WO2011151344A1 - Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique et kit pour réaliser une telle évaluation - Google Patents

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cells
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gastric
gastric mucosa
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Bertrand Kaeffer
Jean-Christophe Roze
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Nantes Université
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Universite de Nantes
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Definitions

  • the invention relates to a method for in vitro evaluation of the physiological state of a gastric mucosa from exfoliated cells of the gastric mucosa of an individual. More specifically, the invention makes it possible to evaluate the importance of the loss of epithelial cells of the gastric mucosa of an individual by inferring on the degree of autophagy and the circadian cycle of the exfoliated cell population of said individual.
  • the invention also relates to a kit comprising a set of antibodies capable of interacting with specific protein biomarkers, in order to evaluate the physiological state of the gastric mucosa of an individual.
  • the invention has applications in the medical field, in order to evaluate the state of the gastric mucosa of premature children, in particular to identify and monitor the establishment of a circadian rhythm in the cellular renewal of the gastric mucosa.
  • the invention also has applications in the medical field, for evaluating the physiological state of the gastric mucosa of a patient following a physiological disorder or a condition such as an ulcer, or following a treatment likely to have problems. repercussions on the gastric mucosa of a patient.
  • the invention also has applications in the medical field, to determine the best time on a 24-hour cycle to administer an oral treatment that may affect a patient's gastric cells, depending on the circadian rhythm. exfoliation of the gastric cells of said patient.
  • the gastric epithelium is a complex structure consisting of tubular and branched glands. Epithelial stem cells in the neck region are responsible for the constant renewal of the epithelium by the production of multiple gastric cell lines that inhabit the glands. Some gastric progenitor cells may function as damage sensors, or spare cells, which are mobilizable to seal microlesions. These cells retain a high proliferative potential, allowing regeneration of parts of the gastric mucosa after injury.
  • Exfoliation is an active biochemical process related to the homeostasis of the epithelium.
  • the detachment of epithelial cells triggers both pro and anti-apoptotic signals, which would allow the cells to survive for some time in the external environment.
  • the exfoliation would have a physiological role in the maintenance and evolution of the architecture of an epithelium, not only by allowing the formation of a glandular lumen, but also by offering sufficient flexibility to preserve the continuity physical epithelia while allowing their growth.
  • the gastric epithelium of a patient may have been damaged, and the control of the patient's good recovery also passes through that of the physiological state of his gastric epithelium.
  • An object of the invention is to provide a reliable and non-invasive method for assessing the physiological condition of a gastric epithelium, which can be done recurrently, and in particular several times per 24 hours, without risk of weakening the patient.
  • the invention advantageously proposes using exfoliated cells of the gastric mucosa, recovered for example from the gastric fluid of the patient.
  • the recovery of quiescent exfoliated cells is possible in many clinical situations, including aspirations of gastric fluids, extensive rinsing at the end of routine colonoscopy, etc.
  • premature infants are kept under a nasogastric tube, particularly to ensure the transitional period between total parenteral nutrition and total enteral nutrition.
  • caregivers should withdraw every three hours, gastric contents containing undigested milk and gastric fluids, which is a source of exfoliated cells from the gastric mucosa of the child.
  • the exfoliated cells are also recoverable in adult patients equipped with a nasogastric tube.
  • the multiplicity and frequency of these routine care procedures performed in all intensive care units makes it possible to collect a syringe of gastric contents and their immediate use (or delayed after storage for example at -70 ° C) to extract and detect exfoliated gastric cells.
  • the exfoliation of the gastric epithelial cells is induced by the constant arrival of milk in the lumen of the stomach and / or by a possible friction of the probe on the gastric mucosa.
  • These epithelial cells are in a particular physiological state, named anoikis, which corresponds to the activation of an autophagy process
  • autophagy is a collection of catabolic mechanisms that result in the breakdown of cellular constituents by the lysosome.
  • Autophagy can be described as a mechanism of cellular survival. The latter takes place in case of stress, especially in case of nutritional deficiencies, accumulation of protein aggregates, etc., and acts by recycling nutrients, including amino acids.
  • autophagy begins with the formation of a vacuole, the autophagosome, which non-selectively sequesters the constituents of the cytoplasm.
  • the autophagosome is delimited by several lipid layers whose origin is still poorly understood.
  • LC3-I human homologous LC3 protein
  • rat and mouse of Atg8 is the only reliable marker for the presence of autophagosomes in cells. Screening for the conversion of LC3-I to LC3-II is thus indicative of autophagic activity cells.
  • a protein responsible for the inhibition of autophagy, SURVIVINE is also known. Specifically, SURVIVINE inhibits the conversion reaction from LC3-I to LC3-II.
  • the inventors have discovered that the detection and analysis of autophagy markers on quiescent exfoliated cells of the gastric mucosa, in parallel with the detection and analysis of the clock markers on said cells, makes it possible to reliably assess the physiological state of the gastric mucosa.
  • the invention thus proposes to evaluate in vitro the physiological state of exfoliated cells of the gastric mucosa of an individual, by using antibodies that may interact with protein markers of autophagy and protein markers of the body. 'clock. It is thus possible, according to the invention, to monitor and control the evolution in kinetics over one or more days of the cells of the gastric mucosa, to evaluate the circadian rhythm of the exfoliation and the effect of nutritional stress. .
  • the invention can make it possible to ensure monitoring in chrononutrition, by controlling disturbances on the exfoliation rate and the level of bolus autophagy of essential amino acids (taken by mouth, alone or in cocktails), like L-Tryptophan for example.
  • the invention can make it possible to provide chronopharmacological monitoring, in particular for detecting the effects of doses of drugs, such as ibuprofen, on the gastric epithelium.
  • the monitoring and control of these cells of the gastric mucosa over several weeks, by weekly samples, can be used to evaluate the maturation of the epithelium.
  • an index of full maturity of the patient's gastric epithelium could be a delicate balance between cell proliferation and cell loss, which could be indirectly revealed by the different levels of exfoliation observed during hospital stay.
  • the analysis and the simultaneous monitoring of the markers of autophagy and the clock according to the invention make it possible to evaluate in time the physiological state of the gastric epithelium of a patient, and thereafter to be able to pose the adequate diagnosis and / or make the necessary decisions for the follow-up of the patient.
  • the subject of the invention is therefore a process for the in vitro evaluation of the physiological state of a gastric mucosa from exfoliated cells isolated from a biological fluid, such as gastric fluid, from an animal, human individual. or non-human, according to which:
  • exfoliated and isolated cells of a biological fluid of said individual, recovered at a time T are subjected to a set of antibodies able to interact with protein markers, among at least one marker of autophagy and at least one marker of the clock.
  • the antibodies are monoclonal antibodies. It is also possible to use specific nano-ligands of the target protein markers.
  • an ELISA system can be used, firstly by capturing the protein markers with a first series of antibodies and then by revealing by a second series of antibodies directed against another epitope of the antibodies. target protein markers.
  • the analysis according to the invention makes it possible to detect and characterize the exfoliated cells, to evaluate their quantity and quality, as well as to aid in the diagnosis of a maturation phenomenon.
  • the cells are for example isolated from the gastric contents, the arrival of milk in the lumen of the stomach inducing a strong cellular exfoliation.
  • the gastric contents may have many epithelial cells, which participate in healing, useful for the analysis of the physiological state of the gastric mucosa.
  • Protein marker is understood to mean a protein capable of providing information, by its presence / absence / quantity, etc. on a particular pathological condition.
  • marker of autophagy is meant a protein capable of informing about the autophagic state of a cell, that is to say whether the cell is autophagy or not.
  • SURVIVINE and / or anti-LC3 antibodies the SURVIVINE protein and the LC3 protein being good markers of autophagy.
  • the presence of LC3 in addition to being directly associated with the presence of the autophagosome in the cell, is also a stem cell marker.
  • clock marker we mean the genes directly involved in the circadian regulation of cell physiology.
  • anti-PERIOD1 antibodies and / or anti-CLOCK antibodies can be used, the PERIOD1 protein and the anti-CLOCK protein being good markers of the clock.
  • the genes encoding the CLOCK and PERIOD1 proteins are part of a dozen genes currently recognized as involved in the circadian regulation of cell physiology.
  • the CLOCK protein is crucial for the determination of the central dimer of the clock (CLOCK: BMAL1).
  • the PERIOD1 protein is the only protein directly correlated to cellular stress.
  • the set of antibodies of step a) also comprises anti-bodies capable of interacting with at least one identity marker, in order to evaluate with certainty that the loss of gastric epithelial cells comes from good of the person studied. Moreover, it makes it possible to compare the number of gastric epithelial cells that express said identity marker between several people.
  • the mobilization of parietal cells expressing identity markers is indicative of the renewal of the gastric epithelium. So, for example, a difference between the exfoliation profiles of the markers of the identity of two people may indicate a difference in sensitivity to nutritional, drug or other treatment.
  • the identity markers used are H + / K + -ATPase and / or Pouf5 / Oct-4.
  • the Pouf5 / Oct-4 marker advantageously provides information on the state of suffering of the gastric mucosa of the individual, which combined with the information obtained from the markers of autophagy and the clock, makes it possible to draw up a reliable diagnosis of the condition of the gastric mucosa of the individual.
  • the method for evaluating in vitro the physiological state of a gastric mucosa comprises a prior step aO) of selecting exfoliated cells isolated from the biological fluid of the individual. , and which express a marker of the cellular identity indicative of a gastric parietal cell of the individual, in particular H + / K + -ATPase.
  • Step a) is then implemented on the cells selected during this step aO).
  • the invention preferably provides that the method implements the deposition of the cells on a suitable surface, preferably so as to make these cells detectable individually, the identification of the cells expressing H + / K + -ATPase, in particular by microscopic observation, for example by confocal microscopy by means of suitable pairs of antibodies, one of which is coupled to a fluorochrome, then bringing these positive cells into contact with the antibodies directed against the other protein markers of interest, in particular the markers autophagy, the clock and cell identity.
  • the method according to the invention also comprises a preliminary step of selecting the quiescent cells, for example by means of a nuclear integrity marker, in order to eliminate the cells senescent may be contained in the biological fluid recovered from the individual, and could distort the results of analysis.
  • the two preliminary steps of the method according to the invention advantageously make it possible to ensure that the analysis will relate only to exfoliated cells that are intact and originating from the gastric mucosa of the targeted individual.
  • step a) is repeated, and if necessary one or both of the preceding steps, in particular step aO), on a new batch of exfoliated cells isolated from said individual, recovered at a time T + n after the first analysis, so as to compare the results and follow the evolution of the physiological state of the gastric mucosa of said individual.
  • step aO the fact that, when this step aO) is implemented prior to step a) for the biological fluid of the individual recovered at the instant T, this preliminary step is also systematically implemented for any biological fluid of this individual recovered at a time T + n.
  • Step a), and where appropriate step aO), are thus repeated each time on a batch of cells of the individual freshly recovered, the cells analyzed having been mostly exfoliated at a time T + n , n being preferably at least 12 hours, compared to the previous analysis.
  • the invention proposes to repeat step a), and if necessary step aO), at least every 12 hours for at least 24 hours, so as to evaluate the establishment of a circadian rhythm of cell exfoliation in the individual whose cells are derived.
  • This is particularly interesting for premature infants, as it allows to determine from when the gastric epithelium of the child is mature, and therefore when the gastric tube can be removed, so that the child can eat without assistance medical.
  • this makes it possible to determine in an animal (human or non-human) the rate of cellular exfoliation, which is its own. .
  • step a) and, where appropriate, step aO) are repeated, at least every 12 hours for at least 72 hours, so as to analyze the circadian rhythm of cell exfoliation in the individual whose cells are derived.
  • step aO is repeated, at least every 12 hours for at least 72 hours, so as to analyze the circadian rhythm of cell exfoliation in the individual whose cells are derived.
  • step aO by repeating step a), and if necessary step aO), at least once a week for at least two weeks, the evolution of the maturation of the gastric mucosa of the individual can be followed. whose cells are derived. It is thus possible to check the enduring remission of the patient's gastric mucosa, the long-term effects of a treatment, etc.
  • abacuses or other tables consisting of acrophases, periods, or amplitudes of the rhythms of all or part of the biomarkers. This can be particularly useful for predictive diagnoses, and for refining the tracking and prognosis of a new individual, compared to other individuals in his category.
  • the invention also relates to a kit for evaluating the physiological state of the gastric mucosa of an animal individual, human or non-human, intended to be applied in vitro to exfoliated gastric cells of said individual, characterized in that it comprises a set of antibodies capable of interacting with protein markers among at least one autophagy marker and at least one marker of the clock.
  • the kit according to the invention is particularly adapted to the implementation of the method of the invention.
  • the antibodies used are monoclonal antibodies.
  • the set of antibodies comprises antibodies capable of interacting with at least one marker among the SURVIVINE protein and the LC3 protein, as a marker of autophagy.
  • the set of antibodies may comprise antibodies capable of interacting with at least one of PERIOD1 protein and CLOCK protein, as a marker of the clock.
  • the set of antibodies may comprise antibodies capable of interacting with at least one identity marker and in particular H + / K + -ATPase.
  • the kit may comprise solutions necessary to allow the extraction of the exfoliated cells, such as calcium phosphate or magnesium ion free phosphate buffer (PBSO) containing 3 mM EDTA and 0.05 mM DTT. Similarly, it may comprise carbonate carbonate bicarbonate buffer pH 9.6 for saturation on the ELISA plates if this solution is retained.
  • solutions necessary to allow the extraction of the exfoliated cells such as calcium phosphate or magnesium ion free phosphate buffer (PBSO) containing 3 mM EDTA and 0.05 mM DTT.
  • PBSO calcium phosphate or magnesium ion free phosphate buffer
  • it may comprise carbonate carbonate bicarbonate buffer pH 9.6 for saturation on the ELISA plates if this solution is retained.
  • cell rinsing buffer such as PSBO, or other buffered saline buffer, containing 0.05% Tween-20 for ELISA rinsing or 0.2% BSA for incubations.
  • cell rinsing buffer such as PSBO, or other buffered saline buffer, containing 0.05% Tween-20 for ELISA rinsing or 0.2% BSA for incubations.
  • any other buffer formula for rinsing and incubating may be considered.
  • distilled water may be provided to resuspend the cell lysate obtained after freeze / thaw cycles, or any other suitable lysis buffer formula.
  • Figures 1A-1D Detection of protein markers expressed by exfoliated gastric cells, in a time series of gastric fluid aspirates of a premature child, for 24 hours, on samples taken every three hours.
  • Figures 2A-2E Detection of protein markers expressed by exfoliated gastric cells, in a time series of gastric fluid aspirates of five children taken at a weekly rate between the third day of life and removal of the gastric tube.
  • Figures 3A to 3F Morphology of freshly isolated gastric epithelial cells ( Figures 3A to 3C) or cultured ( Figures 3D to 3F), with expression of stem cell markers.
  • Figure 4 Evolution of the expression levels of two markers of autophagy on oral exfoliated cells of a healthy individual.
  • Figure 5 Exacerbating effect on gastric exfoliation from oral exposure to a dose of Ibuprofen or L-Tryptophan in the twelve-day-old rat during a diet / replenishment cycle that induces the exfoliation phenomenon.
  • Figure 6 Detection of protein markers expressed by exfoliated gastric cells, in a time series of aspirates of gastric fluids of a premature child over 24 hours, on samples taken every three hours.
  • Figures 7A and 7B Detection of the H + / K + -ATPases protein marker expressed by exfoliated gastric cells, in a time series of gastric fluid aspirates of four premature infants (Children 1 and 2, Figure 7A, Children 3 and 4, Figure 7B), during two consecutive nycthemers, on samples taken every three hours.
  • FIGS. 8A to 8D Confocal microscopy photographs illustrating the labeling of an exfoliated gastric cell of a premature child: FIG. 8A, for the H + / K + -ATPases marker, according to the xy, yz and xz plans, respectively; Figure 8B, for the Survivine marker (high), the H + / K + - ATPases marker (central), and the Hoechst 33258 nuclear marker (low); Figure 8C: for the LC3 marker (high) and the Hoechst nuclear marker 33258 (low); Figure 8D: for the CLOCK marker (high) and the Hoechst nuclear marker 33258 (low snapshot).
  • FIGS. 8A to 8D Confocal microscopy photographs illustrating the labeling of an exfoliated gastric cell of a premature child: FIG. 8A, for the H + / K + -ATPases marker, according to the xy, yz and xz plans, respectively; Figure 8B, for the Survivine
  • Gastric residue or stool from an individual is collected in a sterile container.
  • the sample is processed immediately. Otherwise, the sample may be stored preferably at -80 ° C, or at -20 ° C until use. In the case where the sample had to wait on the bench, it is advisable to leave it at room temperature, in the dark to minimize cell lysis. In any case, it is recommended not to store the cells in a refrigerator at + 4 ° C, which could irrevocably damage the cells and make them unusable afterwards.
  • the sample is then resuspended in calcium phosphate and magnesium-free phosphate buffer containing 3 mM EDTA and 0.05 mM DTT.
  • cells are recovered in a heterogeneous pellet by simple centrifugation at 2000 rpm for 3 min at room temperature. The supernatant is discarded and the pellet can be stored as it is until re-suspension in lysis buffer or used as follows.
  • This cell pellet may be extracted with a lysis buffer for quantitative immunodetection or used as is or after culturing to perform direct microscopic imaging using an immunofluorescence system.
  • Lot # 1 Samples (from the Prematec library biocollection) taken every three hours for 24 hours, from aspirate of gastric fluids from a premature baby ( Figure 1).
  • Lot N ° 2 Samples (from the biocollection Prémare) collected weekly, from aspirates of gastric fluids of five premature children (2A to 2E), with or without cell culture ( Figure 2).
  • Lot # 3 Samples of internal mucosa cells from the cheek of a healthy adult volunteer, exfoliated by gentle rubbing were recovered, to serve as a control ( Figure 4).
  • Batch 4 Samples of exfoliated gastric mucosa cells of twelve-day-old rats fed a five-hour diet / feed cycle and dosed with saline (NaCl 9 per thousand), or a dose of ibuprofen (10 mg / kg live weight, dose used in pediatric medicine) or a dose of L-Tryptophan or nothing. The pups were then delivered with their mother for one hour of suckling and then sacrificed, for a sub-batch at 13:00 and for a second sub-batch at 01:00 ( Figure 5).
  • saline NaCl 9 per thousand
  • ibuprofen 10 mg / kg live weight, dose used in pediatric medicine
  • L-Tryptophan or nothing The pups were then delivered with their mother for one hour of suckling and then sacrificed, for a sub-batch at 13:00 and for a second sub-batch at 01:00 (Figure 5).
  • Lot N ° 5 Samples (from the biocollection Prémare) collected every three hours for 48 hours, from aspirates of gastric fluids of four premature children (Figure 7).
  • Each batch of cells was lysed so that it could be used for an ELISA test. Each time 20 ⁇ of cell pellet is used.
  • the lysis is carried out by three cycles of freezing / thawing: firstly from -70 ° C. to + 37 ° C., then three times in succession, from -20 ° C. for 10-15 min to + 37 ° C., checking each time the freezing - thawing of the droplet of 20 ⁇ at the bottom of the tube.
  • Saturation buffer 0.5 M Na2CO3 / NaHCO3, pH 9.6;
  • Na2CO3 1. 59 g and NaHCO3: 2.93 g supplemented with distilled water;
  • Rinsing buffer PBS0 + 0.05% Tween-20 (25 ⁇ in 50 ml)
  • ELISA plates Greiner, special ELISA, 96 wells
  • KAT13D and H-276 from two suppliers. Only the signal of higher amplitude, obtained with KAT13D (Abcam), was presented.
  • the Table below 3 below shows the biotinylated secondary antibodies used to amplify the reaction.
  • Extravidin-horse-radish peroxidase (Sigma, E-2886, 1/1000), ABTS binding agent (in tablets, Sigma A-9941 including citrate buffer pH 3) and hydrogen peroxide.
  • IR (Sample OD - DO Background Noise) / DO Noise Background.
  • Detection was performed by Alexa-488-labeled secondary antibody to detect mouse antibody to H + / K + -ATPase, and Alexa-568-labeled secondary antibody to detect rabbit antibody to Survivin. , the LC3b or Pouf5 / Oct4.
  • the preparations still contained a fluorescent marker specific for nuclear DNA, namely Hoechst 33258.
  • FIGS. 1A-1D show the circadian profile of the child's cell exfoliation, with all the markers (FIG. 1A), with the phenotype markers only (FIG. 1B), with the markers of autophagy only (Figure 1C), and with the clock markers only ( Figure 1D).
  • This profile corresponds to a series of positive samples with a minimum volume of 500 ⁇ .
  • the milky white appearance observed indicates that the sample contained an undigested milk fraction.
  • Figure 1A illustrates the chronobiometric estimation of a cosine function from the data measured on the exfoliated cells of lot ⁇ .
  • the theoretical function is represented by a "black circle” symbol in parallel with the values obtained by the ELISA test also shown in FIG. 1 A.
  • the white arrow indicates the time (hh: mm) of the acrophase. Specifically, in this case, the calculations were performed by
  • the acrophase of the exfoliation (peak of the oscillation) for this child is: 05 h 26 min in hour of the day (white arrow in figure 1 A which corresponds to the time 29,44 h).
  • a shift in the peak from one day to the next indicates an alteration of the balance related either to nutritional stress or to gastric ripening.
  • the cells were isolated and fixed for immediate microscopic observation, or cultured for 15 days in a conventional growth medium (Dulbecco's Minimum Essential Medium supplemented with 2 mM L-Glutamine, 10% fetal calf serum, amphotericin-B penicillin-streptomycin and gentamycin in conventional antimicrobial doses). Grown colonies were fixed for microscopic observation. Immunomark observations were obtained on a Nikon Eclipse 400 epifluorescence microscope.
  • the isolation of quiescent cells useful for immunodetection was observed only from the third day of life.
  • the cells isolated from aspirates of anterior gastric fluids (day of birth until the second day of life, corresponding to the first gastric contents) are senescent and unsuitable for use in immunodetection.
  • FIGS. 3A, 3B and 3C show the expression of the stem cell marker (Pouf5 / Oct4) in exfoliated cells freshly isolated from the gastric mucosa of a premature child, respectively on Hoechst (FIG. 3A), Alexa 438 (Figure 3B) and light background + Hoechst (Figure 3C).
  • FIGS. 3C, 3D and 3E they show the expression of the stem cell marker (Pouf5 / Oct4) in exfoliated cells isolated from the gastric mucosa of a premature child, and placed in culture, respectively on a light background and UV light (Figure 3D), Alexa 438 (Figure 3E) and Hoechst (Figure 3F).
  • Figure 3D shows the expression of the stem cell marker (Pouf5 / Oct4) in exfoliated cells isolated from the gastric mucosa of a premature child, and placed in culture, respectively on a light background and UV light
  • Figure 3E Alexa 438
  • Figure 3F Hoechst
  • the samples are all of volume less than 500 ⁇ (between 50 ⁇ and 300 ⁇ ), a sample being otherwise missing.
  • the aim here was to follow, by ELISA assay, the parallel evolution of autophagy markers on mechanically exfoliated human cells, and maintained in survival for 3 hours in a phosphate salt buffer at room temperature without an energetic source, in order to reproduce similar conditions. to a forgotten sample on the bench.
  • FIG. 4 thus shows the increase in the level of expression of SURVIVINE and LC-3-b over 3 hours on exfoliated oral cells of an adult human individual.
  • the graph of FIG. 5 shows the exacerbating effect on the exfoliation of gastric mucosal cells, an oral exposure to a dose of Ibuprofen or L-Tryptophan, compared to a dose of physiological saline representing negative control, in the twelve-day-old raccoon during a diet / recharge cycle that induces the exfoliation of gastric mucosal cells.
  • the dose of ibuprofen administered to the pups correlates with that given to a premature infant (10 mg / kg body weight).
  • the dose of L-Tryptophan administered corresponds to that conventionally given to an adult rat when studying this amino acid (50 mg / kg body weight).
  • the oral dose it is possible to easily determine the best time of the day in a given individual, or group of individuals, for taking a treatment, and whether or not it is preferable to associate with food intake, to minimize harmful effects ulcerating on the stomach.
  • a sample of Lot ⁇ was deposited on a chip adapted to microscopic observations, so that each cell is individually identifiable.
  • Each positive cell for H + / K + -ATPase was identified by confocal microscopy ( Figure 8A), visually or automatically, using the antibody described in Table 2 above and a labeled anti-mouse secondary antibody. by the fluorochrome Alexa-488.
  • the expression levels of the markers of autophagy, of the markers of the clock and of the cell identity of interest were analyzed, still by confocal microscopy, by means of the pairs of antibodies described above (for each protein marker, antibody of Table 2 and secondary anti-rabbit antibody coupled to fluorochrome Alexa-568).
  • NeoExfolCel Database Biomarkers of exfoliated digestive cells of premature infants. Acronym: NeoExfolCel (NEC), 2009, IDDN.FR.001 .230013.000.R.P.2009.000.10300 - Kaeffer B. (2010) Exfoliated epithelial cells: potentials to explore gastrointestinal maturation of preterm infants. Brazilian Journal of Mother and Child Health 10: 13-24.

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Abstract

L'invention concerne un procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique à partir de cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique d'un individu animal, humain ou non humain, selon lequel on soumet lesdites cellules à un ensemble d'anti-corps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques parmi au moins un marqueur de l'autophagie et au moins un marqueur de l'horloge. Avantageusement, on utilise des anticorps anti-SURVIVINE et/ou des anticorps anti-LC3, en tant que marqueurs de l'autophagie. De même, on utilise des anticorps anti-PERIOD1 et/ou des anticorps anti-CLOCK, en tant que marqueurs de l'horloge. L'invention concerne également un kit comportant un ensemble d'anti-corps susceptibles d'être utilisés pour ledit procédé.

Description

PROCÉDÉ D'ÉVALUATION IN VITRO DE L'ÉTAT PHYSIOLOGIQUE D'UNE MUQUEUSE GASTRIQUE ET KIT POUR RÉALISER UNE TELLE
ÉVALUATION
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne un procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique à partir de cellules exfoliées de la muqueuse gastrique d'un individu. Plus précisément, l'invention permet d'évaluer l'importance de la perte de cellules épithéliales de la muqueuse gastrique d'un individu en inférant sur le degré d'autophagie et le cycle circadien de la population de cellules exfoliées dudit individu. L'invention concerne également un kit comportant un ensemble d'anticorps susceptibles d'interagir avec des biomarqueurs protéiques spécifiques, afin d'évaluer l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un individu.
L'invention trouve des applications dans le domaine médical, afin d'évaluer l'état de la muqueuse gastrique des enfants prématurés, pour notamment identifier et surveiller la mise en place d'un rythme circadien dans le renouvellement cellulaires de la muqueuse gastrique. L'invention trouve également des applications dans le domaine médical, pour évaluer l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un patient suite à un trouble physiologique ou une affection telle qu'un ulcère, ou suite à un traitement susceptible d'avoir des répercutions sur la muqueuse gastrique d'un patient. L'invention trouve également des applications dans le domaine médical, afin de déterminer le meilleur moment sur un cycle de 24h pour administrer un traitement par voie orale susceptible d'avoir des répercussions sur les cellules gastriques d'un patient, en fonction du rythme circadien de l'exfoliation des cellules gastriques dudit patient. ETAT DE LA TECHNIQUE ET PROBLEMES RENCONTRES
L'épithélium gastrique est une structure complexe, constituée de glandes tubulaires et ramifiées. Les cellules souches épithéliales dans la région du collet sont responsables du renouvellement constant de l'épithélium par la production de multiples lignées de cellules gastriques qui peuplent les glandes. Certaines cellules progénitrices gastriques peuvent fonctionner comme des senseurs de dommages, ou des cellules de réserve, qui sont mobilisables pour colmater des microlésions. Ces cellules conservent un potentiel prolifératif élevé, permettant de régénérer des parties de la muqueuse gastrique après une blessure.
L'exfoliation est un processus biochimique actif lié à l'homéostasie de l'épithélium. La perte de contact entre les cellules épithéliales et la matrice extracellulaire ou les cellules compagnes, telles que les fibroblastes, se traduit par l'activation d'une cascade enzymatique nommée anoïkis. Le détachement des cellules épithéliales déclenche à la fois des signaux pro et anti-apoptotiques, ce qui permettrait aux cellules de survivre quelque temps dans le milieu extérieur. Dans ce contexte, l'exfoliation aurait un rôle physiologique dans le maintien et l'évolution de l'architecture d'un épithélium, non seulement en permettant la formation d'une lumière glandulaire, mais aussi en offrant une souplesse suffisante pour préserver la continuité physique des épithéliums tout en permettant leur croissance.
Chez un enfant prématuré, il est important de pouvoir contrôler la maturation de l'épithélium gastrique, afin notamment d'évaluer si l'enfant est à même ou non d'être alimenté autrement que par sonde gastrique.
De même, suite à un traitement, l'épithélium gastrique d'un patient peut avoir été endommagé, et le contrôle du bon rétablissement du patient passe également par celui de l'état physiologique de son épithélium gastrique.
Jusqu'à présent, il n'existe aucune méthode non invasive d'évaluation de la maturation de l'épithélium gastrique d'un individu. Or, chez des individus fragiles, tels que les enfants prématurés, il n'est pas concevable de procéder à de telles évaluations de manière récurrente.
EXPOSE DE L'INVENTION
Un but de l'invention est de proposer une méthode fiable et non invasive pour évaluer l'état physiologique d'un épithélium gastrique, qui puisse se faire de manière récurrente, et notamment plusieurs fois par 24h, sans risque de fragiliser le patient.
Pour cela, l'invention propose avantageusement d'utiliser des cellules exfoliées de la muqueuse gastrique, récupérées par exemple dans le liquide gastrique du patient. La récupération de cellules exfoliées quiescentes est possible dans de nombreuses situations cliniques, notamment à partir d'aspirats de fluides gastriques, rinçage extensif à la fin d'une coloscopie de routine etc. Par exemple, en milieu hospitalier, les enfants prématurés sont maintenus sous sonde nasogastrique, notamment pour assurer la période transitoire entre nutrition parentérale totale et nutrition entérale totale. Lors des soins courants, le personnel soignant doit retirer toutes les trois heures, le contenu gastrique comportant du lait non-digéré et des fluides gastriques, qui est source de cellules exfoliées de la muqueuse gastrique de l'enfant. Les cellules exfoliées sont également récupérables sur des patients adultes équipés d'une sonde nasogastrique. De plus, la multiplicité et la fréquence de ces gestes du soin courant pratiqués dans toutes les unités de soins intensifs rend possible la collecte d'une seringue de contenu gastrique et leur utilisation immédiate (ou différée après stockage par exemple à -70 °C) pour extraire et détecter les cellules gastriques exfoliées. L'exfoliation des cellules épithéliales gastriques est induite par l'arrivée constante de lait dans la lumière de l'estomac et/ou par un éventuel frottement de la sonde sur la muqueuse gastrique. Ces cellules épithéliales sont dans un état physiologique particulier, nommé anoïkis, qui correspond à l'activation d'un processus d'autophagie
Il a été récemment découvert que l'autophagie regroupe un ensemble de mécanismes cataboliques aboutissant à la dégradation de constituants cellulaires par le lysosome. L'autophagie peut être décrite comme un mécanisme de survie cellulaire. Ce dernier a lieu en cas de stress, notamment en cas de carences nutritionnelles, accumulation d'agrégats protéiques etc., et agit en recyclant des nutriments, notamment les acides aminés. Dans la cellule, l'autophagie débute par la formation d'une vacuole, l'autophagosome, qui séquestre de façon non sélective les constituants du cytoplasme. L'autophagosome est délimité par plusieurs feuillets lipidiques dont l'origine est encore mal connue. Bien que l'importance de l'autophagie chez l'homme soit incontestée, son analyse n'est pas évidente du fait du manque de bons marqueurs. Jusqu'à présent, la protéine LC3, homologue chez l'homme, le rat et la souris de Atg8, est le seul marqueur fiable de la présence d'autophagosomes dans les cellules. Le dépistage de la conversion de LC3-I en LC3-II est ainsi un indicatif de l'activité autophagique des cellules. On connaît également, une protéine responsable de l'inhibition de l'autophagie, la SURVIVINE. Plus précisément, la SURVIVINE inhibe la réaction de conversion de LC3-I à LC3-II.
Les inventeurs ont découvert que la détection et l'analyse de marqueurs de l'autophagie sur les cellules exfoliées quiescentes de la muqueuse gastrique, en parallèle de la détection et de l'analyse de marqueurs de l'horloge sur lesdites cellules, permet d'évaluer de manière fiable l'état physiologique de la muqueuse gastrique.
L'invention propose donc d'évaluer in vitro l'état physiologique de cellules exfoliées de la muqueuse gastrique d'un individu, en utilisant des anti-corps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques de l'autophagie et des marqueurs protéiques de l'horloge. Il est ainsi possible, selon l'invention, de suivre et de contrôler l'évolution en cinétique sur un ou plusieurs jours des cellules de la muqueuse gastrique, pour évaluer le rythme circadien de l'exfoliation et l'effet d'un stress nutritionnel. Notamment, l'invention peut permettre d'assurer un suivi en chrononutrition, en contrôlant les perturbations sur le taux d'exfoliation et le niveau d'autophagie de bolus d'acides aminés essentiels (pris par la bouche, seuls ou en cocktails), comme le L-Tryptophane par exemple. De même, l'invention peut permettre d'assurer un suivi en chronopharmacologie, notamment pour la détection des effets de doses de médicaments, tels que l'ibuprofène, sur l'épithélium gastrique. Par ailleurs, le suivi et le contrôle sur ces cellules de la muqueuse gastrique, sur plusieurs semaines, par prélèvements hebdomadaires, peuvent permettre d'évaluer la maturation de l'épithélium. Ainsi, chez les nourrissons prématurés, la possibilité de déterminer la cinétique cellulaire permettant la maturation et la croissance de l'épithélium gastrique normal permet de suivre l'évolution clinicopathologique du patient. Par exemple, un indice de pleine maturité de l'épithélium gastrique du patient pourrait consister en un équilibre délicat entre la prolifération cellulaire et la perte cellulaire, qui pourrait être révélé indirectement par les différents taux d'exfoliation observés durant le séjour en hôpital. D'une manière générale, l'analyse et le suivi simultané des marqueurs de l'autophagie et de l'horloge selon l'invention permettent d'évaluer dans le temps l'état physiologique de l'épithélium gastrique d'un patient, et par la suite de pouvoir poser le diagnostic adéquat et/ou prendre les décisions qui s'imposent pour le suivi dudit patient.
L'invention a donc pour objet un procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique à partir de cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique, tel que du liquide gastrique, d'un individu animal, humain ou non humain, selon lequel :
a) on soumet des cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique dudit individu, récupéré à un instant T, à un ensemble d'anti-corps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques, parmi au moins un marqueur de l'autophagie et au moins un marqueur de l'horloge.
Préférentiellement, les anticorps sont des anticorps monoclonaux. Il est également possible d'utiliser des nano-ligands spécifiques des marqueurs protéiques cibles.
Selon l'invention, il est possible de déposer des préparations protéiques sur un support, après la lyse des cellules à étudier.
Autrement, il est possible de capturer les protéines par des anticorps immobilisés sur un support. Par exemple, on peut utiliser un système ELISA, en procédant dans un premier temps à une capture des marqueurs protéiques par une première série d'anticorps et dans un second temps à une révélation par une seconde série d'anticorps dirigés contre un autre épitope des marqueurs protéiques cibles.
On peut également utiliser une puce à protéines ou à capture par anticorps.
De même, on peut utiliser un système d'imagerie microscopique de fluorescence à haut débit et multiples signatures biologiques permettant de compter et caractériser les cellules individuellement et d'intégrer leurs caractéristiques, en mettant en œuvre des anticorps dirigés contre les marqueurs d'intérêt associés à des anticorps secondaires couplés à des fluorochromes.
Dans tous les cas, l'analyse selon l'invention permet de détecter et de caractériser les cellules exfoliées, évaluer leur quantité et qualité, ainsi que d'aider au diagnostic d'un phénomène de maturation.
Chez le nourrisson nourrit par sonde, les cellules sont par exemple isolées à partir du contenu gastrique, l'arrivée de lait dans la lumière de l'estomac induisant une forte exfoliation cellulaire. Chez l'adulte suivi pour un ulcère, notamment, le contenu gastrique peut présenter de nombreuses cellules épithéliales, qui participent à la cicatrisation, utile pour l'analyse de l'état physiologique de la muqueuse gastrique.
Par marqueur protéique, on entend une protéine susceptible de renseigner, de par sa présence/absence/quantité etc. sur un état pathologique particulier.
Par marqueur de l'autophagie, on entend une protéine susceptible de renseigner sur l'état autophagique d'une cellule, c'est-à-dire si la cellule est en autophagie ou non.
Notamment, selon l'invention, on peut utiliser des anticorps anti-
SURVIVINE et/ou des anticorps anti-LC3, la protéine SURVIVINE et la protéine LC3 étant de bons marqueurs de l'autophagie. Par ailleurs, la présence de LC3, en plus d'être associée directement à la présence de l'autophagosome dans la cellule, est également un marqueur de cellule souche.
Par marqueur de l'horloge, on entend les gènes directement impliqués dans la régulation circadienne de la physiologie cellulaire.
Notamment selon l'invention, on peut utiliser des anticorps anti- PERIOD1 et/ou des anticorps anti-CLOCK, la protéine PERIOD1 et la protéine anti-CLOCK étant de bons marqueurs de l'horloge. En effet, les gènes codant les protéines CLOCK et PERIOD1 font partie d'une douzaine de gènes actuellement reconnus comme impliqués dans la régulation circadienne de la physiologie cellulaire. Ainsi, la protéine CLOCK est cruciale pour la détermination du dimère central de l'horloge (CLOCK:BMAL1 ). De même, la protéine PERIOD1 est la seule protéine directement corrélée à un stress cellulaire.
Avantageusement, l'ensemble d'anti-corps de l'étape a) comporte également des anti-corps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur de l'identité, afin d'évaluer avec certitude que la perte de cellules épithéliales gastriques provient bien de la personne étudiée. De plus cela permet de comparer entre plusieurs personnes le taux de cellules épithéliales gastriques qui expriment ledit marqueur d'identité. La mobilisation de cellules pariétales exprimant des marqueurs d'identité est indicative du renouvellement de l'épithélium gastrique. Ainsi, par exemple, une différence entre les profils d'exfoliation des marqueurs de l'identité de deux personnes peut indiquer une différence de sensibilité à un traitement nutritionnel, médicamenteux ou autre. Avantageusement, les marqueurs de l'identité utilisés sont H+/K+-ATPase et/ou Pouf5/Oct-4.
En particulier, le marqueur Pouf5/Oct-4 fournit avantageusement des informations sur l'état de souffrance de la muqueuse gastrique de l'individu, qui combinées aux informations tirées des marqueurs de l'autophagie et de l'horloge, permet de dresser un diagnostic fiable sur l'état de la muqueuse gastrique de l'individu.
Dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, le procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique comporte une étape préalable aO) de sélection de cellules exfoliées et isolées du fluide biologique de l'individu, et qui expriment un marqueur de l'identité cellulaire indicatif d'une cellule pariétale gastrique de l'individu, en particulier H+/K+-ATPase. L'étape a) est ensuite mise en œuvre sur les cellules sélectionnées au cours de cette étape aO). On s'assure ainsi avantageusement que seules les cellules pariétales gastriques de l'individu seront examinées conformément à l'invention. En particulier, les cellules pouvant provenir du personnel soignant ayant procédé aux prélèvements sur l'individu, ou de la mère dans le cas des enfants prématurés, ne sont pas susceptibles de venir fausser les résultats de l'analyse des marqueurs protéiques d'intérêt.
Dans un tel cadre, l'invention prévoit de préférence que le procédé mette en œuvre le dépôt des cellules sur une surface appropriée, préférentiellement de manière à rendre ces cellules repérables individuellement, l'identification des cellules exprimant H+/K+-ATPase, notamment par observation microscopique, par exemple par microscopie confocale au moyen de couples d'anticorps adéquats dont un est couplé à un fluorochrome, puis la mise en présence de ces cellules positives avec les anticorps dirigés contre les autres marqueurs protéiques d'intérêt, en particulier les marqueurs de l'autophagie, de l'horloge et de l'identité cellulaire.
Préférentiellement, le procédé selon l'invention comporte en outre une étape préalable de sélection des cellules quiescentes, par exemple au moyen d'un marqueur de l'intégrité nucléaire, afin d'éliminer les cellules pré- sénescentes susceptibles d'être contenues dans le fluide biologique récupéré de l'individu, et qui pourraient fausser les résultats d'analyse.
Les deux étapes préalables du procédé selon l'invention, telles qu'exposées ci-dessus, permettent avantageusement de s'assurer que l'analyse portera uniquement sur des cellules exfoliées intègres et issues de la muqueuse gastrique de l'individu ciblé.
Avantageusement, on répète l'étape a), et le cas échéant une ou les deux étapes préalables, en particulier l'étape aO), sur un nouveau lot de cellules exfoliées et isolées dudit individu, récupérées à un instant T+n après la première analyse, de manière à pouvoir comparer les résultats et suivre l'évolution de l'état physiologique de la muqueuse gastrique dudit individu.
Dans toute la présente description, on entend par « le cas échéant l'étape aO) », le fait que, lorsque cette étape aO) est mise en œuvre préalablement à l'étape a) pour le fluide biologique de l'individu récupéré à l'instant T, cette étape préalable est également systématiquement mise en œuvre pour tout fluide biologique de cet individu récupéré à un instant T+n.
Selon l'invention, en fonction de la périodicité des contrôles, il est possible d'évaluer différents paramètres liés à l'état de la muqueuse gastrique du patient, et ainsi poser différents diagnostics. Généralement, une périodicité d'au moins 12 heures est suffisante. L'étape a), et le cas échéant l'étape aO), sont ainsi répétées à chaque fois sur un lot de cellules de l'individu fraîchement récupérées, les cellules analysées ayant été pour la plus part exfoliées à un instant T+n, n étant préférentiellement au moins égale à 12 heures, par rapport à l'analyse précédente.
Par exemple, l'invention propose de répéter l'étape a), et le cas échéant l'étape aO), au moins toutes les 12 heures pendant au moins 24h, de manière à évaluer la mise en place d'un rythme circadien de l'exfoliation cellulaire chez l'individu dont les cellules sont issues. Cela est particulièrement intéressant pour les enfants prématurés, car cela permet de déterminer à partir de quand l'épithélium gastrique de l'enfant est mature, et donc quand la sonde gastrique peut être retirée, pour que l'enfant puisse s'alimenter sans assistance médicale. De plus, d'une manière générale, cela permet de déterminer chez un animal (humain ou non humain) le rythme d'exfoliation cellulaire, qui lui est propre. . Selon une autre mise en œuvre du procédé de l'invention, on répète l'étape a), et le cas échéant l'étape aO), au moins toutes les 12 heures pendant au moins 72h, de manière à analyser le rythme circadien de l'exfoliation cellulaire chez l'individu dont les cellules sont issues. Ainsi, on peut vérifier la mise en place et le maintien du rythme circadien de l'exfoliation chez l'enfant prématuré, ou la remise en place chez l'adulte d'un tel rythme, par exemple après traitement d'un ulcère. De même, la connaissance exacte, à un moment donné, pour un individu donné, du rythme circadien de l'exfoliation cellulaire de sa muqueuse gastrique, qui lui est propre et peut être modifié de manière ponctuelle, pour différentes raisons, permet d'optimiser la prise d'un traitement particulier. Cela peut notamment être très avantageux dans le cas d'un traitement anti-cancéreux.
De même, en répétant l'étape a), et le cas échéant l'étape aO), au moins une fois par semaine pendant au moins deux semaines, on peut suivre l'évolution de la maturation de la muqueuse gastrique de l'individu dont les cellules sont issues. Il est ainsi possible de vérifier la rémission durable de la muqueuse gastrique du patient, les effets à long terme d'un traitement etc.
Bien entendu, l'homme du métier est tout à fait à même d'adapter la périodicité et la durée de l'analyse, en fonction du patient, des informations spécifiques souhaitées, du diagnostic à poser etc.
Par exemple, il est possible de construire, chez une catégorie d'individus donnée (notamment d'une classe d'âge donnée), des courbes de référence, en compilant les données obtenues pour plusieurs individus de ladite catégorie, sur une période donnée, depuis une journée jusqu'à plusieurs semaines (voir notamment ci-dessous la première et la troisième expérimentations).
Il est également possible de dériver des abaques ou autres tables constituées des acrophases, périodes, ou amplitudes des rythmes de tout ou partie des biomarqueurs. Cela peut notamment être utile pour des diagnostics prédictifs, et pour affiner le suivi et le pronostic d'un nouvel individu, par rapport aux autres individus de sa catégorie.
D'une manière générale, la compilation d'un certain nombre de données pour une catégorie d'individus donnée permet selon l'invention de construire un système expert pour ladite catégorie d'individus. L'invention concerne également, un kit pour l'évaluation de l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un individu animal, humain ou non humain, destiné à être appliqué in vitro à des cellules gastriques exfoliées dudit individu, caractérisé en ce qu'il comporte un ensemble d'anti-corps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques parmi au moins un marqueur de l'autophagie et au moins un marqueur de l'horloge.
Le kit selon l'invention est particulièrement adapté à la mise en œuvre du procédé de l'invention.
Préférentiellement, les anticorps utilisés sont des anticorps monoclonaux.
Selon un exemple de kit de l'invention, l'ensemble d'anticorps comporte des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur parmi la protéine SURVIVINE et la protéine LC3, en tant que marqueur de l'autophagie.
De même, l'ensemble d'anticorps peut comporter des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur parmi la protéine PERIOD1 et la protéine CLOCK, en tant que marqueur de l'horloge.
De plus l'ensemble d'anticorps peut comporter des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur de l'identité et notamment H+/K+-ATPase.
Selon l'invention, le kit peut comporter des solutions nécessaires pour permettre l'extraction des cellules exfoliées, tel que du tampon phosphate salin sans ion calcium ni ion magnésium (PBSO) contenant 3 mM EDTA et 0.05 mM DTT. De même, il peut comporter du tampon carbonate bicarbonate pH 9.6 pour la saturation sur les plaques ELISA si cette solution est retenue.
Il est également possible de prévoir du tampon de rinçage des cellules comme le PSBO, ou autre tampon salin tamponné, contenant Tween-20 à 0.05% pour le rinçage ELISA ou 0.2% BSA pour les incubations. Bien entendu, toute autre formule de tampon pour rincer et incuber peut être envisagée. Avantageusement, on peut prévoir de l'eau distillée pour resuspendre le lysat de cellules obtenu après des cycles de congélation/décongélation, ou toute autre formule de tampon lyse adaptée. BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
Figures 1 A à 1 D : Détection de marqueurs protéiques exprimés par des cellules gastriques exfoliées, dans une série temporelle d'aspirats de fluides gastriques d'un enfant prématuré, pendant 24 heures, sur des échantillons prélevés toutes les trois heures.
Figures 2A à 2E : Détection de marqueurs protéiques exprimés par des cellules gastriques exfoliées, dans une série temporelle d'aspirats de fluides gastriques de cinq enfants prélevés selon un rythme hebdomadaire entre le troisième jour de vie et le retrait de la sonde gastrique.
Figures 3A à 3F : Morphologie de cellules épithéliales gastriques fraîchement isolées (Figures 3 A à 3C) ou mises en culture (Figures 3D à 3F), avec expression des marqueurs de cellules souches.
Figure 4 : Évolution des taux d'expression de deux marqueurs d'autophagie sur des cellules exfoliées buccales d'un individu sain.
Figure 5 : Effet exacerbant sur l'exfoliation gastrique d'une exposition par voie orale à une dose d'Ibuprofène ou de L-Tryptophane chez le raton de douze jours lors d'un cycle diète/réalimentation qui induit le phénomène d'exfoliation.
Figure 6 : Détection de marqueurs protéiques exprimés par des cellules gastriques exfoliées, dans une série temporelle d'aspirats de fluides gastriques d'un enfant prématuré sur 24 heures, sur des prélèvements effectués toutes les trois heures.
Figures 7A et 7B : Détection du marqueur protéique H+/K+-ATPases exprimé par des cellules gastriques exfoliées, dans une série temporelle d'aspirats de fluides gastriques de quatre enfants prématurés (Enfants 1 et 2, Figure 7A ; Enfants 3 et 4, Figure 7B), pendant deux nycthémères consécutifs, sur des échantillons prélevés toutes les trois heures.
Figures 8A à 8D : Clichés de microscopie confocale illustrant le marquage d'une cellule gastrique exfoliée d'un enfant prématuré : Figure 8A, pour le marqueur H+/K+-ATPases, selon les plans respectivement xy, yz et xz ; Figure 8B, pour le marqueur Survivine (cliché haut), le marqueur H+/K+- ATPases (cliché central), et le marqueur nucléaire Hoechst 33258 (cliché bas) ; Figure 8C : pour le marqueur LC3 (cliché haut) et le marqueur nucléaire Hoechst 33258 (cliché bas) ; Figure 8D : pour le marqueur CLOCK (cliché haut) et le marqueur nucléaire Hoechst 33258 (cliché bas). DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
I- MATERIEL ET METHODES
1 - Récupération et préparation des cellules exfoliées de muqueuse gastrique
On récolte du résidu gastrique ou des selles d'un individu en container stérile. L'échantillon est traité immédiatement. Autrement, l'échantillon peut être stocké préférentiellement à -80 °C, ou à -20 °C jusqu'à utilisation. Dans le cas où l'échantillon devait attendre sur la paillasse, il est conseillé de le laisser à température ambiante, à l'obscurité pour minimiser la lyse cellulaire. Dans tous les cas, il est recommandé de ne pas stocker les cellules dans un réfrigérateur, soit à +4°C, ce qui pourrait endommager de manière irrévocable les cellules et les rendre inutilisables ensuite.
On procède ensuite à une re-suspension de l'échantillon dans un tampon phosphate salin sans ions calcium ni magnésium contenant 3 mM EDTA et 0,05 mM DTT.
Puis on récupère des cellules dans un culot hétérogène par simple centrifugation à 2000 tpm durant 3 min à température ambiante. Le surnageant est jeté et le culot peut être stocké en l'état jusqu'à re-suspension en tampon de lyse ou être utilisé comme suit.
Ce culot cellulaire peut être extrait par un tampon de lyse pour immunodétection quantitative ou utilisé en l'état ou après mise en culture pour réaliser des analyses directes par imagerie microscopique en utilisant un système d'immunofluorescence.
2- Échantillons :
Lot n °1 : Échantillons (issus de la biocollection Prémathèque) prélevés toutes les trois heures pendant 24 heures, à partir d'aspirats de fluides gastriques d'un enfant prématuré (figure 1 ).
Lot N °2 : Échantillons (issus de la biocollection Prémathèque) prélevés de manière hebdomadaire, à partir d'aspirats de fluides gastriques de cinq enfants prématurés (2A à 2E), avec ou sans mise en culture des cellules (figure 2). Lot N °3 : Échantillons de cellules de la muqueuse interne de la joue d'un volontaire adulte sain, exfoliées par frottements doux ont été récupérées, pour servir de témoin (figure 4).
Lot N °4 : Échantillons de cellules exfoliées de muqueuse gastrique de ratons de douze jours, soumis à un cycle diète/réalimentation pendant cinq heures, et ayant reçu une dose de sérum physiologique (NaCI 9 pour mille), ou une dose d'Ibuprofène (10 mg/kg poids vif, dose utilisée en médecine pédiatrique) ou une dose de L-Tryptophane ou rien. Les ratons ont été ensuite remis avec leur mère pour une heure de tétée puis sacrifiés, pour un sous lot à 13H00 et pour un second sous lot à 01 H00 (figure 5).
Lot N °5 : Échantillons (issus de la biocollection Prémathèque) prélevés toutes les trois heures pendant 48 heures, à partir d'aspirats de fluides gastriques de quatre enfants prématurés (figure 7).
3- Procédure de lyse :
Chaque lot de cellules a subi une lyse de manière à pouvoir être utilisé pour un test ELISA. On utilise à chaque fois 20 μΙ de culot cellulaire.
La lyse est réalisée par trois cycles de congélation/décongélation : passage dans un premier temps de -70 °C à +37 °C, puis trois fois de suite, de -20°C pendant 10-15 min à +37°C, en vérifiant à chaque fois la congélation - décongélation de la gouttelette de 20 μΙ au fond du tube.
Une aliquote de la solution est re-suspendue dans de l'eau ou du tampon de saturation (100 μί. par échantillon) et mise à saturer sur les puits ELISA.
Tampon de saturation : 0,5 M Na2CO3 / NaHCO3, pH 9,6 ;
Pour un litre : Na2CO3 : 1 ,59 g et NaHCO3 : 2,93 g compléter par de l'eau distillée ;
Tampon de post-saturation et d'incubation : PBS0 + 0,2% BSA
Tampon de rinçage : PBS0 + 0,05% Tween-20 (25 μΙ dans 50 ml) Plaques ELISA : Greiner, spéciale ELISA, 96 puits
Spectrophotomètre : Bio-Tek Instruments Inc, ELX800-UV, filtre 405nm
4- Protéines cibles
Selon l'invention, on utilise avantageusement sur ces échantillons cellulaires des anticorps dirigés contre des protéines spécifiques, telles que celles répertoriées dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 . Liste de marqueurs protéiques pouvant être utilisés pour l'évaluation de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique.
Figure imgf000016_0001
Par ailleurs, il est possible d'envisager d'utiliser l'ADN cellulaire comme biomarqueur supplémentaire, pour permettre un sexage de l'échantillon. Autrement, il est possible d'utiliser un fluorochrome, tel que Hoechst 33258.
5- Batterie d'anticorps primaires mis en œuyre pour le test ELISA
Dans les expérimentations décrites ici, une batterie d'anti-corps a été utilisée, comportant tout ou partie des anti-corps répertoriés dans le
Tableau 2 ci-dessous. Tableau 2 : Batterie d'anti-corps monoclonaux
Figure imgf000017_0001
L'évolution de la protéine CLOCK a été suivie par 2 anticorps
(KAT13D et H-276) provenant de deux fournisseurs. Seul le signal de plus forte amplitude, obtenu avec KAT13D (Abcam), a été présenté.
6- Conjugués mis en œuyre pour le test ELISA
Le Tableau ci-dessous 3 ci-dessous reprend les anticorps secondaires biotinylés utilisés pour amplifier la réaction.
Tableau 3 : Conjugués
Cible Origine Espèce
Goat-anti-rabbit- Vector-lab, BA-1000 Chèvre (1 /1000)
biotin
Goat Anti-mouse- Sigma, B-0529 Chèvre (1 /1000)
biotin 7- Détection et analyse - test ELISA
Révélateur de fixation d'anticorps Extravidin-horse-radish peroxydase (Sigma, E-2886, 1 /1000), ABTS (en tablettes, Sigma A-9941 dont tampon citrate pH 3) et eau oxygénée.
Lecture sur Bio-Tek : Les densités optiques ont été lues à 405 nm après 20 min d'incubation à 37°C. Aucune variation significative des densités optiques n'a été obtenue en incubant sur 40 min.
Traitement des densités optiques : Les valeurs sont exprimés par un indice relatif l'indice relatif se calcule par :
IR = (DO échantillon - DO Bruit Fond) / DO Bruit Fond.
La détection du niveau d'actine par un anticorps a montré une faible différence entre échantillon, aucune normalisation n'a donc été appliquée.
8- Détection et analyse par microscopie confocale
Les anticorps spécifiques des marqueurs protéiques mis en œuvre pour la microscopie confocale sont identiques à ceux cités dans le Tableau 2 ci-dessus.
La détection a été réalisée par un anticorps secondaire marqué par Alexa-488 pour détecter l'anticorps de souris dirigé contre H+/K+-ATPase, et par un anticorps secondaire marqué par Alexa-568 pour détecter l'anticorps de lapin dirigé contre la Survivine, le LC3b ou Pouf5/Oct4.
Les préparations contenaient toujours un marqueur fluorescent spécifique de l'ADN nucléaire, à savoir le Hoechst 33258.
Lors de la révélation, les différentes molécules marquées ont été révélées par utilisation des jeux de filtres appropriés pour chaque fluorochrome visé.
Il- RESULTATS
1 - Expérimentations sur lot N °1
1.1- Première expérimentation
Lors d'une première expérimentation sur le lot N °1 , on a cherché à étudier la variation sur 24 h de la perte cellulaire au niveau de la muqueuse gastrique d'un enfant prématuré, en suivant la cinétique d'expression de marqueurs circadiens dans ces cellules par dosage ELISA.
L'ensemble des six biomarqueurs du tableau 1 ont été détectés, au moyen des sept anti-corps du tableau 2.
Les graphes des figures 1 A à 1 D montrent le profil circadien d'exfoliation cellulaire de l'enfant, avec tous les marqueurs (figure 1 A), avec les marqueurs de phénotype uniquement (figure 1 B), avec les marqueurs d'autophagie uniquement (figure 1 C), et avec les marqueurs de l'horloge uniquement (figure 1 D).
Ce profil correspond à une série d'échantillons positifs de volume minimum 500 μΙ. L'aspect blanc laiteux observé indique que l'échantillon comportait une fraction de lait non digéré.
Ainsi, on observe que l'exfoliation des cellules de la muqueuse gastrique de cet enfant prématuré suit un rythme circadien, qu'illustrent et contrôlent les marqueurs de l'horloge.
Sur cette base, il est possible de vérifier l'acquisition d'un rythme par l'enfant selon l'âge et calculer une amplitude, une période et une phase.
Par exemple, la figure 1 A illustre l'estimation chronobiométrique d'une fonction cosinus à partir des données mesurées sur les cellules exfoliées du lot Ν . La fonction théorique est représentée par un symbole « cercle noir » en parallèle des valeurs obtenues par le test ELISA également représentées sur la figure 1 A. La flèche blanche indique l'heure (hh:mm) de l'acrophase. Plus précisément, dans le cas présent, les calculs ont été réalisés par
Time Séries Analysis Sériel Cosinor, version 6.3, ExpertSoft Technologies.
L'équation proposée par le logiciel est : 0,3671 * Cos ((2 pi t/24.000)- 1 ,426) + 0,6555.
L'existence d'un rythme circadien est testée vraie par analyse de variance et divers tests chronobiométriques au seuil 5%.
A titre d'exemple, l'acrophase de l'exfoliation (pic de l'oscillation) pour cet enfant est : 05 h 26 min en heure de la journée (flèche blanche portée sur la figure 1 A qui correspond au temps 29,44 h). Un décalage dans le pic d'un jour sur l'autre indique une altération de l'équilibre liée soit à un stress nutritionnel soit à une maturation gastrique. 1.2- Deuxième expérimentation
Lors d'une seconde expérimentation sur des cellules du lot Ν , on a voulu montrer que les biomarqueurs de l'autophagie, de l'horloge et/ou de l'identité selon l'invention peuvent être détectés directement au microscope.
Pour cela, les cellules ont été isolées et fixées pour observation microscopique immédiate, ou mises en culture durant 15 jours dans un milieu de croissance classique (Dulbecco's Minimum Essential Médium supplémenté avec 2 mM L-Glutamine, 10% sérum fetal calf, amphotéricine-B -pénicilline- streptomycine et gentamycine en doses antimicrobiennes classiques). Les colonies ayant poussé ont été fixées pour observation microscopique. Les observations d'immunomarques ont été obtenues sur un microscope à épifluorescence Nikon Eclipse 400.
L'isolement des cellules quiescentes utiles pour une immunodétection a été observé uniquement à partir du troisième jour de vie. Les cellules isolées d'aspirats de fluides gastriques antérieurs (jour de naissance jusqu'au second jour de vie, correspondant au premier contenu gastrique) sont en sénescence et impropres pour une utilisation en immunodétection.
Il est alors possible de suivre de manière fiable les phénotypes cellulaires via un système d'analyse quantitative d'images microscopiques.
Ainsi, les figures 3A, 3B et 3C montrent l'expression du marqueur de cellules-souches (Pouf5/Oct4) dans des cellules exfoliées fraîchement isolées de la muqueuse gastrique d'un enfant prématuré, respectivement sur Hoechst (figure 3A), Alexa 438 (figure 3B) et fond clair+Hoechst (figure 3C).
Les figures 3C, 3D et 3E, elles, montrent l'expression du marqueur de cellules-souches (Pouf5/Oct4) dans des cellules exfoliées isolées de la muqueuse gastrique d'un enfant prématuré, et mises en culture, respectivement sur fond clair et lumière UV (figure 3D), Alexa 438 (figure 3E) et Hoechst (figure 3F).
On observe que ces cellules épithéliales quiescentes peuvent être cultivées après exfoliation, ce qui suggère que l'autophagie, induite par un détachement des cellules, contribue à préserver la viabilité de ces cellules.
1.3- Troisième expérimentation
Lors de cette troisième expérimentation, on a voulu montrer qu'il était possible, avec les anti-corps selon l'invention, d'exclure rapidement et aisément des séries d'échantillons non-conformes à une charte de qualité donnée, par dosage ELISA.
Pour cela, il suffit de procéder à la détection des biomarqueurs exprimés par les cellules gastriques exfoliées. Il convient de pouvoir comparer ces résultats avec une courbe de référence, spécifique par exemple d'une tranche d'âge et/ou d'une pathologie et/ou d'un traitement donné etc., pour lesdits marqueurs.
Le profil représenté dans le graphe de la figure 6 montre une série
« négative ». Les échantillons sont tous de volume inférieur à 500 μΙ (compris entre 50 μΙ et 300 μΙ), un échantillon étant par ailleurs manquant.
Dans le cas présent, l'aspect des échantillons était marron sale indiquant une série non-conforme. Ces allégations visuelles ont été confirmées lors de l'analyse des biomarqueurs. Comparativement au profil représenté sur les graphes de la figure 1 , on observe en effet une discordance dans les taux d'expression des marqueurs de l'autophagie et de l'horloge.
2- Expérimentation sur le lot N °2
Lors de l'expérimentation sur le second lot de cellules, on a cherché à suivre l'évolution, par dosage ELISA, de la maturation de l'épithélium gastrique, sur cinq enfants prématurés différents, à partir d'échantillons prélevés une fois par semaine, entre le troisième jour de vie et le retrait de la sonde gastrique, soit environ vers le quarantième jour de vie.
On a, selon les cas, détecté un ou les deux biomarqueurs de l'identité présentés dans le tableau 1 , un ou les deux biomarqueurs de l'autophagie présentés dans le tableau 1 et un ou les deux biomarqueurs de l'horloge présentés dans le tableau 1 , en utilisant les anti-corps correspondants présentés dans le tableau 2.
Les différences de profil entre les enfants (figures 2A à 2E) sont indicatives et leur interprétation pour partie liées à l'âge gestationnel des enfants et à leur historique clinique.
Ainsi, l'expression soudainement élevée de PERIOD1 sur les profils des enfants 3 (figure 2C) et 5 (figure 2E), sans évolution notable des niveaux des autres biomarqueurs, suggère une réponse à un stress nutritionnel ou médicamenteux récent à surveiller ou à retrouver dans le dossier de suivi du patient. L'expression du facteur transcriptionnel CLOCK ne permet pas à elle seule d'interprétation nette sans courbes de référence pour chaque âge. Par contre, en lien avec les autres biomarqueurs, elle permet de moduler l'interprétation. Ainsi, les profils d'exfoliation des enfants 1 (figure 2A), 2 (figure 2B) et 4 (figure 2D) illustrent une maturation progressive de l'épithélium gastrique.
Cette expérimentation permet de montrer qu'il est possible, grâce à l'invention, de suivre des enfants d'âges gestationnels différents pendant la durée de leur hospitalisation.
3- Expérimentation sur le lot N °3
On a voulut ici suivre par dosage ELISA l'évolution en parallèle des marqueurs d'autophagie sur des cellules humaines exfoliées mécaniquement, et maintenues en survie pendant 3 heures dans un tampon salin phosphate à température ambiante sans source énergétique, afin de reproduire des conditions similaires à un échantillon oublié sur la paillasse.
La figure 4 montre ainsi l'augmentation du taux d'expression de la SURVIVINE et de LC-3-b sur 3 heures sur des cellules buccales exfoliées d'un individu humain adulte.
Plus précisément, les cellules exfoliées voient leur taux de biomarqueurs de l'autophagie augmenter de manière significative au cours de la première heure, pour atteindre un palier à une densité optique mesurée à 405 nm de 2,250 et s'y maintenir au cours des heures suivantes. 4- Expérimentation sur le lot N °4
Lors de cette expérimentation, on a voulu suivre par dosage ELISA les effets inducteurs de l'exfoliation lorsqu'une préparation médicamenteuse ou nutritionnelle est prise par la bouche. Pour des raisons éthiques, cette expérimentation a été conduite sur des cellules de ratons.
Le graphe de la figure 5 montre l'effet exacerbant sur l'exfoliation des cellules de la muqueuse gastrique, d'une exposition par voie orale à une dose d'Ibuprofène ou de L-Tryptophane, comparativement à une dose de sérum physiologique représentant le témoin négatif, chez le raton de douze jours lors d'un cycle diète/réalimentation qui induit le phénomène d'exfoliation des cellules de la muqueuse gastrique. La dose d'ibuprofène administrée aux ratons est en corrélation avec celle donnée à un enfant prématuré (10 mg / kg de poids vif).
La dose de L-Tryptophane administrée correspond à celle classiquement donnée à un rat adulte lors d'étude sur cet acide aminé (50 mg / kg de poids vif).
Chez le raton de 12 jours, le rythme de vie, qui consiste à manger la nuit et à dormir le jour, commence à se mettre en place (bien que la mère allaite encore le raton de 12 jours de jour comme de nuit). L'exfoliation est donc circadienne avec une forte sensibilité à "midi" et une faible sensibilité aux perturbations par un bolus alimentaire à "minuit".
Ainsi, dans le cas présent, donner un bolus par la bouche à "minuit" (ici 01 H00) perturbe peu l'épithélium gastrique.
Selon l'invention, il est possible de déterminer aisément le meilleur moment de la journée chez un individu donné, ou sur un groupe d'individus, pour la prise d'un traitement, et de savoir si il est préférable ou non de l'associer à la prise d'aliments, pour minimiser des effets nocifs ulcérant sur l'estomac. Ainsi chez l'humain, pour l'Ibuprofène, il faut avantageusement administrer la dose orale à certaines heures correspondant à la zone "active", c'est à dire le jour en association avec un aliment.
Par ailleurs, on a comparé les niveaux d'expression, mesurés par dosage ELISA, des marqueurs de l'autophagie et de l'horloge chez les mêmes ratons de 12 jours en période d'allaitement, d'une part sur des cellules épithéliales exfoliées gastriques, et d'autre part sur des cellules présentes dans la muqueuse gastrique.
II a été obtenu les résultats suivants (les % indiqués ci-après expriment le taux de cellules exfoliées exprimant le même niveau de marqueur que celles présentes dans la muqueuse gastrique)
Survivine : à 01 H00 : 78%
à 13H00 : 84%
LC3-b : à 13H00 : 90%
CLOCK : à 13H00 : 100%
Ces résultats démontrent que pour les marqueurs conformes à l'invention, les cellules exfoliées suivent le profil d'intensité des cellules de la muqueuse gastrique, qui ont une distribution « minuit » strictement disjointe de la distribution « midi ». Ceci confirme la pertinence du procédé selon l'invention pour étudier l'état physiologique d'une muqueuse gastrique sans réaliser de biopsies.
5- Expérimentation sur le lot N °5
Lors de cette expérimentation, il a été étudié le profil d'exfoliation de cellules gastriques H+/K+-ATPases de quatre enfants prématurés (Enfants 1 à 4) prélevés toutes les trois heures sur deux nycthémères consécutifs, par dosage ELISA.
Ces profils sont représentés sur les Figures 7 A (pour les Enfants 1 et 2) et 7B (pour les Enfants 3 et 4). Sur ces figures, les flèches blanches indiquent les acrophases et les flèches noires les bathyphases.
Les profils montrés sur ces figures démontrent la répétabilité de l'exfoliation de cellules positives pour H+/K+-ATPases pour un même enfant, ce qui confirme la pertinence de sélectionner de telles cellules pour l'étude des autres biomarqueurs.
6- Analyse par microscopie confocale
Un échantillon du Lot Ν a été déposé sur une puce adaptée aux observations microscopiques, de telle sorte que chaque cellule soit repérable individuellement.
Chaque cellule positive pour H+/K+-ATPase a été repérée par microscopie confocale (Figure 8A), de manière visuelle ou automatique, au moyen de l'anticorps décrit dans le Tableau 2 ci-dessus et d'un anticorps secondaire anti-souris marqué par le fluorochrome Alexa-488.
On a également vérifié que chaque cellule ainsi identifiée était quiescente, au moyen par exemple du marqueur de l'intégrité nucléaire Hoechst 33258 (Figures 8B à 8D, clichés bas).
Sur chacune des cellules ainsi préalablement sélectionnées, on a analysé, toujours par microscopie confocale, les niveaux d'expression des marqueurs de l'autophagie, des marqueurs de l'horloge et de l'identité cellulaire d'intérêt, au moyen des couples d'anticorps décrits ci-avant (pour chaque marqueur protéique, anticorps du Tableau 2 et anticorps secondaire anti-lapin couplé au fluorochrome Alexa-568).
Les clichés obtenus sont montrés sur les Figures 8B pour la Survivine (cliché haut), 8C pour LC3 (cliché haut) et 8D pour CLOCK (cliché haut). Un tel mode de mise en œuvre par sélection préalable des cellules positives pour H+/K+-ATPases, préférentiellement associé à un test de contrôle du caractère quiescent des cellules, permet avantageusement d'obtenir un résultat fiable sur l'état réel de la muqueuse gastrique.
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Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique à partir de cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique d'un individu animal, humain ou non humain, selon lequel :
a) on soumet des cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique dudit individu récupéré à un instant T, à un ensemble d'anticorps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques, parmi au moins un marqueur de l'autophagie et au moins un marqueur de l'horloge.
2- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comporte une étape préalable aO) de sélection de cellules exfoliées et isolées dudit fluide biologique, et qui expriment un marqueur de l'identité cellulaire indicatif d'une cellule pariétale gastrique dudit individu, et en ce que l'étape a) est mise en œuvre sur les cellules sélectionnées au cours de ladite étape aO). 3- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit marqueur de l'identité cellulaire est H+/K+-ATPase.
4- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on répète l'étape a), et le cas échéant l'étape aO), sur des cellules exfoliées et isolées d'un fluide biologique dudit individu récupéré à un instant T+n.
5- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps de l'étape a) comporte au moins des anticorps anti-SURVIVINE et/ou des anticorps anti-LC3, en tant que marqueurs de l'autophagie.
6- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps de l'étape a) comporte au moins des anticorps anti-PERIOD1 et/ou des anticorps anti-CLOCK, en tant que marqueurs de l'horloge.
7- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps de l'étape a) comporte également des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur de l'identité cellulaire.
8- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps de l'étape a) comporte au moins des anticorps susceptibles d'interagir avec H+/K+-ATPase et/ou des anticorps susceptibles d'interagir avec Pouf5/Oct-4, en tant que marqueurs de l'identité cellulaire.
9- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on répète l'étape a), et le cas échéant l'étape aO), au moins toutes les 12 heures pendant au moins 24h, de manière évaluer la mise en place d'un rythme circadien de l'exfoliation cellulaire chez l'individu dont les cellules sont issues.
10- Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on répète l'étape a), et le cas échéant l'étape aO), au moins toutes les 12 heures pendant au moins 72h, de manière à analyser le rythme circadien de l'exfoliation cellulaire chez l'individu dont les cellules sont issues.
1 1 - Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on répète l'étape a), et le cas échéant l'étape aO), au moins une fois par semaine pendant au moins deux semaines, pour suivre l'évolution de la maturation de la muqueuse gastrique de l'individu dont les cellules sont issues. 12- Kit pour l'évaluation de l'état physiologique de la muqueuse gastrique d'un individu animal, humain ou non humain, destiné à être appliqué in vitro à des cellules gastriques exfoliées dudit individu, caractérisé en ce qu'il comporte un ensemble d'anticorps susceptibles d'interagir avec des marqueurs protéiques parmi au moins un marqueur de l'autophagie et au moins un marqueur de l'horloge. 13- Kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps comporte des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur parmi la SURVIVINE et la LC3, en tant que marqueur de l'autophagie.
14- Kit selon l'une des revendications 12 à 13, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps comporte des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur parmi PERIOD1 et CLOCK, en tant que marqueur de l'horloge.
15- Kit selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps comporte des anticorps susceptibles d'interagir avec au moins un marqueur de l'identité cellulaire.
16- Kit selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'ensemble d'anticorps comporte au moins des anticorps susceptibles d'interagir avec H+/K+-ATPase et/ou des anticorps susceptibles d'interagir avec Pouf5/Oct-4, en tant que marqueurs de l'identité cellulaire.
PCT/EP2011/058984 2010-06-01 2011-05-31 Procédé d'évaluation in vitro de l'état physiologique d'une muqueuse gastrique et kit pour réaliser une telle évaluation Ceased WO2011151344A1 (fr)

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