WO2012010728A1 - Biomarcador para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer - Google Patents

Biomarcador para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer Download PDF

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Definitions

  • the present invention falls within the field of oncology, specifically, within the biomarkers useful for the diagnosis, prognosis and monitoring of malignant tumors, preferably breast and colon, and the methods of diagnosis, prognosis and monitoring of said tumors. in which the quantification of such biomarkers is necessary.
  • the invention also relates to the use of inhibitor compounds of these biomarkers for the treatment of cancer, preferably of colon and breast.
  • prognostic and predictive factors are very useful in making medical decisions about the management and treatment of the disease.
  • prognostic factors the following are considered validated as prognostic factors: the status of axillary nodes, tumor size, histological type and grade, patient age, and other factors such as biomarkers , measurable in tissues, cells and fluids, such as the state of steroid receptors (RE-RP).
  • RE-RP steroid receptors
  • Phosphoinositide 3-kinases are lipid enzymes that phosphorylate the 3D position of the inositol ring of membrane phosphoinositides (Ptdins) to generate Ptdins (3,4) P 2 (PIP 2 ) and Ptdlns (3,4,5 ) P 3 (PIPs), which are capable of activating routes such as protein kinase B (PKB) or Akt) that induce cell division and survival (Kok K., et al., 2009, Trends Biochem. Sci. 34: 1 15-127).
  • Ptdins membrane phosphoinositides
  • PI3K are heterodimers composed of a p85 regulatory subunit and a catalytic p110 subunit. There are four catalytic subunits encoded by the PIK3CA, CB, CD and CG genes. Of these p1 10g (PIK3CG) is associated with the p87 or p101 regulatory subunits and is activated by receptors associated with G proteins, while the other catalytic subunits are associated with p85 type regulatory subunits and are mainly activated by receptors with tyrosine kinase activity. p85 regulates the stability of p1 10 and a half its translocation to the membrane and its activation after stimulation of growth factor receptors.
  • Overexpression and mutation of genes encoding the catalytic p1 subunits in cancer have been extensively studied (Cully M., et al., 2006, Nat Rev Cancer 6: 184-192).
  • the PIK3R1 gene (p85cc) has been identified as an oncogene involved in tumor processes in the colon and ovary (Amanda J. Philp, et al., 2001, Cancer Research 61: 7426-7429).
  • PI3K activity is increased in hyperproliferative processes, this enzyme has been proposed as a therapeutic target in cancer.
  • the periposin has inhibitory effects on tumor cells in breast cancer, among other types of cancer, through the inhibition of the PI3K signaling pathway (Bryan T. Hennessy, et al., 2007, Clinical Cancer Research 13 (24): 7421-7431).
  • the present invention provides a new biomarker for diagnosis, prognosis and monitoring of cancer, the PIK3R2 gene or any of its expression products, as well as a method of diagnosis, prognosis and monitoring of this disease, preferably of breast or colon cancer, which comprises its quantification in a biological sample containing tumor cells.
  • tumors preferably breast and colon
  • This change to ⁇ 85 ⁇ correlates with tumor progression, that is, malignant tumor phenotypes have high levels of expression of this gene compared to non-tumor tissues.
  • the expression of PIK3R2 is related to the tumor grade and in the case of breast cancer, the expression levels of PIK3R2 correlate with metastatic or invasive capacity.
  • the present invention demonstrates that the analysis of the expression of the biomarker PIK3R2 is a useful method for the diagnosis, prognosis and monitoring of tumor progression.
  • one aspect of the invention relates to the use of the PIK3R2 gene or its expression products for the diagnosis, prognosis and monitoring of cancer.
  • the cancer is breast or colon cancer.
  • Diagnosis is understood as the procedure by which the degree or stage of a disease, preferably neoplastic, is identified. In the context of the present invention, it refers to the identification of an advanced stage in a tumor of an individual or the identification of an invasive or metastatic tumor.
  • prognosis refers to the procedure by which a prediction of the events that will occur in the development or course of a disease, preferably neoplastic, including relapse, metastatic dissemination capacity or response to a particular treatment is established.
  • the nucleotide sequence encoding the PIK3R2 gene is the reference number in GenBank NM_005027.
  • expression product refers to any transcription product (RNA, including alternative rearrangement forms) or expression (protein) of this gene, or to any form resulting from the processing of said products of transcription or expression.
  • the expression products of this gene are preferably the mRNA encoding the ⁇ 85 ⁇ protein or the ⁇ 85 ⁇ protein.
  • cancer refers to the neoplastic disease in which the cells, of abnormal morphology, have an uncontrolled growth reaching to generate a tumor.
  • cancer examples include, but are not limited to, liver or hepatocarcinoma, prostate, lung, pancreatic, colon, breast, gynecological cancers, such as ovarian, uterus, cervix, vagina or vulva, skin cancer, such as melanoma, esophageal cancer, gastric cancer, bladder cancer, urinary tract cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain cancer, sarcoma, lymphoma or leukemia.
  • liver or hepatocarcinoma prostate, lung, pancreatic, colon, breast
  • gynecological cancers such as ovarian, uterus, cervix, vagina or vulva
  • skin cancer such as melanoma, esophageal cancer, gastric cancer, bladder cancer, urinary tract cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain cancer, sarcoma, lymphoma or leukemia.
  • Breast cancer is understood as the type of malignant neoplasm that has its origin in the accelerated and uncontrolled proliferation of cells that cover the interior of the ducts that during breastfeeding carry milk from the glandular acini to the galactophores ducts behind the areola and the nipple, or the type of malignant neoplasm that has its origin in the glandular acini itself.
  • This term includes, but is not limited to, adenocarcinoma, located in the glandular tissue; cystosarcoma; sarcoma; ductal carcinoma, located in the mammary ducts or galactophores; lobular or lobular carcinoma, which includes lobular neoplasia; inflammatory breast cancer, where cancer cells block the lymphatic vessels, which manifests in the skin that acquires a thick and hollowed out appearance; Paget's cancer, which spreads through the skin of the nipple and areola, which appear scaly and reddish; mucinous or colloid cancer, in which cancer cells produce a certain mucus; or spinal cancer, an infiltrating tumor.
  • Breast cancer can be detected by techniques known in the field Biomedical, for example, but not limited to mammography, MRI, ultrasonography or biopsy.
  • Colon cancer includes any type of neoplasm of the colon, rectum or appendix. Colon cancer can be detected by, for example, but not limited to, rectal touch, fecal occult blood test (PSOH), sigmoidoscopy, colonoscopy, virtual colonoscopy, barium enema with double contrast, ultrasound, biopsy or nuclear magnetic resonance (NMR)
  • PSOH fecal occult blood test
  • sigmoidoscopy colonoscopy
  • virtual colonoscopy virtual colonoscopy
  • barium enema with double contrast ultrasound, biopsy or nuclear magnetic resonance (NMR)
  • Another aspect of the invention relates to a method of obtaining useful data for the diagnosis, prognosis and monitoring of cancer, hereinafter "method of the invention", comprising: obtaining an isolated biological sample comprising tumor cells of a individual,
  • step (b) compare the amount detected in step (b) with a reference amount.
  • isolated biological sample comprising tumor cells refers to, but is not limited to, tissues and / or biological fluids of an individual obtained by any method known to a person skilled in the art. That serves for that purpose.
  • the biological sample may be a tissue, for example, but not limited to, a tumor biopsy or a fine needle aspirate, or it may be a biological fluid, for example, but not limited to, a fluid sample, such as blood, plasma, serum , lymph, ascites fluid, urine or breast exudate.
  • the sample can be taken from a human, but also from non-human mammals, such as, but not limited to, rodents, ruminants, felines or canines.
  • the individual from which the biological sample isolated from step (a) of the method of the invention is derived is a mammal.
  • the mammal is a human.
  • the detection of the quantity of product of the expression of the PIK3R2 gene in the sample obtained refers to the measurement of the quantity or concentration, preferably in a semiquantitative or quantitative manner. This measure can be carried out directly or indirectly. Direct measurement refers to the measure of the quantity or concentration of the product of the gene expression based on a signal that is obtained directly from the product of the gene expression and that is directly correlated with the number of molecules of the product of the gene. gene expression present in the sample.
  • Said signal - which we can also refer to as an intensity signal - can be obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of the expression product.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component (for example, a component other than the product of gene expression) or a biological measurement system (for example, the measurement of cellular responses, ligands, "labels" or reaction products enzymatic).
  • the detection of the amount of product of gene expression can be carried out by any method of determining the amount of the product of gene expression known to the person skilled in the art.
  • the detection of the amount of product of the gene expression is performed by determining the level of mRNA derived from its transcription, after extracting the total RNA from the isolated biological sample which can be carried out by methods known by a skilled.
  • the mRNA level analysis can be performed, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, by amplification by polymerase chain reaction (PCR), back transcription in combination with the ligase chain reaction (RTLCR), retrotranscription in combination with the polymerase chain reaction (RT-PCR), retrotranscription in combination with the quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR), or any another method of nucleic acid amplification; DNA microarrays made with oligonucleotides deposited by any mechanism; DNA microarrays made with oligonucleotides synthesized in situ by photolithography or by any other mechanism; in situ hybridization using specific probes labeled with any method of marking; by electrophoresis gels; by membrane transfer and hybridization with a specific probe; by NMR or any other diagnostic imaging technique using paramagnetic nanoparticles or any other type of detectable nanoparticles functionalized with antibodies or by any other means.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RTLCR ligase chain reaction
  • the detection of the amount of product of gene expression is performed by determining the level of ⁇ 85 ⁇ protein, for example, but not limited to, immunohistochemistry or western blot.
  • determining the level of ⁇ 85 ⁇ protein for example, but not limited to, immunohistochemistry or western blot.
  • another preferred embodiment includes, as an indirect method of determining ⁇ 85 ⁇ levels, the measurement of microRNA-126 expression levels.
  • reference amount refers to any value or range of values derived from the quantification of the product of the expression of the PIK3R2 gene in a biological control sample.
  • the reference amount is derived from an isolated biological sample that does not comprise tumor cells (control biological sample), where said sample may be derived from the individual in step (a) or from another individual.
  • the method of the invention further comprises: d. assign the individual from step (a) to the group of patients with advanced tumor stage when the amount detected in step (b) is greater than the reference amount.
  • the term "advanced tumor stage” refers to the stage or tumor phase in which the neoplastic or uncontrolled growth cells have reached deep layers of tissue, and which may or may not metastasize. .
  • samples with normal PIK3R2 (or ⁇ 85 ⁇ ) expression levels that is, not exceeding the reference amount, correlate with low degrees of tumor development , such as, but not limited to, degrees from 0 to A according to the Dukes stratification scale.
  • samples with a high content of the expression product of the PIK3R2 gene that is, with a level of expression of this gene higher than the reference amount, have a higher tumor grade (grades from A, that is, B, C or D) than those samples with normal expression levels of this gene.
  • the greater the product of expression of the PIK3R2 gene in the analyzed biological sample the more advanced is the tumor stage of the individual from which it is derived. Therefore, in a more preferred embodiment of this aspect of the invention, the cancer is colon cancer. Occasionally it may happen that cells in an advanced stage tumor have an invasive or metastatic phenotype.
  • the term "invasive cancer”, as it appears in the present invention refers to the type of cancer in which the cells comprised in the tumor have the capacity to metastasize to other tissues.
  • the cancer is breast cancer.
  • the samples that have high levels of expression of the PIK3R2 gene (or ⁇ 85 ⁇ ), that is, levels of expression of this gene / protein greater than the reference amount come from regions around which there is a high percentage of lymph nodes that have tumor cells. This means that samples with levels of expression of this gene greater than the reference amount have cells with greater invasive capacity than cells comprised in samples with normal levels of expression of this gene. Therefore, in an even more preferred embodiment, when the cancer is breast cancer, the method of the invention comprising steps (a) to (c) further comprises: d. assign the individual from step (a) to the group of patients with invasive cancer when the amount detected in step (b) is greater than the reference amount.
  • Steps (b) and / or (c) of the method of the invention can be totally or partially automated, for example, but not limited, by robotic equipment for the detection, in step (b), of the amount of the gene PIK3R2 or the expression product of the PIK3R2 gene in the isolated biological sample.
  • the method of the invention may comprise additional steps, for example, but not limited to, related to the pre-treatment of the isolated biological sample prior to analysis.
  • kits of the invention comprising the primers, probes or antibodies, or any combination thereof, necessary to detect the amount of expression product of the PIK3R2 gene in an isolated biological sample.
  • kits of the invention have complementarity, and therefore, hybridization capacity, with at least one product of the expression of the PIK3R2 gene.
  • the kit of the invention further comprises primers, probes or antibodies, or any combination thereof, complementary to microRNA-126.
  • the kit of the invention comprises all those reagents necessary to carry out the method of the invention described above.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, enzymes, such as, but not limited to, polymerases, cofactors to obtain optimal activity of these, agents to prevent contamination, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit may also contain other molecules, genes, proteins or probes of interest, which serve as positive and negative controls.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the method of the invention.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the kit of the invention for the diagnosis, prognosis and monitoring of cancer.
  • the cancer is breast or colon cancer.
  • the formed heterodimer has a higher affinity for the physiological substrate present in the cell membrane, resulting in an increase in PI3K activity and tumor progression. Therefore, another aspect of the The invention relates to the use of at least one inhibitor of the PIK3R2 gene or its expression products for the preparation of a medicament for the treatment of cancer.
  • the cancer is breast or colon cancer. In a more preferred embodiment, the cancer is breast cancer.
  • inhibitor is understood as any compound that reduces, blocks or eliminates the expression of the PIK3R2 gene or the transport or activity of any of its expression products.
  • inhibitors are, but not limited to, siRNAs or microRNAs complementary to the mRNA transcription product of this gene; or inhibitors of the ⁇ 85 ⁇ protein such as, for example, but not limited to: peptides that delocalyze ⁇ 85 ⁇ or displace their association with p1 10.
  • Fig. 1 Shows the level of expression, by Q-PCR, of ⁇ 85 ⁇ (PIK3R2, R2) (x axis) and p85cc (PIK3R1, R1) (y axis) in breast (BC) and colon (CC) carcinomas .
  • n number of samples.
  • Inactive samples with inactive PIK3 activity.
  • Active samples with PIK3 activity.
  • R2 values are equal to or greater than in adjacent normal tissue.
  • R1 values in BCs are lower (R1 normalized between -2 and -3); or exhibit small changes (R1 between -1 and +1) with respect to normal tissue.
  • COS-7 cells were transfected with pSG5-p1 10cc combined with pSG5-p85cc or - ⁇ 85 ⁇ (24 h), then they were incubated (1) in serum free medium (48 h); (2) some samples were subsequently activated with serum (10%) or (3) PDGF (50 ng / ml) 10 min. Exponential: COS-7 cells in exponential growth. Control: COS-7 cells without transfecting.
  • Fig. 4. It shows that ⁇ 85 ⁇ increases the content of PIP 3 in the membrane and induces cell transformation
  • (a) NIH3T3 cells were transfected with GFP-Btk-PH in combination with ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ , or ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ (24 h ), were incubated (19 h) in serum-free medium (quiescence) or activated with serum (15 min; right). Control: non-transfected cells.
  • the location of PIP3 (GFP-Btk-PH) was examined by fluorescence microscopy. The arrows indicate the sections in which the fluorescence signal (AU) was measured.
  • the status of the PI3K pathway was examined in a collection of colon adenocarcinomas (CC) and ductal carcinomas of the breast (BC) compared to normal adjacent tissue.
  • a protocol was designed to analyze these samples that included immunohistochemical (IH) analysis, quantitative PCR (Q-PCR) and Western blot analysis (WB).
  • BC breast carcinoma
  • CC colon
  • the intensity signals were in a range of 1 to 3 (1, low staining level; 2 was> 3 times higher than the background; 3 was> 6 times higher than the background).
  • WB analysis frozen sections of the samples were lysed in RIPA buffer; The WB signal was quantified and normalized by loading actin controls. These signals were measured in a range of -2 to +2 (0 indicates no change, ⁇ 1 reflects an increase or decrease of between 20% and 50%; and ⁇ 2 changes greater than 50%).
  • the Q-PCR analysis the mRNA of the frozen samples was obtained and analyzed in custom-designed TaqMan Low Density Arrays (LDA, Applied Biosystems) containing the primers and probes of the PI3K genes and their regulators. As template RNA for reverse transcription, 1 ng of total RNA per sample (triplicate) was used.
  • the Q-PCR was performed on an ABI PRISM 7900 HT (Applied Biosystems).
  • the LDA probes used were GAPDH (probe Hs4342376), ACTB (Hs99999903), AKT1 (Hs00178289), AKT2 (Hs00609846), AKT3 (Hs00178533), IGF1 (Hs00153126), IGF1R (Hs00602267 (IGs124) ), SHIP1 (Hs00183290), PIK3CA (Hs00180679), PIK3CB (Hs00178872), PIK3CD (Hs00192399), PIK3CG (Hs00176916), PIK3R1 (Hs00236128), PIK3R2 (Hs00178188243)
  • PIK3CG and PIK3R1 Hs00277090 and Hs00381459 were also used.
  • the relative mRNA quantification was determined by the AACt method. Values of 2 _ ⁇ ( ⁇ 1 represents decrease and> 1 represents increase). To facilitate the comparison, the different values were normalized in a range of -3 to +3 (where 0 indicates no changes or insignificant (2 _ ⁇ between 0.6-1, 2); 1 -3 indicates increase, 1 (2 " ct 1, 2-3.0), 2 (2 "ct 3.0-6.0), 3 (2 _ ⁇ >6); and negative values indicate a decrease -1 (2 _ ⁇ 0.6-0, 3), -2 (2 "ct 0.3-0.1), -3 (2 " ct ⁇ 0.1)).
  • the primary antibodies used for WB were anti-phospho- (p) - PKB (Ser473), -p-p70s6k (Thr389), -p-PKC (zeta-Thr410) from Cell Signaling; anti-pan-p85 PI3K, -human p85cc and -PKB from Upstate Biotechnology; -p70S6K (C-18) and -PTEN (N-19) of Santa Cruz Biotechnology.
  • Anti-HA (12CA5) was from Babeo and anti- ⁇ -actin from Sigma-Aldrich.
  • the Anti-p1 10cc was donated by A. Klippel.
  • Anti- ⁇ 85 ⁇ PI3K (rat Ab 1 C8,) and anti-HA (12CA5) antibodies were used for immunoprecipitation (IP).
  • mice were immunized with the C-terminal KLH-conjugated peptide (residues 71 1-722 of ⁇ 85 ⁇ ) or rats with an N-terminal GST-fused fragment.
  • the ⁇ - ⁇ 85 ⁇ -specific antibody was tested on ELISA, WB and IP using recombinant bacteria proteins or cells expressing the ⁇ - ⁇ 85 ⁇ or r-p85cc extracts.
  • Rabbit antibody K1 123 strongly recognized ⁇ 85 ⁇ in WB and p85cc slightly.
  • the 1 C8 rat monoclonal antibody (mAb) was efficient in recognizing ⁇ 85 ⁇ by WB and IP, but did not recognize p85cc; This mAb was purified by affinity (GST kit; Pierce).
  • the first 10 samples were analyzed using (Ab) anti-phospho-PKB (P-PKB) antibodies, however, anti-phospho-S6 (p-S6; Cell Signaling) antibodies gave a better and more signal consistent and therefore were used for the rest of the samples.
  • P-PKB anti-phospho-PKB
  • p-S6 Cell Signaling
  • WB the antibodies described above that recognize the different catalytic and regulatory subunits of PI3K and their regulators were used. The complete analysis was carried out in 95% of the CC and 85% of the BC.
  • the relationship between the tumor variables was tested using the Pearson test and the contingency of the tumor parameters by the Chi-square test were calculated using Prism5V.5.0b software.
  • the gel bands and the intensity of the Fluorescence were quantified using ImageJ software.
  • the Student t test was performed using StatView 512+.
  • IH showed that the majority of the samples were heterogeneous, since only a fraction of the tumor cells in a given tumor was positive for p-S6. Those were classified as active samples in which the positive proportion for p-S6 or p-PKB was greater than 50%, or when 30 to 40% of the cells were highly positive (3 on a scale of 1 to 3) . PI3K activity was also tested by WB using Ab anti-pPKB and -pp70S6K; approximately 80% of the carcinoma samples that were positive for HI were also positive for WB. Only when the proportion of positive cells in a tumor was very low, WB positivity was not detected.
  • PIK3CB mRNA was increased in 25% of the CC and in approximately 15% of the BC, while that of PIK3CD was increased in 20 % of the BC and CC; These changes in WB expression were confirmed in approximately 10 tumor samples of each type.
  • PIK3CG was also increased by 25% of BCs, but since the WBs showed very low levels of protein, it is not clear if this change contributes to the behavior of the tumor.
  • Approximately 30% of the CC and 50% of the BCs also showed increased levels of AKT2, although this did not correlate with the activation of the route, tumor stage or invasion of lymph nodes. Characteristic tumor-like expression patterns were also observed.
  • PIP-chip Q-PCR showed that 60% of the CC, and only 8% of the BC, exhibited increased expression of SHIP1, a phenotype that was found mainly in active samples in PI3K.
  • the IGF route was altered in high frequency in BC (55%) and CC (85%), with increases in the expression of IGF1 R, more frequent in BC, and increased levels of IGF2, more frequently in CC.
  • the most surprising observation was the change in the expression of the ubiquitous regulatory subunits of class IA PI3K.
  • EXAMPLE 2 An increase in ⁇ 85 ⁇ levels in colon and breast carcinoma correlates with tumor progression.
  • PIK3R1 In normal tissues p85cc (PIK3R1) is usually expressed at levels higher than ⁇ 85 ⁇ (PIK3R2). Normalized analyzes by Q-PCR on PIP-chip cards showed that> 50% of colon and breast carcinomas had an increase in the expression of PIK3R2 ( ⁇ 85 ⁇ ). In addition, the increase in PIK3R2 levels was found in samples with decreased levels of PIK3R1 (p85cc) (Fig. 1). The increase in PIK3R2 by Q-PCR was confirmed in northern blot. Specific antibodies for p85 were prepared and increases in expression of ⁇ 85 ⁇ in CC and BC were confirmed by WB (Fig. 2a).
  • PIK3R2 While in Dukes stratification in CC describes the penetration of tumor cells in tissue layers, in BC the Bloom Richardson (BR) criterion describes cell differentiation, and to assess the invasiveness the proportion of lymph nodes is reported ( LN) in the environment of the tumor presenting tumor cells.
  • LN lymph nodes
  • Elevated levels of PIK3R2 were found more frequently in tumors with active PI3K, PIK3R2 RNAn levels were also increased in approximately 40% of samples with inactive PI3K (Fig. 2e).
  • the increase in PIK3R2 levels did not correlate with Bloom Richardson grade (Fig. 2f), although in active samples the malignant phenotypes had high levels of PIK3R2 (Fig. 2f).
  • PIK3R2 RNAn The possible correlation between the levels of PIK3R2 RNAn and the invasive / metastatic phenotype was examined.
  • the invasive potential was quantified as a percentage of LN infiltrated by tumor cells; thus, PIK3R2 levels correlated with metastatic capacity (Fig. 2g).
  • PIK3R2 mRNA and ⁇ 85 ⁇ protein
  • PIK3R2 expression is a biomarker for tumor progression, since it is associated with tumor grade in CC and invasiveness in BC.
  • EXAMPLE 3 The activation of the PI3K pathway is increased in cells expressing ⁇ 85 ⁇ . To compare the activities of ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ and ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ in vivo, the activation status of different effectors of the PI3K pathway in cells expressing recombinant p1 10cc (r) and rp85cc or ⁇ 85 ⁇ was examined.
  • Mouse embryonic fibroblasts (MEF) and NIH3T3, COS-7 and U2OS cells were cultured as described previously (Marqués M., et al., 2008, Mol Cell Biol., 28: 2803-2814). The cells were transfected with Lipofectamine (Invitrogen).
  • Plasmid pEGFP-PH-Btk encoding the PH domain of Bruton Tyrosine Kinase was assigned by T. Baila (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
  • the pT7 / T3-U19 vector encoding murine ⁇ 85 ⁇ was yielded by JWG Janssen (Institute fur Humangenetik, Heidelberg, Germany).
  • the ⁇ 85 ⁇ was subcloned into pSG5, introducing a hemagglutinin (HA) epitope into N-terminal.
  • the ⁇ 85 ⁇ ATG codon was replaced by a proline and the HA-tag ATG codon was maintained (Quickchange mutagenesis kit; Stratagene).
  • the siRNA control and for ⁇ 85 ⁇ were from Dharmacon.
  • the cells remained inactive between 19 (N IH3T3) or 48 h (COS7) without serum; some were treated 10 min in medium containing 10% serum or 50 ng / ml PDGF (Calbiochem).
  • the extracts were prepared in a TX-100 lysis medium; an IP was made with the PI3K with the appropriate antibody.
  • the cells were fixed in 4% paraformaldehyde in PBS (15 min), and permeabilized in PBS with 1% BSA and 0.3% TX-100, subsequently blocked with 1% BSA, 10 % goat serum and 0.01% TX-100 in PBS (30 min). The cells were visualized using a 60 x 1, 3NA PLOIL objective in an Olympus Fluoview 1000 microscope.
  • ⁇ 85 ⁇ levels were reduced using siRNA in HeLa cells.
  • PIK3R2 the contribution of PIK3R2 in tumor progression suggests that therapies aimed at reducing the expression or action of ⁇ 85 ⁇ (as siRNAs) are useful for the treatment of cancer.
  • EXAMPLE 4 ⁇ 85 ⁇ increases membrane PIP 3 levels and induces cell transformation.
  • Ptdlns (4,5) P2 the formation of PIP3 in vivo was examined by co-transfecting ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ or ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ with the green fluorescent protein (GFP) fused to the Btk PH domain, which selectively binds PIP3.
  • GFP green fluorescent protein
  • Btk-PH expression levels were similar in control cells and in cells transfected with ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ and ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ .
  • Btk-PH was located in the cytoplasm and in the nucleus (Fig. 4a).
  • the addition of serum produced a relocation of part of the Btk-PH to the cell membrane in both control cells and ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ cells.
  • a foci-forming assay was used to test the ability of p85 ⁇ to induce transformation. While the expression of p85cc does not transform NIH3T3 cells, ⁇ 85 ⁇ was able to induce foci formation although to a lesser extent than V12-Ras (Fig. 4c). These results show that tumor progression correlates with alterations in the levels of PI3K regulatory subunits. The increase of ⁇ 85 ⁇ and the decrease of p85cc causes an enrichment in complexes ⁇ 85 ⁇ / ⁇ 1 10 ⁇ that has a higher affinity for the physiological substrate Ptdlns (4,5) P 2 . This increases the production of PIP3 even in the absence of growth factors explaining the transforming capacity of ⁇ 85 ⁇ and its role in tumor progression.

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Abstract

La presente invención proporciona un nuevo biomarcador para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer, preferiblemente de mama y colon, el gen PIK3R2 o cualquiera de sus productos de expresión; ya que niveles elevados de PIK3R2 correlacionan con estadios tumorales avanzados, y en el caso de cáncer de mama, con capacidad invasiva o metastásica. Así, la invención también se refiere a un método de diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer, preferiblemente de mama o de colon, en el que es necesaria la cuantificación de dicho biomarcador en una muestra biológica que comprende células tumorales.

Description

BIOMARCADOR PARA EL DIAGNÓSTICO, PRONÓSTICO Y
SEGUIMIENTO DE CÁNCER
La presente invención se encuadra en el campo de la oncología, específicamente, dentro de los biomarcadores útiles para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de tumores malignos, preferiblemente de mama y de colon, y de los métodos de diagnóstico, pronóstico y seguimiento de dichos tumores en los que es necesaria la cuantificación de tales biomarcadores. La invención también se refiere al uso de compuestos inhibidores de estos biomarcadores para el tratamiento del cáncer, preferiblemente, de colon y mama.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR En cáncer, los factores pronósticos y predictivos son de gran utilidad en la toma de decisiones médicas sobre el manejo y tratamiento de la enfermedad. Así, por ejemplo, en el caso de cáncer de mama, se consideran validados como factores pronósticos los siguientes: el estado de los ganglios axilares, el tamaño tumoral, el tipo y grado histológico, la edad del paciente, y otros factores como los biomarcadores, medibles en tejidos, células y fluidos, como el estado de los receptores esteroideos (RE- RP). En este último grupo, la sobreexpresión del c-erbB-2, el estado del p53, la evidencia histológica de invasión vascular y los parámetros cuantitativos de angiogénesis, han sido extensamente estudiados clínica y biológicamente, pero no tienen un papel establecido en el manejo de los pacientes, por lo que estos parámetros no son suficientes para predecir el curso de la enfermedad.
Las fosfoinosítido 3-quinasas (PI3K) son enzimas lipídicas que fosforilan la posición 3D del anillo de inositol de los fosfoinosítidos (Ptdins) de membrana para generar Ptdins (3,4)P2 (PIP2) y Ptdlns(3,4,5)P3 (PIPs), los cuales son capaces de activar rutas como la de la proteína quinasa B (PKB o Akt) que inducen división celular y supervivencia (Kok K., et al., 2009, Trends Biochem. Sci. 34: 1 15-127).
Las PI3K son heterodímeros compuestos por una subunidad p85 reguladora y una subunidad p1 10 catalítica. Existen cuatro subunidades catalíticas codificadas por los genes PIK3CA, CB, CD y CG. De éstas p1 10g (PIK3CG) se asocia a las subunidades reguladoras p87 o p101 y se activa por receptores asociados a proteínas G, mientras que las demás subunidades catalíticas se asocian a subunidades reguladoras tipo p85 y se activan principalmente por receptores con actividad tirosina quinasa. p85 regula la estabilidad de p1 10 y media su translocación a la membrana y su activación tras la estimulación de receptores de factores de crecimiento. Existen tres genes que codifican subunidades tipo p85, los ubicuos PIK3R1 (p85cc) y PIK3R2 (ρ85β), y el específico de tejido PIK3R3 (ρ55γ) (Yuan T.L. y Cantley L.C., 2008, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 105: 9739-9744).
PI3K regula la división, migración y supervivencia celular y es conocido que mutaciones que inducen activación aberrante de esta ruta, incluyendo la deleción del regulador negativo, la fosfatasa PTEN, mutaciones activadoras de PIK3CA y expresión aumentada de PIK3CB o PIK3CD, son frecuentes en cáncer. La sobreexpresión y mutación de genes que codifican para las subunidades p1 10 catalíticas en cáncer han sido estudiadas extensivamente (Cully M., et al., 2006, Nat Rev Cáncer 6: 184- 192). El gen PIK3R1 (p85cc) ha sido identificado como oncogén implicado en procesos tumorales en colon y ovario (Amanda J. Philp, et al., 2001 , Cáncer Research 61 : 7426-7429). Asimismo, un análisis del perfil de expresión de los ARNm de los genes PI3K en diferentes tipos de tumores (Lin Zhang, et al., 2007, Clinical Cáncer Research 13(18): 5314-5321 ) mostró que 6 de ellos presentan una ganancia en su número de copias en las células tumorales de ovario, así como en otros tipos de cáncer, como cáncer de colon o de mama, respecto a los tejidos normales correspondientes. En este sentido, se ha propuesto el gen PIK3R3 como diana terapéutica, por ser el gen de sobreexpresión más significativa en los tumores analizados.
Ya que la actividad PI3K se encuentra incrementada en procesos hiperproliferativos, esta enzima se ha propuesto como diana terapéutica en cáncer. En este sentido, por ejemplo, la perifosina posee efectos inhibidores sobre las células tumorales en cáncer de mama, entre otros tipos de cáncer, a través de la inhibición de la vía de señalización PI3K (Bryan T. Hennessy, et al., 2007, Clinical Cáncer Research 13(24): 7421 - 7431 ).
No obstante, continúa existiendo la necesidad de encontrar nuevos biomarcadores con los que poder diagnosticar, ya no la ausencia o presencia de tumores, sino estadios tumorales avanzados en pacientes de cáncer. De esta manera, se facilitaría el seguimiento de la enfermedad y se podrían establecer valoraciones predictivas sobre el curso de la misma, como por ejemplo, capacidad invasiva del tumor, y así, orientar la toma de decisiones médicas en cuanto al tratamiento más adecuado a administrar en cada caso clínico particular.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un nuevo biomarcador de diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer, el gen PIK3R2 o cualquiera de sus productos de expresión, así como un método de diagnóstico, pronóstico y seguimiento de esta enfermedad, preferiblemente de cáncer de mama o de colon, que comprende su cuantificación en una muestra biológica conteniendo células tumorales. Como muestran los ejemplos de la presente invención, los tumores, preferiblemente de mama y colon, presentan un cambio en la subunidad reguladora de PI3K utilizada incrementando la expresión de ρ85β (PIK3R2) y reduciendo la de p85cc (PIK3R1). Este cambio a ρ85β correlaciona con progresión tumoral, es decir, fenotipos tumorales malignos presentan altos niveles de expresión de este gen en comparación con los tejidos no tumorales. En el caso de carcinomas de colon, la expresión de PIK3R2 se encuentra relacionada con el grado tumoral y en el caso de cáncer de mama, los niveles de expresión de PIK3R2 correlacionan con capacidad metastásica o invasiva. Así, la presente invención demuestra que el análisis de la expresión del biomarcador PIK3R2 es un método útil para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de la progresión tumoral.
Por ello, un aspecto de la invención se refiere al uso del gen PIK3R2 o de sus productos de expresión para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer. En una realización preferida, el cáncer es cáncer de mama o de colon.
Se entiende por "diagnóstico" el procedimiento mediante el cual se identifica el grado o estadio de una enfermedad, preferiblemente, neoplásica. En el contexto de la presente invención, se refiere a la identificación de un estadio avanzado en un tumor de un individuo o a la identificación de un tumor invasivo o metastásico. El término "pronóstico" se refiere al procedimiento mediante el cual se establece una predicción de los sucesos que ocurrirán en el desarrollo o curso de una enfermedad, preferiblemente, neoplásica, incluyendo recaída, capacidad de diseminación metastásica o respuesta a un determinado tratamiento.
La secuencia nucleotídica codificante del gen PIK3R2 es la de número de referencia en el GenBank NM_005027. El término "producto de la expresión", tal y como se utiliza en esta descripción, hace referencia a cualquier producto de transcripción (ARN, incluyendo formas de reordenamiento alternativo) o expresión (proteína) de este gen, o a cualquier forma resultante del procesamiento de dichos productos de transcripción o expresión. Los productos de expresión de este gen son, preferiblemente, el ARNm codificante para la proteína ρ85β o la proteína ρ85β. El término "cáncer", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a la enfermedad neoplásica en la cual las células, de morfología anormal, presentan un crecimiento descontrolado llegando a generar un tumor. Ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitarse, cáncer de hígado o hepatocarcinoma, de próstata, de pulmón, pancreático, de colon, de mama, cánceres ginecológicos, como el de ovario, útero, cérvix, vagina o vulva, cáncer de piel, como el melanoma, cáncer de esófago, cáncer gástrico, cáncer de vejiga, cáncer del tracto urinario, cáncer tiroideo, cáncer renal, cáncer de cerebro, sarcoma, linfoma o leucemia. Se entiende por "cáncer de mama" el tipo de neoplasia maligna que tiene su origen en la proliferación acelerada y descontrolada de células que tapizan el interior de los conductos que durante la lactancia llevan la leche desde los acinos glandulares hasta los conductos galatóforos situados detrás de la areola y el pezón, o bien el tipo de neoplasia maligna que tiene su origen en los propios acinos glandulares. Dentro de este término se incluyen, aunque sin limitarnos, el adenocarcinoma, localizado en el tejido glandular; el cistosarcoma; el sarcoma; el carcinoma ductal, localizado en los conductos mamarios o galactóforos; el carcinoma lobulillar o lobular, dentro del cual se incluye la neoplasia lobular; el cáncer inflamatorio de mama, donde las células cancerosas bloquean los vasos linfáticos, lo cual se manifiesta en la piel que adquiere una apariencia gruesa y ahuecada; el cáncer de Paget, que se propaga por la piel del pezón y de la areola, las cuales aparecen escamosas y rojizas; el cáncer mucinoso o coloide, en el que las células cancerosas producen cierta mucosidad; o el cáncer medular, un tumor infiltrante. El cáncer de mama se puede detectar mediante técnicas conocidas en el ámbito biomédico como por ejemplo, aunque sin limitarnos, mamografía, resonancia magnética, ultrasonografía o biopsia.
El "cáncer colorrectal" o "cáncer de colon", incluye cualquier tipo de neoplasia del colon, recto o apéndice. El cáncer de colon se puede detectar mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, tacto rectal, prueba de sangre oculta en heces (PSOH), sigmoidoscopia, colonoscopia, colonoscopia virtual, enema de bario con doble contraste, ecografía, biopsia o resonancia magnética nuclear (RMN).
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer, de ahora en adelante "método de la invención", que comprende: obtener una muestra biológica aislada que comprende células tumorales de un individuo,
detectar la cantidad de producto de expresión del gen PIK3R2 en la muestra biológica aislada de (a), y
comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
El término "muestra biológica aislada que comprende células tumorales", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere, pero no se limita, a tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica puede ser un tejido, por ejemplo, pero sin limitarse, una biopsia tumoral o un aspirado por aguja fina, o puede ser un fluido biológico, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero, linfa, fluido ascítico, orina o exudado mamario. La muestra puede ser tomada de un humano, pero también de mamíferos no humanos, como por ejemplo, pero sin limitarse, roedores, rumiantes, felinos o caninos. Por ello, en una realización preferida de este aspecto de la invención, el individuo del cual procede la muestra biológica aislada del paso (a) del método de la invención es un mamífero. En una realización más preferida, el mamífero es un humano. La detección de la cantidad de producto de la expresión del gen PIK3R2 en la muestra obtenida, se refiere a la medida de la cantidad o la concentración, preferiblemente de manera semicuantitativa o cuantitativa. Esta medida puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de la expresión del gen basada en una señal que se obtiene directamente del producto de la expresión del gen y que está correlacionada directamente con el número de moléculas del producto de la expresión del gen presente en la muestra. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del producto de expresión. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario (por ejemplo, un componente distinto del producto de la expresión génica) o un sistema de medida biológica (por ejemplo, la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
De acuerdo con la presente invención, la detección de la cantidad de producto de la expresión del gen puede ser llevada a cabo por cualquier método de determinación de la cantidad del producto de la expresión de los genes conocido por el experto en la materia. En una realización preferida, la detección de la cantidad de producto de la expresión del gen se realiza determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total de la muestra biológica aislada lo cual puede llevarse a cabo por métodos conocidos por un experto en la materia. El análisis del nivel de ARNm se puede realizar, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RTLCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qRT-PCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo; microarrays de ADN elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. En otra realización preferida, la detección de la cantidad de producto de la expresión del gen se realiza determinando el nivel de proteína ρ85β, mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, inmunohistoquímica o western blot. Finalmente, dado que la capacidad de traducción de PIK3R2 a proteína ρ85β se inhibe por el microARN-126, otra realización preferida incluye, como método indirecto de determinación de los niveles de ρ85β, la medida de los niveles de expresión del microARN-126.
El término "cantidad de referencia", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier valor o rango de valores derivado de la cuantificación del producto de la expresión del gen PIK3R2 en una muestra biológica control. En una realización preferida, la cantidad de referencia procede de una muestra biológica aislada que no comprende células tumorales (muestra biológica control), donde dicha muestra puede proceder del individuo del paso (a) o de otro individuo.
En otra realización preferida, el método de la invención además comprende: d. asignar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con estadio tumoral avanzado cuando la cantidad detectada en el paso (b) es superior a la cantidad de referencia. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "estadio tumoral avanzado" se refiere a la etapa o fase tumoral en la que las células neoplásicas o de crecimiento descontrolado han alcanzado capas profundas de tejido, y que puede cursar o no con metástasis. En el caso de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, cáncer de colon, las muestras con niveles de expresión de PIK3R2 (o bien de ρ85β) normales, es decir, no superiores a la cantidad de referencia, correlacionan con bajos grados de desarrollo tumoral, como por ejemplo, pero sin limitarnos, grados de 0 a A según la escala de estratificación de Dukes. Sin embargo, las muestras con un contenido elevado en producto de expresión del gen PIK3R2, es decir, con un nivel de expresión de este gen superior a la cantidad de referencia, presentan un mayor grado tumoral (grados a partir de A, es decir, B, C o D) que aquellas muestras con niveles de expresión de este gen normales. En este sentido, a mayor cantidad de producto de expresión del gen PIK3R2 en la muestra biológica analizada, más avanzado es el estadio tumoral del individuo del cual procede la misma. Por ello, en una realización más preferida de este aspecto de la invención, el cáncer es cáncer de colon. En ocasiones puede ocurrir que las células comprendidas en un tumor de estadio avanzado presenten un fenotipo invasivo o metastásico. El término "cáncer invasivo", tal y como aparece en la presente invención, se refiere al tipo de cáncer en el cual las células comprendidas en el tumor poseen capacidad para metastatizar a otros tejidos.
En una realización más preferida, el cáncer es cáncer de mama. En el caso de este tipo de cáncer, las muestras que presentan elevados niveles de expresión del gen PIK3R2 (o bien de ρ85β), es decir, niveles de expresión de este gen/proteína superiores a la cantidad de referencia, proceden de regiones alrededor de las cuales hay un elevado porcentaje de nodulos linfáticos que presentan células tumorales. Esto significa que las muestras con niveles de expresión de este gen superiores a la cantidad de referencia presentan células con mayor capacidad invasiva que las células comprendidas en las muestras con niveles normales de expresión de este gen. Por ello, en una realización aun más preferida, cuando el cáncer es cáncer de mama, el método de la invención que comprende los pasos (a) a (c) además comprende: d. asignar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con cáncer invasivo cuando la cantidad detectada en el paso (b) es superior a la cantidad de referencia.
Los pasos (b) y/o (c) del método de la invención pueden ser total o parcialmente automatizados, por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante un equipo robótico para la detección, en el paso (b), de la cantidad del gen PIK3R2 o del producto de expresión del gen PIK3R2 en la muestra biológica aislada.
Además de los pasos especificados anteriormente, el método de la invención puede comprender otros pasos adicionales, por ejemplo, aunque sin limitarnos, relacionados con el pre-tratamiento de la muestra biológica aislada previamente a su análisis.
Por tanto, el método de la invención es útil para establecer el diagnóstico (estadio), pronóstico y seguimiento de cáncer, detectar la presencia de metástasis ocultas y recidivas, monitorear la respuesta a un tratamiento e incluso para realizar muéstreos en la población. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer, de ahora en adelante "kit de la invención", que comprende los cebadores, sondas o anticuerpos, o cualquiera de sus combinaciones, necesarios para detectar la cantidad de producto de expresión del gen PIK3R2 en una muestra biológica aislada.
Los cebadores, sondas y/o anticuerpos comprendidos en el kit de la invención presentan complementariedad, y por tanto, capacidad de hibridación, con al menos un producto de la expresión del gen PIK3R2. Preferiblemente, el kit de la invención además comprende cebadores, sondas o anticuerpos, o cualquiera de sus combinaciones, complementarios al microARN-126. En general, el kit de la invención comprende todos aquellos reactivos necesarios para llevar a cabo el método de la invención descrito anteriormente. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, enzimas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, polimerasas, cofactores para obtener una actividad óptima de éstas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. El kit puede contener además otras moléculas, genes, proteínas o sondas de interés, que sirvan como controles positivos y negativos. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del kit de la invención para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer. En una realización preferida, el cáncer es cáncer de mama o de colon.
Por otro lado, cuando ρ85β se asocia con la subunidad catalítica p1 10a, el heterodímero formado tiene una mayor afinidad por el sustrato fisiológico presente en la membrana celular, lo que resulta en un aumento de la actividad PI3K y en progresión tumoral. Por ello, otro aspecto de la invención se refiere al uso de al menos un inhibidor del gen PIK3R2 o de sus productos de expresión para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En una realización preferida, el cáncer es cáncer de mama o de colon. En una realización más preferida, el cáncer es cáncer de mama.
En la presente invención se entiende por "inhibidor" todo compuesto que permite reducir, bloquear o eliminar la expresión del gen PIK3R2 o el transporte o actividad de alguno de sus productos de expresión. Ejemplos de inhibidores de este tipo son, aunque sin limitarnos, siRNAs o microRNAs complementarios al ARNm producto de la transcripción de este gen; o inhibidores de la proteína ρ85β como son, por ejemplo, aunque sin limitarnos: péptidos que deslocalicen ρ85β o que desplacen su asociación con p1 10.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Muestra el nivel de expresión, mediante Q-PCR, de ρ85β (PIK3R2, R2) (eje x) y p85cc (PIK3R1, R1 ) (eje y) en carcinomas de mama (BC) y de colon (CC). n=número de muestras. Inactivo: muestras con actividad PIK3 inactiva. Activo: muestras con actividad PIK3. Los valores de R2 son iguales o mayores que en el tejido normal adyacente. Los valores de R1 en los CC son iguales (R1 normalizado = 0) o menores (R1 <0) que en el tejido normal; los valores de R1 en los BC son menores (R1 normalizado entre -2 y -3); o exhiben pequeños cambios (R1 entre -1 y +1 ) con respecto al tejido normal. (*) Chi-cuadrado, P=0,016 (BC) y 0,012 (CC). Fig. 2. Muestra que el aumento en la expresión de ρ85β correlaciona con progresión tumoral. (a) Los niveles de p85cc y ρ85β se examinaron en Western Blot (WB) en diferentes muestras de BC y CC. Las gráficas muestran la intensidad de la señal de p85cc y ρ85β (indicado R1 y R2) en unidades arbitrarias (A.U.) normalizadas frente a Actina. Las flechas indican los niveles normales de expresión de p85cc y ρ85β. Los valores de mRNA (analizados por Q-PCR) de R2 y R1 normalizados se indican en la parte inferior, (b) Porcentaje de CC con niveles iguales (igual) o superiores (elevado) de PIK3R2 (R2) medido por Q-PCR en el tumor comparado con el tejido normal. Los tumores se agruparon según el grado de actividad de PI3K (activo/inactivo). (*) valor Chi-cuadrado para estos datos P=0,02. (c, d) Grado tumoral en muestras de carcinoma de colon (CC) con PI3K activa o inactiva (c), o en la colección completa de tumores (d) representado frente a los valores de expresión de R2 por Q-PCR. Los CC de grado entre 0-A se representan con los de grado 0. (**) Chi- cuadrado P=0,001 (c) y 0,002 (d). (e) Porcentaje de carcinomas de mama (BC) según los niveles de expresión de R2 medidos por Q-PCR. (*) Chi- cuadrado P=0,04. (f) Grado tumoral en BC con PI3K activa o inactiva en relación a los niveles de R2 por Q-PCR. n.s.; no significativo, (g) Invasión/metástasis de BC determinado como porcentaje de nodos linfáticos (LN) con células tumorales infiltradas con respecto a LN totales, representados frente a los niveles de R2. (**) test de Pearson P=0,002; se comparan muestras con R2 muy elevado (> 2), elevado (1 ) o igual al tejido adyacente normal (0). (***) Pearson P=0,0008. Fig. 3. Muestra el aumento de la activación de la ruta de PI3K en células que expresan ρ85β. (a) Células COS-7 se transfectaron con pSG5-p1 10cc combinado con pSG5-p85cc o -ρ85β (24 h), a continuación se incubaron (1 ) en medio sin suero (48 h); (2) algunas muestras se activaron posteriormente con suero (10%) o (3) PDGF (50 ng/ml) 10 min. Exponencial: células COS-7 en crecimiento exponencial. Control: células COS-7 sin transfectar. Muestra los niveles de expresión de proteína y activación de los efectores de PI3K (geles inferiores) examinados por WB, usando Actina como control, (b) Muestra la cuantificación de la señal de los efectores de PIK3 pPKB y pp70S6K de tres experimentos en células control y transfectadas (media ± Desviación estándar, n=3; AU). (c) Las células HeLa se transfectaron con ρ85β siRNA (100 nM, βΐ y 200 nM, β2), (24 y 48 h); se prepararon extractos y se ensayaron por WB para estudiar la eficiencia de los siRNA en la reducción de los niveles de ρ85β, así como la fosforilación de los efectores PKB y p70S6k, usando Actina como control. Ctr: extractos de células control, transfectadas con el siRNA control. Gráficas como en (b). (*) test t de Student P<0,01 .
Fig. 4. Muestra que ρ85β aumenta el contenido de PIP3 en la membrana e induce transformación celular, (a) Células NIH3T3 se transfectaron con GFP-Btk-PH en combinación con ρ85α/ρ1 10α, o ρ85β /ρ1 10α (24 h), se incubaron (19 h) en medio sin suero (quiescencia) o se activaron con suero (15 min; derecha). Control: células no transfectadas. La localización de PIP3 (GFP-Btk-PH) se examinó por microscopía de fluorescencia. Las flechas indican las secciones en las que se midió la señal de fluorescencia (AU). (b) Porcentaje de células con la señal de PIP3 concentrada en la membrana, el citosol o ambas (intermedio), y de las células con morfología discoidal, mesenquimal, o intermedia, (c) Ensayos de formación de focos representativos en células NIH3T3 control y en células transfectadas con ρ85α, ρ85β o V12-Ras (media ± Desviación estándar, n = 6). (**) test t de Student P<0,001 . Barra = 15 μιτι. EJEMPLOS
A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la especificidad y efectividad del método de la invención en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer, preferiblemente de mama y de colon. Estos ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con fines ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. EJEMPLO 1. Alteraciones en la ruta PI3K en tumores clínicos de colon y mama.
Se examinó el estado de la ruta de PI3K en una colección de adenocarcinomas de colon (CC) y de carcinomas ductales de mama (BC) comparándolos con el tejido adyacente normal. Se diseñó un protocolo para analizar estas muestras que incluyó análisis por inmunohistoquímica (IH), PCR cuantitativa (Q-PCR) y análisis por Western blot (WB).
Tanto las muestras de carcinoma de mama (BC) como de colon (CC) y las muestras de tejidos normales adyacentes fueron obtenidas de la colección de tumores del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO, Madrid, España).
En la inmunohistoquímica, las señales de intensidad estaban en un rango de 1 a 3 (1 , bajo nivel de tinción; 2 era > 3 veces superior al fondo; 3 era > 6 veces superior al fondo). Para el análisis por WB se lisaron secciones congeladas de las muestras en buffer RIPA; la señal de WB fue cuantificada y normalizada cargando controles de actina. Dichas señales fueron medidas en un rango de -2 hasta +2 (0 indica sin cambios, ±1 refleja un aumento o disminución de entre el 20% y el 50%; y ±2 cambios superiores al 50%). Para el análisis por Q-PCR, se obtuvo el ARNm de las muestras congeladas y se analizó en custom-designed TaqMan Low Density Arrays (LDA, Applied Biosystems) que contenía los cebadores y las sondas de los genes de PI3K y de sus reguladores. Como ARN molde para la transcripción reversa, se utilizó 1 ng de ARN total por muestra (triplicado).
La Q-PCR se realizó en un ABI PRISM 7900 HT (Applied Biosystems). Las sondas de LDA utilizadas fueron GAPDH (sonda Hs4342376), ACTB (Hs99999903), AKT1 (Hs00178289), AKT2 (Hs00609846), AKT3 (Hs00178533), IGF1 (Hs00153126), IGF1R (Hs00609566), IGF2 (Hs00171254), IGFBP3 (Hs00426287), SHIP1 (Hs00183290), PIK3CA (Hs00180679), PIK3CB (Hs00178872), PIK3CD (Hs00192399), PIK3CG (Hs00176916), PIK3R1 (Hs00236128), PIK3R2 (Hs00178181 ), PIK3R3 (Hs00177524) y PTEN (Hs00829813). Para PIK3CG y PIK3R1, también se utilizaron Hs00277090 y Hs00381459.
La cuantificación relativa de ARNm se determinó por el método AACt. Valores de 2_ΔΔα (<1 representa disminución y >1 representa aumento). Para facilitar la comparación, los diferentes valores se normalizaron en un rango de -3 hasta +3 (donde 0 indica sin cambios o insignificantes (2_ΔΔα entre 0,6-1 ,2); 1 -3 indica aumento, 1 (2" ct 1 ,2-3,0), 2 (2" ct 3,0-6,0), 3 (2_ΔΔα >6); y los valores negativos indican un descenso -1 (2_ΔΔα 0,6-0,3), -2 (2" ct 0,3-0,1 ), -3 (2" ct <0,1 )). Los anticuerpos primarios empleados para el WB fueron anti-fosfo-(p)- PKB (Ser473), -p-p70s6k (Thr389), -p-PKC (zeta-Thr410) de Cell Signaling; anti-pan-p85 PI3K, -humano p85cc y -PKB de Upstate Biotechnology; -p70S6K (C-18) y -PTEN (N-19) de Santa Cruz Biotechnology. Anti-HA (12CA5) era de Babeo y anti-β -actina de Sigma- Aldrich. El Anti-p1 10cc fue donado por A. Klippel. Los anticuerpos Anti- ρ85β PI3K (rat Ab 1 C8,) y anti-HA (12CA5) se utilizaron para la inmunoprecipitación (IP). Para los anticuerpos anti-p85 , se inmunizaron ratones con el péptido KLH-conjugado C-terminal (residuos 71 1 -722 de ρ85β) o ratas con un fragmento GST-fusionado en N-terminal. El anticuerpo Αηίί-ρ85β -específico fue testado en ELISA, WB e IP utilizando proteínas recombinantes de bacteria o células que expresaban los extractos Γ-ρ85β o r-p85cc . El anticuerpo de conejo K1 123 reconocía fuertemente ρ85β en WB y p85cc ligeramente. El anticuerpo monoclonal (mAb) de rata 1 C8 era eficiente en el reconocimiento de ρ85β por WB e IP, pero no reconocía p85cc; este mAb fue purificado por afinidad (kit GST; Pierce).
La inmunoprecipitación se realizó según lo descrito (Marqués M., et al., 2008, Mol Cell Biol., 28: 2803-2814). Para el WB, se lisaron las células en medio 1 % Tritón X-100 (TX-100) que contenía inhibidores de la proteasa y de la fosfatasa. Las líneas de tumores humanas se lisaron en medio RIPA conteniendo inhibidores de la proteasa e inhibidores de fosfatasa.
Para la IH, las primeras 10 muestras se analizaron utilizando anticuerpos (Ab) anti-fosfo-PKB (P-PKB), sin embargo, los anticuerpos anti-fosfo-S6 (p-S6; Cell Signalling) dieron una señal mejor y más consistente y por ello fueron utilizados para el resto de las muestras. Para examinar los niveles de ARNm de los miembros de la ruta de PI3K, se utilizaron las tarjetas TaqMan mencionadas (que denominaremos PIP-chip); para WB se utilizaron los anticuerpos anteriormente descritos que reconocen las distintas subunidades catalíticas y reguladoras de PI3K y sus reguladores. El análisis completo se llevó a cabo en un 95% de los CC y en un 85% de los BC.
Para los análisis estadísticos, la relación entre las variables del tumor fue ensayada mediante el test de Pearson y la contingencia de los parámetros de los tumores por el test de Chi-cuadrado se calcularon utilizando Prism5V.5.0b software. Las bandas de gel y la intensidad de la fluorescencia se cuantificaron mediante ImageJ software. El test t de Student se realizó utilizando StatView 512+.
La IH mostró que la mayoría de las muestras eran heterogéneas, ya que solo una fracción de las células tumorales en un determinado tumor era positiva para p-S6. Se clasificaron como muestras activas aquellas en que la proporción de positividad para p-S6 o p-PKB era mayor del 50%, o bien cuando eran altamente positivas un 30 a 40% de las células (3 en una escala de 1 a 3). La actividad PI3K también se ensayó por WB utilizando Ab anti-pPKB y -pp70S6K; aproximadamente el 80% de las muestras de carcinoma que fueron positivas por IH también fueron positivas por WB. Solo cuando la proporción de células positivas en un tumor era muy baja, no se detectaba positividad por WB. El análisis por IH y WB mostró que un tercio de las muestras de BC y un 55% de las muestras de CC tenían activada la ruta de PI3K, resultados dentro del rango de estudios previos. En CC, la actividad de esta ruta correlacionó con el estadio tumoral (de acuerdo con el criterio de Dukes, estratificación A a D) (DeVita V.T., et al., 2005, Philadelphia USA. P. 1239-1242). Para carcinoma de mama (BC, grados Bloom Richardson I a III) (Bloom M.J., et al., 1962, Br Med J. 5299, 213), la correlación no fue estadísticamente significativa aunque los tumores avanzados (grado ll/lll o III) presentaban frecuentemente PI3K activa, sin embargo, en estos tumores sí hubo correlación de niveles de ρ85β con invasividad como se muestra más adelante. Se examinó si el estado de activación de la ruta de PI3K correlacionaba con cambios en los niveles de ARNm de los principales reguladores de la vía de PI3K. Usando PIP-chip, se midieron los niveles de las subunidades catalíticas p1 10, las subunidades reguladoras p85, SHIP1 , PTEN y las isoformas de PKB, así como de los elementos de la vía de IGF. Este ensayo se complementó con la evaluación por WB de los niveles de proteína de la mayoría de estas moléculas en 10 muestras, aproximadamente. La alteración de los ARNm que codifican PTEN, ρ1 10α, β, o δ, ρ85α o β, ΡΚΒβ (ΑΚΤ2) y SHIP1 fue consistente con los cambios en la expresión de las proteínas correspondientes por WB (en el 75% o más de los casos examinados). La regulación postranscripcional o postraduccional podría explicar la falta de correlación en el 100% de los casos.
Los análisis PIP-chip y WB detectaron que, en una alta proporción de muestras de BC y CC con PI3K inactiva, la proteína PTEN tenía una elevada expresión; la diferencia en la expresión de PTEN entre las muestras con PI3K activa o inactiva fue significativa en el caso de BC (n=22).
Además de la mutación de PIK3CA, previamente observada en varios tipos de tumores, la expresión del ARNm de PIK3CB estaba incrementada en el 25% de los CC y en aproximadamente el 15% de los BC, mientras que la de PIK3CD estaba incrementada en el 20% de los BC y CC; se confirmaron estos cambios de expresión por WB en aproximadamente 10 muestras de tumores de cada tipo. PIK3CG también estaba incrementada en el 25% de los BC, pero ya que los WB mostraron muy bajos niveles de proteína, no está claro si este cambio contribuye al comportamiento del tumor. Aproximadamente el 30% de los CC y el 50% de los BC también mostraron aumento de los niveles de AKT2, aunque esto no correlacionó con la activación de la ruta, estadio tumoral o invasión de nodos linfáticos. Se observaron también patrones de expresión característicos de tipo tumoral. PIP-chip Q-PCR mostró que el 60% de los CC, y solo un 8% de los BC, exhibían aumento en la expresión de SHIP1, un fenotipo que se encontró principalmente en muestras activas en PI3K. La ruta de IGF estaba alterada en elevada frecuencia en BC (55%) y CC (85%), con aumentos en la expresión de IGF1 R, más frecuentes en BC, y aumento de los niveles de IGF2, más frecuentemente en CC. Sin embargo, la observación más sorprendente fue el cambio en la expresión de las subunidades reguladoras ubicuas de PI3K de clase IA.
EJEMPLO 2. Un aumento de los niveles de ρ85β en carcinoma de colon y mama correlaciona con progresión tumoral.
En tejidos normales p85cc (PIK3R1) se expresa habitualmente a niveles más altos que ρ85β (PIK3R2). Los análisis normalizados por Q-PCR en tarjetas PIP-chip mostraron que >50% de los carcinomas de colon y mama presentaban un aumento en la expresión de PIK3R2 (ρ85β). Además el aumento en los niveles de PIK3R2 se encontraba en muestras con descenso de los niveles de PIK3R1 (p85cc) (Fig. 1 ). El aumento de PIK3R2 por Q-PCR se confirmó en northern blot. Se prepararon anticuerpos específicos para p85 y se confirmaron los aumentos de expresión de ρ85β en CC y BC por WB (Fig. 2a).
A continuación, se evaluó si el aumento de expresión de ρ85β correlacionaba con la activación de la ruta de PI3K en CC. Se encontró que las muestras con niveles aumentados de ARNm de PIK3R2 se encontraban con mayor frecuencia en muestras de CC con PI3K activa (Fig. 2b). Además, mientras que los tumores con niveles de PIK3R2 normales tenían grados de 0 a 0-A, las muestras con elevado contenido en PIK3R2 eran de mayor grado (Fig. 2c). De hecho, la expresión de PIK3R2 correlacionaba con el grado tumoral (Fig. 2d). Así pues en CC el nivel de expresión de PIK3R2 se puede considerar un biomarcador de progresión tumoral.
Mientras que en CC la estratificación de Dukes describe la penetración de las células tumorales en las capas del tejido, en BC el criterio de Bloom Richardson (BR) describe la diferenciación celular, y para evaluar la invasividad se informa de la proporción de nodos linfáticos (LN) en el entorno del tumor que presentan células tumorales. En BC, aunque los niveles elevados de PIK3R2 se encontraban con mayor frecuencia en tumores con PI3K activa, los niveles de ARNnn de PIK3R2 también se encontraban aumentados en aproximadamente un 40% de muestras con PI3K inactiva (Fig. 2e). El aumento en los niveles de PIK3R2 no correlacionó con el grado Bloom Richardson (Fig. 2f), aunque en muestras activas los fenotipos malignos tenían altos niveles de PIK3R2 (Fig. 2f). Se examinó la posible correlación entre los niveles de ARNnn de PIK3R2 y el fenotipo invasivo/metastásico. El potencial invasivo se cuantificó como porcentaje de LN infiltrado por células tumorales; así, los niveles de PIK3R2 correlacionaron con capacidad metastásica (Fig. 2g).
Así, la comparación de los niveles de expresión de las subunidades catalíticas y reguladoras de PI3K mostró que el ARNm y la proteína de ρ85β (PIK3R2) aumentan en estos tumores (>50%). El aumento de ρ85β en carcinomas de colon correlacionó con el grado tumoral . Así pues, en colon, la medida de los niveles de PIK3R2 puede considerarse un biomarcador de progresión tumoral. En mama, mientras que los niveles de ρ85β aumentan en muestras con PI3K activo e inactivo, se encontraban más frecuentemente elevados en activos. En carcinoma de mama, el contenido de ρ85β correlacionó con invasión/metástasis. Por tanto, los niveles de PIK3R2 en mama pueden indicar la potencial recidiva del tumor y apoyar la decisión de la necesidad de administrar terapia adyuvante.
Por lo tanto, estos estudios muestran que la expresión de PIK3R2 es un biomarcador para progresión tumoral, ya que esta asociado al grado del tumor en CC y a invasividad en BC.
EJEMPLO 3. La activación de la ruta PI3K esta aumentada en células que expresan ρ85β. Para comparar las actividades de ρ85α/ρ1 10α y ρ85β/ρ1 10α in vivo, se examinó el estado de activación de distintos efectores de la ruta de PI3K en células que expresaban p1 10cc recombinante (r) y rp85cc o φ85β. Se cultivaron fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) y células NIH3T3, COS-7 y U2OS como se ha descrito anteriormente (Marqués M., et al., 2008, Mol Cell Biol., 28: 2803-2814). Las células fueron transfectadas con Lipofectamina (Invitrogen). El vector vacío pSG5, pSG5-p85cc, -V12Ras y myc-p1 10a ya han sido descritos con anterioridad. El plásmido pEGFP- PH-Btk que codifica el dominio PH de la Tirosina Kinasa de Bruton fue cedido por T. Baila (National Institutes of Health, Bethesda, MD). El vector pT7/T3-U19 que codifica para ρ85β murino fue cedido por J.W.G. Janssen (Institute fur Humangenetik, Heidelberg, Alemania). El ρ85β se subclonó en pSG5, introduciéndose un epítopo de hemaglutinina (HA) en N- terminal . El codon ρ85β ATG fue sustituido por una prolina y el codon HA- tag ATG se mantuvo (Quickchange mutagenesis kit; Stratagene). El siRNA control y para ρ85β eran de Dharmacon.
Para los ensayos celulares de PI3K, las células permanecían inactivas entre 19 (N IH3T3) ó 48 h (COS7) sin suero; algunas fueron tratadas 10 min en medio que contenía 10% de suero o 50 ng/ml de PDGF (Calbiochem). Los extractos se prepararon en un medio de lisis TX-100; se hizo una IP con la PI3K con el anticuerpo apropiado. Para la inmunofluorescencia, se fijaron las células en paraformaldehído al 4% en PBS (15 min), y se permeabilizaron en PBS con BSA al 1 % y 0,3% TX- 100, posteriormente se bloquearon con un 1 % de BSA, 10% de suero de cabra y 0,01 % TX-100 en PBS (30 min). La células se visualizaron utilizando un objetivo de 60 x 1 ,3NA PLOIL en un microscopio Olympus Fluoview 1000.
Tras transfectar células COS-7 con los ADNc adecuados se examinó la actividad de las dianas moleculares de PI3K en extractos de células quiescentes o activadas (10 min con medio conteniendo 10% de suero o 50 ng /mi de PDGF). ρ85β aparecía asociada a razón 1 :1 con p1 10cc, al igual que p85cc. Los niveles de expresión de p85cc y ρ85β fueron comparables; y también lo fue la expresión de rp1 10cc (aproximadamente 10 veces mayor que los niveles endógenos) (Fig. 3a). El tratamiento con PDGF o con suero aumentó la cantidad de p-PKB, p-p70s6k y ρ-ΡΚΟζ en las células control; la activación de estos efectores fue mayor en células que expresaban mayores niveles de p1 10a (Fig. 3a). Además, a pesar de la similitud de expresión de ρ85α/ρ1 10α y ρ85β/ρ1 10α, las células ρ85β/ρ1 10α, mostraron una mayor activación de los efectores de PI3K incluso en ausencia de suero (Fig. 3a y 3b). Un análisis similar en células NIH3T3 mostró un resultado parecido, aunque la expresión de rpH Occ fue solo aproximadamente 2 veces mayor al endógeno y la activación de la ruta en ausencia de suero fue menos prominente. Así pues, in vivo, ρ85β/ρ1 10α potenció la activación de la ruta de PI3K.
Para demostrar la contribución de ρ85β en el control de la activación de la ruta de PI3K in vivo, se redujeron los niveles ρ85β usando siRNA en células HeLa. El siRNA de ρ85β, pero no el siRNA control, redujo los niveles de ρ85β y de p-PKB y p-p70s6k en las células (Fig. 3c). Este resultado confirmó la contribución de ρ85β en el control de la activación de la ruta de PI3K en células transformadas.
Por tanto, la contribución de PIK3R2 en progresión tumoral sugiere que terapias dirigidas a reducir la expresión o la acción de ρ85β (como siRNAs) son de utilidad para el tratamiento del cáncer.
EJEMPLO 4. ρ85β aumenta los niveles de PIP3 de membrana e induce transformación celular. Para confirmar la mayor actividad de ρ85β/ρ1 10α por su sustrato fisiológico Ptdlns(4,5)P2, se examinó la formación de PIP3 in vivo co- transfectando ρ85β/ρ1 10α o ρ85α/ρ1 10α con la proteína verde fluorescente (GFP) fusionada al dominio PH de Btk, que une selectivamente PIP3. Se analizaron los niveles de Btk-PH en la membrana celular en células NIH3T3 quiescentes y tratadas con suero (10 min) que expresaban ρ85β/ρ1 10α o ρ85α/ρ1 10α.
Los niveles de expresión de Btk-PH fueron similares en células control y en las células transfectadas con ρ85β/ρ1 10α y ρ85α/ρ1 10α. En células control, Btk-PH se localizaba en el citoplasma y en el núcleo (Fig. 4a). La adición de suero produjo una relocalización de parte del Btk-PH a la membrana celular tanto en células control como en células ρ85α/ρ1 10α. Sin embargo, en células quiescentes ρ85β/ρ1 10α la mayoría de Btk-PH estaba en la membrana, y esta fracción aumentó al añadir suero (Fig. 4a). La cuantificación de la señal de fluorescencia en un número de muestras elevado (n=50) confirmó que este fenotipo era general (Fig. 4b). Además, la incubación con suero indujo un cambio de morfología discoidal/epitelial a mesenquimal (Fig. 4a). Comparado con células control, el porcentaje de células con morfología mesenquimal estaba levemente aumentado en células p85cc/p1 10 ya que estas expresan niveles más altos de p1 10cc (Fig. 4b). Además, una gran proporción de las células ρ85β/ρ1 10α mostraron esta morfología migratoria previamente a la adición de suero (Fig. 4b). Estos resultados indican que la expresión de ρ85β aumenta los niveles de PIP3 en la membrana y causa un fenotipo migratorio.
Dado el efecto de ρ85β en la actividad de PI3K, y la función de PI3K en la transformación celular, se utilizó un ensayo de formación de focos para ensayar la capacidad de p85β de inducir transformación. Mientras que la expresión de p85cc no transforma células NIH3T3, ρ85β era capaz de inducir formación de focos aunque en menor grado que V12-Ras (Fig. 4c). Estos resultados muestran que la progresión tumoral correlaciona con alteraciones en los niveles de las subunidades reguladoras de PI3K. El aumento de ρ85β y el descenso de p85cc causa un enriquecimiento en complejos ρ85β/ρ1 10α que tiene mayor afinidad por el sustrato fisiológico Ptdlns(4,5)P2. Esto aumenta la producción de PIP3 incluso en ausencia de factores de crecimiento explicando la capacidad transformante de ρ85β y su papel en progresión tumoral.
Estos ensayos muestran el distinto efecto de p85cc y ρ85β en la actividad de p1 10cc, ya que asociada a ρ85β, p1 10cc presenta una unión mayor a su sustrato fisiológico Ptdlns (4,5)P2. El aumento en los complejos ρ85β/ρ1 10α resulta en una mayor producción de PIP3 y, en consecuencia, en una mayor activación de los efectores de PI3K: PKB y p70s6k, incluso en ausencia de estímulo, proporcionado al tumor independencia de factor para su crecimiento. Finalmente, el aumento de expresión de la subunidad reguladora ρ85β es un evento frecuente en carcinomas de colon y mama que aumenta la actividad PI3K en ausencia de estímulo. La elevación de ρ85β es, por tanto, un factor pronóstico de progresión tumoral.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Uso del gen PIK3R2 o de sus productos de expresión para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer.
2. Uso del gen PIK3R2 o de sus productos de expresión según la reivindicación 1 donde el cáncer es cáncer de mama o de colon.
Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer que comprende: a. obtener una muestra biológica aislada que comprende células tumorales de un individuo,
b. detectar la cantidad de producto de expresión del gen PIK3R2 en la muestra biológica aislada de (a), y
c. comparar la cantidad detectada en el paso (b) con una cantidad de referencia.
Método según la reivindicación 3 que además comprende: d. asignar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con estadio tumoral avanzado cuando la cantidad detectada en el paso (b) es superior a la cantidad de referencia.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4 donde el cáncer es cáncer de colon.
Método según la reivindicación 3 donde el cáncer es cáncer de mama.
7. Método según la reivindicación 6 que además comprende: d. asignar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con cáncer invasivo cuando la cantidad detectada en el paso (b) es superior a la cantidad de referencia.
8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 donde la cantidad de referencia procede de una muestra biológica aislada que no comprende células tumorales.
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8 donde el individuo es un mamífero.
10. Método según la reivindicación 9 donde el mamífero es un humano.
1 1 . Kit para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer que comprende los cebadores, sondas o anticuerpos, o cualquiera de sus combinaciones, necesarios para detectar la cantidad de producto de expresión del gen PIK3R2.
12. Uso del kit según la reivindicación 1 1 para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer.
13. Uso del kit según la reivindicación 12 donde el cáncer es cáncer de mama o de colon.
14. Uso de al menos un inhibidor del gen PIK3R2 o de sus productos de expresión para la elaboración de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
15. Uso de al menos un inhibidor del gen PIK3R2 o de sus productos de expresión según la reivindicación 14 donde el cáncer es cáncer de mama o de colon.
PCT/ES2011/070451 2010-07-22 2011-06-21 Biomarcador para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de cáncer Ceased WO2012010728A1 (es)

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