARN dosés dans l'échantillon suspecté C (montrées dans le Tableau 3) reportées en ordonnées, avec les valeurs des ratios dans un tissu sain de référence (valeurs du Tableau 2) reportées en abscisses. Les valeurs de ratios pour l'échantillon suspecté C sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu sain de référence. La droite reportée dans le graphique illustre la situation théorique de parfaite corrélation entre les valeurs obtenues pour l'échantillon C suspecté et celles de l'échantillon de référence.
Figure 3b : la figure 3b illustre la comparaison des valeurs des 21 ratios des couples de microARN dosés dans l'échantillon suspecté C (montrées dans le Tableau 3) reportées en ordonnées, avec les valeurs des ratios dans un tissu ODG de référence (valeurs du Tableau 2) reportées en abscisses. Les valeurs de ratios pour l'échantillon suspecté C sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu ODG de référence. La droite reportée dans le graphique illustre la situation théorique de parfaite corrélation entre les valeurs obtenues pour l'échantillon C suspecté et celles de l'échantillon de référence.
Figure 3c : la figure 3clc illustre la comparaison des valeurs des 21 ratios des couples de microARN dosés dans l'échantillon suspecté C (montrées dans le Tableau 3) reportées en ordonnées, avec les valeurs des ratios dans un tissu GBM de référence (valeurs du Tableau 2) reportées en abscisses. Les valeurs de ratios pour l'échantillon suspecté C sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu GBM de référence. La droite reportée dans le graphique illustre la situation théorique de parfaite corrélation entre les valeurs obtenues pour l'échantillon C suspecté et celles de l'échantillon de référence.
Figure 4 : la figure 4 représente un graphique à deux dimensions, dans lequel les valeurs du ratio hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p mesurées dans les différents échantillons sont reportées en abscisse ; et les valeurs du ratio hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p mesurées dans ces échantillons sont reportées en ordonnée. Les losanges représentent les échantillons de tissu sain. Les carrés représentent les échantillons d'ODG. Les triangles représentent les échantillons de GBM.
Figure 5 : la figure 5 représente un graphique à deux dimensions, dans lequel les valeurs du ratio hsa-miR-320c/hsa-miR-127-3p mesurées dans les différents échantillons sont reportées en abscisse ; et les valeurs du ratio hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p mesurées dans ces échantillons sont reportées en ordonnée. Les losanges représentent les échantillons de tissu sain. Les carrés représentent les échantillons d'ODG. Les triangles représentent les échantillons de GBM.
Figure 6 : la figure 6 représente un graphique à deux dimensions, dans lequel les valeurs du ratio hsa-miR-17/hsa-miR-494 mesurées dans les différents échantillons sont reportées en abscisse ; et les valeurs du ratio hsa-miR-210/hsa-miR-193b mesurées dans ces échantillons sont reportées en ordonnée. Les losanges représentent les échantillons de tissu sain. Les carrés représentent les échantillons d'ODG. Les triangles représentent les échantillons de GBM.
Figure 7 : la figure 7 représente un graphique à deux dimensions, dans lequel les valeurs du ratio hsa-miR-320c/hsa-miR-127-3p mesurées dans les différents échantillons sont reportées en abscisse ; et les valeurs du ratio hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p mesurées dans ces échantillons sont reportées en ordonnée. Les losanges représentent les échantillons de tissu sain. Les carrés représentent les échantillons d'ODG. Les triangles représentent les échantillons de GBM.
Figure 8 : la figure 8 représente un graphique à deux dimensions, dans lequel les valeurs du ratio hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p mesurées dans les différents échantillons sont reportées en abscisse ; et les valeurs du ratio hsa-miR-106a/hsa-miR-23b mesurées dans ces échantillons sont reportées en ordonnée. Les losanges représentent les échantillons de tissu sain. Les carrés représentent les échantillons d'ODG. Les triangles représentent les échantillons de GBM.
Exemple 1 : Matériel et Méthodes 1.1 Echantillons tumoraux
Les échantillons tumoraux de glioblastomes, oligodendrogliomes et méningiomes ainsi que les échantillons de tissu sain (cortectomies) sont obtenus après exérèse par les neurochirurgiens au bloc opératoire du CHU de Grenoble et sont immédiatement congelés à - 80°C. Des coupes de tissu d'environ 40μιη d'épaisseur sont ensuite réalisées à l'aide d'un cryotome en nombre suffisant afin d'obtenir environ 80mg de tissu et conservées à -80°C jusqu'à extraction des ARN.
1.2 Liquides biologiques
Pour la purification des microARNs circulants dans le sang, des échantillons sanguins sont prélevés chez les patients sur des tubes de prélèvement de type PAXGene Blood RNA (PreAnalytix- Qiagen - BD company). La lyse totale des cellules circulantes est réalisée et les ARN sont collectés par centrifugation et purifiés selon les indications du fournisseur.
En ce qui concerne les fractions de microARN contenus dans les microvésicules produites par les tumeurs et présentes dans le sang, la méthode utilisée est directement basée sur celle décrite par Skog et coll (Skog J, Wùrdinger T, van Rijn S, Meijer DH, Gainche L, Sena-Esteves M, Curry WT Jr, Carter BS, Krichevsky AM, Breakefïeld XO. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. (Skog et coll,, Nat Cell Biol. 2008 Dec;10(12):1470-6. Epub 2008 Nov 16).
Les microvésicules sont purifiées à partir des sérums par centrifugations et micro fïltration. Les sérums sont centrifugés une première fois pendant 10 min à 300g, puis les surnageants sont ensuite centrifugés pendant 20 min à 17000g et filtrés sur filtre de 0,22 microns. Les micro vésicules sont obtenues par ultracentrifugation du filtrat à 110000g pendant 70 min. Le culot est enfin resuspendu en tampon phosphate (PBS) et les ARN sont extraits selon le protocole décrit ci-après.
1.3 Extraction d'ARN
Les ARN sont extraits grâce au kit hsa-miRVana™ (Ambion, ABI) permettant de séparer les ARN longs (taille > 25 Ont) des ARN courts (taille < 25 Ont) en suivant les recommandations du fournisseur. Brièvement, le tissu est tout d'abord lysé, les ARN sont ensuite précipités après ajout d'acétate de sodium et d'éthanol, extraits en présence d'un mélange phénol / chloroforme, séparés selon leur taille sur colonnes chromatograpiques puis élués. Les ARN élués sont ensuite quantifiés par mesure de la DO à 260nm à l'aide du spectrophotomètre Nanodrop ND-1000 et un contrôle qualité de ces ARN est réalisé par migration électrophorétique dans un gel de polymère sur le Bio Analyser 2100 grâce au kit RNA 6000 nano LabChip® (Agilent).
1.4 Dosage des miARNs par hybridation sur puce à ADN Les ARN courts (taille inférieure à 250 bases) obtenus à l'étape précédente sont utilisés pour l'analyse par hybridation sur puce à ADN GeneChip miRNA Affymetrix.
La première étape consiste à ajouter une extrémité poly-A en position 3' des ARN. La seconde étape consiste à réaliser le marquage des ARN. Pour cela, une réaction de ligature va être faite pour ajouter aux ARN de l'ADN biotinylé (par exemple avec les réactifs de marquage et détection du kit Flash Tag HSR de chez Genisphere, Hatfïeld, USA). Une fois cette étape réalisée, l'hybridation pourra avoir lieu avec les sondes se trouvant sur la puce. Après l'hybridation, il y a une étape d'amplification du marquage puis des lavages qui sont faits avant que la puce ne soit scannée. Enfin la puce sera scannée et on obtient une image de chaque puce qui devra être traitée pour avoir une valeur d'intensité correspondant à l'hybridation ARN/Sonde pour chaque micro ARN. Les données sont ensuite traitées et normalisées avec le logiciel QC Tools selon les méthodes proposées par Irizarry et al (RA. Irizarry, B Hobbs, F Collin, Y D. Beazer-Barclay, K J. Antonellis, U Scherf and T P. Speed. Exploration, Normalization, and Summaries of High Density Oligonucleotide Array Probe Level Data. Biostatistics, April 2003; Vol. 4; Number 2: 249-264).
Alternativement, les résultats peuvent aussi être générés par dosage par RT-Q-PCR, tout autre type de puce à ADN d'un quelconque fournisseur ou toute autre méthode de dosage. Les analyses peuvent être réalisées sur les liquides biologiques (sang ou sous-fraction par exemple).
1.5 Dosage des miARNs par PCR en temps réel
L'expression de miARNs est quantifiée par la technique de PCR quantitative à l'aide des kits distribués par Applied Biosystems, spécifiques des miARNs matures. Dans un premier temps, 80ng dARNs courts sont inversement transcrits (en cDNA monobrin) en présence d'amorces en boucle, qui confèrent la spécificité pour la quantification de l'expression des miARNs matures. La PCR en temps réel est ensuite réalisée à l'aide des amorces fournies dans les kits. Une des amorces comporte des groupements fluorescents (sonde dite Taqman@) ce qui permet de réaliser une mesure quantitative en utilisant un fluorimètre adapté tel que la station Stratagene Mx3005.Le seuil de détection est déterminé dans un premier temps par l'utilisateur en début de phase exponentielle. La valeur de Ct correspond au nombre de cycles à partir duquel la fluorescence dépasse ce seuil de détection. Cette valeur de Ct est proportionnelle à la quantité de cDNA présent initialement dans l'échantillon. Le calcul des ratios entre deux miARN donnés à partir de mesures de Ct réalisés pour un même échantillon et pour deux miARN différents (appelés ici pour exemple miPA et miRe) est obtenu grâce à la formule suivante : hsa-miRA / hsa-miRB = 2A(Ct hsa-miRA - Ct hsa-miRB)
Exemple 2
Un abaque des ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs (tableau 2 ci- dessous) est établi à partir des ratios mesurés dans un tissu sain de référence (N), un tissu d'ODG de référence (ODG), un tissu de GBM de référence (GBM)
Le tissu sain de référence, le tissu d'ODG de référence et le tissu de GBM de référence sont obtenus tel que décrit dans l'exemple 1 (partie 1.1).
Les niveaux d'expression des miARNs sont mesurés selon la méthode décrite dans l'exemple 1. Pour augmenter la lisibilité et afin de disposer de valeurs des ratios supérieure à 1 dans la plupart des cas, les valeurs calculées ont été multipliées par un facteur 10.
ratio N ODG GBM
groupe 1 : type de gliome : : ODG
1 hsa-m i R- 106a/hsa-m i R-494 51 ,9 344,4 72,9
2 hsa-m i R- 17/hsa-m i R-494 66,3 443,7 80,8
groupe 2 : : type de gliome : : GBM
3 hsa-m i R-210/hsa-m i R- 193b 7,3 9,9 51,7
4 hsa-m i R-210/hsa-m i R-423-5p 13,0 13,5 190,4
groupe 3 : marqueurs de gliomes
5 hsa-m i R-423-5p/hsa-m i R-491 -5p 1 ,7 13,6 17,5
6 hsa-m i R-210/hsa-m i R-491 -5p 2,2 18,4 334,1
7 hsa-m i R-92a/hsa-m i R- 127-3p 4,5 111 ,7 25,7
8 hsa-m iR-92a/hsa-m iR- 132 4,9 55,1 29,0
9 hsa-m i R-320a/hsa-m i R-491 -5p 47,5 389,1 474,3
10 hsa-m i R-320c/hsa-m i R-491 -5p 39,9 335,1 436,7
groupe 4 : marqueurs de gliome (ODG)
11 hsa-m i R-320a/hsa-m i R- 127-3p 12,6 120,8 42,8
12 hsa-m i R-320b/hsa-m i R- 127-3p 12, 1 115,3 43, 1
13 hsa-m i R-320c/hsa-m i R- 127-3p 10,6 104,0 39,4
14 hsa-m i R- 17/hsa-m i R- 107 1 ,7 7,3 5,2
15 hsa-m i R- 106a/hsa-m i R-23b 2, 1 9,5 4,4
16 hsa-m i R- 17/hsa-m i R-23b 2,6 12,3 4,9
17 hsa-m i R-345/hsa-m i R-574-3p 3,2 20,1 5,3
18 hsa-m i R- 191 /hsa-m i R-425-star 148,8 702,4 450,7
groupe5 : marqueurs de gliome (GBM)
19 hsa-m i R-345/hsa-m i R-324-5p 2,3 6,8 10,6
20 hsa-m i R-345/hsa-m i R- 185 0,6 1 ,6 3,7
21 hsa-m i R-345/hsa-m i R-320d 0,8 1 ,9 3,6
Tableau 2 L'utilisation des valeurs de référence établies dans l'abaque (Tableau 2) dans le cadre de la réalisation d'analyses afin de caractériser un échantillon suspecté d'être tumoral est illustrée dans les exemples 3 à 5 ci-après. Exemple 3
Dans l'exemple 3, trois échantillons distincts (A, B ou C) sont analysés. Les taux respectifs de chacun des 23 miR A du tableau 1 sont mesurés dans ces échantillons. Les valeurs des 21 ratios décrits dans le tableau 2 entre microARNs dosés dans un même échantillon sont ensuite calculées. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 3. On constate par comparaison des valeurs du Tableau 3 avec celles indiquées dans le Tableau 2 que les valeurs des ratios dans l'échantillon A sont très proches des valeurs des ratios caractéristiques d'un échantillon normal. Il peut être conclu que l'échantillon A est un tissu cérébral normal. Les valeurs respectives des ratios de microARN pour l'échantillon B sont très semblables aux valeurs caractéristiques des ODG. L'échantillon B est donc diagnostiqué comme ODG. Les valeurs respectives des ratios de microARN pour l'échantillon C sont très semblables aux valeurs caractéristiques des GBM. L'échantillon C est donc diagnostiqué comme GBM. ratio A B C
1 hsa-m i R- 106a/hsa-m i R-494 61 , 1 471 ,6 94,0
2 hsa-m i R- 17/hsa-m i R-494 84,9 625,6 102,6
3 hsa-m i R-210/hsa-m i R- 193b 6,0 9,0 61 ,4
4 hsa-m i R-210/hsa-m i R-423-5p 13,3 9,9 169,0
5 hsa-m i R-423-5p/hsa-m i R-491 -5p 1 ,6 16,5 22,0
6 hsa-m i R-210/hsa-m i R-491 -5p 2,2 16,4 371 ,8
7 hsa-m i R-92a/hsa-m i R- 127-3p 4,3 122,7 30,4
8 hsa-m i R-92a/hsa-m i R- 132 5,6 48,0 35,5
9 hsa-m i R-320a/hsa-m i R-491 -5p 45,3 452,2 420,9
10 hsa-m i R-320c/hsa-m i R-491 -5p 38,4 415,5 401 ,3
11 hsa-m i R-320a/hsa-m i R- 127-3p 13,6 123,7 40,4
12 hsa-m i R-320b/hsa-m i R- 127-3p 12,9 121 ,3 40,5
13 hsa-m i R-320c/hsa-m i R- 127-3p 1 1 ,5 1 13,7 38,5
14 hsa-m i R- 17/hsa-m i R- 107 1 ,2 8,6 5,5
15 hsa-m i R- 106a/hsa-m i R-23b 1 ,5 8,2 4,9
16 hsa-m i R- 17/hsa-m i R-23b 2, 1 10,9 5,4
17 hsa-m i R-345/hsa-m i R-574-3p 2,6 20,4 4,9 18 hsa-m i R- 191 /hsa-m i R-425-star 124,4 706,5 437,8
19 hsa-m i R-345/hsa-m i R-324-5p 2,6 5,7 12,0
20 hsa-m i R-345/hsa-m i R- 185 0,6 1 ,2 4, 1
21 hsa-m i R-345/hsa-m i R-320d 0,8 2,0 4, 1
Tableau 3
Exemple 4
Dans l'exemple 4, l'exploration est menée de manière identique à celle indiquée dans l'exemple 3 ci-dessus. Cependant, afin de rendre l'interprétation des analyses plus directe et évidente, une représentation graphique des résultats obtenus, préférée des inventeurs est proposée comme exemple. Les valeurs des ratios entre des couples de microARN dosés dans un même échantillon (montrées dans le Tableau 3 pour les échantillons A, B et C) sont reportées dans des graphiques à deux dimensions (Figures la, lb, le pour l'échantillon A, Figure 2a, 2b, 2c pour l'échantillon B, Figure 3a, 3b, 3c pour l'échantillon C) dans lesquels les valeurs des ratios des échantillons de référence (valeurs du Tableau 2) sont reportées en abscisse et les valeurs des ratios identiques obtenus pour les échantillons analysés (Tableau 3) sont reportées en ordonnée. Les valeurs de ratios pour un échantillon suspecté sont mises en corrélation avec les valeurs respectives pour un tissu sain de référence, un tissu ODG de référence et un tissu GBM de référence. Pour chacun des graphiques, la droite (y = x) reportée dans les graphiques illustre la corrélation théorique parfaite entre les valeurs obtenues pour un échantillon suspecté et celles d'un échantillon de référence. Plus l'ensemble des points d'un graphique est positionné à proximité de la droite de parfaite corrélation du graphique plus forte est l'identité du tissu analysé avec le tissu de référence pris en considération dans ledit graphique. Ainsi la lecture visuelle des graphiques de la Figure 1 montre à l'évidence que l'échantillon A est très semblable au tissu sain de référence et se distingue nettement des tissus ODG ou GBM. On en déduit donc que l'échantillon A est un tissu cérébral sain. De manière identique, il peut être constaté que l'échantillon B est un tissu ODG et que l'échantillon C est un tissu GBM.
Exemple 5
Dans l'exemple 5, les valeurs de deux ratios entre microARN d'un même échantillon sont utilisés pour créer un graphique qui permet de distinguer très rapidement les types de tissus. Dans ces graphiques, et pour chaque échantillon de tissu on reporte en abscisse la valeur obtenue pour un ratio donné entre un couple de microARN et en ordonnée les valeurs d'un deuxième ratio pour un autre couple de microARN. Chaque échantillon est représenté par un point sur le graphique. Ce graphique permet de constituer, comme montré par les figures 4-8, des nuages de points regroupés de manière cohérente en fonction du type de tissu. Ainsi les tissus sains forment un ensemble de point de coordonnées très distinctes des tumeurs gliales et les tissus ODG sont regroupés dans une zone de coordonnées très distinctes du nuage des points correspondant aux tissus GBM. Ainsi pour tout échantillon inconnu, on peut sur la base des valeurs d'un couple de ratio entre miRNA préciser par cette représentation graphique si l'échantillon montre des caractéristiques identiques à celles d'un tissu sain, d'un tissu ODG ou d'un tissu GBM et donc d'en déduire la nature de cet échantillon analysé.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode de diagnostic in vitro d'une tumeur cérébrale appartenant au groupe constitué de 2 types de tumeurs : ODG, GBM, et d'identification du type de la tumeur, comprenant :
(i) la mesure d'au moins deux ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrales, lesdits deux ratios des niveaux d'expression étant :
- un ratio N°l des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 1 constitué de hsa-miR-106a/hsa-miR-494 et hsa-miR-17/hsa-miR-494,
- un ratio N°2 des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 2 constitué de hsa-miR-210/hsa-miR-193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p,
(ii) la comparaison des susdits ratios mesurés dans ledit échantillon avec ceux obtenus respectivement dans un tissus sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui mesuré dans un tissu d'ODG de référence, ou lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence.
3. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, ou lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence.
4. Méthode selon la revendication 1, comprenant en outre la mesure d'un ratio N°3 des niveaux d'expression de couples de miARNs dans un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrale, ledit ratio étant le ratio des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa-miR-491-5p, hsa-miR- 210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa-miR-132, hsa-miR- 320a/hsa-miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p.
5. Méthode selon la revendication 4, comprenant :
(i) la mesure de trois ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrale, lesdits trois ratios des niveaux d'expression étant :
- le ratio N°3 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa- miR-132, hsa-miR-320a/hsa-miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p,
- le ratio N°l des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-106a/hsa- miR-494 et hsa-miR-17/hsa-miR-494,
- le ratio N°2 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-210/hsa- miR-193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p,
(ii) la comparaison des susdits ratios obtenus dans ledit échantillon avec ceux obtenus respectivement dans un tissus sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
6. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite - lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, ou lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence.
7. Méthode selon la revendication 5, dans laquelle la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, ou lorsque le ratio N° 1 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence.
8. Méthode selon l'une des revendications 4 à 7, comprenant en outre la mesure dans un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrale
- d'un ratio N°4 des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 4 constitué de hsa-miR-320a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-320b/hsa-miR-127-3p, hsa-miR- 320c/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-17/hsa-miR-107, hsa-miR-106a/hsa-miR-23b, hsa-miR- 17/hsa-miR-23b, hsa-miR-345/hsa-miR-574-3p, hsa-miR- 19 l/hsa-miR-425-star.
9. Méthode selon la revendication 8, comprenant :
(i) la mesure de quatre ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrale, lesdits quatre ratios des niveaux d'expression étant :
- le ratio N°3 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa- miR-132, hsa-miR-320a/hsa-miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p,
- le ratio N°l des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR- 106a/hsa- miR-494 et hsa-miR- 17/hsa-miR-494,
- le ratio N°2 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-210/hsa- miR-193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p,
- le ratio N°4 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-320a/hsa- miR-127-3p, hsa-miR-320b/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-320c/hsa-miR-127-3p, hsa-miR- 17/hsa-miR-107, hsa-miR-106a/hsa-miR-23b, hsa-miR-17/hsa-miR-23b, hsa-miR-345/hsa- miR-574-3p, hsa-miR- 19 l/hsa-miR-425-star.
10. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est confirmée :
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, ou lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le ratio N°4 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
11. Méthode selon l'une des revendications 4 à 7, comprenant en outre la mesure dans un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrale d'un ratio N°5 des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 5 constitué de hsa-miR-345/hsa-miR-324-5p, hsa-miR-345/hsa-miR-185 et hsa-miR- 345/hsa-miR-320d.
12. Méthode selon la revendication 11, comprenant :
(i) la mesure de quatre ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrale, lesdits quatre ratios des niveaux d'expression étant :
- le ratio N°3 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa- miR- 132, hsa-miR-320a/hsa-miR-491 -5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491 -5p,
- le ratio N°l des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR- 106a/hsa- miR-494 et hsa-miR- 17/hsa-miR-494,
- le ratio N°2 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-210/hsa- miR-193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p, et - le ratio N°5 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-345/hsa- miR-324-5p, hsa-miR-345/hsa-miR-185 et hsa-miR-345/hsa-miR-320d,
(ii) la comparaison des susdits ratios obtenus dans ledit échantillon avec ceux obtenus respectivement dans un tissus sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
13. Méthode selon la revendication 12, dans laquelle la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est confirmée :
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, ou lorsque le ratio du groupe 1 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence,
- lorsque le ratio N°5 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
14. Méthode selon l'une des revendications 4 à 7, comprenant en outre la mesure dans un échantillon biologique provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrale
- d'un ratio N°4 des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 4 constitué de hsa-miR-320a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-320b/hsa-miR-127-3p, hsa- miR-320c/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-17/hsa-miR-107, hsa-miR-106a/hsa-miR-23b, hsa-miR- 17/hsa-miR-23b, hsa-miR-345/hsa-miR-574-3p, hsa-miR-191/hsa-miR-425-star, et
- d'un ratio N°5 des niveaux d'expression de couples de miARNs choisis parmi le groupe 5 constitué de hsa-miR-345/hsa-miR-324-5p, hsa-miR-345/hsa-miR-185 et hsa-miR- 345/hsa-miR-320d.
15. Méthode selon la revendication 14, comprenant : (i) la mesure de cinq ratios des niveaux d'expression de couples de miARNs extraits d'un échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs cérébrale, lesdits cinq ratios des niveaux d'expression étant :
- le ratio N°3 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-423-5p/hsa- miR-491-5p, hsa-miR-210/hsa-miR-491-5p, hsa-miR-92a/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-92a/hsa- miR-132, hsa-miR-320a/hsa-miR-491-5p et hsa-miR-320c/hsa-miR-491-5p
- le ratio N°l des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-106a/hsa- miR-494 et hsa-miR-17/hsa-miR-494,
- le ratio N°2 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-210/hsa- miR- 193b et hsa-miR-210/hsa-miR-423-5p,
- le ratio N°4 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-320a/hsa- miR-127-3p, hsa-miR-320b/hsa-miR-127-3p, hsa-miR-320c/hsa-miR-127-3p, hsa-miR- 17/hsa-miR-107, hsa-miR-106a/hsa-miR-23b, hsa-miR-17/hsa-miR-23b, hsa-miR-345/hsa- miR-574-3p, hsa-miR-191/hsa-miR-425-star, et
- le ratio N°5 des niveaux d'expression de couples choisis parmi hsa-miR-345/hsa- miR-324-5p, hsa-miR-345/hsa-miR-185 et hsa-miR-345/hsa-miR-320d,
(ii) la comparaison des susdits ratios obtenus dans ledit échantillon avec ceux obtenus respectivement dans un tissus sain de référence, un tissu d'ODG de référence et un tissu de GBM de référence.
16. Méthode selon la revendication 15, dans laquelle la déduction de la présence d'ODG dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite :
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, ou lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°l mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et
- lorsque le ratio N°4 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
17. Méthode selon la revendication 15, dans laquelle la déduction de la présence de GBM dans l'échantillon provenant d'un patient suspecté de présenter une des susdites tumeurs est faite :
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon n'est pas au moins 4 fois supérieur ou au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu de GBM de référence, ou lorsque le ratio du groupe 1 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois inférieur à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°2 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence, et à celui obtenu dans un tissu d'ODG de référence, et
- lorsque le ratio N°3 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui obtenu dans un tissu sain de référence,
- lorsque le ratio N°5 mesuré dans ledit échantillon est au moins 4 fois supérieur à celui mesuré dans un tissu sain de référence.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMBROS ET AL.: "A uniform system for microRNA annotation", RNA, vol. 9, no. 3, 2003, pages 277 - 279, XP009032091, DOI: doi:10.1261/rna.2183803
BARTEL ET AL., CELL, vol. 116, no. 2, 2004, pages 281 - 97
BENARD, J.; S. DOUC-RASY, BULL CANCER, vol. 92, no. 9, 2005, pages 757 - 62
CHEN YAO-TSENG ET AL: "Messenger RNA expression ratios among four genes predict subtypes of renal cell carcinoma and distinguish oncocytoma from carcinoma.", CLINICAL CANCER RESEARCH : AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH 15 SEP 2005 LNKD- PUBMED:16166433, vol. 11, no. 18, 15 September 2005 (2005-09-15), pages 6558 - 6566, XP002636533, ISSN: 1078-0432 *
CHEN, N ENGL J MED, vol. 353, no. 17, 2005, pages 1768 - 71
CIAFRE ET AL., BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 334, no. 4, 9 September 2005 (2005-09-09), pages 1351 - 8
GRIFFITHS-JONES ET AL., NAR, vol. 36, 2008, pages D154 - D158
HAMMOND, CURR OPIN GENET DEV, vol. 16, no. 1, 2006, pages 4 - 9
JESSE CHUNG-SEAN PANG ET AL: "Oncogenic role of microRNAs in brain tumors", ACTA NEUROPATHOLOGICA, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 117, no. 6, 3 April 2009 (2009-04-03), pages 599 - 611, XP019713406, ISSN: 1432-0533 *
LI A; WALLING J; AHN S; KOTLIAROV Y; SU Q; QUEZADO M; OBERHOLTZER JC; PARK J; ZENKLUSEN JC; FINE HA, CANCER RES., vol. 69, no. 5, 1 March 2009 (2009-03-01), pages 2091 - 9
NEELY LORI A ET AL: "A microRNA expression ratio defining the invasive phenotype in bladder tumors.", UROLOGIC ONCOLOGY 2010 JAN-FEB LNKD- PUBMED:18799331, vol. 28, no. 1, January 2010 (2010-01-01), pages 39 - 48, XP002636534, ISSN: 1873-2496 *
RA. IRIZARRY; B HOBBS; F COLLIN; Y D. BEAZER-BARCLAY; K J. ANTONELLIS; U SCHERF; T P. SPEED: "Exploration, Normalization, and Summaries of High Density Oligonucleotide Array Probe Level Data", BIOSTATISTICS, vol. 4, no. 2, April 2003 (2003-04-01), pages 249 - 264, XP002466228, DOI: doi:10.1093/biostatistics/4.2.249
SANGER MIRBASE VERSION 16, September 2010 (2010-09-01)
SILBER ET AL., BMC MED., vol. 6, 24 June 2008 (2008-06-24), pages 14
SKOG, NAT CELL BIOL., vol. 10, no. 12, 16 November 2008 (2008-11-16), pages 1470 - 6

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