WO2011151595A1 - Methode de revelation d'une substance toxique dans un echantillon - Google Patents

Methode de revelation d'une substance toxique dans un echantillon Download PDF

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WO2011151595A1
WO2011151595A1 PCT/FR2011/051247 FR2011051247W WO2011151595A1 WO 2011151595 A1 WO2011151595 A1 WO 2011151595A1 FR 2011051247 W FR2011051247 W FR 2011051247W WO 2011151595 A1 WO2011151595 A1 WO 2011151595A1
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cells
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collagen
epithelial cells
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Sylvia Sanquer
Robert Barouki
Laurence Herry
Céline TOMKIEWICZ-RAULET
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Universite Paris Descartes
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Universite Paris Descartes
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5026—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on cell morphology

Definitions

  • the invention relates to a simple method for revealing the presence of toxic substances in a sample, which is based on the demonstration of an epithelio-mesenchymal transition in the presence of said sample.
  • the epithelial-mesenchymal transition is a process in which the epithelial cells acquire an invasive fibroblastoid phenotype, the expression of the specific epithelial proteins (tight junction proteins such as E-cadherin) being repressed and that of the proteins of mesenchymal origin induced .
  • This process is involved both in physiological processes (such as embryogenesis or scarring) and in pathological processes (such as cancer, fibrosis and chronic inflammation associated with many pathologies).
  • the aryl hydrocarbon receptor the AhR receptor
  • This receptor is a transcription factor activated by a very large number of ligands including polycyclic, polyhalogenated aromatic hydrocarbons (including dioxins, furans, PCBs and some flame retardants), certain polyphenols of natural origin as well as derivatives of tryptophan and indoles. This observation demonstrates a potentially important involvement of the environment in the development of not only the epithelial mesenchymal, but also pathophysiological processes associated with it.
  • gel invasion assay tests that rely on epithelial cell invasion of three-dimensional gel collagen.
  • the epithelial cells are placed in the presence of a collagen gel after the polymerization of the collagen. The cells are thus placed on the surface of the collagen gel and their migration within the gel is analyzed by sophisticated imaging techniques.
  • the present invention is based on the demonstration of new properties of epithelial cells subjected to an epithelio-mesenchymal transition.
  • the inventors have discovered that these cells are capable of contracting a collagen gel when they undergo an epithelio-mesenchymal transition.
  • the appearance of the epithelio-mesenchymal transition is quantified by measuring the diameter of collagen gels prepared with epithelial cells in the presence or absence of a reaction medium conducive to the development of this process.
  • the present invention therefore relates to a method for revealing the presence of a toxic substance in a sample comprising the steps of: a) polymerizing a collagen gel in which a suspension of epithelial cells from a line has been previously placed immortalized cells;
  • step b) incubating the gel obtained in step a) with or without said sample;
  • the sample can be any type of sample in which it is desired to search for the presence of a toxic substance.
  • the sample may be a non-biological sample. It can be a specific chemical compound, natural or synthetic, pure, in solution in a solvent, or in a mixture of chemical compounds, or a sample taken from the environment (water taken from different points such as rivers, groundwater, sewage treatment plants etc., molecules contained in atmospheric air dissolved in a liquid etc.).
  • the sample is a biological sample for which it is desired to determine the possible toxicity.
  • biological sample is meant any culture medium, as well as any body fluid from a mammalian organism.
  • said mammal is a rodent (mouse, rat, etc.), a dog, a cat, a horse, or a primate. Even more preferably, said mammal is a man.
  • the biological sample may be blood, plasma, urine, cerebrospinal fluid, bronchoalveolar lavage fluid or amniotic fluid.
  • toxic substance any compound having the ability to induce an epithelio-mesenchymal transition when applied to epithelial cells in culture.
  • Such toxic substances are, for example, but not limited to:
  • the collagen gel according to the invention can be obtained by various techniques known to those skilled in the art.
  • a collagen solution can be obtained from various commercial sources, such as Sigma-Aldrich, under the reference C4243.
  • the collagen solution can be prepared from rat tail tendons or any other collagen-rich tissue.
  • a solution of coUagene or coUagene gel means a solution or a gel which contains coUagene, but which may contain other proteins. It may be a solution of pure coUagene, or of coUagene mixed with other components of the extracellular matrix.
  • An example of a gel containing coUagene is Matrigel® marketed by BD Biosciences.
  • the polymerization of the coUagene gel is obtained by adding a neutralizing solution, such as sodium hydroxide (NaOH).
  • a neutralizing solution such as sodium hydroxide (NaOH).
  • NaOH sodium hydroxide
  • the polymerization is obtained by placing the solution containing coUagene, the epithelial cells, in a neutral medium under conditions suitable for the culture of said cells (incubator at 37 °, under standardized conditions of CO 2, etc.).
  • kits comprising both the coUagene solution and the neutralization solution (for example the CBA-201 kit marketed by Cell Biolabs Inc.).
  • the epithelial cells useful for the method of the invention are any type of epithelial cell capable of undergoing an epithelio-mesenchymal transition from an immortalized cell line.
  • epithelial cell line is meant, without limitation, cells selected from:
  • HCC1500 HCC1599, HCC1937, HCC2157, HCC2218, HCC1569
  • Uterus RL95-2 Skin: TE 354.T, A-431, A431NS, A253
  • Thyroid TT, SW579
  • the epithelial cells are cells for which an epithelio-mesenchymal transition has already been demonstrated experimentally. These are HepG2, HaCaT and MCF-7 human cells, and murine NmuMG and EpH4 lines.
  • the epithelial cells are HepG2 cells.
  • the epithelial cells are HaCaT cells.
  • a suspension of epithelial cells in a suitable culture medium is mixed with the coUagene solution before the polymerization of said coUagene gel.
  • the ratio may vary between 10 5 cells per mg of coUagene to 10 7 cells per mg of coUagene.
  • the total volume before polymerization may also vary, so that the concentration of coUagene in the final gel may vary, preferably between 0.1 mg of coUagene per ml of gel and 10 mg of coUagene. Even more preferably, the concentration of coUagene in the final gel is of the order of 0.5 mg per ml, 1 mg per ml, 1.5 mg / ml, 2 mg / ml, or 2.5 mg / ml.
  • the density of epithelial cells within the coUabir gel can typically vary between 0,1x10 e cells per ml of gel and 10x10 e cells per mL.
  • the density of cells within the final gel is of the order of 0.2 ⁇ 10 6 cells per mL, 0.3 ⁇ 10 6 cells per mL, 0.4 ⁇ 10 6 cells per mL, 0.5 ⁇ 10 6 cells per mL , 0,55xl0 6 cells per mL, 0,6xl0 6 cells per mL, 0,7x10 6 cells per mL, 0,8x10 6 cells per mL, 0,9x10 6 cells per ml, 1x10 cells per mL, 1.5x10 e cells per mL, 2x10 6 cells per mL, or 5x10 6 cells per mL.
  • the contraction of said gel can be measured in different ways.
  • the coUagene gel is detached from the well of the culture plate and can then retract freely.
  • the diameter of the gel can then be measured easily. This step can easily be automated using an optical microscope and image processing software.
  • the present invention also relates to a kit for revealing the presence of a toxic substance in a sample comprising:
  • the positive control of the kit according to the invention is dioxin.
  • the present invention also relates to the use of a collagen gel comprising epithelial cells to demonstrate an epithelio-mesenchymal transition of said epithelial cells.
  • the present invention also relates to the use of a collagen gel comprising epithelial cells to reveal the presence of a toxic substance in a sample.
  • these screens can be used to automatically determine the potentially toxic effects of chemical molecules placed on the market.
  • the European REACH regulation registration requirement, Evaluation and Authorization, CHemicals restriction
  • high throughput screenings of samples taken from the environment in the context of pollution controls polylution of water, air, etc.
  • epithelial cells in vitro culture develop an epithelio-mesenchymal transition in the presence of growth factors such as EGF, FGF and PDGF (Huber 2005, Peinado 2007, Polyak 2009, Thiery 2006).
  • growth factors such as EGF, FGF and PDGF
  • TGF- ⁇ , TNF-cc, and IL- ⁇ are also capable of inducing epithelio-mesenchymal transition (Willis, 2007, Zhang, 2009, Borthwick, 2010).
  • TGF- ⁇ , TNF-cc, and IL- ⁇ are also capable of inducing epithelio-mesenchymal transition.
  • the simultaneous presence of these different factors has a synergistic effect on the development of epithelial-mesenchymal transition (Borthwick, 2010).
  • Figure 1 shows the measurement of contraction of collagen gels containing a suspension of HepG2 cells in the presence or absence of dioxin.
  • Figure 2 shows the change in the morphology of the dioxin-treated cells for 3 days and in particular the modification of the cytoskeleton (the cells were labeled with an anti-actin antibody and an anti-paxillin antibody).
  • HepG2 cells were cultured according to standard protocols.
  • Collagen was prepared from rat tail tendons according to conventional protocols. The culture medium and the cell concentration, and the proportions of the different constituents were adapted to the epithelial cells.
  • the collagen gels were prepared in a sterile tube placed in an ice bath by mixing the following constituents: 5 volumes of DMEM + 10% S VF, 3 volumes of collagen in acid medium, a few drops of NaOH O. IN to neutralize media and 1 volume of epithelial cell suspension (5x10 6 cells / ml). The mixture was then rapidly transferred to 6 or 24-well culture plates (5 or 2 ml per well), and the plates immediately placed in an oven at 37 ° C in the presence of 5% CO 2 and in a humid atmosphere.
  • the gel polymerized in a few minutes after the neutralization of the acidity of the collagen solution and the raising of the temperature. About 2 hours after manufacture, the gels were peeled off the well walls by gentle shaking to then obtain regular contraction if the epithelial cells underwent an epithelial-mesenchymal transition.
  • Collagen gels were prepared with epithelial cells (hepG2) and treated with or without dioxin at 25 nM. Two independent experiments were performed and each condition was evaluated in triplicate cultures. The diameters of the gels were measured daily.
  • the gels were rinsed with 0.9% NaCl solution, then fixed with 10% formalin solution, dehydrated and embedded in a paraffin block. Immunolabeling with actin and paxillin was then performed to visualize the cytoskeleton of the cells and to look for the presence of adhesion molecules.
  • the collagen gels are prepared with HepG2 epithelial cells as described in Example 1.
  • Example 1 For the detection of toxic substances in the patients' plasma, the S VF used in Example 1 is replaced by:
  • TGF-beta-induced EMT Mechanisms and implications for fibrotic lung disease.

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Abstract

L'invention a pour objet une méthode pour révéler la présence d'une substance toxique dans un échantillon comprenant les étapes consistant à : a) polymériser un gel de collagène dans lequel a été préalablement placée une suspension de cellules épithéliales provenant d'une lignée de cellules immortalisées; b) incuber le gel obtenu à l'étape a) avec ou sans ledit échantillon; c) mesurer le diamètre du gel.

Description

METHODE DE REVELATION D'UNE SUBSTANCE TOXIQUE DANS
UN ECHANTILLON
L'invention a pour objet une méthode simple de révélation de la présence de substances toxiques dans un échantillon, qui repose sur la mise en évidence d'une transition épithélio-mésenchymateuse en présence dudit échantillon.
La transition épithélio-mésenchymateuse est un processus au cours duquel les cellules épithéliales acquièrent un phénotype fibroblastoïde invasif, l'expression des protéines épithéliales spécifiques (protéines des jonctions serrées telles que la E-cadhérine) étant réprimée et celle des protéines d'origine mésenchymateuse induite.
Ce processus est impliqué aussi bien lors de processus physiologiques (comme l'embryogenèse ou la cicatrisation) que pathologiques (comme le cancer, la fîbrose et l'inflammation chronique associée à de nombreuses pathologies).
Des études récentes ont montré que certains polluants environnementaux avaient un effet sur la transition épithélio-mésenchymateuse.
En effet, le récepteur aux aryl hydrocarbures, le récepteur AhR, est impliqué dans les changements morphologiques et le remodelage du cytosquelette liés à la transition épithélio-mésenchymateuse et à la migration cellulaire (Diry et coll, 2006, Oncogene ; Bui et coll, 2009, Oncogene). Ce récepteur est un facteur transcriptionnel activé par un très grand nombre de ligands incluant les hydrocarbures aromatiques poly cycliques, polyhalogénés (incluant les dioxines, les furanes, les PCB et certains retardateurs de flamme), certains polyphénols d'origine naturelle ainsi que des dérivés du tryptophane et d'indoles. Cette observation démontre une implication potentiellement importante de l'environnement dans le développement, non seulement de la transition épithélio- mésenchymateuse, mais également des processus physiopathologiques qui y sont associés.
Jusqu'à présent, la caractérisation de la transition épithélio-mésenchymateuse reposait principalement sur des techniques d'immunomarquage pour la mise en évidence des modifications du cytosquelette des cellules épithéliales. Ces techniques qualitatives sont fastidieuses à mettre en œuvre pour des études à large échelle. Dans une revue récente, Moreno-Bueno et al. ont décrit les différentes méthodes utilisées pour caractériser la transition épithélio-mésenchymateuse (Moreno- Bueno et al. 2009. Nature Protocols).
Parmi celles-ci figurent des techniques reposant sur l'analyse morphologique et phénotypique de cellules cultivées en monocouche (immuno fluorescence, Western blot, RT-PCT, microarrays, test de réparation de lésions induites par une blessure).
Ce document décrit également des tests qui reposent sur l'invasion par les cellules épithéliales de gels tridimensionnels de collagène (« gel invasion assay »). Dans ce test, les cellules épithéliales sont mises en présence d'un gel de collagène après la polymérisation du collagène. Les cellules sont donc placées à la surface du gel de collagène et leur migration au sein du gel est analysée par des techniques d'imagerie sophistiquées.
Aucun des tests décrits ci-dessus ne permet d'envisager des tests de criblage à haut débit quantitatifs reposant sur la mise en évidence d'une transition épithélio- mésenchymateuse . DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention repose sur la mise en évidence de nouvelles propriétés des cellules épithéliales soumises à une transition épithélio-mésenchymateuse. En effet, les inventeurs ont découvert que ces cellules sont capables de contracter un gel de collagène lorsqu'elles sont soumises à une transition épithélio- mésenchymateuse. L'apparition de la transition épithélio-mésenchymateuse est quantifiée en mesurant le diamètre de gels de collagène préparés avec des cellules épithéliales en présence ou non d'un milieu réactionnel propice au développement de ce processus.
La présente invention a donc pour objet une méthode pour révéler la présence d'une substance toxique dans un échantillon comprenant les étapes consistant à : a) polymériser un gel de collagène dans lequel a été préalablement placée une suspension de cellules épithéliales provenant d'une lignée de cellules immortalisées;
b) incuber le gel obtenu à l'étape a) avec ou sans ledit échantillon ;
c) mesurer le diamètre du gel. Selon la présente invention, l'échantillon peut être n'importe quel type d'échantillon dans lequel on souhaite rechercher la présence d'une substance toxique.
Dans un mode de réalisation, il peut s'agir d'un échantillon non biologique. Il peut s'agir d'un composé chimique déterminé, naturel ou de synthèse, pur, en solution dans un solvant, ou au sein d'un mélange de composés chimiques, ou d'un échantillon prélevé dans l'environnement (eau prélevée dans différents points tels que rivières, nappes phréatiques, stations d'épuration etc., molécules contenues dans l'air atmosphérique dissoutes dans un liquide etc.). Dans un autre mode de réalisation, l'échantillon est un échantillon biologique dont on cherche à déterminer la toxicité éventuelle. Par «échantillon biologique », on entend tout milieu de culture, ainsi que tout fluide corporel issu d'un organisme mammifère. De préférence, ledit mammifère est un rongeur (souris, rat etc.), un chien, un chat, un cheval, ou un primate. De manière encore plus préférée, ledit mammifère est un homme.
Typiquement, l'échantillon biologique peut être du sang, du plasma, de l'urine, du liquide céphalo-rachidien, du liquide de lavage broncho-alvéolaire ou du liquide amniotique.
On entend ici par substance toxique tout composé ayant la capacité d'induire une transition épithélio-mésenchymateuse lorsqu'il est appliqué à des cellules épithéliales en culture.
De telles substances toxiques sont par exemple, de manière non limitative :
des substances environnementales comme la dioxine, le benzène et ses dérivés etc.
des substances biologiques telles que des molécules inflammatoires, fïbrosantes etc.
Le gel de collagène selon l'invention peut être obtenu par différentes techniques, connues de l'homme du métier.
Typiquement, une solution de collagène peut être obtenue auprès de différentes sources commerciales, telles que Sigma- Aldrich, sous la référence C4243.
De manière alternative, la solution de collagène peut être préparée à partir de tendons de queue de rat ou de tout autre tissu riche en collagène. Typiquement, par solution de coUagène ou gel de coUagène, on entend une solution ou un gel qui contiennent du coUagène, mais qui peuvent contenir d'autres protéines. Il peut s'agir d'une solution de coUagène pur, ou bien de coUagène en mélange avec d'autres composants de la matrice extracellulaire. Un exemple de gel contenant du coUagène, est le Matrigel® commercialisé par BD Biosciences.
La polymérisation du gel de coUagène est obtenue par ajout d'une solution neutralisante, telle que la soude (NaOH). En effet, les molécules de coUagène, qui sont à l'état de monomères dans la solution acide, polymérisent à pH neutre.
La polymérisation est obtenue en plaçant la solution contenant le coUagène, les cellules épithéliales, en milieu neutre dans des conditions adaptées à la culture desdites cellules (incubateur à 37°, dans des conditions standardisées de C02 etc.).
Il existe également des kits comprenant à la fois la solution de coUagène et la solution de neutralisation (par exemple le kit CBA-201 commercialisé par Cell Biolabs Inc.). Les cellules épithéliales utiles pour la méthode de l'invention sont tout type de cellules épithéliales susceptible de subir une transition épithélio- mésenchymateuse provenant d'une lignée de cellules immortalisées.
Par lignée de cellules épithéliales, on entend, de manière non limitative, des cellules choisies parmi:
- les cellules épithéliales dérivées d'un adénocarcinome
Cellules d'origine humaine :
Col cervical : HeLa, Hela 229, Hela S3, HlHeLa, Hs 588.T
Colorectal : NCI-H548, Hs 255. T, SW837, NCI-H716, NCI-H747, NCI-H508,NCI-H498, WiDr, COLO 320DM, COLO 320HSR,
DLD-1, HCT-15, SW480, SW403, SW48, SW1116, SW948, SW1417, LS123, LS 180, LS 174T, C2BBel, Hs257.T, Hs 587.1nt, Caco-2, HT-29, Hs 207.T, SW1463, Hs 200.T, Hs 219.T, HCT-8 Duodénum : HuTu 80 Rein : A704, SW 839, ACHN, 786-0, 769-P
Poumon : NCI-H1373, NCI-H1395, Hs 618.T, SK-LU-1, Hs
229.T, NCI-H1581, NCI-H23, NCI-H522, NCI-H1435, NCI-
H1563, NCI-H1734, NCI-H1651, NCI-H1793, NCI-H1838, NCI-
H1975, NCI-H2073, NCI-H2085, NCI-H2228, NCI-H2342, NCI-
H2347, NCI-H2066, NCI-H2286, NCI-H1703
Glandes Mammaires : Hs 274.T, Hs 280.T, Hs 281.T, Hs 343.T, Hs
362.T, Hs 739.T, Hs 741. T, Hs 742.T
Glandes pituitaires : HP75
Ovaire : Caov-3, T0V-21G, T0V-112D
Pancréas : BxPC-3, HPAF-II, HPAC, Pane 03.27, Pane 08.13,
Pane 02.03, Pane 02.13, Capan-2, CFPAC-1, PL45, MPanc-96,
Pane 10.05
Prostate : C A-HP V- 10
Utérus : KLE, HEC-l-A, HEC-l-B
Estomac : AGS, RF- 1
Cellules d'origine non humaine :
Souris : JC, LTPA, TRAMP-C2, WR21, RAG, LA-4, aTCl, NIT-2 Rat : 13762 MAT B III, NMU, RBA, SMT/2A LNM, RC-4B/C Cochon d'Inde : GPC-16
- les cellules épithéliales dérivées d'un carcinome
Cellules d'origine humaine :
Glandes adrénales : NCI-H295R, NCI-H295, SW-13
Vessie : Hs 195.T, Hs 228.T, Hs 172.T, 5637, HT-1376, HT-1197,
UM-UC-3, SW 780, J82, SCaBER, T24, TCCSUP
Uretère : Hs 789.T
Urètre : Hs 769.T
Rein : A-498, Caki-2
Col cervical : C-4 I, C-4 II, DoTc2 4510, C-33 A, SW756, SiHa Vulve : SW 954
Poumon : A549, A-427, NCI-H596, SW 1573, NCI-H358, NCI- H1688, NCI-H1417, NCI-H1672, NCI-H1836, HLF-a, NCI-H810, NCI-H292, NCI-H2126, Calu-6, DMS 79, DMS 53, DMS 114, SW 1271, NCI-H2227, NCI-H1963, SHP-77, H69AR, NCI-H2170, NCI-H520, SW 900, NCI-N417
Glandes mammaires : Hs 540.T, Hs 566(B).T, Hs 605. T, Hs 606,
BT-20, UACC-812, HCC1954, Hs 574.T, BT-483, BT-549,
DU4475, Hs 578.T, BT-474, HCC1806, UACC-893, HCC38,
HCC70, HCC202, HCC1143, HCC1187, HCC1395, HCC1419,
HCC1500, HCC1599, HCC1937, HCC2157, HCC2218, HCC1569
Ovaires : Hs 38.T, Hs 571. T, ES-2
Pancréas : MIA PaCa-2, PANC-1
Prostate : 22Rvl
Estomac : Hs T40.T, SNU-1
Utérus : RL95-2 Peau : TE 354.T, A-431, A431NS, A253
Colorectal : SNU-C2B, SNU-C2A, LS513, LS1034, LS411N, HCT 116, Hs 722.T
Testicules : Cates-1B
Glandes salivaires : A-253
Foie : C3A, SNU-398, SNU-449, SNU-182, SNU-475, Hep 3B2.1- 7, PLHC-1, SNU-387, SNU-423
Thyroïde : TT, SW579
Pharynx : FaDu
Langue : SCC-15, SCC-4, SCC-25, SCC-9, CAL 27 Placenta : BeWo, JAR, JEG-3
Cellules d'origine non humaine :
Souris : CT26.WT, CT26.CL25, NFPE, PFHR 9, ES-E14TG2a,
ES-D3 GL, CMHla, CSMab6C, CSMablH, SCA-9, MTC-M,
Erlich-Lettre ascites, TGP49, TGP47, F9, LL/2, CMT-93
Rat : L2-RYC, DSL-6A/C1, DSL-6B/C2, LLC-WRC 256, AT3B-
1, MAT-Ly-Lu-B-2, 6-23, FAT 7
Poulet : LMH, LMH/2A
Lapin : VX7
De manière préférée, les cellules épithéliales sont des cellules pour lesquelles une transition épithélio-mésenchymateuse a déjà été mise en évidence de manière expérimentale. Il s'agit des cellules humaines HepG2, HaCaT et MCF-7, et des lignées murines NmuMG et EpH4.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules épithéliales sont des cellules HepG2.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, les cellules épithéliales sont des cellules HaCaT.
Selon la méthode de l'invention, une suspension de cellules épithéliales dans un milieu de culture approprié est mélangée à la solution de coUagène, avant la polymérisation dudit gel de coUagène. L'homme du métier saura déterminer, par des tests de routine, le ratio optimal entre les cellules et le coUagène pour chaque type de cellules utilisées. Typiquement, le ratio pourra varier entre 105 cellules par mg de coUagène à 107 cellules par mg de coUagène.
Le volume total avant polymérisation pourra également varier, de sorte que la concentration en coUagène dans le gel final pourra varier, de manière préférée, entre 0,lmg de coUagène par mL de gel et 10 mg de coUagène. De manière encore plus préférée, la concentration en coUagène dans le gel final est de l'ordre de 0,5mg par mL, 1 mg par mL, 1,5 mg/mL, 2 mg/mL, ou 2,5mg/mL. De même, la densité de cellules épithéliales au sein du gel de coUagène pourra typiquement varier entre 0,1x10e cellules par mL de gel et 10x10e cellules par mL. De manière préférée, la densité de cellules au sein du gel final est de l'ordre de 0,2x106 cellules par mL, 0,3x106 cellules par mL, 0,4x106 cellules par mL, 0,5x106 cellules par mL, 0,55xl06 cellules par mL, 0,6xl06 cellules par mL, 0,7x106 cellules par mL, 0,8x106 cellules par mL, 0,9x106 cellules par mL, 1x10 cellules par mL, 1,5x10e cellules par mL, 2xl06 cellules par mL, ou 5x 106 cellules par mL.
Une fois que le gel de coUagène comprenant les cellules épithéliales a polymérisé, la contraction dudit gel peut être mesurée de différentes manières.
Dans mode de réalisation préféré, le gel de coUagène est détaché du puits de la plaque de culture et peut alors se rétracter librement. Le diamètre du gel peut alors être mesuré aisément. Cette étape peut facilement est automatisée à l'aide d'un microscope optique et d'un logiciel de traitement d'image.
La présente invention a également pour objet un kit pour révéler la présence d'une substance toxique dans un échantillon comprenant :
a) une solution de coUagène ;
b) des cellules épithéliales ;
c) une substance toxique servant de témoin positif et permettant la calibration ; d) éventuellement, une notice explicative indiquant que les cellules épithéliales doivent être suspendues dans la solution de collagène avant sa polymérisation et que le diamètre du gel de collagène doit être mesuré pour indiquer la présence d'une substance toxique.
Comme substance toxique pouvant servir de témoin positif et permettant la calibration du test, on pourra utiliser n'importe quelle substance toxique connue pour induire une transition épithélio-mésenchymateuse. Typiquement, le témoin positif du kit selon l'invention est la dioxine.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un gel de collagène comprenant des cellules épithéliales pour mettre en évidence une transition épithélio-mésenchymateuse desdites cellules épithéliales.
L'étude de ce phénomène trouve notamment des applications dans l'analyse toxicologique d'échantillons, qu'il s'agisse d'échantillons environnementaux ou d'échantillons biologiques humains. Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un gel de collagène comprenant des cellules épithéliales pour révéler la présence d'une substance toxique dans un échantillon.
Parmi ces différentes applications, on pourra citer, à titre illustratif et de manière non limitative :
- les criblages de toxicité à haut débit:
Dans un premier aspect, ces criblages peuvent servir à déterminer de manière automatisée les effets potentiellement toxiques de molécules chimiques mises sur le marché. A titre d'exemple, le règlement européen REACh (obligation d'enREgistrement, Evaluation et Autorisation, restriction des produits CHimiques) en vigueur depuis le 1er juin 2007 impose de tester la toxicité de toute substance chimique. Sont également envisagés selon l'invention des criblages à haut débit d'échantillons prélevés dans l'environnement dans le cadre de contrôles de pollution (pollution de l'eau, de l'air etc.).
- l'analyse de la toxicité d'échantillons biologiques
Certaines molécules présentes dans des échantillons biologiques sont susceptibles de provoquer une transition épithélio-mésenchymateuse. Ainsi des cellules épithéliales en culture in vitro développent une transition épithélio- mésenchymateuse en présence de facteurs de croissance tels que EGF, FGF et PDGF (Huber, 2005 ; Peinado, 2007 ; Polyak, 2009 ; Thiery, 2006). Des facteurs impliqués fortement dans les processus inflammatoires, tels que TGF-β, TNF-cc et IL-Ιβ, sont également capables d'induire une transition épithélio- mésenchymateuse (Willis, 2007 ; Zhang, 2009 ; Borthwick, 2010). La présence simultanée de ces différents facteurs a un effet synergique sur le développement de la transition épithélio-mésenchymateuse (Borthwick,2010). Ceci suggère que l'association de plusieurs facteurs pourrait induire le développement d'une transition épithélio-mésenchymateuse, y compris lorsque ces facteurs sont présents à des concentrations inférieures à celles établies pour avoir un rôle dans le développement d'une transition épithélio-mésenchymateuse. La révélation précoce et non invasive du développement d'une transition épithélio- mésenchymateuse pourrait être utile pour prédire des réactions indésirables de l'organisme dans différentes situations. Par exemple, il est connu que, chez des patients transplantés pulmonaires, il existe un risque de complications de type d'inflammation chronique qui peut provoquer une fïbrose pulmonaire et résulter en une bronchiolite oblitérante. Le traitement de notre modèle cellulaire de mise en évidence de transition épithélio-mésenchymateuse par du plasma et/ou des liquides de lavage broncho-alvéolaire issus de patients transplantés pulmonaires devrait permettre de révéler de manière précoce des substances toxiques dans ces échantillons biologiques et ainsi de prédire un risque accru du développement d'une bronchiolite oblitérante chez certains de ces patients. L'invention sera mieux comprise à la lecture des figures et exemples ci-dessous. Ces exemples sont présentés à titre illustratif et ne sauraient limiter la portée de la présente invention en aucune manière.
La Figure 1 représente la mesure de la contraction des gels de collagène contenant une suspension de cellules HepG2 en présence ou en l'absence de dioxine.
La Figure 2 montre la modification de la morphologie des cellules traitées par la dioxine pendant 3 jours et en particulier la modification du cytosquelette (les cellules ont été marquées par un anticorps anti-actine et un anticorps anti- paxilline).
EXEMPLE 1
Mise en évidence des effets de la dioxine sur la transition épithélio- mésenchymateuse
Matériel et méthodes
Culture des cellules épithéliales
Des cellules HepG2 ont été cultivées selon des protocoles classiques.
Préparation des gels de collagène au sein desquels sont placées les cellules épithéliales
Le collagène a été préparé à partir de tendons de queues de rat selon des protocoles classiques. Le milieu de culture et la concentration en cellules, et les proportions des différents constituants ont été adaptés aux cellules épithéliales. Les gels de collagène ont été préparés dans un tube stérile placé dans un bain de glace en mélangeant les constituants suivants : 5 volumes de DMEM + 10% S VF, 3 volumes de collagène en milieu acide, quelques gouttes de NaOH O. IN pour neutraliser les milieux et 1 volume de suspension de cellules épithéliales (5xl06 cellules/ml). Le mélange a alors été rapidement transféré dans des plaques de culture 6 ou 24 puits (5 ou 2 ml par puits), et les plaques immédiatement placées dans une étuve à 37°C en présence de 5% de C02 et en atmosphère humide. Le gel a polymérisé en quelques minutes après la neutralisation de l'acidité de la solution de collagène et l'élévation de la température. Environ 2 heures après la fabrication, les gels ont été décollés des parois des puits par une agitation douce afin d'obtenir ensuite une contraction régulière si les cellules épithéliales subissaient une transition épithélio-mésenchymateuse.
Des gels de collagène ont été préparés avec des cellules épithéliales (hepG2) et traités ou non par la dioxine à la concentration 25 nM. Deux expériences indépendantes ont été réalisées et chaque condition a été évaluée dans des cultures en triplicate. Les diamètres des gels étaient mesurés quotidiennement.
Immunomarquages
A différents temps, les gels ont été rincés par une solution de NaCl à 0,9%, puis fixés à l'aide d'une solution de formol 10%>, déshydratés et inclus dans un bloc de paraffine. Des immunomarquages par l'actine et la paxilline ont ensuite été réalisés pour visualiser le cytosquelette des cellules et rechercher la présence de molécules d'adhésion.
Résultats
Comme l'indique la figure 1, l'ajout de dioxine dans le milieu de culture des gels de collagène contenant les cellules HepG2 a provoqué une importante contraction des gels de collagène. Cette contraction était visible et significative dès 2 jours de culture, par rapport aux conditions témoin sans ajout de dioxine. Les différences de diamètre observées étaient bien dues à une modification du cytosquelette des cellules épithéliales. En effet, des expériences d'immunomarquage ont montré une réorganisation du cytosquelette d'actine avec l'apparition de prolongements marqués par les anticorps anti-actine dans les cellules traitées, ainsi que l'apparition progressive de points focaux d'adhésion marqués par la paxilline (voir figure 2). Les cellules HepG2 commencent alors à émettre des prolongements et prennent un aspect fïbroblastoïde alors que les cellules HepG2 témoin non traitées par la dioxine conservent une morphologie de cellule épithéliale. Cette différence de morphologie explique les différences de diamètre observées.
Conclusion
Ce test permet donc de visualiser et de quantifier de manière aisée la transition épithélio-mésenchymateuse induite par différentes substances toxiques, telle que la dioxine.
Des résultats similaires ont été obtenus avec des cellules HaCaT.
EXEMPLE 2
Mise en évidence de la présence de substances toxiques au sein de plasmas et/ou de liquide de lavage broncho-alvéolaire chez certains patients transplantés pulmonaires
Les gels de collagène sont préparés avec des cellules épithéliales HepG2 comme il est décrit dans l'exemple 1.
Pour la mise en évidence de substances toxiques dans le plasma des patients, le S VF utilisé dans l'exemple 1 est remplacé par :
du plasma issu d'un pool de plasma préparé à partir de sujets sains pour les gels de collagène "témoins*
- du plasma issu des patients transplantés pulmonaires à différents temps après la transplantation pour les gels de collagène "traités* Pour la mise en évidence de substances toxiques dans le liquide de lavage broncho-alvéolaire, le SVF utilisé dans l'exemple 1 est remplacé par ;
un pool de lysat cellulaire préparé à partir du liquide de lavage bronchoalvéolaire obtenus chez une vingtaine de patients environ 1 mois après la transplantation pulmonaire (ne souffrant pas de fibrose pulmonaire) pour les gels de collagène "témoins*
du lysat cellulaire issu du liquide de lavage broncho-alvéolaire des patients transplantés pulmonaires à différents temps après la transplantation pour les gels de collagène "traités*
- d'un pool de surnageant lyophilisé préparé à partir des liquides de lavage broncho-alvéolaire obtenus chez une vingtaine de patients environ 1 mois après la transplantation pulmonaire (ne souffrant pas de fibrose pulmonaire) pour les gels de collagène "témoins*
du surnageant lyophilisé préparé à partir du liquide de lavage broncho- alvéolaire des patients transplantés pulmonaires à différents temps après la transplantation pour les gels de collagène "traités*
Chaque condition est évaluée dans des cultures en triplicate, et les diamètres des gels sont mesurés quotidiennement pendant une semaine.
Pour confirmer nos résultats, des immuno marquages par l'actine et la paxilline sont réalisés pour visualiser le cytosquelette des cellules et rechercher la présence de molécules d'adhésion. On observe une contraction plus importante par rapport aux conditions témoin pour les gels de collagène qui ont été traités par des fluides biologiques (plasma ou liquide de lavage broncho-alvéolaire) provenant de patients transplantés pulmonaires qui développent une bronchiolite oblitérante. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode pour révéler la présence d'une substance toxique dans un échantillon comprenant les étapes consistant à :
a) polymériser un gel de collagène dans lequel a été préalablement placée une suspension de cellules épithéliales provenant d'une lignée de cellules immortalisées;
b) incuber le gel obtenu à l'étape a) avec ou sans ledit échantillon ;
c) mesurer le diamètre du gel.
2. Kit pour révéler la présence d'une substance toxique dans un échantillon comprenant :
a) une solution de collagène ;
b) des cellules épithéliales ;
c) une substance toxique servant de témoin positif et permettant la calibration ; d) éventuellement, une notice explicative indiquant que les cellules épithéliales doivent être suspendues dans la solution de collagène avant sa polymérisation et que le diamètre du gel de collagène doit être mesuré pour indiquer la présence d'une substance toxique.
3. Kit selon la revendication 2, dans lequel la substance toxique servant de témoin positif est la dioxine.
4. Utilisation d'un gel de collagène comprenant des cellules épithéliales provenant d'une lignée de cellules immortalisées pour mettre en évidence une transition épithélio-mésenchymateuse desdites cellules épithéliales, dans laquelle le diamètre dudit gel est mesuré.
5. Utilisation d'un gel de collagène comprenant des cellules épithéliales provenant d'une lignée de cellules immortalisées pour révéler la présence d'une substance toxique dans un échantillon, dans laquelle le diamètre dudit gel est mesuré.
6. Méthode, kit ou utilisation selon les revendications 1 à 5, dans laquelle l'échantillon est un échantillon non biologique.
7. Méthode, kit ou utilisation selon les revendications 1 à 5, dans laquelle l'échantillon est un échantillon biologique choisi dans le groupe constitué par le sang, le plasma, l'urine, le liquide céphalo-rachidien, le liquide de lavage broncho-alvéolaire et le liquide amniotique.
8. Méthode, kit ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle les cellules épithéliales sont choisies dans le groupe constitué par les cellules HepG2, HaCaT, MCF-7, NmuMG et EpH4.
9. Méthode, kit ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la concentration en collagène dans le gel final est de l'ordre de 1 mg par mL.
10. Méthode, kit ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la densité de cellules au sein du gel final est de l'ordre de 0,55xl06 cellules par mL.
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