WO2012052684A1 - Procede de detection de dommages irreversibles de l'adn et mesure des effets genotoxiques d'agents sur des stades precoces de developpement d'organismes entiers - Google Patents

Procede de detection de dommages irreversibles de l'adn et mesure des effets genotoxiques d'agents sur des stades precoces de developpement d'organismes entiers Download PDF

Info

Publication number
WO2012052684A1
WO2012052684A1 PCT/FR2011/052443 FR2011052443W WO2012052684A1 WO 2012052684 A1 WO2012052684 A1 WO 2012052684A1 FR 2011052443 W FR2011052443 W FR 2011052443W WO 2012052684 A1 WO2012052684 A1 WO 2012052684A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
dissociation
dna damage
measuring
embryo
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/FR2011/052443
Other languages
English (en)
Inventor
Saadia Berrada
Bénédicte MORIN
Jérôme CACHOT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ATOXIGEN R
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1
Original Assignee
ATOXIGEN R
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ATOXIGEN R, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Sciences et Technologies Bordeaux 1 filed Critical ATOXIGEN R
Publication of WO2012052684A1 publication Critical patent/WO2012052684A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F1/00—Treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F1/008—Control or steering systems not provided for elsewhere in subclass C02F
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
    • C02F3/32—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the animals or plants used, e.g. algae
    • C02F3/327—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the animals or plants used, e.g. algae characterised by animals and plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2209/00—Controlling or monitoring parameters in water treatment
    • C02F2209/003—Downstream control, i.e. outlet monitoring, e.g. to check the treating agents, such as halogens or ozone, leaving the process
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
    • C02F2209/00—Controlling or monitoring parameters in water treatment
    • C02F2209/36—Biological material, e.g. enzymes or ATP
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W10/00—Technologies for wastewater treatment
    • Y02W10/10—Biological treatment of water, waste water, or sewage

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting DNA damage as well as a method for measuring genotoxic effects induced by chemical, biological or physical agents.
  • the invention also relates to the use of these methods, in particular for detecting, analyzing and / or studying the genotoxicity of compounds for humans or the environment, or for evaluating the therapeutic efficacy of compounds, in particular for evaluating the efficacy of chemotherapeutic substances or anti-cancer substances, or for evaluating the effectiveness of water and sludge treatment processes.
  • micronucleus test described for the first time by Fenech and Mor / ey (1985), is particularly known.
  • Micronuclei are defined as fragments of chromosomes or whole chromosomes lost by the cell nucleus during mitosis and forming small, well-individualized entities in the cytoplasm of the cells. Interphase. They are generated during a cell division and come from chromosomal breaks induced by so-called clastogenic agents, or from mitotic spindle anomalies induced by so-called aneugenes agents. They result from a direct genotoxic effect or epigenetic modifications that lead to the appearance of stable chromosomal mutations.
  • micronuclei is therefore an imprint of irreversible DNA damage, which can trigger a cascade of adverse biological effects for cells, organs, whole organisms and even populations.
  • micronucleus test or micronucleus test has been used for many years to evaluate the genotoxicity of compounds in higher organisms. It is a mutagenicity test that identifies clastogenic or anecdotal physical or chemical agents. It is widely validated and is subject to an OECD Guideline (No. 487).
  • micronuclei The presence of micronuclei is considered to be a biomarker of genotoxic effects. Studies on fish or amphibians have shown the presence of micronuclei in cases of pollution proven to heavy metals or hydrocarbons. In humans, it is known that micronuclei can make it possible to demonstrate chromosomal damage induced by mutagenic or carcinogenic agents.
  • genotoxicity tests have also been developed on cells of multicellular organisms. These tests are carried out from isolated cells taken from whole organisms after exposure to the test substance. These are usually cells from connective tissues, particularly lymphocytes or erythrocytes.
  • Patent application WO-2007/038664 for example describes the application of the micronucleus test for the analysis of bone marrow cells or peripheral blood of mice.
  • the test has also been applied to pleurodelic amphibian erythrocytes (Jaylet et al., "A new micronucleus test using peripheral blood erythrocytes to newt Pleurodeles waiti to detect mutagens in fresh-water pollution” Mutation Research vol.164 issue 4 ( augustl986) p245-257), fish (Bahari et al., "Micronucleated erythrocytes as an assay to assess actions by physical and chemical genotoxic agents in Clarias gariepinus” Mutation Research, 313: 1-5 (1994)), or on Hemolymph of bivalves such as oysters (Burgeot et al., "The micronucleus assay in Crassostrea gigas for the detection of seawater genotoxicity" Mutation Res.
  • the invention proposes to use multicellular organisms, namely whole organisms at early stages of development.
  • the invention relates to a method for detecting irreversible damage to DNA from embryos or larvae of amphibians, molluscs, fish or annelids, or from mammalian animal embryos, comprising in particular the following steps:
  • multicellular system is intended to mean any system consisting of at least two cell types, chosen from:
  • any animal mammalian embryo for example rat or mouse embryos.
  • mammal animal any mammal with the exception of human beings.
  • the multicellular system will be chosen from embryos or larvae of amphibians, fish, molluscs or annelids.
  • embryo-larval stage or “embryo-larva” is meant any pro-larva or embryo, that is to say any embryo intended to give a larva, before hatching of said larva.
  • the invention also relates to a method for measuring the genotoxic potential of chemical, biological or physical agents, comprising in particular the following steps:
  • agent within the meaning of the invention is meant any chemical and / or biological agent, pure or within a composition, or any physical agent whose genotoxic effects are to be evaluated. This can be for example:
  • progénotoxic pollutants that are likely to be found in the environment, such as polycyclic aromatic hydrocarbons, certain pesticides and organochlorine solvents, aromatic amines,
  • nitro-polycyclic aromatic hydrocarbons such as nitro-polycyclic aromatic hydrocarbons, nitrosoalkylureas, certain metals,
  • anticancer drugs bleomycin, cisplatin, carboplatin, etc.
  • the method for detecting irreversible alterations of the DNA according to the invention is economical and makes it possible to analyze a large number of molecules in a minimum of time. It provides information on longer-term effects such as genetic instability and cancer. It presents a great specificity and response sensitivity.
  • the method according to the invention can be used in various fields, in particular for the evaluation of the therapeutic efficacy of compounds or for the detection, the evaluation of the genotoxicity and / or the study of environmental contaminants or the assessment of the potential impact of these pollutants on human health or the environment.
  • the invention therefore aims at a process for detecting irreversible DNA damage from a multicellular system or organism chosen from the whole organisms of amphibians, molluscs, annelids or fish, a larval or embryo-larval stage, and mammalian animal embryos, comprising the following steps:
  • the cell suspension is obtained by performing on the multicellular system, at least two successive dissociations: a mechanical dissociation (physical dissociation) followed by at least one enzymatic dissociation. Even more preferentially, the cell suspension is obtained by performing on the multicellular system three successive dissociations: a mechanical dissociation followed by two enzymatic dissociations.
  • enzymatic dissociation a dissociation comprising the use of at least one enzyme.
  • the enzymatic dissociation may optionally comprise substeps of mechanical treatment.
  • the suspension of isolated cells is obtained by carrying out the following steps:
  • the mechanical dissociation step comprises at least the implementation of the following substeps:
  • the enzymatic dissociation performed next preferably comprises the implementation of the following substeps:
  • collagenase is collagenase IV.
  • collagenase is derived from Clostridium histolyticum.
  • collagenase is used at a concentration of between 0.2 and 2 mg / ml of culture medium, in particular between 0.5 and 1.8 mg / ml.
  • This dissociation with collagenase is preferably followed by a second enzymatic dissociation.
  • This second enzymatic dissociation is carried out during the presence of cell clusters. It preferably comprises at least the implementation of the following substeps:
  • centrifuge preferably between 5 and 30 minutes
  • a suspension of isolated heterogeneous cells is thus obtained.
  • this method makes it possible to obtain a large number of dissociated cells for a small quantity of embryos, pro larvae or larvae.
  • the cell suspension has several cell types.
  • this step can comprise at least the implementation of the following substeps:
  • hypotonically shocking the cells in order to inflate the cells to increase detection of micronuclei later in the case of Wright staining, centrifug the cell suspension at least once and put it in contact with a fixative,
  • the cells can be bathed in a solution of Potassium Chloride.
  • Potassium plays a role in the regulation of cell volume: during an increase in the volume of a cell, the potassium channels are open allowing the passage of water containing these ions from the most concentrated to the least concentrated medium. A higher concentration of potassium ion in the external medium allows the absorption of water and ions by the cell, and therefore the increase of the volume thereof.
  • the cells are centrifuged and fixed. There may be alternatively several repetitions: centrifugation of the cell suspension and fixation.
  • the fixative is preferably a Carnoy solution or a modified Carnoy solution, containing in particular acetic acid and methanol.
  • the acetic acid / methanol ratio is preferably between 2/1 and 5/1.
  • Acetic acid creates hydrogen bonds with the polar heads of phospholipids, thus allowing a stabilization of the cellular structure.
  • Methanol allows the water molecules in the medium to solubilize proteins, by swelling the three-dimensional structures of these proteins. After the last centrifugation, the supernatant is removed and the cells are placed spotwise on degreased slides. The slides are then dried and stained.
  • the cells are stained. They can be stained with a Wright stain or May-Griinwald Giemsa stain or a Wright stain or May-Griinwald Giemsa stain. changed.
  • the micronucleus can also be revealed by fluorescent labeling (acridine orange, DAPI, etc.) and reading under an epifluorescence microscope.
  • the qualitative and / or quantitative detection of the presence of micronuclei in the cells is carried out.
  • the cell population is composed of different kinds of cells, the starting system being multicellular. All cells on the slides are in the mononuclear stage.
  • the cell reading and micronucleus search procedure takes into account three distinct types of objects: cells, nuclei and micronuclei.
  • the slides are preferably read under the microscope with the naked eye or by an automated device.
  • the slides can be read with an optical microscope. Next, count the number of mononuclear cells with one or more micronuclei.
  • Crystals recognition criteria include:
  • the nucleus must be contained in the cytoplasm
  • the core must have a round or oval shape
  • Criteria for recognizing micronuclei include:
  • micronucleus must be round or oval with smooth edges
  • the micronucleus can be slightly connected to the main core and overlap it,
  • micronucleus is not refractive and can be distinguished from artifacts
  • the micronucleus must have the same coloration as the main nuclei, the micronucleus must have approximately the same intensity of coloration as the main nuclei,
  • the diameter of the micronuclei varies between 1/10 and 1/3 of the area of the main core.
  • the presence of micronuclei indicates irreversible DNA damage.
  • the method according to the invention is thus useful as a biomarker of genotoxic lesions.
  • the method according to the invention can therefore be used to determine irreversible lesions of DNA.
  • the method for detecting irreversible lesions of the DNA according to the invention can be used to measure the genotoxic effects of various agents or compounds.
  • the invention therefore also relates to a particular method for measuring the genotoxic effects of chemical, biological or physical agents.
  • the method comprises at least the following steps:
  • the embryos are therefore brought into contact with a potentially toxic compound at a very early stage of development where the rate of cell division is very high.
  • the method according to the invention thus makes it possible to evaluate effectively whether the cell repair systems are sufficient to protect the body from the impact on the DNA of the test compound.
  • the embryos of animal mammals, fish, molluscs, annelids and amphibians respect the new bioethical rules concerning animal experimentation.
  • molluscs we can choose among gastropods and bivalves, in particular the little gray snail ⁇ Hélix aspersa) and the hollow oyster (Crassosfrea gigas).
  • the fish it is possible to choose among the teleost fishes, in particular the Zebrafish (ùan / o renders) or the Japanese Medaka (Oryzias latipes).
  • the annelids we can choose among the earthworms (Lombricidae), especially the manure worm (Eisenia fetida).
  • the amphibians it is possible to choose among the xenopus (Xenopus laevis) or the pleurodela (P / eurode / es waltlii).
  • teleost embryo larvae are used, in particular Zebrafish (ùan / oerio) or Japanese Medaka (Oryzias latipes).
  • Zebrafish ùan / oerio
  • Medaka Oryzias latipes
  • Medaka embryo-larvae are used.
  • the Medaka is a small freshwater fish native to Southeast Asia. It has been used as a model in genetics for many years. It is an internationally recognized vertebrate biological model in toxicology and is one of the freshwater fish species advocated by the OECD for assessing the hazards and risks of chemical substances.
  • the embryos After fertilizing the eggs of fish, molluscs, annelids or amphibians, the embryos are harvested. They are then kept in a medium suitable for their development, for example an ERS medium (Egg Rearing Solution, solution for rearing eggs), or sediment until hatching. Alternatively, the embryos can be previously decorionized, for example with ⁇ (Embryo Enclosure Enzyme) to allow better penetration of the test compound and increase the sensitivity of the test. The embryos are put in contact with the agent whose genotoxicity is to be evaluated between 1 hour and 10 days after fertilization of the eggs.
  • ERS medium Egg Rearing Solution, solution for rearing eggs
  • ⁇ Embryo Enclosure Enzyme
  • the treatment may be acute or subacute by sweating, topical deposition on the surface of the egg, sediment-contact or microinjection into the egg.
  • test substance is water-soluble it is solubilized in the culture medium of the embryos and if the substance is hydrophobic, it is deposited on the surface of the embryo, microinjected in the egg or coated on a sediment or a soil on which the eggs are incubated.
  • the embryo-larvae may for example be exposed to different concentrations of the agent or compound to be tested (especially water-soluble compounds and certain metal salts) diluted in the culture medium. After 24 to 48 hours of exposure, the embryos are rinsed and returned to clean environment until hatching. Another alternative is low-dose chronic exposure throughout embryonic development.
  • the agent or compound to be tested especially water-soluble compounds and certain metal salts
  • the fertilized embryos are placed on sediment or soil previously coated with the test compound (hydrophobic compounds and certain heavy metals) at different concentrations. The embryos then remain in contact with this sediment or the soil for 24 hours or for the duration of their embryonic development.
  • the test compound hydrophobic compounds and certain heavy metals
  • the larvae After hatching, the larvae are placed in mixing water (osmosis water and tap water) under appropriate rearing conditions.
  • mixing water osmosis water and tap water
  • the step of measuring the micronucleus level formed in the cells preferably comprises a step of comparison with the results obtained with embryo-larvae that have not been brought into contact with the compound, the agent whose genotoxicity must be evaluated.
  • Such a method constitutes a bioassay for measuring the genotoxicity of physical, chemical or biological agents alone or integrated in compositions, fast, simple to implement, economical and very effective.
  • the method for measuring the genotoxic effects of chemical, biological or physical agents according to the invention can be used in ecotoxicology to study the impact of environmental contaminants contained in various matrices, for example water, sediments, suspended solids. , soils, etc.
  • the method according to the invention can therefore be used for the detection, analysis and / or study of environmental contaminants and the study of the quality of the environment. For example, it can be used for assessing the toxicity of urban or industrial effluents, dredged sludge or sewage treatment plants. As a specific example, it can be used to control the quality of water or sludge after treatment in treatment plants or to evaluate the efficiency of a water purification process. water or purification of water or sludge or to control soil remediation.
  • the invention also relates to the use of the method for measuring the genotoxic effects of chemical, biological or physical agents, for the detection, analysis and / or study of the genotoxicity of compounds for humans, particularly in cosmetology, agrochemistry, agribusiness and pharmacy.
  • the method may also be useful for evaluating the therapeutic efficacy of compounds, particularly chemotherapeutic substances or anticancer substances.
  • the method according to the invention may therefore constitute a predictive test or diagnosis in health and / or environmental biomonitoring. Its use can make it possible to demonstrate the pollution of a given environment.
  • the process according to the invention is very sensitive and makes it possible to demonstrate the genotoxicity of compounds present in very low concentrations in a given medium. Applied to whole organism (embryos or larvae), it can also reveal or confirm the bio-availability of substances by demonstrating that they are able to penetrate organisms, that they have been distributed in their tissues, have been there metabolized, transformed and induced biological effects.
  • This example consists in testing on Medaka embryo-larvae three agents: Cadmium and two polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), Benzo [a] pyrene (BaP) and Fluoranthene.
  • PHs Cadmium and two polycyclic aromatic hydrocarbons
  • BaP Benzo [a] pyrene
  • Fluoranthene Fluoranthene
  • Cadmium has been known for its toxicity for more than 50 years. It is bioaccumulated in organisms and biomagnified throughout the food chain. It is toxic in all its forms (salt, metal, vapor, organic compounds) and is recognized as a CM (carcinogenic, mutagenic, reprotoxic).
  • BaP (C 20 H 12 ) is one of the most well known and studied PAHs. It is also one of the most toxic. It is mutagenic and highly carcinogenic because after bioactivation in benzo [a] pyrene diol epoxide it forms strong covalent interactions with certain bases of DNA. It is formed during the incomplete combustion of organic matter, hence its important representation in the environment. Fluoranthene is a polycyclic aromatic hydrocarbon widely used in the environment. It is the product of an incomplete combustion of organic matter. Its effects are poorly known and many studies tend to show that it is not genotoxic.
  • the study is performed on Medaka embryo-larvae.
  • Adult fish are raised in aquariums (2/3 of osmosis water and 1/3 of tap water) with a ratio of 2 males for a female.
  • the temperature is maintained at 24 ° C and the photoperiod corresponds to the natural photoperiod.
  • the fish are fed twice a day and the water is renewed twice a week for at least 1/5 of the volume.
  • the operating protocol is described following.
  • the embryos are harvested.
  • the embryos are arranged in an ERS buffer composed of [NaCl (lg),
  • the embryos are exposed for 24 hours to different concentrations of contaminant (0.1 ⁇ , 1 ⁇ and 10 ⁇ ) diluted in the ERS.
  • the embryos are rinsed and returned to the ERS until they hatch.
  • the embryos are placed on sediment previously coated with fluoranthene at different concentrations (0.22 g / g, 0.44 g / g and 1.72 g / g). In order to match the natural conditions, the embryos remain in contact with this sediment until they hatch. The sediment is not renewed during the experiment. Embryos are covered with culture medium (ERS buffer). A negative control without contaminant is carried out in parallel.
  • ERS buffer culture medium
  • the larvae After hatching, irrespective of the type of contamination, the larvae are placed in mixing water for 10 days, in order to allow the fixation of primary damage in the form of mutations and to have enough cells.
  • the larvae are then placed in microtubes which are immersed for at least 5 minutes in water with melted ice to anesthetize them.
  • the larvae are then rinsed with sterile cell culture medium containing antibiotics. This operation is renewed once.
  • the larvae are then dissociated in three successive stages: mechanical dissociation and two enzymatic dissociations.
  • the mechanical dissociation is carried out as follows:
  • the larvae are finely cut with a sterile razor blade
  • the material is recovered in eppendorf tubes containing culture medium, which is then put in ice,
  • the culture medium is removed.
  • Collagenase from Clostridium histolyticum type IV is introduced into culture medium at a concentration of approximately 1 mg / ml.
  • the dissociation is then carried out as follows: the culture medium containing collagenase is introduced into the tubes containing the material resulting from the mechanical dissociation,
  • the tubes are placed in an incubator at 37 ° C. with gentle agitation for between 30 and 60 minutes, then centrifuged for between 5 and 30 minutes, and
  • a second enzymatic dissociation can be implemented.
  • This is a trypsin disintegration.
  • This step includes a substep of mechanical dissociation. It is achieved by the implementation of the following steps:
  • the cells After dissociation, the cells are bathed in a solution of KCl.
  • the cell suspension is then centrifuged for 5 to 18 minutes and then the pellet is taken up in a fixative composed of methanol and acetic acid in a 4/1 ratio between 5 and 30 minutes. The operation is repeated once and the suspension follows a last centrifugation.
  • the supernatant is removed and the cells are spot-deposited on slides. The coloring is then carried out.
  • the slides are read with an optical microscope at X400 magnification. A thousand cells are counted on average on a slide.
  • Fluoranthene does not induce genotoxicity, which confirms a certain number of other studies carried out on the subject.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Hydrology & Water Resources (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

L'objet de l ' invention est un procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - obtention d'une suspension de cellules isolées par dissociation d'un système pluricellulaire, - récupération et traitement des cellules, et - mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules. L'invention concerne plus particulièrement un procédé de mesure des effets génotoxiques de composés, ainsi que ses utilisations notamment pour la détection, l'analyse et/ou l'étude de la toxicité de composés sur l'homme ou l'environnement, ou pour l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de composés, en particulier pour l'évaluation de l'efficacité de substances chimiothérapeutiques ou de substances ant\-cancéreuses ou encore pour l'évaluation de l'efficacité de procédés de traitement de l'eau ou des boues.

Description

PROCEDE DE DETECTION DE DOMMAGES IRREVERSIBLES DE L'ADN ET MESURE DES EFFETS GENOTOXIQUES D'AGENTS SUR DES STADES PRECOCES DE DEVELOPPEMENT D'ORGANISMES ENTIERS
La présente invention se rapporte à un procédé permettant de détecter des lésions de l'ADN ainsi qu a un procédé de mesure des effets génotoxiques induits par des agents chimiques, biologiques ou physiques.
L'invention vise également l'utilisation de ces procédés notamment pour la détection, l'analyse et/ou l'étude de la génotoxicité de composés pour l'homme ou l'environnement, ou pour l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de composés, en particulier pour l'évaluation de l'efficacité de substances chimiothérapeutiques ou de substances anti-cancéreuses, ou encore pour l'évaluation de l'efficacité de procédés de traitement de l'eau et des boues.
L'identification et la surveillance de substances et facteurs environnementaux susceptibles d'interagir avec le patrimoine génétique des cellules est devenue essentielle.
Dans cette perspective, plusieurs tests de génotoxicité ont été établis en vue de détecter de nouveaux agents génotoxiques, caractériser leurs propriétés et prévenir les conséquences des altérations de l'ADN qu'ils induisent.
Parmi ces tests, on connaît notamment le test du micronoyau, décrit pour la première fois par Fenech et Mor/ey (1985).
Les micronoyaux se définissent comme des fragments de chromosomes ou des chromosomes entiers perdus par le noyau cellulaire au cours de la mitose et formant de petites entités bien individualisées dans le cytoplasme des cellules en interphase. Ils sont générés au cours d'une division cellulaire et proviennent de cassures chromosomiques induites par des agents dits clastogenes, ou d'anomalies du fuseau mitotique induites par des agents dits aneugenes. Ils résultent d'un effet génotoxique direct ou de modifications épigénétiques qui aboutissent à l 'apparition de mutations chromosomiques stables.
La formation de micronoyaux est donc une empreinte de dommages irréversibles de l'ADN, dommages qui peuvent déclencher une cascade d'effets biologiques néfastes pour les cellules, les organes, les organismes entiers, voire les populations.
Le test de numération des micronoyaux ou test du micronoyau est utilisé depuis de nombreuses années pour évaluer la génotoxicité de composés chez les organismes supérieurs. C'est un test de mutagénéicité qui permet d' identifier les agents physiques ou chimiques clastogenes ou aneugenes. Il est largement validé et fait l'objet d'une ligne directrice OCDE (N°487).
La présence de micronoyaux est notamment considérée comme un biomarqueur d'effets génotoxiques. Des études sur des poissons ou des amphibiens ont mis en évidence la présence de micronoyaux dans des cas de pollution avérée aux métaux lourds ou aux hydrocarbures. Chez l'homme on sait que les micronoyaux peuvent permettre de mettre en évidence des dommages chromosomiques induits par des agents mutagènes ou cancérogènes.
Les tests in vitro de génotoxicité existants consistent à mettre un seul type de cellules isolées en présence de composés potentiellement génotoxiques de manière directe ou indirecte, leur faire subir au moins une division cellulaire, et comparer le nombre de micronoyaux dans les cellules à celui obtenu avec des cellules contrôles n'ayant pas été exposées aux composés. On peut citer à titre d'exemple la demande de brevet WO-02/14859 qui décrit notamment un tel procédé. Toutefois ce type de procédé, s'il peut être un bon indicateur, ne reflète pas la réalité, car dans la nature les composés ne sont pas directement mis en contact avec les cellules isolées. Ces tests in vitro ne prennent pas en compte le devenir de la substances dans l'organisme entier. Ils donnent donc une indication du potentiel génotoxique de la substance mais ne prennent pas en compte la toxico-cinétique de ladite substance.
En outre, ces tests in vitro ne sont pas adaptés pour tester la génotoxicité de substances hydrophobes telles que les HAP, PCB, pesticides organochlorés, solvants, etc., et extraits organiques, en raison de la faible solubilité de ces substances dans l'eau
Pour éviter ces limites, des tests de génotoxicité ont également été développés sur des cellules d'organismes pluricellulaires. Ces tests sont mis en oeuvre à partir de cellules isolées prélevées sur des organismes entiers après exposition à la substance étudiée. Il s'agit généralement de cellules provenant de tissus conjonctifs, en particulier des lymphocytes ou des érythrocytes.
La demande de brevet WO-2007/038664 par exemple décrit l'application du test des micronoyaux pour l'analyse de cellules de moelle osseuse ou du sang périphérique de souris. Le test a également été appliqué à des érythrocytes d'amphibiens pleurodèles (Jaylet et al., « A new micronucleus test using peripheral blood érythrocytes of to newt Pleurodèles waiti to detect mutagens in fresh-water pollution » Mutation Research vol.164 issue 4 (augustl986) p245-257), de poissons (Bahari et al., « Micronucleated érythrocytes as an assay to assess actions by physical and chemical genotoxic agents in Clarias gariepinus » Mutation Research , 313 :l-5 (1994)), ou sur l'hémolymphe des bivalves tels que des huîtres (Burgeot et al., « The micronucleus assay in Crassostrea gigas for the détection of seawater genotoxicity » Mutation Res. - ôenetic Toxicology 342: 125-140 (1995)).
Toutefois ces procédés présentent eux aussi plusieurs inconvénients.
Tout d'abord ces tests ont recours à des animaux. Or, la sensibilité du public et la réglementation actuelle, notamment européenne, imposent que l'on limite l'expérimentation sur animaux juvéniles ou adultes dans le cadre des tests de toxicologie. En outre, ces procédés sont très coûteux et ne permettent pas toujours de réaliser des études d'innocuité. La quantification des micronoyaux est le plus souvent réalisée sur des cellules isolées accessibles au prélèvement et non sur l'organe ou le tissu cible susceptible de subir des dommages d'où une tendance à minimiser les effets produits par la substance.
Il subsiste donc un besoin pour un outil complet de détection d'altérations irréversibles de l'ADN, palliant les inconvénients des procédés de l'art antérieur. Pour y répondre, l'invention propose d'utiliser des organismes pluricellulaires, à savoir des organismes entiers à des stades précoces de développement. En particulier l'invention vise un procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN à partir d'embryons ou de larves d'amphibiens, de mollusques, de poissons ou d'annélides, ou à partir d'embryons de mammifères animaux, comprenant notamment les étapes suivantes :
- obtention d'une suspension de cellules isolées par dissociation physique et enzymatique dudit système pluricellulaire,
- récupération et traitement des cellules, et
- mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules.
Par « système pluricellulaire » au sens de l'invention, on entend donc tout système constitué d'au moins deux types cellulaires, système choisi parmi :
- tout amphibien, tout mollusque, tout poisson ou tout annélide, à un stade embryo-larvaire ou larvaire,
- tout embryon de mammifère animal, par exemple des embryons de rats ou de souris.
Par mammifère animal on entend tout mammifère à l'exception des êtres humains.
Préférentiellement on choisira le système pluricellulaire parmi les embryons ou les larves d'amphibiens, de poissons, de mollusques ou d'annélides. Par « stade embryo-larvaire » ou « embryo-larve », on entend toute pro-larve ou embryon c'est à dire tout embryon destiné à donner une larve, avant éclosion de ladite larve.
L'invention vise aussi un procédé de mesure du potentiel génotoxique d'agents chimiques, biologiques ou physiques, comprenant notamment les étapes suivantes :
- mise en contact d'au moins un organisme entier d'amphibien, de mollusque, d'annélide ou de poisson à un stade embryo-larvaire, avec au moins un agent dont la génotoxicité doit être évaluée,
- récupération de l'organisme entier à un stade embryonnaire plus avancé ou après éclosion à un stade larvaire, et
- dissociation physique et enzymatique de l'organisme récupéré de façon à obtenir une suspension de cellules isolées,
- récupération et traitement des cellules, et
- mesure du taux de micronoyaux formés.
Par « agent » au sens de l'invention, on entend tout agent chimique et/ou biologique, pur ou au sein d'une composition, ou tout agent physique dont on souhaite évaluer les effets génotoxiques. Cela peut être par exemple :
- des polluants progénotoxiques que l'on est susceptible de trouver dans l'environnement, comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques, certains pesticides et solvants organochlorés, les aminés aromatiques,
- des polluants génotoxiques directs que l'on est susceptible de trouver dans l'environnement, comme des hydrocarbures aromatiques polycycliques nitrés, des nitrosoalkylurée, certains métaux,
- des anticancéreux (bléomycine, cisplatine, carboplatine, etc.), ou encore
- des radiations, ionisantes ou non ionisantes.
Avantageusement, le procédé de détection d'altérations irréversibles de l'ADN selon l'invention est économique et permet d'analyser un grand nombre de molécules en un minimum de temps. Il permet de renseigner sur des effe s à plus long terme comme l'instabilité génétique et le cancer. Il présente une grande spécificité et sensibilité de réponse.
L'exposition à un stade très précoce du développement des organismes, le stade embryonnaire, permet d'évaluer les effets génotoxiques de polluants au moment où la croissance cellulaire est à son maximum et les systèmes de réparation de l'ADN sont inopérants.
Le procédé selon l'invention peut être utilisé dans différents domaines, en particulier pour l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de composés ou pour la détection, l'évaluation de la génotoxicité et/ou l'étude de contaminants environnementaux ou encore l'évaluation de l'impact potentiel de ces polluants pour la santé humaine ou l'environnement.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre.
Selon un premier objet, l'invention vise donc un procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN à partir d'un système ou organisme pluricellulaire choisi parmi les organismes entiers d'amphibiens, de mollusques, d'annélides ou de poissons, à un stade larvaire ou embryo-larvaire, et les embryons de mammifères animaux, comprenant les étapes suivantes :
- obtention d'une suspension de cellules isolées par dissociation physique et enzymatique dudit système pluricellulaire,
- récupération et traitement des cellules, et
- mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules.
Préférentiellement, la suspension de cellules est obtenue en réalisant sur le système pluricellulaire, au moins deux dissociations successives : une dissociation mécanique (dissociation physique) suivie d'au moins une dissociation enzymatique. Encore plus préférentiellement la suspension de cellules est obtenue en réalisant sur le système pluricellulaire, trois dissociations successives : une dissociation mécanique suivie de deux dissociations enzymatiques.
Par dissociation enzymatique, on entend une dissociation comprenant l'utilisation d'au moins une enzyme. La dissociation enzymatique peut éventuellement comprendre des sous-étapes de traitement mécanique.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l'obtention de la suspension de cellules isolées est réalisée par la mise en oeuvre des étapes suivantes :
- dissociation mécanique du système pluricellulaire,
- dissociation par digestion enzymatique à la collagénase, et
- dissociation des amas cellulaires non dissociés par la collagénase, avec de la trypsine.
Préférentiellement, l'étape de dissociation mécanique comprend au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes :
- découper le système pluricellulaire (embryon ou larve) à l'aide de lames, par exemple des lames de rasoir ou un scalpel à lames très fines,
- placer le matériel découpé dans un milieu de culture adapté en fonction du système pluricellulaire utilisé,
- centrifuger entre 5 et 30 minutes, et
- enlever le milieu de culture.
La dissociation enzymatique réalisée ensuite comprend préférentiellement la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes :
- placer le matériel issu de la dissociation mécanique dans un milieu contenant de la collagénase,
- incuber, préférentiellement à 37°C sous agitation douce, puis centrifuger, préférentiellement entre 5 et 30 minutes, et
- enlever le milieu de culture avec la collagénase. La collagenase est la collagenase IV. De façon préférée la collagénase est issue de Clostridium histolyticum. Pour un meilleur résultat, la collagénase est utilisée à une concentration comprise entre 0,2 et 2 mg/ml de milieu de culture, en particulier entre 0,5 et 1,8 mg/ml.
Cette dissociation à la collagénase est préférentiellement suivie d'une seconde dissociation enzymatique. Cette seconde dissociation enzymatique est réalisée lors de la présence d'amas cellulaires. Elle comprend préférentiellement au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes :
- placer le matériel issu de la première dissociation enzymatique en contact avec de la trypsine,
- incuber, préférentiellement à 37°C sous agitation douce,
- rincer avec du milieu de culture et dissocier mécaniquement le culot cellulaire, notamment avec un mouvement de va et vient,
- éventuellement filtrer la suspension cellulaire sur un tamis de diamètre compris entre 50 et 200 microns, dans un but d'automatisation du test,
- centrifuger, préférentiellement entre 5 et 30 minutes, et
- renouveler l'opération une fois.
On obtient ainsi une suspension de cellules hétérogènes isolées.
Avantageusement, ce procédé permet d'obtenir un grand nombre de cellules dissociées pour une petite quantité d'embryons, de pro-larves ou de larves. De plus la suspension de cellules comporte plusieurs types cellulaires.
Les cellules isolées sont ensuite récupérées et traitées. De façon particulièrement adaptée, cette étape peut comprendre au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes :
- faire subir aux cellules un choc hypotonique, afin de faire gonfler les cellules pour augmenter la détection des micronoyaux ultérieurement dans le cas d'une coloration de Wright, - centrifuger au moins une fois la suspension cellulaire et la mettre en contact avec un fixateur,
- prélever le surnageant,
- procéder à une coloration des cellules.
Pour réaliser le choc hypotonique, les cellules peuvent être baignées dans une solution de Chlorure de Potassium. Le potassium joue un rôle dans la régulation du volume cellulaire : lors d'une augmentation du volume d'une cellule, les canaux potassiques sont ouverts permettant alors le passage d'eau contenant ces ions du milieu le plus concentré vers le moins concentré. Une plus grande concentration en ion potassium dans le milieu extérieur permet une absorption d'eau et d'ions par la cellule, et donc l'augmentation du volume de celle-ci.
Après le choc hypotonique, les cellules sont centrifugées et fixées. Il peut y avoir alternativement plusieurs répétitions : centrifugation de la suspension cellulaire puis fixation.
Le fixateur est préférentiellement une solution de Carnoy ou une solution de Carnoy modifiée, contenant notamment de l'acide acétique et du méthanol. Le ratio acide acétique/méthanol est préférentiellement compris entre 2/1 et 5/1. L'acide acétique créé des liaisons hydrogènes avec les têtes polaires des phospholipides, permettant ainsi une stabilisation de la structure cellulaire. Le méthanol quant à lui permet aux molécules d'eau du milieu de solubiliser les protéines, en faisant gonfler les structures tridimensionnelles de ces protéines. Après la dernière centrifugation, le surnageant est prélevé et on dispose les cellules par spot sur des lames dégraissées. Les lames sont ensuite séchées puis colorées.
En effet, avant de pouvoir mesurer le taux de micronoyaux formés notamment par acquisition et analyse d'images au microscope, les cellules sont colorées. Elles peuvent notamment être colorées par une coloration Wright stain ou May- Griinwald Giemsa, ou une coloration Wright stain ou May-Griinwald Giemsa modifiée. La révélation des micronoyaux peut également s'opérer par marquage fluorescent (acridine orange, DAPI, etc.) et lecture sous microscope à épifluorescence.
Après coloration, on procède à la détection qualitative et/ou quantitative de la présence de micronoyaux dans les cellules.
La population cellulaire est composée de différentes sortes de cellules, le système de départ étant multicellulaire. Toutes les cellules présentes sur les lames sont au stade mononuclée. La procédure de lecture des cellules et de recherche des micronoyaux tient compte de trois types d'objets distincts : les cellules, les noyaux et les micronoyaux.
Les lames sont préférentiellement lues au microscope à l'œil nu ou grâce à un dispositif automatisé. Les lames peuvent être lues avec un microscope optique. Il convient ensuite de comptabiliser le nombre de cellules mononuclées avec un ou plusieurs micronoyaux.
Les critères de reconnaissance des noyaux sont notamment les suivants :
- le noyau doit être contenu dans le cytoplasme,
- le noyau doit avoir une forme ronde ou ovale,
- les courbures maximales admissibles pour les noyaux en forme de haricot doivent être nettes.
Les critères de reconnaissance des micronoyaux sont notamment les suivants :
- le micronoyau doit être rond ou ovale avec des bords lisses,
- le micronoyau peut être légèrement connecté au noyau principal et le chevaucher,
- le micronoyau n'est pas réfringent et peut se distinguer d'artéfacts,
- le micronoyau doit avoir la même coloration que les noyaux principaux, - le micronoyau doit avoir approximativement la même intensité de coloration que les noyaux principaux,
- le diamètre des micronoyaux varie entre 1/10 et 1/3 de l'aire du noyau principal.
La présence de micronoyaux indique une altération d'ADN irréversible. Le procédé selon l'invention est ainsi utile comme biomarqueur d'atteintes génotoxiques.
Avantageusement, le procédé selon l'invention peut donc être utilisé pour dé ecter des lésions irréversibles de l'ADN.
D'une manière générale, le procédé de détection de lésions irréversibles de l'ADN selon l'invention peut être utilisé pour mesurer les effets génotoxiques de divers agents ou composés.
C'est pourquoi, l'invention vise donc également un procédé particulier de mesure des effets génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques. Le procédé comprend au moins les étapes suivantes :
- mise en contact d'un organisme entier de type amphibien, mollusque, annélide ou poisson à un stade embryo-larvaire ou mammifère animal à un stade embryonnaire, avec au moins un agent dont la génotoxicité doit être évaluée,
- récupération de l'organisme entier à un stade embryonnaire plus avancé ou après éclosion à un stade larvaire, et
- détection de la présence de dommages irréversibles de l'ADN par la mise en oeuvre du procédé décrit précédemment, comprenant notamment les étapes suivantes :
· obtention d'une suspension de cellules isolées par dissociation physique et enzymatique dudit système pluricellulaire,
• récupération et traitement des cellules, et • mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules. Selon l'invention, les embryons sont donc mis en contact avec un composé potentiellement toxique, à un stade très précoce du développement où le taux de division cellulaire est très élevé. Le procédé selon l'invention permet ainsi d'évaluer efficacement si les systèmes de réparation cellulaire sont suffisants pour protéger l'organisme de l'impact sur l'ADN du composé testé. De plus, les embryons de mammifères animaux, de poissons, de mollusques, d'annélides et d'amphibiens respectent les nouvelles règles bioéthiques concernant l'expérimentation animale.
Parmi les mollusques, on peut notamment choisir parmi les gastéropodes et les bivalves, en particulier l'escargot petit-gris {Hélix aspersa) et l'Huitre creuse (Crassosfrea gigas).
Parmi les poissons, on peut notamment choisir parmi les poissons téléostéens, en particulier le Poisson Zèbre (ùan/o rend) ou le Medaka japonais (Oryzias latipes). Parmi les annélides on peut notamment choisir parmi les lombrics (Lombricidae), en particulier le vers du fumier (Eisenia fetida).
Parmi les amphibiens on peut notamment choisir parmi le xénope {Xenopus laevis) ou la pleurodèle (P/eurode/es waltlii).
De façon préférée, on utilise des embryo-larves de téléostéens, notamment de Poisson Zèbre (ùan/o rerio) ou de Medaka japonais (Oryzias latipes). Très préférentiellement on utilise des embryo-larves de Medaka. Le Medaka est un petit poisson d'eau douce originaire d'Asie du sud-est. Il est utilisé comme modèle en génétique depuis de nombreuses années. C'est un modèle biologique vertébré reconnu au niveau international en toxicologie et fait partie d'une des espèces de poisson d'eau douce préconisée par l'OCDE pour l'évaluation des dangers et des risques des substances chimiques.
Après fertilisation des œufs de poissons, de mollusques, d'annélides ou d'amphibiens, les embryons sont récoltés. Ils sont ensuite maintenus dans un milieu approprié à leur développement, par exemple un milieu ERS (« Egg Rearing Solution, solution pour l'élevage d'oeufs»), ou sur sédiments jusqu'à éclosion. Selon une variante, les embryons peuvent être préalablement déchorionisés, par exemple avec de ΓΕΕΕ (Enzyme d'Eclosion des Embryons) pour permettre une meilleure pénétration du composé à tester et accroître la sensibilité du test. Les embryons sont mis en contact avec l'agent dont on souhaite évaluer la génotoxicité, entre 1 heure et 10 jours après fertilisation des oeufs.
Le traitement peut être aigu ou subaigu par balnéation, dépôt topique à la surface de l'œuf, sédiment-contact ou microinjection dans l'œuf.
De façon préférentielle, si la substance étudiée est hydrosoluble elle est solubilisée dans le milieu de culture des embryons et si la substance est hydrophobe, elle est déposée à la surface de l'embryon, microinjectée dans l'œuf ou enrobée sur un sédiment ou un sol sur lequel sont incubés les œufs.
Pour la première variante, les embryo-larves peuvent par exemple être exposés à différentes concentrations de l'agent ou composé à tester (notamment composés hydrosolubles et certains sels métalliques) dilué dans le milieu de culture. Au bout de 24 à 48 heures d'exposition, les embryons sont rincés et remis dans du milieu propre jusqu'à éclosion. Une autre alternative est une exposition chronique à faibles doses pendant toute la durée du développement embryonnaire.
Pour la seconde variante, les embryons fécondés sont disposés sur du sédiment ou un sol préalablement enrobé avec le composé à tester (composés hydrophobes et certains métaux lourds) à différentes concentrations. Les embryons restent ensuite en contact avec ce sédiment ou le sol pendant 24h ou pendant toute la durée de leur développement embryonnaire.
Après éclosion les larves sont placées dans de l'eau de mélange (eau osmosée et eau du robinet) dans des conditions d'élevage appropriées.
On les récolte entre 0 et 15 jours après éclosion, préférentiellement entre 1 et 10 jours après éclosion, quoiqu'il en soit toujours avant que la larve n'ait terminé son développement (avant métamorphose complète). Au moment de la récolte, préalablement à la phase de dissociation des larves, il est préférable de plonger les larves dans l'eau entre 0 et 4°C, éventuellement à plusieurs reprises, afin de les anesthésier. On peut également les rincer avec un milieu de culture cellulaire stérile contant des antibiotiques.
Il convient ensuite de mettre en oeuvre les étapes de dissociation des larves, de récupération et traitement des cellules isolées obtenues, et enfin de mesure du taux de micronoyaux formés.
L'étape de mesure du taux de micronoyaux formé dans les cellules comprend préférentiellement une étape de comparaison avec les résultats obtenus avec des embryo-larves n'ayant pas été mises en contact avec le composé, l'agent dont la génotoxicité doit être évaluée.
Un tel procédé constitue un bioessai pour la mesure de la génotoxicité d'agents physiques, chimiques ou biologiques seuls ou intégrés dans des compositions, rapide, simple à mettre en oeuvre, économique et très efficace.
Le procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques selon l'invention peut être utilisé en écotoxicologie pour étudier l'impact de contaminants environnementaux contenus dans diverses matrices, par exemple l'eau, les sédiments, les matières en suspension, les sols, etc. Le procédé selon l'invention peut donc être utilisé pour la détection, l'analyse et/ou l'étude de contaminants environnementaux et l'étude de la qualité de l'environnement. Il peut par exemple être utilisé pour l'évaluation de la toxicité d'effluents urbains ou industriels, de boues de dragage ou de stations d'épuration. A titre d'exemple spécifique, il peut être utilisé pour le contrôle de la qualité de l'eau ou d'une boue après traitement dans les stations d'épuration ou l'évaluation de l'efficacité d'un procédé de potabilisation de l'eau ou d'épuration de l'eau ou des boues ou encore pour contrôler la dépollution des sols. L'invention vise aussi l'utilisation du procédé de mesure des effe s génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques, pour la détection, l'analyse et/ou l'étude de la génotoxicité de composés pour l'homme, notamment en cosmétologie, en agrochimie, agroalimentaire et en pharmacie. Le procédé peut également être utile pour évaluer l'efficacité thérapeutique de composés, en particulier de substances chimiothérapeutiques ou de substances anticancéreuses.
D'une manière générale, le procédé selon l'invention peut donc constituer un test prédictif ou diagnostic en biosurveillance sanitaire et/ou environnementale. Son utilisation peut permettre de démontrer la pollution d'un milieu donné.
De façon avantageuse, le procédé selon l'invention est très sensible et permet de démontrer la génotoxicité de composés présents en très faibles concentrations dans un milieu donné. Appliqué sur organisme entier (embryons ou larves), il peut aussi permettre de révéler ou confirmer la bio-disponibilité de substances en démontrant qu'elles sont capables de pénétrer dans les organismes, qu'elles ont été distribuées dans leurs tissus, y ont été métabolisées, transformées et y ont induit des effets biologiques.
L'invention est à présent illustrée par un exemple non limitatif de mise en oeuvre de l'invention.
Cet exemple consiste à tester sur des embryo-larves de Medaka, trois agents : le Cadmium et deux hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), le Benzo[a]pyrène (BaP) et le Fluoranthène.
Le Cadmium est connu pour sa toxicité depuis plus de 50 ans. Il est bioaccumulé dans les organismes et bioamplifié tout au long de la chaîne trophique. Il est toxique sous toutes ses formes (sel, métal, vapeur, composés organiques) et il est reconnu comme étant un CM (cancérogène, mutagène, reprotoxique).
Le BaP (C20H12) est l'un des HAP les plus connus et étudiés. C'est aussi l'un des plus toxiques. Il est mutagène et fortement cancérogène car après bioactivation en benzo[a]pyrène diol époxyde il forme des interactions covalentes fortes avec certaines bases de l'ADN. Il est formé lors de la combustion incomplète de matières organiques, d'où son importante représentation dans l'environnement. Le fluoranthène est un hydrocarbure aromatique polycyclique très répandu dans l'environnement. Il est le produit d'une combustion incomplète de la matière organique. Ses effets sont mal connus et de nombreuses études tendent à montrer qu'il n'est pas génotoxique.
L'étude est réalisée sur des embryo-larves de Medaka. Les poissons adultes sont élevés dans des aquariums (2/3 d'eau osmosée et 1/3 d'eau du robinet) avec un ratio de 2 mâles pour une femelle. La température est maintenue à 24°C et la photopériode correspond à la photopériode naturelle. Les poissons sont nourris deux fois par jour et l'eau est renouvelée deux fois par semaine pour au moins 1/5 du volume.
Le protocole opératoire est décrit en suivant.
1 - CONTAMINATION
Après fertilisation des œufs, les embryons sont récoltés.
- Pour le BaP ou le Cadmium
Les embryons sont disposés dans un tampon ERS composé de [NaCI (lg),
KCI (0,03g), CaCI2 (0,04g), MgS04 (0,163g)].
Entre le jour 3 et le jour 4 après fécondation, les embryons sont exposés pendant 24 heures à différentes concentrations de contaminant (0,1 μΜ, 1 μΜ et 10 μΜ) dilué dans l'ERS.
Au bout de 24 heures, les embryons sont rincés et remis dans de l'ERS jusqu'à leur éclosion.
- Pour le Fluoranthène
Les embryons sont disposés sur du sédiment préalablement enrobé de fluoranthène à différentes concentrations (0,22 g/g, 0,44 g/g et l,72 g/g). Afin de calquer les conditions naturelles, les embryons restent en contact avec ce sédiment jusqu'à leur éclosion. Le sédiment n'est pas renouvelé au cours de l'expérience. Les embryons sont recouverts de milieu de culture (tampon ERS). Un contrôle négatif sans contaminant est réalisé en parallèle.
Après I eclosion, quel que soit le type de contamination, les larves sont placées dans de l'eau de mélange pendant 10 jours, afin de permettre la fixation des dommages primaires sous forme de mutations et de pouvoir disposer de suffisamment de cellules.
Les larves sont ensuite placées dans des microtubes qui sont plongés au moins 5 minutes dans l'eau avec de la glace fondue afin de les anesthésier. Les larves sont ensuite rincées avec du milieu de culture cellulaire stérile contenant des antibiotiques. Cette opération est renouvelée une fois.
2 - DISSOCIATION
Les larves sont ensuite dissociées en trois étapes successives : une dissociation mécanique et deux dissociations enzymatiques.
a- Dissociation mécanique
La dissociation mécanique est réalisée comme suit :
- une quinzaine de larves sont récupérées à l'aide d'une pipette et sont placées dans une boîte de Pétri,
- les larves sont découpées finement avec une lame de rasoir stérile,
- le matériel est récupéré dans des tubes eppendorf contenant du milieu de culture, qui est ensuite mis dans de la glace,
- le matériel est ensuite centrifugé entre 5 et 30 minutes, puis
- le milieu de culture est enlevé.
b- lere dissociation enzymatique
De la collagénase issue de Clostridium histolyticum type IV est introduite dans du milieu de culture, à une concentration d'environ lmg/ml.
La dissociation est ensuite réalisée comme suit : - le milieu de culture contenant de la collagénase est introduit dans les tubes contenant le matériel issu de la dissociation mécanique,
- les tubes sont placés dans un incubateur à 37°C sous agitation douce pendant entre 30 et 60 minutes, puis centrifugés pendant entre 5 et 30 minutes, et
- le milieu de culture contenant la collagénase est enlevé, c- 2nde dissociation enzymatique
Eventuellement, une seconde dissociation enzymatique peut être mise en oeuvre. Il s'agit d'une désagrégation à la trypsine. Cette étape comprend une sous-étape de dissociation mécanique. Elle est réalisée par la mise en oeuvre des étapes suivantes :
- ajouter de la trypsine dans les tubes,
- placer les tubes dans l'incubateur à 37°C sous agitation douce entre 5 et 20 minutes,
- rincer la suspension cellulaire avec du milieu de culture,
- dissocier mécaniquement le culot cellulaire avec un mouvement de flux et reflux à l'aide d'une micropipette,
- éventuellement filtrer la suspension cellulaire sur un tamis de diamètre compris entre 50 et 200 microns,
- centrifuger pendant entre 5 et 30 minutes, et
- renouveler l'opération une fois en laissant la suspension cellulaire reposer dans ce milieu entre 2 et 10°C.
3 - RECOLTE ET TRAITEMENT DES CELLULES
Après dissociation, les cellules sont baignées dans une solution de KCI.
La suspension cellulaire est ensuite centrifugée entre 5 et 18 minutes, puis le culot est repris dans un fixateur composé de méthanol et d'acide acétique dans un ratio 4/1 entre 5 et 30 minutes. L'opération est renouvelée une fois et la suspension suit une dernière centrif ugation.
Le surnageant est prélevé, et les cellules sont déposées par spot sur des lames. On procède ensuite à la coloration.
Les lames sont colorées avec du colorant de Wright stain. Le procédé de coloration est le suivant :
- préparer une solution mère de colorant comprenant du méthanol dilué avec du PBS et de l'eau distillée,
- plonger les lames dans du colorant dilué pendant quelques minutes, - rincer les lames à l'eau courante, et
- laisser sécher les lames.
4 - LECTURE DES LAMES
Les lames sont lues avec un microscope optique au grossissement X400. Mille cellules sont dénombrées en moyenne sur une lame.
Les résultats obtenus en nombre moyen de cellules présentant des micronoyaux pour 1000 cellules sont présentés dans le tableau ci-dessous :
Figure imgf000020_0001
Les résultats obtenus pour le Cadmium et le BaP, connus pour leur génotoxicité, révèlent la présence de micronoyaux en plus grand nombre que pour les témoins non traités. Cela confirme que le procédé selon l'invention permet de révéler de façon dose-dépendante la génotoxicité de composés génotoxiques.
On constate par ailleurs qu'avec le procédé selon l'invention, le Fluoranthene n'induit pas de génotoxicité, ce qui confirme un certain nombre d'autres études menées sur le sujet.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN à partir d'un système pluricellulaire choisi parmi les organismes entiers d'amphibiens, de mollusques, d'annélides ou de poissons, lesdits organismes étant à un stade larvaire ou embryo-larvaire, et les embryons de mammifères animaux à l'exception des êtres humains, comprenant les étapes suivantes :
- obtention d'une suspension de cellules hétérogènes isolées par dissociation physique et enzymatique dudit système pluricellulaire,
- récupération et traitement des cellules, et
- mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules.
2. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'obtention de la suspension de cellules isolées est réalisée par la mise en oeuvre d'au moins deux dissociations successives du système pluricellulaire : une dissociation mécanique suivie d'au moins une dissociation enzymatique.
3. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'obtention de la suspension de cellules isolées est réalisée par la mise en oeuvre de trois dissociations successives du système pluricellulaire : une dissociation mécanique suivie de deux dissociations enzymatiques.
4. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'obtention de la suspension de cellules isolées est réalisée par la mise en oeuvre des étapes suivantes :
- dissociation mécanique du système pluricellulaire,
- dissociation par digestion enzymatique à la collagénase, et - éventuellement dissociation des amas cellulaires non dissociés par la collagénase, avec de la trypsine.
5. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que l'étape de dissociation mécanique comprend au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes :
- découper le système pluricellulaire à l'aide de lames,
- placer le matériel découpé dans un milieu de culture adapté,
- centrifuger, et
- enlever le milieu de culture.
6. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que la dissociation enzymatique ou première dissociation enzymatique comprend au moins la mise en oeuvre des sous- étapes suivantes :
- placer le matériel issu de la dissociation mécanique dans un milieu de culture contenant de la collagénase,
- incuber puis centrifuger, et
- enlever le milieu de culture.
7. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que la seconde dissociation enzymatique comprend au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes :
- placer le matériel issu de la première dissociation enzymatique en contact avec de la trypsine,
- incuber, rincer avec du milieu de culture et dissocier mécaniquement le culot cellulaire,
- éventuellement filtrer la suspension cellulaire sur un tamis de diamètre compris entre 50 et 200 microns,
- centrifuger, et
- renouveler l'opération une fois.
8. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape de récupération et de traitement des cellules de la suspension comprend au moins la mise en oeuvre des sous-étapes suivantes :
- faire subir aux cellules un choc hypotonique,
- centrifuger au moins une fois la suspension cellulaire et la mettre en contact avec un fixateur,
- prélever le surnageant,
- procéder à une coloration des cellules.
9. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le traitement des cellules avant mesure du taux de micronoyaux formés, consiste notamment à procéder à une coloration Wright stain ou May-Griinwald Glemsa.
10. Procédé de détection de dommages irréversibles de l'ADN selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l'étape de mesure du taux de micronoyaux formés dans les cellules, se fait à l'aide d'un microscope à l'œil nu ou grâce à un dispositif automatisé.
11. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, pour mesurer les effets génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques.
12. Procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents chimiques, biologiques ou physiques, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mise en contact d'un organisme entier de type amphibien, mollusque, annélide ou poisson, lesdits organismes étant à un stade embryo- larvaire, ou mammifère animal à un stade embryonnaire à l'exception des êtres humains, avec au moins un agent dont la génotoxicité doit être évaluée,
- récupération de l'organisme entier à un stade embryo-larvaire plus avancé ou après éclosion à un stade larvaire, et - détection de la présence de dommages irréversibles de l'ADN par la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10.
13. Procédé de mesure des effe s génotoxiques d'agents selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- après fertilisation d'oeufs d'amphibiens, de mollusques, d'annélides ou de poissons, récolte des embryo-larves,
- mettre les embryo-larves en contact avec l'agent dont la génotoxicité doit être évaluée et maintenir les embryo-larves dans un milieu approprié à leur développement jusqu'à éclosion,
- après éclosion utilisation des larves pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10.
14. Procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents selon la revendication 13, caractérisé en ce que les larves sont utilisées pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10, entre 0 et 15 jours après éclosion.
15. Procédé de mesure des effets génotoxiques d'agents selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'étape de mesure du taux de micronoyaux formé dans les cellules comprend une étape de comparaison avec les résultats obtenus avec des embryo-larves n'ayant pas été mises en contact avec l'agent dont la génotoxicité doit être évaluée.
16. Utilisation d'un procédé selon l'une des revendications 12 à 15, pour :
- la détection, l'analyse et/ou l'étude de la génotoxicité de composés pour l'homme, ou
- l'évaluation de l'efficacité thérapeutique de composés, l'évaluation de l'efficacité de substances chimiothérapeutiques ou de substances anticancéreuses, ou
la détection, l'analyse et/ou l'étude de contaminants environnementaux et l'étude de la qualité de l'environnement, ou - le contrôle de la qualité de l'eau ou d'une boue après traitement dans les stations d'épuration ou l'évaluation de l'efficacité d'un procédé de potabilisation de l'eau ou d'épuration de l'eau ou des boues ou le contrôle de dépollution des sols.
PCT/FR2011/052443 2010-10-19 2011-10-19 Procede de detection de dommages irreversibles de l'adn et mesure des effets genotoxiques d'agents sur des stades precoces de developpement d'organismes entiers Ceased WO2012052684A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1058505A FR2966164B1 (fr) 2010-10-19 2010-10-19 Procede de detection de dommages irreversibles de l'adn et mesure des effets genotoxiques d'agents sur des stades precoces de developpement d'organismes entiers
FR1058505 2010-10-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012052684A1 true WO2012052684A1 (fr) 2012-04-26

Family

ID=43827684

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2011/052443 Ceased WO2012052684A1 (fr) 2010-10-19 2011-10-19 Procede de detection de dommages irreversibles de l'adn et mesure des effets genotoxiques d'agents sur des stades precoces de developpement d'organismes entiers

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2966164B1 (fr)
WO (1) WO2012052684A1 (fr)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002014859A1 (fr) 2000-08-16 2002-02-21 Diatech Pty Ltd Test du micronoyau
WO2007038664A1 (fr) 2005-09-27 2007-04-05 Massachusetts Institute Of Technology Test de micronoyau sur erythroide in vitro pour genotoxicite

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002014859A1 (fr) 2000-08-16 2002-02-21 Diatech Pty Ltd Test du micronoyau
WO2007038664A1 (fr) 2005-09-27 2007-04-05 Massachusetts Institute Of Technology Test de micronoyau sur erythroide in vitro pour genotoxicite

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAHARI ET AL.: "Micronucleated erythrocytes as an assay to assess actions by physical and chemical genotoxic agents in Clarias gariepinus", MUTATION RESEARCH, vol. 313, 1994, pages 1 - 5, XP025212021, DOI: doi:10.1016/0165-1161(94)90027-2
BURGEOT ET AL.: "The micronucleus assay in Crassostrea gigas for the detection of seawater genotoxicity", MUTATION RES - GENETIC TOXICOLOGY, vol. 342, 1995, pages 125 - 140
JAYLET ET AL.: "A new micronucleus test using peripheral blood erythrocytes of to newt Pleurodeles waiti to detect mutagens in fresh-water pollution", MUTATION RESEARCH, vol. 164, no. 4, August 1986 (1986-08-01), pages 245 - 257
KOSMEHL THOMAS ET AL: "A novel contact assay for testing genotoxicity of chemicals and whole sediments in zebrafish embryos.", ENVIRONMENTAL TOXICOLOGY AND CHEMISTRY / SETAC AUG 2006 LNKD- PUBMED:16916029, vol. 25, no. 8, August 2006 (2006-08-01), pages 2097 - 2106, XP002634326, ISSN: 0730-7268 *
MORIN BENEDICTE ET AL: "Detection of DNA damage in yolk-sac larvae of the Japanese Medaka,, by the comet assay", ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 399, no. 6, 9 January 2011 (2011-01-09), pages 2235 - 2242, XP019879893, ISSN: 1618-2650, DOI: 10.1007/S00216-010-4602-Y *
UYSAL I I ET AL: "Investigation of direct toxic and teratogenic effects of anticoagulants on rat embryonic development using in vitro culture method and genotoxicity assay", ANATOMIA HISTOLOGIA EMBRYOLOGIA, vol. 35, no. 2, April 2006 (2006-04-01), pages 84 - 92, XP002634325, ISSN: 0340-2096 *

Also Published As

Publication number Publication date
FR2966164A1 (fr) 2012-04-20
FR2966164B1 (fr) 2016-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Xia et al. Secondary PVC microplastics are more toxic than primary PVC microplastics to Oryzias melastigma embryos
Al-Thawadi Microplastics and nanoplastics in aquatic environments: challenges and threats to aquatic organisms
Ali et al. Assessment of genotoxic and mutagenic effects of chlorpyrifos in freshwater fish Channa punctatus (Bloch) using micronucleus assay and alkaline single-cell gel electrophoresis
Hulak et al. In vitro effects of bisphenol A on the quality parameters, oxidative stress, DNA integrity and adenosine triphosphate content in sterlet (Acipenser ruthenus) spermatozoa
Parolini et al. Interactive effects between sinking polyethylene terephthalate (PET) microplastics deriving from water bottles and a benthic grazer
Paravani et al. Cypermethrin: Oxidative stress and genotoxicity in retinal cells of the adult zebrafish
Xian et al. Phagocytic activity, respiratory burst, cytoplasmic free-Ca2+ concentration and apoptotic cell ratio of haemocytes from the black tiger shrimp, Penaeus monodon under acute copper stress
Maisano et al. Developmental abnormalities and neurotoxicological effects of CuO NPs on the black sea urchin Arbacia lixula by embryotoxicity assay
Murano et al. Impact of microbial colonization of polystyrene microbeads on the toxicological responses in the sea urchin Paracentrotus lividus
Auguste et al. In vivo immunomodulatory and antioxidant properties of nanoceria (nCeO2) in the marine mussel Mytilus galloprovincialis
Hennebicq et al. The effect of spawning of cultured mussels (Mytilus edulis) on mechanical properties, chemical and biochemical composition of byssal threads
Auguste et al. Multiple responses of Mytilus galloprovincialis to plastic microfibers
Pham et al. First report on free and covalently bound microcystins in fish and bivalves from Vietnam: Assessment of risks to humans
Strużyński et al. Markers of oxidative stress in hepatopancreas of crayfish (Orconectes limosus, raf) experimentally exposed to nanosilver
Sun et al. Perfluorooctanoate and nano titanium dioxide impair the byssus performance of the mussel Mytilus coruscus
Esposito et al. Reproductive toxicity assessment of cellulose nanofibers, citric acid, and branched polyethylenimine in sea urchins: Eco-design of nanostructured cellulose sponge framework (Part B)
Harikrishnan et al. Effect of microfibers induced toxicity in marine sedentary polychaete Hydroides elegans: Insight from embryogenesis axis
Allouche et al. Meiobenthic nematode Oncholaimus campylocercoides as a model in laboratory studies: selection, culture, and fluorescence microscopy after exposure to phenanthrene and chrysene
Wang et al. Infiltration of freshwater food chain by nanoplastics: An examination of trophic transfer and biological impact
Leandro et al. Permissible concentration of mancozeb in Brazilian drinking water elicits oxidative stress and bioenergetic impairments in embryonic zebrafish
Costa et al. Nanoplastic uptake temporarily affects the pulsing behavior in ephyrae of the moon jellyfish Aurelia sp
Banaee et al. LC50 and bioaccumulation of lead nitrate (Pb (NO3) 2) in Goldfish (Carassius auratus)
Ritschar et al. Taking advantage of transparency: A proof-of-principle for the analysis of the uptake of labeled microplastic particles by organisms of different functional feeding guilds using an adapted CUBIC protocol
WO2012052684A1 (fr) Procede de detection de dommages irreversibles de l'adn et mesure des effets genotoxiques d'agents sur des stades precoces de developpement d'organismes entiers
Ramoino et al. Metabotropic γ‐aminobutyric acid (GABAB) receptors modulate feeding behavior in the calcisponge Leucandra aspera

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11787722

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11787722

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1