WO2011067630A1 - Method and kit for dna extraction from vitis vinifera l. and for amplification and detection of grapevine varieties or cultivars in musts or wines - Google Patents

Method and kit for dna extraction from vitis vinifera l. and for amplification and detection of grapevine varieties or cultivars in musts or wines Download PDF

Info

Publication number
WO2011067630A1
WO2011067630A1 PCT/IB2009/055612 IB2009055612W WO2011067630A1 WO 2011067630 A1 WO2011067630 A1 WO 2011067630A1 IB 2009055612 W IB2009055612 W IB 2009055612W WO 2011067630 A1 WO2011067630 A1 WO 2011067630A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dna
wine
extraction
wines
varieties
Prior art date
Application number
PCT/IB2009/055612
Other languages
French (fr)
Portuguese (pt)
Inventor
Paula Filomena Martins Lopes
Maria Leonor GONÇALVES PEREIRA
Henrique De Pinho Guedes Pinto
Original Assignee
Universidade De Trás-Os-Montes E Alto Douro
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to PT104856 priority Critical
Priority to PT10485609A priority patent/PT104856A/en
Application filed by Universidade De Trás-Os-Montes E Alto Douro filed Critical Universidade De Trás-Os-Montes E Alto Douro
Publication of WO2011067630A1 publication Critical patent/WO2011067630A1/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Abstract

The present invention describes a method for extracting DNA from Vitis vinifera L. comprising the following stages: a. precipitating the wine or must samples with isopropanol or 2 propanol, extracting and collecting the pellet; b. incubating the sample resulting from the previous stage with an extraction buffer comprising: • preferably a membrane solubilizer; • one or more anti-oxidizing agents; • a chelant of divalent cations, Mg+2 and/or Ca+2; c. performing one or more extractions on the sample resulting from the previous stage using chloroform and/or phenol; d. performing one or more periods of precipitation and incubation with RNases; e. detecting the grapevine varieties or cultivars. The invention also describes a DNA extraction kit for wine or must samples comprising a solution that contains said extraction buffer, and the extraction is conducted according to the described method. The method and kit can be implemented as a traceability system for ascertaining the origin of the product, detecting counterfeits and mislabelling, and represents an advantageous solution in that it allows grapevine DNA extraction from monovarietal, varietal and commercial musts and wines, thereby making the detection and quantification of different grapevine varieties in musts and wines possible.

Description

Description  Description
Title of Invention: MÉTODO E ESTOJO PARA A EXTRACÇÃO DO ADN DE VITIS VINIFERA L. E PARA A AMPLIFICAÇÃO E DETECÇÃO DE VARIEDADES DE VIDEIRA OU CASTAS EM Title of Invention: METHOD AND CASE FOR THE EXTRACTION OF VITIS VINIFERA L. DNA AND FOR THE AMPLIFICATION AND DETECTION OF VARIETIES OF VINE OR CASSAVES IN
MOSTOS OU VINHOS MUST OR WINES
Domínio Técnico da Invenção  Technical Domain of the Invention
[1] A presente invenção enquadra-se em duas áreas distintas, a da sua aplicação, na área vitivinícola, uma vez que abrange todo o processo de vinificação desde a videira (folha e bago), passando pelo mosto até ao produto final, o vinho, posterior engarrafamento e certificação e também na área da genética molecular, em cujo âmbito se desenvolveu o método de extracção de ADN de videira, a partir de mostos e vinhos monovarietais, varietais e comerciais, e sua amplificação.  [1] The present invention falls into two distinct areas, that of its application, in the wine sector, since it covers the whole process of vinification from the vine (leaf and berry), through the wort to the final product, the wine, subsequent bottling and certification, as well as in the area of molecular genetics, where the method of extracting grapevine DNA from monovarietal, varietal and commercial wines and musts and their amplification was developed.
Introdução  Introduction
[2] A viticultura é uma das actividades agrícolas com maior impacto económico a nível mundial. A União Europeia produz 60% do vinho mundial (156 milhões de hL/ano), o que representa 2,4 biliões de Euros. Contudo, surgem cada vez mais novos países produtores de vinho (Chile, USA, África do Sul e Austrália). Com a adesão de  [2] Viticulture is one of the agricultural activities with the greatest economic impact worldwide. The European Union produces 60% of the world's wine (156 million hL / year), which represents 2.4 billion Euros. However, new wine-producing countries (Chile, USA, South Africa and Australia) are emerging. With the
Portugal à União Europeia, adoptou-se a nomenclatura comunitária de classificação dos vinhos e em Portugal , assim como em vários países, a Denominaçãode Origem designa vinhos cujas características e individualidade são indissociáveis de uma região geográfica determinada, incluindo os factores naturais e humanos. No entanto, para que um vinho beneficie de uma Denominação de Origem todo o processo de produção do vinho é rigorosamente controlado, desde a vinha até ao consumidor, cumprindo uma selecção de variedades de videira autorizadas para cada região, métodos de vinificação e características organolépticas. Em Portugal, o organismo responsável pelo controlo, garantindo a genuinidade dentro das regiões demarcadas (Lei n°. 8/85, de 4 de Junho) são as Comissões Vitivinícolas Regionais. A primeira região de Denominação de Origem Controlada (DOC) surgiu em Portugal no séc. XVIII (Região do Vinho do Porto - 1756), no entanto, só há relativamente pouco tempo se generalizou a demarcação de outras regiões produtoras de vinhos de qualidade. Tal como referido anteriormente todo o controlo é efectuado nas regiões vitícolas e adegas incluindo engarrafamento, rotulagem e distribuição, no entanto, esta fiscalização não impede que as fraudes ocorram continuamente, principalmente em produtos certificados com elevado valor económico, como o Vinho do Porto. A informação falaciosa presente em rótulos, relativamente às variedades de videira usadas na produção de determinado vinho e a origem das mesmas, assim como a falsificação de selos de certificação exige uma resposta imediata por parte dos organismos competentes. Portugal in the European Union, the Community nomenclature for wine classification has been adopted and in Portugal, as well as in several countries, the Denominación de Origen means wines whose characteristics and individuality are inseparable from a given geographical region, including natural and human factors. However, for a wine to benefit from a Denomination of Origin, the entire process of wine production is strictly controlled from the vineyard to the consumer, fulfilling a selection of vine varieties authorized for each region, vinification methods and organoleptic characteristics. In Portugal, the body responsible for control, ensuring the genuineness within the demarcated regions (Law no. 8/85, of 4 June) are the Regional Wine Commissions. The first region of Denomination of Controlled Origin (DOC) originated in Portugal in the 19th century. XVIII (Port Wine Region - 1756), however, it is only relatively recently that the demarcation of other regions producing quality wines has become widespread. As mentioned above all control is carried out in wine-growing and wine-growing regions including bottling, labeling and distribution, however, this inspection does not prevent fraud from occurring continuously, especially in certified products with a high economic value, such as Port wine. The fallacious information on labels, in relation to the vine varieties used in the production of a particular wine and the origin thereof, as well as the falsification of certification response by the competent bodies.
[3] A presente invenção descreve um método simples e rápido de extracção de ADN de videira a partir de vinhos possibilitando a detecção/quantificação de diferentes variedades em mostos e vinhos revestindo-se por isso, de extrema importância no controlo de qualidade do vinho produzido, detecção de falsificações, aumento da segurança alimentar e rejeição do vinho importado vendido como produto nacional ou uvas de diferentes variedades e regiões introduzidas em outras regiões de vinhos DOC. Sumário da invenção  [3] The present invention describes a simple and rapid method of extracting grapevine DNA from wines allowing the detection / quantification of different varieties in musts and wines, thus being of extreme importance in quality control of wine produced , detection of forgeries, increased food safety and rejection of imported wine sold as national product or grapes of different varieties and regions introduced into other regions of DOC wines. SUMMARY OF THE INVENTION
[4] Esta invenção é uma consequência natural da procura económica e social actual.  [4] This invention is a natural consequence of current economic and social demand.
Surge como resposta aos, cada vez mais exigentes, consumidores que requerem segurança alimentar e uma verificação precisa do produto certificado adquirido uma vez que permite a detecção e consequente quantificação de variedade de videira utilizada na produção de determinado vinho que se encontra referenciada no rótulo.  It comes as a response to the increasingly demanding consumers who require food safety and an accurate verification of the certified product purchased since it allows the detection and consequent quantification of the variety of vine used in the production of a particular wine that is referenced on the label.
[5] Até ao momento, os métodos desenvolvidos para a identificação de variedades de videiras não apresentavam qualquer componente genética, apenas compreendiam perfis proteicos, antocianinas, compostos aromáticos e elementos químicos. Deste modo, dependiam de diversos factores tais como a composição do solo, condições climáticas, e dos processos de vinificação e envelhecimento do vinho comprometendo a identificação da variedade de videira utilizada na produção de determinado mosto/ vinho.  [5] So far, the methods developed for the identification of grapevine varieties did not contain any genetic component, they only comprised protein profiles, anthocyanins, aromatic compounds and chemical elements. In this way, they depended on several factors such as the composition of the soil, climatic conditions, and the processes of vinification and aging of the wine compromising the identification of the grape variety used in the production of a certain must / wine.
[6] De acordo com a literatura existente, a extracção de ADN de videira foi testada em vinhos experimentais recolhidos imediatamente após o processo de fermentação e até dois anos de engarrafamento, no entanto, todas as tentativas falharam devido à ineficácia dos métodos em ultrapassar os inúmeros problemas encontrados no decorrer do processo. A escassez de ADN obtido no final da extracção e a sua fraca qualidade, a interferência de polissacarídeos, taninos e polifenóis presentes nestas matrizes na amplificação do ADN impediam a identificação das variedades e conduziam a abordagens cada vez mais complexas.  [6] According to existing literature, DNA extraction from grapevine was tested on experimental wines collected immediately after the fermentation process and up to two years of bottling, however, all attempts failed because of the inefficacy of the methods in overcoming the numerous problems encountered in the course of the process. The shortage of DNA obtained at the end of the extraction and its poor quality, the interference of polysaccharides, tannins and polyphenols present in these matrices in DNA amplification prevented the identification of the varieties and led to increasingly complex approaches.
[7] O método aqui descrito não depende de factores externos, aplica-se a ADN de videira em amostras de vinho até agora inacessíveis, é de fácil execução, não compreende acções perigosas ou letais durante a sua realização, o processo é rápido relativamente às actuais metodologias, não admite custos excessivos, e sobretudo supera, sem excepção, todos os problemas técnicos expostos anteriormente. No final, os resultados, alcançados de uma forma fácil e rápida, são exactos (confirmam a existência de determinada variedade) e inequívocos.  [7] The method described here does not depend on external factors, it applies to vine DNA in hitherto inaccessible wine samples, is easy to perform, does not comprise dangerous or lethal actions during its implementation, the process is quick methodologies, does not admit of excessive costs, and above all goes beyond all the technical problems set out above. In the end, the results, achieved in an easy and fast way, are accurate (confirm the existence of a certain variety) and unequivocal.
[8] Um dos objectos da presente invenção é a descrição de um método de extracção de [8] One of the objects of the present invention is the description of a method of extracting
ADN de Vitis vinifera L. caracterizado por compreender as seguintes etapas: DNA of Vitis vinifera L. characterized by comprising the following steps:
a. precipitar as amostras de vinho ou mosto com isopropanol ou 2 propanol, extrair e recolher o sedimento; The. precipitate the wine or must samples with isopropanol or 2-propanol, extract and collecting the sediment;
b. incubar a amostra resultante da etapa anterior com um tampão de extracção que compreende:  B. incubating the resulting sample from the previous step with an extraction buffer comprising:
- um solubilizador de membranas, de preferência um detergente catiónico, CTAB - brometo de cetiltrimeltilamónia;  a membrane solubilizer, preferably a cationic detergent, CTAB - cetyltrimethyl ammonium bromide;
- um ou mais agentes anti-oxidantes;  one or more anti-oxidant agents;
- uma substância quelante de catiões divalentes, Mg+2 e/ou Ca+2, de preferência EDTA- a divalent cation chelating agent, Mg +2 and / or Ca +2 , preferably EDTA
- ácido etilenodiamino tetra-acético; - ethylenediamine tetraacetic acid;
c. efectuar uma ou mais extracções da amostra resultante da etapa anterior, utilizando clorofórmio e/ou fenol;  W. performing one or more extractions of the sample resulting from the previous step using chloroform and / or phenol;
d. efectuar um ou mais períodos de precipitação e de incubação com RNases.  d. carry out one or more periods of precipitation and incubation with RNases.
[9] Numa realização preferencial, existe uma etapa prévia etapa prévia de precipitação da a amostra em 2-propanol ou isopropanol, centrifugando a amostra e recolhendo-se o sedimento.  [9] In a preferred embodiment, there is a previous step prior step of precipitating the sample into 2-propanol or isopropanol by centrifuging the sample and collecting the pellet.
[10] Numa outra realização preferencial a solução de extracção compreender ainda cloreto de sódio e tris-HCl. Numa realização ainda mais preferencial os agentes anti-oxidantes utilizados podem ser polivinilpirrolidona (PVP) e/ou o β-mercaptoetanol.  [10] In another preferred embodiment the extraction solution further comprises sodium chloride and tris-HCl. In an even more preferred embodiment the anti-oxidant agents used may be polyvinylpyrrolidone (PVP) and / or β-mercaptoethanol.
[11] Numa realização ainda mais preferencial o tampão de extracção é previamente  [11] In an even more preferred embodiment the extraction buffer is previously
aquecido.  heated.
[12] Numa outra realização preferencial o ADN extraído, de amostras de vinho ou mosto, é posteriormente amplificado e identificado com marcadores adequados à variedade ou casta da Vitis vmi èraLNuma realização ainda mais preferencial pode-se amplificar e identificar o ADN extraído, por PCR e com marcadores específicos, de pelo menos uma das seguintes variedades ou castas de Vitis vinifera L. ou por técnicas de hibridação.  [12] In a further preferred embodiment the extracted DNA from wine or must samples is further amplified and identified with markers suitable for the variety or caste of Vitis viridis. In an even more preferred embodiment one can amplify and identify the extracted DNA by PCR and with specific markers, of at least one of the following varieties or varieties of Vitis vinifera L. or by hybridization techniques.
[13] Uma realização ainda mais preferencial da presente invenção é identificação do ADN extraído, por PCR e com marcadores específicos, de pelo menos uma das seguintes variedades ou castas:  [13] An even more preferred embodiment of the present invention is the identification of DNA extracted by PCR with specific markers from at least one of the following varieties or varieties:
Alicante Bouschet, Baga, Barbera, Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Canaiolo, Carménère, Cinsaut, Dolcetto, Gamay, Malbec, Merlot, Mourvèdre, Nebbiolo, Petit Syrah, Pinot Noir, Syrah, Sangiovese, Tannat , TempraniUo ou Aragonez, Tinta Negra Mole, Touriga Nacional, Negra Mole, Blaufrankish ou Kekfrancós, Abelhal,  Alicante Bouschet, Baga, Barbera, Cabernet Sauvignon, Canaiolo, Carménère, Cinsaut, Dolcetto, Gamay, Malbec, Merlot, Mourvèdre, Nebbiolo, Petit Syrah, Pinot Noir, Syrah, Sangiovese, Tannat, TempraniUo or Aragonez, Mole Black Ink , Touriga Nacional, Negra Mole, Blaufrankish or Kekfrancós, Abelhal,
Alvarinho, Chardonnay, Chenin Blanc, Gewiirztraminer, Malvasia, Muller- Thurgau, Pinot Blanc, Pinot Grigio, Prosecco, Riesling, Sauvignon Blanc, Semillon Blanc, Trebiano, Furmint , Moscatel Amarela (yellow Muscat), Zeta, Bouvier , Riesling, Harslevelu, Milleau , Mosaico Liturcci ou Cereza Italiana, Riesling Rosè, Saint Tomaint, Terreau.  Alvarinho, Chardonnay, Chenin Blanc, Gewiirztraminer, Malvasia, Muller-Thurgau, Pinot Blanc, Pinot Grigio, Prosecco, Riesling, Sauvignon Blanc, Semillon Blanc, Trebiano, Furmint, Muscat Yellow, Zeta, Bouvier, Riesling, Harslevelu, Milleau, Mosaic Liturcci or Italian Cherry, Riesling Rosè, Saint Tomaint, Terreau.
[14] Numa realização ainda mais preferencial para a amplificação e identificação de ADN extraído de castas ou variedades vegetais de Vitis vinifera L., por PCR poderá utilizar- se entre outros os seguintes marcadores moleculares ssrVVS2, ssrVVMD5, ssrVVMD7, ssrVVMD27, VrZAG62 e ssrVrZAG79. [14] In an even more preferred embodiment for the amplification and identification of DNA from strains or plant varieties of Vitis vinifera L., the following molecular markers may be used, among others: ssrVVS2, ssrVVMD5, ssrVVMD7, ssrVVMD27, VrZAG62 and ssrVrZAG79.
[15] Numa realização ainda mais preferencial as amostras de vinhos ou mostos a analisar, poderão ser recolhidas durante a fermentação, na fase final da fermentação, na maturação, envelhecimento ou em vinho engarrafado independentemente da sua idade.  In still more preferred embodiment samples of wines or musts to be analyzed may be collected during fermentation, in the final stage of fermentation, in maturation, aging or in bottled wine irrespective of their age.
[16] Numa outra realização preferencial o método de extracção de ADN Vitis vinifera L., em amostras de vinhos ou mostos o ADN extraído está isento de contaminação por fenol, polissacarídeos, proteínas, outros compostos fenólicos, solventes e sais que absorvam a 280, 270 e 230 nm.  [16] In another preferred embodiment the DNA extraction method Vitis vinifera L., in samples of wines or musts the extracted DNA is free from contamination by phenol, polysaccharides, proteins, other phenolic compounds, solvents and salts which absorb 280, 270 and 230 nm.
[17] Numa realização mais preferencial o método de extracção de ADN de Vitis vinifera L., em amostras de vinho ou mosto o ADN obtido contêm um número de pares de bases compreendido entre 10 e 2 500 bp, preferencialmente entre 245 e 249 bp.  [17] In a more preferred embodiment of the method of extracting DNA from Vitis vinifera L., in wine or must samples the obtained DNA contains a number of base pairs comprised between 10 and 2500 bp, preferably between 245 and 249 bp.
[18] É ainda objecto da presente invenção a descrição de um estojo de extracção de ADN em amostras de vinho ou mosto caracterizado por compreender uma solução que contém o tampão de extracção anteriormente referido, onde de preferência a extracção de ADN de Vitis vinifera L., em amostras de vinho ou mosto se realiza pelo método anteriormente descrito.  It is further object of the present invention to provide a description of a DNA extraction kit in samples of wine or wort characterized in that it comprises a solution containing the aforementioned extraction buffer, where preferably the extraction of Vitis vinifera L. , in samples of wine or must is performed by the method described above.
[19] O estojo poderá ainda conter pelo menos uma das seguintes soluções:  [19] The kit may also contain at least one of the following solutions:
- uma solução de precipitação que compreende de preferência 2-propanol ou iso- propanol;  a precipitation solution which preferably comprises 2-propanol or isopropanol;
- uma solução de lavagem,  - a washing solution,
- uma solução que compreende pelo menos um dos seguintes compostos: fenol, ou clorofórmio, RNase e Proteinase K.  - a solution comprising at least one of the following compounds: phenol, or chloroform, RNase and Proteinase K.
Antecedentes da Invenção  Background of the Invention
[20] A produção de vinho movimenta biliões de euros por ano, atraindo, portanto, práticas fraudulentas. A União Europeia adoptou legislação específica (178/2002) sobre a ras- treabilidade dos alimentos para melhorar a qualidade e a segurança alimentar, proteger os consumidores contra informações falsas sobre o produto e deste modo promover o comércio justo. Deste modo, é essencial associar o conhecimento científico ao consórcio legislativo existente, com a finalidade de desenvolver métodos para rastre- abilidade de produtos vitícolas, de modo a garantir a origem do produto e detectar fraudes. [20] Wine production moves billions of euros per year, thus attracting fraudulent practices. The European Union has adopted specific legislation (178/2002) on food traceability to improve food quality and safety, protect consumers against false product information and thereby promote fair trade. It is therefore essential to associate scientific knowledge with the existing consortium with the aim of developing methods for traceability of wine products so as to guarantee the origin of the product and detect fraud.
[21] O desenvolvimento de métodos confiáveis para a detecção de variedades de videiras em vinhos reveste-se de crucial importância uma vez que o conhecimento da origem e a protecção de produtos de denominação de origem controlada é cada vez mais uma necessidade.  [21] The development of reliable methods for the detection of grapevine varieties in wines is of crucial importance as knowledge of the origin and the protection of controlled denomination of origin products is increasingly a necessity.
[22] Até ao momento não se encontra patenteado nenhum método referente à extracção de ADN de Vitis viniferaL. em vinhos. [22] To date no method has been Vitis vinifera L. DNA. in wines.
[23] O documento ES 2 059 280, de origem espanhola, refere-se ao modo de produção de uma levedura, por técnicas de ADN recombinante ( levedura vínica CETC 1973), e a sua aplicação industrial como levedura vínica para aperfeiçoamento dos aromas do vinho. Deste modo, é notória a diferença de propósitos entre esta patente e a que aqui se propõe. [23] Document ES 2 059 280, of Spanish origin, concerns the method of production of a yeast by recombinant DNA techniques (CETC yeast 1973) and its industrial application as a wine yeast for the improvement of flavorings of the yeast. wine. Thus, the difference in purpose between this patent and the one proposed here is obvious.
[24] O documento CN 101210032, de origem chinesa, refere-se a um método de  [24] CN 101210032, of Chinese origin, refers to a method of
preparação de culturas de células (leveduras de vinificação).  preparation of cell cultures (vinification yeasts).
[25] Na literatura, os métodos até ao momento desenvolvidos para a identificação de  [25] In the literature, the methods so far developed for the identification of
variedades de videiras ou a origem geográfica das uvas compreendem perfis proteicos [ Gonzalez-Lara, R., Correa, I., Polo, M.C., Martin-Alvarez, P.J., Ramos, M. (1989). Food Chem. 34: 103-110; Pueyo, E., Dizy, M., Polo, M.C. (1993). Am. J. Enol. Vitic. 44: 255-260; Moreno- Arribas, M.V., Cabello, F., Polo, M.C., Martin-Alvarez, P.J., Pueyo, E. (1999). /. Agne. Food Chem. 47: 114-120] , antocianinas [ Revilla, E., Garcia-Beneylez, E., Cabello, F., Martin-Ortega, G., Ryan, J.M. (2001). /.  varieties of vines or the geographical origin of the grapes comprise protein profiles [Gonzalez-Lara, R., Correa, I., Polo, M.C., Martin-Alvarez, P.J., Ramos, M. (1989). Food Chem. 34: 103-110; Pueyo, E., Dizy, M., Polo, M.C. (1993). Am. J. Enol. Vitic. 44: 255-260; Moreno- Arribas, M.V., Cabello, F., Polo, M.C., Martin-Alvarez, P.J., Pueyo, E. (1999). /. Agne. Food Chem. 47: 114-120], anthocyanins [Revilla, E., Garcia-Beneylez, E., Cabello, F., Martin-Ortega, G., Ryan, J.M. (2001). /.
Chromatogr. A 915: 53-60; Garcia-Beneytez, E., Cabello, F., Revilla, E. ( 2003). /. Agne. Food Chem. , 51: 5622-5629] , aminoácidos [ Vasconcellos, A.M.P., Chaves das Neves, HJ. (1989). /. Agne. Food Chem. 37: 931-937] , compostos aromáticos [ Munoz-Organero, G. e Ortiz, J.M. (1987) Riv . Vitic. Enol. 3: 55-64] e elementos químicos [ Almeida, CM. e Vasconcelos, M.T. (2003). /. Agric. Food Chem. 51: 4788-4798; Monaci, F., Bergagli, R. Fcardi, S. (2003). /. Trace Elem. Med. Biol. 17: 45-50; Coetzee, P.P. e Vanhaecke, F. (2005). Anal. Bioanal. Chem. 383: 977-984] . No entanto, estes métodos apresentam como principais desvantagens a duração e a dependência de diversos factores tais como a composição do solo, condições climáticas, os processos de vinificação e de envelhecimento do vinho comprometendo a identificação da (s) variedade (s) de videira utilizada na produção do vinho.  Chromatogr. A 915: 53-60; Garcia-Beneytez, E., Cabello, F., Revilla, E. (2003). /. Agne. Food Chem. , 51: 5622-5629], amino acids [Vasconcellos, A.M.P., Chaves das Neves, HJ. (1989). /. Agne. Food Chem. 37: 931-937], aromatic compounds [Munoz-Organero, G. and Ortiz, J.M. (1987) Riv. Vitic. Enol. 3: 55-64] and chemical elements [Almeida, CM. and Vasconcelos, M.T. (2003). /. Agric. Food Chem. 51: 4788-4798; Monaci, F., Bergagli, R. Fcardi, S. (2003). /. Trace Elem. Med. Biol. 17: 45-50; Coetzee, P.P. and Vanhaecke, F. (2005). Anal. Bioanal. Chem. 383: 977-984]. However, these methods have as main drawbacks the duration and dependence of various factors such as soil composition, climatic conditions, vinification processes and aging of the wine, thus compromising the identification of the grape variety (s) used in wine production.
[26] O ADN de videira pode ser extraído de qualquer parte da planta, no entanto, a  [26] Vine DNA can be extracted from any part of the plant, however, the
preferência recai em folhas jovens [ Lodhi, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Reisch, B.I. (1994). Plant Mol. Biol. Rep. 12: 6-13]. Apenas alguns estudos referem a extracção de ADN a partir de sumo de uva [ Faria, M.A., Magalhães, R., Ferreira, M.A., Meredith, C.P., Monteiro, F.F. (2000). /. Agric. Food Chem. 48: 1096-1100] , mosto [ Baleiras- Couto, M.M.e Eiras-Dias, J.E. (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291; Rodríguez- Plaza, P., González, R., Moreno- Arribas, M.V., Polo, M.C., Bravo, G., Martínez- Zapater, J.M., Martinez, M.C.; Cifuentes, A. ( 2006). Eur. Food Res. Technol. 223: 625-631; Faria, M.; Nunes, E.; Oliveira, M. (2008). Eur. Food Res. Technol. 227: 845-850], vinhos experimentais recolhidos imediatamente após o final do processo de fermentação [ Baleiras-Couto, M.M.e Eiras-Dias, J.E. (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291; Garcia-Beneytez, E., Maria, V.M., Joaquin, B., Maria, C.P., Javier, I. (2002). J. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096; Siret, R.; Gigaud, O., Rosec, J.P., This, P. preference lies in young leaves [Lodhi, MA, Ye, GN, Weeden, NF, Reisch, BI (1994). Plant Mol. Biol. Rep. 12: 6-13]. Only a few studies have reported the extraction of DNA from grape juice [Faria, MA, Magalhães, R., Ferreira, MA, Meredith, CP, Monteiro, FF (2000). /. Agric. Food Chem. 48: 1096-1100], must [Baleiras- Couto, MMe Eiras-Dias, JE (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291; Rodríguez-Plaza, P., González, R., Moreno-Arribas, MV, Polo, MC, Bravo, G., Martínez-Zapater, JM, Martinez, MC; Cifuentes, A. (2006). Eur. Food Res. Technol. 223: 625-631; Faria, M .; Nunes, E .; Oliveira, M. (2008). Eur. Food Res. Technol. 227: 845-850], experimental wines collected immediately after the end of the fermentation process [Baleiras-Couto, MMe Eiras-Dias, JE (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291; Garcia-Beneytez, E., Maria, VM, Joaquin, B., Maria, CP, Javier, I. (2002). J. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096; Siret, R .; Gigaud, O., Rosec, JP, This, P.
(2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827 ] e com alguma idade [ Savazzini, F. e Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282; Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). /. Agric. Food Chem. 55 : 10388-10395; Drábek, J.; Stávek, J.; Jal vková, M.; Jurbek, T.; Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491- 497 ], no entanto, nenhum deles apresentou resultados conclusivos.  (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827] and with some age [Savazzini, F. and Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282; Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). /. Agric. Food Chem. 55: 10388-10395; Drábek, J .; Stávek, J .; Jal vková, M .; Jurbek, T .; Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491- 497], however, none of them presented conclusive results.
[27] A extracção eficiente e a amplificação de ADN de mostos e vinhos é maioritariamente comprometida pela interferência de polissacarídeos, taninos e polifenóis presentes nestas matrizes, pela degradação bioquímica, acção enzimática e o próprio processo de vinificação [ Faria, M.; Nunes, E.; Oliveira, M. (2008). Eur. Food Res. Technol. 227: 845-850 ; Garcia-Beneytez, E., Maria, V.M., Joaquin, B., Maria, C.P., Javier, I. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096; Savazzini, F. e Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282; Siret, R.; Gigaud, O., Rosec, J.P., This, P. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827 ]. Estudos anteriores colocaram a hipótese de que a decantação, clarificação e filtração removem completamente o ADN da videira [ Garcia-Beneytez, E., Maria, V.M., Joaquin, B., Maria, C.P., Javier, I. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096] .  [27] Efficient extraction and DNA amplification of musts and wines is mostly compromised by the interference of polysaccharides, tannins and polyphenols present in these matrices, by biochemical degradation, enzymatic action and the winemaking process itself [Faria, M .; Nunes, E .; Oliveira, M. (2008). Eur. Food Res. Technol. 227: 845-850; Garcia-Beneytez, E., Maria, V.M., Joaquin, B., Maria, C.P., Javier, I. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096; Savazzini, F. and Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282; Siret, R .; Gigaud, O., Rosec, J.P., This, P. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827]. Previous studies have hypothesized that decantation, clarification, and filtration completely remove DNA from the vine [Garcia-Beneytez, E., Maria, V.M., Joaquin, B., Maria, C.P., Javier, I. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096].
[28] A diferenciação de variedades de videira pela reacção em cadeia da polimerase  [28] The differentiation of grape varieties by the polymerase chain reaction
(PCR) usando o vinho como modelo é dificultada pela escassa quantidade de ADN presente assim como a sua fraca qualidade. As principais causas são a degradação do ADN da planta durante a fermentação, a contaminação por ADNs de microrganismos, em particular de leveduras, a interferência da extracção de ADN por polissacarídeos e polipeptídeos e a coexistência de substâncias como os polifenóis, que inibem a DNA polimerase na reacção de PCR [ Garcia-Beneytez, E., Maria, V.M., Joaquin, B., Maria, C.P., Javier, I. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096; Siret, R.; Gigaud, O., Rosec, J.P., This, P. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827 ]. Recentemente, têm sido adoptadas novas abordagens para superar as várias dificuldades encontradas na obtenção do ADN extraído do vinho e sua amplificação [ Savazzini, F. e Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282; Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). /. Agric. Food Chem. 55 : 10388-10395; Drábek, J.; Stávek, J.; Jal vková, M.; Jurbek, T.; Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491- 497 ], mas nenhum delas tem sido bem sucedida já que os problemas relacionados com o método de extracção e amplificação do ADN permanecem.  (PCR) using wine as a model is hampered by the scarce amount of DNA present as well as its poor quality. The main causes are degradation of plant DNA during fermentation, contamination by DNAs of microorganisms, in particular yeasts, interference of DNA extraction by polysaccharides and polypeptides, and the coexistence of substances such as polyphenols, which inhibit DNA polymerase in the PCR reaction [Garcia-Beneytez, E., Maria, VM, Joaquin, B., Maria, CP, Javier, I. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096; Siret, R .; Gigaud, O., Rosec, J.P., This, P. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827]. Recently, new approaches have been adopted to overcome the various difficulties encountered in obtaining DNA extracted from wine and its amplification [Savazzini, F. and Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282; Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). /. Agric. Food Chem. 55: 10388-10395; Drábek, J .; Stávek, J .; Jal vková, M .; Jurbek, T .; Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491- 497], but none of them have been successful since problems related to the method of DNA extraction and amplification remain.
[29] Relativamente aos dados até ao momento publicados na literatura referem-se as  [29] With regard to the data published so far published in the literature, the
seguintes vantagens e problemas superados pela invenção aqui descrita:  the following advantages and problems overcome by the invention described herein:
• Tipo de amostra - Esta invenção permite a extracção eficiente e consequente amplificação de ADN genómico de folhas, de mosto (início da fermentação) e vinhos, e neste caso, considerando amostras recolhidas no final da fermentação e após vários anos de engarrafamento, algo que até ao momento não tinha sido alcançado. Alguns autores testaram os seus protocolos, em vinhos experimentais recolhidos imediatamente após o final do processo de fermentação [ Baleiras-Couto, M.M. e Eiras-Dias, J.E. (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291 ; e com alguma idade [ Savazzini, F. e Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282; Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). J. Agric. Food Chem. 55 : 10388- 10395; Drábek, J., Stávek, J., Jal vková, M., Jurbek, T., Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491-497 ], mas nunca tantos anos após o engarrafamento. Em todos os casos, os resultados foram infrutíferos. • Sample type - This invention allows the efficient extraction and consequent amplification of genomic DNA from leaves, wort (beginning of fermentation) and wines, and in this case, considering samples collected at the end of the fermentation and after several years of bottling, something that had not been achieved so far. Some authors tested their protocols in experimental wines collected immediately after the end of the fermentation process [Baleiras-Couto, MM and Eiras-Dias, JE (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291; and with some age [Savazzini, F. and Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282; Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). J. Agric. Food Chem. 55: 10388-10395; Drábek, J., Stávek, J., Jalkov, M., Jurbek, T., Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491-497], but never so many years after bottling. In all cases, the results were fruitless.
• Volume inicial de amostra - O método proposto permite a extracção de ADN de videira a partir de um volume de amostra de vinho de apenas 10 mL mostrando-se vantajoso em relação aos volumes apresentados na literatura actual, que variam de 30 a 400 mL [ Baleiras-Couto, M.M. e Eiras-Dias, J.E. (2006). Anal. Chim. Acta 563:  • Initial sample volume - The proposed method allows the extraction of grapevine DNA from a volume of wine sample of only 10 mL showing advantageous in relation to the volumes presented in the current literature, ranging from 30 to 400 mL [ Baleiras-Couto, MM and Eiras-Dias, J.E. (2006). Anal. Chim. Minutes 563:
283-291 ; Savazzini, F. e Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282; 283-291; Savazzini, F. and Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563: 274-282;
Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). /. Agric. Food Chem. 55 : 10388-10395; Drábek, J., Stávek, 1, Jal vková, M., Jurbek, T., Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491-497 ]. Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). /. Agric. Food Chem. 55: 10388-10395; Drábek, J., Stávek, 1, Jal vková, M., Jurbek, T., Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491-497].
• Integridade e quantidade de ADN - Relatórios anteriores referiam que o ADN extraído de amostras de vinho para além de ser escasso apresentava sempre má qualidade, justificando este facto principalmente com a degradação do ADN durante o processo de vinificação [ Baleiras-Couto, M.M. e Eiras-Dias, J.E. (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291 ; Savazzini, F. e Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Acta 563:  • Integrity and quantity of DNA - Previous reports stated that DNA extracted from samples of wine was not always scarce, but always showed poor quality, justifying this mainly with the degradation of DNA during the vinification process [Baleiras-Couto, M.M. and Eiras-Dias, J.E. (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291; Savazzini, F. and Martinelli, L. (2006) Anal. Chim. Minutes 563:
274-282; Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). /. Agric. Food Chem. 55 : 10388-10395; Drábek, J., Stávek, J., Jal vková, M., Jurbek, T., Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491- 497 ]. Neste estudo, a quantificação das amostras de ADN genómico extraído do vinho revelou uma elevada concentração e pureza, demonstrando que o ADN de Vitis vinifera L. permanece não só após a fermentação, como também resiste a todo a o processo de vinificação, uma vez que as amostras de vinho foram recolhidas no final da fermentação e até cinco anos após o engarrafamento. Para a resolução destes problemas foi necessário um processo de optimização do protocolo de extracção de ADN de Vitis vinifera L. em vinhos. 274-282; Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). /. Agric. Food Chem. 55: 10388-10395; Drábek, J., Stávek, J., Jalkov, M., Jurbek, T., Frébort, I. (2008). Eur. Food Res. Technol. 226: 491- 497]. In this study, the quantification of the genomic DNA samples extracted from the wine revealed a high concentration and purity, demonstrating that Vitis vinifera L. DNA remains not only after fermentation, but also resists the whole winemaking process, since the samples of wine were collected at the end of fermentation and up to five years after bottling. In order to solve these problems it was necessary to optimize the DNA extraction protocol of Vitis vinifera L. in wines.
• Inibição da reacção de PCR - Como mencionado anteriormente, contaminações por polissacarídeos, taninos e polifenóis, existentes quer em vinhos brancos, quer em vinhos tintos [ Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. (2007). /. Agric. Food Chem. 55 : 10388-10395 ], inibem a reacção de PCR. Neste método a  • Inhibition of the PCR reaction - As mentioned previously, contaminations by polysaccharides, tannins and polyphenols, both in white wines and in red wines [Nakamura, S., Haraguchi, K., Mitani, N., Ohtsubo, K. 2007). /. Agric. Food Chem. 55: 10388-10395], inhibit the PCR reaction. In this method the
combinação entre o tratamento enzimático, a precipitação com isopropanol e as várias lavagens revelou-se a solução perfeita para uma reacção de PCR favorável, eliminando todos os possíveis contaminantes e permitindo a obtenção de um perfil de amplificação inequívoco. combination of the enzymatic treatment, precipitation with isopropanol and the various washes proved the perfect solution for a favorable PCR reaction, eliminating all possible contaminants and allowing to obtain an amplification profile unequivocal.
• Amplificação do ADN - Em todas as situações testadas (extracção de ADN de videira em vinhos monovarietais e comerciais, tintos e brancos) foi possível amplificar o ADN com um marcador específico demonstrando que o ADN presente correspondia a uma variedade de videira, excluindo a hipótese de pertencer a um microrganismo.  • Amplification of DNA - In all tested situations (extraction of DNA from vines in monovarietal and commercial wines, red and white wines) it was possible to amplify the DNA with a specific marker demonstrating that the DNA present corresponded to a variety of grapevines, excluding the hypothesis belonging to a microorganism.
[30] Neste trabalho, um simples primer SSR nuclear foi usado directamente na amostra de ADN genómico permitindo a amplificação do fragmento com o tamanho correcto. Os resultados obtidos mostraram que os tamanhos dos alelos encontrados para os vinhos estão em concordância com os tamanhos encontrados para as variedades de videira usadas na sua produção. Deste modo, ao utilizar este método, será possível identificar as variedades usadas na produção de um vinho específico. Este é o primeiro relatório que reporta a amplificação de ADN extraído de amostras de vinho comercial. Até ao momento, nenhum autor consegui amplificar ADN genómico de videira extraído de vinho, direccionando o alvo para o ADN mitocondrial ou dos cloroplastos [ Siret, R.; Gigaud, O., Rosec, J.P., This, P. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827 Baleiras- Couto, M.M.e Eiras-Dias, J.E. (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291] .  [30] In this work, a simple primer nuclear primer was used directly on the genomic DNA sample allowing the amplification of the fragment to the correct size. The results obtained showed that the allele sizes found for the wines are in agreement with the sizes found for the vine varieties used in their production. In this way, when using this method, it will be possible to identify the varieties used in the production of a specific wine. This is the first report reporting the amplification of DNA extracted from commercial wine samples. To date, no author has been able to amplify genomic DNA from wine-extracted vine, targeting mitochondrial or chloroplast DNA [Siret, R .; Gigaud, O., Rosec, J.P., This, P. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827 Baleiras- Couto, M. M. and Eiras-Dias, J.E. (2006). Anal. Chim. Acta 563: 283-291].
Descrição Geral da Invenção  General Description of the Invention
[31] A qualidade, valor e preço do vinho dependem das variedades de videira utilizadas, das condições climáticas, das condições agronómicas da área de cultivo, da tecnologia de vinificação e do tipo de armazenamento. Assim, é importante que os consumidores confiem no sistema de rotulagem dos vinhos usado e para tal é necessário estabelecer um sistema de rastreabilidade eficiente.  [31] The quality, value and price of the wine depends on the vine varieties used, the climatic conditions, the agronomic conditions of the area under cultivation, the vinification technology and the type of storage. Therefore, it is important that consumers rely on the labeling system for the wines used and for this an efficient traceability system must be established.
[32] Na presente invenção é descrito um método e um estojo, simples e eficiente, para a extracção de ADN de videira a partir de vinho. Problemas, tais como a quantidade e qualidade de ADN assim como as contaminações com polissacarídeos, taninos e polifenóis foram totalmente superados. As dificuldades presentes na fase seguinte, correspondentes à amplificação por PCR, também foram ultrapassadas e o uso de um marcador molecular nuclear (microssatélite) específico de videira mostrou-se suficiente para a identificação da variedade utilizada para produzir determinado vinho.  [32] In the present invention there is described a simple and efficient method and kit for extracting DNA from vine from wine. Problems such as the quantity and quality of DNA as well as the contaminations with polysaccharides, tannins and polyphenols were totally overcome. The difficulties present in the next phase, corresponding to the PCR amplification, were also overcome and the use of a specific nuclear molecular marker (microsatellite) of vine was sufficient to identify the variety used to produce a certain wine.
[33] Neste momento foi estabelecido um método de extracção de ADN de videira a partir de vinho superando todos os obstáculos, habitualmente encontrados neste processo. Deste modo, e uma vez que não existe qualquer patente divulgada e os artigos até ao momento publicados não foram bem sucedidos quanto aos métodos experimentais expostos pois não conseguiram provar a existência de ADN de videira em vinhos nem a sua amplificação por um método simples e eficaz, esta invenção torna-se a primeira no âmbito aqui proposto.  [33] At this time a method of extracting DNA from vine from wine overcoming all the obstacles usually found in this process was established. Thus, since there is no published patent and the articles so far published have not been successful in the experimental methods exposed because they have not been able to prove the existence of grapevine DNA in wine nor its amplification by a simple and effective method , this invention becomes the first in the scope proposed here.
[34] A importância deste método reside ainda na componente de aplicabilidade que  [34] The importance of this method still lies in the applicability component that
apresenta, uma vez que pode ser implementado como sistema de rastreabilidade e por isso útil para os produtores, distribuidores e consumidores de modo a garantir a origem do produto, detectar fraudes e rotulagem enganosa. since it can be implemented as a traceability producers, distributors and consumers in order to guarantee the origin of the product, to detect fraud and misleading labeling.
[35] A equipa de investigação, integrada no Instituto de Bioengenharia e Biotecnologia - Centro de Genética e Biotecnologia da Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro (IBB-CGB/UTAD) desenvolveu com sucesso um método de extracção de ADN genómico de Vitis viniferaL. a partir de vinhos monovarietais produzidos em laboratório e de vinhos comerciais. Após a obtenção do ADN genómico foi possível detectar a variedade de videira presente nos vinhos utilizando marcadores moleculares microssatélites. [35] The research team, integrated in the Institute of Bioengineering and Biotechnology - Center of Genetics and Biotechnology of the University of Trás-os-Montes and Alto Douro (IBB-CGB / UTAD) successfully developed a method of extracting genomic DNA from Vitis viniferaL. from single-varietal wines produced in the laboratory and from commercial wines. After obtaining the genomic DNA it was possible to detect the grape variety present in the wines using molecular markers microsatellites.
[36] A Vitis vinifera L. é a espécie de videira (Vitis sp.) mais cultivada para a produção do vinho na Europa. Esta trepadeira da família das vitáceas, cujo fruto é a uva, foi cultivada por várias civilizações europeias desde há milhares de anos, o que originou dezenas de variedades, as denominadas castas, através de selecção artificial.  [36] Vitis vinifera L. is the most widely cultivated grape vine (Vitis sp.) For wine production in Europe. This vine of the family of grapefruit, whose fruit is the grape, has been cultivated by several European civilizations for thousands of years, which originated dozens of varieties, the so-called grape varieties, through artificial selection.
[37] Seguidamente detalhamos uma lista não exaustiva e apenas indicativa de variedades ou castas de Vitis vinifera L. conhecidas:  [37] The following is a non-exhaustive and indicative list of known varieties or varieties of Vitis vinifera L.:
Castas de uvas tintas: Alicante Bouschet , Baga , Barbera , Cabernet Franc , Cabernet Sauvignon , Canaiolo , Carménère , Cinsaut , Dolcetto , Gamay, Malbec , Merlot , Mourvèdre , Nebbiolo , Petit Syrah , Pinot Noir , Syrah , Sangiovese , Tannat , Tem- pranillo ou Aragonez , Tinta Negra Mole , Touriga Nacional , Negra Mole ,  Grape varieties: Alicante Bouschet, Baga, Barbera, Cabernet Sauvignon, Canaiolo, Carménère, Cinsaut, Dolcetto, Gamay, Malbec, Merlot, Mourvèdre, Nebbiolo, Petit Syrah, Pinot Noir, Syrah, Sangiovese, Tannat, pranillo or Aragonez, Tinta Negra Mole, Touriga Nacional, Negra Mole,
Blaufrankish (Kekfrancós na Hungria ), entre outras.  Blaufrankish (Kekfrancós in Hungary), among others.
Castas de uvas brancas : Abelhal , Alvarinho , Chardonnay , Chenin Blanc , Gewiirztraminer , Malvasia , Muller- Thurgau , Pinot Blanc , Pinot Grigio , Prosecco , Riesling, Sauvignon Blanc , Semillon Blanc , Trebiano , Furmint , Moscatel Amarela (yellow Muscat) , Zeta , Bouvier , Riesling ,Harslevelu, entre outras;  White Grape Varieties: Abelhal, Alvarinho, Chardonnay, Chenin Blanc, Gewiirztraminer, Malvasia, Muller-Thurgau, Pinot Blanc, Pinot Grigio, Prosecco, Riesling, Sauvignon Blanc, Semillon Blanc, Trebiano, Furmint, Yellow Muscat, Zeta , Bouvier, Riesling, Harslevelu, among others;
Castas de uvas Rosadas: Milleau , Mosaico Liturcci ou Cereza Italiana , Riesling Rosè , Saint Tomaint, Terreau, entre outras.  Grape Varieties: Milleau, Mosaic Liturcci or Italian Cherry, Riesling Rosè, Saint Tomaint, Terreau, among others.
[38] Contudo, será de realçar que existem uma imensidão de castas/variedades mais de 16000, sendo que só em Portugal são conhecidas mais de 450. Ainda será de realçar que estão sempre a surgir novas castas que resultam do melhoramento de plantas, para conseguir corresponder às solicitações cada vez mais exigentes do campo vitivinícola.  [38] However, it should be noted that there are more than 16000 varieties of varieties and varieties, of which only more than 450 are known in Portugal. It is also worth mentioning that new varieties are always emerging as a result of plant breeding, to meet the increasingly demanding demands of the wine field.
[39] O método de extracção e amplificação do ADN detectar Vitis vinifera L. em amostras de vinho compreendendo as seguintes etapas:  [39] The DNA extraction and amplification method detects Vitis vinifera L. in wine samples comprising the following steps:
- O protocolo inicia-se com a recolha de uma amostra de vinho ou mosto, de preferência de apenas 10 mL;  - The protocol begins with the collection of a sample of wine or must, preferably of only 10 mL;
- A amostra é precipitada, de preferência em 2 -propanol ou em isopropanol, cen- trifugada e recolhe-se o sobrenadante;  The sample is precipitated, preferably 2-propanol or isopropanol, centrifuged and the supernatant is collected;
- Seguidamente a amostra é incubada com um tampão de extracção que contém: • um detergente catiónico CTAB ( brometo de cetiltrimeltilamónia) que solubiliza as membranas, - The sample is then incubated with an extraction buffer containing: • a CTAB cetyl detergent (cetyltrimethyl ammonium bromide) which solubilizes the membranes,
• agentes anti-oxidantes, de preferência PVP (polivinilpirrolidona) e/ou o β- mercaptoetanol,  • anti-oxidant agents, preferably PVP (polyvinylpyrrolidone) and / or β-mercaptoethanol,
• uma substância quelante de catiões divalentes, Mg+2 e Ca+2, de preferência o EDTA (ácido etilenodiamino tetra- acético) inibindo a acção das DNAses e com baixas concentrações de cloreto de sódio que favorece juntamente como o CTAB a precipitação de ADN, • a divalent cation chelating agent, Mg +2 and Ca +2 , preferably EDTA (ethylenediamine tetra acetic acid) inhibiting the action of the DNAs and with low concentrations of sodium chloride which favors together with the CTAB the precipitation of DNA ,
- Em fases independentes realizam-se várias extracções utilizando fenol e/ou clorofórmio, que desnaturam as proteínas tornando-as insolúveis à fase aquosa, onde se encontram os ácidos nucleicos permitindo deste modo a separação entre estes componentes,  - In separate phases, several extractions are carried out using phenol and / or chloroform, which denature the proteins making them insoluble in the aqueous phase, where the nucleic acids are, thus allowing the separation between these components,
- O protocolo engloba ainda dois períodos de precipitação a -20 °C e de incubação com RNases, este último para eliminar o ARN (ácido ribonucleico) das amostras.  - The protocol also includes two periods of precipitation at -20 ° C and incubation with RNases, the latter to eliminate RNA (ribonucleic acid) from the samples.
[40] No final, obtém-se o ADN de videira que deve ser seguidamente quantificado e  [40] At the end, the DNA of the vine is obtained, which is then quantified and
utilizado na amplificação por PCR (reacção em cadeia da polimerase) com marcadores específicos (microssatélites) que permitem identificar ou determinar a(s) diversas variedades/castas presente(s) na amostra de vinho/mosto. Poderá ser utilizado com outros tipos de marcadores da PCR ou ainda em técnica de hibridação como os de mi- croarrays.  used in polymerase chain reaction (PCR) amplification with specific markers (microsatellites) to identify or determine the various varieties / varieties present in the wine / must sample. It may be used with other types of PCR markers or in a hybridization technique such as microarrays.
[41] Com este protocolo problemas como a quantidade e a integridade de ADN foram ultrapassados assim como as todas as contaminações anteriormente descritas que inibem a reacção de PCR, obtendo- se no final resultados fiáveis e inequívocos.  [41] With this protocol problems such as the amount and integrity of DNA have been overcome as well as all the previously described contaminations that inhibit the PCR reaction, obtaining in the end reliable and unambiguous results.
Descrição das Figuras  Description of Figures
[42] A Figura 1. representa o espectro UV obtido pelo espectrofotómetro NanoDrop® ND- 1000 revelando ( A ) presença de contaminação pelo fenol e (B) ausência de contaminação pelo fenol e/ou outras substâncias em amostras de ADN de vinhos.  Figure 1 represents the UV spectrum obtained by the NanoDrop® ND-1000 spectrophotometer revealing (A) presence of phenol contamination and (B) absence of contamination by phenol and / or other substances in wine DNA samples.
[43] A Figura 2. representa o perfil de amplificação obtido com o primer nuclear  [43] Figure 2 represents the amplification profile obtained with the nuclear primer
VrZAG79. (A) 1/2/3 - vinhos comerciais brancos, 4 - vinho monovarietal branco, 5 - variedade 'Fernão Pires' (folha); (B) 1/2/3 - vinhos comerciais tintos, 4 - vinho monovarietal tinto, 5 - variedade 'Tinta Roriz' (folha); M - marcador molecular GeneRuler ™ 100 bp DNA Ladder (Fermentas).  VrZAG79. (A) 1/2/3 - white commercial wines, 4 - white monovarietal wine, 5 - 'Fernão Pires' variety (leaf); (B) 1/2/3 - red commercial wines, 4 - red monovarietal wine, 5 - 'Tinta Roriz' variety (leaf); M - molecular marker GeneRuler ™ 100 bp DNA Ladder (Ferments).
Descrição Detalhada da Invenção  Detailed Description of the Invention
[44] O método de extracção compreende as seguintes etapas:  [44] The extraction method comprises the following steps:
1 - Precipitar 10 mL de vinho (ou mosto) em 2-propanol (70%- 100%) num tubo de centrífuga; homogeneizar e colocar a -20 °C durante o mínimo de uma a duas semanas, podendo se estender o período de precipitação;  1 - Precipitate 10 mL of wine (or must) in 2-propanol (70% - 100%) in a centrifuge tube; homogenize and place at -20 ° C for a minimum of one to two weeks, and the precipitation period may extend;
2 - Após a precipitação, centrifugação a 2 500 (2 500 -4 000) rpm durante 30 (10 a 45) minutas à temperatura ambiente; 2 - After precipitation, centrifugation at 2500 (2500-4000) rpm for 30 (10 to 45) minutes at room temperature;
3 - Remover o sobrenadante;  3 - Remove the supernatant;
4 - Adicionar ao precipitado 0,750 (0,750 a 1) mL de tampão de extracção [20 mM EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), 100 mM Tris-HCl (hidroximetil amino metano - cloreto de hidrogénio, pH 8), 1.4 M NaCl (Cloreto de sódio) , 2 (1 a 4)% (w/v) CTAB ( brometo de cetiltrimeltilamónia)] e ao qual se adicionou 2 (1 a 4) % (w/v) de polivinilpirrolidona (PVP) e 1 (0,5 a 2)% de β-mercaptoetanol; o tampão foi previamente aquecido a 65 (50 a 70) °C; homogeneizar por inversão e adicionar 100 (volumes variáveis) μL· de proteinase K (20 mg/mL);  4 - Add to the precipitate 0.750 (0.750 to 1) mL extraction buffer [20 mM EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid), 100 mM Tris-HCl (hydroxymethyl amino methane hydrogen chloride, pH 8), 1.4 M NaCl Sodium chloride), 2 (1 to 4)% (w / v) CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide)] and to which 2 (1 to 4)% (w / v) of polyvinylpyrrolidone (PVP) and 1 , 5 to 2)% of β-mercaptoethanol; the buffer was preheated to 65 (50 to 70) ° C; homogenize by inversion and add 100 μL of proteinase K (20 mg / mL);
5 - Incubar a 65 (50 a 70) °C durante o mínimo de 1 h, homogeneizando a sensivelmente cada 15 minutos;  5 - Incubate at 65 (50 to 70) ° C for a minimum of 1 h, homogenizing at approximately every 15 minutes;
6 - Adicionar 750 (1 volume) de mistura clorofórmio - álcool isoamílico (24: 1); homogeneizar as amostras durante aproximadamente 10 minutos;  6 - Add 750 (1 volume) chloroform-isoamyl alcohol mixture (24: 1); homogenize the samples for approximately 10 minutes;
7 - Centrifugar a 13 000 (rotação máxima) rpm durante pelo menos 15 minutos, e transferir o sobrenadante cuidadosamente para outro tubo (não perturbar a interface); 7 - Centrifuge at 13,000 (maximum rotation) rpm for at least 15 minutes, and transfer the supernatant carefully to another tube (do not disturb the interface);
8 - Tratar as amostras durante o mínimo de 1 h à temperatura ambiente, com 1-4 μΙ7 mL RNase (Ribonuclease A)(10 mg/mL) ou aproximadamente 30 minutos a 37°C;8 - Treat the samples for a minimum of 1 h at room temperature, with 1-4 μm RNase (Ribonuclease A) (10 mg / mL) or approximately 30 minutes at 37 ° C;
9 - Precipitar o ADN com 0,6 volumes de isopropanol a -20 °C durante a noite, podendo-se prolongar o passo de precipitação para vários dias; 9 - Precipitate the DNA with 0.6 volumes of isopropanol at -20 ° C overnight, the precipitation step being prolonged for several days;
10 - Centrifugar a 3 000 (2 500-4 000) rpm durante pelo menos 15 minutos a 4 (0 a 10) °C. Desprezar o sobrenadante;  10 - Centrifuge at 3000 (2500-4000) rpm for at least 15 minutes at 4 (0 to 10) ° C. Neglect the supernatant;
11 - Ressuspender o sedimento em 300 a 1 000 de TE (Tris- EDTA) IX;  11 - Resuspend the pellet in 300 to 1000 TE (Tris-EDTA) IX;
12 - Adicionar 300 a 1 000 de fenol e homogeneizar durante aproximadamente 10 minutos;  Add 300 to 1000 phenol and homogenize for approximately 10 minutes;
13 - Centrifugar a 8 000 (7 000 a 10 000) rpm durante aproximadamente 15 minutos a 4 (0 a 10)°C. Transferir a fase aquosa para outro tubo;  13. Centrifuge at 8,000 (7,000 to 10,000) rpm for about 15 minutes at 4 (0 to 10) ° C. Transfer the aqueous phase to another tube;
14 - Repetir os passos 11 e 12, quantas vezes as necessárias até um máximo de 5.  14 - Repeat steps 11 and 12, as many times as necessary up to a maximum of 5.
15 - Tratar novamente as amostras durante o mínimo de 1 h à temperatura ambiente, com 1-4 μΕ/mL RNase (10 mg/mL) ou aproximadamente 30 minutos a 37°C;  15 - Re-test the samples for a minimum of 1 h at room temperature, with 1-4 μE / mL RNase (10 mg / mL) or approximately 30 minutes at 37 ° C;
16 - Precipitar o ADN com 0,6 volumes de isopropanol frio a -20 a -25 °C durante a noite, podendo-se prolongar o passo de precipitação para vários dias;  Precipitate the DNA with 0.6 volumes of cold isopropanol at -20 to -25 ° C overnight, the precipitation step being prolonged for several days;
17 - Centrifugar a 3 000 (2 500-4 000) rpm durante o mínimo de 15 minutos a 4 (0 a 10)°C. Desprezar o sobrenadante;  17 - Centrifuge at 3,000 (2,500-4,000 rpm) for a minimum of 15 minutes at 4 (0 to 10) ° C. Neglect the supernatant;
18 - Adicionar 0,750 (0,250 a 1,5) mL de tampão de lavagem (etanol a 76 ; 10 mM de acetato de amónio) e homogeneizar durante pelo menos 5 minutos;  Add 0.750 (0.250 to 1.5) mL wash buffer (76% ethanol, 10 mM ammonium acetate) and homogenize for at least 5 minutes;
19 - Centrifugar a 3 000 (2 500-4 000) rpm durante o mínimo de 10 minutos. Eliminar o sobrenadante;  19 - Centrifuge at 3,000 (2,500-4,000 rpm) for a minimum of 10 minutes. Remove the supernatant;
20 - Deixar secar o sedimento; 21 - Diluir o ADN em 30 (10 a 100) de TE O.lx; 20 - Allow the sediment to dry; 21 - Dilute the DNA in 30 (10 to 100) TEO.lx;
22 - Quantificar e conservar a -20 a -80°C.  22 - Quantify and store at -20 to -80 ° C.
[45] Exemplos [45] Examples
Para uma mais fácil compreensão da invenção descrevem-se de seguida exemplos de realizações preferenciais do invento, as quais, contudo, não pretendem, limitar o objecto da presente invenção.  For a more complete understanding of the invention, examples of preferred embodiments of the invention will be described below, which, however, are not intended to limit the subject matter of the present invention.
[46] Exemplo 1 - Extracção de ADN e comparação de metodologias - Um método de extracção de ADN consistente e fiável é a base para a determinação da composição varietal de determinado vinho através de marcadores moleculares. Deste modo, foram testados e comparados 5 métodos de extracção de ADN anteriormente descritos, um kit comercial com o protocolo aqui descrito (Tabela 1). O método desenvolvido mostrou- se vantajoso relativamente aos restantes uma vez que se obteve não só uma maior concentração de ADN como também maior rendimento para além do facto de se iniciar o protocolo com menor volume de amostra.  [46] Example 1 - DNA extraction and comparison of methodologies - A consistent and reliable DNA extraction method is the basis for the determination of the varietal composition of a particular wine through molecular markers. Thus, 5 previously described DNA extraction methods were tested and compared, a commercial kit with the protocol described herein (Table 1). The method developed proved to be advantageous over the remainder since not only did a higher DNA concentration but also a higher yield were obtained in addition to the initiation of the lower sample volume protocol.
[47] Tabela 1. Comparação entre sete métodos de extracção de ADN diferentes, considerando o volume inicial de vinho, a média da concentração de ADN e o rendimento total  [47] Table 1. Comparison between seven different DNA extraction methods, considering the initial volume of wine, the mean of the DNA concentration and the total yield
[Table 1]  [Table 1]
[Table ]  [Table]
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0001
[48] Exemplo 2 - Quantificação e pureza das amostras de ADN - O fenol é frequentemente usado nos métodos de extracção de ADN aumentando o risco de contaminação. Este reagente apresenta o máximo de absorvância entre 270-275 nm, próximo do comprimento de onda de absorvância do ADN o que por vezes, condiciona os resultados já que eleva os valores quer da pureza quer da concentração de ADN devido a uma leitura sobrevalorizada do valor obtido com a absorvância de 260 nm (A 26o)- Nas amostras de vinho ocorre ainda outro tipo de contaminações como os polissacarídeos, proteínas, outros compostos fenólicos, solventes e sais que absorvem a 280, 270 e 230 nm. Mais uma vez, o protocolo aqui descrito evita esses problemas, como fica provado pela Figura 1. Esta apresenta os espectros UV obtidos pelo espectrofotómetro NanoDrop em duas amostras de ADN genómico extraído de vinho: na amostra A, na qual se utilizou outro método, revela contaminação fenólica e a amostra B, na qual se usou o método aqui descrito, que revelou ausência de [48] Example 2 - Quantification and purity of DNA samples - Phenol is often used in DNA extraction methods increasing the risk of contamination. This reagent shows the maximum absorbance between 270-275 nm, near the wavelength of absorbance of the DNA which sometimes conditions the results since it raises the values of both the purity and the concentration of DNA due to an overvalued reading of the obtained value with the absorbance of 260 nm (A 26o) - Nas Other contaminants such as polysaccharides, proteins, other phenolic compounds, solvents and salts absorb at 280, 270 and 230 nm. Again, the protocol described herein avoids these problems, as demonstrated by Figure 1. This shows the UV spectra obtained by the NanoDrop spectrophotometer on two samples of genomic DNA extracted from wine: in sample A, in which another method was used, reveals phenol contamination and sample B, in which the method described here was used, which revealed absence of
contaminação por fenol. O espectro revela ainda a inexistência de qualquer outro tipo de contaminação da amostra de ADN referidas anteriormente.  phenol contamination. The spectrum further shows the absence of any other contamination of the above DNA sample.
[49] As leituras realizadas no espectrofotómetro NanoDrop® ND- 1000 revelaram uma elevada concentração de ADN genómico obtido de folhas, vinhos monovarietais e comerciais (Tabela 2). As concentrações nos vinhos comerciais variaram entre 164 ng/ μL· (brancos) e 452 ng/μΐ. (tintos) e o grau de pureza apresentou valores entre 1,71 e 1,81. Estes valores são inferiores comparativamente aos obtidos para as folhas, no entanto, são óptimos resultados para os vinhos.  [49] The readings performed on the NanoDrop® ND-1000 spectrophotometer revealed a high concentration of genomic DNA obtained from leaves, monovarietal and commercial wines (Table 2). Concentrations in commercial wines ranged from 164 ng / μL · (white) to 452 ng / μΐ. (red) and the degree of purity presented values between 1.71 and 1.81. These values are lower than those obtained for the leaves, however, they are excellent results for the wines.
[50] Tabela 2. Determinação da concentração e grau de pureza de ADN genómico obtido a partir de folhas e vinhos monovarietais e comerciais [50] Table 2. Determination of the concentration and degree of purity of genomic DNA obtained from monovarietal and commercial leaves and wines
[Table 2] [Table 2]
[Table ]  [Table]
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0001
[51] Exemplo 3 - Amplificação de ADN genómico obtido a partir de vinhos - Após a obtenção de ADN de boa qualidade e em quantidade, a amplificação surge como a etapa seguinte. A reacção de PCR pode ser inibida por diversos factores. Em amostras de vinho e de entre vários factores, a presença de compostos fenólicos e  [51] Example 3 - Amplification of genomic DNA obtained from wines - After obtaining good quality and quantity DNA, amplification appears as the next step. The PCR reaction can be inhibited by several factors. In wine samples and among several factors, the presence of phenolic compounds and
polissacarídeos são a causa principal para o impasse da amplificação. No entanto, esses contaminantes foram eliminados e a amplificação foi bem sucedida.  polysaccharides are the main cause for the amplification deadlock. However, these contaminants were eliminated and the amplification was successful.
[52] O projecto europeu GENRES-081 (http://www.genres.de/idb/vitis/vitis.htm) estabeleceu um conjunto de seis marcadores moleculares (ssrVVS2, ssrVVMD5, ssrVVMD7, ssrVVMD27, VrZAG62 e ssrVrZAG79) do tipo microssatélites (SSR) como marcadores universais para a genotipagem da videira. Deste modo, e após a extracção do ADN de mosto e/ou vinho, estes marcadores permitem a identificação de genótipos específicos de variedades de videira e consequentemente a detecção do seu envolvimento na produção de determinado vinho. Outro dos objectivos foi demonstrar que o método de extracção desenvolvido era eficiente e que a amostra de ADN genómico extraído de vinho era adequada para amplificação. Para essa finalidade, utilizou-se apenas o primer nuclear ssr VrZAG79 [ Sefc, K.M., Regner, F., Turetschek, E., Glõssl, J.H., Steinkellner, H. (1999). Genome 42: 367-373] para a diferenciação das variedades de videira. A amplificação foi consistente e visível num gel de agarose (Figura 2) tendo sido possível identificar as variedades de videira utilizadas nos vinhos monovarietais e comerciais (tinto e branco) com um marcador nuclear. Até ao momento, outros autores relataram apenas a amplificação de ADN de amostras de vinhos experimentais recolhidas imediatamente após a fermentação [ Garcia-Beneytez, E., Maria, V.M., Joaquin, B., Maria, C.P., Javier, I. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096; Siret, R., Gigaud, O., Rosec, J.P., This, P. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827 ]. [52] The European project GENRES-081 (http://www.genres.de/idb/vitis/vitis.htm) established a set of six molecular markers (ssrVVS2, ssrVVMD5, ssrVVMD7, ssrVVMD27, VrZAG62 and ssrVrZAG79) of the type microsatellites (SSR) as universal markers for grapevine genotyping. Thus, after extraction of the must and / or wine DNA, these markers allow the identification of specific genotypes of grape varieties and consequently the detection of their involvement in the production of a particular wine. Another objective was to demonstrate that the extraction method developed was efficient and that the genomic DNA sample extracted from wine was suitable for amplification. For this purpose, only the first nuclear primer VrZAG79 [Sefc, KM, Regner, F., Turetschek, E., Glössl, JH, Steinkellner, H. (1999). Genome 42: 367-373] for the differentiation of varieties of vine. The amplification was consistent and visible on an agarose gel (Figure 2) and it was possible to identify the vine varieties used in monovarietal and commercial wines (red and white) with a nuclear marker. To date, other authors have reported only the amplification of DNA from experimental wine samples collected immediately after fermentation [Garcia-Beneytez, E., Maria, VM, Joaquin, B., Maria, CP, Javier, I. (2002) . /. Agric. Food Chem. 50: 6090-6096; Siret, R., Gigaud, O., Rosec, JP, This, P. (2002). /. Agric. Food Chem. 50: 3822-3827].
[53] Os tamanhos dos alelos obtidos com o microssatélite VrZAG79 obtidos no se- quenciador automático e expressos em pares de base encontram-se na Tabela 3. O tamanho dos alelos nos vinhos monovarietais (brancos e tintos) está em concordância com os valores encontrados para as folhas. Para os vinhos comerciais foi encontrada uma gama de valores que compreendem todos os alelos das variedades usadas na produção daqueles vinhos.  [53] The sizes of the alleles obtained with the microsatellite VrZAG79 obtained in the automatic sequencer and expressed in base pairs are shown in Table 3. The size of the alleles in monovarietal wines (white and red) is in agreement with the values found to the leaves. For commercial wines a range of values has been found which comprise all alleles of the varieties used in the production of those wines.
[54] Tabela 3. Genótipos obtidos utilizando o primer nuclear VrZAG79 expressos em tamanho do alelo e gama de valores encontrados, em pares de base, obtido a partir de ADN genómico de folhas, vinhos monovarietais e comerciais. [54] Table 3. Genotypes obtained using the nuclear primer VrZAG79 expressed in allele size and range values found in base pairs, obtained from leaf genomic DNA, monovarietal and commercial wines.
[Table 3] [Table 3]
[Table ] [Table]
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0001
Neste estudo, apenas os vinhos comerciais da região do Douro foram utilizados, tendo como referência duas variedades (folhas) largamente utilizadas na produção de vinho nesta região. No entanto, o método aqui descrito também foi bem sucedido para um vinho tinto comercial, Bordeaux (2006), em que na produção, foram utilizadas as variedades Merlot e Cabernet Sauvignon, reconhecidas em todo o mundo, (resultados não apresentados).  In this study, only the commercial wines of the Douro region were used, having as reference two varieties (leaves) widely used in wine production in this region. However, the method described here was also successful for a commercial red wine, Bordeaux (2006), where the Merlot and Cabernet Sauvignon varieties were recognized worldwide (results not shown).

Claims

Claims  Claims
Método de extracção de ADN de Vitis vinifera L. caracterizado por compreender as seguintes etapas:  Method of extracting DNA from Vitis vinifera L. characterized by comprising the following steps:
a. precipitar da amostras de vinho ou mosto com isopropanol, extrair e recolher do sedimento; The. precipitate from the wine or must samples with isopropanol, extract and collect from the sediment;
b. incubar a amostra resultante da etapa anterior com um tampão de extracção que compreende: B. incubating the resulting sample from the previous step with an extraction buffer comprising:
c. incubar a amostra de vinho ou mosto com um tampão de extracção que compreende: W. incubating the wine or must sample with an extraction buffer comprising:
- um solubilizador de membranas, nomeadamente um detergente catiónico, CTAB - brometo de cetiltrimeltilamónia;  a membrane solubilizer, namely a cationic detergent, CTAB - cetyltrimethyl ammonium bromide;
- um ou mais agentes anti-oxidantes;  one or more anti-oxidant agents;
- uma substância quelante de catiões divalentes, Mg+2 e/ou Ca+2, nomeadamente EDTA - a divalent cation chelating agent, Mg +2 and / or Ca +2 , namely EDTA
- ácido etilenodiamino tetra- acético;  - ethylenediamine tetraacetic acid;
d. efectuar uma ou mais extracções da amostra resultante da etapa anterior, utilizando clorofórmio e/ou fenol; d. performing one or more extractions of the sample resulting from the previous step using chloroform and / or phenol;
e. efectuar um ou mais períodos de precipitação e de incubação com RNases. and. carry out one or more periods of precipitation and incubation with RNases.
Método de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por o solubilizador de membranas ser o detergente catiónico CTAB - brometo de cetiltrimeltilamónia.  A method according to the preceding claim characterized in that the membrane solubilizer is the cationic detergent CTAB - cetyltrimethyl ammonium bromide.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por a substância quelante de catiões divalentes, Mg+2 e/ou Ca+2, ser o EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético. A method according to any one of the preceding claims characterized in that the divalent cation chelating agent, Mg +2 and / or Ca +2 , is EDTA - ethylenediamine tetraacetic acid.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por o tampão de extracção compreender ainda cloreto de sódio e tris-HCl.  A method according to any one of the preceding claims characterized in that the extraction buffer further comprises sodium chloride and tris-HCl.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por os agentes anti-oxidantes serem po- livinilpirrolidona (PVP) e/ou o β-mercaptoetanol.  A method according to any one of the preceding claims characterized in that the anti-oxidizing agents are polyvinylpyrrolidone (PVP) and / or β-mercaptoethanol.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por compreender a etapa prévia de precipitar a amostra em 2-propanol ou isopropanol, centrifugar e recolher o sedimento.  A method according to any one of the preceding claims characterized in that it comprises the previous step of precipitating the sample into 2-propanol or isopropanol, centrifuging and collecting the pellet.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações an- teriores caracterizado por o tampão de extracção ser previamente aquecido . A method according to any one of the preceding claims, characterized in that the extraction plug is preheated.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por o ADN extraído ser posteriormente amplificado e identificado com marcadores adequados a variedade ou casta da Vitis viniferaL.  A method according to any one of the preceding claims characterized in that the extracted DNA is subsequently amplified and identified with labels suitable for the Vitis vinifera L. variety or caste.
Método de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado identificar o ADN extraído, por técnicas de hibridação.  Method according to the previous claims characterized to identify the extracted DNA by hybridization techniques.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por amplificar e identificar o ADN extraído, por PCR e com marcadores específicos, de pelo menos uma das seguintes variedades ou castas: A method according to any one of the preceding claims characterized in that the amplified and identified DNA is extracted by PCR and with specific markers of at least one of the following varieties or varieties:
Alicante Bouschet, Baga, Barbera, Cabernet Franc, Cabernet  Alicante Bouschet, Baga, Barbera, Cabernet Franc, Cabernet
Sauvignon, Canaiolo, Carménère, Cinsaut, Dolcetto, Gamay, Malbec, Merlot, Mourvèdre, Nebbiolo, Petit Syrah, Pinot Noir, Syrah, Sauvignon, Canaiolo, Carménère, Cinsaut, Dolcetto, Gamay, Malbec, Merlot, Mourvèdre, Nebbiolo, Petit Syrah, Pinot Noir, Syrah,
Sangiovese, Tannat , Tempranillo ou Aragonez, Tinta Negra Mole, Touriga Nacional, Negra Mole, Blaufrankish ou Kekfrancos, Abelhal, Alvarinho, Chardonnay, Chenin Blanc, Gewiirztraminer, Malvasia, Muller- Thurgau, Pinot Blanc, Pinot Grigio, Prosecco, Riesling, Sauvignon Blanc, Semillon Blanc, Trebiano, Furmint , Moscatel Amarela (yellow Muscat), Zeta, Bouvier , Riesling, Harslevelu, Milleau , Mosaico Liturcci ou Cereza Italiana, Riesling Rosè, Saint Tomaint, Terreau. Sangiovese, Tannat, Tempranillo or Aragonez, Tinta Negra Mole, Touriga Nacional, Negra Mole, Blaufrankish or Kekfrancos, Abelhal, Alvarinho, Chardonnay, Chenin Blanc, Gewiirztraminer, Malvasia, Muller-Thurgau, Pinot Blanc, Pinot Grigio, Prosecco, Riesling, Sauvignon Blanc, Semillon Blanc, Trebiano, Furmint, Muscat Yellow, Zeta, Bouvier, Riesling, Harslevelu, Milleau, Mosaic Liturcci or Italian Cherry, Riesling Rosè, Saint Tomaint, Terreau.
Método de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por amplificar e identificar o ADN extraído, por PCR utilizando pelo menos um dos seguintes marcadores moleculares ssrVVS2, ssrVVMD5, ssrVVMD7, ssrVVMD27, VrZAG62 e  A method according to the preceding claims characterized by amplifying and identifying the extracted DNA by PCR using at least one of the following molecular markers ssrVVS2, ssrVVMD5, ssrVVMD7, ssrVVMD27, VrZAG62 and
ssrVrZAG79.  ssrVrZAG79.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicaç ões anteriores caracterizado por utilizar amostras de vinhos ou mosto, recolhidas durante a fermentação, na fase final da fermentação, na maturação, envelhecimento ou em vinho engarrafado independentemente da sua idade.  Method according to any one of the preceding claims characterized in that samples of wine or must, collected during fermentation, at the final stage of fermentation, at maturation, aging or bottled wine, irrespective of their age, are used.
Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por se obter ADN isento de contaminação por fenol, polissacarídeos, proteínas, outros compostos fenólicos, solventes e sais que absorvam a 280, 270 e 230 nm.  Method according to any one of the preceding claims characterized in that the DNA is free of phenol, polysaccharides, proteins, other phenolic compounds, solvents and salts which absorb at 280, 270 and 230 nm.
Método de extracção e amplificação de ADN de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores caracterizado por se obter ADN contendo um número de pares de bases compreendido entre 10 e 2 500 bp, preferencialmente entre 245 e 249 bp. Method of extracting and amplifying DNA according to any one of the preceding claims characterized in that DNA containing a number of base pairs is comprised between 10 and 2500 bp, preferably between 245 and 249 bp.
[Claim 15] Estojo de extracção de ADN em amostras de vinho ou mosto caracterizado por compreender uma solução que contém o tampão de extracção referido em qualquer uma das reivindicações 1-14. [Claim 15] A DNA extraction kit in wine or wort samples which comprises a solution containing the extraction buffer of any one of claims 1-14.
[Claim 16] Estojo de extracção de ADN em amostras de vinho ou mosto de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por compreender o referido tampão de extracção e restantes percursores, conforme o método de qualquer uma das reivindicações 1-14.A DNA extraction kit in wine or must samples according to the preceding claim, characterized in that it comprises said extraction buffer and the remaining precursors according to the method of any one of claims 1-14.
[Claim 17] Estojo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15-16, caracterizado por compreender pelo menos uma das seguintes soluções:Claim 17 The kit according to any one of claims 15-16, characterized in that it comprises at least one of the following solutions:
- uma solução de precipitação que compreende de preferência - a precipitation solution which preferably comprises
2-propanol ou isopropanol;  2-propanol or isopropanol;
- uma solução de lavagem,  - a washing solution,
- uma solução que compreende pelo menos um dos seguintes compostos: fenol, ou clorofórmio, RNase e Proteinase K.  - a solution comprising at least one of the following compounds: phenol, or chloroform, RNase and Proteinase K.
PCT/IB2009/055612 2009-12-04 2009-12-09 Method and kit for dna extraction from vitis vinifera l. and for amplification and detection of grapevine varieties or cultivars in musts or wines WO2011067630A1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PT104856 2009-12-04
PT10485609A PT104856A (en) 2009-12-04 2009-12-04 METHOD AND CASE FOR THE EXTRACTION OF VITIS VINIFERA L. DNA AND FOR THE AMPLIFICATION AND DETECTION OF VARIETIES OF VINE OR CASTLE IN MUST OR WINES

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011067630A1 true WO2011067630A1 (en) 2011-06-09

Family

ID=42079140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/IB2009/055612 WO2011067630A1 (en) 2009-12-04 2009-12-09 Method and kit for dna extraction from vitis vinifera l. and for amplification and detection of grapevine varieties or cultivars in musts or wines

Country Status (2)

Country Link
PT (1) PT104856A (en)
WO (1) WO2011067630A1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450683A (en) * 2014-12-22 2015-03-25 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 Method for extracting grape genome DNA from wine
IT201800020986A1 (en) * 2018-12-24 2019-03-24 Ginevra Marzucchi METHOD OF EXTRACTION OF DNA OF VITIS VINIFERA FROM WINE SAMPLES

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2059280A1 (en) 1993-04-16 1994-11-01 Consejo Superior Investigacion Wine yeast CECT 1973, method for obtaining it by recombinant DNA techniques and application thereof as a wine yeast for industrial use, useful for improving the bouquet of wines
CN101210032A (en) 2006-12-26 2008-07-02 河南农业大学 Simple and fast extraction method for DNA in grape wine

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2059280A1 (en) 1993-04-16 1994-11-01 Consejo Superior Investigacion Wine yeast CECT 1973, method for obtaining it by recombinant DNA techniques and application thereof as a wine yeast for industrial use, useful for improving the bouquet of wines
CN101210032A (en) 2006-12-26 2008-07-02 河南农业大学 Simple and fast extraction method for DNA in grape wine

Non-Patent Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALMEIDA, C.M.; VASCONCELOS, M.T., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 51, 2003, pages 4788 - 4798
BALEIRAS-COUTO M M ET AL: "Detection and identification of grape varieties in must and wine using nuclear and chloroplast microsatellite markers", ANALYTICA CHIMICA ACTA, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL LNKD- DOI:10.1016/J.ACA.2005.09.076, vol. 563, no. 1-2, 23 March 2006 (2006-03-23), pages 283 - 291, XP025047133, ISSN: 0003-2670, [retrieved on 20060323] *
BALEIRAS-COUTO, M.M.; EIRAS-DIAS, J.E., ANAL. CHIM. ACTA, vol. 563, 2006, pages 283 - 291
COETZEE, P.P.; ANHAECKE, F., ANAL. BIOANAL. CHEM., vol. 383, 2005, pages 977 - 984
DRABEK, J.; STAVEK, J.; JAL VKOVA, M.; JURBEK, T.; FRÉBORT, 1., EUR. FOOD RES. TECHNOL., vol. 226, 2008, pages 491 - 497
DRÁBEK, J.; STAVEK, J.; JAL VKOVA, M.; JURBEK, T.; FRÉBORT, 1., EUR. FOOD RES. TECHNOL., vol. 226, 2008, pages 491 - 497
DRÁBEK, J.; STÁVEK, J.; JAL VKOVA, M.; JURBEK, T.; FRÉBORT, 1., EUR. FOOD RES. TECHNOL., vol. 226, 2008, pages 491 - 497
DRÁBEK, J.; STAVEK, J.; JAL VKOVA, M.; JURBEK, T.; FRÉBORT, I., EUR. FOOD RES. TECHNOL., vol. 226, 2008, pages 491 - 497
EVA GARCIA-BENEYTEZ ET AL: "Application of a DNA Analysis Method for the Cultivar Identification of Grape Musts and Experimental and Commercial Wines of Vitis vinifera L. Using Microsatellite Markers", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 50, no. 21, 9 July 2002 (2002-07-09), pages 6090 - 6096, XP007912971, ISSN: 0021-8561, [retrieved on 20020907] *
FARIA M A ET AL: "Vitis vinifera Must Varietal Authentication Using Microsatellite DNA Analysis (SSR)", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, SCIENTIFIC PUBLISHERS, NEW DELHI - INDIA LNKD- DOI:10.1021/JF990837H, vol. 48, 1 January 2000 (2000-01-01), pages 1096 - 110, XP007912992, ISSN: 0021-8561, [retrieved on 20000331] *
FARIA, M.; NUNES, E.; OLIVEIRA, M., EUR. FOOD RES. TECHNOL., vol. 227, 2008, pages 845 - 850
FARIA, M.A.; MAGALHAES, R.; FERREIRA, M.A.; MEREDITH, C.P.; MONTEIRO, F.F., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 48, 2000, pages 1096 - 1100
GARCIA-BENEYTEZ, E.; CABELLO, F.; REVILLA, E., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 51, 2003, pages 5622 - 5629
GARCIA-BENEYTEZ, E.; MARIA, V.M.; JOAQUIN, B.; MARIA, C.P.; JAVIER, 1., J. AGRIC. FOOD CHEM, vol. 50, 2002, pages 6090 - 6096
GARCIA-BENEYTEZ, E.; MARIA, V.M.; JOAQUIN, B.; MARIA, C.P.; JAVIER, 1., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 50, 2002, pages 6090 - 6096
GARCIA-BENEYTEZ, E.; MARIA, V.M.; JOAQUIN, B.; MARIA, C.P.; JAVIER, I., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 50, 2002, pages 6090 - 6096
GONZALEZ-LARA, R.; CORREA, I.; POLO, M.C.; MARTIN-ALVAREZ, P.J.; RAMOS, M., FOOD CHEM., vol. 34, 1989, pages 103 - 110
JIAA Ã DRÃ BEK ET AL: "Quantification of DNA during winemaking by fluorimetry and Vitis vinifera L.-specific quantitative PCR", EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY ; ZEITSCHRIFT FÜR LEBENSMITTELUNTERSUCHUNG UND -FORSCHUNG A, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 226, no. 3, 26 January 2007 (2007-01-26), pages 491 - 497, XP019584952, ISSN: 1438-2385 *
KRISTINA M SEFC ET AL: "Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their applicability for genotyping of different Vitis species", GENOME, OTTAWA, CA, vol. 42, no. 3, 1 January 1999 (1999-01-01), pages 367 - 373, XP007912977, ISSN: 0831-2796 *
LODHI, M.A.; YE, G.N.; WEEDEN, N.F.; REISCH, B.I., PLANT MOL. BIOL. REP., vol. 12, 1994, pages 6 - 13
MIGUEL ANGELO FARIA ET AL: "Relative quantification of Vitis vinifera L. varieties in musts by microsatellite DNA analysis", EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY ; ZEITSCHRIFT FÜR LEBENSMITTELUNTERSUCHUNG UND -FORSCHUNG A, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 227, no. 3, 27 November 2007 (2007-11-27), pages 845 - 850, XP019621750, ISSN: 1438-2385 *
MONACI, F.; BERGAGLI, R.; FCARDI, S., J. TRACE ELEM. MED. BIOL., vol. 17, 2003, pages 45 - 50
MORENO-ARRIBAS, M.V.; CABELLO, F.; POLO, M.C.; MARTIN-ALVAREZ, P.J.; PUEYO, E., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 47, 1999, pages 114 - 120
MUNOZ-ORGANERO, G.; ORTIZ, J.M., RIV. VITIC. ENOL., vol. 3, 1987, pages 55 - 64
NAKAMURA, S.; HARAGUCHI, K.; MITANI, N.; OHTSUBO, K., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 55, 2007, pages 10388 - 10395
PUEYO, E.; DIZY, M.; POLO, M.C., AM. J. ENOL. VITIC., vol. 44, 1993, pages 255 - 260
REVILLA, E.; GARCIA-BENEYLEZ, E.; CABELLO, F.; MARTIN-ORTEGA, G.; RYAN, J.M., J. CHROMATOGR. A, vol. 915, 2001, pages 53 - 60
RODRÍGUEZ-PLAZA P ET AL: "Combining microsatellite markers and capillary gel electrophoresis with laser-induced fluorescence to identify the grape (Vitis vinifera) variety of musts", EUROPEAN FOOD RESEARCH AND TECHNOLOGY ; ZEITSCHRIFT FÜR LEBENSMITTELUNTERSUCHUNG UND -FORSCHUNG A, SPRINGER, BERLIN, DE LNKD- DOI:10.1007/S00217-005-0244-2, vol. 223, no. 5, 27 January 2006 (2006-01-27), pages 625 - 631, XP019420485, ISSN: 1438-2385 *
RODRIGUEZ-PLAZA, P.; GONZALEZ, R.; MORENO-ARRIBAS, M.V.; POLO, M.C.; BRAVO, G.; MARTINEZ-ZAPATER, J.M.; MARTINEZ, M.C.; CIFUENTES,, EUR. FOOD RES. TECHNOL., vol. 223, 2006, pages 625 - 631
SAVAZZINI F ET AL: "DNA analysis in wines: Development of methods for enhanced extraction and real-time polymerase chain reaction quantification", ANALYTICA CHIMICA ACTA, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL LNKD- DOI:10.1016/J.ACA.2005.10.078, vol. 563, no. 1-2, 23 March 2006 (2006-03-23), pages 274 - 282, XP025047132, ISSN: 0003-2670, [retrieved on 20060323] *
SAVAZZINI, F.; MARTINELLI, L., ANAL. CHIM. ACTA, vol. 563, 2006, pages 274 - 282
SEFC, K.M.; REGNER, F.; TURETSCHEK, E.; G16SSL, J.H.; STEINKELLNER, H., GENOME, vol. 42, 1999, pages 367 - 373
SIRET R ET AL: "Analysis of Grape Vitis vinifera L. DNA in Must Mixtures and Experimental Mixed Wines Using Microsatellite Markers", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 50, no. 13, 14 May 2002 (2002-05-14), pages 3822 - 3827, XP007912974, ISSN: 0021-8561, [retrieved on 20020514] *
SIRET, R.; GIGAUD, 0.; ROSEC, J.P.; THIS, P., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 50, 2002, pages 3822 - 3827
SIRET, R.; GIGAUD, O.; ROSEC, J.P.; THIS, P., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 50, 2002, pages 3822 - 3827
SUMIKO NAKAMURA ET AL: "Novel Preparation Method of Template DNAs from Wine for PCR To Differentiate Grape (Vitis vinifera L.) Cultivar", JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY, vol. 55, no. 25, 11 October 2007 (2007-10-11), pages 10388 - 10395, XP007912982, ISSN: 0021-8561, [retrieved on 20071110] *
VASCONCELLOS, A.M.P.; CHAVES DAS NEVES, H.J., J. AGRIC. FOOD CHEM., vol. 37, 1989, pages 931 - 937

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450683A (en) * 2014-12-22 2015-03-25 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 Method for extracting grape genome DNA from wine
CN104450683B (en) * 2014-12-22 2017-07-14 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 A kind of method that grape genomic DNA is extracted from grape wine
IT201800020986A1 (en) * 2018-12-24 2019-03-24 Ginevra Marzucchi METHOD OF EXTRACTION OF DNA OF VITIS VINIFERA FROM WINE SAMPLES

Also Published As

Publication number Publication date
PT104856A (en) 2011-06-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sahu et al. DNA extraction protocol for plants with high levels of secondary metabolites and polysaccharides without using liquid nitrogen and phenol
Villano et al. Wine varietal authentication based on phenolics, volatiles and DNA markers: State of the art, perspectives and drawbacks
Pereira et al. An enhanced method for Vitis vinifera L. DNA extraction from wines
Steenkamp et al. Improved method for DNA extraction from Vitis vinifera
Albertin et al. Development of microsatellite markers for the rapid and reliable genotyping of Brettanomyces bruxellensis at strain level
CN101962639B (en) Broad-spectrum high-efficiency plant RNA extracting kit
Catalano et al. Experimental review of DNA-based methods for wine traceability and development of a single-nucleotide polymorphism (SNP) genotyping assay for quantitative varietal authentication
CN101974513A (en) Extraction method of soil microbe genome DNA and total RNA
Boccacci et al. Genetic traceability of Asti Spumante and Moscato d’Asti musts and wines using nuclear and chloroplast microsatellite markers
CN101492485A (en) Method for extracting RNA in gymnosperm tissue
CN102409041A (en) Extraction method of total genome DNA from microbes
Marsal et al. A Fast, Efficient Method for Extracting DNA from Leaves, Stems, and Seeds of Vitis vinifera L.
CN1978453A (en) Method for extracting soil microbial DNA
Işçi et al. Evaluation of methods for DNA extraction from must and wine
Boccacci et al. Single-nucleotide polymorphism (SNP) genotyping assays for the varietal authentication of ‘Nebbiolo’musts and wines
WO2011067630A1 (en) Method and kit for dna extraction from vitis vinifera l. and for amplification and detection of grapevine varieties or cultivars in musts or wines
González-Royo et al. Effect of yeast strain and supplementation with inactive yeast during alcoholic fermentation on wine polysaccharides
Takakura et al. Safer DNA extraction from plant tissues using sucrose buffer and glass fiber filter
CN101629174A (en) Simple, efficient and cheap method for purifying forest soil sample DNA
Zambianchi et al. Applicability of DNA traceability along the entire wine production chain in the real case of a large Italian cooperative winery
Bhattacharjee et al. Field collection, preservation and large scale DNA extraction procedures for cassava (Manihot esculenta Crantz.)
CN102994493A (en) Method for extracting total DNA (deoxyribonucleic acid) from body wall of sea cucumber
CN101210032B (en) Extraction method for DNA in grape wine
US11098273B2 (en) Yeast extract for clarifying musts and beverages
Drábek et al. Quantification of DNA during winemaking by fluorimetry and Vitis vinifera L.-specific quantitative PCR

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09807459

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase in:

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 09807459

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1