WO2012049531A1 - Process for producing sugars by enzymatic hydrolysis of pretreated efb oil palm waste - Google Patents

Process for producing sugars by enzymatic hydrolysis of pretreated efb oil palm waste Download PDF

Info

Publication number
WO2012049531A1
WO2012049531A1 PCT/IB2010/003408 IB2010003408W WO2012049531A1 WO 2012049531 A1 WO2012049531 A1 WO 2012049531A1 IB 2010003408 W IB2010003408 W IB 2010003408W WO 2012049531 A1 WO2012049531 A1 WO 2012049531A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hydrolysis
enzymatic
complex
enzymatic hydrolysis
substrate
Prior art date
Application number
PCT/IB2010/003408
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Кирилл Георгиевич КОРОЛЕВ
Олеr Иванович ЛОМОВСКИЙ
Анатолий Александрович ПОЛИТОВ
ГОЛЯЗИМОВА (БЕРШАК), Ольга Викторовна
Алексей Леонидович БЫЧКОВ
Original Assignee
Артер Текнолоджи Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Артер Текнолоджи Лимитед filed Critical Артер Текнолоджи Лимитед
Priority to PCT/IB2010/003408 priority Critical patent/WO2012049531A1/en
Publication of WO2012049531A1 publication Critical patent/WO2012049531A1/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02Monosaccharides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C13SUGAR INDUSTRY
    • C13KSACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/02Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of cellulosic materials
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02EREDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • This invention is a method of preparing waste processing of bunches of oil palm for enzymatic hydrolysis and allows to accelerate the enzymatic hydrolysis of waste polysaccharides into soluble carbohydrates.
  • the method is intended to obtain solutions of carbohydrates with the aim of converting the latter into ethanol or other products of microbiological synthesis by the method of subsequent saccharification and co-fermentation.
  • As a raw material it is preferable to use empty fruit bunches (waste oil palm trees (Elaeis guineensis), which are formed in the production of palm oil.
  • the method is based on the elimination of the interfering effect of biogenic silicon dioxide and polyphenols in combination with a stepwise increase in the reactivity of raw polysaccharides by alternating mechanical activation and enzymatic hydrolysis.
  • Ethanol is considered the most modern type of bio-renewable fuel; it is a potential fuel for “sustainable development” / Jeewon Lee, Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol, J. Biotech., 56 (1997) 1-24; Y. Sun, J. Cheng, Hydrolysis of Lignocellulosic Materials for Ethanol Production: A Review, Bioresource Technology, 83 (2007) 1-1 1 /.
  • Usually its production is based on the microbiological fermentation of carbohydrates, mainly glucose.
  • Many methods have been proposed for fermenting other common carbohydrates, for example xylose / T.W. Jeffries, Y.-S. Jin, Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts, Appl. Microbiol. Biotechnol, 63 (2004) 495-509 /.
  • lignocellulosic raw materials wood, straw, cereal and fodder crops, etc.
  • the main problems in the conversion of such raw materials to bioethanol and other technologically significant products of microbiological synthesis are associated with low the reactivity of cellulose and its associated polymers.
  • the application of methods based on the chemical conversion of lignocellulose to fermentable carbohydrates is limited by the high cost of acid-resistant equipment and the lack of the ability to efficiently utilize biomass residues. For example, the use of sulfuric acid limits the use of lignin, environmental problems arise when it is burned.
  • Methods based on the enzymatic hydrolysis of lignocellulose polysaccharides require effective methods to increase the reactivity of the feedstock. Combined methods combining chemical and mechanical processing are most widely used. Usually, a substantial portion of hemicellulose, in some cases lignin, is first removed. Partial acid hydrolysis products are used to produce xylose, xylitol, and related commercial products. The cellulose enriched intermediate is subjected to mechanical activation and subsequent enzymatic hydrolysis to produce glucose. Combined methods and methods of direct enzymatic hydrolysis often face the problem of inactivation of enzymatic complexes used for saccharification, by-products of acid hydrolysis, non-carbohydrate components of the raw materials / J.P.
  • the objective of the present invention is to find a technical solution that allows for effective biotechnological conversion of waste into soluble carbohydrates suitable for fermentation into ethanol or other products of microbiological synthesis.
  • the problem is solved by using the specific characteristics of the waste, which allows for the effective mechanical activation of raw materials and its saccharification.
  • pre-treatment all methods use energy in the form of steam, mechanical energy, radiation energy.
  • pretreatment increases the availability and surface area of hydrolyzable polysaccharides, disrupts the physical and molecular structure of the starting material and leads to the separation (a sharp decrease in intermolecular interactions between the macrostructural elements) of lignocellulosic materials into lignin, hemicellulose and cellulose components.
  • additional chemicals at the pre-treatment stage their removal from the final product is required.
  • steam treatment steam explosion treatment (steam explosion, powerful steam extrusion, that is, supply of raw materials by steam pressure and destruction of raw materials as a result of a sharp pressure drop when passing through the outlet);
  • Crystalline biomass cellulose can be amorphized by mechanical processing of raw materials in apparatuses of various designs - extruders, ball, vibrocentrifugal, jet, roller mills, etc.
  • the method of obtaining vegetable flour / Emil N. Balz, Andrew W. Kassay, 1944, US 2362528, B27L 1 1/06 / includes grinding of raw materials in a drum impact mill, separation of fine particles and regrinding of the remaining part of the raw materials in a rotary mill.
  • the method proposed by N.S. Yenikolopov and others is that the raw materials are moistened before grinding, then crushed in a screw mixer, heated to 120 ° C, at a pressure of up to 50 MPa / SU 4260749, 1988, D21 B 1/06 /.
  • a pressure of up to 50 MPa / SU 4260749, 1988, D21 B 1/06 / To destroy the crystalline structure of cellulose and increase the specific surface of the raw materials in order to intensify the subsequent enzymatic hydrolysis of polysaccharides, it was proposed to process the waste in twin-screw extruders at elevated temperatures (up to 200 ° C).
  • raw materials can be used rice grains, cotton lint, cotton stalks /B.C. Orlova, RU 2223327, 2004, C13 1/02 /. G.R.
  • Huber et al. Also proposed the processing of cellulose-containing raw materials in extruders at elevated temperature and /G.R pressure. Huber et al., 1992, US 51 14488, B30B 1 1/22, C13 1/00 /.
  • a known method of processing fibrous lignocellulosic biomass for the next hydrolysis is based on the processing of pulp in microcavitation plants, and due to intensive shear loads, a violation of the structure of lignocellulosic biomass fibers and acceleration of enzymatic hydrolysis is achieved / Ernest D. Stuart et al, 1996, US 5498766, C12P 19/14 /.
  • the disadvantages of the above methods for producing finely dispersed products from plant materials are the high energy costs for grinding and drying the raw materials, as well as low grinding efficiency.
  • the decrease in efficiency is due to the fibrous structure of plant materials, the presence of components accompanying cellulose, such as lignins, hemicelluloses, which give special strength to natural materials containing cellulose. Therefore, various methods have been proposed for the preparation of finely dispersed products from plant materials, including a preliminary chemical effect on the raw materials and subsequent mechanical processing.
  • These methods include acid hydrolysis of cellulose and hemicelluloses contained in plant materials, alkaline treatment to remove lignins, treatment with various solvents.
  • Pretreatment of raw materials containing cellulose can be carried out in extruders in the presence of alkali solutions / T. Inoi et al, 1987, US 4,642,287, C12P 19/00, C13 1/00 /, while increasing the efficiency of subsequent enzymatic hydrolysis of the polysaccharides of the feedstock is achieved.
  • J.M. Gould et al. Proposed a method combining physical and chemical treatment to increase the availability of lignocellulosic raw materials relative to the digestibility of microorganisms and animals.
  • wheat straw was pretreated in a hammer mill, then passed through the extruder in the presence of an alkaline solution of hydrogen peroxide / John M. Gould et al, 1991, US 4997488, C13 1/02 /.
  • the resulting product in particular, it is proposed to use as a source of carbohydrates, glucose for subsequent fermentation to ethanol.
  • the methods are the following methods proposed by N. Kabbashi et al and Y.H. Syafwina et al. Both of these methods relate to the preparation of raw materials for enzymatic saccharification of its polysaccharides.
  • the essence of the method is to treat the raw materials with a mixture of cultures capable of producing cellulolytic enzymes and ferment the resulting carbohydrates into ethanol. Since the method does not provide for the intensification of enzymatic hydrolysis, through the amorphization of cellulose, the authors obtained relatively low yields of soluble carbohydrates and ethanol.
  • Distinctive features of the present invention is to take into account the specifics of the selected lignocellulosic raw materials, as well as carrying out mechanical activation with the least energy.
  • the raw materials are preliminarily subjected to hot water treatment followed by pressing in a press. At this stage, a significant portion of the water-soluble is removed. substances and lipids, which, as will be shown below, reduce the activity of the enzymatic complex.
  • the resulting intermediate is crushed to a particle size of 0.5-2 mm, treated with a weak solution of a cellulolytic complex in the presence of a surfactant.
  • an additional removal of lipids and partial destruction of supramolecular structures formed by polysaccharides of raw materials are achieved, thereby reducing its mechanical strength.
  • the resulting intermediate is subjected to mechanical activation followed by extraction with hot water.
  • the saccharification of raw materials is carried out by alternating the mechanical activation of the solid residue and enzymatic hydrolysis. In this case, the mechanical treatment is carried out until a linear relationship is maintained between the activation time and the hydrolysis rate.
  • the chemical composition of biomass (Empty fruit bunches, EFB)
  • the biomass of plant materials consists of five main components: cellulose, hemicellulose, lignin, proteins and inorganic substances.
  • Cellulose, hemicellulose and lignin are the most important in the production of ethanol.
  • Cellulose is a linear polysaccharide constructed from elementary units of anhydro-O-glucose and is a poly ⁇ -1,4-0-glucopyranosyl-0-glucopyranose.
  • Cellulose macromolecule, along with anhydroglucose, may contain residues of other monosaccharides (pentoses and hexoses), as well as uronic acids. The nature and amount of such residues is determined by the conditions of biochemical synthesis.
  • the degree of polymerization of native cellulose can be more than 10 thousand monomeric units; for most herbaceous plants, the degree of polymerization does not exceed 1.5 thousand units.
  • Cellulose is the main component of the cell walls of higher plants. Together with the substances accompanying it, it plays the role of a skeleton that carries the main mechanical load.
  • Cellulose has a complex supramolecular structure.
  • the smallest supramolecular cellulose unit is primary fibril, in which groups of parallel macromolecules are linked by multiple hydrogen bonds.
  • Cellulose macromolecules in primary fibrils form highly ordered crystalline zones, which alternate with heterogeneous less ordered amorphous zones.
  • the length of the crystalline zones in the primary fibrils reaches 15 nm, the cross section of the primary fibrils is 3-7 nm.
  • microfibrils are interconnected via hydrogen bonds into microfibrils, which are the main links in the structure of cellulose fibers.
  • occluded water and lignin and hemicellulose located between the primary fibrils play a significant role in the formation of microfibrils.
  • cellulose ensures its stability under the influence of significant mechanical loads.
  • Cellulose is also very resistant to acids, enzymes and microorganisms.
  • Natural cellulose is a crystalline composite matrix and amorphous fillers, hemicellulose and lignin, which play the role of adhesives.
  • the complexity of the process of converting lignocellulosic feedstock to bioethanol is to convert stable cellulose into glucose, which is easily fermented by yeast into ethanol.
  • Hemicelluloses - polysaccharides that make up the cell wall of plant tissue, along with cellulose and lignin, are branched polymers of various structures.
  • the main monomeric units of hemicelluloses are galactose, glucose, mannose, xylose, arabinose, uronic acids.
  • Hemicelluloses differ from cellulose in the best solubility in alkaline solutions and the ability to more easily hydrolyze with solutions of cellulolytic enzymes and weak acid solutions.
  • the degree of polymerization in hemicelluloses is usually lower than in cellulose.
  • Monosaccharide residues are usually connected by ⁇ -1, 4-bonds, and often there are side bonds of a different type.
  • the main component of hemicelluloses is xylose (50-70% of monomer units).
  • Lignins are an amorphous cross-linked phenolic polymer that is present only in vascular plants and can make up 30% of their mass. Lignins are not processed by microorganisms capable of forming ethanol, and are not used in the production of ethanol. Lignin residues can be used as fuel directly in production, for example, to produce steam and generate electricity.
  • Plant biomass consists of cellulose macrofibers coated with a layer of hemicelluloses. These layers are immersed in a lignin matrix.
  • the diameter of cellulose macro fibers is 1-4 microns.
  • the mechanical separation of cellulose and lignin can be achieved by grinding the material to a particle size of 1-4 microns. Processing plant materials to a powder of this size with a productivity acceptable from an industry point of view is very difficult.
  • the EFB biomass Compared with other types of plant materials: wood, stalks of cereal plants, the EFB biomass has the following differences that must be taken into account in the processing technology and preparation for enzymatic hydrolysis:
  • Raw materials are characterized by a high concentration of lipids and water-soluble substances
  • the raw material consists of vascular cells with a length of 0.5-1.2 microns with a diameter of 10 microns and a wall thickness of 2-3 microns, containing supramolecular structures formed by hemicellulose and lignin,
  • the walls of vascular cells are composed of cellulose and lignin, the content of the latter is lower than the average lignin content in the feed.
  • mechanical activation is recognized as one of the effective methods for changing the physicochemical properties of solid phases.
  • mechanical activation is meant an increase in reactivity due to persistent changes in the structure of a substance under the action of mechanical loads.
  • Avakumov EG Mechanical methods of activation of chemical processes. Novosibirsk: Science, Siberian Branch, 1986, 303 s).
  • Mechanochemical processing In relation to heterogeneous systems, which have a complex phase composition and consist of many components, use the more general term "mechanochemical processing". Mechanochemical treatment, like mechanical activation, leads to stable changes in the physicochemical properties of the system. Increased reactivity typically affects most phases and components of the system. During mechanochemical processing, chemical reactions can occur, which are the result of an increase in the mobility of the components and their free energy under the action of mechanical loads /V.V. Boldyrev, Mechanochemistry and mechanical activation, Materials Sci. Forum, 225-227 (1996) 51 1-520 /.
  • a distinctive feature of the present invention is the mechanical activation taking into account the specifics of biomass and with the least energy:
  • Raw materials are preliminarily subjected to hot water treatment followed by pressing in a press. At this stage, a significant part of water-soluble substances and lipids is removed, which, as will be shown below, reduce the activity of the enzymatic complex.
  • the resulting intermediate is subjected to mechanical activation in the mode of constrained shock, followed by extraction with hot water. At this stage, internal volumes of vascular cells are opened and soluble polyphenols and most of the biogenic silicon dioxide, components that also reduce the effectiveness of the enzymatic complex, are removed.
  • Saccharification of raw materials is carried out by alternating the mechanical activation of a solid residue consisting of vascular cells with an open internal volume and enzymatic hydrolysis.
  • the mechanical treatment is carried out until a linear relationship is maintained between the activation time and the carbohydrate yield, which is achieved at a constant rate of hydrolysis.
  • the reaction rate is proportional to the contact area, provided that the concentration of the catalyst is constant.
  • Enzymatic hydrolysis of the biomass used is characterized by a marked decrease in the rate at the initial stages of the process, in comparison with other lignocellulosic raw materials, for example, with straw of cereal crops. The decrease in velocities observed at the initial stage is very substantial and cannot be explained by the consumption of the reagent in the hydrolysis reaction (decrease in the contact area).
  • Measures to reduce the rate of thermal degradation of enzymes can increase the rate of hydrolysis and open up additional opportunities for the reuse of primary hydrolysates, for example, in countercurrent mode to obtain concentrated solutions of carbohydrates.
  • the following recommendations are proposed. Since the water-soluble part of the plant material does not contain an economically significant amount of carbohydrates, it is proposed to remove the water-soluble components at the stage of preparation of the raw material. On the one hand, this avoids partial inactivation. enzymes. On the other hand, the removal of water-soluble substances significantly increases the efficiency of machining of plant materials.
  • surfactant additives contributes to the preservation of the activity of the enzymatic complex. Due to this, the sorption of enzymes on lignin is reduced, while the amount of available enzyme increases.
  • a surfactant TWEEN and low molecular weight polyethylene oxide can be used.
  • the mineral component has a significant effect on the hydrolysis process.
  • the introduction of calcium chloride at the stage of mechanical processing contributes to fine grinding, increase surface and reduce crystallinity. Therefore, the introduction of calcium chloride is recommended only for the first stage of the process.
  • Ions of some metals are able to integrate into the active centers of enzymes and change the activity of the enzyme. These metals include magnesium and calcium.
  • Polysaccharides are hydrolyzed by endoglucanases acting on internal glycosidic bonds (endocellulase or 1,4-beta-0-glucan-glucanohydrolase, the technical name for this enzyme is endo-1,4-beta-glucanase, in the £ 7 scheme), with the formation of “long "Oligosaccharides.
  • Endoglucanases act on crystalline and amorphous cellulose, are substrate-specific enzymes, are well sorbed on a solid substrate.
  • Oligosaccharides are a substrate for exoglucanases acting on external bonds closest to the end of the molecule.
  • the main reaction product is disaccharides.
  • this group of enzymes is indicated. the most significant in this group of enzymes is exocellulase or 1,4-beta-0-glucan-cellobiohydrolase, the technical name of this enzyme is cellobiohydrolase, the product of its action on oligosaccharides is cellobiose disaccharide.
  • Exoglucanases are also specific enzymes.
  • Cellobiose can be hydrolyzed to two glucose molecules under the influence of beta-glucosidase or beta-O-glucoside-cellobiohydrolase, the technical name for this enzyme - cellobiase, in the diagram - Ej. It is believed that the intermediate product of cellobiosis is capable of reversibly inactivating the enzyme of the previous stage - cellobiohydrolase.
  • Glucosidases are characterized by broad specificity: they are able to hydrolyze D-glycosidic bonds between glucose and aryl, alkyl or carbohydrate residues. Glucosidases can hydrolyze 1 -2, 1-3, -4 and 1-6 glycosidic bonds. Many beta-glucosidases lack strict specificity for the configuration of hydroxyl groups at C-4 and C-5 atoms of hexosides and pentosides. A distinctive feature of beta-glucosidases is that they, unlike exoglucosidases (in scheme E4), act faster on short oligosaccharides.
  • Exoglucosidases differ from cellobiohydrolases in that the main product of their action on poly- or oligosaccharide substrates is not di- but monosaccharides. Exoglucosidases are able to hydrolyze amorphous cellulose.
  • the stepwise nature of hydrolysis is understood as follows. It is believed that the hydrolysis of cellulose proceeds in two stages. The first stage, fast, is the hydrolysis of the amophic substrate, the second stage, slow, is the hydrolysis of the crystalline substrate.
  • EXAMPLE 2 Chemical inactivation of the components of the enzymatic complex with water-soluble substances and lignin.
  • Water-soluble substances isolated from biomass inactivate the enzymatic complex in the first hour of hydrolysis by 35-40%.
  • the introduction of water-soluble substances at the beginning of the hydrolysis of cellulose leads to a decrease in the activity measured by glucose from 370 to 190 units (Error! Source of link not found.).
  • EXAMPLE 3 Chemical inactivation of the components of the enzymatic complex by water-soluble minerals.
  • amorphous cellulose is hydrolyzed, and the content of amorphous cellulose in the substrate is a value that reflects the reactivity of the substrate with respect to hydrolysis.
  • the lower value of the sum of the activities of variants S and L compared with the activity found in option 0 is explained by a decrease in the content of the amorphous phase in the system.
  • EXAMPLE 3 The stepwise nature of the process (a combination of "fast” and “slow” hydrolysis). Referring to the cited Error! Link source not found, enzymatic hydrolysis scheme and data provided on Error! The source of the link was not found., We can conclude that a deep change in the substrate during enzymatic hydrolysis.
  • the predominantly amorphous part of cellulose is hydrolyzed in the first 7-10 hours.
  • the hydrolysis rate decreases, and the process goes into a “slow stage”.
  • the reason for the decrease in activity is the inhibition by the products of hydrolysis of the stages in which enzymes are involved, indicated in the scheme as Eg, Ez, E4. If inhibition by reaction products at a degree of polysaccharide conversion of 15–40% makes a significant contribution to a decrease in the process rate, precipitate-free hydrolysates (option L) will have noticeably less activity on a fresh substrate compared to the initial activity (option 0).
  • the maximum activity for option L can be calculated from model experiments on the sorption of complex components on microcrystalline cellulose.
  • model experiments the activity of hydrolysates obtained on microcrystalline cellulose and paper was measured.
  • 25-30% of the initial activity was found in the hydrolyzate, that is, a significant part of the enzymatic complex is adsorbed by the substrate.
  • the hydrolysis rate dropped significantly, while the conversion of the substrate was about 10%.
  • some of the adsorbed components of the enzymatic complex went into solution; approximately 40% of the initial activity was determined in the hydrolyzate upon contact with a fresh substrate.
  • Biomass hydrolysates, freed from sediment, showed noticeable activity on a fresh substrate. Note that the hydrolysis rate, measured by glucose before separation of the hydrolyzate, was zero. The polysaccharide content in the biomass is about 65%, taking into account the above data, it can be expected that the hydrolysates contain about 40 / 0.65 61.5% of the initial activity. With the exception of experiments 2 and 3, where inactivation of the complex components by cations was noted calcium, there is good agreement between the experimental data and the above calculations.
  • the reactivity of the substrate is more than halved.
  • the substrate conversion is significantly lower than the calculated one, based on the amount of enzyme remaining on the substrate.
  • the hydrolysis rate is stepwise. Until the achievement of 30-40%, the conversion of polysaccharides occurs rapidly. After the exhaustion of the available phase, with increased reactivity, the hydrolysis process is slow.
  • enzymatic hydrolysis will be limited by the heterogeneous stage in a wide concentration range of the enzymatic complex. Up to deep degrees of conversion, the concentration of the intermediate cellobiose product will remain pseudostationary. This concentration will be the lower, the higher the concentration of the enzymatic complex.
  • the total speed of the process only slightly increases with increasing concentration of the enzymatic complex (in the first approximation, it is proportional to the product of the rate constant by the concentration of the enzymatic complex ki x [S] x [Ei], where ki is some effective constant reflecting the reactivity of the substrate , [S] is the surface of the substrate, [Ei] is the concentration of enzymes of the heterogeneous stage, proportional to the concentration of the enzymatic complex.
  • hydrolysis of activated substrates is limited by a homogeneous stage, which creates the conditions for the accumulation of an intermediate cellobiose product in a solution.
  • hydrolysis can proceed in three modes.
  • the level of the pseudostationary concentration of cellobiose is determined by the ratio of the effective rate of the heterogeneous stage ki> ⁇ [S] x [Ei] of the hydrolysis of the amorphous part of the substrate to the effective rate of the homogeneous stage to 2 x [E 2 ].
  • the rate of the heterogeneous stage of hydrolysis of the crystalline substrate is taken into account, which will be obvious much lower than the rate of hydrolysis of the amorphous part, therefore, for activated substrates, the glucose / cellobiosis ratio is always lower.
  • the hydrolysis of an effectively activated substrate differs from the hydrolysis of a substrate with a low content of amorphous phase in the ratio of the concentration of intermediate products (cellobiose) to the concentration of the final product (glucose).
  • Activated substrates are characterized by a lower glucose / cellobiosis ratio when a stationary concentration of cellobiose is reached.
  • the hydrolysis of activated substrates in the initial stages is characterized by an increased yield of glucose.
  • the duration and intense mechanical activation of the feed is determined by the ratio of the energy expended to the yield of soluble carbohydrates. This position is illustrated by Error! Link source not found, and Error! The source of the link was not found., From which it follows that at the initial stages mechanical activation proceeds with the greatest efficiency.
  • the raw materials were preliminarily subjected to treatment with hot water, followed by pressing in a press. At this stage, a significant portion of water-soluble substances and lipids, that is, components that significantly reduce the effectiveness of mechanical activation, were removed.
  • the final removal of lipids, water-soluble lignin, as well as a significant part of nutrient silicon was achieved as follows.
  • the intermediate obtained by processing with hot water on a press was crushed to a particle size of 0.04–2 mm, treated with a weak solution of a cellulolytic complex in the presence of a surfactant. Due to this, partial destruction of the supramolecular structures formed by polysaccharides and lignin occurred, the mechanical strength of the raw material decreased, and it became suitable for mechanical activation in the mode of constrained shock.
  • the obtained intermediate was subjected to mechanical activation in the mode of constrained shock, followed by extraction with hot water.
  • the yield of the fine fraction (less than 50 ⁇ m) was increased from 10 to 80%.
  • the hydrolysis scheme provides for the residence of the substrate in each reactor for several hours and the subsequent transfer of the substrate and hydrolysis to adjacent reactors in countercurrent mode, as shown in Error! No reference source was found ..
  • a fresh substrate obtained by mechanical activation of lignocellulosic raw materials enters the first reactor.
  • the substrate is in contact with the hydrolyzate received from reactor 2.
  • the last reactor receives a substrate that no longer contains amorphous cellulose and other polysaccharides that are readily hydrolyzed by enzymes; this substrate is exposed to a fresh solution of the enzymatic complex.
  • the advantage of this approach is to obtain concentrated hydrolysates suitable for the process of subsequent saccharification and co-fermentation (SSCF, in the English literature).
  • SSCF saccharification and co-fermentation
  • the hydrolysis of polysaccharides is carried out to obtain a mixture of monomers and oligomers
  • the concentrated mixture is then sent to the SSCF process, in which the final hydrolysis of the oligomers to monomers and microbiological fermentation of the latter into ethanol are carried out by enzymes.
  • Low concentrations of enzymes are usually used in the SSCF process, so it is theoretically possible for monomers to inhibit the hydrolysis of oligomers.
  • the presence of microorganisms fermenting monomers to ethanol removes the inhibitory effect of monomers. Concentrated hydrolysates containing residual amounts of enzymes are in most cases a suitable substrate for the SSCF process.
  • the enzymes of the homogeneous hydrolysis stage are concentrated, as well as the components of the enzymatic complex, which have weak sorption properties, but are able to efficiently hydrolyze the amorphous substrate (exoglucosidase).
  • the substrate entering the first reactor is first exposed to such enzymes, then, as the solid residue moves to the right, effective cleavage of the amorphous part is achieved due to the action of fresh portions of enzymes.
  • Such a scheme has several additional advantages. For example, it allows you to choose optimal temperature conditions for various stages of the process. There is the possibility of additional regulation of parameters such as pH, ionic strength, mixing intensity, that is, to create conditions that ensure maximum stability of the enzymatic complex. This makes it possible to control the degree of adsorption of enzymes, to regulate the degree of participation of the components of the enzymatic complex at the stages of the process.
  • the diagram on the left shows the reuse of the hydrolyzate.
  • the solid residue was centrifuged, the hydrolyzate was transferred to a fresh substrate, the hydromodule was adjusted to its initial value by adding a buffer (1 -> 2 on the graph).
  • a buffer (1 -> 2 on the graph).
  • the diagram also shows the results of glucose output during the hydrolysis of raw materials under the influence of the residual amount of enzymes.
  • Fresh buffer was added to the separated precipitate of reactor 1 to the hydromodule 10. After five hours, the solution was separated and transferred to reactor 2, from which the concentrated hydrolyzate was removed by centrifugation. It can be seen that the rate of hydrolysis remains constant when transferring diluted hydrolysates to a substrate subjected to enzymatic treatment.
  • EXAMPLE 6 Stepwise increase in the reactivity of raw polysaccharides by alternating mechanical activation and enzymatic hydrolysis.
  • the solid residues obtained by mechanical processing of the feedstock and subsequent enzymatic hydrolysis were subjected to maceration, an enzymatic complex capable of hydrolyzing pectin substances. It is known that pectins give plant tissues additional strength, since they provide “adhesion” of cell walls. Hydrolysis of pectins allows the destruction of plant tissue up to individual cells. After this treatment, the solid residues were dried and subjected to mechanical activation in shock-shear mode.
  • the yield at this stage reaches 49%, the total conversion of 66%.
  • the conversion of hemicelluloses, consisting mainly of xylans, is 95%.
  • the resulting hydrolysates are suitable for reprocessing fresh batches of substrate. Subsequent mechanical activation of the solid residue and its enzymatic hydrolysis make it possible to achieve 90% carbohydrate conversion of the total polysaccharide content in 20 hours.

Abstract

The invention relates to a process for preparing pretreated EFB oil palm waste for enzymatic hydrolysis and makes it possible to enhance the enzymatic hydrolysis of polysaccharides in the waste into soluble sugars. The method is intended for producing solutions of carbohydrates for the purpose of converting same into ethanol or other products of microbiological synthesis by further saccharification and combined fermentation. Empty Fruit Bunches, a waste product of oil palm (Elaeis guineensis) which is usually left after the production of palm oil, are preferably used as the initial feedstock. The method is based on eliminating the interfering influence of biogenic silicon dioxide and polyphenols and also gradually enhancing the reactivity of the polysaccharides in the raw material by alternating mechanical activation and enzymatic hydrolysis.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ САХАРОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫМ ГИДРОЛИЗОМ ОБРАБОТАННЫХ ПУСТЫХ ФРУКТОВЫХ ГРОЗДЕЙ-ОТХОДОВ МАСЛИЧНОЙ ПАЛЬМЫ  METHOD FOR PRODUCING SUGARS BY ENZYMATIC HYDROLYSIS OF PROCESSED EMPTY FRUIT CLUSTERS OF WASTE OIL PALM
Область техники Technical field
Данное изобретение представляет собой способ подготовки отходов переработки гроздей масличной пальмы к ферментативному гидролизу и позволяет ускорить ферментативный гидролиз полисахаридов отходов в растворимые углеводы. Способ предназначен для получения растворов углеводов с целью конверсии последних в этанол или другие продукты микробиологического синтеза методом последующего осахаривания и совместного сбраживания. В качестве сырья предпочтительно используются пустые фруктовые грозди (Empty fruit bunches) - отходы масличной пальмы (Elaeis guineensis), которые образуются при производстве пальмового масла. В основе способа лежит устранение мешающего влияния биогенного диоксида кремния и полифенолов в сочетании со ступенчатым повьппением реакционной способности полисахаридов сырья путем чередования механической активации и ферментативного гидролиза. This invention is a method of preparing waste processing of bunches of oil palm for enzymatic hydrolysis and allows to accelerate the enzymatic hydrolysis of waste polysaccharides into soluble carbohydrates. The method is intended to obtain solutions of carbohydrates with the aim of converting the latter into ethanol or other products of microbiological synthesis by the method of subsequent saccharification and co-fermentation. As a raw material, it is preferable to use empty fruit bunches (waste oil palm trees (Elaeis guineensis), which are formed in the production of palm oil. The method is based on the elimination of the interfering effect of biogenic silicon dioxide and polyphenols in combination with a stepwise increase in the reactivity of raw polysaccharides by alternating mechanical activation and enzymatic hydrolysis.
Предшествующий уровень техники State of the art
Этанол относят к наиболее современному виду биовозобновляемого топлива, он является потенциальным топливом «устойчивого развития» /Jeewon Lee, Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol, J. Biotech., 56 (1997) 1-24; Y. Sun, J. Cheng, Hydrolysis of Lignocellulosic Materials for Ethanol Production: A Review, Bioresource Technology, 83 (2007) 1-1 1/. Обычно его производство основано на микробиологическом сбраживании углеводов, главным образом глюкозы. Предложено много способов ферментации других распространенных углеводов, например ксилозы /T.W. Jeffries, Y.-S. Jin, Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts, Appl. Microbiol. Biotechnol, 63 (2004) 495-509/. Ethanol is considered the most modern type of bio-renewable fuel; it is a potential fuel for “sustainable development” / Jeewon Lee, Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol, J. Biotech., 56 (1997) 1-24; Y. Sun, J. Cheng, Hydrolysis of Lignocellulosic Materials for Ethanol Production: A Review, Bioresource Technology, 83 (2007) 1-1 1 /. Usually its production is based on the microbiological fermentation of carbohydrates, mainly glucose. Many methods have been proposed for fermenting other common carbohydrates, for example xylose / T.W. Jeffries, Y.-S. Jin, Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts, Appl. Microbiol. Biotechnol, 63 (2004) 495-509 /.
Альтернативой дефицитным источникам сбраживаемых углеводов, пищевому сырью (крахмалу, пшенице, кукурузе, сахарозе), является лигноцеллюлозное сырье: древесина, солома злаковых и кормовых культур и др. Основные проблемы конверсии такого сырья в биоэтанол и в другие технологически значимые продукты микробиологического синтеза связаны с низкой реакционной способностью целлюлозы и сопутствующих ей полимеров. Применение методов, основанных на химической конверсии лигноцеллюлозы в сбраживаемые углеводы, ограничиваются высокой стоимостью кислотостойкого оборудования и отсутствием возможности эффективно утилизировать остатки биомассы. Например, применение серной кислоты ограничивает использование лигнина, возникают проблемы экологического характера при его сжигании. An alternative to scarce sources of fermentable carbohydrates, food raw materials (starch, wheat, corn, sucrose), is lignocellulosic raw materials: wood, straw, cereal and fodder crops, etc. The main problems in the conversion of such raw materials to bioethanol and other technologically significant products of microbiological synthesis are associated with low the reactivity of cellulose and its associated polymers. The application of methods based on the chemical conversion of lignocellulose to fermentable carbohydrates is limited by the high cost of acid-resistant equipment and the lack of the ability to efficiently utilize biomass residues. For example, the use of sulfuric acid limits the use of lignin, environmental problems arise when it is burned.
Методы, основанные на ферментативном гидролизе полисахаридов лигноцеллюлозы, требуют применения эффективных способов повышения реакционной способности исходного сырья. Наибольшее распространение получили комбинированные методы, сочетающие химическую и механическую обработку. Обычно сначала удаляется существенная часть гемицеллюлозы, в ряде случаев и лигнина. Продукты частичного кислотного гидролиза используют для получения ксилозы, ксилита, сопутствующих коммерческих продуктов. Промежуточный продукт, обогащенный целлюлозой, подвергают механической активации и последующему ферментативному гидролизу с получением глюкозы. Комбинированные методы и методы прямого ферментативного гидролиза часто сталкиваются с проблемой инактивации ферментативных комплексов, используемых для осахаривания, побочными продуктами кислотного гидролиза, неуглеводными компонентами сырья /J.P. Delegnes, R. Moletta, J.M. Navarro, Effect of lignocelluloses degradation products on ethanol fermentations of glucose and xylose by Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis, Pichia stipits, and Candida shehatae, Enz. Microb. Tech., 19 (1996) 220-225/.  Methods based on the enzymatic hydrolysis of lignocellulose polysaccharides require effective methods to increase the reactivity of the feedstock. Combined methods combining chemical and mechanical processing are most widely used. Usually, a substantial portion of hemicellulose, in some cases lignin, is first removed. Partial acid hydrolysis products are used to produce xylose, xylitol, and related commercial products. The cellulose enriched intermediate is subjected to mechanical activation and subsequent enzymatic hydrolysis to produce glucose. Combined methods and methods of direct enzymatic hydrolysis often face the problem of inactivation of enzymatic complexes used for saccharification, by-products of acid hydrolysis, non-carbohydrate components of the raw materials / J.P. Delegnes, R. Moletta, J.M. Navarro, Effect of lignocelluloses degradation products on ethanol fermentations of glucose and xylose by Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis, Pichia stipits, and Candida shehatae, Enz. Microb. Tech., 19 (1996) 220-225 /.
Одним из ключевых вопросов получения лигноцеллюлозного этанола из биовозобновляемых источников является выявление наиболее доступных и технологически удобных источников сырья. При этом необходимо рассматривать такие параметры как локализация сырья, урожайность, стоимость, сезонная продуктивность культуры, возможность эффективной транспортировки и локальной концентрации запасов сырья, содержание углеводов, степень готовности сырья к микробиологическим превращениям, получение ценных сопутствующих технологических продуктов.  One of the key issues in obtaining lignocellulosic ethanol from bio-renewable sources is to identify the most accessible and technologically convenient sources of raw materials. At the same time, it is necessary to consider such parameters as localization of raw materials, productivity, cost, seasonal productivity of the crop, the possibility of efficient transportation and local concentration of stocks of raw materials, carbohydrate content, the degree of readiness of raw materials for microbiological transformations, and obtaining valuable related technological products.
Только производства, связанные с получением пальмового масла в Малайзии образуют 90 млн. тонн отхода - лигноцеллюлозной биомассы. 40 млн. тонн в год приходится на невостребованный отход - пустые фруктовые грозди.  Malaysia-based palm oil production alone forms 90 million tons of waste - lignocellulosic biomass. 40 million tons per year falls on unclaimed waste - empty fruit clusters.
Вырабатываемая из масличной пальмы продукция составляет только 10 % перерабатываемой биомассы. Остальные 90 % сырья, представляющего собой ценный для биохимической переработки лигноцеллюлозный материал, до сих пор не нашли экономически эффективного промышленного применения. Утилизация биомассы на плантациях ограничивается закапыванием отходов в траншеи в местах их накопления с целью обогащения грунта органическим компонентом, продуктом микробиологического распада биомассы. Однако огромный избыток ежегодно возобновляемой биомассы значительно превышает научно-обоснованный объем органических удобрений, необходимых для эффективного функционирования пальмовых плантаций. Это отрицательно влияет на себестоимость выращивания масличной пальмы /Research and Development of Oil Palm Biomass Utilization in Wood-based Industries. Palm Oil Develpoments, MPOB, 36 (2002) 1-5/. Принимая во внимание данные литературы можно заключить, что указанные отходы являются наиболее доступным и технологически удобным источником лигноцеллюлозы, которая может использоваться для производства биоэтанола в данном регионе. Products produced from oil palm make up only 10% of the processed biomass. The remaining 90% of the raw material, which is a valuable lignocellulosic material for biochemical processing, has still not found cost-effective industrial applications. Biomass utilization on plantations are limited to landfills in trenches in places of their accumulation in order to enrich the soil with an organic component, a product of microbiological decay of biomass. However, a huge excess of annually renewable biomass significantly exceeds the scientifically-based amount of organic fertilizers necessary for the efficient functioning of palm plantations. This negatively affects the cost of growing oil palm / Research and Development of Oil Palm Biomass Utilization in Wood-based Industries. Palm Oil Develpoments, MPOB, 36 (2002) 1-5 /. Taking into account the literature data, it can be concluded that these wastes are the most affordable and technologically convenient source of lignocellulose, which can be used for bioethanol production in this region.
Задачей настоящего изобретения является поиск технического решения, позволяющего осуществлять эффективную биотехнологическую конверсию отходов в растворимые углеводы, пригодные для сбраживания в этанол или другие продукты микробиологического синтеза. Поставленная задача решается путём использования специфических особенностей отходов, что позволяет осуществлять эффективную механическую активацию сырья и его осахаривание.  The objective of the present invention is to find a technical solution that allows for effective biotechnological conversion of waste into soluble carbohydrates suitable for fermentation into ethanol or other products of microbiological synthesis. The problem is solved by using the specific characteristics of the waste, which allows for the effective mechanical activation of raw materials and its saccharification.
Ниже рассмотрены подходы, используемые для конверсии лигноцеллюлозного сырья в растворимые углеводы. Приводятся данные по содержанию полисахаридов в пустых фруктовых гроздях масличной пальмы, методы конверсии данного сырья в биоэтанол.  The following are approaches used to convert lignocellulosic feed to soluble carbohydrates. The data on the content of polysaccharides in empty fruit clusters of oil palm, methods for the conversion of this raw material into bioethanol are presented.
Для предварительной обработки во всех способах используется энергия в виде пара, механической энергии, энергии излучения. Для увеличения скорости гидролиза и степени гидролиза применяют один или несколько видов предварительной обработки. Предварительная обработка увеличивает доступность и площадь поверхности гидролизуемых полисахаридов, нарушает физическую и молекулярную структуру исходного материала и приводит к разделению (резкому уменьшению межмолекулярных взаимодействий между макроструктурными элементами) лигноцеллюлозных материалов на лигнин, гемицеллюлозу и целлюлозу компоненты. При использовании дополнительных химических реагентов на стадии предварительной обработки требуется их удаление из конечного продукта.  For pre-treatment, all methods use energy in the form of steam, mechanical energy, radiation energy. To increase the rate of hydrolysis and the degree of hydrolysis, one or more types of pretreatment are used. Pretreatment increases the availability and surface area of hydrolyzable polysaccharides, disrupts the physical and molecular structure of the starting material and leads to the separation (a sharp decrease in intermolecular interactions between the macrostructural elements) of lignocellulosic materials into lignin, hemicellulose and cellulose components. When using additional chemicals at the pre-treatment stage, their removal from the final product is required.
Примеры общепринятых способов предварительной обработки включены в обзор /Sinitsyn А.Р., Gusakov A.V., Chemoglazov V.M. Bioconversion of lignocellulose materials/ Moscow: Publishing House of Moscow State University, 1995, 220 p., and references in the list/: • растворение лигнина химическими реагентами, такими как едкие щелочи, аммиак, хлорит, диоксид серы, амиды, разбавленные и концентрированные кислоты, и т. д. широко используемое в производстве пульпы и бумаги;Examples of generally accepted pretreatment methods are included in the review / Sinitsyn A.R., Gusakov AV, Chemoglazov VM Bioconversion of lignocellulose materials / Moscow: Publishing House of Moscow State University, 1995, 220 p., And references in the list /: • dissolution of lignin by chemical reagents, such as caustic alkali, ammonia, chlorite, sulfur dioxide, amides, dilute and concentrated acids, etc., widely used in the production of pulp and paper;
• обработка паром, паровзрывная обработка (steam explosion, мощная экструзия паром, то есть подача сырья давлением пара и разрушение сырья в результате резкого перепада давления при прохождении через выходное отверстие); • steam treatment, steam explosion treatment (steam explosion, powerful steam extrusion, that is, supply of raw materials by steam pressure and destruction of raw materials as a result of a sharp pressure drop when passing through the outlet);
• автогидролиз высокотемпературным паром (220-270 °С);  • autohydrolysis by high temperature steam (220-270 ° C);
• механическая обработка - измельчение и рассев;  • machining - grinding and sieving;
• микроволновое облучение;  • microwave irradiation;
• ультразвуковое облучение;  • ultrasonic irradiation;
• облучение электронами;  • irradiation with electrons;
• гамма облучение.  • gamma radiation.
Здесь рассмотрены наиболее близкие технические решения, использующие в том или ином виде ферментативную обработку. Также приводятся примеры, включающие механическую активацию лигноцеллюлозного сырья.  Here we consider the closest technical solutions that use enzyme processing in one form or another. Examples are also given including mechanical activation of lignocellulosic feedstocks.
Большинство исследователей отмечают зависимость между степенью кристалличности целлюлозы и скоростью ее гидролиза. Чем более аморфизована целлюлоза, тем больше скорость гидролиза. В ряде случаев увеличение содержания аморфной фазы с 20 процентов до 80 приводит к увеличению скорости гидролиза в 5-6 раз. Кристаллическая целлюлоза биомассы может быть аморфизована путем механической обработки сырья в аппаратах различной конструкции - экструдерах, шаровых, виброцентробежных, струйных, валковых мельницах и др.  Most researchers note a relationship between the degree of crystallinity of cellulose and the rate of its hydrolysis. The more amorphized the cellulose, the greater the rate of hydrolysis. In some cases, an increase in the content of the amorphous phase from 20 percent to 80 leads to an increase in the rate of hydrolysis by 5–6 times. Crystalline biomass cellulose can be amorphized by mechanical processing of raw materials in apparatuses of various designs - extruders, ball, vibrocentrifugal, jet, roller mills, etc.
Ферментативный гидролиз биомассы, содержащей целлюлозу, протекает в гетерогенной среде, поэтому влияние площади границы раздела фаз на скорость гидролиза является значительным. В этой связи при предварительной обработке сырья по возможности стараются достичь низкого значения среднего размера частиц и обеспечить максимальное увеличение поверхности раздела фаз.  The enzymatic hydrolysis of biomass containing cellulose proceeds in a heterogeneous medium; therefore, the effect of the phase boundary on the hydrolysis rate is significant. In this regard, when preliminary processing of raw materials, it is possible to try to achieve a low value of the average particle size and to ensure the maximum increase in the interface.
Для получения мелкодисперсного продукта растительное сырье, содержащее целлюлозу, подвергают механическому измельчению на различных типах мельниц, полученный продукт подвергают сушке и рассеву. Так, способ получения растительной муки /Emil Н. Balz, Andrew W. Kassay, 1944, US 2362528, B27L 1 1/06/ включает измельчение сырья на барабанной ударной мельнице, отделение мелких частиц и повторное измельчение на роторной мельнице оставшейся части сырья. To obtain a finely dispersed product, plant materials containing cellulose are subjected to mechanical grinding in various types of mills, the resulting product is dried and sieved. So, the method of obtaining vegetable flour / Emil N. Balz, Andrew W. Kassay, 1944, US 2362528, B27L 1 1/06 / includes grinding of raw materials in a drum impact mill, separation of fine particles and regrinding of the remaining part of the raw materials in a rotary mill.
Способ, предложенный Н.С. Ениколоповым и др., заключается в том, что сырье перед измельчением увлажняют, затем измельчают в шнековом смесителе, нагретом до 120 °С, при давлении до 50 МПа /SU 4260749, 1988 г., D21 B 1/06/. Для разрушения кристаллической структуры целлюлозы и увеличения удельной поверхности сырья с целью интенсификации последующего ферментативного гидролиза полисахаридов предложено обрабатывать отходы в двухшнековых экструдерах при повышенной температуре (до 200 °С). В качестве сырья могут быть использованы рисовая дробина, хлопковый линт, стебли хлопчатника /B.C. Орлова, RU 2223327, 2004 г., С13 1/02/. G.R. Huber с соавторами также предложил проводить обработку содержащего целлюлозу сырья в экструдерах при повышенных температуре и давлении /G.R. Huber, и др., 1992, US 51 14488, В30В 1 1/22, С13 1/00/.  The method proposed by N.S. Yenikolopov and others, is that the raw materials are moistened before grinding, then crushed in a screw mixer, heated to 120 ° C, at a pressure of up to 50 MPa / SU 4260749, 1988, D21 B 1/06 /. To destroy the crystalline structure of cellulose and increase the specific surface of the raw materials in order to intensify the subsequent enzymatic hydrolysis of polysaccharides, it was proposed to process the waste in twin-screw extruders at elevated temperatures (up to 200 ° C). As raw materials can be used rice grains, cotton lint, cotton stalks /B.C. Orlova, RU 2223327, 2004, C13 1/02 /. G.R. Huber et al. Also proposed the processing of cellulose-containing raw materials in extruders at elevated temperature and /G.R pressure. Huber et al., 1992, US 51 14488, B30B 1 1/22, C13 1/00 /.
Известен метод обработки волокнистой лигноцеллюлозной биомассы для полследующего гидролиза. Метод основан на обработке пульпы в микрокавитационных установках, при этом за счет интенсивных сдвиговых нагрузок достигается нарушение структуры волокон лигноцеллюлозной биомассы и ускорение ферментативного гидролиза /Ernest D. Stuart et al, 1996, US 5498766, C12P 19/14/.  A known method of processing fibrous lignocellulosic biomass for the next hydrolysis. The method is based on the processing of pulp in microcavitation plants, and due to intensive shear loads, a violation of the structure of lignocellulosic biomass fibers and acceleration of enzymatic hydrolysis is achieved / Ernest D. Stuart et al, 1996, US 5498766, C12P 19/14 /.
Недостатками перечисленных способов получения мелкодисперсных продуктов из растительного сырья являются большие затраты энергии на измельчение и сушку сырья, а также низкая эффективность измельчения. Снижение эффективности обусловлено волокнистой структурой растительного сырья, наличием сопутствующих целлюлозе компонентов, таких как лигнины, гемицеллюлозы, которые придают особую прочность природным материалам, содержащим целлюлозу. Поэтому были предложены различные способы получения мелкодисперсных продуктов из растительного сырья, включающие предварительное химическое воздействие на сырье и последующую механическую обработку.  The disadvantages of the above methods for producing finely dispersed products from plant materials are the high energy costs for grinding and drying the raw materials, as well as low grinding efficiency. The decrease in efficiency is due to the fibrous structure of plant materials, the presence of components accompanying cellulose, such as lignins, hemicelluloses, which give special strength to natural materials containing cellulose. Therefore, various methods have been proposed for the preparation of finely dispersed products from plant materials, including a preliminary chemical effect on the raw materials and subsequent mechanical processing.
Данные способы включают кислотный гидролиз целлюлозы и гемицеллюлоз, содержащихся в растительном сырье, щелочную обработку с целью удаления лигнинов, обработку различными растворителями.  These methods include acid hydrolysis of cellulose and hemicelluloses contained in plant materials, alkaline treatment to remove lignins, treatment with various solvents.
В частности, предложен способ получения мелкодисперсных продуктов, основанный на обработке древесины или другого сырья, содержащего целлюлозу, раствором мочевины, последующей сушке и измельчении на шаровой мельнице /Andrew W. assay, и др., 1942 г, US 2364721, C08L 97/02/. Предварительная обработка сырья, содержащего целлюлозу, может проводиться в экструдерах в присутствии растворов щелочей /Т. Inoi et al, 1987, US 4642287, C12P 19/00, C13 1/00/, при этом достигается увеличение эффективности последующего ферментативного гидролиза полисахаридов сырья. In particular, a method for producing finely dispersed products based on the processing of wood or other raw materials containing cellulose, a urea solution, subsequent drying and grinding in a ball mill / Andrew W. assay, et al., 1942, US 2364721, C08L 97/02 /. Pretreatment of raw materials containing cellulose can be carried out in extruders in the presence of alkali solutions / T. Inoi et al, 1987, US 4,642,287, C12P 19/00, C13 1/00 /, while increasing the efficiency of subsequent enzymatic hydrolysis of the polysaccharides of the feedstock is achieved.
J.M. Gould с соавторами предложил метод, комбинирующий физическую и химическую обработку, для повышения доступности лигноцеллюлозного сырья по отношению к перевариваемости микроорганизмами и животными. В частности, солому пшеницы подвергали предварительной обработке в молотковой мельнице, затем пропускали через экстру дер в присутствии щелочного раствора перекиси водорода /John М. Gould et al, 1991, US 4997488, C13 1/02/. Полученный продукт в частности предложено использовать в качестве источника углеводов, глюкозы для последующего сбраживания в этанол.  J.M. Gould et al. Proposed a method combining physical and chemical treatment to increase the availability of lignocellulosic raw materials relative to the digestibility of microorganisms and animals. In particular, wheat straw was pretreated in a hammer mill, then passed through the extruder in the presence of an alkaline solution of hydrogen peroxide / John M. Gould et al, 1991, US 4997488, C13 1/02 /. The resulting product in particular, it is proposed to use as a source of carbohydrates, glucose for subsequent fermentation to ethanol.
Предложены методы, включающие предварительный кислотный гидролиз гемицеллюлоз растительного сырья, последующее механическое измельчение твердого остатка или активацию его паровым взрывом /David L. Brink et al, 1996, US 5536325, C13K 1/02; 1997, US 5628830, C13K 1/02/.  Methods are proposed, including preliminary acid hydrolysis of hemicelluloses of plant materials, subsequent mechanical grinding of the solid residue or activation by steam explosion / David L. Brink et al, 1996, US 5536325, C13K 1/02; 1997, US 5628830, C13K 1/02 /.
Недостатками перечисленных способов предварительной обработки биомассы являются: использование химических реагентов, что ограничивает применение полученных полупродкутов, а также высокие производственные затраты на удаление растворителей, кислот. Применение растворов кислот требует использовать кислотостойкие сорта металла для измельчающего, сушильного, транспортирующего оборудования. Возникает необходимость удаления побочных продуктов кислотного гидролиза, способных ингибировать ферменты и микроорганизмы.  The disadvantages of the above methods of biomass pretreatment are: the use of chemical reagents, which limits the use of the resulting semi-products, as well as the high production costs of removing solvents, acids. The use of acid solutions requires the use of acid-resistant grades of metal for grinding, drying, conveying equipment. There is a need to remove by-products of acid hydrolysis that can inhibit enzymes and microorganisms.
Наиболее близкими к настоящему изобретению способами являются следующие методы, предложенные N. Kabbashi et al и Y.H. Syafwina et al. Оба этих метода касаются подготовки сырья к ферментативному осахариванию его полисахаридов.  Closest to the present invention, the methods are the following methods proposed by N. Kabbashi et al and Y.H. Syafwina et al. Both of these methods relate to the preparation of raw materials for enzymatic saccharification of its polysaccharides.
Предложен метод прямой биоконверсии биомассы фруктовых гроздей масличной пальмы путем гетерогенной микробиологической обработки /Nassereldeen A. Kabbashi, Md. Zahangir Alam, M. Fahrurrazi Tompang, Direct bioconversion of oil palm empty fruit bunches for bioethanol production by solid state bioconversion, HUM Eng. J., 8:2 (2007) 1 -12/. Суть метода сводится к обработке сырья смесью культур, способных продуцировать целлюлозолитические ферменты и сбраживать образующиеся углеводы в этанол. Поскольку метод не предусматривает интенсификации ферментативного гидролиза, посредством аморфизации целлюлозы, авторами получены сравнительно невысокие выходы растворимых углеводов и этанола. A method for direct bioconversion of the biomass of fruit clusters of oil palm by heterogeneous microbiological treatment / Nassereldeen A. Kabbashi, Md. Zahangir Alam, M. Fahrurrazi Tompang, Direct bioconversion of oil palm empty fruit bunches for bioethanol production by solid state bioconversion, HUM Eng. J., 8: 2 (2007) 1-12 /. The essence of the method is to treat the raw materials with a mixture of cultures capable of producing cellulolytic enzymes and ferment the resulting carbohydrates into ethanol. Since the method does not provide for the intensification of enzymatic hydrolysis, through the amorphization of cellulose, the authors obtained relatively low yields of soluble carbohydrates and ethanol.
Y.H. Syafwina et al предложили проводить активацию данного вида лигноцеллюлозного сырья посредством обработки его грибами - возбудителями белой гнили. Достигалось частичное разрушение лигнина, и как следствие некоторое повышение реакционной способности полисахаридов сырья по отношению к ферментативному гидролизу /Syafwina* I, Yoichi Honda, Takashi Watanabe, Masaaki Kuwahara, Pre-treatment of oil palm empty fruit bunch by white-rot fungi for enzymatic saccharification, Wood Research, 89 (2002) 19-20/.  Y.H. Syafwina et al proposed the activation of this type of lignocellulosic raw material by treating it with white rot fungi. Partial destruction of lignin was achieved, and as a result, a slight increase in the reactivity of raw polysaccharides with respect to enzymatic hydrolysis / Syafwina * I, Yoichi Honda, Takashi Watanabe, Masaaki Kuwahara, Pre-treatment of oil palm empty fruit bunch by white-rot fungi for enzymatic saccharification Wood Research 89 (2002) 19-20 /.
Анализ литературы показывает, что основой задачей, которую необходимо решать при конверсии лигноцеллюлозных материалов в растворимые углеводы является повышение реакционной способности полисахаридов сырья. С технологической точки зрения и с точки зрения рационального природопользования оптимальными представляются методы, которые сочетают:  An analysis of the literature shows that the basis of the problem that must be solved in the conversion of lignocellulosic materials to soluble carbohydrates is to increase the reactivity of raw polysaccharides. From a technological point of view and from the point of view of rational environmental management, optimal methods are those that combine:
• Существенное изменение морфологии лигноцеллюлозного сырья, снижение межмолекулярных взаимодействий между основными макроструктурными элементами сырья: - лигнином, гемицеллюлозой и целлюлозой. Как правило, такое изменение морфологии наблюдается при размере частиц продукта, сравнимом с размерами клеток исходного сырья;  • A significant change in the morphology of lignocellulosic raw materials, a decrease in intermolecular interactions between the main macrostructural elements of the raw material: - lignin, hemicellulose and cellulose. Typically, such a change in morphology is observed when the particle size of the product is comparable to the size of the cells of the feedstock;
• Диспергирование исходного сырья и увеличению реакционной поверхности, на которой может протекать ферментативный гидролиз полисахаридов при контакте продукта предварительной обработки с водными средами;  • Dispersing the feedstock and increasing the reaction surface on which enzymatic hydrolysis of polysaccharides can occur upon contact of the pretreatment product with aqueous media;
• Аморфизацию кристаллической целлюлозы, и как следствие ускорение ее последующего ферментативного гидролиза.  • Amorphization of crystalline cellulose, and as a result, acceleration of its subsequent enzymatic hydrolysis.
• Использование в качестве реагентов экологически безопасных ферментативных комплексов.  • Use of environmentally friendly enzymatic complexes as reagents.
Желаемый технологический эффект, повышение реакционной способности полисахаридов сырья, достигается в настоящем изобретении путем сочетания упомянутых факторов. Отличительным признаками настоящего изобретения является учет специфики выбранного лигноцеллюлозного сырья, а также проведение механической активации с наименьшими затратами энергии.  The desired technological effect, increasing the reactivity of the polysaccharides of raw materials, is achieved in the present invention by combining the above factors. Distinctive features of the present invention is to take into account the specifics of the selected lignocellulosic raw materials, as well as carrying out mechanical activation with the least energy.
Сырье предварительно подвергают обработке горячей водой с последующим отжимом на прессе. На этой стадии удаляется значительная часть водорастворимых веществ и липидов, которые, как будет показано ниже, снижают активность ферментативного комплекса. Полученный полупродукт измельчают до размера частиц 0,5-2 мм, обрабатывают слабым раствором целлюлозолитического комплекса в присутствии поверхностно-активного вещества. Здесь достигается дополнительно удаление липидов и частичное разрушение надмолекулярных структур, образованных полисахаридами сырья, благодаря чему понижается его механическая прочность. Полученный полупродукт подвергают механической активации с последующей экстракцией горячей водой. На этой стадии удаляют растворимые полифенолы и большую часть биогенного диоксида кремния, компоненты, которые также снижают эффективность ферментативного комплекса. Осахаривание сырья осуществляют путем чередования механической активации твердого остатка и ферментативного гидролиза. При этом механическую обработку проводят до тех пор, пока сохраняется линейная зависимость между временем активации и скоростью гидролиза. The raw materials are preliminarily subjected to hot water treatment followed by pressing in a press. At this stage, a significant portion of the water-soluble is removed. substances and lipids, which, as will be shown below, reduce the activity of the enzymatic complex. The resulting intermediate is crushed to a particle size of 0.5-2 mm, treated with a weak solution of a cellulolytic complex in the presence of a surfactant. Here, an additional removal of lipids and partial destruction of supramolecular structures formed by polysaccharides of raw materials are achieved, thereby reducing its mechanical strength. The resulting intermediate is subjected to mechanical activation followed by extraction with hot water. At this stage, soluble polyphenols and most of the biogenic silicon dioxide, components that also reduce the effectiveness of the enzymatic complex, are removed. The saccharification of raw materials is carried out by alternating the mechanical activation of the solid residue and enzymatic hydrolysis. In this case, the mechanical treatment is carried out until a linear relationship is maintained between the activation time and the hydrolysis rate.
Хи ический состав биомассы (Empty fruit bunches, EFB)The chemical composition of biomass (Empty fruit bunches, EFB)
Общие сведения General information
Биомасса растительных материалов состоит из пяти основных компонентов: целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина, белков и неорганических веществ. Целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин являются наиболее важными в производстве этанола.  The biomass of plant materials consists of five main components: cellulose, hemicellulose, lignin, proteins and inorganic substances. Cellulose, hemicellulose and lignin are the most important in the production of ethanol.
Целлюлоза — линейный полисахарид, построенный из элементарных звеньев ангидро-О-глюкозы и представляющий собой поли~ -1,4-0-глюкопиранозил-0- глюкопиранозу. Макромолекула целлюлозы наряду с ангидроглюкозой может содержать остатки других моносахаридов (пентоз и гексоз), а также уроновых кислот. Характер и количество таких остатков определяется условиями биохимического синтеза. Степень полимеризации нативной целлюлозы может составлять более 10 тысяч мономерных единиц, для большинства травянистых растений степень полимеризации не превышает 1,5 тысяч единиц.  Cellulose is a linear polysaccharide constructed from elementary units of anhydro-O-glucose and is a poly ~ -1,4-0-glucopyranosyl-0-glucopyranose. Cellulose macromolecule, along with anhydroglucose, may contain residues of other monosaccharides (pentoses and hexoses), as well as uronic acids. The nature and amount of such residues is determined by the conditions of biochemical synthesis. The degree of polymerization of native cellulose can be more than 10 thousand monomeric units; for most herbaceous plants, the degree of polymerization does not exceed 1.5 thousand units.
Целлюлоза - главная составляющая клеточных стенок высших растений. Вместе с сопровождающими ее веществами она играет роль каркаса, несущего основную механическую нагрузку.  Cellulose is the main component of the cell walls of higher plants. Together with the substances accompanying it, it plays the role of a skeleton that carries the main mechanical load.
Целлюлоза имеет сложную надмолекулярную структуру. Наименьшим надмолекулярным звеном целлюлозы является первичная фибрилла, в которой группы параллельно расположенных макромолекул связаны между собой множественными водородными связями. Макромолекулы целлюлозы в первичных фибриллах образуют высокоупорядоченные кристаллические зоны, которые чередуются с неоднородными менее упорядоченными аморфными зонами. Протяженность кристаллических зон в первичных фибриллах достигает 15 нм, поперечное сечение первичных фибрилл составляет 3-7 нм.  Cellulose has a complex supramolecular structure. The smallest supramolecular cellulose unit is primary fibril, in which groups of parallel macromolecules are linked by multiple hydrogen bonds. Cellulose macromolecules in primary fibrils form highly ordered crystalline zones, which alternate with heterogeneous less ordered amorphous zones. The length of the crystalline zones in the primary fibrils reaches 15 nm, the cross section of the primary fibrils is 3-7 nm.
Первичные фибриллы целлюлозы соединяются между собой с помощью водородных связей в микрофибриллы, которые и являются основными звеньями строения волокон целлюлозы. Согласно общепринятой в настоящее время модели Фрей-Висслинга существенную роль в формировании микрофибрилл играет окклюдированная вода и находящиеся между первичными фибриллами лигнин и гемицеллюлоза.  Primary cellulose fibrils are interconnected via hydrogen bonds into microfibrils, which are the main links in the structure of cellulose fibers. According to the currently accepted Frey-Wissling model, occluded water and lignin and hemicellulose located between the primary fibrils play a significant role in the formation of microfibrils.
Такая специфичная организация морфологической структуры целлюлозы обеспечивает ее устойчивость при воздействии значительных механических нагрузок. Целлюлоза также весьма устойчива к действию кислот, ферментов и микроорганизмов. Природная целлюлоза представляет собой композиционный материал с кристаллической матрицей и аморфными наполнителями, гемицеллюлозой и лигнином, которые играют роль адгезивов. Such a specific organization of the morphological structure of cellulose ensures its stability under the influence of significant mechanical loads. Cellulose is also very resistant to acids, enzymes and microorganisms. Natural cellulose is a crystalline composite matrix and amorphous fillers, hemicellulose and lignin, which play the role of adhesives.
Сложность процесса конверсии лигноцеллюлозного сырья в биоэтанол заключается в том, чтобы превратить устойчивую целлюлозу в глюкозу, которая легко сбраживаются дрожжами в этанол.  The complexity of the process of converting lignocellulosic feedstock to bioethanol is to convert stable cellulose into glucose, which is easily fermented by yeast into ethanol.
Гемицеллюлозы - полисахариды, входящие в состав клеточной стенки растительной ткани наряду с целлюлозой и лигнином, представляют собой разветвленные полимеры различного строения. Основными мономерными единицами гемицеллюлоз являются галактоза, глюкоза, манноза, ксилоза, арабиноза, уроновые кислоты.  Hemicelluloses - polysaccharides that make up the cell wall of plant tissue, along with cellulose and lignin, are branched polymers of various structures. The main monomeric units of hemicelluloses are galactose, glucose, mannose, xylose, arabinose, uronic acids.
Гемицеллюлозы отличаются от целлюлозы лучшей растворимостью в щелочных растворах и способностью легче гидролизоваться растворами целлюлозолитических ферментов и слабыми растворами кислот. Степень полимеризации у гемицеллюлоз, как правило, ниже, чем у целлюлозы. Моносахаридные остатки обычно соединены β-1 ,4- связями, причем часто имеются боковые связи другого типа. Главным компонентом гемицеллюлоз является ксилоза (50-70 % мономерных звеньев).  Hemicelluloses differ from cellulose in the best solubility in alkaline solutions and the ability to more easily hydrolyze with solutions of cellulolytic enzymes and weak acid solutions. The degree of polymerization in hemicelluloses is usually lower than in cellulose. Monosaccharide residues are usually connected by β-1, 4-bonds, and often there are side bonds of a different type. The main component of hemicelluloses is xylose (50-70% of monomer units).
Лигнины — аморфный поперечно сшитый фенольный полимер, который присутствует только у сосудистых растений, и может составлять 30 % от их массы. Лигнины не перерабатываются микроорганизмами, способными к образованию этанола, и не используются в производстве этанола. Остатки лигнина можно использовать в качестве топлива непосредственно на производстве, например для получения пара и генерации электроэнергии.  Lignins are an amorphous cross-linked phenolic polymer that is present only in vascular plants and can make up 30% of their mass. Lignins are not processed by microorganisms capable of forming ethanol, and are not used in the production of ethanol. Lignin residues can be used as fuel directly in production, for example, to produce steam and generate electricity.
Биомасса растений состоит из целлюлозных макроволокон, покрытых слоем гемицеллюлоз. Эти слои погружены в матрицу лигнина. Диаметр целлюлозных макроволокон 1-4 мкм. Механическое разделение целлюлозы и лигнина может быть достигнуто при измельчении материала до размера частиц 1-4 мкм. Обработка растительных материалов до порошка такого размера с производительностью, приемлемой с промышленности точки зрения, связана с большими трудностями.  Plant biomass consists of cellulose macrofibers coated with a layer of hemicelluloses. These layers are immersed in a lignin matrix. The diameter of cellulose macro fibers is 1-4 microns. The mechanical separation of cellulose and lignin can be achieved by grinding the material to a particle size of 1-4 microns. Processing plant materials to a powder of this size with a productivity acceptable from an industry point of view is very difficult.
Таблица 1. Химический состав биомассы.  Table 1. The chemical composition of biomass.
Содержание, % от Содержание, % от Content,% of Content,% of
Компонент Компонент Component Component
сухого сырья сухого сырья  dry raw materials dry raw materials
Экстрактивные вещества 3,7 ± 0,3 Ксилоза 33, 1 ± 2,6  Extractives 3.7 ± 0.3 Xylose 33, 1 ± 2.6
Нерастворимый в  Insoluble in
18,8 ± 0,3 Манноза 1 ,3 ± 0,01  18.8 ± 0.3 Mannose 1.3 ± 0.01
кислоте лигнин  acid lignin
Беззольный 17,8 ± 0,2 Галактоза 1 ,0 ± 0,0 кислоторастворимый Ashless 17.8 ± 0.2 Galactose 1.0 ± 0.0 acid soluble
лигнин  lignin
Зола 1 ,3 ± 0,2 Глюкоза 66,4 ± 3,7  Ash 1, 3 ± 0.2 Glucose 66.4 ± 3.7
Растворимые в горячей Растворимые в 1 %  Hot Soluble 1% Soluble
7,5 ± 0,8 14,5 ± 2,7  7.5 ± 0.8 14.5 ± 2.7
воде NaOH  water NaOH
Холоцеллюлоза 82,4 ± 1 ,4 Целлюлоза 62,9 ± 2,0  Cellulose 82.4 ± 1, 4 Cellulose 62.9 ± 2.0
Гемицеллюлоза 28,0 Арабиноза 2,5 ± 1 , 1  Hemicellulose 28.0 Arabinose 2.5 ± 1, 1
Химический состав пустых фруктовых гроздей масличной пальмы представлен в таблице 1 / K-N. Law, W.R.W. Daud, A. Ghazali, Morphological and chemical nature of fibre strands of oil palm empty-fruit-bunch (OPEFB, BioResources, 2:3 (2007) 351-362/. Видно, что общее содержание целлюлозы и гемицеллюлозы в данной биомассе более 80 %, а содержание лигнина - около 18 %. По сравнению с соломой злаковых и кормовых культур, где содержание целлюлозы не превышает 60 %, а содержание лигнина достигает 35 %, данный вид лигноцеллюлозного сырья имеет явное преимущество. The chemical composition of empty fruit clusters of oil palm is presented in table 1 / K-N. Law, W.R.W. Daud, A. Ghazali, Morphological and chemical nature of fiber strands of oil palm empty-fruit-bunch (OPEFB, BioResources, 2: 3 (2007) 351-362 /. It can be seen that the total content of cellulose and hemicellulose in this biomass is more than 80 %, and the lignin content is about 18%. Compared with straw of cereal and forage crops, where the cellulose content does not exceed 60% and the lignin content reaches 35%, this type of lignocellulosic raw material has a clear advantage.
По сравнению с другими видами растительного сырья: древесиной, стеблями злаковых растений, биомасса EFB имеет следующие отличия, которые необходимо учитывать в технологии переработки и подготовки к ферментативному гидролизу:  Compared with other types of plant materials: wood, stalks of cereal plants, the EFB biomass has the following differences that must be taken into account in the processing technology and preparation for enzymatic hydrolysis:
• Сырьё отличается повышенной концентрацией липидов и водорастворимых веществ,  • Raw materials are characterized by a high concentration of lipids and water-soluble substances,
• Сырьё состоит из сосудистых клеток длиной 0,5-1,2 мкм с диаметром 10 мкм и толщиной стенок 2-3 мкм, содержащими между собой надмолекулярные структуры, образованные гемицеллюлозой и лигнином, • The raw material consists of vascular cells with a length of 0.5-1.2 microns with a diameter of 10 microns and a wall thickness of 2-3 microns, containing supramolecular structures formed by hemicellulose and lignin,
• Внутренний объём сосудистых клеток соединён и распространяется по всей длине волокна (фибриллы), • The internal volume of vascular cells is connected and spreads along the entire length of the fiber (fibrils),
• В стенках сосудистых клеток существуют каналы, ведущие из внутреннего объёма наружу, которые в исходном виде закрыты частицами аморфного кремнезёма,  • In the walls of vascular cells, there are channels leading from the internal volume to the outside, which in their original form are covered by particles of amorphous silica,
• Стенки сосудистых клеток состоят из целлюлозы и лигнина, содержание последнего меньше, чем среднее содержание лигнина в сырье. ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ • The walls of vascular cells are composed of cellulose and lignin, the content of the latter is lower than the average lignin content in the feed. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Механическая активация и механохимическая обработка Mechanical activation and mechanochemical treatment
В настоящее время нет общей теории описывающей механохимические реакции / М.К. Beyer, Н. Clausen-Schaumann, Mechanochemistry: the mechanical activation of covalent bond, Chem. Rev., 105:8 (2005) 2921-2948/. Рассматриваются отдельные аспекты и возможные явления: There is currently no general theory describing mechanochemical reactions / M.K. Beyer, N. Clausen-Schaumann, Mechanochemistry: the mechanical activation of covalent bond, Chem. Rev. 105: 8 (2005) 2921-2948 /. Separate aspects and possible phenomena are considered:
• образование активных поверхностных радикалов,  • formation of active surface radicals,
• роль межфазовых процессов /P.Yu. Butyagin, The role of interphases in low temperature reactions of mechanochemical synthesis, Russ. Colloidal J, 59:4 (1997) 460-467/,  • the role of interphase processes /P.Yu. Butyagin, The role of interphases in low temperature reactions of mechanochemical synthesis, Russ. Colloidal J, 59: 4 (1997) 460-467 /,
• гидротермальные химические процессы при механической активации гетерогенных систем, содержащих воду (в результате стесненного удара на контакте частиц возникают условия «автоклавирования», которые характеризуются высокими температурами и давлением) /V.V. Boldyrev, Hydrothermal reactions under mechanochemical action, Powder Technol, 122 (2002) 247-254/.  • hydrothermal chemical processes during mechanical activation of heterogeneous systems containing water (as a result of a constrained shock at the contact of particles, “autoclaving” conditions arise, which are characterized by high temperatures and pressure) /V.V. Boldyrev, Hydrothermal reactions under mechanochemical action, Powder Technol, 122 (2002) 247-254 /.
С технической точки зрения механическая активация признана одним из эффективных методов изменения физико-химических свойств твердых фаз. Под механической активацией понимают увеличение реакционной способности, обусловленное устойчивыми изменениями структуры вещества под действием механических нагрузок. (Авакумов Е.Г. Механические методы активации химических процессов. Новосибирск: Наука, Сибирское отделение, 1986, 303 с).  From a technical point of view, mechanical activation is recognized as one of the effective methods for changing the physicochemical properties of solid phases. By mechanical activation is meant an increase in reactivity due to persistent changes in the structure of a substance under the action of mechanical loads. (Avakumov EG. Mechanical methods of activation of chemical processes. Novosibirsk: Science, Siberian Branch, 1986, 303 s).
Приложенное к твердому телу механическое напряжение может релаксировать по нескольким каналам. Механическая энергия расходуется, главным образом, на образование новой поверхности и дефектов кристаллической структуры. Эти процессы приводят к увеличению свободной энергии твердого тела, в результате чего повышается его реакционная способность. Так, механически активированные твердые фазы характеризуются повышенными, по сравнению с неактивированными фазами, скоростями растворения и легче вступают в химические реакции с газами и жидкостями.  The mechanical stress applied to a solid can relax through several channels. Mechanical energy is spent mainly on the formation of a new surface and defects in the crystal structure. These processes lead to an increase in the free energy of a solid, as a result of which its reactivity increases. Thus, mechanically activated solid phases are characterized by increased, in comparison with non-activated phases, dissolution rates and enter chemical reactions with gases and liquids more easily.
Основные физико-химические последствия механической активации твердых веществ заключаются в повышении их реакционной способности, с практической точки зрения интерес представляют: • Увеличение поверхности и связанные с этим размерные эффекты; The main physico-chemical consequences of the mechanical activation of solids are to increase their reactivity; from a practical point of view, they are of interest: • Surface increase and related dimensional effects;
• Разупорядочение кристаллической структуры и аморфизация;  • disordering of the crystal structure and amorphization;
• Получение гетерогенных систем с развитой границей раздела фаз, на которой наблюдаются существенные изменения физико-химических характеристик вещества (свободной энергии, кристаллической структуры и ДР-)- • Obtaining heterogeneous systems with a developed phase boundary, at which significant changes in the physicochemical characteristics of a substance (free energy, crystalline structure and DR -) are observed -
Применительно к гетерогенным системам, которые имеют сложный фазовый состав и состоят из множества компонентов, используют более общий термин «механохимическая обработка». Механохимическая обработка, как и механическая активация, приводит к устойчивым изменениям физико-химических свойств системы. Повышение реакционной способности, как правило, затрагивает большинство фаз и компонентов системы. При механохимической обработке могут протекать химические реакции, которые являются следствием увеличения подвижности компонентов и их свободной энергии под действием механических нагрузок /V.V. Boldyrev, Mechanochemistry and mechanical activation, Materials Sci. Forum, 225-227 (1996) 51 1 -520/. In relation to heterogeneous systems, which have a complex phase composition and consist of many components, use the more general term "mechanochemical processing". Mechanochemical treatment, like mechanical activation, leads to stable changes in the physicochemical properties of the system. Increased reactivity typically affects most phases and components of the system. During mechanochemical processing, chemical reactions can occur, which are the result of an increase in the mobility of the components and their free energy under the action of mechanical loads /V.V. Boldyrev, Mechanochemistry and mechanical activation, Materials Sci. Forum, 225-227 (1996) 51 1-520 /.
Механическая активация и следующий за ней химический процесс с участием жидкой фазы, например гидролиз, экстракция, химическое взаимодействие твердых компонентов вследствие полного или частичного растворения в жидкой фазе, могут быть совмещены. Показано, что при механической обработке системы твердое тело - жидкость наблюдаются инициирование и ускорение различных химических превращений. Протеканию таких химических реакций способствуют явления, характерные для активации смесей твердых компонентов (увеличение границы раздела фаз, накопление дефектов, аморфизация, повышение свободной энергии).  Mechanical activation and the subsequent chemical process involving the liquid phase, for example, hydrolysis, extraction, chemical interaction of solid components due to complete or partial dissolution in the liquid phase, can be combined. It is shown that during the mechanical processing of a solid-liquid system, the initiation and acceleration of various chemical transformations are observed. The occurrence of such chemical reactions is facilitated by the phenomena characteristic of the activation of mixtures of solid components (an increase in the phase boundary, accumulation of defects, amorphization, and an increase in free energy).
Известны физические явления, которые осуществляются при механохимическом воздействии на систему твердое вещество - жидкость. Интенсивное перемешивание, распределение частиц твердого вещества в целлюлозных гелях увеличивает скорость диффузии компонентов системы. Диспергирование, эмульгирование несмешивающихся компонентов - другой эффект, характерный для механохимической обработки. Агломерация частиц в поле механических напряжений может являться следствием высокой скорости столкновений вследствие механического воздействия. Механическая обработка может создавать необычные условия для химических реакций. В жидких системах в локальных участках обрабатываемого объема создаются гидротермальные условия, наблюдаются кавитационные процессы. C экономической точки зрения механическая энергия является «дорогостоящим» типом энергии. Использовать ее необходимо эффективно. В некоторых случаях механохимическая обработка твердой смеси может быть остановлена на ранней стадии превращения реагентов, а полное химическое превращение достигается в результате других, менее энергоемких процессов, как правило, с участием жидких фаз. Physical phenomena are known that occur during mechanochemical action on a solid-liquid system. Intensive mixing, distribution of solid particles in cellulose gels increases the diffusion rate of system components. Dispersion, emulsification of immiscible components is another effect characteristic of mechanochemical processing. Agglomeration of particles in the field of mechanical stresses can be a consequence of the high speed of collisions due to mechanical stress. Machining can create unusual conditions for chemical reactions. In liquid systems in local areas of the treated volume, hydrothermal conditions are created, cavitation processes are observed. From an economic point of view, mechanical energy is an “expensive” type of energy. It must be used effectively. In some cases, the mechanochemical processing of the solid mixture can be stopped at an early stage of the conversion of the reactants, and the complete chemical conversion is achieved as a result of other, less energy-intensive processes, usually involving liquid phases.
В случае такого подхода на стадии механохимической обработки достигается:  In the case of this approach, at the stage of mechanochemical processing is achieved:
• Введение дефектов в кристаллическую структуру реагентов,  • Introduction of defects into the crystal structure of reagents,
• Уменьшение степени кристалличности и аморфизация реагентов,  • Reducing the degree of crystallinity and amorphization of reagents,
• К настоящему времени описано множество технологий, в которых используется механохимическая обработка, например:  • To date, many technologies have been described that use mechanochemical processing, for example:
• Подготовка минерального сырья с целью увеличения выхода в процессах извлечения полезного компонента /Tkacova, К. Mechanical activation of minerals. - Amsterdam: Elsevier, 1989. - 156 pp./,  • Preparation of mineral raw materials in order to increase the yield in the processes of extracting a useful component / Tkacova, K. Mechanical activation of minerals. - Amsterdam: Elsevier, 1989 .-- 156 pp./,
• Интенсификация гидрометаллургических процессов /Balaz, P. Mechanicka activacia v procesoch extrakcinh metalurgie - Veda.: Bratislava (Slovakia), 1997. -223 pp./ • Intensification of hydrometallurgical processes / Balaz, P. Mechanicka activacia v procesoch extrakcinh metalurgie - Veda .: Bratislava (Slovakia), 1997. -223 pp./
• Химическая переработка угля /Khrenkova, T.M. Mechanochemical activation of coals - Moscow: Nedra. - 176 pp./. • Chemical processing of coal / Khrenkova, T.M. Mechanochemical activation of coals - Moscow: Nedra. - 176 pp./.
Перспективы развития механохимии связывают с катализом органических реакций /V. V. Molchanov, R. A. Buyanoy, Mechanochemistry of catalysts, Russ. Chem. Rev. , 69 (2000) 476-493/, фармакологией / V.V. Boldyrev, Mechanochemical modification and synthesis of drugs, J. Materials Science, 39 (2004) 51 17-5120) и решением экологических проблем /Lomovsky О. I., Boldyrev V.V. Mechanochemistry for solving environmental problems. Publ. SO RAN: Novosibirsk (Russia), 2006, 221 pp/.  The prospects for the development of mechanochemistry are associated with the catalysis of organic reactions / V. V. Molchanov, R. A. Buyanoy, Mechanochemistry of catalysts, Russ. Chem. Rev. 69 (2000) 476-493 /, pharmacology / V.V. Boldyrev, Mechanochemical modification and synthesis of drugs, J. Materials Science, 39 (2004) 51 17-5120) and solving environmental problems / Lomovsky O. I., Boldyrev V.V. Mechanochemistry for solving environmental problems. Publ. SO RAN: Novosibirsk (Russia), 2006, 221 pp /.
Эффективность осуществления механохимических реакций зависит не только от химических свойств реагентов, но и от их механических свойств. Проведение механохимических процессов, в которых участвуют мягкие вещества и материалы, требует небольших затратах энергии /Awakumov, Е. М. Senna, М. Kosova. Soft mechanochemical synthesis: a basis for new chemical technologies/ Boston: Kluwer Academic Publishers, 2001. - 200 pp./. Твердость органических веществ обычно гораздо ниже, чем неорганических. Механохимические реакции, протекающие в органических системах, имеют в 1000 раз больший энергетический выход, чем в неорганических системах. Показано, что некоторые органические реакции более эффективно проводить в твердой фазе, нежели в жидкой фазе /К. Tanaka, F. Toda, Solvent- free organic synthesis, Chem. Rev. , 100 (2000) 1025-1074/. Таким образом, в плане технологического использования наиболее перспективными оказываются механохимические процессы, протекающие с участием органических веществ. The effectiveness of the implementation of mechanochemical reactions depends not only on the chemical properties of the reagents, but also on their mechanical properties. Carrying out mechanochemical processes in which soft substances and materials are involved requires low energy costs / Awakumov, E. M. Senna, M. Kosova. Soft mechanochemical synthesis: a basis for new chemical technologies / Boston: Kluwer Academic Publishers, 2001 .-- 200 pp. /. The hardness of organic substances is usually much lower than inorganic. Mechanochemical reactions taking place in organic systems have a 1000 times greater energy yield than in inorganic systems. It was shown that some organic reactions are more efficiently carried out in the solid phase than in the liquid phase / K. Tanaka, F. Toda, Solvent-free organic synthesis, Chem. Rev. , 100 (2000) 1025-1074 /. Thus, in terms of technological use, the most promising are the mechanochemical processes taking place with the participation of organic substances.
Одним из дополнительных преимуществ применения механической обработки в биотехнологиях является возможность одновременного разрушение клеточных мембран, на что в других вариантах технологии требуются дополнительные затраты тепловой энергии и реагентов.  One of the additional advantages of using mechanical processing in biotechnology is the possibility of simultaneous destruction of cell membranes, which in other versions of the technology requires additional costs of thermal energy and reagents.
Отличительным признаками настоящего изобретения является проведение механической активации с учетом специфики биомассы и с наименьшими затратами энергии:  A distinctive feature of the present invention is the mechanical activation taking into account the specifics of biomass and with the least energy:
• Сырье предварительно подвергают обработке горячей водой с последующим отжимом на прессе. На этой стадии удаляется значительная часть водорастворимых веществ и липидов, которые, как будет показано ниже, снижают активность ферментативного комплекса.  • Raw materials are preliminarily subjected to hot water treatment followed by pressing in a press. At this stage, a significant part of water-soluble substances and lipids is removed, which, as will be shown below, reduce the activity of the enzymatic complex.
• Полученный полупродукт измельчают до размера частиц 0,04-2 мм, обрабатывают слабым раствором целлюлозолитического комплекса в присутствии поверхностно- активного вещества. Здесь достигается частичное разрушение надмолекулярных структур, образованных гемицеллюлозой и лигнином, благодаря чему понижается его механическая прочность. После этой стадии сырье становится пригодным для механической активации в режиме стесненного удара.  • The resulting intermediate is crushed to a particle size of 0.04-2 mm, treated with a weak solution of a cellulolytic complex in the presence of a surfactant. Here, partial destruction of supramolecular structures formed by hemicellulose and lignin is achieved, due to which its mechanical strength is reduced. After this stage, the raw material becomes suitable for mechanical activation in the constrained shock mode.
• Полученный полупродукт подвергают механической активации в режиме стесненного удара с последующей экстракцией горячей водой. На этой стадии открываются внутренние объёмы сосудистых клеток и удаляются растворимые полифенолы и большую часть биогенного диоксида кремния, компоненты, которые также снижают эффективность ферментативного комплекса.  • The resulting intermediate is subjected to mechanical activation in the mode of constrained shock, followed by extraction with hot water. At this stage, internal volumes of vascular cells are opened and soluble polyphenols and most of the biogenic silicon dioxide, components that also reduce the effectiveness of the enzymatic complex, are removed.
• Осахаривание сырья осуществляют путем чередования механической активации твердого остатка, состоящего из сосудистых клеток с открытым внутренним объёмом, и ферментативного гидролиза. Механическую обработку проводят до тех пор, пока сохраняется линейная зависимость между временем активации и выходом углеводов, который достигается при постоянной скорости гидролиза. Факторы, влияющие на активность ферментативного комплекса • Saccharification of raw materials is carried out by alternating the mechanical activation of a solid residue consisting of vascular cells with an open internal volume and enzymatic hydrolysis. The mechanical treatment is carried out until a linear relationship is maintained between the activation time and the carbohydrate yield, which is achieved at a constant rate of hydrolysis. Factors affecting the activity of the enzymatic complex
Для гетерогенного гидролиза скорость реакции пропорциональна площади контакта при условии постоянства концентрации катализатора. Ферментативный гидролиз использованной биомассы характеризуется заметным снижением скорости на начальных стадиях процесса, по сравнению с другим лигноцеллюлозным сырьем, например, с соломой злаковых культур. Наблюдаемое на начальном этапе снижение скоростей весьма существенно и не может быть объяснено расходом реагента в реакции гидролиза (уменьшением площади контакта). For heterogeneous hydrolysis, the reaction rate is proportional to the contact area, provided that the concentration of the catalyst is constant. Enzymatic hydrolysis of the biomass used is characterized by a marked decrease in the rate at the initial stages of the process, in comparison with other lignocellulosic raw materials, for example, with straw of cereal crops. The decrease in velocities observed at the initial stage is very substantial and cannot be explained by the consumption of the reagent in the hydrolysis reaction (decrease in the contact area).
Наиболее вероятными факторами, вызывающими отклонение от формальной кинетики, являются:  The most likely factors causing a deviation from formal kinetics are:
• Термическая инактивация компонентов ферментативного комплекса.  • Thermal inactivation of the components of the enzymatic complex.
• Химическая инактивация ферментативного комплекса.  • Chemical inactivation of the enzymatic complex.
• Обратимый характер некоторых стадий процесса.  • The reversible nature of some stages of the process.
• Ступенчатый характер процесса (сочетание «быстрого» и «медленного» гидролиза, когда сначала быстро гидролизуется аморфный субстрат, а затем протекает гидролиз кристаллического субстрата).  • The stepwise nature of the process (a combination of “fast” and “slow” hydrolysis, when the amorphous substrate quickly hydrolyzes first and then the crystalline substrate hydrolyzes).
Термическая инактивация ферментативного комплекса. Большинство ферментов стабильны в иммобилизованном, твердом или глубоко охлажденном состоянии. Многие ферменты теряют активность в растворах, особенно в отсутствии субстрата. Установлено, что активность ферментативного комплекса заметно снижается при его инкубировании в оптимальных условиях проведения гидролиза. Эти данные согласуются с данными производителя, согласно им в оптимальных условиях гидролиза (рН = 4,5-4,7, Т = 50,0 °С) ферментативный комплекс теряет в растворе в отсутствии субстрата 4-5 % общей активности в час. Это означает, что в течение суток активность комплекса уменьшается на 40-60 процентов. Таким образом, заметное снижение активности наблюдается за технологически приемлемые времена, сопоставимые со временем проведения процесса последующего осахаривания и совместного сбраживания.  Thermal inactivation of the enzymatic complex. Most enzymes are stable in immobilized, solid or deeply chilled state. Many enzymes lose activity in solutions, especially in the absence of substrate. It was found that the activity of the enzymatic complex significantly decreases when it is incubated under optimal conditions for hydrolysis. These data are consistent with the manufacturer's data, according to them, under optimal hydrolysis conditions (pH = 4.5–4.7, T = 50.0 ° C), the enzymatic complex loses 4–5% of the total activity per hour in solution in the absence of a substrate. This means that during the day the activity of the complex decreases by 40-60 percent. Thus, a noticeable decrease in activity is observed for technologically acceptable times, comparable with the time of the process of subsequent saccharification and co-fermentation.
В присутствии субстрата активность падает в меньшей степени по сравнению с растворами фермента без субстрата, поскольку последний способен иммобилизовать ферменты. С другой стороны, ферменты, имеющие слабое сродство к твердому субстрату, например экзоглюканазы и глюкозидазы, ответственные за расщепление олигосахаридов до моносахаридов, могут инактивироваться вне зависимости от наличия субстрата. Инактивация этих ферментов приводит к накоплению промежуточных продуктов и снижению скорости реакции. Предложен способ устранения данного эффекта. In the presence of a substrate, activity decreases to a lesser extent compared with enzyme solutions without a substrate, since the latter is capable of immobilizing enzymes. On the other hand, enzymes having a weak affinity for a solid substrate, such as exoglucanases and glucosidases, are responsible for the cleavage of oligosaccharides to monosaccharides, can be inactivated regardless of the presence of a substrate. Inactivation of these enzymes leads to the accumulation of intermediate products and a decrease in the reaction rate. A method for eliminating this effect is proposed.
Меры по снижению скорости термической деградации ферментов позволяют увеличить скорость гидролиза и открывают дополнительные возможности в плане повторного использования первичных гидролизатов, например, в режиме противотока для получения концентрированных растворов углеводов.  Measures to reduce the rate of thermal degradation of enzymes can increase the rate of hydrolysis and open up additional opportunities for the reuse of primary hydrolysates, for example, in countercurrent mode to obtain concentrated solutions of carbohydrates.
Химическая инактивация ферментативного комплекса. Установлена корреляция между падением скорости гидролиза на начальном этапе гидролиза и содержанием в сырье водорастворимых веществ. Наблюдаемый эффект обусловлен наличием во фракции ВРВ компонентов, способных связывать ферменты комплекса. К таким компонентам относятся лигнин, пектиновые вещества, а также минеральные вещества.  Chemical inactivation of the enzymatic complex. A correlation was established between the decrease in the rate of hydrolysis at the initial stage of hydrolysis and the content of water-soluble substances in the feed. The observed effect is due to the presence in the HRV fraction of components capable of binding the enzymes of the complex. These components include lignin, pectin, and minerals.
В кислых и слабокислых растворах сравнительно легко протекает реакция образования прочных межмолекулярных комплексов между белками и полифенолами. На этом в частности основан процесс дубления или осветления соков /K.J. Siebert, N.V. Troukhanova, P.Y. Lynn, Nature of Polyphenol-Protein Interactions, J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 80-85/. В случае ферментативного гидролиза некоторые компоненты растительного сырья, а именно растворимые полифенолы, растворимая часть лигнина, могут обратимо или необратимо связывать компоненты ферментативного комплекса.  In acidic and weakly acidic solutions, the formation of strong intermolecular complexes between proteins and polyphenols is relatively easy. The tanning or clarification of juices /K.J is particularly based on this. Siebert, N.V. Troukhanova, P.Y. Lynn, Nature of Polyphenol-Protein Interactions, J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 80-85 /. In the case of enzymatic hydrolysis, some components of the plant material, namely soluble polyphenols, the soluble part of lignin, can reversibly or irreversibly bind the components of the enzymatic complex.
При введении водорастворимых веществ или лигнина биомассы в модельные системы (фильтровальная бумага + ферментативный комплекс) наблюдали существенное снижение скорости гидролиза.  With the introduction of water-soluble substances or biomass lignin into model systems (filter paper + enzymatic complex), a significant decrease in the rate of hydrolysis was observed.
Механическая активация заметно нарушает строение природного лигноцеллюлозного композита, открывает доступ к целлюлозе. С другой стороны следует ожидать увеличения доступности лигнина. Имеют место два процесса: параллельная сорбция ферментов на лигнине и целлюлозе, а также перенос ферментов с целлюлозы на лигнин. В пользу этого свидетельствует увеличивающая разница в концентрации глюкозы для экспериментов с добавлением и без добавления лигнина. Равновесие субстрат- фермент устанавливается быстро, после чего лигнин «вытягивает» через раствор адсорбированные субстратом ферменты.  Mechanical activation noticeably disrupts the structure of the natural lignocellulosic composite and opens up access to cellulose. On the other hand, an increase in the availability of lignin should be expected. Two processes take place: parallel sorption of enzymes on lignin and cellulose, as well as transfer of enzymes from cellulose to lignin. This is evidenced by the increasing difference in glucose concentration for experiments with and without lignin. The equilibrium of the substrate – enzyme is quickly established, after which the lignin “draws” enzymes adsorbed by the substrate through the solution.
На основе полученных данных предложены следующие рекомендации. Поскольку водорастворимая часть растительного сырья не содержит экономически значимого количества углеводов, предлагается удалять водорастворимые компоненты на стадии подготовки сырья. С одной стороны это позволяет избежать частичной инактивации ферментов. С другой стороны, удаление водорастворимых веществ значительно повышает эффективность механической обработки растительного сырья. Based on the data obtained, the following recommendations are proposed. Since the water-soluble part of the plant material does not contain an economically significant amount of carbohydrates, it is proposed to remove the water-soluble components at the stage of preparation of the raw material. On the one hand, this avoids partial inactivation. enzymes. On the other hand, the removal of water-soluble substances significantly increases the efficiency of machining of plant materials.
Введение добавок поверхностно-активных веществ способствует сохранению активности ферментативного комплекса. Благодаря этому снижается сорбция ферментов на лигнине, при этом количество доступного фермента повышается. В качестве ПАВ можно использовать TWEEN и низкомолекулярный полиэтиленоксид.  The introduction of surfactant additives contributes to the preservation of the activity of the enzymatic complex. Due to this, the sorption of enzymes on lignin is reduced, while the amount of available enzyme increases. As a surfactant, TWEEN and low molecular weight polyethylene oxide can be used.
Существенное влияние на процесс гидролиза оказывает минеральная составляющая. Введение хлористого кальция на стадии механической обработки способствует тонкому измельчению, увеличению поверхности и снижению кристалличности. Поэтому введение хлористого кальция рекомендуется только для первой стадии процесса. Ионы некоторых металлов способны встраиваться в активные центры ферментов и менять активность фермента. К таким металлам относятся магний и кальций.  The mineral component has a significant effect on the hydrolysis process. The introduction of calcium chloride at the stage of mechanical processing contributes to fine grinding, increase surface and reduce crystallinity. Therefore, the introduction of calcium chloride is recommended only for the first stage of the process. Ions of some metals are able to integrate into the active centers of enzymes and change the activity of the enzyme. These metals include magnesium and calcium.
Обратимый характер некоторых стадий процесса (псевдоинактивация компонентов ферментативного комплекса продуктами гидролиза) и ступенчатый характер гидролиза. Для удобства последующего изложения, приводится схема /Sinitsyn А.Р., Gusakov A.V., Chernoglazov V.M. Bioconversion of lignocellulose materials/ Moscow: Publishing House of Moscow State University, 1995, 220 p., and references in the list/, поясняющая стадии ферментативного гидролиза (Ошибка! Источник ссылки не найден.). Полисахариды гидролизуются эндоглюканазами, действующими на внутренние гликозидные связи, (эндоцеллюлаза или 1,4-бета-0-глюкан-глюканогидролаза, техническое название этого фермента - эндо-1,4-бетаглюканаза, на схеме £7), при этом преимущественно образуются «длинные» олигосахариды. Эндоглюканазы действуют на кристаллическую и аморфную целлюлозу, являются субстрат-специфичными ферментами, хорошо сорбируются на твердом субстрате.  The reversible nature of some stages of the process (pseudo-inactivation of the components of the enzymatic complex by hydrolysis products) and the stepwise nature of hydrolysis. For the convenience of the subsequent presentation, the scheme is given / Sinitsyn A.R., Gusakov A.V., Chernoglazov V.M. Bioconversion of lignocellulose materials / Moscow: Publishing House of Moscow State University, 1995, 220 p., And references in the list /, explaining the stages of enzymatic hydrolysis (Error! Source of link not found.). Polysaccharides are hydrolyzed by endoglucanases acting on internal glycosidic bonds (endocellulase or 1,4-beta-0-glucan-glucanohydrolase, the technical name for this enzyme is endo-1,4-beta-glucanase, in the £ 7 scheme), with the formation of “long "Oligosaccharides. Endoglucanases act on crystalline and amorphous cellulose, are substrate-specific enzymes, are well sorbed on a solid substrate.
Олигосахариды являются субстратом для экзоглюканаз, действующих на внешние, ближайшие к концу молекулы, связи. Основным продуктом реакции являются дисахариды. На схеме эта группа ферментов обозначена . наиболее значимым в этой группе ферментов является экзоцеллюлаза или 1,4-бета-0-глюкан-целлобиогидролаза, техническое название этого фермента - целлобиогидролаза, продукт ее действия на олигосахариды - дисахарид целлобиоза. Экзоглюканазы также являются специфичными ферментами.  Oligosaccharides are a substrate for exoglucanases acting on external bonds closest to the end of the molecule. The main reaction product is disaccharides. In the diagram, this group of enzymes is indicated. the most significant in this group of enzymes is exocellulase or 1,4-beta-0-glucan-cellobiohydrolase, the technical name of this enzyme is cellobiohydrolase, the product of its action on oligosaccharides is cellobiose disaccharide. Exoglucanases are also specific enzymes.
Целлобиоза может быть гидролизована до двух молекул глюкозы под действием бета-глюкозидазы или бета-О-глюкозид-целлобиогидролазы, техническое название этого фермента - целлобиаза, на схеме - Ej. Считается, что промежуточный продукт целлобиоза способен обратимо инактивировать фермент предшествующей стадии - целлобиогидролазу. Cellobiose can be hydrolyzed to two glucose molecules under the influence of beta-glucosidase or beta-O-glucoside-cellobiohydrolase, the technical name for this enzyme - cellobiase, in the diagram - Ej. It is believed that the intermediate product of cellobiosis is capable of reversibly inactivating the enzyme of the previous stage - cellobiohydrolase.
Для глюкозидаз характерна широкая специфичность: они способны гидролизовать D-гликозидные связи между глюкозными и арильными, алкильными или углеводными остатками. Глюкозидазы могут гидролизовать 1 -2, 1-3, -4 и 1-6 гликозидные связи. У многих бета-глюкозидаз отсутствует строгая специфичность к конфигурации гидроксильных групп у С-4 и С-5 атомов гексозидов и пентозидов. Отличительной особенностью бета-глюкозидаз является то, что они, в отличие от экзоглюкозидаз (на схеме Е4), быстрее действуют на короткие олигосахариды.  Glucosidases are characterized by broad specificity: they are able to hydrolyze D-glycosidic bonds between glucose and aryl, alkyl or carbohydrate residues. Glucosidases can hydrolyze 1 -2, 1-3, -4 and 1-6 glycosidic bonds. Many beta-glucosidases lack strict specificity for the configuration of hydroxyl groups at C-4 and C-5 atoms of hexosides and pentosides. A distinctive feature of beta-glucosidases is that they, unlike exoglucosidases (in scheme E4), act faster on short oligosaccharides.
Экзоглюкозидазы отличаются от целлобиогидролаз тем, что основным продуктом их действия на поли- или олигосахаридные субстраты являются не ди-, а моносахариды. Экзоглюкозидазы способны гидролизовать аморфную целлюлозу.  Exoglucosidases differ from cellobiohydrolases in that the main product of their action on poly- or oligosaccharide substrates is not di- but monosaccharides. Exoglucosidases are able to hydrolyze amorphous cellulose.
Под ступенчатым характером гидролиза понимается следующее. Считается, что гидролиз целлюлозы протекает в две стадии. Первая стадия, быстрая, - гидролиз амофного субстрата, вторая стадия, медленная, - гидролиз кристаллического субстрата. The stepwise nature of hydrolysis is understood as follows. It is believed that the hydrolysis of cellulose proceeds in two stages. The first stage, fast, is the hydrolysis of the amophic substrate, the second stage, slow, is the hydrolysis of the crystalline substrate.
Предпочтительные варианты (осуществления изобретения)Preferred Options (Embodiments)
ПРИМЕР 1. Термическая инактивация ферментативного комплекса. EXAMPLE 1. Thermal inactivation of the enzymatic complex.
Здесь и далее за одну единицу активности целлюлозолитического комплекса принимается способность гидролизовать бумагу Watman N°l при гидромодуле 20 и Т = 50 °С в течение часа с образованием 1 мг альдоз (восстанавливающих углеводов) в пересчете на глюкозу. Таким образом, активность является величиной, пропорциональной начальной скорости гидролиза целлюлозы в определенных условиях. Поскольку по ходу гидролиза скорость процесса падает, очевидно, что активность, измеренная в начальные времена, будет заметно выше активности, измеренной через несколько часов гидролиза, или средней активности, найденной за продолжительный гидролиз.  Hereinafter, for one unit of activity of the cellulolytic complex, the ability to hydrolyze Watman N ° l paper at a water module of 20 and T = 50 ° C for an hour with the formation of 1 mg aldose (reducing carbohydrates) in terms of glucose is taken. Thus, activity is proportional to the initial rate of hydrolysis of cellulose under certain conditions. Since the rate of the process decreases during hydrolysis, it is obvious that the activity measured in the initial times will be noticeably higher than the activity measured after several hours of hydrolysis, or the average activity found during prolonged hydrolysis.
На Ошибка! Источник ссылки не найден, представлены данные по изменению активности ферментативного комплекса Целлолюкс (целлюлозолитический комплекс производства Сиббифарм, Бердск, РФ) в растворе. Видно, что активность комплекса (по глюкозе и общая) в буферном растворе при оптимальной температуре снижается примерно на 4-5 % в час. Показано, что введение в реакционные среды поверхностно- активных веществ, например ТВИН-20 или ТВИН-80 в концентрации 0,1-0,2 % значительно повышает устойчивость растворов ферментов и позволяет использовать инкубированные 24 часа при 50 °С растворы с эффективностью практически равной исходной (Ошибка! Источник ссылки не найден.). Значительной стабилизации компонентов ферментативного целлюлозолитического комплекса можно добиться путем введения в реакционные среды полиэтиленоксида. Однако, отмечается снижение общей активности, которое обусловлено повышением вязкости растворов и возникновением дополнительных диффузионных ограничений.  To Error! No reference source found, data on changes in the activity of the Cellulux enzyme complex (cellulolytic complex produced by Sibbifarm, Berdsk, RF) in solution are presented. It can be seen that the activity of the complex (for glucose and total) in the buffer solution at the optimum temperature decreases by about 4-5% per hour. It has been shown that the introduction of surface-active substances, for example, TWIN-20 or TWIN-80 in a concentration of 0.1-0.2%, significantly increases the stability of enzyme solutions and allows the use of solutions that are incubated for 24 hours at 50 ° C with an efficiency almost equal source (Error! Link source not found.). Significant stabilization of the components of the enzymatic cellulolytic complex can be achieved by introducing polyethylene oxide into the reaction medium. However, a decrease in overall activity is noted, which is due to an increase in the viscosity of solutions and the appearance of additional diffusion restrictions.
ПРИМЕР 2. Химическая инактивация компонентов ферментативного комплекса водорастворимыми веществами и лигнином.  EXAMPLE 2. Chemical inactivation of the components of the enzymatic complex with water-soluble substances and lignin.
Водорастворимые вещества, выделенные из биомассы, инактивируют ферментативный комплекс в первый час гидролиза на 35-40 %. Так, введение водорастворимых веществ в начале гидролиза целлюлозы приводит к снижению активности, измеренной по глюкозе, с 370 до 190 единиц (Ошибка! Источник ссылки не найден.).  Water-soluble substances isolated from biomass inactivate the enzymatic complex in the first hour of hydrolysis by 35-40%. Thus, the introduction of water-soluble substances at the beginning of the hydrolysis of cellulose leads to a decrease in the activity measured by glucose from 370 to 190 units (Error! Source of link not found.).
В эксперименте измерялось накопление глюкозы при действии целлюлозолитического комплекса на бумагу в отсутствии лигнина, выделенного из биомассы, и с его добавкой (Ошибка! Источник ссылки не найден.). Введение мелкодисперсного порошка лигнина из расчета 10-15 % на субстрат приводило к снижению выхода глюкозы в первые несколько часов на 25 %. In the experiment, the accumulation of glucose was measured under the action of a cellulolytic complex on paper in the absence of lignin isolated from biomass, and with its addition (Error! Link source not found.). The introduction of finely divided lignin powder at the rate of 10-15% per substrate led to a 25% decrease in glucose output in the first few hours.
ПРИМЕР 3. Химическая инактивация компонентов ферментативного комплекса водорастворимыми минералами.  EXAMPLE 3. Chemical inactivation of the components of the enzymatic complex by water-soluble minerals.
Введение растворимых форм кальция в реакционные среды, включающие субстрат и ферментативный комплекс, заметно снижает скорость ферментативного гидролиза целлюлозы. На Ошибка! Источник ссылки не найден, представлены результаты измерения активности ферментативного комплекса при добавлении в реакционные среды хлорида кальция и щавелевокислого аммония, образующего нерастворимый осадок с хлоридом кальция. В качестве субстрата использовали биомассу, подвергнутую механической обработке с добавкой хлорида кальция (5 % по массе). Из растительного сырья были предварительно удалены липиды и водорастворимые вещества. Механически активированное сырье заливали раствором фермента, в отдельных вариантах в реакционную среду вводили необходимые добавки, реакторы помещали на 13 часов в термошейкер с температурой 50 °С, частой колебаний ~ 240 в минуту (вариант 0). Затем гидролизаты центрифугировали, 2/3 гидролизата, освобожденного от осадка, переносили на свежий субстрат, подготовленный аналогичным способом и взятый в количестве 2/3 от исходного (вариант L). К остатку добавляли цитратный буфер до достижения исходного объема (вариант S). Через 13 часов определяли содержание глюкозы в гидролизатах, на основе полученных данных находили активность комплекса. При расчете активности для вариантов L u S использовали исходную концентрацию комплекса.  The introduction of soluble forms of calcium in the reaction medium, including the substrate and the enzymatic complex, significantly reduces the rate of enzymatic hydrolysis of cellulose. To Error! No reference source found, the results of measuring the activity of the enzymatic complex when calcium chloride and ammonium oxalate are added to the reaction medium, forming an insoluble precipitate with calcium chloride. The substrate used was biomass machined with the addition of calcium chloride (5% by weight). Lipids and water-soluble substances were previously removed from plant materials. Mechanically activated raw materials were poured with an enzyme solution, in some versions, the necessary additives were introduced into the reaction medium, the reactors were placed for 13 hours in a thermo-shaker with a temperature of 50 ° С, with frequent fluctuations of ~ 240 per minute (option 0). Then the hydrolysates were centrifuged, 2/3 of the hydrolyzate freed from the precipitate was transferred to a fresh substrate prepared in the same way and taken in an amount of 2/3 of the original (option L). Citrate buffer was added to the residue until the initial volume was reached (option S). After 13 hours, the glucose content in the hydrolysates was determined, based on the obtained data, the activity of the complex was found. When calculating the activity for the L u S variants, the initial concentration of the complex was used.
Из левой диаграммы для опытов 2 и 3, что суммарная активность компонентов комплекса (варианты L и S), оказывается ниже исходной активности. Эффект снижения активности ферментативного комплекса наиболее выражен для опыта 2, в котором был добавлен хлористый кальций. Здесь потери составили примерно 50 % для первичного гидролиза в течение 13 часов (сравните варианты 0 опытов 1 и 2), и примерно столько же для суммы вариантов L и S.  From the left diagram for experiments 2 and 3, that the total activity of the components of the complex (options L and S) is lower than the initial activity. The effect of reducing the activity of the enzymatic complex is most pronounced for experiment 2, in which calcium chloride was added. Here, the losses were approximately 50% for primary hydrolysis for 13 hours (compare options 0 of experiments 1 and 2), and about the same for the sum of options L and S.
Снижение суммарной активности ферментативного комплекса объясняется инактивацией компонентов комплекса катионами кальция.  The decrease in the total activity of the enzymatic complex is explained by the inactivation of the complex components by calcium cations.
В опыте 3, когда кальций был связан в нерастворимую форму, сохранилось порядка 70 % исходной активности. Однако и здесь не удалось избежать заметной инактивации компонентов комплекса. Над осадком нерастворимого оксалата кальция, образующегося при добавлении щавелевокислого аммония, имеется некоторая равновесная концентрация растворенного кальция. Кальций, находящийся в растворе, «связывает» ферменты. Снижение концентрации кальция компенсируется частичным растворением осадка до достижения равновесной концентрации. В результате наблюдается снижение активности компонентов комплекса, однако над осадком нерастворимой соли этот процесс протекает заметно медленнее. In experiment 3, when calcium was bound in an insoluble form, about 70% of the initial activity was preserved. However, here, it was not possible to avoid a noticeable inactivation of the components of the complex. Above the precipitate of insoluble calcium oxalate formed when adding oxalic ammonium, there is some equilibrium concentration of dissolved calcium. Calcium in solution "binds" enzymes. The decrease in calcium concentration is offset by partial dissolution of the precipitate until an equilibrium concentration is reached. As a result, a decrease in the activity of the components of the complex is observed, however, this process proceeds noticeably slower over the precipitate of insoluble salt.
Обращают на себя внимание результаты опыта 2, в котором активности в вариантах S и L примерно одинаковые. При высоком содержании кальция, практически полностью инактивируются ферменты, находящиеся в растворе. Вероятно, в основе инактивации лежит связывание кальция активным центром фермента. Для компонентов комплекса, сорбированных субстратом, следует ожидать меньшей доступности активного центра, поэтому эти ферменты при избытке кальция подвергаются инактивации в меньшей степени по сравнению с ферментами, находящимися в растворе.  Noteworthy are the results of experiment 2, in which the activities in variants S and L are approximately the same. With a high calcium content, the enzymes in solution are almost completely inactivated. Probably, inhibition is based on calcium binding to the active center of the enzyme. For the components of the complex adsorbed by the substrate, one should expect a lower availability of the active center; therefore, these enzymes are inactivated to a lesser extent with an excess of calcium compared to the enzymes in solution.
Известно, что в первую очередь гидролизуется аморфная целлюлоза, а содержание аморфной целлюлозы в субстрате является величиной, отражающей реакционную способность субстрата по отношению к гидролизу. Меньшее значение суммы активностей вариантов S и L по сравнению с активностью, найденной в варианте 0, объясняется снижением содержания аморфной фазы в системе.  It is known that, first of all, amorphous cellulose is hydrolyzed, and the content of amorphous cellulose in the substrate is a value that reflects the reactivity of the substrate with respect to hydrolysis. The lower value of the sum of the activities of variants S and L compared with the activity found in option 0 is explained by a decrease in the content of the amorphous phase in the system.
Для опыта 4 отмечено заметное увеличение активности части ферментативного комплекса, оставшейся вместе с осадком после центрифугирования (сравните варианты S опытов 1 и 4). Введение щавелевокислого аммония в исходный субстрат связывает добавленный на стадии механической активации хлористый кальций и таким образом предотвращает инактивацию ферментов. Данный эффект более выражен для опытов 2 и 3. Здесь активность ферментов, оставшихся на осадке, возрастает примерно в два раза - с 18 до 35 единиц.  For experiment 4, a marked increase in the activity of part of the enzymatic complex remaining with the precipitate after centrifugation was observed (compare options S of experiments 1 and 4). The introduction of ammonium oxalate in the starting substrate binds calcium chloride added at the stage of mechanical activation and thus prevents the inactivation of enzymes. This effect is more pronounced for experiments 2 and 3. Here, the activity of the enzymes remaining on the sediment increases approximately twice - from 18 to 35 units.
Представленные выше эксперименты свидетельствую в пользу того, что инактивация компонентов ферментативного комплекса водорастворимыми веществами, выделенными из пальмовых гроздей, может быть обусловлена наличием в растворимой минеральной части солей щелочноземельных металлов. Представляется целесообразным перед ферментативным гидролизом удалять из растительного сырья растворимую минеральную составляющую.  The experiments presented above testify in favor of the fact that the inactivation of the components of the enzymatic complex by water-soluble substances isolated from palm clusters may be due to the presence of alkaline earth metal salts in the soluble mineral part. It seems advisable to remove the soluble mineral component from plant materials before enzymatic hydrolysis.
ПРИМЕР 3. Ступенчатый характер процесса (сочетание «быстрого» и «медленного» гидролиза). Обращаясь к приведенным на Ошибка! Источник ссылки не найден, схеме ферментативного гидролиза и данным, приведенным на Ошибка! Источник ссылки не найден., можно сделать вывод о глубоком изменении субстрата по ходу ферментативного гидролиза. EXAMPLE 3. The stepwise nature of the process (a combination of "fast" and "slow" hydrolysis). Referring to the cited Error! Link source not found, enzymatic hydrolysis scheme and data provided on Error! The source of the link was not found., We can conclude that a deep change in the substrate during enzymatic hydrolysis.
Часть компонентов ферментативного комплекса, практически полностью сорбируется на субстрате, преимущественно это эндоглюканазы. С учетом сорбции в варианте S следовало ожидать активности, составляющей более 1/3 от исходной и более 1/2 от варианта L. В опытах 1, 3 и 4 наблюдается существенно меньшая активность.  Some of the components of the enzymatic complex are almost completely adsorbed on the substrate, mainly endoglucanases. Taking into account sorption in variant S, an activity of more than 1/3 of the initial one and more than 1/2 of variant L. could be expected. In experiments 1, 3, and 4, significantly less activity was observed.
На начальных этапах в первые 7-10 часов гидролизуется преимущественно аморфная часть целлюлозы. По мере уменьшения содержания субстрата с повышенной реакционной способностью снижается скорость гидролиза, и процесс переходит в «медленную стадию». Причиной уменьшения активности является ингибирование продуктами гидролиза стадий, в которых принимают участие ферменты, обозначенные на схеме как Ег, Ез, Е4. Если ингибирование продуктами реакции при степени конверсии полисахаридов 15-40 % вносит существенный вклад в уменьшение скорости процесса, свободные от осадка гидролизаты (вариант L) будут обладать заметно меньшей активностью на свежем субстрате по сравнению с исходной активностью (вариант 0).  In the initial stages, the predominantly amorphous part of cellulose is hydrolyzed in the first 7-10 hours. As the content of the substrate with increased reactivity decreases, the hydrolysis rate decreases, and the process goes into a “slow stage”. The reason for the decrease in activity is the inhibition by the products of hydrolysis of the stages in which enzymes are involved, indicated in the scheme as Eg, Ez, E4. If inhibition by reaction products at a degree of polysaccharide conversion of 15–40% makes a significant contribution to a decrease in the process rate, precipitate-free hydrolysates (option L) will have noticeably less activity on a fresh substrate compared to the initial activity (option 0).
Максимальную активность для варианта L, можно рассчитать из модельных экспериментов по сорбции компонентов комплекса на микрокристаллической целлюлозе. В модельных экспериментах измерена активность гидролизатов, полученных на микрокристаллической целлюлозе и бумаге. В первые 1-2 часа гидролиза в гидролизате найдено 25-30 % исходной активности, то есть значительная часть ферментативного комплекса адсорбирована субстратом. К 13 часам скорость гидролиза существенно упала, при этом конверсия субстрата составила порядка 10 %. По ходу гидролиза некоторая часть адсорбированных компонентов ферментативного комплекса перешла в раствор, в гидролизате при контакте со свежим субстратом определили примерно 40 % исходной активности.  The maximum activity for option L can be calculated from model experiments on the sorption of complex components on microcrystalline cellulose. In model experiments, the activity of hydrolysates obtained on microcrystalline cellulose and paper was measured. In the first 1-2 hours of hydrolysis, 25-30% of the initial activity was found in the hydrolyzate, that is, a significant part of the enzymatic complex is adsorbed by the substrate. By 13 o’clock, the hydrolysis rate dropped significantly, while the conversion of the substrate was about 10%. In the course of hydrolysis, some of the adsorbed components of the enzymatic complex went into solution; approximately 40% of the initial activity was determined in the hydrolyzate upon contact with a fresh substrate.
Гидролизаты биомассы, освобожденные от осадка, проявляли на свежем субстрате заметную активность. Отметим, что скорость гидролиза, измеренная по глюкозе перед отделением гидролизата, была равна нулю. Содержание полисахаридов в биомассе составляет около 65 %, с учетом приведенных выше данных можно ожидать, что в гидролизатах содержится примерно 40/0,65 = 61,5 % исходной активности. За исключением опытов 2 и 3, где отмечена инактивация компонентов комплекса катионами кальция, наблюдается хорошее согласие данных эксперимента с приведенными расчётами. Biomass hydrolysates, freed from sediment, showed noticeable activity on a fresh substrate. Note that the hydrolysis rate, measured by glucose before separation of the hydrolyzate, was zero. The polysaccharide content in the biomass is about 65%, taking into account the above data, it can be expected that the hydrolysates contain about 40 / 0.65 = 61.5% of the initial activity. With the exception of experiments 2 and 3, where inactivation of the complex components by cations was noted calcium, there is good agreement between the experimental data and the above calculations.
Полученные данные могут быть сведены к следующим утверждениям:  The data obtained can be reduced to the following statements:
• При достижении 14 % конверсии по глюкозе полисахаридов биомассы, что соответствует 30-40 % выходу растворимых углеводов, скорость гидролиза падает до нуля.  • Upon reaching 14% glucose conversion of biomass polysaccharides, which corresponds to 30-40% yield of soluble carbohydrates, the hydrolysis rate drops to zero.
• В гидролизатах сохраняется около 65 % исходной активности.  • About 65% of the initial activity is retained in hydrolysates.
• Реакционная способность субстрата падает более чем в два раза. При замене гидролизата свежим буфером конверсия субстрата существенно ниже расчетной, найденной исходя из количества фермента, оставшегося на субстрате.  • The reactivity of the substrate is more than halved. When replacing the hydrolyzate with fresh buffer, the substrate conversion is significantly lower than the calculated one, based on the amount of enzyme remaining on the substrate.
Таким образом, скорость гидролиза носит ступенчатый характер. Вплоть до достижения 30-40 % конверсия полисахаридов происходит быстро. После исчерпания доступной фазы, обладающей повышенной реакционной способностью процесс гидролиза идёт медленно.  Thus, the hydrolysis rate is stepwise. Until the achievement of 30-40%, the conversion of polysaccharides occurs rapidly. After the exhaustion of the available phase, with increased reactivity, the hydrolysis process is slow.
ПРИМЕР 4. Влияние индекса кристалличности на скорость гидролиза биомассы. EXAMPLE 4. The effect of crystallinity index on the rate of hydrolysis of biomass.
Чем ниже степень (индекс) кристалличности (выше содержание аморфной части), тем выше скорость гидролиза. На Ошибка! Источник ссылки не найден, приводится зависимость индекса кристалличности (ИК) содержащейся в биомассе целлюлозы от времени механической активации. Для активации использована вибромельница, которая обеспечивает измельчение материала в ударно-сдвиговом режиме. The lower the degree (index) of crystallinity (the higher the content of the amorphous part), the higher the rate of hydrolysis. To Error! No reference source found, the dependence of the crystallinity index (IR) of cellulose contained in biomass on the time of mechanical activation is given. For activation, a vibration mill is used, which provides grinding of the material in the shock-shear mode.
Установлено, что эффективное использование механической энергии возможно лишь в первые 40 минут активации, что соответствует снижению ИК с 70 до 33 %. Затем скорость аморфизации существенно падает, и в течение последующих 80-ти минут ИК снижается с 33 % лишь до 25 %. Снижение ИК с 70 до 55 % приводит к увеличению средней скорости гидролиза по глюкозе в 2,25 раза, последующее снижение ИК с 55 % до 33 % лишь в 1,15 раза (Ошибка! Источник ссылки не найден.)- Суммарные выходы растворимых продуктов гидролиза увеличиваются в 2 и 1 ,25 раза, соответственно. Таким образом, с точки зрения выхода целевого продукта первоначальное снижение кристалличности на 15 % оказывается в 2 раза эффективнее последующего снижения ИК на 20 %.  It was found that the effective use of mechanical energy is possible only in the first 40 minutes of activation, which corresponds to a decrease in IR from 70 to 33%. Then the amorphization rate drops significantly, and over the next 80 minutes, the IR decreases from 33% to only 25%. A decrease in IR from 70 to 55% leads to an increase in the average glucose hydrolysis rate by 2.25 times, a subsequent decrease in IR from 55% to 33% only 1.15 times (Error! Source of link not found.) - Total yields of soluble products hydrolysis increase 2 and 1, 25 times, respectively. Thus, from the point of view of the yield of the target product, an initial decrease in crystallinity of 15% is 2 times more effective than a subsequent decrease in IR by 20%.
При гидролизе накапливается глюкоза, концентрация целлобиозы выходит на псевдостационарный уровень. Классический вид кривых зависимости концентрации этих продуктов от времени приведен на Ошибка! Источник ссылки не найден.. С увеличением общего выхода отношение глюкоза / целлобиоза возрастает (при заметных степенях превращения после точки равенства концентраций целлобиозы и глюкозы). Такой результат достигается при гидролизе бумаги и любого растительного сырья, в том числе гроздей масличной пальмы. Однако на Ошибка! Источник ссылки не найден, можно видеть обратную картину - с увеличением выхода растворимых продуктов, отношение глюкоза / целлобиоза падает, то есть вместе с выходом растет стационарная концентрация целлобиозы. Различному ходу гидролиза не активированной и активированной биомассы можно дать следующее объяснение. During hydrolysis, glucose accumulates, the concentration of cellobiose reaches a pseudostationary level. The classical form of the curves of the dependence of the concentration of these products on time is given in Error! Link source not found .. C by increasing the total yield, the glucose / cellobiosis ratio increases (with noticeable degrees of conversion after the point of equal concentrations of cellobiose and glucose). This result is achieved by hydrolysis of paper and any plant material, including clusters of oil palm. However on Error! The source of the link was not found, you can see the opposite picture - with an increase in the yield of soluble products, the glucose / cellobiosis ratio decreases, that is, along with the yield, the stationary concentration of cellobiose increases. The following explanation can be given to the different course of hydrolysis of unactivated and activated biomass.
Для неактивированных субстратов с высокой степенью кристалличности, более 70 %, ферментативный гидролиз будет лимитироваться гетерогенной стадией в широком диапазоне концентрации ферментативного комплекса. Вплоть до глубоких степеней превращения концентрация промежуточного продукта целлобиозы будет оставаться псевдостационарной. Эта концентрация будет тем ниже, чем выше концентрация ферментативного комплекса. Суммарная скорость процесса, по выходу растворимых продуктов, лишь незначительно увеличивается при повышении концентрации ферментативного комплекса (в первом приближении пропорционально произведению константы скорости на концентрацию ферментативного комплекса ki x[S]x[Ei], где ki - некоторая эффективная константа, отражающая реакционную способность субстрата, [S] - поверхность субстрата, [Ei] - концентрация ферментов гетерогенной стадии, пропорциональна концентрации ферментативного комплекса. For non-activated substrates with a high degree of crystallinity, more than 70%, enzymatic hydrolysis will be limited by the heterogeneous stage in a wide concentration range of the enzymatic complex. Up to deep degrees of conversion, the concentration of the intermediate cellobiose product will remain pseudostationary. This concentration will be the lower, the higher the concentration of the enzymatic complex. The total speed of the process, according to the yield of soluble products, only slightly increases with increasing concentration of the enzymatic complex (in the first approximation, it is proportional to the product of the rate constant by the concentration of the enzymatic complex ki x [S] x [Ei], where ki is some effective constant reflecting the reactivity of the substrate , [S] is the surface of the substrate, [Ei] is the concentration of enzymes of the heterogeneous stage, proportional to the concentration of the enzymatic complex.
Гидролиз активированных субстратов, лимитируется гомогенной стадией, что создает условия для накопления в растворе промежуточного продукта целлобиозы. Для активированных субстратов гидролиз может протекать в трех режимах.  The hydrolysis of activated substrates is limited by a homogeneous stage, which creates the conditions for the accumulation of an intermediate cellobiose product in a solution. For activated substrates, hydrolysis can proceed in three modes.
1. Гидролиз субстрата с очень высокой реакционной способностью протекает в условиях недостаточной концентрации ферментативного комплекса, тогда можно ожидать, что процесс в целом будет лимитироваться гомогенной стадией k] X[S] x[E|] > k2 x[E2], k| - велико, k2 - некоторая эффективная константа гидролиза промежуточных продуктов, [Е2] - концентрация ферментов гомогенной стадии, пропорциональна концентрации ферментативного комплекса. Для этого случая гидролиз протекает в условиях заметного избытка активного субстрата по отношению эндоглюканазам, ферментам гетерогенной стадии, и недостатка ферментов гомогенной стадии. В растворе продолжительное время будет сохраняться возрастающая концентрация целлобиозы, превышающая в несколько раз концентрацию глюкозы. 2. Повышение концентрации ферментативного комплекса приведет к увеличению скоростей обеих стадий, как гетерогенной, так и гомогенной, следовательно, и скорости процесса в целом. Относительно высоким степеням превращения будет соответствовать псевдостационарная концентрация целлобиозы, меньшая в 1,5-2 раза концентрации глюкозы. Примечательно, что увеличение скорости образования глюкозы достигается с одной стороны за счет повышения скорости гомогенного гидролиза целлобиозы ферментами Е3. С другой стороны повышение концентрации ферментативного комплекса, приводит к увеличению концентрации экзоглюкозидаз, способных гидролизовать аморфный субстрат и олигосахариды. Увеличение реакционной способности субстрата повышает значение этого шунтирующего пути (см. Ошибка! Источник ссылки не найден.), как следствие сокращается период выхода скорости образования глюкозы на стационарный уровень. Точка равенства концентраций целлобиозы и глюкозы, отмечена на Ошибка! Источник ссылки не найден, стрелкой, перемещается в область меньших времен. При этом в начале гидролиза концентрация глюкозы лишь незначительно меньше концентрации целлобиозы, что не характерно для исходных кристаллических субстратов. В целом процесс будет лимитироваться по-прежнему гомогенной стадией, о чем свидетельствует относительно низкое отношение глюкоза / целлобиоза. когда концентрация последней достигает псевдостационарного уровня. 1. The hydrolysis of the substrate with a very high reactivity proceeds in conditions of insufficient concentration of the enzymatic complex, then it can be expected that the process as a whole will be limited by the homogeneous stage k] X [S] x [E |]> k 2 x [E 2 ], k | is large, k 2 is some effective constant for the hydrolysis of intermediate products, [E 2 ] is the concentration of enzymes of the homogeneous stage, proportional to the concentration of the enzymatic complex. For this case, hydrolysis proceeds under conditions of a noticeable excess of the active substrate with respect to endoglucanases, enzymes of the heterogeneous stage, and a lack of enzymes of the homogeneous stage. In the solution, an increasing concentration of cellobiose, which will be several times higher than the concentration of glucose, will remain for a long time. 2. An increase in the concentration of the enzymatic complex will lead to an increase in the rates of both stages, both heterogeneous and homogeneous, and consequently, the speed of the process as a whole. Relatively high degrees of conversion will correspond to a pseudostationary concentration of cellobiose, which is 1.5-2 times lower than the concentration of glucose. It is noteworthy that an increase in the rate of glucose formation is achieved on the one hand by increasing the rate of homogeneous hydrolysis of cellobiose with E 3 enzymes. On the other hand, an increase in the concentration of the enzymatic complex leads to an increase in the concentration of exoglucosidases capable of hydrolyzing the amorphous substrate and oligosaccharides. An increase in the reactivity of the substrate increases the value of this shunting pathway (see Error! The source of the link was not found.), As a result, the period of the glucose formation rate reaching a stationary level is reduced. The point of equal concentrations of cellobiose and glucose is marked on Error! The source of the link was not found, the arrow moves to the area of smaller times. At the same time, at the beginning of hydrolysis, the glucose concentration is only slightly lower than the concentration of cellobiose, which is not characteristic of the initial crystalline substrates. In general, the process will still be limited by the homogeneous stage, as evidenced by the relatively low glucose / cellobiosis ratio. when the concentration of the latter reaches a pseudostationary level.
Уровень псевдостационарной концентрации целлобиозы определяется отношением эффективной скорости гетерогенной стадии ki ><[S]x[Ei] гидролиза аморфной части субстрата к эффективной скорости гомогенной стадии к2х[Е2]. В случае субстратов с высокой степенью кристалличности в расчет принимается скорость гетерогенной стадии гидролиза кристаллического субстрата, которая очевидна будет значительно ниже скорости гидролиза аморфной части, поэтому для активированных субстратов отношение глюкоза / целлобиоза всегда ниже. The level of the pseudostationary concentration of cellobiose is determined by the ratio of the effective rate of the heterogeneous stage ki><[S] x [Ei] of the hydrolysis of the amorphous part of the substrate to the effective rate of the homogeneous stage to 2 x [E 2 ]. In the case of substrates with a high degree of crystallinity, the rate of the heterogeneous stage of hydrolysis of the crystalline substrate is taken into account, which will be obvious much lower than the rate of hydrolysis of the amorphous part, therefore, for activated substrates, the glucose / cellobiosis ratio is always lower.
3. При достижении определенного предела концентрации ферментативного комплекса процесс будет лимитироваться гетерогенной стадией k| X[S]x[Ei] < к2 х2]. Тогда ход кривых накопления промежуточного продукта будет напоминать классический случай, с той лишь разницей, что на начальных этапах гидролиза концентрации глюкозы и целлобиозы будут сопоставимы. Дальнейшее повышение концентрации ферментативного не оказывает существенного влияния на суммарную скорость процесса и сопровождается увеличением отношения глюкоза / целлобиоза. 3. Upon reaching a certain concentration limit of the enzymatic complex, the process will be limited by the heterogeneous stage k | X [S] x [Ei] <k 2 x [E 2 ]. Then, the course of the curves of the accumulation of the intermediate product will resemble the classical case, with the only difference being that at the initial stages of hydrolysis, glucose and cellobiose concentrations will be comparable. A further increase in the concentration of the enzymatic does not significantly affect the total speed of the process and is accompanied by an increase in the glucose / cellobiosis ratio.
Приведенные выше рассуждения можно свести к следующим технологически важным выводам: От начала процесса вплоть до глубоких степеней превращения гидролиз эффективно активированного субстрата отличается от гидролиза субстрата с низким содержанием аморфной фазы отношением концентрации промежуточных продуктов (целлобиозы) к концентрации конечного продукта (глюкозы). Для активированных субстратов характерно более низкое отношение глюкоза / целлобиоза при достижении стационарной концентрации целлобиозы. Гидролиз активированных субстратов на начальных этапах характеризуется повышенным выходом глюкозы. The above reasoning can be reduced to the following technologically important conclusions: From the beginning of the process to the deep degrees of conversion, the hydrolysis of an effectively activated substrate differs from the hydrolysis of a substrate with a low content of amorphous phase in the ratio of the concentration of intermediate products (cellobiose) to the concentration of the final product (glucose). Activated substrates are characterized by a lower glucose / cellobiosis ratio when a stationary concentration of cellobiose is reached. The hydrolysis of activated substrates in the initial stages is characterized by an increased yield of glucose.
Повышение концентрации ферментативного комплекса в случае активированных субстратов приводит к заметному росту суммарной скорости процесса вплоть до насыщения субстрата эндоглюканазами.  An increase in the concentration of the enzymatic complex in the case of activated substrates leads to a noticeable increase in the total process rate up to saturation of the substrate with endoglucanases.
Представляется целесообразным повышать концентрацию ферментативного комплекса до предельного значения, которое определяется областью линейной зависимости общей скорости процесса от концентрации ферментативного комплекса (до насыщения субстрата эндоглюканазами).  It seems appropriate to increase the concentration of the enzymatic complex to a limiting value, which is determined by the region of the linear dependence of the total process rate on the concentration of the enzymatic complex (until the substrate is saturated with endoglucanases).
Дополнительные затраты, обусловленные повышением нормы расхода ферментативного комплекса должны быть компенсированы путем регенерации ферментов или повторного использования гидролизатов для осахаривания свежих субстратов. В этом случае гидролизаты с высоким содержанием растворимых углеводов, необходимым для эффективного проведения брожения, могут быть получены с максимальной скоростью.  Additional costs due to an increase in the rate of consumption of the enzymatic complex should be compensated by regeneration of the enzymes or reuse of hydrolysates for saccharification of fresh substrates. In this case, hydrolysates with a high soluble carbohydrate content necessary for efficient fermentation can be obtained at maximum speed.
При прочих равных условиях длительность и интенсивной механической активации сырья определяется отношением затраченной энергии к выходу растворимых углеводов. Это положение проиллюстрировано на Ошибка! Источник ссылки не найден, и Ошибка! Источник ссылки не найден., из которых следует, что на начальных этапах механическая активация протекает с наибольшей эффективностью.  Other things being equal, the duration and intense mechanical activation of the feed is determined by the ratio of the energy expended to the yield of soluble carbohydrates. This position is illustrated by Error! Link source not found, and Error! The source of the link was not found., From which it follows that at the initial stages mechanical activation proceeds with the greatest efficiency.
ПРИМЕР 5. Повышение эффективности гидролиза биомассы.  EXAMPLE 5. Increasing the efficiency of biomass hydrolysis.
На Ошибка! Источник ссылки не найден, приведены зависимости выхода растворимых углеводов от времени гидролиза для двух образцов механически активированных отходов пальмы. Видно, что скорости гидролиза для этих образцов различаются в семь раз. Значительного увеличения выхода растворимых углеводов удалось достигнуть благодаря сочетанию следующих приемов.  To Error! No reference source found, the dependences of the yield of soluble carbohydrates on the hydrolysis time for two samples of mechanically activated palm wastes are given. It can be seen that the hydrolysis rates for these samples differ by a factor of seven. A significant increase in the yield of soluble carbohydrates was achieved due to a combination of the following techniques.
Удаление балластных веществ. Предварительная ферментативная обработка. Исходное сырье отходов масличной пальмы с трудом поддается механическому измельчению в ударно-сдвиговом режиме, даже в присутствии абразивного материала. В ходе группового анализа сырья показано, что образцы характеризуются заметным остаточным содержанием масла. Наличие в образцах веществ, способных понижать коэффициенты трения мелющих тел о стенки реактора мельниц, приводит к нарушению ударно-сдвигового режима. В ряде случаев наблюдается проскальзывание рабочих тел, в результате чего резко падает механическая нагрузка на измельчаемый материал. Ballast removal. Preliminary enzymatic treatment. Oil palm waste feedstock is difficult to mechanically grind in shock-shear mode, even in the presence of abrasive material. In the course of a group analysis of raw materials, it was shown that the samples are characterized by a noticeable residual oil content. The presence in the samples of substances capable of lowering the friction coefficients of grinding media on the walls of the mill reactor leads to a violation of the shock-shear regime. In some cases, slippage of the working fluid is observed, as a result of which the mechanical load on the material to be ground sharply decreases.
Для повышения эффективности механической активации в ударно-сдвиговом режиме предложено проводить предварительную отмывку сырья от липидов. При использовании на стадии отмывки комбинированных составов можно снизить негативное влияние водорастворимых веществ на активность ферментативного комплекса. В качестве таких составов использованы водные растворы, содержащие ПАВ и незначительные количества смеси ферментативных комплексов.  To increase the efficiency of mechanical activation in shock-shear mode, it was proposed to carry out preliminary washing of the raw material from lipids. When using combined compositions at the washing stage, the negative effect of water-soluble substances on the activity of the enzymatic complex can be reduced. As such compositions, aqueous solutions containing surfactants and small amounts of a mixture of enzymatic complexes were used.
Сырье предварительно подвергли обработке горячей водой с последующим отжимом на прессе. На этой стадии удаляли значительную часть водорастворимых веществ и липидов, то есть компонентов, существенно снижающих эффективность механической активации.  The raw materials were preliminarily subjected to treatment with hot water, followed by pressing in a press. At this stage, a significant portion of water-soluble substances and lipids, that is, components that significantly reduce the effectiveness of mechanical activation, were removed.
Окончательное удаление липидов, водорастворимого лигнина, а также значительной части биогенного кремния достигали следующим образом. Полученный путем обработки горячей водой на прессе полупродукт измельчали до размера частиц 0,04-2 мм, обрабатывали слабым раствором целлюлозолитического комплекса в присутствии поверхностно-активного вещества. Благодаря этому произошло частичное разрушение надмолекулярных структур, образованных полисахаридами и лигнином, снизилась механическая прочность сырья, и оно стало пригодным для механической активации в режиме стесненного удара.  The final removal of lipids, water-soluble lignin, as well as a significant part of nutrient silicon was achieved as follows. The intermediate obtained by processing with hot water on a press was crushed to a particle size of 0.04–2 mm, treated with a weak solution of a cellulolytic complex in the presence of a surfactant. Due to this, partial destruction of the supramolecular structures formed by polysaccharides and lignin occurred, the mechanical strength of the raw material decreased, and it became suitable for mechanical activation in the mode of constrained shock.
Полученный полупродукт подвергли механической активации в режиме стесненного удара с последующей экстракцией горячей водой. Выход тонкой фракции (менее 50 мкм) был увеличен с 10 до 80 %.  The obtained intermediate was subjected to mechanical activation in the mode of constrained shock, followed by extraction with hot water. The yield of the fine fraction (less than 50 μm) was increased from 10 to 80%.
Использование смеси ферментативных препаратов. За счет разбавления целлюлозолитического комплекса дешевыми ферментными препаратами, которые используются для осахаривания крахмалистого сырья, можно снизить производственные затраты на этой стадии.  Using a mixture of enzyme preparations. By diluting the cellulolytic complex with cheap enzyme preparations that are used to saccharify starchy raw materials, production costs at this stage can be reduced.
На Ошибка! Источник ссылки не найден, представлено действие ферментативных препаратов на отходы масличной пальмы. Исследовано действие индивидуальных ферментативных комплексов, а именно Целлюлолюкса (CLL, используется для гидролиза целлюлозы и ксиланов), Амилолюкса (AML, для предварительного осахаривания крахмала), смеси Целлолюкса и Амилолюкса. Видно, что разбавление целлюлозолитического комплекса Амилолюксом повышает выход растворимых углеводов. Таким образом, на стадии предварительной отмывки и предварительной ферментативной обработки, могут быть использованы более доступные смеси препаратов без потери эффективности. To Error! The source of the link was not found; the effect of enzymatic preparations on oil palm wastes is presented. The effect of individual enzymatic complexes was studied, namely Cellulux (CLL, used for the hydrolysis of cellulose and xylans), Amylolux (AML, for preliminary saccharification of starch), a mixture of Cellolux and Amilolux. It is seen that dilution Amyloluxom cellulolytic complex increases the yield of soluble carbohydrates. Thus, at the stage of preliminary washing and preliminary enzymatic treatment, more accessible mixtures of preparations can be used without loss of effectiveness.
Повторное использование гидролизатов при ферментативном гидролизе механически активированного сырья. Выше мы показали, что максимальная скорость ферментативного гидролиза аморфизованного субстрата достигается при насыщении субстрата эндоглюканазами. Проведение гидролиза в условиях повышенной концентрации ферментативного комплекса требует регенерации ферментов либо повторного использования гидролизатов.  Reuse of hydrolysates in the enzymatic hydrolysis of mechanically activated raw materials. We have shown above that the maximum rate of enzymatic hydrolysis of an amorphized substrate is achieved when the substrate is saturated with endoglucanases. Hydrolysis under conditions of increased concentration of the enzymatic complex requires the regeneration of enzymes or the reuse of hydrolysates.
Предложено проводить гидролиз в серии последовательных реакторов. Схема гидролиза предусматривает пребывание субстрата в каждом реакторе в течение нескольких часов и последующий перенос субстрата и гидролиза в соседние реакторы в режиме противотока, так как это показано на Ошибка! Источник ссылки не найден.. Согласно представленной схеме в первый реактор поступает свежий субстрат, полученный путем механической активации лигноцеллюлозного сырья. Субстрат контактирует с гидролизатом, поступившим из реактора 2. В последний реактор поступает субстрат, который уже не содержит аморфной целлюлозы и других легкогидролизуемых ферментами полисахаридов, данный субстрат подвергается воздействию свежего раствора ферментативного комплекса.  It is proposed to carry out hydrolysis in a series of series reactors. The hydrolysis scheme provides for the residence of the substrate in each reactor for several hours and the subsequent transfer of the substrate and hydrolysis to adjacent reactors in countercurrent mode, as shown in Error! No reference source was found .. According to the presented scheme, a fresh substrate obtained by mechanical activation of lignocellulosic raw materials enters the first reactor. The substrate is in contact with the hydrolyzate received from reactor 2. The last reactor receives a substrate that no longer contains amorphous cellulose and other polysaccharides that are readily hydrolyzed by enzymes; this substrate is exposed to a fresh solution of the enzymatic complex.
Преимуществом такого подхода является получение концентрированных гидролизатов, пригодных для процесса последующего осахаривания и совместного сбраживания (SSCF, в англоязычной литературе). Обычно гидролиз полисахаридов ведут до получения смеси мономеров и олигомеров, концентрированную смесь затем направляют в SSCF-процесс, в котором за счет ферментов осуществляется окончательный гидролиз олигомеров до мономеров и микробиологическое сбраживание последних в этанол. В SSCF-процесс обычно используют низкие концентрации ферментов, поэтому теоретически возможно ингибирование мономерами гидролиза олигомеров. Однако наличие микроорганизмов, сбраживающих мономеры до этанола, снимает ингибирующий эффект мономеров. Концентрированные гидролизаты, содержащие остаточные количества ферментов в большинстве случаев являются подходящим субстратом для SSCF-процесса.  The advantage of this approach is to obtain concentrated hydrolysates suitable for the process of subsequent saccharification and co-fermentation (SSCF, in the English literature). Usually, the hydrolysis of polysaccharides is carried out to obtain a mixture of monomers and oligomers, the concentrated mixture is then sent to the SSCF process, in which the final hydrolysis of the oligomers to monomers and microbiological fermentation of the latter into ethanol are carried out by enzymes. Low concentrations of enzymes are usually used in the SSCF process, so it is theoretically possible for monomers to inhibit the hydrolysis of oligomers. However, the presence of microorganisms fermenting monomers to ethanol removes the inhibitory effect of monomers. Concentrated hydrolysates containing residual amounts of enzymes are in most cases a suitable substrate for the SSCF process.
В режиме противотока избыточная сорбция эндоглюканаз при контакте свежего раствора ферментов с субстратом (реактор 10, Ошибка! Источник ссылки не найден.) исключается, поскольку поступающий в реактор 10 субстрат, практически не содержит аморфной фазы. Здесь пульпа субстрата промывается раствором ферментов, что позволяет направить остаточные количества растворимых углеводов в сторону SSCF-процесса. Поскольку субстрат подвергается действию свежего раствора ферментов, достигается наиболее эффективная подготовка его кристаллической части к последующей механической активации. In counterflow mode, excessive sorption of endoglucanases upon contact of a fresh enzyme solution with a substrate (reactor 10, Error! Source of link not found.) It is excluded, since the substrate entering the reactor 10 practically does not contain an amorphous phase. Here, the pulp of the substrate is washed with an enzyme solution, which allows us to direct the residual amounts of soluble carbohydrates towards the SSCF process. Since the substrate is exposed to the action of a fresh enzyme solution, the most efficient preparation of its crystalline part for subsequent mechanical activation is achieved.
В средней части процесса (Ошибка! Источник ссылки не найден.) концентрируется большая часть эндоглюканаз, ферментов ответственных за гетерогенный гидрол полисахаридов. Такое распределение ферментов гетерогенной стадии является оптимальным.  In the middle part of the process (Error! The source of the link was not found.) Most of the endoglucanases, the enzymes responsible for the heterogeneous hydrolysis of polysaccharides, are concentrated. This distribution of enzymes of the heterogeneous stage is optimal.
В левой части процесса (Ошибка! Источник ссылки не найден.), ближе SSCF- части, концентрируются ферменты гомогенной стадии гидролиза, а также компоненты ферментативного комплекса, обладающие слабыми сорбционными свойствами, однако способные эффективно гидролизовать аморфный субстрат (экзоглюкозидазы). Поступающий в первый реактор субстрат сначала подвергается действию таких ферментов, затем, по мере продвижения твердого остатка вправо, за счет действия свежих порций ферментов достигается эффективное расщепление аморфной части.  On the left side of the process (Error! Source of link not found.), Closer to the SSCF part, the enzymes of the homogeneous hydrolysis stage are concentrated, as well as the components of the enzymatic complex, which have weak sorption properties, but are able to efficiently hydrolyze the amorphous substrate (exoglucosidase). The substrate entering the first reactor is first exposed to such enzymes, then, as the solid residue moves to the right, effective cleavage of the amorphous part is achieved due to the action of fresh portions of enzymes.
Подобная схема имеет ряд дополнительных преимуществ. Например, она позволяет выбирать для различных стадий процесса оптимальные температурные режимы. Появляется возможность дополнительного регулирования таких параметров, как рН, ионная сила, интенсивность перемешивания, то есть создавать условия, обеспечивающие максимальную устойчивость ферментативного комплекса. Благодаря этому возникает возможность контролировать степень адсорбции ферментов, регулировать степень участия компонентов ферментативного комплекса на стадиях процесса.  Such a scheme has several additional advantages. For example, it allows you to choose optimal temperature conditions for various stages of the process. There is the possibility of additional regulation of parameters such as pH, ionic strength, mixing intensity, that is, to create conditions that ensure maximum stability of the enzymatic complex. This makes it possible to control the degree of adsorption of enzymes, to regulate the degree of participation of the components of the enzymatic complex at the stages of the process.
На Ошибка! Источник ссылки не найден, приводятся данные, демонстрирующие повторное использование гидролизатов для ферментативного осахаривания свежего субстрата. Эксперимент проводился с биомассой механически активированной в ударно- сдвиговом режиме с добавкой хлористого кальция.  To Error! No reference source found, data showing the reuse of hydrolysates for the enzymatic saccharification of a fresh substrate are provided. The experiment was carried out with biomass mechanically activated in the shock-shear regime with the addition of calcium chloride.
На диаграмме слева приводятся результаты повторного использования гидролизата. После пяти часов гидролиза твердый остаток центрифугировали, гидролизат переносили на свежий субстрат, гидромодуль доводили до исходного значения добавлением буфера (на графике отмечено 1 -> 2). Таким образом с помощью одной порции гидролизата, полученного в первом реакторе, было последовательно обработано еще три реактора. В итоге была достигнута степень превращения по глюкозе более 15 %, общая концентрация Сахаров в итоговом гидролизате соответствовала 40 % конверсии полисахаридов сырья. При гидромодуле 10 данная величина составляет порядка 30 мг/мл. The diagram on the left shows the reuse of the hydrolyzate. After five hours of hydrolysis, the solid residue was centrifuged, the hydrolyzate was transferred to a fresh substrate, the hydromodule was adjusted to its initial value by adding a buffer (1 -> 2 on the graph). Thus, using one portion of the hydrolyzate obtained in the first reactor, three more reactors were sequentially processed. AT as a result, the degree of conversion of glucose to more than 15% was achieved, the total concentration of Sugars in the final hydrolyzate corresponded to 40% of the conversion of raw polysaccharides. With a hydraulic module 10, this value is about 30 mg / ml.
В реакторах 2-4 отмечено замедление процесса по сравнению с реактором 1. Данное обстоятельство объясняется присутствием в системе кальция, который концентрируется при переносе гидролизата из одного реактора в другой. Инактивация ферментов была частично компенсирована добавлением свежих порций ферментатвиного комплекса (отмечено красными точками). Наблюдалось увеличение скорости гидролиза в первые часы после добавления комплекса.  In reactors 2-4, a slowdown of the process was noted compared with reactor 1. This circumstance is explained by the presence of calcium in the system, which is concentrated when the hydrolyzate is transferred from one reactor to another. Enzyme inactivation was partially offset by the addition of fresh portions of the enzyme-twin complex (marked with red dots). An increase in the rate of hydrolysis was observed in the first hours after the addition of the complex.
На диаграмме также приведены результаты по выходу глюкозы в процессе гидролиза сырья под действием остаточного количества ферментов. К отделенному осадку реактора 1 добавляли свежий буфер до гидромодуля 10. После пяти часов раствор отделяли и переносили в реактор 2, из которого центрифугированием удалили концентрированный гидролизат. Видно, что скорость гидролиза сохраняется постоянной при переносе разбавленных гидролизатов на субстрат подвергнутый ферментативной обработке.  The diagram also shows the results of glucose output during the hydrolysis of raw materials under the influence of the residual amount of enzymes. Fresh buffer was added to the separated precipitate of reactor 1 to the hydromodule 10. After five hours, the solution was separated and transferred to reactor 2, from which the concentrated hydrolyzate was removed by centrifugation. It can be seen that the rate of hydrolysis remains constant when transferring diluted hydrolysates to a substrate subjected to enzymatic treatment.
Таким образом, показана эффективность повторного использования гидролизатов для обработки свежей партии субстрата. Данный подход использован для получения пригодных для SSCF-процесса концентрированных растворов углеводов из механически активрованных отходов масличной пальмы. Повторное использование гидролизатов может осуществлятся в серии последовательно установленных реакторов, оптимальным является режим противотока.  Thus, the efficiency of the reuse of hydrolysates for processing a fresh batch of substrate is shown. This approach was used to prepare concentrated carbohydrate solutions suitable for the SSCF process from mechanically activated oil palm wastes. Reuse of hydrolysates can be carried out in a series of reactors installed in series, the counterflow regime is optimal.
ПРИМЕР 6. Ступенчатое повышение реакционной способности полисахаридов сырья путем чередования механической активации и ферментативного гидролиза.  EXAMPLE 6. Stepwise increase in the reactivity of raw polysaccharides by alternating mechanical activation and enzymatic hydrolysis.
В модельных экспериментах показано, что с точки зрения затрат энергии, исчерпывающая механическая аморфизация субстрата не представляется целесообразной. После достижения некоторого порогового значения индекса кристалличности последующее увеличение количества аморфной фазы требует неприемлемо длительных времен обработки. Кроме того, увеличение количества аморфной фазы после этого порогового значения ИК приводит к меньшим увеличениям скорости гидролиза (Ошибка! Источник ссылки не найден.).  In model experiments, it was shown that from the point of view of energy consumption, exhaustive mechanical amorphization of the substrate does not seem appropriate. After reaching a certain threshold crystallinity index, a subsequent increase in the amount of the amorphous phase requires unacceptably long processing times. In addition, an increase in the amount of the amorphous phase after this IR threshold value leads to smaller increases in the hydrolysis rate (Error! Link source not found.).
Наиболее эффективным является подход, в котором частично аморфизованное сырье, до порогового значения ИК, подвергается ферментативной обработке в режиме последовательного переноса гидролизата на свежий субстрат. Затем сырье подвергается повторной механической активации и ферментативному гидролизу. Механической активации может подвергаться как высушенный твердый остаток, так и пульпа. Ниже приводятся иллюстрация успешного применения таких обработок. The most effective approach is that in which partially amorphized raw materials, up to a threshold IR value, are subjected to enzymatic treatment in the mode of sequential transfer of the hydrolyzate to a fresh substrate. Then the raw material is exposed re-mechanical activation and enzymatic hydrolysis. Both the dried solid residue and the pulp can undergo mechanical activation. The following are illustrations of the successful application of such treatments.
Твердые остатки, полученные путем механической обработки исходного сырья и последующего ферментативного гидролиза, подвергли мацерации - действию ферментативного комплекса, способного гидролизовать пектиновые вещества. Известно, что пектины придают тканям растений дополнительную прочность, поскольку обеспечивают «сцепление» клеточных стенок. Гидролиз пектинов позволяет разрушать ткани растений вплоть до отдельных клеток. После такой обработки твердые остатки высушили и подвергли механической активации в ударно-сдвиговом режиме.  The solid residues obtained by mechanical processing of the feedstock and subsequent enzymatic hydrolysis were subjected to maceration, an enzymatic complex capable of hydrolyzing pectin substances. It is known that pectins give plant tissues additional strength, since they provide “adhesion” of cell walls. Hydrolysis of pectins allows the destruction of plant tissue up to individual cells. After this treatment, the solid residues were dried and subjected to mechanical activation in shock-shear mode.
Результаты последующего ферментативного гидролиза приведены на Ошибка! Источник ссылки не найден.. Диаграмма слева соответствует гидролизу в условиях низкой концентрации ферментативного комплекса. В системе устанавливается относительно высокая концентрация целлобиозы, за 38 часов достигается выход по растворимым углеводам 29,5 %, общая конверсия с учетом первой стадии составляет 53 %.  The results of subsequent enzymatic hydrolysis are shown in Error! No reference source found. The diagram on the left corresponds to hydrolysis under conditions of a low concentration of the enzymatic complex. A relatively high concentration of cellobiose is established in the system, a soluble carbohydrate yield of 29.5% is achieved in 38 hours, the total conversion, taking into account the first stage, is 53%.
При увеличении концентрации ферментативного комплекса до 5 мг/мл скорость гидролиза возрастает на начальных этапах в два раза, то есть не пропорционально концентрации ферментов (Ошибка! Источник ссылки не найден.). Это говорит о том, что данная концентрация ферментативного комплекса является избыточной, а в системе наступило насыщение по эндоглюканазам. Стоит отметить, что гидролиз по-прежнему протекает в условиях высокой скорости гетерогенной стадии, благодаря чему к 6 часам в системе достигается значительная концентрация промежуточного продукта. После 6-7 часов концентрация целлобиозы падает, что свидетельствует об уменьшении скорости гетерогенной стадии. Данное падение обусловлено уменьшением содержания аморфной фазы, и свидетельствует о необходимости повторной механической активации.  With an increase in the concentration of the enzymatic complex to 5 mg / ml, the hydrolysis rate doubles at the initial stages, that is, is not proportional to the concentration of enzymes (Error! Link source was not found.). This suggests that this concentration of the enzymatic complex is excessive, and endoglucanases are saturated in the system. It is worth noting that hydrolysis still proceeds under conditions of a high speed heterogeneous stage, due to which a significant concentration of the intermediate product is reached in the system by 6 hours. After 6-7 hours, the concentration of cellobiose decreases, which indicates a decrease in the speed of the heterogeneous stage. This drop is due to a decrease in the content of the amorphous phase, and indicates the need for repeated mechanical activation.
Выход на данной стадии достигает 49 %, суммарная конверсия 66 %. Конверсия гемицеллюлоз, состоящих преимущественно из ксиланов, составляет 95 %. Полученные гидролизаты пригодны для повторной обработки свежих партий субстрата. Последующая механическая активация твердого остатка и его ферментативный гидролиз позволяют достигнуть за 20 часов 90 % конверсии углеводов от общего содержания полисахаридов.  The yield at this stage reaches 49%, the total conversion of 66%. The conversion of hemicelluloses, consisting mainly of xylans, is 95%. The resulting hydrolysates are suitable for reprocessing fresh batches of substrate. Subsequent mechanical activation of the solid residue and its enzymatic hydrolysis make it possible to achieve 90% carbohydrate conversion of the total polysaccharide content in 20 hours.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ CLAIM
1. Способ подготовки отходов переработки масличной пальмы к ферментативному гидролизу, позволяющий ускорить ферментативный гидролиз полисахаридов в растворимые углеводы, предназначенный для получения растворов углеводов с целью конверсии последних в этанол или другие продукты микробиологического синтеза осахариванием и совместным сбраживанием и включающий стадии:  1. A method of preparing waste oil palm processing for enzymatic hydrolysis, which allows to accelerate the enzymatic hydrolysis of polysaccharides into soluble carbohydrates, intended for the production of carbohydrate solutions for the conversion of the latter into ethanol or other products of microbiological synthesis by saccharification and co-fermentation, and includes stages:
a. Удаление более 80 %, содержащихся в сырье липидов и водорастворимых веществ, путем обработки сырья горячей водой с последующим отжимом на прессе,  a. Removing more than 80% of the lipids and water-soluble substances contained in the feed by treating the feed with hot water, followed by pressing in a press,
b. Снижение механической прочности сырья, которое достигается путем удаления остаточных липидов и частичного разрушения надмолекулярных структур за счет измельчения сырья до размера частиц 0,04-2 мм, обработки слабым раствором ферментативного комплекса в присутствии поверхностно-активного вещества, c. Исчерпывающую экстракцию водорастворимых компонентов, удаление большей части биогенного кремния, путем механической активации в режиме стесненного удара с последующей экстракцией горячей водой.  b. The decrease in the mechanical strength of the raw material, which is achieved by removing residual lipids and partial destruction of the supramolecular structures by grinding the raw material to a particle size of 0.04-2 mm, processing with a weak solution of the enzymatic complex in the presence of a surfactant, c. Exhaustive extraction of water-soluble components, removal of most of the biogenic silicon, by mechanical activation in the mode of constrained shock, followed by extraction with hot water.
d. Осахаривание сырья путем чередования механической активации твердого остатка и ферментативного гидролиза с помощью целлюлозолитического комплекса, при этом механическую активацию проводят до тех пор, пока сохраняется линейная зависимость между временем активации и выходом углеводов, который достигается при постоянной скорости гидролиза.  d. The saccharification of raw materials by alternating the mechanical activation of the solid residue and enzymatic hydrolysis using a cellulolytic complex, while mechanical activation is carried out as long as the linear relationship between the activation time and the yield of carbohydrates is maintained, which is achieved at a constant rate of hydrolysis.
2. Способ по п. 1, в котором в качестве сырья предпочтительно используются пустые фруктовые грозди (Empty fruit bunches) - отходы биомассы масличной пальмы (Elaeis guineensis), которые образуются при производстве пальмового масла.  2. The method according to p. 1, in which the raw materials are preferably empty fruit bunches (waste palm oil biomass (Elaeis guineensis), which are formed in the production of palm oil.
3. Способ по п. 1, в котором механическая активация проводится в шаровых, планетарных или вибрационных мельницах при ускорении мелющих тел от 60 до 400 м/с2 в течение 0,5-2,0 минут, или в роторных мельницах при скорости воздействующих роторов 10- 120 м/с в течение 0,2-2,0 минут, или в пневматических вихревых мельницах при скорости газового потока 10-120 м/с в течение 0,2-2,0 минут. 3. The method according to p. 1, in which mechanical activation is carried out in ball, planetary or vibration mills with acceleration of grinding media from 60 to 400 m / s 2 for 0.5-2.0 minutes, or in rotary mills at a speed acting rotors 10-120 m / s for 0.2-2.0 minutes, or in pneumatic vortex mills at a gas flow rate of 10-120 m / s for 0.2-2.0 minutes.
4. Способ по п. 1, в котором ферментативный гидролиз осуществляется в режиме противотока, то есть путем перемещения гидролизатов и твердых остатков, так как это показано на Ошибка! Источник ссылки не найден.. 4. The method according to p. 1, in which the enzymatic hydrolysis is carried out in countercurrent mode, that is, by moving the hydrolysates and solid residues, as shown in the Error! Link source not found ..
5. Способ по п. 1, в котором в качестве ферментативного комплекса используют обладающие деполимеразной активностью по отношению к полисахаридам ферменты, выделенные из культуральных сред Trichoderma viride. 5. The method according to claim 1, in which enzymes isolated from Trichoderma viride culture media are used as an enzymatic complex with depolymerase activity towards polysaccharides.
6. Способ по п. 1, в котором в качестве ферментативного комплекса используют смесь обладающих деполимеразной активностью по отношению к полисахаридам ферментов, которые выделяют из культуральных сред Trichoderma viride, Aspergillus awamori, Bacillus subtilis.  6. The method according to p. 1, in which the enzyme complex uses a mixture with depolymerase activity against polysaccharides of enzymes that are isolated from culture media Trichoderma viride, Aspergillus awamori, Bacillus subtilis.
7. Способ по n. 1, в котором в качестве поверхностно-активных веществ используют препараты марки Tween или полиэтиленоксид.  7. The method according to n. 1, in which Tween or polyethylene oxide brands are used as surfactants.
8. Способ по п. 1, в котором в качестве целлюлозолитического комплекса используют обладающие деполимеразной активностью по отношению к полисахаридам ферменты, выделенные из культуральных сред Trichoderma viride.  8. The method according to p. 1, in which enzymes isolated from Trichoderma viride culture media are used as a cellulolytic complex with depolymerase activity towards polysaccharides.
9. Способ по п. 1, в котором после механической активации и ферментативного гидролиза проводят мацерацию сырья путем обработки последнего ферментативным комплексом, выделенным из культуральных жидкостей продуцент (Aspergillus foetidus).  9. The method according to p. 1, in which, after mechanical activation and enzymatic hydrolysis, maceration of the raw material is carried out by treating the latter with an enzymatic complex isolated from producer culture liquids (Aspergillus foetidus).
PCT/IB2010/003408 2010-10-12 2010-10-12 Process for producing sugars by enzymatic hydrolysis of pretreated efb oil palm waste WO2012049531A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2010/003408 WO2012049531A1 (en) 2010-10-12 2010-10-12 Process for producing sugars by enzymatic hydrolysis of pretreated efb oil palm waste

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2010/003408 WO2012049531A1 (en) 2010-10-12 2010-10-12 Process for producing sugars by enzymatic hydrolysis of pretreated efb oil palm waste

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012049531A1 true WO2012049531A1 (en) 2012-04-19

Family

ID=44063614

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/IB2010/003408 WO2012049531A1 (en) 2010-10-12 2010-10-12 Process for producing sugars by enzymatic hydrolysis of pretreated efb oil palm waste

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2012049531A1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113026409A (en) * 2021-03-29 2021-06-25 边静 Method for preparing biological sulfur-free semi-chemical pulp by using palm fibers
CN114540430A (en) * 2022-03-23 2022-05-27 清华大学 Processing method of empty palm fruit clusters

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2362528A (en) 1942-06-03 1944-11-14 Libbey Owens Ford Glass Co Preparation of fine cellulose flour
US2364721A (en) 1942-06-03 1944-12-12 Libbey Owens Ford Glass Co Method of producing fine wood flour
US4642287A (en) 1983-04-14 1987-02-10 Shinnenryoyu Kaihatsugijutsu Kenkyukumiai Process for pretreating biomasses in advance of their enzymatic treatment
US4997488A (en) 1988-02-05 1991-03-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Combined physical and chemical treatment to improve lignocellulose digestibility
US5114488A (en) 1985-01-31 1992-05-19 Wenger Manufacturing, Inc. Extrusion method and apparatus for acid treatment of cellulosic materials
US5498766A (en) 1992-12-17 1996-03-12 Colorado State University Research Foundation Treatment method for fibrous lignocellulosic biomass using fixed stator device having nozzle tool with opposing coaxial toothed rings to make the biomass more susceptible to hydrolysis
US5536325A (en) 1979-03-23 1996-07-16 Brink; David L. Method of treating biomass material
US5628830A (en) 1979-03-23 1997-05-13 The Regents Of The University Of California Enzymatic hydrolysis of biomass material
RU2223327C1 (en) 2002-08-09 2004-02-10 Орлова Валентина Сергеевна Method for preparing glucose from cellulose-containing raw, from brewery waste mainly
WO2011002329A1 (en) * 2009-07-01 2011-01-06 "Arter Technology Limited" Method for preparation of oil palm waste to enzymatic hydrolysis for production of water-soluble carbohydrides

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2362528A (en) 1942-06-03 1944-11-14 Libbey Owens Ford Glass Co Preparation of fine cellulose flour
US2364721A (en) 1942-06-03 1944-12-12 Libbey Owens Ford Glass Co Method of producing fine wood flour
US5536325A (en) 1979-03-23 1996-07-16 Brink; David L. Method of treating biomass material
US5628830A (en) 1979-03-23 1997-05-13 The Regents Of The University Of California Enzymatic hydrolysis of biomass material
US4642287A (en) 1983-04-14 1987-02-10 Shinnenryoyu Kaihatsugijutsu Kenkyukumiai Process for pretreating biomasses in advance of their enzymatic treatment
US5114488A (en) 1985-01-31 1992-05-19 Wenger Manufacturing, Inc. Extrusion method and apparatus for acid treatment of cellulosic materials
US4997488A (en) 1988-02-05 1991-03-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Combined physical and chemical treatment to improve lignocellulose digestibility
US5498766A (en) 1992-12-17 1996-03-12 Colorado State University Research Foundation Treatment method for fibrous lignocellulosic biomass using fixed stator device having nozzle tool with opposing coaxial toothed rings to make the biomass more susceptible to hydrolysis
RU2223327C1 (en) 2002-08-09 2004-02-10 Орлова Валентина Сергеевна Method for preparing glucose from cellulose-containing raw, from brewery waste mainly
WO2011002329A1 (en) * 2009-07-01 2011-01-06 "Arter Technology Limited" Method for preparation of oil palm waste to enzymatic hydrolysis for production of water-soluble carbohydrides

Non-Patent Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Research and Development of Oil Palm Biomass Utilization in Wood-based Industries. Palm Oil Developments", MPOB, vol. 36, 2002, pages 1 - 5
ALAM, MD.Z. ET AL.: "The factors affecting the performance of activated carbon prepared from oil palm empty fruit bunches for adsorption of phenol", CHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, vol. 155, no. 1-2, December 2009 (2009-12-01), pages 191 - 198, XP026676137 *
ARIFFIN, H. ET AL.: "Production of Bacterial Endoglucanase from Pretreated Oil Palm Empty Fruit Bunch by Bacillus pumilus EB3", JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, vol. 106, no. 3, September 2008 (2008-09-01), pages 231 - 236, XP025536421 *
AVVAKUMOV, E. M., SENNA, M. KOSOVA: "Soft mechano-chemical synthesis: a basis for new chemical technologies", 2001, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, pages: 200
BALAZ, P., MECHANICKA ACTIVACIA V PROCESOCH EXTRAKCINH METALURGIE, 1997, pages 223
BIORESOURCES, vol. 2, 2007, pages 351 - 362
E. G AVAKUMOV: "Mechanical methods of activation of chemical processes", 1986, NAUKA PUBLISHING HOUSE, pages: 303
HENDRIKS, A.T.W.M. & ZEEMAN, G.: "Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 100, no. 1, 2 July 2008 (2008-07-02), pages 10 - 18, XP025407559 *
J.P. DELEGNES, R. MOLETTA, J.M. NAVARRO: "Effect of lignocelluloses degradation products on ethanol fermentations of glucose and xylose by Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis, Pichia stipits, and Candida shehatae", ENZ. MICROB. TECH., vol. 19, 1996, pages 220 - 225
JEEWON LEE: "Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol", J BIOTECH., vol. 56, 1997, pages 1 - 24, XP004126073, DOI: doi:10.1016/S0168-1656(97)00073-4
K. TANAKA, F. TODA: "Solvent-free organic synthesis", CHEM. REV., vol. 100, 2000, pages 1025 - 1074, XP002262508, DOI: doi:10.1021/cr940089p
K.J. SIEBERT, N.V. TROUKHANOVA, P.Y. LYNN: "Nature of Polyphenol-Protein Interactions", JAGRIC. FOOD CHEM., vol. 44, 1996, pages 80 - 85, XP002197460, DOI: doi:10.1021/jf9502459
KHRENKOVA, T.M., MECHANOCHEMICAL ACTIVATION OF COALS - MOSCOW: NEDRA, pages 176
LOMOVSKY O.I., BOLDYREV V.V.: "Mechanochemistry for solving environmental problems", PUBL. SO RAN, 2006, pages 221
M.K. BEYER, H. CLAUSEN-SCHAUMANN: "Mechanochemistry: the mechanical activation of covalent bond", CHEM. REV., vol. 105, 2005, pages 2921 - 2948
NASSERELDEEN A. KABBASHI, MD. ZAHANGIR ALAM, M. FAHRURRAZI TOMPANG: "Direct bioconversion of oil palm EFB for bioethanol production by solid state bioconversion", IIUM ENG. J., vol. 8, no. 2, 2007, pages 1 - 12, XP008144160
P.YU. BUTYAGIN: "The role of interphases in the low-temperature reactions of mechanochemical synthesis", RUSS. COLLOIDAL J, vol. 59, no. 4, 1997, pages 460 - 467
SINITSYN A.P., GUSAKOV A.V, CHERNOGLAZOV V.M: "Bioconversion of lignocellulosic materials", 1995, PUBLISHING HOUSE OF MOSCOW STATE UNIVERSITY, pages: 220
SINITSYN A.P., GUSAKOV A.V., CHERNOGLAZOV V.M.: "Bioconversion of lignocellulosic materials", 1995, PUBLISHING HOUSE OF MOSCOW STATE UNIVERSITY, pages: 220
SYAFWINA*I, YOICHI HONDA, TAKASHI WATANABE, MASAAKI KUWAHARA: "Pre-treatment of oil palm empty fruit bunch by white-rot fungi for enzymatic saccharification", WOOD RESEARCH, vol. 89, 2002, pages 19 - 20, XP008144156
T.W. JEFFRIES, Y.-S. JIN: "Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts", APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 63, 2004, pages 495 - 509, XP002999147
TKACOVA, K.: "Mechanical activation of minerals", 1989, ELSEVIER, pages: 156
V.V MOLCHANOV, R.A. BUYANOY: "Mechanochemistry of catalysts", RUSS. CHEM. REV., vol. 69, 2000, pages 476 - 493
V.V. BOLDYREV: "Hydrothermal reactions under mechano-chemical action", POWDER TECHNOL, vol. 122, 2002, pages 247 - 254
V.V. BOLDYREV: "Mechanochemical modification and synthesis of drugs", J. MATERIALS SCIENCE, vol. 39, 2004, pages 5117 - 5120, XP019209900, DOI: doi:10.1023/B:JMSC.0000039193.69784.1d
V.V. BOLDYREV: "Mechanochemistry and mechanical activation", MATERIALS SCI. FORUM, 1996, pages 511 - 520
Y SUN, J. CHENG: "Hydrolysis of Lignocellulosic Materials for Ethanol Production: A Review", BIORESOURCE TECHNOLOGY, vol. 83, 2007, pages 1 - 11, XP002670852, DOI: doi:10.1016/S0960-8524(01)00212-7

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113026409A (en) * 2021-03-29 2021-06-25 边静 Method for preparing biological sulfur-free semi-chemical pulp by using palm fibers
CN114540430A (en) * 2022-03-23 2022-05-27 清华大学 Processing method of empty palm fruit clusters

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6169138B2 (en) Biomass processing method
KR101731575B1 (en) Processing biomass
CA2738333C (en) Bio-oil production method
US20090098616A1 (en) Enzymatic treatment of lignocellulosic materials
US20090098617A1 (en) Enzymatic treatment under vacuum of lignocellulosic materials
MX2010011965A (en) Cellulosic and lignocellulosic structural materials and methods and systems for manufacturing such materials by irradiation.
JP2010508390A5 (en)
US20090098618A1 (en) Treatment of lignocellulosic materials utilizing disc refining and enzymatic hydrolysis
WO2012155239A1 (en) Lignin removal after enzymatic treatment of lignocellulosic materials
WO2011063484A1 (en) Method for processing vegetable biomass
WO2009005390A1 (en) Method of producing bioethanol from lignocellulose
US10144785B2 (en) Liquefaction biomass processing with heat recovery
WO2012049531A1 (en) Process for producing sugars by enzymatic hydrolysis of pretreated efb oil palm waste
WO2011002329A1 (en) Method for preparation of oil palm waste to enzymatic hydrolysis for production of water-soluble carbohydrides
WO2012155238A1 (en) Method of fermenting a sugar stream to produce an alcohol stream
Valchev et al. Use of enzymes in hydrolysis of maize stalks
Bahena-Molina et al. Pretreatment Technologies for Second-Generation Bioethanol Production
BenYahmed et al. Impact of Pretreatment Technology on Cellulosic Availability for Fuel Production
KEMKA et al. PRETREATMENT PROCEDURES ON LIGNOCELLULOSIC BIOMASS MATERIAL FOR BIOGAS PRODUCTION: A REVIEW.
Singh et al. Bioethanol Production From Brassica Napus Biomass And Pineapple Waste
AL-Rubaia’ay et al. HYDROLYSIS OF WHEAT STRAW UNDER ALKALI CONDITIONS
WO2012016189A1 (en) Biomass liquefaction processes, and uses of same
Chen et al. Gas Explosion Technique Principles and Biomass Refining Pandect
Nazari Chamaki Ethanol production from orange waste with a focus on its cellulosic fragment
Kumar et al. Separation of hemi cellulose from corn cobs by alkali pretreatment method.

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10824278

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10824278

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1