WO2011137876A2 - Tolerogenos adyuvados como vacuna de malaria - Google Patents

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Abstract

La presente invención se relaciona con el campo de las composiciones vacunales para el tratamiento efectivo o preventivo de infecciones de transmisión vertical, particularmente la malaria y preferiblemente la humana causada por Plasmodium falciparum. El objetivo técnico que se persigue es usar los tolerógenos trasferidos tempranamente de la madre al feto/recién nacido y formularlos con potentes adyuvantes inductores de respuestas Th1 y T citotóxica para su uso en vacunas profilácticas o terápeuticas contra las infecciones de transmisión vertical y particularmente la malaria. El empleo de estas formulaciones por vía parenteral o mucosal o ambas a la vez en edades tempranas revierte la tolerancia inducida por la transferencia de tolerógenos y con ello inducir respuestas protectivas.

Description

TOLEROGENOS ADYUVADOS COMO VACUNA DE MALARIA

Memoria Descriptiva

Rama de la Técnica

Esta invención se relaciona con el campo de las vacunas, específicamente con la obtención y uso de vacunas adyuvadas para el tratamiento o prevención de infecciones de transmisión vertical, particularmente la Malaria.

Las materias de estudio e informaciones reveladas en las publicaciones y patentes o patentes aplicadas mencionadas en estas especificaciones son incorporadas aquí por referencia (EP 885900077.8 o US 5, 597,572; WO/2004/047805; WO/2003/094964, EP1716866, CU/P/2008/215; Pérez O et al. Infect Immun. 2001, 69(7):4502-4508; Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004,82:603-610; Rodríguez, T et al. Vaccine 2005, 26:1312- 21; Pérez O, et al. Scand J Immunology 2007,66:271-77).

El objetivo técnico que se persigue es usar los tolerógenos trasferidos tempranamente de la madre al feto/recién nacido y formularlos con potentes adyuvantes en particular los derivados de Neisseria meningitidis serogrupo B (AFPL1, Adjuvant Finlay Proteoliposome 1 y AFCo (cocleatol), inductores de respuestas Thl y CTL para su uso en vacunas profilácticas o terapéuticas contra infecciones de transmisión vertical, particularmente la Malaria. El empleo de estas formulaciones en edades tempranas revierte la tolerancia induciendo respuestas protectivas.

Estado del arte

La OMS declara a la Malaria como la enfermedad tropical más importante, que mata más personas que cualquier otra enfermedad transmisible con excepción del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y la Tuberculosis. Esta estima entre 350 a 500 millones de casos de malaria clínica cada año, resultando en 1.1 millones de muertes anuales. La mayor mortalidad ocurre entre los niños menores de 5 años. La Malaria es endémica de unos 100 países donde vive el 40% de la población mundial (WHO/IVB/06.01:46-55,2006). Se estima que cada 30 segundos muere otro niño de malaria en los países endémicos.

La Malaria es causada por protozoos del género Plasmodium. Existen alrededor de 156 especies de éste género que infectan diferentes vertebrados. Entre ellas: P. berghei, P. chaboie y P. yoeli infectan a los roedores; P. knowlesi and P. cynomolgi infectan a los primates no humanos y sólo 5 especies: P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae y recientemente se adición P. knowlesi infectan al humano.

La infección ocurre por la picada de hembras del género Anopheles que requieren de sangre para su reproducción. Se conocen unas 50 especies de Anopheles que sirven de huésped intermediario. A pesar de esto y la restricción del huésped, el ciclo es muy similar. El mosquito inocula la forma esporozoítica, forma infectiva, presente en su saliva y una vez en la sangre, en menos de 30 minutos arriban al hígado y penetran en los hepatocitos. Cada hepatocito es infectado por un sólo esporozoito, donde por eschizogonia asexual, se trasforma en eschizontes que a su vez, dan lugar a decenas de miles de merozoitos en sólo 6-16 días. La ruptura del hepatocito permite su liberación sanguínea y la invasión de los hematíes. Aquí ocurre la multiplicación y maduración en periodos de 24 a 72 horas en dependencia de la especie. Cada explosión eritrocitaria es consecuencia de la multiplicación parasitaria y conlleva a la invasión de nuevos eritrocitos. Los signos clásicos de Malaria como son los episodios de fiebre aguda y rigidez que ocurren cada 48-72 horas coinciden con la lisis sincronizada de los eritrocitos infectados. Algunos merozoitos se transforman en el estadio sexual, gametocitos, que son adquiridos por el mosquito donde ocurre su unión y evolución a esporozoitos.

Los síntomas/signos de la Malaria incluyen: fiebre alta, malestar, dolor de cabeza, dolores articulares, náuseas y vómitos. La infección por P. falciparum es más severa por la habilidad de los hematíes infectados de adherirse a los vasos sanguíneos. El fallo renal agudo, la malaria cerebral y el edema pulmonar ocurren más comúnmente en poblaciones no inmunes como son los niños y los viajeros provenientes de zonas no endémicas. Otro grupo de alto riesgo son las gestantes. La Malaria causa anemia severa, que es el principal factor que contribuye a la muerte materna durante la gestación. La infección concomitante con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) y la Malaria en las gestantes propicia la infección del recién nacido con VIH (Miller LH, et al. Nature, 2002, 415:673-679 y WHO/IVB/06.01 :46- 55,2006).

En áreas donde el control vectorial con abate ha fallado, la quimioterapia, consistente en una selección limitada de agentes antimaláricos, es la única defensa contra esta enfermedad. El incremento de la resistencia a las drogas en toda las regiones endémicas de Malaria es causa de gran preocupación y llamadas para el desarrollo de nuevas medidas contra la Malaria, las cuales incluirían una gran variedad de drogas, así como un amplio espectro de estrategias vacunales (Richie TL y Saúl A. Nature 2002, 415:694-701, Gardner MJ et al. Nature 2002, 419:498-511 y Banyal HS y Inselburg J. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1985, 34: 1055-1064).

La batalla contra la Malaria conlleva esfuerzos para mejorar el diagnóstico, la quimioterapia, así como las medidas de control basadas en mosquiteros impregnados con insecticidas y la fumigación con insecticidas residuales. En ellos se están integrando esfuerzos de múltiples organizaciones. Sin embargo, la emergencia o resurgencia de países con Malaria es evidente. Por ello, el desarrollo de una vacuna segura, efectiva y de posible uso general es una prioridad crítica de la salud pública global (WHO/IVB/06.01 :46-55,2006).

El término Premunición fue introducido para definir la inmunidad contra la Malaria caracterizada por el estado de resistencia concomitante con la persistencia de parásitos (Sergent ED, Parrot L, Institute Pasteur d'Algerie Archives, 1935,3:279-319). Esta sólo se adquiere en países hiperendémicos tras al menos 2 décadas de continua exposición (Gordon- Thomson J, Immunity in Malaria. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1933, 26(6):483-514). La Premunición o immunidad no esterilizante es adquirida muy lentamente; incapaz de eliminar la infección y muy lábil, desapareciendo por ausencia de reinfección por más de un año.

La respuesta inmune efectora es generalmente dividida en mediada por anticuerpos o células. Esta división conlleva a interpretaciones erróneas, pues se asume que la primera proviene de un patrón Th2 y la segunda de una Thl . No se tiene en cuanta que la respuesta Thl es la que también produce una buena respuesta de anticuerpos funcionales (fijadores de complemento y con capacidad opsonofagocítica [citofílica]) e induce una buena respuesta de memoria. Además, la inducción de una respuesta CTL y su duración (memoria) sólo se induce cuando se establece una potente respuesta Thl. Si tenemos en cuenta estas consideraciones, asumir que la respuesta de anticuerpos o de células es la responsable de la protección contra cualquiera de los estadios del ciclo de Malaria tiende a confundir la esencia de los mismos.

La marginalización de los eritrocitos infectados, así como de los gametocitos, es uno de los mecanismos de escape parasitario dirigido fundamentalmente a evitar la eliminación esplénica de los primeros y posibilitar la mejor captación por el mosquito de los segundos. Esta marginalización aunque ocurre en muchos órganos es particularmente importante en la placenta durante la gravidez, cuando los merozoitos cambian sus receptores de adhesión vascular de CD36 a condroitil sulfato A (CSA). Se piensa que los merozoitos de la placenta son una variante diferente a la circulatoria y que en la placenta se mantiene esta variante independiente de la otra.

La influencia de la presencia o no de inmunidad contra la Malaria en las gestantes es otro serio problema durante el embarazo. En consecuencia se sabe que las gestantes no inmunes, seguidas de las gestantes semi-inmunes son más afectadas por la Malaria que las inmunes. Por otro lado, es determinante la paridad (número de partos), donde las primíparas y por ello, las madres jóvenes, son las más afectadas. Esto es debido a que durante las sucesivas gestaciones la madre se pone en contacto con nuevas variantes de parásitos en la placenta adquiriendo cierta inmunidad contra los mismos. No obstante, esto se contradice con la necesidad de al menos dos décadas requeridas para adquirir inmunidad y que esta se pierde tan rápido como al año sin exposición a mosquitos infectados. Como resultado del secuestro de parásitos en la placenta ocurre: mayor mortalidad de la madre y del recién nacido; abortos; anemia materna y del niño; nacidos muertos y bajo peso al nacer.

Existen varias evidencias de que se puede obtener una vacuna profiláctica contra la Malaria como son: protección del 90% de los inmunizados con sporozoitos irradiados; adquisición de Premunición después de décadas de exposición continua en áreas de alta endemicidad y protección por transferencia pasiva de anticuerpos específicos (WHO/IVB/06.01 :46-55, 2006).

En humanos existen dos poblaciones importantes que requieren enfoques diferentes: habitantes de zonas endémicas y viajeros que no han tenido ningún contacto con la Malaria. En el primero, se encuentran varios grupos de riesgo sujetos a infecciones reiteradas con P. falciparum: a) los niños menores de un año que sufren particularmente de anemia con riesgo para la vida; b) los niños de 2 a 5 años que sufren de coma inducido (Marsh K y Snow RW. Parasitología 1999, 41 :241-246); y c) las mujeres primo grávidas que sufren severas enfermedades relacionadas con el secuestro de los parásitos en la placenta (Ricke CH et al. J. Immunol. 2000, 165:3309-3316) sobre todo las primíparas no inmunes.

Para la futura madre: el recrudecimiento de la anemia; la morbi-mortalidad materna y los altos porcentajes de abortos (Heard D y Jordán T. Cent. Afr. J. Med., 1981, 27:62-68), así como los nacidos muertos y los bajos de peso al nacer son hechos frecuentes en la Malaria. La mayor gravedad de la Malaria durante la gestación y sobre todo en las primíparas (McGregor IA. Am. J. Trp. Med. Hyg., 1984, 33:517-25 y Brabin A. Int. J. Epidemiol., 1991, 20:276-83) es un hecho aceptado por todos. No obstante, sus mecanismos no están totalmente elucidados. Por ello, existen varias hipótesis que tratan de explicar parcialmente, este fenómeno:

• Primero, la respuesta inmune Thl requerida para la protección contra la malaria (Fried M, et al. J. Immunol., 1998, 160:2523-30, Fievet N, et al. J. Infecí. Dis., 2001, 183: 1530-34 y Suguitan AJL et al. J. Infect. Dis., 2003, 188: 1074-82) está deprimida durante la gestación (Riley EM, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989, 40: 141 -4, Fievet N, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1995, 53:612-17 y Recusen EN, et al. Am. J. Reprod. Immunol., 2001 , 46: 169-79); pues el embarazo genera una respuesta Th2 sistémica, para proteger al feto incompatible con la madre por el aporte paterno de ser rechazado. Esta respuesta pudiera ser, junto a la exacerbación de la anemia, una de las causas de aborto o muerte fetal temprana.

• Segundo, los anticuerpos anti adhesión contra los parásitos que se unen a CSA están asociados con la protección y se adquieren por gestaciones sucesivas (Ricke CH et al. J. Immunol., 2000, 165:3309-16, O'Neil-Dunne I, et al. Infect. Immun., 2001 , 69:7487-92, Fried M and Duffy PE. Science 1996,272: 1502-1504). Durante la infección, los merozoitos en sangre periférica se adhieren a los endotelios vasculares a través del CD36, mientras que los secuestrados en la placenta se adhieren a CSA (Fried M y Duffy PE. Science, 1996, 272:1502-1504, Beeson JG, et al. Nat. Med., 2000, 6:86-90), ambos representan clones con variantes de antígenos de superficie (VSA) diferentes (Ofori MF, et al. Infect. Immun., 2003, 71(3):1584-1586). Se han identificado varias familias de genes que codifican para las VSA. La mejor caracterizada es la familia de genes var que codifican para la proteína 1 de la membrana eritrocitaria de P. falciparum (PfEMPl) (Smith JD, et al. Cell, 1995, 82,101-110, Baruch DI, et al. Cell, 1995, 82,77-87 y Su X, et al. Cell, 1995, 82:89-100). Dos genes var que son menos polimórficos que el resto de la familia var: varlcsa y var2csa (Salanti A, et al. Mol. Microbiol., 2003, 49; 179-191) han sido identificados y éstos parecen ser prometedores candidatos vacunales. No obstante, cualquier vacuna de este tipo no protegerá contra la infección, pues la respuesta observada es contra los estadios eritrocitarios y no contra los hepáticos o sexuales. También existe la posibilidad de escape por mutantes en estos genes que evadan la inmunidad y como las secuencias vari sea y var2csa varían entre las cepas y una vacuna eficaz tendría que estimular una amplia respuesta de anticuerpos. Esta teoría no explica tampoco por qué no se protegen las madres que elaboran anticuerpos contra los parásitos que se unen a CSA desde el segundo trimestre del embarazo (Ricke CH, et al. J. Immunol., 2000,

165:3309-3316 y Staalsoe T, et al. J. Inf. Dis., 2001, 184:618-626).

• Tercero, la inmunosupresión no específica por hormonas asociadas a la gestación que deprimen la respuesta innata, particularmente las células asesinas naturales (NK) (Bouyou-Akotet MK, et al. CID, 2004, 38:342-347).

Para el futuro hijo: las muertes por abortos; los nacidos muertos; la anemia; la prematuridad y los bajos pesos al nacer, son hechos frecuentes impuestos por el secuestro de parásitos en la placenta (Desowitz RS, et al. Am J Trop Med Hyg, 1989, 41(6):630-4). Para los que logran nacer, la influencia de la infección materna con Malaria pudiera ser positiva o negativa:

• En la positiva podemos encontrar: traspaso de anticuerpos (IgG o IgA) anti Malaria por la placenta y/o la leche que protejan al recién nacido durante los primeros meses de vida en los humanos y traspaso de antígenos que logren estimular ('priming') efectivamente a nivel del feto o perinatalmente.

• En la negativa podemos suponer: que el traspaso de antígenos en un sistema inmune inmaduro induzca tolerancia; que se induzca una respuesta inapropiada (Th2) o que los anticuerpos interfieran con la futura respuesta a la infección por afectación de la especificidad fina de la repuesta inmune (Stanisic DI, et al. J Immunology 2003, 172:5570-5581).

A los murinos los infectan especies tales como: P chaboudi; P. vinckei; P. yoelii o P. bergei y dentro de éstas, existen cepas más o menos virulentas con letalidades diferentes y que pueden reproducir hasta la malaria cerebral. La cepa P. bergei NK65 es una de las altamente virulenta produciendo mortalidad en los ratones antes de los 20 días de la inoculación.

Por un lado, existen reportes de infección en murinos (ratones y ratas) con P. bergei NK65 durante la gestación (Leopardo O, et al. Patológica, 1994, 86(3):284-290, Desowitz RS, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1989, 41(6):630-634, Oduela AM, et al. J. Protozool., 1982, 29(1):77-81 y Hioki A, et al. J. Protozool., 1990, 37(3): 163-167) que en dependencia de los días de inoculación logran completar las gestaciones. Estos trabajos son anteriores a 1995 y si bien, permiten afirmar que el modelo es posible, no se beneficiaron de los recientes hallazgos inmunológicos relacionados con las teorías innatistas, procesamiento y presentación antigénica y de células T reguladoras que están revolucionando los enfoques de la inducción y regulación de la respuesta inmune. De hecho, se está retomando la necesidad de modelos de infección durante la gestación para testar las vacunas anti maláricas (Galinski MR y V Corredor. Mol. Biochem. Parasitol., 2004, 134:17-25) y ya aparecen trabajos relacionados con las células T supresoras durante la infección con P. berghei NK65. Este trabajo fue en ratones adultos y se relaciona con la inducción de protección (Long TT, et al. Int. J. Parasitol., 2003, 33(2): 175-83).

Por otro lado, el paso de antígenos e incluso parásitos desde la madre a la descendencia no es un hecho infrecuente en la malaria murina ni en la humana. No obstante, no esta totalmente claro sus porcentajes.

• Trabajos usando ratonas inmunes inducidas por infecciones/tratamientos anti maláricos sucesivos transfieren células y anticuerpos que afectan el desarrollo de la vacunación posterior e incluso el comportamiento de la infección con malaria a las dos semanas de nacido (Stanisic DI, et al. J. Immunology, 2003, 171:5461-5469 y Stanisic DI, et al. J Immunology, 2003, 172:5570-5581). En gestantes humanos con secuestro de Malaria en la placenta, la transferencia de parásitos al recién nacido puede ser variable, con un reporte de hasta el 50%. La transferencia de parásitos se considera que es en bajas concentraciones y sin llegar a producir Malaria congénita (Ismaili J, et al. Clin. Exp. Immunol., 2003, 133:414-421).

No obstante, ningún trabajo murino aborda la infección temprana de los descendientes de madres gestantes infectadas, los cuales están bajo la influencia del posible traspaso de parásitos (Akingbade OA. J. Reprod. Med., 1992, 37(3):273-6) o antígenos (Guoling Xi, et al. Infec. Immun., 2003, 71:1242-46) perinatalmente y se sabe que el secuestro placentario produce severas alteraciones llegando hasta inducir necrosis en la placenta (Desowitz RS, et al. Am J Trop Med Hyg, 1989, 41(6):630-4).

En humanos, se han encontrado altas concentraciones de exoantígenos en el suero de cordón (Iakodsen PH, et al. Immunology, 1998, 93:264-9) y el riesgo del recién nacido a desarrollar Malaria congénita esta en dependencia del estatus inmune y del secuestro de malaria en la placenta de la gestante. Este riesgo va desde: muy alto en las primíparas o multíparas no- inmunes (áreas no endémicas), alto en primíparas semi-inmunes (áreas de baja endemicidad); moderado en las multíparas semi-inmunes (áreas de baja endemicidad); bajo en las primíparas hiperinmunes (áreas hiperendémicas); hasta muy bajo en multíparas hiper-inmunes (áreas hiperendémicas) (Hviid L y Staalsoe T. Trens in Parasitology, 2004, 20(4): 66-72). Este riesgo no incluye el paso de antígenos ni tampoco el de anticuerpos idiotípicos (Id)/ anti Id que semejen a los antígenos (Rajewsky K y Takemori T. Ann. Rev. Immunol., 1983, 1 :569 y Kaerney JF, et al. Chem. Immunol., 1990, 48: 1). Esta clasificación del riesgo ha sido relacionada con un enfoque de cambios de subclones de P. falciparum que expresen diferentes VSA: VSASM (malaria severa); VSAUM (malaria no complicada) y VSAPAM (malaria asociada a la gestación) (Smith JD y Deitsch KW. J. Exp. Med., 2004, 200(9): 1093- 1097 y Rajewsky K y Takemori T. Ann. Rev. Immunol., 1983, 1 :569) que escapan así, a los anticuerpos preexistentes. Este enfoque parasitológico-humoral se focaliza sobre la presión de los anticuerpos para inducir cambios en los parásitos a través de la variación de los VSA. Sin embargo, no se tiene en cuenta la respuesta celular (Thl y CTL) importante en la protección contra la Malaria y que es la que en definitiva produce los anticuerpos que se desean (como expresamos anteriormente), ni tampoco la influencia de los posibles antígenos de malaria que arriban al feto/recién nacido en un ambiente inmunológico no maduro y bajo la influencia de citocinas y/o células T supresoras.

Es de recordar que durante la gestación tanto en murinos como en humanos hay cambios hormonales e inmunológicos que favorecen el cambio de un patrón Thl hacia uno Th2 y que el recién nacido tiene también una mayor producción de citocinas Th2 que Thl (Hassan J y Reen DJ. Immunology Today, 2000, 21 : 107-8). Este cuenta con un sistema inmune inmaduro donde las funciones de las células dendríticas, células presentadoras profesionales, están disminuidas con un subsiguiente déficit en la producción de IL-12 (Goriely S et al. J. Immunol., 2001, 166:2141-6), citocina involucrada en el direccionamiento hacia un patrón Thl y la producción de IFND requeridos para el control de la infección con malaria. También, P. falciparum inhibe la maduración de las células dendríticas (Urban BC, et al. Nature, 1999, 400:71-73). Adicionalmente, en el recién nacido existe neutropenia y déficit de algunos componentes del complemento que pudieran también estar involucrados. La producción de citocinas supresoras como la IL-10 y el TGFp por la placenta infectada junto a células T supresoras han sido reportadas (Suguitan AL, et al. Amer. J Trop. Med. Hyg., 2003,69:574-81 y Stanisic DI, et al. J Immunology 2003,171:5461-5469). La IL-10, la anemia, la baja relación TNFoc/IL-10 y la alta parasitemia son factores de riesgo para la relación madre- feto (Tilg H, et al. J Immunol 2002,169:2204-2209) y la IL-10 también se ha asociado con el incremento de la anemia (Tilg H, et al. J. Immunol., 2002, 169:2204-2209 y Jeans RT Jr. Curr. Hematol. Rep., 2003, 2:116-121). Por ello, la posible transferencia de antígenos por excreción/secreción o parásitos en un micro ambiente supresor puede inducir tolerancia o una respuesta inadecuada a algunos antígenos esenciales para la protección contra la Malaria.

La protección contra la Malaria congénita del recién nacido puede ocurrir por:

1. los anticuerpos derivados de la madre transferidos por vía de la placenta (Edozien JC, et al. Lancet, 1962, 2:951; Akanmori BD, et al. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1995, 89:560, Campell CC, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1980, 29:151, How B, et al. Infect. Immun., 1995 ,63:4034, Branco OH, et al. J. Infec. Dis. 2000, 181 :1746, Bruce-Chwatt I, Nature, 1954, 173:353 y Ferry RJ. Trans. R Soc. Trop. Med. Hyg. 1956, 50:41). En los murinos se plantea que ocurre fundamentalmente por la leche (Halliday R. Proc. R. Soc. London. Ser., 1955, B 144:427). No obstante, nosotros encontramos transferencia por la placenta;

2. la presencia de hemoglobina fetal que hace a los eritrocitos menos susceptibles a la infección (Pasvol G, et al. Nature, 1977 ,270: 171);

3. la ausencia de ácido para-aminobenzóico requerido por el parásito en la leche materna (Hawking F. Br. Med. J., 1954, 1 :1201 y Maegraith BG, et al Br. Med. J., 1952, 2:1382) y

4. la menor exposición a las picadas de los mosquitos (MacDonald G. Trop. Dis. Bull., 1950, 47:915) por el uso de mosquiteros en algunos casos impregnados con insecticidas.

Esta protección puede explicar por qué los niños menores de 6 meses están relativamente protegidos contra la malaria severa, su mortalidad y altas parasitemias asexuales (McGuinness d, et al. Trop. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1998, 92:527). No obstante, en la Malaria ocurre un fenómeno único de secuestro de parásitos en la placenta que puede producir muerte fetal, prematuridad, bajo peso al nacer y niños nacidos muertos. Además, las serias alteraciones de la arquitectura de la placenta pueden favorecer el traspaso de antígenos o parásitos que en presencia de anticuerpos maternos pueden ser eficientemente eliminados. También los inmunocomplejos formados (Desowiz RS. Am. Trop. Med. Parasitol., 1988, 82: 121, Jacoksen PH, et al. Immunology, 1998, 93:264-269 y Kasuhara Y, et al. Int. J. Parasitol., 2000, 24:609-15) podrían estimular la respuesta en un micro ambiente desfavorable. De hecho se ha reportado que estos antígenos producen la estimulación ('priming') T en los recién nacidos (Rasheed FN, et al. Parasite. Immunol. 1995, 17: 1 y Fievet N, et al. Parasite. Immunol., 1996, 18:483, Jacoksen PH, et al. Immunology, 1998, 93:264-269). Si esto ocurre es de esperar que dicha estimulación sea de linfocitos Th2 y no de los protectores, Thl . Evidencias que apuntan hacia ello es la producción de IL-4, además de IFND. tras la sensibilización en el útero (King CH, et al. J. Immunol., 2002, 168:356-364), la producción de IgM e IgE anti Malaria en suero de recién nacidos (Achidi EA and Salimanu LS, Afr. J. Med. Sci., 1997, 26:167-70, Chizzolini C, et al. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1991, 45:57-64, Deloron P, et al. Clin. Exp. Immunol., 1997, 110:212-218, Desowitz RS et al. PNG Med. J., 1992, 35:303-305 y Egwunyenga OA, et al. J. Commun. Dis. 1995, 27:77-83), el aumento de sCD30 e IL13 (Holt PG, et al.Allergy 2000,55:688-97) y el predominio de IgGl en ratones (Malhotra I, et al. J Immunolo 2001, 166:2141-6). Es de recordar que la IL-4, la IgE, el sCD30, la IL-13 y en ratones la IgGl son característicos de una respuesta Th2.

Se sabe que los alérgenos son capaces de atravesar la barrera placentaria (Holt PG, et al. Allergy, 2000, 55:688-97) y junto a los helmintos son los principales inductores de IgE y de un patrón Th2. También se sabe que la respuesta a la inmunización con BCG en niños de madres con helmintiasis está deprimida (Malhotra I, et al. J. Immunol., 2001, 166:2141-6). Aunque la aparición y desarrollo de las alergias está relacionada con factores de tipo ambiental, el papel básico en la propensión del individuo a desarrollar una respuesta Th2/IgE hacia antígenos ambientales, es de orden genético (Holgate ST. J. Allergy Clin. Immunol., 1999, 104: 1139-1146). Esto se traduce en que, la descendencia de padres alérgicos lo será también con una mayor frecuencia que los hijos de padres no alérgicos (esta frecuencia se ha estimado en 75, 50 y 25% si ambos parentales, la madre o el padre son alérgicos, respectivamente). Lo que significa que existe una alta probabilidad de predecir el comportamiento de un individuo dentro de la población y por tanto de ésta, si se tiene un sistema de detección a nivel parental. También es conocido que el afianzamiento del patrón patológico Th2 ocurre en los primeros 6-24 meses de vida del niño y que factores ambientales como la exposición a infecciones bacterianas puede influir de forma positiva en la enfermedad induciendo un patrón Thl, que contraregula el Th2 alérgico (Holt PG. Allergy Clin. Immunol. International, 2000, S 1:83-85). Estos hallazgos dejan entrever la posibilidad de diseñar vacunas anti-alérgicas profilácticas, que prevengan el afianzamiento del patrón Th2 hacia los alérgenos, en la temprana infancia. Estas vacunas podrían estar basadas en el empleo de adyuvantes Thl formulados con los alérgenos que fueran efectivos durante la lactancia. La Cloroquina ha sido y sigue siendo empleada como anti malárico. Este es una droga inmunomoduladora (Ertel W, et al. Blood, 1991, 78: 1781-8 y Landewe R, et al. J. Rheumatol. 1992, 19: 1353-7) por lo que empleada en la quimioprofilaxis o tratamiento durante la gestación pudiera estar incrementando los problemas del recién nacido ya sea por la disminución de la adquisición de anticuerpos (Ibeziako PA y Williams AI. Br. J. Obst. Gynecol., 1980, 87:976-82) o por disminuir la sensibilización ('priming') in útero. Las consecuencias del tratamiento con esta u otras drogas no han sido completamente exploradas.

Los adyuvantes son sustancias que potencian la respuesta inmune específica contra un antígeno provocando una inducción más rápida de ésta y aumentando su duración (Vogel FR. Dev. Biol. Stand., 1998, 92:241-248). La Alúmina continúa siendo el adyuvante más usado en las vacunas parenterales. No obstante, éste no es un potente adyuvante que pudiera ayudar a las nuevas vacunas por subunidades. Se considera que sólo posee propiedades de sistema de reparto, aunque recientemente se ha descrito un nuevo mecanismo de acción independiente de los receptores parecidos a Toll que involucra al Nalp3 (Eisenbarth SC et al. Nature, 2008, 453:1122-1 126). Su utilidad mucosal tampoco ha sido probada y se asume que induce preferentemente una respuesta Th2. Los adyuvantes vacunales licenciados son escasos (MF59, AS02, virosoma, AFPL1, Proteollin, MPL, etc.) y pocos son los de aplicación mucosal (CT, LT, CTB, mutantes de LT (LT63K, LTR72), CpG, Quitosana, ISCOM y AFCol) (Singh M y O'Hagan DT. Pharm. Res. 2002,19(6):715-728, Pérez O et al. Immunology and Cell Biology, 2004, 82:603-610). Solo el CTB ha sido licenciado en humanos en una vacuna contra el cólera.

El empleo de los adyuvantes en las formulaciones vacunales permite reducir la cantidad de antígeno necesaria, dirigir la respuesta hacia un patrón deseado y disminuir el número de dosis requeridas. Nosotros contamos con una plataforma de Adyuvantes basada en Proteo- Cocleatos (AFPL1 y AFCol) derivado de N. meningitidis serogrupo B o similares de otros microorganismos para usar en vacunas parenterales o mucosales. Estos adyuvantes inducen una respuesta preferencial Thl en murinos y humanos por administración parenteral caracterizada por: IgG y subclases Thl anti PL; producción de IFNy, IL-12 e TNFa, respuesta positiva de hipersensibilidad retardada y adicionalmente, la inducción de linfocitos T citotóxicos (CTL) (Pérez O et al. Infecí Immun. 2001, 69(7):4502-4508; Pérez O et al. Immunology and Cell Biology. 2004,82:603-610; Rodríguez, T et al. Vaccine 2005, 26:1312- 21; Pérez O, et al. Scand J Immunology 2007,66:271-77). La acción mucosal del AFCol y el AFPLl también ha sido demostrada por aplicaciones nasales, orales, vaginales y rectales y su producción ha sido extendida a similares derivados de otros microorganismos. Los Proteoliposomas y sus derivados los cocleatos, también se han empleado como adyuvantes como es revelado en WO/2004/047805. La aplicación simultánea de AFCol mucosal y AFPLl parenteral con los antígenos correspondientes induce respuestas potentes (patente OCPI CU/P/2008/215).

Los inventores presentes han encontrado una solución al problema de la malaria en recién nacidos y niños provenientes de madres infectadas con P. falciparum. Estos mueren fundamentalmente de anemia causada por ciclos hemáticos incontrolados, por su incapacidad de desarrollar respuestas inmunes protectoras. Estos reconocen como tolerógenos a los derivados parasitarios que arriban desde la placenta infectada a los fetos/recién nacidos con sistemas inmunes inmaduros. De esta forma los derivados parasitarios no pueden ser reconocidos como antígenos sino como sustancias propias o tolerógenos.

Los inventores presentes han encontrado que en la Malaria la necrosis de la placenta permite un mayor paso de los tolerógenos cuando la infección ocurre al término de la gestación. Esto se debe a la disminución del espesor de la placenta en la etapa terminal de la gestación y con ello a la mayor efectividad de las necrosis a nivel de la placenta para transferir los tolerógenos.

Los inventores presentes han encontrado, en un modelo murino de P. berghei y como ocurre en la causada por P. falciparum, que los signos de malaria (la mortalidad fetal y la materna, los nacidos muertos y los bajo peso al nacer) son más graves si la infección ocurre al final de la gestación, es decir, próximo al parto.

Los inventores presentes han encontrado en un modelo murino de gestantes infectadas con P. berghei la anemia como signo de la Malaria en los recién nacidos y que ésta es incrementada por una nueva reinfección de los recién nacidos.

Los inventores presentes han encontrado que la Malaria congénita, poco frecuente en los humanos, es muy frecuente en un modelo murino de P. berghei.

Los inventores presentes han encontrado que los parásitos y/o sus derivados sirven como tolerógenos en el ambiente fetal/recién nacido inmunológicamente inmaduro conllevando a una respuesta de anticuerpos de clase IgG anti merozoitos disminuida y de un patrón principalmente Th2.

Los inventores presentes han usado los tolerógenos para obtener formulaciones con adyuvantes propietarios potentes inductores de respuesta de linfocitos T auxiliarores (Thl) y citotóxicos (CTL).

Los inventores presentes han encontrado tolerógenos de Malaria formulados con potentes adyuvantes son eficientes al inducir respuestas celulares, Thl en recién nacidos.

La presente invención tiene como objeto usar los tolerógenos trasferidos tempranamente de la madre al feto/recién nacido y formularlos con potentes adyuvantes en particular los derivados de N. meningitidis (AFPL1 y AFCol), inductores de respuestas de Thl y CTL para su uso en vacunas profilácticas o terapéuticas contra infecciones de transmisión vertical, particularmente la Malaria. El empleo de estas formulaciones en edades tempranas revierte el estadio de tolerancia induciendo respuestas protectivas.

El término "transmisión vertical" es usado para denominar las infecciones, antígenos o tolerógenos transferidos de la madre al feto/recién nacido a través de la placenta o durante la lactancia.

El término "tolerógeno" es usado en un sentido inmunológico amplio y nunca será interpretado en un sentido restrictivo a un solo componente. Este puede ser un epitope, una proteína, una glicoprotína, un sacárido, un alérgeno, el merozoito total o alguno de sus componentes o sustancias excretadas/secretadas por microrganismos, en particular por Plasmodium.

El término "tolerancia" es usado en un sentido inmunológico amplio y nunca será interpretado en un sentido restrictivo a la ausencia específica de respuesta inmune. Este término puede interpretarse como ausencia o disminución de respuesta humoral específica; desviación del patrón protectivo Thl hacia uno Th2; presencia de respuesta supresora a nivel de citocinas (tales como IL-10 y/o TGF ) o de células T reguladoras; ausencia de respuesta CTL y no inducción de una adecuada memoria inmune. El término "T reguladoras" es aplicable a las células reguladoras naturales (Trl) o inducibles (Th3, Treg, etc.)

El término "Proteoliposoma (PL)" es usado para nanopartículas obtenidos de bacterias usando cualquier método conocido, como puede ser: su aislamiento sin detergente; un proceso que incluya detergente (como desoxicolato, duodesilsulfato de sodio (SDS), etc.) o la extracción a partir de vesículas ("bleb") de sobrenadantes de cultivos y particularmente los revelados en US 5,597,572. Los PLs contienen diferentes Patrones Moleculares Asociados a Patógenos (PAMP, "pathogen-associated molecular patter'). Estos son estructuras moleculares conservadas entre los patógenos capaces de estimular fuertemente al sistema inmunitario innato, particularmente a las células dendríticas y con ello, inducir una potente respuesta adaptativa. Los PLs también contienen proteínas protectogénicas por lo que son usados no solo como adyuvantes contra antígenos heterólogos, sino también como vacunas. Estos contienen estructuras de la membrana externa de las bacterias; pero para los efectos de esta patente también se consideran los extraídos de otros organismos tales como virus, hongos, protozoos, helmintos o células tumorales. El término AF (Adjuvant Finlay) PL se reserva para el uso del PL como adyuvante.

Por "Cocleato (Co)" se entiende un derivado de un PL que por lo tanto también contiene varios PAMPs según se refiere en la patente (WO/2004/047805, Pérez O et al. Infecí Immun. 2001, 69(7) :4502^1508 y Pérez O et al. Immunology and cell Biology. 2004, 82:603-610). El AFPL1 representa el PL extraído del serogrupo B de N. meningitidis. También, para los efectos de esta patente, el concepto de Co se extiende a la producción de los mismos a partir de combinaciones de lípidos sintéticas con la inclusión de PAMPs que actúen sinérgicamente, los que los diferencia radicalmente de otros Co producidos a partir de lípidos sintéticos y no incluidos en la patente referida anteriormente.

Fue sorprendente encontrar que, contrario a lo que ocurre en las gestantes humanas infectadas con P. falciparum donde sólo un relativamente bajo porcentaje de recién nacidos desarrollan malaria congénita, el 100% de los recién nacidos de murinos (ratones y ratas) gestantes infectadas con P. berghei contenían merozoitos, es decir presentaban malaria congénita.

Fue inesperado reproducir muchos de los signos principales de la Malaria humana (mortalidad materna, abortos, anemia, nacidos muertos y bajo peso) en los modelos murinos (ratones y ratas). Fue sorprendente encontrar mayor frecuencia de signos de Malaria en las gestantes infectadas al final del embarazo en los modelos murinos (ratones y ratas), como también ocurre en las gestantes humanas infectadas con P. falciparum.

Fue sorprendente encontrar mayor gravedad de las infecciones en las embarazas jóvenes que en las adultas en los modelos murinos (ratones y ratas), como también ocurre en las gestantes humanas infectadas con P. falciparum.

Fue inesperado encontrar reducción de la respuesta inmune Thl (producción de IgG2a específica) e incremento de la respuesta Th2 (IgGl específica) en los ratones recién nacidos de madres infectadas.

Fue sorprendente encontrar que el AFPL1 y el AFCol funcionan en recién nacidos e inducen respuesta de memoria en los modelos murinos (ratones y ratas).

Más sorprendente fue encontrar que dichas formulaciones funcionen también por vía mucosal y en aplicaciones mucosales y parenterales simultáneas (unitemporales) en los modelos murinos (ratones y ratas).

La novedad de la invención radica primeramente en demostrar que la malaria durante la gestación produce malaria congénita en murinos en porcentajes muy superiores a los reportados para los humanos.

Es también novedoso que, como en los humanos donde las gestantes jóvenes son las más afectadas y cuando las infecciones ocurren en el tercer trimestre del embarazo; pero sin producir malaria congénita en los recién nacidos, también en los murinos los gestantes jóvenes y aquellas preferentemente infectadas al final del embarazo (a término) son las más afectadas, solo que en éstas sí inducen malaria congénita en la descendencia.

También es novedoso que esta infección se comporte como tolerógenos al disminuir la respuesta de anticuerpos y ser estos de un patrón Th2 (IgGl).

Es también novedoso que las formulaciones conteniendo APCol y AFPL1 y antígenos de malaria induzcan respuesta Thl .

Es también novedoso que las formulaciones conteniendo AFCol y AFPL1 funcionen por vía mucosal e incluso en inmunizaciones unitemporales.

Es también novedoso que las formulaciones conteniendo AFCol y AFPL1 funcionen en neonatos e induzcan también respuesta inmune de memoria en edades tempranas. La solución propuesta tiene las siguientes ventajas:

• La necrosis de la placenta, inducida principalmente; pero no exclusivamente por P. falciparum, permite el paso de merozoitos y sustancias derivados de éstos que inducen tolerancia en vez de estimulación antigénica en los fetos/recién nacidos, que es posible revertiría por inmunizaciones tempranas efectivas.

• Las Formulaciones con los potentes adjuvantes: AFPL1 y AFCol conteniendo antígenos/tolerógenos de Malaria revierten la tolerancia inducida, en edades tempranas, por el traspaso de tolerógenos de las gestantes infectadas con Malaria a los fetos/recién nacidos.

• Las Formulaciones con los potentes adjuvantes: AFPL1 y AFCol conteniendo antígenos/tolerógenos de Malaria inducen un patrón de respuesta inmune Thl y CTL.

• Las Formulaciones conteniendo como adyuvante el AFCol funcionan por vía nasal induciendo respuestas inmunes sistémicas potentes a nivel celular (Thl) y de anticuerpos, así como una respuesta inmune cualitativamente superior caracterizada por respuesta a nivel de mucosas.

• Las Formulaciones con los potentes adjuvantes: AFCol y AFPL1 funcionan en aplicaciones por vía mucosl y parenteral simultáneas (vacunas unitemporales).

• Las Formulaciones conteniendo los potentes adjuvantes: AFPL1 y AFCol son funcionales en edades tempranas (recién nacidos).

• Las Formulaciones conteniendo los potentes adjuvantes: AFCol y AFPL1 pueden ser extendidas a la protección de otras infecciones de trasmisión vertical.

• Otros varios objetivos y ventajas de la presente invención se convertirán en aparentes de las siguientes descripciones de esta invención conjuntamente con las figuras.

La presente invención será descrita a través de los siguientes ejemplos específicos.

Ejemplo 1. Obtención del Proteoliposoma (PL). Para la obtención del PL se realiza un cultivo de N. meningitidis de cualquier serogrupo, particularmente el B, Salmonella Typhi, Vibrio cholerae, Echerichia coli, Shiguella, Salmonella, Bordetella pertusus o Micobacterium tuberculosis y la biomasa colectada mediante centrifugación se somete a un proceso de extracción con detergente, enzimas y ultrasonido. El debris celular es removido mediante centrifugación y el sobrenadante es sometido entonces a digestión con nucleasas para eliminar los ácidos nucleicos. El extracto es recuperado mediante ultracentrifugación, resuspendido en solución con detergente y purificado del resto de los componentes de bajo y mediano peso molecular mediante cromatografía de exclusión molecular. El PL de N. meningitidis serogrupo B así obtenido contiene: porinas (PorA y PorB); trazas de DNA bacteriano y menos del 10% (en relación a las proteínas) de LPS nativo insertado en su estructura; pero nunca libre. Las porinas, el DNA y el LPS presente son PAMPs que interactúan sinérgicamente con los receptores de reconocimiento de patrones desencadenando las señales de peligro a nivel de las células involucradas en la respuesta innata. El producto final es sometido a un conjunto de controles biológicos y físico-químicos. En el caso de que el LPS sea, además de un PAMP, el antígeno de interés este puede incrementarse hasta al menos 35% con relación a las proteínas. Similar procedimiento para obtener estructuras liposomales enriquecidas en proteínas de membrana externa se ha empleado partiendo de virus y protozoos.

Ejemplo 2. Obtención de Cocleato (Co) derivado de Proteoliposoma (PL). Se parte de PL obtenido por los métodos descritos en EP 885900077.8 ó US 5, 597,572. Estos son resuspendidos en solución buffer de Tris-EDTA con 0.5% de desoxicolato de sodio. La concentración de proteínas se determinó por Lowry modificado según Peterson (Peterson GL. Analyt. Biochem. 83, 346, 1977). El contenido de los fosfolípidos que forman el PL es determinado mediante la cuantificación del fósforo inorgánico (Bartlett GR. J. Biol. Chem., 1959, 234, 459-465). Tanto la concentración de las proteínas como la concentración de los fosfolípidos fueron empleadas para establecer las condiciones óptimas y las cantidades de detergentes necesarios para la formación del Co. Se prepara una solución con el PL ajustado a una concentración final proteica de 5-6 mg/mL en tampón Tris-EDTA conteniendo desoxicolato de sodio en una cantidad de 6 a 15 veces la cantidad total de proteínas. Esta solución es filtrada directamente en el dispositivo de diálisis a través de un filtro con tamaño de poro de 0,2 μηι. La diálisis es realizada por agitación rotacional, filtración tangencial, o un sistema cerrado durante 24 h con cambio continuo y lento del tampón de diálisis en el primero, varios lavados en el segundo y incrementos de volúmenes según se requiere en el tercero. Esta última solución consistió en NaCl 50-150 mM, Imidazol 1-4 mM, HEPES 3-5 mM y CaCl 2-7 mM en H20 preparada bajo condiciones de esterilidad que fueron conservadas durante todos los pasos. La formación del Co es comprobada por la formación de un precipitado blanco y la posterior observación microscópica tanto óptica como electrónica. La concentración de proteínas y fosfolípidos es nuevamente estimada y ajustada para los posteriores ensayos. Las propiedades físico-químicas de las proteínas incluidas en el Co son chequeadas y comparadas con las del PL mediante electroforesis en geles de poliacrilamida teñidos con Azul de Coomassie. Adicionalmente, la integridad estructural de estas fue chequeada y comprobada por medio de la metodología de Western Blot.

Ejemplo 3. Prolongación de la gestación en ratas jóvenes infectadas con Plasmodium berghei NK65 cerca de la fecha del parto

Protocolo de infección: la cepa de P. berghei NK65 es mantenida por pases sucesivos en ratones. Posteriormente, esta cepa fue adaptada a ratas. Ratas Spray Dowly hembras jóvenes o adultas, con 7±2 ó 11 semanas de nacidas, respectivamente, fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Luego, éstas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los menos 7, 5 ó 3 días antes de la fecha media de parto en los gestantes controles (22 días). Se consideró la infección en el día -3 con respecto al parto como infecciones a término, es decir tardía. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Las ratas fueron observadas 2 veces al día y se determinó los días de parto. Se considero retardo cuando las ratas parieron al menos un día después de las ratas controles. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.

Resultados: las ratas Spray Dowly no infectadas empleadas como controles parieron a los 22 días de gestadas lo que es característico de esta línea. Todas las gestantes infectadas tempranamente durante la gestación, 7 días antes del parto (7) parieron también a los 22 días. Por el contrario las infectadas posteriormente entre -5 y -3 días se retrasaron en sus partos, particularmente las ratas jóvenes en las cuales el retraso fue de 3 días. Las ratas adultas se retrasaron un solo un día (Tab. 1).

Tab. 1. Prolongación de la gestación en ratas jóvenes infectadas cerca de la fecha del parto

Gestación Día de infección Retardo (días)

-3 3

Jóvenes -5 3

-7 0 -3 1

Adultos -5 1

-7 0

Resumen: la infección con P. berghei tardía durante el embarazo produce retardo del parto lo que es más acentuado cuando las gestantes son jóvenes.

Ejemplo 4. Nacidos muertos en ratas jóvenes infectadas cerca del parto y mortalidad de los recién nacidos en ratas adultas infectadas cerca del parto

Protocolo de infección: Ratas Spray Dowly hembras jóvenes o adultas, con 7±2 ó 1 1 semanas de nacidas, respectivamente, fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los 7, 5 ó 3 días antes del parto. Se consideró la infección en el día -3 con respecto al parto como infecciones a término o tardío. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Las ratas fueron observadas al menos 4 veces al día y se determinó los por cientos de nacidos muertos y la mortalidad de los recién nacidos. Estos se cuantificaron desde el día 1 al 5 de nacidos. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.

Resultados: en las ratas Spray Dowly no infectadas empleadas como controles no se observan nacidos muertos ni mortalidad de los recién nacidos. En las gestantes infectadas tempranamente (-7 ó -5 días antes del parto) no se observaron nacidos muertos. Por el contrario, en las ratas gestantes infectadas a término (-3 días antes del parto) se produjeron nacidos muertos tanto en las ratas adultas (12.5%) como en las jóvenes (75%). No obstante, la mortalidad fue muy superior en las jóvenes. La mortalidad de los recién nacidos ocurrió en las ratas adultas infectadas a término (-3 días antes del parto). La alta cifra de nacidos nuestros explica por qué no se produjo mortalidad en los recién nacidos en las ratas jóvenes infectadas a término (Tab. 2).

Tab. 2. Nacidos muertos en ratas jóvenes infectadas cerca del parto y mortalidad de los recién nacidos en ratas adultas infectadas cerca del parto

Gestación Día de infección Nacidos Mortalidad de

muertos (%) recién nacidos (%)

-3 75 0

Jóvenes -5 0 0

-7 0 0 -3 12.5 43

Adultos -5 0 0

-7 0 0

Resumen: la infección con P. berghei tardía durante el embarazo produce alta mortalidad particularmente en las ratas gestantes jóvenes así como mortalidad de los recién nacidos. Ejemplo 5. Ratas jóvenes infectadas a término tuvieron recién nacidos de bajo peso

Protocolo de infección: ratas Spray Dowly hembras jóvenes o adultas, con 7±2 ó 11 semanas de nacidas, respectivamente, fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los 7, 5 ó 3 días antes del parto. Se consideró la infección en el día -3 con respecto al parto como infecciones a término o tardía. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Las ratas fueron observadas al menos 4 veces al día y se determinó los pesos en gramos (g) de los ratones nacidos vivos. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.

Resultados: en las ratas Spray Dowly no infectadas empleadas como controles los pesos de los recién nacidos fueron superiores en las gestante jóvenes que en las adultas. La infección en las gestantes adultas no alteraron en ningún caso el peso de sus recién nacidos. Por el contrario las gestantes jóvenes infectadas a término (-3 días antes del parto) si redujeron el peso de los recién nacidos (Tab. 3).

Tab. 3. Ratas jóvenes infectadas a término tuvieron recién nacidos de baj

Gestación Día de infección Peso nacidos vivos ± ED (g)

-3 5.26 ± 0.45

Jóvenes -5 7.23 ± 0. 83

-7 8.79 ± 0.65

Control 8.18 ±0.46

-3 5.96 ± 0.89

Adultos -5 5.88± 0.56

-7 5.48 ± 0.32

Control 6.67 ± 0.65 Resumen: la infección con P. berghei NK65 a término durante el embarazo reduce el peso de los recién nacidos.

Ejemplo 6. Las ratas jóvenes infectadas a término presentaron mortalidad materna

Protocolo de infección: ratas Spray Dowly hembras jóvenes o adultas, con 7±2 ó 1 1 semanas de nacidas, respectivamente, fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los 7, 5 ó 3 días antes del parto. Se consideró la infección en el día -3 con respecto al parto como infecciones a término o tardía. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Las ratas fueron observadas al menos 4 veces al día y se determinó la ocurrencia de mortalidad materna. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.

Resultados: en las ratas Spray Dowly no infectadas empleadas como controles así com en las gestantes adultas infectadas en diferentes días no se observó mortalidad materna. Tampoco se presentó mortalidad materna en las gestantes jóvenes infectadas a los -7 ó -5 días. Por el contrario, las gestantes jóvenes infectadas a término (-3 días antes del parto) si ocurrió mortalidad materna (Tab. 4).

Tab. 4. Ratas jóvenes infectadas a término tuvieron mortalidad materna

Figure imgf000023_0001

Resumen: la infección con P. berghei tardía durante el embarazo produce alta mortalidad las gestantes jóvenes. Ejemplo 7. Malaria congénita en recién nacidos de madres infectadas

Protocolo de infección: Ratas Spray Dowly hembras fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los -7, -5 ó -3 días antes del parto. En las ratas así como en su descendencia se determinó la infección por examinación microscópica de su sangre. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.

Resultados: Todos los recién nacidos de madres infectadas en cualquier momento de la gestación tuvieron malaria congénita, es decir tenían merozoitos en su sangre. Resumen: El 100% de los recién nacidos de madres infectadas tubo malaria congénita.

Ejemplo 8. Presencia de anemia en los recién nacidos de madres infectadas.

Protocolo de infección: ratas Spray Dowly hembras fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, las ratas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los -7, -5 ó -3 días antes del parto. En las ratas se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Los recién nacidos de madres infectadas o sanas fueron infectados también con P. berghei NK65 a los 5 días de nacidos por vía intraperitoneal. Un grupo proveniente de madres infectadas no fue infectado y este se uso como control. La anemia se expreso en por cientos. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces. Resultados: Se observó anemia en el 18% de los hijos de madres infectadas con P. berghei NK65, la que aumento hasta el 50% cuando los recién nacidos fueron reinfectados con la misma cepa (Fig. 1).

Resumen: La malaria congénita induce anemia en los recién nacidos y esta es incrementada por la reinfección. Ejemplo 9. Potente respuesta Thl inducida por formulaciones de péptidos de malaria y los Adyuvantes Finlay administrados por vía intramuscular o intranasal en recién nacidos con inducción de memoria.

Protocolo: Péptidos de P. falciparum fueron formulados con AFPL1 o AFCol. Ratones Balb/c de 7 días de nacidos fueron inmunizados intramuscularmente con AFPLl+péptido en 2 dosis intramusculares espaciadas 14 días; con AFCol +péptido en 3 dosis intranasales espaciadas 7 días o con una aplicación simultánea por ambas vía. La respuesta en saliva y en suero anti peptídica fue evaluada a los 7 y 21 días posteriores a la última dosis. Una dosis de refuerzo posterior a los 3 meses de inmunizados fue aplicada para evaluar la memoria inmune inducida.

Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: la extracción de sangre se realizó a los 28 días de nacidos a través de una ligera incisura en la cola. Las muestras de sangre obtenidas se incubaron durante 1 h a 37°C, posteriormente se centrifugaron a 2000 g durante 10 min para extraer el suero. Detección de IgG anti merozoitos por ELISA:

Reactivos y Soluciones:

Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 11 mM, NaHC03 35 mM (pH 9.6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)

Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1% (p/v)

Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0, 1%): SSTF, Tween 20 al 0,1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las muestras (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0,1%)

Anti-IgG de ratón conjugado a peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO, EUA)

Solución tampón Sustrato, STS (Na2HP04 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6))

Solución de detención: H2S04 2 M. Metodología:

• Se añade 100 μί/ροζο de antígenos de merozoitos purificados a una concentración de 10 μ^Γηί, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 4°C en cámara húmeda

• Se lava tres veces con SSTF

• Se añade 100 μΙ7ροζο de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda

• Se lava tres veces con solución de lavado

• Se aplican 100 μΙ7ροζο por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y se incuban 2 h a 37°C

• Se lava tres veces con Solución de lavado

• Se adicionan 100 μΙ7ροζο del conjugado anti IgG diluido 1 :2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 1 h a 37°C en cámara húmeda

• Se lava tres veces con Solución de lavado

• Se añade 100 μΙ7ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno orí/zo-fenilendiamina (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min

• La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ, de una solución de detención. La medición de absorbancia en densidad óptica (DO) se realiza a 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus)

Método de Extracción y procesamiento de la saliva: la extracción de saliva se realizó a los 7 días después de la última dosis. Para la toma de muestras de saliva, se estimuló la salivación en los animales con la aplicación intraperitoneal de 50 μΐ. por ratón de pilocarpina al 0.5% (Imefa, Cuba). Las muestras se mantuvieron sobre hielo durante la extracción y se inactivaron inmediatamente a 56°C durante 15 min. Seguidamente fueron centrifugadas a 14000 g durante 15 min a 4°C, se colectó el sobrenadante y se almacenaron a -70°C hasta su uso.

Detección de IgA anti péptido por ELISA:

Reactivos y Soluciones:

Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 11 mM, NaHC03 35 mM (pH 9.6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2) Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1% (p/v)

Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0.1 %): SSTF, Tween 20 al 0.1% (v/v), pH 7.4) Solución de dilución de las Muestra (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0.1%)

Anti-IgA (R5-140) de ratón biotinilado conjugado a peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO, EUA) Estreptavidina-peroxidasa (Sigama, St. Louis, MO, EUA)

Solución tampón Sustrato, STS (Na2HP04 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6))

Solución de detención: H2S04 2 M.

Saliva Estándar de Anticuerpos: Como estándar interno de anticuerpos, para los ensayos de IgA anti PL, se empleó una curva elaborada con muestras de saliva de ratones hiper inmunes.

Metodología:

• Se añade 100 μί/ροζο de péptido a una concentración de 10 μg/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 4°C en cámara húmeda

• Se lava tres veces con SSTF.

• Se añade 100 μί/ροζο de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.

• Se lava tres veces con Solución de lavado.

• La Saliva Estándar de Anticuerpos y las salivas a evaluar se diluyeron 1 :2 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de las diluciones de los sueros individuales y del suero de referencia y se incuban 2 h a 37°C.

• Se lava tres veces con Solución de lavado.

• Se adicionan 100 μΙ7ροζο del conjugado anti IgA a una concentración de 2 μg/mL en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda.

• Se lava tres veces con Solución de lavado.

• Posteriormente, se añade un segundo conjugado (estreptavidina-peroxidasa) en una dilución 1 :2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 30 min a 37°C

• Se lava cinco veces con Solución de lavado

• Se añade 100 μΙ7ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0.01% (v/v) y del cromógeno ort/zo-fenilendiamina (OPD) 0.6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min. • La reacción se detiene mediante la adición de 50 μΐ. de una solución de detención

• La medición de la absorbancia (DO) se realiza a una lectura de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).

Resultados: Se indujo respuesta sistémica de IgG anti péptidos por ambas vías de inmunización y se indujo respuesta de IgA específica en saliva por la inmunización nasal. Adicionalmente, la aplicación simultánea por ambas vías también indujo respuesta sistémica y mucosal. Una dosis a los 3 meses de nacidos (memoria) incremento ambas respuestas inmunes.

Resumen: Las formulaciones adyuvadas inducen respuestas inmunes sistémicas y mucosales y de memoria en los ratones recién nacidos.

Ejemplo 10. Menor IgG anti merozoitos en los recién nacidos de madres infectadas con P. berghei Protocolo de infección: ratones Balb/c hembras fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, éstas fueron infectadas con P. berghei NK65 a los -3 días antes del parto. En las gestantes y en su descendencia se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre. Un grupo de gestantes no fue infectado y su descendencia se empleo como control. Estos fueron infectados P. berghei N 65 a los 5 días de nacidos por vía intraperitoneal. Se tomaron muestras de sangre de los recién nacidos y se extrajo su suero. En estos se evaluaron la respuesta de IgG anti merozoitos inducidas por ELISA. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.

La respuesta de IgG anti péptido fue evaluada como se describe en el ejemplo 9.

Resultados: los recién nacidos de madres infectadas presentaron menores respuestas de IgG anti merozoitos que los infectados nacidos de madres sanas.

Resumen: los recién nacidos de madres infectadas reconocen menos la infección por P. berghei que los recién nacidos sanos infectados, es decir son tolerantes. Ejemplo 11. Alteración del patrón de reconocimiento a nivel de subclases de IgG anti merozoitos en los ratones recién nacidos de madres infectadas con P. berghei

Protocolo de infección: como en los ratones está más claro los patrones Thl/Th2 a nivel de subclases los experimentos para determinarlos se realizaron en ratones Balb/c hembras. Estas fueron apareadas y se verificó su gestación por la pérdida del tampón mucoso. Posteriormente, se infectaron con P. berghei NK65 a los -3 días antes del parto. Se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre tanto en las gestantes como en su descendencia. Un grupo de gestantes no fue infectado y su descendencia se empleo como control. Estos fueron infectados P. berghei NK65 a los 5 días de nacidos por vía intraperitoneal. Se tomaron muestras de sangre de los recién nacidos y se extrajo su suero. En estos se evaluaron la respuesta de IgGl a IgG2a anti merozoitos inducidas por ELISA. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.

Método de Extracción y procesamiento de la sangre para la obtención del suero: Se procedió según se describe en el ejemplo 9. Detección de Subclases IgGl e IgG2a anti merozoitos por ELISA: Reactivos y Soluciones:

Solución tampón de recubrimiento (STR): Na2C03 11 mM, NaHC03 35 mM (pH 9.6) Solución Salina Tamponada con Fosfato (SSTF) 0.15 M (pH 7.2)

Solución de bloqueo (SSTF / SAB 1%): SSTF 0.15 M (pH 7.2), Seroalbumina Bovina al 1 % (p/v)

Solución de lavado (SSTF, Tween 20 al 0.1%): SSTF, Tween 20 al 0.1% (v/v), pH 7,4) Solución de dilución de las Muestra (SSTF, SAB 1%, Tween 20 al 0.1%)

AcM de carnero anti IgGl y anti IgG2a de ratón biotinilado (Amersham, LIFE SCIENCE) Estreptavidina-peroxidasa (Sigma, St. Louis, MO, EUA)

Solución tampón Sustrato, STS (Na2HP04 52 mM y ácido cítrico 25 mM (pH 5.6))

Solución de detención: H2S04 2 M.

Metodología: • Se añade 100 μΤ/ροζο de PL a una concentración de 20 μg/mL, diluido en STR a placas de 96 pozos de alta capacidad de unión (Maxisorp, Nunc, EUA) y se incuban toda la noche a 4°C en cámara húmeda

• Se lava tres veces con SSTF.

• Se añade 100 μί/ροζο de Solución de Bloqueo e incubar 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.

• Se lava tres veces con Solución de lavado.

• Los sueros a evaluar se diluyen 1 : 100 en Solución de dilución de las muestras. Se aplican 100 μί/ροζο por duplicado de las diluciones de los sueros y se incuban 2 h a 37°C.

• Se lava tres veces con Solución de lavado.

• Se adicionan 100 μί/ροζο del conjugado anti IgGl de ratón o anti IgG2a diluido

1:2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incuba 2 h a 37°C en cámara húmeda.

• Se lava tres veces con Solución de lavado.

• Posteriormente, se añade un segundo conjugado (estreptavidina-peroxidasa) en una dilución 1 :2000 en Solución de Dilución de las muestras y se incubó 30 min a 37°C

• Se lava cinco veces con Solución de lavado

• Se añade 100 μΕ/ροζο de una solución de peróxido de hidrógeno 0,01% (v/v) y del cromógeno ortAo-fenilendiamina (OPD) 0,6 mg/mL en STS y se incubaron en la oscuridad durante 30 min.

• La reacción se detiene mediante la adición de 50 ¿L de una solución de detención

• La medición de absorbancia (DO) se realiza a una lectura de 492 nm en un lector de microplacas (Titertek, Multiskan Plus).

Los resultados de IgGl e IgG2a anti PL fueron expresados como densidad óptica (DO). En este ensayo las muestras se consideran positivas por encima del valor 0.25 de DO

Resultados: en los recién nacidos de madres infectadas predominó la respuesta de IgGl (Th2) mientras que en los descendientes de gestantes sanas que fueron infectados después de nacer se detectó también respuesta de IgG2a (Thl) anti merozoitos.

Resumen: se demuestra alteración de la respuesta Thl protectora contra la malaria en los descendientes de madres infectadas. Ejemplo 12. Inducción de respuesta Thl por formulaciones de antígenos de merozoitos de Plasmodium berghei formulados con potentes adyuvantes revierten la tolerancia en recién nacidos de madres infectadas

Protocolo: ratones Balb/c de 10 días de nacidos (recién nacidos) de madres infectadas fueron inmunizados con las formulaciones de AFPLl+antígenos de P. berghei o AFCol+ antígenos de P. berghei aplicadas en dos dosis espaciadas 14 días. Se uso también un grupo control proveniente de madres sanas. Se verificó la infección por examinación microscópica de su sangre antes del comienzo de las inmunizaciones. Se tomaron muestras de sangre de los recién nacidos a los 21 días de la última dosis y se extrajo su suero. En estos se evaluaron la respuesta de IgGl a IgG2a anti antígenos de P. falciparum inducidas por ELISA. Los ensayos se repitieron al menos 3 veces.

Resultados: los ratones controles provenientes de madres no infectadas indujeron respuesta de IgG2a contra los merozoitos de P. berghei. De igual forma los provenientes de madres infectadas también indujeron un patrón Thl (IgG2a). Resumen: las formulaciones con antígenos adyuvados fueron capaces de revertir la tolerancia de los recién nacidos provenientes de madres infectadas.

Claims

TOLEROGENOS ADYUVADOS COMO VACUNA DE MALARIA Reivindicaciones
1. Formulaciones vacunales para la inmunización de mamíferos contra tolerógenos que empleen potentes adyuvantes que evoquen respuesta inmunes celulares (Thl y CTL) y sus correspondientes anticuerpos que rompan la tolerancia inducida por transmisión vertical de tolerógenos al ser administrados por vía parenteral y/o mucosal.
2. Formulaciones vacunales según reivindicación 1, donde el tolerógeno provenga de Malaria, un alérgeno u otra infección de transmisión vertical.
3. Formulaciones vacunales según reivindicación 2, donde la Malaria sea producida por el género Plasmodium, particularmente P. falciparum o P. vivax.
4. Formulaciones vacunales según reivindicación 3, donde el tolerógeno sea el Merozoito o uno de sus constituyentes o derivados.
5. Formulaciones vacunales según reivindicación 4, donde el constituyente sea una proteína, un fosfolípido, un sacárido o cualquiera de sus combinaciones.
6. Formulaciones vacunales según reivindicación 2, donde el alérgeno provenga de un ácaro, un polen o derivados de animales en forma natural o recombinante.
7. Formulaciones vacunales según reivindicación 1, donde el adyuvante sea el AFCol, el AFPL1 u otro adyuvante que induzca una respuesta inmune Thl y CTL o funcione por vía mucosal. Uso de las formulaciones vacunales donde se empleen simultáneamente o independientes la vía mucosal y la parenteral.
Método de tratamiento caracterizado porque comprende la aplicación de formulaciones vacunales conteniendo tolerógenos adyuvados.
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