WO2011025014A1

WO2011025014A1 - 薬物の安全性の評価方法

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Publication number: WO2011025014A1
Application number: PCT/JP2010/064747
Authority: WO
Inventors: 尚美上口; 照明奥田; 英嗣青山
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-08-31
Filing date: 2010-08-30
Publication date: 2011-03-03
Anticipated expiration: 2012-02-29

Abstract

　本発明は、生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在下および非存在下で肝細胞を試験化合物に曝露し、両条件下での該酵素活性を比較することを含む、該試験化合物の生体異物代謝酵素誘導能の評価方法を提供する。

Description

薬物の安全性の評価方法

　本発明は、薬物の安全性、特に生体異物代謝酵素誘導能の評価方法に関する。詳細には、本発明は、生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在下および非存在下で肝細胞を試験化合物に曝露し、両条件下での該酵素活性を比較することを含む、薬物の生体異物代謝酵素誘導能の評価方法に関する。

（発明の背景）
　肝臓は医薬品などの生体異物を排泄しやすい形態に変換する生体異物代謝に関して中心的機能を果たしている。この生体異物代謝の機能は、同時に生体異物代謝産物による突然変異誘発や毒性発現、あるいは併用薬の薬理効果の低減などをもたらす場合もある。このような理由から、医薬品などの開発には、早期探索段階において候補化合物群の肝臓での代謝機能誘導活性を調査する必要があり、実験動物あるいは実験動物より採取した肝細胞を用いた生体異物の肝代謝の研究が広く進められてきた。しかし、生体異物代謝酵素群の活性は、実験動物とヒトとの間で大きく異なり、実験動物を用いて得られた知見がヒトに反映されない場合も多い。それゆえ、医薬品のヒト肝代謝に及ぼす影響を正しく知るためには、ヒトの肝臓あるいはヒト肝臓由来の細胞を用いることが望ましいが、肝細胞の場合、本来の分化形質を失うことが一般に多いとされる株化細胞だけでなく、初代培養においてさえも生体異物代謝酵素群の活性が失われやすい。生体異物代謝能を保持する肝細胞として、摘出後速やかに新鮮肝臓切片から調製された初代肝細胞を用いることが考えられるが、入手の困難さなど様々な問題があり、実用性は極めて低い。

　近年、凍結保存した初代ヒト肝細胞を利用可能にするための研究が進められ、ＦＤＡによって誘導アッセイ用として認可された凍結初代ヒト肝細胞が、商業的に入手可能となった。凍結初代ヒト肝細胞は、新鮮初代ヒト肝細胞と比較して、入手容易性、実験の再現性、ドナーの選択性などの点で有利である。しかし、初代肝細胞における肝機能の発現の多くは、培養液中に含まれる各種成分や血清をはじめとする添加物に著しく影響される。西原ら（特許文献１）は、凍結初代ヒト肝細胞を、グルココルチコイドを含有する無血清完全合成培地で維持することにより、生体異物代謝酵素群の活性および遺伝子発現、並びに該酵素群の活性誘導および遺伝子発現誘導の機構を安定に維持することができ、試験化合物の生体異物代謝酵素群の活性および／または遺伝子発現の誘導活性の有無を判定できることを報告した。
　しかし、実際の誘導アッセイでは、試験化合物によっては高濃度域で生体異物代謝酵素の活性が低下することが知られている。この場合でも、ｍＲＮＡレベルでは誘導能が認められることが多く、試験化合物の生体異物代謝酵素の発現誘導能が過小評価されて、真に誘導能を有しない化合物だけを選択することができないという問題がある。そこで、Nicoll-Griffithら（非特許文献１）は、試験化合物単独でヒト肝細胞を処理した場合と、既知のＣＹＰ３Ａ誘導物質であるリファンピシンを用いて、該酵素（ＣＹＰ３Ａ）を誘導した後に、リファンピシンを除去してから試験化合物をヒト肝細胞に添加した場合とで、該酵素の活性を測定・比較することにより、偽陰性の出現を防ぎ、試験の信頼性を高めることができると報告している。

国際公開第02/40995号パンフレット

Drug Metabolism and Disposition 32: 1509-1515 (2004)

　本発明の目的は、早期創薬段階における医薬候補化合物の生体異物代謝酵素誘導能を評価するための、簡便で信頼性のある評価方法を提供することである。

　本発明者らは、上記の課題に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在下および非存在下に、肝細胞を試験化合物に曝露し、両条件下における該酵素の活性を測定・比較することにより、試験化合物が該酵素活性を阻害する場合のみならず、細胞傷害性や機序に基づく阻害作用を持つ場合等に起こる酵素活性の誘導能の過小評価をも防ぐことができ、より信頼性の高い評価が可能であることを見出した。また、薄層マトリゲルコートした９６穴プレートを使用することにより、ヒト肝細胞は長期の培養期間中でも高いＣＹＰ３Ａ活性を維持できたことから、このアッセイ系は、頑健で高スループットな生体異物代謝酵素誘導能の評価系となり得ることが確認された。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

　すなわち、本発明は以下のとおりである：
［１］以下の工程：
　（ａ）培養肝細胞を含む試料を二分し、一方を生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在下、試験化合物で処理し、他方を生体異物代謝酵素活性の誘導物質の非存在下、試験化合物で処理する工程、
　（ｂ）工程（ａ）で得られた各試料中に含まれる該生体異物代謝酵素の活性を測定する工程、及び
　（ｃ）工程（ｂ）で測定された各酵素活性を比較し解析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物の生体異物代謝酵素誘導能の評価方法。
［２］工程（ａ）における処理が、薄層マトリゲルでコーティングされた培養器上で行われることを特徴とする、上記［１］の方法。
［３］培養器が９６穴プレートである、上記［２］の方法。
［４］工程（ａ）における処理が、２以上の試験化合物濃度において行われる、上記［１］～［３］のいずれかの方法。
［５］生体異物代謝酵素が、シトクロムＰ４５０である、上記［１］～［４］のいずれかの方法。
［６］シトクロムＰ４５０が、ＣＹＰ３Ａである、上記［５］の方法。
［７］シトクロムＰ４５０がＣＹＰ３Ａ４である、上記［５］の方法。
［８］生体異物代謝酵素活性の誘導物質が、リファンピシン、ニフェジピン、エファビレンツ、カルバマゼピン、アバシミベ、トログリタゾン、ゲムフィブロジル、ランソプラゾール、モダフィニル、ネビラピン、オメプラゾール、フェノバルビタール、フェニトイン、ロフェコキシブ、スルフィンピラゾン、又はトピラメートである、上記［１］～［７］のいずれかの方法。
［９］生体異物代謝酵素活性の誘導物質が、リファンピシンである、上記［１］～［８］のいずれかの方法。
［１０］培養肝細胞が哺乳動物由来肝細胞である、上記［１］～［９］のいずれかの方法。
［１１］培養肝細胞がヒト肝細胞である、上記［１］～［１０］のいずれかの方法。
［１２］培養肝細胞が凍結初代ヒト肝細胞である、上記［１］～［１１］のいずれかの方法。
［１３］培養肝細胞における該生体異物代謝酵素の遺伝子発現を測定する工程をさらに含む、上記［１］～［１２］のいずれかの方法。

　本発明によれば、生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在下および非存在下に、肝細胞を試験化合物に曝露し、両条件下における該酵素の活性を測定・比較することにより、試験化合物が該酵素活性を阻害する場合のみならず、その試験化合物が細胞傷害性や機序に基づく阻害作用を有する場合等に起こり得る該酵素（例、ＣＹＰ３Ａ）誘導能の過小評価を防ぐことができ、頑健で高スループットな生体異物代謝酵素の誘導能の評価が可能となる。

リファンピシンでのＣＹＰ３Ａ酵素活性の誘導に対するマトリクスの影響を示す。凍結初代ヒト肝細胞を、コラーゲンでコーティングした４８穴プレート（白三角）、９６穴プレート（黒三角）、又は薄層マトリゲルでコーティングした９６穴プレート（黒丸）上で培養した。肝細胞培養を、３日間０．１％　ＤＭＳＯ（コントロール）又は種々の濃度のリファンピシンで処理した。細胞密度は、４８穴プレートでは０．１６×１０^６細胞／ウェルとし、９６穴プレートでは０．８×１０^５細胞／ウェルとした。ＣＹＰ３Ａ活性を、テストステロンの６β－ヒドロキシル化の程度として決定した。データを、ｎ＝３（４８穴プレート）又は４（９６穴プレート）の別個のプレートから算出した平均値±Ｓ．Ｄ．で表す。凍結初代ヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ誘導に対するプレート基質の影響を示す。凍結初代ヒト肝細胞を、２ロットの薄層マトリゲル、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン（ＰＬＯ／ＬＭ）又はポリ－Ｄ－リジン（ＰＤＬ）でコーティングしたプレート上で培養した。該肝細胞を、０．１％　ＤＭＳＯ（コントロール）、１０μＭ　リファンピシン、３０μＭ　フェニトイン又は３０μＭ　カルバマゼピンで処理した。ＣＹＰ３Ａ誘導応答は、ＣＹＰ３Ａ活性（テストステロンの６β－ヒドロキシル化の程度）として表す。各カラムの棒グラフは、左から、ＤＭＳＯ、リファンピシン、フェニトイン、カルバマゼピンを示す。種々の誘導剤及び非誘導剤で処理した凍結初代ヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａの誘導を示す。試験した化合物を、N.J. Hewitt, et al.; Chem. Biol. Interact. 168, 51-65 (2007)で報告された新鮮又は凍結初代ヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ誘導能にしたがって、強力な誘導剤（黒いバー）、中程度の誘導剤（グレーのバー）又は非誘導剤（白いバー）に分類した。１０μＭ（Ａ）、１μＭ（Ｂ）、及び０．１μＭ（Ｃ）の化合物でのＣＹＰ３Ａ誘導応答を、１０μＭ　リファンピシン応答に対する割合（％）として表す（縦軸）。凍結初代ヒト肝細胞において陽性応答を生じる化合物の濃度－応答曲線を示す。いくつかの濃度の試験化合物を単独で（黒丸）、又は試験化合物と１０μＭ　リファンピシンとを組合せて（白丸）、肝細胞を処理した。フェノバルビタール及びカルバマゼピンは、典型的な濃度－応答曲線を示し、リファンピシンによるＣＹＰ３Ａ誘導の阻害は示さない（Ａ）。アバシミベ及びエファビレンツは、ベル型の濃度－応答関係を示し、リファンピシンによるＣＹＰ３Ａ誘導を阻害する（Ｂ）。データは、ＣＹＰ３Ａ活性の平均値±Ｓ．Ｄ．として表す（ｎ＝３又は４）。リトナビルで処理した肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ活性及びＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量の誘導の濃度－応答曲線を示す。肝細胞を、いくつかの濃度のリトナビル単独で（黒丸）、又はリトナビルと１０μＭ　リファンピシンとを組合せて（白丸）処理した。ＣＹＰ３Ａ活性を、テストステロン６β－ヒドロキシル化を測定することによって決定し（Ａ）、ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量をｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した（Ｂ）。データは、ＣＹＰ３Ａ活性の平均値±Ｓ．Ｄ．又はＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量の平均値として表す（ｎ＝３又は４）。誘導されたＣＹＰ３Ａ活性とＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量との間の相関を示す。凍結初代ヒト肝細胞を、４４の化合物で、いくつかの濃度において処理した（ｎ＝１２８）。各記号は、化合物によるリファンピシン誘導性のＣＹＰ３Ａ活性の残留率を表す。データは、平均値として表す（ｎ＝３又は４）。

（発明の詳細な説明）
　本発明の生体異物代謝酵素誘導能の評価方法（本明細書中、本発明の評価方法と略記する場合がある）は、以下の工程：
　（ａ）培養肝細胞を含む試料を二分し、一方を生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在下、試験化合物で処理し、他方を生体異物代謝酵素活性の誘導物質の非存在下、試験化合物で処理する工程、
　（ｂ）工程（ａ）で得られた各試料中に含まれる該生体異物代謝酵素の活性を測定する工程、及び
　（ｃ）工程（ｂ）で測定された各酵素活性を比較し解析する工程
を含む。

　本発明の評価方法における「培養肝細胞」とは、任意の動物の肝臓から採取した肝細胞を培地中で維持したものをいい、例えば、新鮮肝臓から得られる肝細胞を用いても、肝細胞を凍結させた凍結肝細胞を融解して用いてもよいが、供給の安定性、ドナーの選択性、及び細胞従来の性質の維持等の観点から、凍結初代肝細胞が好ましい。本発明の評価方法における「培養肝細胞を含む試料」とは、このような肝細胞自体であってもよいし、培地中で維持される肝細胞、すなわち、肝細胞を含む培地であってもよい。
　本発明における培養肝細胞の由来は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（イヌ、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、及びマウス等）由来であり、特に好ましくはヒト由来である。例えば、ヒト肝細胞は、ヒト成人から手術により部分的に摘出された新鮮肝臓切片あるいは脳死患者より摘出された新鮮肝臓又はこれら摘出肝臓等の正常組織を、公知のコラゲナーゼ潅流法等で処理することで得られる(A.P. Li, et al.; J. Tiss. Cult. Meth. 14, 139-146 (1992))。このようにして得られた初代ヒト肝細胞は、５～２０％のジメチルスルホキシドと５～２０％の牛胎児血清を含む細胞培養培地や、セルバンカー（日本全薬工業株式会社)、セルヴェイション（ＣＥＬＯＸ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）等市販の細胞凍結保存液に分散させ、プログラムフリーザ等を用いる公知の方法等に準じて凍結し、液体窒素液中あるいは液体窒素で－１４０℃以下に冷却された窒素気層中で数年以上安定に保存できる（A. Ostrowska, et al.; Cell and Tissue Banking 1, 55-68 (2000)）。あるいは、本発明における培養肝細胞として、例えばＣｅｌｓｉｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社等から市販されている凍結初代肝細胞、又はＸｅｎｏｔｅｃｈ社等から市販されている不死化ヒト肝細胞等を用いることもできる。本発明の評価方法における「培養肝細胞」は、特に好ましくは、凍結初代ヒト肝細胞である。

　こうして保存又は入手した細胞は、必要に応じ融解して維持し、凍結初代肝細胞として用いることができる。細胞の融解及び維持は、市販の培地を用い、公知の培養方法にしたがって行うことができる。例えば、凍結初代ヒト肝細胞を、プレーティング培地（例、Ｉｎ　ＶｉｔｒｏＧＲＯ（登録商標）ＣＰ培地；Ｃｅｌｓｉｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）中で融解し、９６穴マイクロプレートを培養器として、０．１～１．０×１０^５生細胞／ウェルの密度にて播種する。１２～４８時間、好ましくは約２４時間のインキュベーション後、プレーティング培地を除去し、Ｔｏｒｐｅｄｏ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｍｉｘ（Ｃｅｌｓｉｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を追加したインキュベーション培地（例、Ｉｎ　ＶｉｔｒｏＧＲＯ（登録商標）ＨＩ培地；Ｃｅｌｓｉｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）と交換する。次いで、細胞を数日（例、１、２、３、５、７日）間インキュベートすることで、培養系を確立できる。その後は２４から７２時間毎に新鮮な培地に交換することが好まれる。なお、インキュベーションは、３０～４２℃、好ましくは約３７℃前後、５％　ＣＯ_２を含む水蒸気飽和した培養器中で行われる。

　あるいは、本発明において凍結初代肝細胞は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、ＤＭＥＭ培地、ランフォード培地中において、５％　ＣＯ_２を含む水蒸気飽和した培養器中、３０～４２℃にて培養できる。培地中にＩＴＳ（インシュリン、トランスフェリン、セレニウム）、デキサメタゾン、抗生物質（ペニシリン-ストレプトマイシン）等を添加して培養することもできる。

　培養器は、肝細胞の培養に適した形態であれば特にマイクロプレートに限定されず、例えばプラスチック製プレート（１２、２４、９６穴プレート等）、プラスチック又はガラス等のシャーレ又はディッシュ等が用いられる。また、キトサン膜、ハイドロゲル薄膜、綿等のガーゼ、ポリウレタン又はポリグリコール酸等の多孔性スポンジ、ナイロン若しくはポリエステル等の中空糸又はホロファイバー、セラミック等の無機材料ビーズ等を培養支持体として用いても良い。培養器又は培養支持体は、必要に応じて細胞の接着を容易にする物質（例えばコラーゲン、コラーゲンゲル等が挙げられ、好ましくは薄層マトリゲルである）でコーティングされてもよい。本発明の評価方法では、肝細胞の長期培養においても生体異物代謝酵素の活性を高く維持することができ、また必要な細胞数を抑えることが可能である点から、薄層マトリゲルでコーティングされた培養器（好ましくは９６穴マイクロプレート）を用いるのが最も好ましい。

　本発明の評価方法における「生体異物代謝」とは、例えば医薬品、食品添加物、環境汚染物質等の生体に通常存在しない物質の代謝を意味し、なかでも薬物代謝が代表的な例である。本発明の評価方法における「生体異物代謝酵素」とは、生体異物代謝を行う酵素をいい、代表的な例として、主に肝細胞内のミクロソームで行われる薬物代謝に関与する薬物代謝酵素が挙げられる。本発明の評価方法における「生体異物代謝酵素」としては、肝特異的な生体異物代謝に関与する酵素、例えば、シトクロムＰ４５０、フラビン含有モノオキシゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、モノアミン酸化酵素、ＮＡＤＰＨ－シトクロムＰ４５０還元酵素、アルデヒド還元酵素、ケトン還元酵素、ＵＤＰ－グルクロン酸転移酵素、硫酸転移酵素、アミノ酸Ｎ－アシル転移酵素、アセチル転移酵素、メチル転移酵素、及びグルタチオンＳ－転移酵素が挙げられる。これらの中でシトクロムＰ４５０は、動物では肝以外にも腎、肺、消化管、副腎、脳、皮膚等ほとんどすべての臓器に少量ながら存在し、ヒトにおいて医薬品の９５％以上の代謝に関与するともいわれており、生体異物代謝における機能の点から特に重要な酵素群である。従って、生体異物代謝酵素としては、シトクロムＰ４５０が好ましい。

　シトクロムＰ４５０は、多数の酵素タンパク質の総称であり、ヒト肝臓で生体異物の代謝に関わる個々のシトクロムＰ４５０の分子種の例としては、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ（具体的には、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９）、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ（具体的には、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５及びＣＹＰ３Ａ７）等が知られており、なかでもＣＹＰ１Ａ（ＣＹＰ１Ａ１又はＣＹＰ１Ａ２）、ＣＹＰ３Ａ（ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５又はＣＹＰ３Ａ７）等、特にＣＹＰ３Ａ、とりわけＣＹＰ３Ａ４が好ましく用いられる。シトクロムＰ４５０の活性発現には、ＮＡＤＰＨ－シトクロムＰ４５０還元酵素の存在が必須である。

　肝特異的な生体異物代謝に関わる酵素活性としては、例えば、ＵＤＰ－グルクロニルトランスフェラーゼ活性、フラビン含有モノオキシゲナーゼ活性、エポキシドヒドラーゼ活性、スルフォトランスフェラーゼ活性、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ活性、又はＮＡＤＰＨ－シトクロムＰ４５０還元酵素及びシトクロムＰ４５０等によって構成される混合機能酸化反応（ＭＦＯ）活性（例えば、メトキシレゾルフィン脱アルキル化活性、エトキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ペントキシレゾルフィン脱アルキル化活性、ベンジルオキシレゾルフィン脱アルキル化活性、エトキシクマリン脱アルキル化活性、クマリンヒドロキシル化活性、タキソールヒドロキシル化活性、トルブタミドヒドロキシル化活性、(Ｓ)－メフェニトインヒドロキシル化活性、ブフラロールヒドロキシル化活性、ニトロフェノールヒドロキシル化活性やテストステロンヒドロキシル化活性等）等が挙げられる。なかでも、ＵＤＰ－グルクロニルトランスフェラーゼ活性、フラビン含有モノオキシゲナーゼ活性、ＭＦＯ活性が重要であり、ＭＦＯ活性として検出できるシトクロムＰ４５０活性は例えば生体異物代謝における機能の点から最も重要な酵素活性と考えられる。

　生体異物代謝酵素活性の測定は、測定を目的とする酵素に応じて、公知の方法を用いて測定できる。例えばＣＹＰ３Ａ活性を測定する場合、テストステロンからの６β－ヒドロキシテストステロン形成の程度を、液体クロマトグラフィによって測定することが可能である。具体的には、例えば、培養肝細胞を適宜洗浄後、１００μＭ　テストステロンを含有する緩衝液（ハンクス平衡塩溶液等）又は培地（ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ－１５培地、ランフォード培地等）で、３７℃にて２時間インキュベートする。インキュベーション終了後、培地１０μＬを液体クロマトグラフィカラムに注入し、６β－ヒドロキシテストステロンの生成量からテストステロンのヒドロキシル化活性を測定できる。

　本発明の評価方法における「生体異物代謝酵素活性の誘導物質」とは、その物質を投与することによって、生体異物代謝酵素の活性化を誘導する物質をいい、本明細書中、単に、誘導物質または「誘導剤」と略記することがある。多くの生体異物代謝酵素は、ある一定の条件下で誘導を受けることが知られており、生体異物代謝酵素の活性化を誘導する限り、誘導物質は特に限定されないが、例としては、ＣＹＰ１Ａ発現に対するベンゾ[ａ]ピレン、ベンズ[ａ]アントラセン、３－メチルコランスレン、ダイオキシン等のいわゆる多環性芳香族化合物の効果、ＣＹＰ２Ｂ発現に対するフェノバルビタール、フェノバルビトンの効果、ＣＹＰ３Ａ発現に対するリファンピシン、デキサメタゾン、フェニトイン、フェニルブタゾンの効果等がよく知られている（Ｃ．Ｇ．ギブソンら、新版生体異物の代謝学　講談社、１９９５年）。他にも、ＣＹＰ３Ａ活性の誘導物質として、例えばニフェジピン、エファビレンツ、カルバマゼピン、アバシミベ、トログリタゾン、ゲムフィブロジル、ランソプラゾール、モダフィニル、ネビラピン、オメプラゾール、フェノバルビタール、ロフェコキシブ、スルフィンピラゾン、及びトピラメート等が挙げられるが、ＣＹＰ３Ａ発現に対する誘導効果の高さから、本発明の評価方法では、リファンピシンが好ましく用いられる。

　培養肝細胞を含む試料を試験化合物で処理する工程が、後述のように、試験化合物を添加した培地中で当該試料をインキュベートすることにより実施される場合、生体異物代謝酵素活性の誘導物質は当該培地に添加して用いられる。
　生体異物代謝酵素活性の誘導物質の培地への添加濃度は、生体異物代謝酵素活性を誘導するのに十分な濃度であれば特に制限はなく、誘導物質の種類に応じて好ましい濃度範囲が適宜選択されるが、例えば、リファンピシンの場合、０．０５～２０μＭ、好ましくは０．１～１０μＭの濃度で用いることができる。

　本発明の評価方法における試験化合物としては、特に限定されないが、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性天然物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等が挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
　本明細書中、培養肝細胞を含む試料を試験化合物で「処理する」とは、培養肝細胞が試験化合物に曝露される状態におくことを意味し、具体的には、当該処理は、培養肝細胞を含む試料に試験化合物を添加することによって実施される。さらに具体的には、当該処理は、例えば、培養肝細胞を含む試料を、試験化合物を添加した培地中でインキュベートすることにより実施され得る。
　培養肝細胞を含む試料を試験化合物で処理する際（具体的には、培養肝細胞を含む試料を、試験化合物を添加した培地中でインキュベートする際）の試験化合物の濃度（試験化合物濃度）は、好ましくは１ｎｍｏｌ／Ｌから１ｍｏｌ／Ｌ程度である。該試験化合物濃度は、２以上であることが好ましく、例えば３、４、５、７、又は１０の試験化合物濃度において試料が処理される。試験化合物は生理食塩水やメタノール、ジメチルスルホキシド等の溶剤に溶解した溶液として用いることができ、該溶剤の培地に占める割合は０．１％から１％が好ましい。培養肝細胞を試験化合物に曝露させる時間、即ち、培養肝細胞を含む試料を、試験化合物（あるいはさらに生体異物代謝酵素活性の誘導物質）を添加した培地中でインキュベートする時間は、例えば、１～７日間、好ましくは２～５日間、より好ましくは３日間前後である。
また、培養肝細胞を含む試料を試験化合物で処理する工程は、好ましくは、薄層マトリゲルでコーティングされた培養器（好ましくは、９６穴プレート）上で行われる。

　本発明の評価方法において、生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在及び非存在下、培養肝細胞を含む試料（例えば、培養肝細胞）を試験化合物で処理し、得られた各試料中に含まれる該生体異物代謝酵素の活性を測定して、測定された各酵素活性を比較及び解析することによって、試験化合物が生体異物代謝酵素活性の誘導能を有するかを評価することができる。その結果、（ａ）生体異物代謝酵素活性の誘導物質の非存在下において、酵素活性が試験化合物の添加によって上昇した場合、その試験化合物は該酵素の誘導能を有すると判定することができる。一方、（ｂ）生体異物代謝酵素活性の誘導物質の非存在下において、試験化合物の添加による酵素活性の上昇が認められなかった場合であって、（ｂ１）生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在下において、酵素活性が試験化合物の添加によって変化しなかった（例えば、該誘導物質単独の場合と同等の酵素活性の上昇が認められた）場合には、その試験化合物は該酵素生体異物代謝酵素活性の誘導物質の非存在下において試験化合物による酵素活性の誘導能を有しないと判定することができ、（ｂ２）生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在下において、酵素活性が試験化合物の添加によって変化した（例えば、該誘導物質単独の場合と比較して有意に酵素活性が低下した）場合には、その試験化合物は、該酵素の誘導能を有する可能性があると判定することができる。

　本発明の評価方法はまた、培養肝細胞における生体異物代謝酵素の遺伝子発現を測定する工程をさらに含んでいても良い。ここで、遺伝子発現を測定することによって、試験化合物が真に生体異物代謝酵素の誘導能を有するか否かを評価することができる。特に、酵素活性に基づく評価結果が上記（ｂ２）の場合となった試験化合物については、遺伝子発現の測定を実施することが望ましい。
　遺伝子発現の測定は、培養肝細胞から全ＲＮＡ画分を調製し、該画分中に含まれる生体異物代謝酵素のｍＲＮＡを検出することにより調べることができる。ＲＮＡ画分の調製は、グアニジン－ＣｓＣｌ超遠心法、ＡＧＰＣ法等公知の手法を用いて行うことができるが、市販のＲＮＡ抽出用キット（例：ＳＶ　９６　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；Ｐｒｏｍｅｇａ製、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ製等）を用いることで、微量試料から迅速且つ簡便に高純度の全ＲＮＡを調製することができる。ＲＮＡ画分中の遺伝子転写産物（生体異物代謝酵素のｍＲＮＡ）を検出する手段としては、例えば、ハイブリダイゼーション（ノーザンブロット、ドットブロット、ＤＮＡチップ（マイクロアレイ）解析等）を用いる方法、あるいはＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ、競合ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ等）を用いる方法等が挙げられる。微量試料から迅速且つ簡便に定量性よく遺伝子の発現変動を検出できる点で競合ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲ等の定量的ＰＣＲ法が好ましい。

（材料及び方法）
材料
　５バッチの凍結初代ヒト肝細胞（表１）は、Ｃｅｌｓｉｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，アメリカ）から入手した。肝細胞プレーティング培地（Ｉｎ　ＶｉｔｒｏＧＲＯ（登録商標）ＣＰ培地）（以下、プレーティング培地と略記することがある）、インキュベーション培地（Ｉｎ　ＶｉｔｒｏＧＲＯ（登録商標）ＨＩ培地）及びＴｏｒｐｅｄｏ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｍｉｘは、Ｃｅｌｓｉｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。薄層マトリゲル、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン（ＰＬＯ／ＬＭ）及びポリ－Ｄ－リジン（ＰＤＬ）コート９６穴プレートは、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ，アメリカ）から入手した。市販されている全ての化合物は、最高グレードの物を用いた。ＣＹＰ３Ａ活性とＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量との間の相関を調べる実験で用いた４４化合物のうち、市販されていないものは、Ｔａｋｅｄａ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌｔｄによって合成された。

実施例１
細胞培養及び誘導
　凍結初代ヒト肝細胞を、プレーティング培地中で融解し、薄層マトリゲル９６穴プレートに、０．４～０．８×１０^５生細胞／ウェルの密度にて移した。薄層マトリゲル９６穴プレートに移された凍結初代ヒト肝細胞（以下、単に「肝細胞」と略記する場合がある）を２４ｈｒインキュベーションした後、プレーティング培地を除去し、Ｔｏｒｐｅｄｏ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ｍｉｘを追加したインキュベーション培地に交換した。次いで、肝細胞をさらに３日間インキュベートし、培養系を確立した。最初の４日間のコンディショニング培養後、培地を除去し、肝細胞を３日間毎日、１０μＭリファンピシンの存在又は非存在下、試験化合物を含むインキュベーション培地で処理した。１０μＭリファンピシン存在下の試験化合物のウェルを、リファンピシン誘導ＣＹＰ３Ａ活性に対する試験化合物の阻害作用を予測するのに使用した。全てのインキュベーションを、３７℃、５％　ＣＯ_２を含む水蒸気飽和した雰囲気下で行った。

ＣＹＰ３Ａ活性測定
　ＣＹＰ３Ａ活性を、テストステロンからの６β－ヒドロキシテストステロン形成の程度を、超高速液体クロマトグラフィシステム（ＵＰＬＣ；Ｗａｔｅｒｓ）によって測定することにより定量した。肝細胞を、２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳを含むハンクス平衡塩溶液で２回洗浄した後、１００μＭ　テストステロンを含む同じ溶液１５０μＬで、３７℃にて２時間インキュベートした。インキュベーション終了時、培地１２０μＬを、１０μＬの５％　ＨＣｌＯ_４を含有する９６穴プレートに移し、１０μＬをカラムに注入した。６β－ヒドロキシテストステロンを標準物質として用いた。ＵＰＬＣ／ＵＶ条件は、以下のとおりである：
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ　ＢＥＨ　Ｃ１８，１．７μｍ，１００×２．１ｍｍ　Ｉ．Ｄ．（Ｗａｔｅｒｓ）
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ）１０ｍＭ　酢酸アンモニウム／水／アセトニトリル（１：８：１，ｖ／ｖ）
　　　　Ｂ）１０ｍＭ　酢酸アンモニウム／アセトニトリル（１：９，ｖ／ｖ）
流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエント（Ｂに対する％）：２５％（０－１ｍｉｎ），９５％（１．０１－２．４ｍｉｎ），２５％（２．４１－２．５ｍｉｎ）
ＵＶ検出：２５０ｎｍ

リアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ
　肝細胞における全ＲＮＡを、ＳＶ　９６　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，アメリカ）を用いて単離した。肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ量を標準的なＴａｑＭａｎ　ｑＲＴ－ＰＣＲ法を用いて決定した。ＴａｑＭａｎプライマー及びプローブ配列を表２に示す。ＴａｑＭａｎ　ｏｎｅ－ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ　ｏｎｅ－ｓｔｅｐ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，アメリカ）から調製した最終反応容積１０μＬ中２μＬの各ＲＮＡ試料について、ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　７９００ＨＴ配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。最初のＲＴ工程を３０分間、４８℃にて行った後、続いて９５℃まで１０分間加熱し、次いで９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間のサイクルを４０サイクル行った。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼＩ（ＨＰＲＴ）を、内因性コントロールとして用い、ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量をＨＰＲＴの発現によって、標準化した。

データ解析
　リファンピシンに対する割合の値（％ＲＩＦ）及びコントロールに対する倍率（Ｆｏｌｄ）を以下に示すように算出した。
％ＲＩＦ＝（化合物活性－コントロール活性）／（１０μＭ　リファンピシン活性－コントロール活性）×１００
Ｆｏｌｄ＝（化合物活性）／（コントロール活性）

（結果）
ＣＹＰ３Ａ酵素活性の誘導に対するプレートの基質の影響
　ＣＹＰ３Ａ誘導アッセイにおける９６穴プレートの有用性を評価するために、Ｉ型コラーゲンでコーティングした４８穴若しくは９６穴プレート、又は薄層マトリゲルでコーティングした９６穴プレート上で培養した夫々のリファンピシン処理肝細胞間で、ＣＹＰ３Ａ活性を比較した（図１）。肝細胞を各プレートに蒔き、４日間で培養系を確立させ、次いでさらに３日間、０．１％　ＤＭＳＯの存在下（コントロール細胞）又は種々の濃度のリファンピシンの存在下でインキュベートした。ＣＹＰ３Ａ活性を、テストステロンの６β－ヒドロキシル化の測定によって決定した。リファンピシンによる用量依存的なＣＹＰ３Ａ誘導が、各プレート上で培養された全ての肝細胞において観察されたが、ＣＹＰ３Ａ活性のレベルは、培養条件によって異なった。４８穴、９６穴のＩ型コラーゲンプレート、及び９６穴のマトリゲルプレートにおけるコントロール活性はそれぞれ８０、５０、及び１５３ｐｍｏｌ／ｈ／１０^６細胞であり、それらのプレートにおいて１０μＭ　リファンピシンで誘導されたＣＹＰ３Ａ活性はそれぞれ２２４３、１２００、及び３５３８ｐｍｏｌ／ｈ／１０^６細胞であった。９６穴マトリゲルプレートにおける基礎及び誘導されたＣＹＰ３Ａ活性は、４８又は９６穴Ｉ型コラーゲンプレートにおける活性よりも有意に高かった。
　図２は、リファンピシン、フェニトイン、及びカルバマゼピンによるＣＹＰ３Ａの誘導に対する異なるマトリクス条件の影響を示す。ＣＹＰ３Ａ誘導応答を、薄層マトリゲル（２ロット）、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチン等のバイオマテリアルからの細胞外マトリクスの成分；並びにポリ－Ｌ－オルニチン／ラミニン（ＰＬＯ／ＬＭ）、又はポリ－Ｄ－リジン（ＰＤＬ）等の培養基質上への細胞接着を促進する合成化合物、を含む、異なる種類の基質をもつ９６穴プレートにおいて培養された肝細胞間で比較した。マトリゲルプレートにおける平均基礎ＣＹＰ３Ａ活性は、他のプレートにおける活性と比較して、３．６倍～１０倍高かった。誘導されたＣＹＰ３Ａ活性もまた、これらのプレートの中で、マトリゲルプレートにおいて最も高かった。１０μＭ　リファンピシン応答に対して標準化したＣＹＰ３Ａ相対活性も、肝細胞をフェニトイン及びカルバマゼピンで刺激した場合に、前記したプレートの中で、マトリゲルコートプレートにおいて最も高かった（表３）。これらの知見は、試験化合物が弱い誘導剤である場合にも、薄層マトリゲルでのコーティングが、ＣＹＰ３Ａ誘導能の信頼性ある評価に効果的であることを示す。

種々の誘導剤及び非誘導剤で処理した凍結初代ヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａの誘導応答
　本発明の評価方法を検証するため、N.J. Hewitt, et al.; Chem. Biol. Interact. 168, 51-65 (2007)で報告された新鮮又は凍結初代ヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ誘導能にしたがって、強力な誘導剤、中程度の誘導剤又は非誘導剤に分類された種々の化合物で細胞を処理した。非誘導剤として用いた化合物は、セレコキシブ、シメチジン、シタロプラム、ファモチジン、フェキソフェナジン、フルボキサミン、ロキソプロフェン、ミダゾラム、及びリスペリドンであった。中程度の誘導剤として用いた化合物は、ゲムフィブロジル、ランソプラゾール、モダフィニル、ネビラピン、オメプラゾール、フェノバルビタール、フェニトイン、ロフェコキシブ、スルフィンピラゾン、及びトピラメートであった。強力な誘導剤として用いた化合物は、アバシミベ、カルバマゼピン、エファビレンツ、ニフェジピン、リファンピシン、及びトログリタゾンであった。各化合物を０．１μＭ、１μＭ、及び１０μＭで検査した。凍結初代肝細胞を３日間処理し、評価項目としてＣＹＰ３Ａ活性を測定した。ＣＹＰ３Ａ誘導能を、１０μＭ　リファンピシン応答の割合として表す。０．１μＭの濃度では、リファンピシン及びアバシミベを含むわずかな化合物のみが、ＣＹＰ３Ａ活性を誘導した（図３）。これらの化合物は、１μＭでは、ＣＹＰ３Ａ活性の著しい増加を示した。ニフェジピン、エファビレンツ、及びトログリタゾンもまた、１μＭでＣＹＰ３Ａ活性を誘導した。１０μＭの濃度では、全ての強力な誘導剤及び大部分の中程度の誘導剤が、ＣＹＰ３Ａ活性の増加をもたらした。これに対し、セレコキシブを除く全ての非誘導剤が、１０μＭでＣＹＰ３Ａ誘導をもたらさなかった。

リファンピシン誘導性のＣＹＰ３Ａ活性に対する化合物の阻害作用の評価の有用性
　本発明の評価方法を用いて、凍結初代ヒト肝細胞におけるさらなる化合物のＣＹＰ３Ａ誘導の濃度－応答の研究を行った。試験化合物のうち、フェノバルビタール及びカルバマゼピンは、ＣＹＰ３Ａ活性の標準的な濃度依存性のアップレギュレーションを示した（図４Ａ）。これに対し、アバシミベ及びエファビレンツは、ベル型の濃度－応答曲線を示した（図４Ｂ）。これらの化合物においては、ＣＹＰ３Ａ活性によって誘導能をスクリーニングする場合に、ＣＹＰ３Ａ誘導を過小評価するリスクがある。そのような過小評価を防ぐために、本発明の評価方法では、アッセイのコントロールとして、リファンピシン誘導性のＣＹＰ３Ａ活性に対する試験化合物の阻害作用を評価した。リファンピシンと、いくつかの濃度の試験化合物の存在下肝細胞を３日間培養し、誘導されたＣＹＰ３Ａ活性を決定した。標準的な濃度依存性を示した化合物の場合、リファンピシン誘導性のＣＹＰ３Ａ活性は、試験化合物の全濃度範囲において、変化しなかった（図４Ａ）。しかし、化合物が非定型のベル型の濃度－応答曲線を示した場合、リファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ活性は、より高い化合物濃度においては減弱し、それと共に、試験化合物による誘導も減少した（図４Ｂ）。
　リトナビルは、周知のＣＹＰ３Ａの誘導剤かつ機序に基づく阻害剤であるが（E.L. LeCluyse, et al.; Eur. J. Pharm. Sci. 13, 343-368 (2001)）、リトナビルのＣＹＰ３Ａ誘導能は、ＣＹＰ３Ａ活性の測定によっては検出できず、リファンピシン存在下ではリトナビル濃度が増加するとともにリファンピシン誘導性のＣＹＰ３Ａ活性が減弱した（図５Ａ）。しかし、同一の肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量の測定によっては、リトナビルの濃度依存的なＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量の増加によってリトナビルのＣＹＰ３Ａ４誘導能が確認された（図５Ｂ）。リトナビルと共培養したリファンピシンによって誘導されたＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量は、高リトナビル濃度においても減弱しなかった。
　これらの結果により、本発明の評価方法は、ＣＹＰ３Ａ誘導能の過小評価を防ぐことを可能とすることが示された。

　誘導されたＣＹＰ３Ａ活性とＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量との間の相関を確認するために、４４の化合物をいくつかの濃度で、１０μＭ　リファンピシンの存在下又は非存在下で検査した。図６は、試験化合物についての、誘導されたＣＹＰ３Ａ活性とＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量との間の相関プロットを示す。この図において、各記号は、試験化合物と共培養した場合の、リファンピシン誘導性ＣＹＰ３Ａ活性の残留率の程度を表す。試験化合物によって誘導されたＣＹＰ３Ａ活性及びＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡ量は、リファンピシン誘導性のＣＹＰ３Ａ活性の残留率が８０％を超える場合には、全て良く相関した。しかし、リファンピシン誘導性のＣＹＰ３Ａ活性が３０％未満に抑制された場合、試験化合物は潜在的に阻害作用を有し、試験化合物のＣＹＰ誘導能は、ＣＹＰ３Ａ活性によって検出されなかった一方で、ＣＹＰ３Ａ４　ｍＲＮＡの発現は、化合物によって誘導された。

　本発明の評価方法は、早期探索段階における医薬候補化合物の生体異物代謝酵素活性の誘導能評価において、試験化合物が細胞傷害性又は機序に基づく阻害作用等を有する場合に起こる誘導能の過小評価を防ぐことを可能とし、特に真に誘導能のない化合物を探索するために有用である。

　本出願は、2009年8月31日付で日本国に出願された特願2009-201043を基礎としており、その内容は全て本明細書に包含される。

Claims

　以下の工程：
　（ａ）培養肝細胞を含む試料を二分し、一方を生体異物代謝酵素活性の誘導物質の存在下、試験化合物で処理し、他方を生体異物代謝酵素活性の誘導物質の非存在下、試験化合物で処理する工程、
　（ｂ）工程（ａ）で得られた各試料中に含まれる該生体異物代謝酵素の活性を測定する工程、及び
　（ｃ）工程（ｂ）で測定された各酵素活性を比較し解析する工程
を含むことを特徴とする、試験化合物の生体異物代謝酵素誘導能の評価方法。
　工程（ａ）における処理が、薄層マトリゲルでコーティングされた培養器上で行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
　培養器が９６穴プレートである、請求項２記載の方法。
　工程（ａ）における処理が、２以上の試験化合物濃度において行われる、請求項１記載の方法。
　生体異物代謝酵素が、シトクロムＰ４５０である、請求項１記載の方法。
　シトクロムＰ４５０が、ＣＹＰ３Ａである、請求項５記載の方法。
　シトクロムＰ４５０がＣＹＰ３Ａ４である、請求項５記載の方法。
　生体異物代謝酵素活性の誘導物質が、リファンピシン、ニフェジピン、エファビレンツ、カルバマゼピン、アバシミベ、トログリタゾン、ゲムフィブロジル、ランソプラゾール、モダフィニル、ネビラピン、オメプラゾール、フェノバルビタール、フェニトイン、ロフェコキシブ、スルフィンピラゾン、又はトピラメートである、請求項１記載の方法。
　生体異物代謝酵素活性の誘導物質が、リファンピシンである、請求項１記載の方法。
　培養肝細胞が哺乳動物由来肝細胞である、請求項１記載の方法。
　培養肝細胞がヒト肝細胞である、請求項１記載の方法。
　培養肝細胞が凍結初代ヒト肝細胞である、請求項１記載の方法。
　培養肝細胞における該生体異物代謝酵素の遺伝子発現を測定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。