WO2011009992A2 - Método para la detección, identificación y cuantificación de peronospora arborescens por pcr cuantitativa en tiempo real - Google Patents

Método para la detección, identificación y cuantificación de peronospora arborescens por pcr cuantitativa en tiempo real Download PDF

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Universidad de Cordoba
Alcaliber SA
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the invention concerns, in general, the detection and quantification of plant pathogens and, in particular, with a method for the quantification of Peronospora arborescens based on the quantitative PCR amplification of specific regions in the DNA of said pathogen.
  • Opium poppy (Papaver somniferum) is the only source of pharmaceutical morphine, codeine and thebaine, which are key drugs to relieve chronic pain associated with cancer diseases.
  • opium poppy In Spain around 9,500 hectares of opium poppy are grown annually, mainly in the southern (Andalusia) and central regions (Castilla-La Mancha and Castilla-León) of the country (Landa, BB et al; 2007.
  • This cultivation area represents about 5% of the opium poppy cultivated legally worldwide, which makes Spain, respectively, the third and fourth largest producer in Europe and worldwide of poppy straw rich in morphine (INCB , 2006).
  • a quantitative and sensitive PCR method would be particularly useful for epidemiological studies, the design of disease control and quarantine strategies, particularly to: (i) identify the existence of resistant or tolerant poppy germplasm by quantifying the pathogen in symptomatic infections and asymptomatic; (ii) establish a correlation between the amount of disease that can develop from use of commercial seed batches with the amount of pathogen quantified therein, which would help avoid the use of seed batches that represent a potential risk for the development of epidemics; and (iii) correlate the amount of pathogen in infected plant tissues with the level of disease development and / or subsequent symptom expression after the use of disease control measures (biological, chemical or physical).
  • Quantitative real-time PCR was introduced in the monitoring of plant pathogens directly from plant tissues in the late 1990s, and has since been adapted for use in many plant-pathogen systems, including several oomycetes, fungi, bacteria, nematodes and plant pathogenic viruses (see, for example, Schena, L., et al. 2004. Eur. J. Plant Pathol. 110: 893-908).
  • oomycetes most qPCR assays have been developed for different species of Pythium (Atallah, ZK, and WR Stevenson. 2006. Phytopathology 96: 1037-1045) and Phytophthora (Atallah, ZK, and WR Stevenson 2006.
  • Identification and detection through real-time qPCR can be useful to solve problems derived from the nature of the strict biotrophy of Peronospora spp., Mainly related to the impossibility of isolating the pathogen from infected tissues and conventional culture in vitro.
  • the chemistry of the real-time qPCR assays used for the detection and study of phytopathogenic microorganisms can be grouped into non-specific sequence methods (Schroeder, KL et al. 2006. Phytopathology 96: 637-647) and specific sequence methods (TaqMan , Molecular Beacons, Scorpion-PCR, etc.) (Valsesia, G et al. 2005. Phytopathology 95: 672-678) of amplicons. Sequence-specific chemistry is more specific but increases the cost of analysis when these methods are used in a generalized and practical way.
  • SYBR Green I fluorescent dye for the detection of amplicons is a good and reliable method if specific primers are well designed; but more importantly, it is probably the most economical option compared to other chemicals, thereby allowing Perform a higher number of qPCR trials for practical applications in field studies.
  • each reaction is characterized by a specific number of cycles, the threshold cycle (C T ), in which a statistically significant increase in fluorescence can be detected above the initial level.
  • the C T is inversely proportional to the logarithm of the concentration of the target sequence. This means that the more template that is present in a PCR sample, the lower the number of amplification cycles necessary to reach the point where fluorescence can be detected above the initial level (Lie, YS et al. 1998. Curr. Opin Biotechnol. 9: 43-48).
  • the methods of real-time qPCR analysis obtained by comparing the C ⁇ values of the test samples against a standard curve that originates from samples of known concentration are commonly known as absolute quantification.
  • DNA samples can be obtained to obtain standard curves from mycelia and fragmented sporangia from sporulated leaves (Hukkanen, A et al. 2006. Eur. J. Plant Pathol. 116: 225-235; Landa, BB et al; 2007. Phytopathology 97: 1380-1390).
  • absolute standard curves have been constructed from plasmids containing the target DNA as a cloned insert (Hukkanen, A et al. 2006. Eur. J. Plant Pathol. 116: 225-235).
  • an economical, fast, innovative and reliable real-time qPCR assay has been developed to identify and quantify P. arborescens DNA in different poppy tissues.
  • the effects of different host plant tissues on the amplification, reproducibility and sensitivity of the assays, and on the detection limits have been evaluated by comparing the sensitivity of the qPCR protocol in real time with the simple and nested PCR protocols specific for P previously developed arborescens (Landa, BB et al .; 2007. Phytopathology 97: 1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99: 73-81).
  • Peronospora arborescens is a pathogenic fungus responsible, among others, for Mildiu's disease of the opium poppy (Papaver somniferum).
  • Mildiu's disease of the opium poppy Papaver somniferum.
  • the development of a method of identification and specific detection of said pathogen and also highly reproducible, allows an early diagnosis of the disease useful in its control, thus avoiding the distribution of the pathogen to other crop areas.
  • the invention is therefore related to a method for the quantification of Peronospora arborescens by quantitative PCR in a biological sample, comprising:
  • the invention relates to the use of the oligonucleotide pair SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, in a quantitative PCR amplification reaction to quantify the presence of P. arborescens in a biological sample.
  • Figure 1 describes the real-time PCR amplification profiles generated from the cycle-by-cycle collection of genomic DNA from P. arborescens (10 ng / ⁇ l) serially diluted [1: 1 (•), 1: 10 ( O), l: 10 2 (D), l: 10 3 ( ⁇ ), l: 10 4 (O) and l: 10 5 (V)] in ultrapure sterile water (AEU) (Gw) (A) as well as in a fixed background of Papaver somniferum DNA (40 ng / ⁇ l) extracted from healthy poppy seeds (Gs) (C), and analysis of the respective fusion curves for Gw (B) and Gs (D), shown as the first negative derivative of the relative fluorescence units -d (RFU) / dt represented against temperature.
  • AEU ultrapure sterile water
  • FIG. 1 describes box diagrams showing the reproducibility of qPCR assays using primer pairs P3Pa2fw / P3Pa2rv (set P2), OMPaclfw / OMPaclrv (set P3) and OMPac7fw / OMPac7rv (set P6).
  • Threshold cycles were plotted against the logarithm of the genomic DNA standard curves of Peronospora arborescens (from 10 ng to 100 fg) diluted in water (GIw charts) or in Papaver somniferum DNA (40 ng) extracted from seeds (Gis graphics). Each concentration of DNA in each background DNA was tested for all three sets of primers on the same plate in duplicate and the experiment was repeated twice.
  • Figure 3 shows standard regression lines of (A) a serial dilution of
  • Figure 4 shows the sensitivity of the method in agarose gel electrophoresis of OMPac7fw / OMPac7rv primers (set P6) specific to Peronospora arborescens in simple, quantitative and nested PCR assays using P.
  • Figure 5 shows (A) the standard deviations and (B) the standard regression lines of a 10-fold serial dilution of five DNA points of Peronospora arborescens (1 ng / ⁇ l; G series) or a serial dilution of 10 times of six DNA points of plasmid EC3 P38ESJ (1 ng / ⁇ l; P series) containing the ITS region of the pathogen, both diluted in Papaver somniferum DNA (40 ng) extracted from the leaves (GL and PL) O of Seeds (Gs and Ps) - Threshold cycles (CT) were plotted against the logarithm of the genomic DNA standard curves of known concentrations.
  • the data shown are from five independent DNA standard curves and two independent technicians, and each data point represents the average of two qPCR repeats.
  • Figure 6 shows the quantification of Peronospora arborescens DNA in the stem of asymptomatically infected Papaver somniferum plants.
  • A Standard regression lines of a 10-fold serial dilution of six points of P. arborescens DNA (1 ng / ⁇ l; G L series) or a 10-fold serial dilution of seven points of
  • Plasmid DNA EC3 P38ESJ (1 ng / ⁇ l; P L series) containing the ITS region of the pathogen, both diluted in P. somniferum DNA (40 ng) extracted from the leaves and used in qPCR assays.
  • the data shown are the average of three plates for
  • Figure 7 shows the quantification of Peronospora arborescens DNA in samples from commercial seed lots of Papaver somniferum.
  • A Standard regression lines of a 10-fold serial dilution of six points of P. arborescens DNA (1 ng / ⁇ l; G L series) Or a 10-fold serial dilution of seven DNA points of plasmid EC3 P38ESJ (1 ng / ⁇ l; P L series) containing the ITS region of the pathogen, both diluted in P. somniferum DNA extracted from the seeds and used in the qPCR assays. The data shown are the average of two independent PCR plates and two repetitions of qPCR ⁇ standard deviation.
  • B, C, D Relative amounts of P. arborescens DNA in P.
  • Peronospora arborescens is a pathogenic oomycete that causes the disease called Mildiu of the opium poppy ⁇ Papaver somniferum).
  • the development of a specific identification and detection method of said pathogen allows an early diagnosis of the disease during asymptomatic states of the plant, which facilitates the efficient control of the same, as well as the sanitary certification of the seed avoiding this mode the distribution of the pathogen to culture areas where it is not present.
  • this technology allows the evaluation of resistance or tolerance to P. arborescens in poppy germplasm that would make it possible to select resistant poppy cultivars in plant genetic improvement programs
  • the method developed in the present invention is based on the quantitative detection of P. arborescens by real-time PCR using for that amplification specific oligonucleotide primers for P. arborescens (SEQ ID NO: 5-6). Therefore, the invention relates to a method, hereinafter, method of the invention, for the quantification of Peronospora arborescens by quantitative PCR in a biological sample, comprising:
  • step (ii) amplification of the DNA extracted in step (i) by quantitative PCR with the oligonucleotides identified by the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • step (i) of the method of the invention can be carried out by conventional protocols known to the person skilled in the art, or by using commercial kits, for example, the G-Spin Hp kit (Intron Biotechnology, Korea) or the Fast Prep System Bio 101 (Qbiogene, Madrid, Spain), as shown in Example 1 accompanying the present invention.
  • G-Spin Hp kit Intron Biotechnology, Korea
  • Fast Prep System Bio 101 Qbiogene, Madrid, Spain
  • the method of the invention comprises in step (ii), an amplification reaction of the DNA extracted in step (i) previously cited by quantitative PCR, using oligonucleotides specially designed to specifically amplify fragments of the internal spacer regions of the ribosomal DNA of P. arborescens.
  • the particular conditions employed in the amplification reaction for the oligonucleotide primer pair, designated in the present invention P6 (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6), are described in Example 1.
  • the iQ SYBR Green Supermix reaction mixture (BioRad, Madrid, Spain) and the iCycler IQ (BioRad) apparatus can be used, as shown in Example 1.
  • optimal oligonucleotide primers used in amplification are the couple
  • OMPac7fw / OMPac7rv (SEQ ID NO: 5 and 6, respectively).
  • the biological sample is a sample of plant material, or a sample of a P. arborescens structure.
  • said sample of plant material includes seed tissues, seed covers, leaves, stems, capsules, roots, etc., and mixtures thereof.
  • the method of the invention makes it possible to detect and quantify the presence of P. arborescens in seeds or tissues derived from seeds (such as their covers, pericarp and endocarp). This is really important, because in this way it is possible to detect and prevent the transmission of P. arborescens through the seeds, which have been shown to give rise to infected adult plants.
  • said biological sample is infected by P. arborescens.
  • oomycete structures include somatic structures, such as mycelium, and reproductive structures, such as sporangium forums, sporangia, and oospores.
  • the biological sample is a sample of P. arborescens structures, which contains mycelium, sporangia, sporangiophors or oospores.
  • mycelium refers to the set of filaments provided with a cell wall that forms the oomycete. Each filament of it is called hypha.
  • sporangiophore refers to the filamentous and arborescent structure of the oomycete on whose distal ends the sporangia are formed, a globose structure with a simple peridial membrane that contains numerous "sporangiospores.”
  • sporangiospores refers to the spore produced and contained in a sporangio.
  • oospora refers to spores that result from the sexual reproduction of the oomycete mediated by heterogametangios (ogamous reproduction) capable of remaining viable in the remains of the plant tissues in which they are formed and in the soil for a long period of time.
  • the biological sample comes from P. somniferum.
  • This plant can be in an asymptomatic state, that is, without symptoms or distinctive signs that allow to know if the plant has been infected by P. arborescens, or in a symptomatic state, that is, the plant has the symptoms of the infection of the pathogen such as, among others, dwarfism, development of chlorotic areas in leaf limbus, deformations of leaf limbus and aggregation of infected leaves forming rosettes.
  • the method of the invention for quantifying Peronospora arborescens has, among others, the following advantages:
  • the method of the invention is based on the quantification of Peronospora arborescens by quantitative PCR in a biological sample using oligonucleotides that specifically amplify P. arborescens.
  • the invention relates to the use of an oligonucleotide pair identified by the sequences SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 in the quantitative PCR amplification reaction in order to quantify the presence of P. arborescens in a biological sample.
  • Said oligonucleotides hybridize with the internal transcribed spacer regions of the P. arborescens ribosomal DNA.
  • Seedlings were grown to obtain mature leaf tissues from germinated seeds in sterile layers of filter paper moistened with 2 ml of sterile 50% Hoagland solution (Hoagland, DR, and DI Arnon. 1950; Calif. Agrie. Exp. Stn Circ. No. 347) in 9 cm diameter Petri dishes at 2O 0 C for one week. The seedlings were then transplanted in a soil mixture (clay loam / peat, 2: 1, vol / vol) pasteurized (7O 0 C, 60 min.) In pots and incubated in a culture chamber (Sanyo MLR-350 H , Sanyo Electric Co., Ltd. Japan) at 2O 0 C and relative humidity (RH) of 70/90% and a photoperiod of 12 h of fluorescent light at 360 ⁇ E-rn ⁇ -s "1 .
  • Hoagland solution Hoagland, DR, and DI Arnon. 1950; Calif. Agrie. Exp. Stn Cir
  • ITS and 5.8S regions of rDNA from two different samples of P. arborescens (P38ESJ and M2ERUI, Landa, BB et al; 2007.
  • Phytopathology 97: 1380-1390) of our culture collection were amplified using pairs of DC6 / ITS4 primers and ITS5 / ITS4. Amplicons were purified and ligated into System I of pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, WI, USA) using Escherichia coli strain JM 109 for transformation, as described above (Landa, BB et al; 2007. Phytopathology 97: 1380-1390).
  • Genomic DNA from P. arborescens and poppy seeds and leaves was extracted using the 'G-Spin TM Hp' genomic DNA extraction kit (Intron Biotechnology, Korea) and the Fast Prep System Bio 101 (Qbiogene, Madrid, Spain) according to Landa et al. (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97: 1380-1390).
  • LB Luria broth-Bertani
  • DNA quality was evaluated by gel electro foresis and ethidium bromide staining. All DNA samples were quantified accurately using the broad-spectrum fluorometric assay of the Quant-iT DNA test kit (Molecular Probes Inc., Leiden, The Netherlands) and a Tecan Safire fluorospectometer (Tecan Spain, Barcelona, Spain) (Landa, BB et al; 2007. Phytopathology 97: 1380-1390). Special care was taken to take exact concentrations of plasmid, pathogen and host DNA by quantifying each DNA sample in triplicate, in two independent microplates. To have an internal control of DNA quantification, samples of opium poppy and P. arborescens DNA of known concentration were included in each quantification plate. Genomic and plasmid DNA were diluted with AEU if appropriate.
  • DNA standard curves were obtained from 10-fold dilutions of P. arborescens genomic DNA (G series) or plasmid DNA (P series).
  • each dilution point was quantified in triplicate using the fluorometric Quant-iT high sensitivity DNA assay kit (Molecular Probes Inc.), assuming the same DNA from the pathogen in the DNA standard curves G1-5 L G1-5 S and P1-5 L and P1-5 S.
  • the five series of DNA standard curves obtained with genomic DNA from P. arborescens (G1-5L and Gl-5s, background DNA of the leaves and of the seeds, respectively) and / or DNA of the selected plasmid EC3_P38ESJ (P1-5 L and P1-5 S , background DNA of the leaves and seeds, respectively) in a series of two by two (G1L, S-P1L, S, G2 L , S-P2L, S, G3L, S-P3L, S, G4 L , S-P4L, S and G5L, S -P5L, S ) on the same PCR plate.
  • Quantitative PCR amplifications of each series of DNA standard curves included two repetitions per plate and were repeated twice in independent experiments (PCR plates and technicians).
  • DNA was extracted as described above (Landa, BB et al .; 2007. Phytopathology 97: 1380-1390) from seeds obtained from capsules of 30 randomly chosen poppy plants grown in a field with a disease incidence of about 5%. Of the 30 capsules, 19 showed symptoms of Mildiu of different severity and 11 had no symptoms. In these real-time qPCR assays, G4s and P4s DNA standard curves were used and included in each of the two independent plates, with two repetitions for each DNA sample.
  • Seed or opium poppy plant DNA was diluted 1/2 or 1/5 times in AEU to obtain a DNA concentration in a range similar to that used in the DNA standard curve. Then DNA samples were quantified exactly, in triplicate, using the broad spectrum fluorometric assay of the Quant-iT DNA test kit, as described above and used to normalize P. arborescens DNA with respect to the total plant DNA present in each reaction. The qPCR results of unknown samples (seeds and stems) were compared with those obtained previously with simple and nested PCR assays using the P6 primer set (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99: 73-81 ). Finally, the amount of pathogen DNA in unknown samples was estimated from the universal G series regression lines, once it was found that the P4s standard regression lines did not differ statistically (P> 0.05) from the Universal P series regression lines (see below).
  • the threshold cycle values (C T ) were first calculated for each reaction by determining the number of PCR cycles in which the fluorescence signal exceeds the background using the default estimation criteria in the iCycler IQ version 3.0a software ( Bio-Rad). Subsequently, in order to compare and establish relationships between different DNA standard curves generated from different treatments, the threshold position was manually defined and fixed at the same position for all treatments and experiments to properly compare all curves pattern (Vaerman, JL et al. 2004; J. Biol. Regul. Homeost. Agents 18: 212-214).
  • EA efficiency of amplification
  • the optimization of qPCR in real time involved the fine tuning step by step of the following PCR parameters: selection of the set of primers (P2 vs. P3 vs. P6), concentration of primers, hybridization temperature and final volume of the reactions of PCR This was done using DNA standard curves (GIw and Gis) in two independent experiments for each set of primers.
  • the optimized PCR reaction mixture was similar for each of the primer sets and contained (final volume of 20 ⁇ l): 1 ⁇ l of DNA sample, l ⁇ iQ SYBR Green Supermix (BioRad) and 0.3 ⁇ M of each primer.
  • the thermal cycling conditions consisted of an initial denaturation at 95 0 C for 2 min. followed by 35 cycles of 1 min. at 95 0 C, 1 min. at 63 0 C, 2 min. at 72 0 C and 83 0 C for 15 s.
  • One final extension step at 72 0 C was added over 10 min. Fluorescence was detected of the target amplicon at 83 0 C.
  • a threshold position of 400 was set for all experiments to determine C T values.
  • the target DNA could not be quantified in some repetitions at the highest concentration of 10 ng due to the inhibition of the amplification reaction.
  • the sensitivity of the qPCR protocol in real time was determined using a set of P6 primers for two series of DNA standard curves (G1-2 W , S , L and Pl-2 W , S , L ) and the results were compared with those obtained by gel electrophoresis using the simple and nested PCR protocols previously developed (Landa, BB et al; 2007. Phytopathology 97: 1380-1390; Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99: 73-81) .
  • G1-2 W , S , L curves were used, the PCR detection limits for the simple and nested PCR assays were similar to those previously reported (Landa, BB et al; 2007.
  • the amount of P. arborescens DNA ranged from 0.074 to 0.0013% or ( Figure 7B), from 0.0004 to 0.09 l% or ( Figure 7C) and from 0.05 to 1, 275% or (Figure 7D) in the seed samples that produced respectively null, weak, or positive amplifications, in the simple PCR assay; and weak amplifications, positive or positive, in nested PCR assays, respectively.
  • P. arborescens represented a maximum of 0.077% in P. somniferum DNA, which represents approximately 0.256 mg of P. arborescens DNA per kg of seeds.
  • the amount of pathogen within a seed batch varied between the three independent samples tested, indicating the need to perform several repetitions per seed batch to achieve an exact quantification of pathogens ( Figure 7).
  • kits were used to measure the ratio of the pathogen DNA (quantified by the real-time qPCR assay) for the host DNA in each sample of the sample was deduced test (quantified previously by fluorescence) by adjusting the variation introduced by the differences from one sample to another in the DNA extraction; In addition, this avoided the cost of quantifying host DNA by additional qPCR assays (Gachón, C, and P. Saommenan. 2004. Plant Physiol. Biochem. 42: 367-371).
  • C T threshold cycles
  • C ⁇ are defined based on the threshold position and the background fluorescence is not a constant or absolute value, since it is influenced by changing reaction conditions, calculating a different threshold for each treatment or plate could give as a result an error, especially when trying to combine different plates for a single experiment (Bustin, SA, and Nolan, T. 2004. J. Biomol. Tech. 15: 155-166). Therefore, in the present invention, a DNA standard curve was included in each microplate when a real-time qPCR assay was performed, and the threshold position was defined and set manually, after appropriate validation, in the same position for that all treatments and experiments could compare independent plaques and combine the results after adequate verification of statistically similar results (P ⁇ 0.05). The position was chosen based on the establishment of a commitment to detect C T in the exponential phase of the reaction while avoiding background fluorescence (Bustin, SA, and Nolan, T. 2004. J. Biomol Tech. 15: 155-166).
  • the EA, sensitivity and reproducibility of the qPCR reactions of both standard G-series and P-series DNA curves were positively affected by the presence of both types of host DNA (from tissues of the leaves and seeds). Therefore, there was a tendency to obtain greater sensitivity when the host DNA was present in the reaction, as previously demonstrated by the simple and nested PCR protocol.
  • Other studies have found a reduction (Li, W. et al. 2007. Plant Dis. 91: 51-58) or found no difference (Atallah, ZK et al. 2007. Phytopathology 97: 865-872) in AD , the accuracy and limit of detection when a background DNA of host plant tissues is used in qPCR assays.
  • the univariable ANOVA of the values of C T and the statistical comparison between the slopes and the ordinates at the origin of the derived standard regression lines of 10 independent experiments indicated high accuracy and reproducibility, which demonstrates the high reliability of our real-time qPCR assay.
  • All standard regression lines showed high efficiency and reproducibility of amplifications, with low standard deviations of C T , oscillating EA values from 89.6 to 111.1% for the G and P series, and a linear dynamic range over 6 orders of magnitude s using the values of R 2 0.99.
  • the statistical analysis of the ten independent DNA standard curves obtained using different sources of pathogen and plant DNA (Table 1), including leaves and poppy seeds of different origin and different age, P.
  • the method of the invention by qPCR showed a higher sensitivity than that reported for other qPCR assays using Taq Man probes to quantify viticultural Plasmopara in leaves of Vitis vinifera (Valsesia, G. et al. 2005. Phytopathology 95: 672- 678) or four species of Phytophthora ⁇ Phytophthora ramorum, Ph. Kernoviae, Ph. Quercina and Ph. Citricol ⁇ ) in different plant species (Schena, L. et al. 2004. Eur. J. Plant Pathol. 110: 893-908 ), or using SYBR Green I to quantify P. sparsa in Rubus spp. (Hukkanen, A et al.
  • This higher level of sensitivity may be due to the fact that the set of P6 primers was developed in the ITS regions of the rDNA, which occurs in multiple copies (for example, 414 ⁇ 12 copies per haploid genome in Ph. Infestans); however, some of the studies referred to previously used primers that select the same gene as a target (Ippolito, A. et al. 2004. Eur. J. Plant Pathol. 110: 833-843).
  • the main advantages of the high sensitivity of the method of the invention was that the method could detect and quantify pathogen biomass in naturally infested samples complex from multiple sources, including asymptomatic capsule seeds and commercial seed batches as well as from asymptomatic opium poppy plants systemically infected by P. arborescens. Mildius are among the most destructive diseases of crops worldwide and can be transported by seeds. Consequently, efforts should be made to prevent the introduction of infected seeds in areas where the pathogen is not produced. Although the presence of Peronospora spp. in commercial seed batches through the use of traditional or specific PCR assays (Belbahri, L. et al. 2005. Mycol. Res.
  • the amount of P. arborescens DNA in commercial seed batches may range from 0.0013% or up to 1.255% or in P. somniferum DNA and that it represents up to 0.256 mg of DNA of P. arborescens per kg of seeds. It has also been shown that P. arborescens can be detected in seeds obtained from asymptomatic capsules representing 0.006-0.6 l% or DNA from P. somniferum.
  • Nigrum in which asymptomatic systemic infections have been established is considered Mildiu tolerant (FJ Mu ⁇ oz-Ledesma, personal communication), consequently the present results would also be of great interest for the detection of resistance, since the lack of symptoms does not guarantee that The infection does not take place.
  • Genomic DNA from P. arborescens and from the seeds and leaves of the opium poppy was extracted using the genomic DNA extraction kit from plants "G-SpinTM Hp" and the Fast Prep System Bio 101 according to Landa et al. Plasmid DNA from E. coli strain JM 109 was extracted with the QuickGene Plasmid kit using the QuickGene- device.
  • G 8 40 + / + + / + + / + ⁇ / ⁇ - / - - / - np - / -
  • OMPac7fw / OMPac7rv primers (P6 set) were used in simple and nested PCR protocols as described above (Landa, BB et al .; 2007. Phytopathology 97: 1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009 ; Phytopathology 99: 73-81) or in a quantitative PCR assay (this study).

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Abstract

El método para la cuantificación de peronospora arborescens por PCR cuantitativa (qPCR) en una muestra biológica comprende extraer el ADN contenido en dicha muestra biológica y amplificarlo mediante qPCR. De aplicación en la cuantificación de P. arborescens

Description

MÉTODO PARA LA DETECCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PERONOSPORA ARBORESCENS POR PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO
REAL CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención concierne, en general, a la detección y cuantificación de patógenos de plantas y, en particular, con un método para la cuantificación de Peronospora arborescens basado en la amplificación por PCR cuantitativa de regiones específicas en el ADN de dicho patógeno.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La adormidera (Papaver somniferum) es la única fuente de morfina, codeína y tebaína farmacéuticas, que son fármacos clave para aliviar el dolor crónico asociado con enfermedades de cáncer. En España se cultivan anualmente alrededor de 9.500 ha de adormidera, principalmente en las regiones meridional (Andalucía) y central (Castilla-La Mancha y Castilla-León) del país (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380- 1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). Esta superficie de cultivo representa cerca del 5% de la adormidera cultivada de manera legal en todo el mundo, lo que hace que España sea, respectivamente, el tercer y cuarto productor más grande de Europa y mundial de paja de adormidera rica en morfina (INCB, 2006).
Los cultivos comerciales de adormidera en España pueden verse afectados por varias enfermedades de etiología diversa (Aranda, S. et al. 2008. Plant Dis. 2:317, Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390). Sin embargo, durante los últimos 5 años el Mildiu se ha convertido en el principal factor que limita el rendimiento de este cultivo en el país (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). En la actualidad, los ataques del Mildiu se producen en todas las áreas que cultivan adormidera en España y su incidencia y gravedad han aumentado continuamente desde que se registraron los primeros ataques de la enfermedad (Landa, B. B. et al. 2005. Plant Dis. 89:338). En España y Francia, los ataques de Mildiu en los campos comerciales de adormidera son causados por el oomiceto biotrofo obligado Peronospora arborescens (Landa, B. B. et al. 2005. Plant Dis. 89:338, Montes-Borrego, M. et al. 2008. Plant Dis. 92:834), en comparación con Australia donde se ha identificado a P. cristata como el agente causal de la enfermedad (Scott, J. B. et al. 2004. Mycol. Res. 108:198-295). La detección exacta y la identificación apropiada del agente causal son esenciales para el control eficaz de una enfermedad de plantas. Durante los últimos 15 años han surgido técnicas moleculares basadas principalmente en ensayos convencionales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como principal herramienta para diagnosticar e identificar hongos fitopatógenos, que han contribuido a mitigar algunos de los problemas asociados con la detección, el control y la contención de patógenos de plantas (Henson, J.M. et al. 1993. Annu. Rev. Phytopathol. 31 :81-109). Gracias a esta tecnología, recientemente se han realizado progresos considerables en el desarrollo de protocolos moleculares para la detección de P. arborescens en diferentes tejidos vegetales (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). En un trabajo reciente (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390) se ha desarrollado un protocolo de PCR simple específico de P. arborescens usando cualesquiera de dos conjuntos de pares de cebadores (OMPaclfw/OMPaclrv y OMPac7fw/OMPac7rv) que: (i) puede usarse para la detección de patógenos en cápsulas, hojas, raíces, semillas y tallos de plantas de adormidera; (ii) es lo bastante sensible para detectar de 0,1 a 10 pg de ADN de P. arborescens; y (iii) es altamente específico ya que no se produce la amplificación cruzada con otros patógenos estrechamente relacionados en tejidos infectados de adormidera, especialmente de P. cristata. Posteriormente se ha logrado una mejora significativa para la detección in planta de ADN de P. arborescens mediante un protocolo de PCR anidada desarrollado recientemente (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81) que tiene una sensibilidad de 2 a 3 órdenes de magnitud superior en comparación con la del ensayo de PCR simple usando los mismos cebadores, mientras que se mantienen las propiedades de este último ensayo. Ese aumento de la sensibilidad del protocolo de PCR anidada permitió la detección de tan sólo de 5 a 0,5 fg de ADN de P. arborescens en un fondo de 25 a 50 ng de ADN de adormidera.
Una de las limitaciones de los protocolos de PCR desarrollados es que no permiten cuantificar el nivel de infección en la planta por el patógeno. Un método de PCR cuantitativo y sensible sería particularmente útil para estudios epidemiológicos, el diseño de estrategias de control de enfermedades y cuarentena, particularmente para: (i) identificar la existencia de germoplasma de adormidera resistente o tolerante mediante la cuantificación del patógeno en infecciones sintomáticas y asintomáticas; (ii) establecer una correlación entre la cantidad de enfermedad que puede desarrollarse a partir del uso de lotes de semillas comerciales con la cantidad de patógeno cuantificada en las mismas, que ayudaría a evitar el uso de lotes de semillas que representan un riesgo potencial para el desarrollo de epidemias; y (iii) correlacionar la cantidad de patógeno en tejidos vegetales infectados con el nivel de desarrollo de la enfermedad y/o expresión de síntomas posterior tras el uso de medidas de control de enfermedades (biológicas, químicas o físicas).
La PCR cuantitativa (qPCR) en tiempo real se introdujo en la monitorización de patógenos de plantas directamente a partir de tejidos vegetales a finales de los años 90, y desde entonces se ha adaptado para su uso en muchos sistemas de plantas-patógenos, incluyendo varios oomicetos, hongos, bacterias, nemátodos y virus patógenos de plantas (véase, por ejemplo, Schena, L., et al. 2004. Eur. J. Plant Pathol. 110: 893-908). En el caso de los oomicetos, la mayoría de los ensayos de qPCR se han desarrollado para diferentes especies de Pythium (Atallah, Z. K., y W. R. Stevenson. 2006. Phytopathology 96:1037-1045) y Phytophthora (Atallah, Z. K., y W. R. Stevenson. 2006. Phytopathology 96:1037-1045, Avrova, A. et al. 2003. Fung. Genet. Biol. 40:4- 14). Además, se han desarrollado algunos ensayos de qPCR para los oomicetos biotrofos obligados como Plasmopara vitícola (Valsesia, G et al. 2005. Phytopathology 95:672- 678) y para algunas especies de Peronospora, incluyendo P. sparsa (Hukkanen, A et al. 2006. Eur. J. Plant Pathol. 116:225-235) y P. parasítica (Brouwer, M. et al. 2003. FEMS Microbiol. Lett. 228:241-248). La identificación y la detección a través de qPCR en tiempo real puede ser útil para resolver problemas derivados de la naturaleza de la biotrofia estricta de Peronospora spp., relacionados principalmente con la imposibilidad de aislar el patógeno a partir de tejidos infectados y del cultivo convencional in vitro.
La química de los ensayos qPCR en tiempo real utilizados para la detección y el estudio de microorganismos fitopatógenos pueden agruparse en métodos no específicos de secuencia (Schroeder, K. L. et al. 2006. Phytopathology 96:637-647) y métodos específicos de secuencia (TaqMan, Molecular Beacons, Scorpion-PCR, etc.) (Valsesia, G et al. 2005. Phytopathology 95:672-678) de amplicones. La química específica de secuencia es más específica pero aumenta el coste del análisis cuando se usan esos métodos de un modo generalizado y práctico. El uso del colorante fluorescente SYBR Green I para la detección de amplicones es un método bueno y fiable si los cebadores específicos están bien diseñados; pero de manera más importante, es probablemente la opción más económica en comparación con otras químicas, permitiendo de ese modo realizar un número superior de ensayos de qPCR para aplicaciones prácticas en estudios de campo.
En la qPCR en tiempo real, cada reacción está caracterizada por un número de ciclos específico, el ciclo umbral (CT), en el que puede detectarse un aumento estadísticamente significativo de la fluorescencia por encima del nivel inicial. El CT es inversamente proporcional al logaritmo de la concentración de la secuencia diana. Esto significa que cuanto más molde esté presente en una muestra de PCR menor es el número de ciclos de amplificación necesarios para alcanzar el punto en el que puede detectarse la fluorescencia por encima del nivel inicial (Lie, Y. S. et al. 1998. Curr. Opin. Biotechnol. 9:43-48). Los métodos de análisis de qPCR en tiempo real obtenidos comparando los valores de Cτ de las muestras de prueba con respecto a una curva patrón que se origina a partir de muestras de concentración conocida, se conocen comúnmente como cuantificación absoluta. Para la cuantificación absoluta, la exactitud de la cuantificación de muestras desconocidas depende por completo de la exactitud de los patrones. Por tanto, se requiere mucho cuidado para el diseño, la síntesis, la purificación y la calibración de patrones de ADN (Vaerman, J. L. et al. 2004. J. Biol. Regul. Homeost. Agents 18: 212-214). En el caso de microorganismos biotrofos obligados, tales como P. arborescens, pueden obtenerse muestras de ADN para obtener curvas patrón a partir de micelios y esporangios fragmentados a partir de hojas en esporulación (Hukkanen, A et al. 2006. Eur. J. Plant Pathol. 116:225-235; Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390). Además, más recientemente, se han construido curvas patrón absolutas a partir de plásmidos que contienen el ADN diana como un inserto clonado (Hukkanen, A et al. 2006. Eur. J. Plant Pathol. 116:225-235).
En la presente invención, se ha desarrollado un ensayo de qPCR en tiempo real económico, rápido, innovador y fiable para identificar y cuantificar ADN de P. arborescens en diferentes tejidos de adormidera. Asimismo, se han evaluado los efectos de diferentes tejidos vegetales huéspedes en la amplificación, reproducibilidad y sensibilidad de los ensayos, y en los límites de detección comparando la sensibilidad del protocolo de qPCR en tiempo real con los protocolos de PCR simple y anidada específicos para P. arborescens previamente desarrollados (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73- 81). Además se ha desarrollado una curva patrón basada en ADN extraído de un plásmido con el ADN diana como inserto clonado, y se ha establecido una relación numérica robusta con una curva patrón basada en ADN genómico de P. arborescens para facilitar su uso a una escala mayor y por laboratorios diferentes. De esta manera, se ha llegado a establecer un protocolo universal para cuantificar P. arborescens en tejidos de adormidera que: (i) no depende de la obtención de micelio de este biotrofo estrictamente obligado que va a aplicarse; (ii) es altamente reproducible y fácil de usar por técnicos diferentes en laboratorios diferentes; y (iii) la muestra de ADN inicial para obtener la curva patrón y la propia curva patrón pueden almacenarse y conservarse durante un periodo de tiempo prolongado sin perder la exactitud en la cuantificación. Finalmente, la robustez y eficiencia del ensayo recientemente desarrollado se han constatado cuantificando la cantidad de P. arborescens en muestras infectadas de manera natural de múltiples orígenes, incluyendo semillas de cápsulas asintomáticas y lotes de semillas comerciales, así como de plantas de adormidera asintomáticas infectadas sistémicamente por P. arborescens. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Peronospora arborescens es un hongo patógeno responsable, entre otras, de la enfermedad de Mildiu de la adormidera (Papaver somniferum). El desarrollo de un método de identificación y detección específico de dicho patógeno y además altamente reproducible, permite un diagnóstico temprano de la enfermedad útil en el control de la misma, evitando de este modo la distribución del patógeno a otras áreas de cultivo.
El protocolo de PCR específico de P. arborescens desarrollado en esta invención solventa los inconvenientes que presentan las técnicas actuales porque permite cuantificar la cantidad de patógeno en la muestra y además es altamente reproducible.
La invención se relaciona, por tanto, con un método para la cuantificación de Peronospora arborescens por PCR cuantitativa en una muestra biológica, que comprende:
(i) extracción del ADN contenido en dicha muestra biológica; y
(ii) amplificación del ADN extraído en la etapa (i) mediante PCR cuantitativa con los oligonucleótidos identificados por las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO :6. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de la pareja de oligonucleótidos SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6, en una reacción de amplificación por PCR cuantitativa para cuantificar la presencia de P. arborescens en una muestra biológica. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 describe los perfiles de amplificación por PCR en tiempo real generados a partir de la recogida ciclo por ciclo de ADN genómico de P. arborescens (10 ng/μl) diluido en serie [1 :1 (•), 1 :10 (O), l :102 (D), l :103(Δ), l :104(O) y l :105(V)] en agua estéril ultrapura (AEU) (Gw) (A) así como en un fondo fijo de ADN de Papaver somniferum (40 ng/μl) extraído de semillas sanas de adormidera (Gs) (C), y análisis de las curvas de fusión respectivas para Gw (B) y Gs (D), mostrados como la primera derivada negativa de las unidades de fluorescencia relativas -d(RFU)/dt representada frente a la temperatura. (H<) ADN desinfectado libre de patógeno o agua (Gw) de P. somniferum (Gs); (X) sin molde de ADN. La posición umbral para determinar el número de ciclos de PCR se fijó manualmente a 400. Cada serie de dilución se repitió dos veces (líneas continuas y discontinuas). La Figura 2 describe diagramas de cajas que muestran la reproducibilidad de los ensayos de qPCR usando los pares de cebadores P3Pa2fw/P3Pa2rv (conjunto P2), OMPaclfw/OMPaclrv (conjunto P3) y OMPac7fw/OMPac7rv (conjunto P6). Se representaron los ciclos umbral (CT) frente al logaritmo de las curvas patrón de ADN genómico de Peronospora arborescens (desde 10 ng hasta 100 fg) diluido en agua (gráficos GIw) o en ADN de Papaver somniferum (40 ng) extraído de semillas (gráficos Gis). Cada concentración de ADN en cada ADN de fondo se sometió a prueba para los tres conjuntos de cebadores en la misma placa por duplicado y el experimento se repitió dos veces. La Figura 3 muestra rectas de regresión patrón de (A) una dilución en serie de
10 veces de cinco puntos de ADN de Peronospora arborescens (1 ng/μl; serie G) o (B) una dilución en serie de 10 veces de seis puntos de ADN del plásmido EC3 P38ESJ (1 ng/μl; serie P) que contienen la región ITS del patógeno, diluido en agua estéril ultrapura (Gw y Pw), o en ADN de Papaver somniferum (40 ng) extraído de las hojas (GL y PL) O de las semillas (Gs y Ps)- Se representaron los ciclos umbral (CT) frente al logaritmo de las curvas patrón de ADN genómico de concentraciones conocidas. Los datos mostrados son de dos curvas patrón de ADN independientes y de dos técnicos independientes, y cada punto de datos representa la media de dos repeticiones de qPCR. La Figura 4 muestra la sensibilidad del método en electroforesis en gel de agarosa de cebadores OMPac7fw/OMPac7rv (conjunto P6) específicos de Peronospora arborescens en ensayos de PCR simple, cuantitativa y anidada usando ADN de P. arborescens (1 ng/μl; serie G) o ADN del plásmido EC3_P38ESJ (1 ng/μl; serie P) diluido en agua estéril ultrapura (Gw y Pw), o en ADN de Papaver somniferum (40 ng) extraído de las hojas (GL y PL) O de las semillas (Gs y Ps)- M, mezcla de marcadores de tamaño molecular de ADN Gene-ruler™ (Fermentas, St Leon-Rot, Alemania); serie de dilución de ADN 1 :1 (carril 1); 1 :1o1 (carril 2); l :102 (carril 3); l :103 (carril 4); l :104 (carril 5); l :105 (carril 6); agua (Gw), ADN libre de patógenos de P. somniferum (GL,S) O serie de dilución de ADN 1 : 106 (PW,L,S) (carril 7); sin molde de ADN (carril 8).
La Figura 5 muestra (A) las desviaciones estándar y (B) las rectas de regresión patrón de una dilución en serie de 10 veces de cinco puntos de ADN de Peronospora arborescens (1 ng/μl; serie G) o una dilución en serie de 10 veces de seis puntos de ADN del plásmido EC3 P38ESJ (1 ng/μl; serie P) que contienen la región ITS del patógeno, ambos diluidos en ADN de Papaver somniferum (40 ng) extraído de las hojas (GL y PL) O de las semillas (Gs y Ps)- Se representaron los ciclos umbral (CT) frente al logaritmo de las curvas patrón de ADN genómico de concentraciones conocidas. Los datos mostrados son a partir de cinco curvas patrón de ADN independientes y dos técnicos independientes, y cada punto de datos representa la media de dos repeticiones de qPCR.
La Figura 6 muestra la cuantificación de ADN de Peronospora arborescens en el tallo de plantas de Papaver somniferum infectadas asintomáticamente. (A) Rectas de regresión patrón de una dilución en serie de 10 veces de seis puntos de ADN de P. arborescens (1 ng/μl; serie GL) o una dilución en serie de 10 veces de siete puntos de
ADN del plásmido EC3 P38ESJ (1 ng/μl; serie PL) que contienen la región ITS del patógeno, ambos diluidos en ADN de P. somniferum (40 ng) extraído de las hojas y usado en los ensayos de qPCR. Los datos mostrados son la media de tres placas para
PCR independientes y de dos repeticiones de qPCR ± desviación estándar. (B)
Cantidades relativas de ADN de P. arborescens en ADN de P. somniferum (ppm) cuantificadas en cada planta individual. Los datos mostrados son la media de dos repeticiones de qPCR ± desviación estándar. (*) La escala para estas dos muestras de tallo está en el eje Y a la derecha.
La Figura 7 muestra la cuantificación de ADN de Peronospora arborescens en muestras de lotes de semillas comerciales de Papaver somniferum. A: Rectas de regresión patrón de una dilución en serie de 10 veces de seis puntos de ADN de P. arborescens (1 ng/μl; serie GL) O una dilución en serie de 10 veces de siete puntos de ADN del plásmido EC3 P38ESJ (1 ng/μl; serie PL) que contienen la región ITS del patógeno, ambos diluidos en ADN de P. somniferum extraído de las semillas y usado en los ensayos de qPCR. Los datos mostrados son la media de dos placas para PCR independientes y de dos repeticiones de qPCR ± desviación estándar. B, C, D: Cantidades relativas de ADN de P. arborescens en ADN de P. somniferum (%o) cuantificadas en cada muestra de semillas (300 mg). Los datos mostrados son la media de dos repeticiones de qPCR ± desviación estándar. (+), (±) y (-) indican amplificación positiva, débil o ausencia de la misma, respectivamente, tras ensayos de PCR simple o anidada usando las mismas muestras de ADN que las mostradas en Montes-Borrego et al. (2009). (*) Esta muestra estaba por debajo del límite de detección del ensayo de qPCR. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Peronospora arborescens es un oomiceto patógeno causante de la enfermedad denominada Mildiu de la adormidera {Papaver somniferum). El desarrollo de un método de identificación y detección específico de dicho patógeno permite un diagnóstico temprano de la enfermedad durante estados asintomáticos de la planta, con lo que se facilita el control eficiente de la misma, así como la certificación sanitaria de la semilla evitando de este modo la distribución del patógeno a zonas de cultivo donde no está presente. Además esta tecnología permite evaluar la resistencia o la tolerancia a P. arborescens en germoplasma de adormidera que haría posible la selección de cultivares de adormidera resistentes en programas de mejora genética vegetal
El método desarrollado en la presente invención está basado en la detección cuantitativa P. arborescens por PCR en tiempo real utilizando para dicha amplificación unos oligonucleótidos cebadores específicos para P. arborescens (SEQ ID NO: 5-6). Por tanto, la invención se relaciona con un método, en adelante, método de la invención, para la cuantificación de Peronospora arborescens por PCR cuantitativa en una muestra biológica, que comprende:
(i) extracción del ADN contenido en dicha muestra biológica; y
(ii) amplificación del ADN extraído en la etapa (i) mediante PCR cuantitativa con los oligonucleótidos identificados por las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO :6.
La extracción del ADN en la etapa (i) del método de la invención puede realizarse mediante protocolos convencionales conocidos por el experto en la materia, o empleando kits comerciales, por ejemplo, el kit G-Spin Hp (Intron Biotechnology, Corea) o el Fast Prep System Bio 101 (Qbiogene, Madrid, España), tal como se muestra en el Ejemplo 1 que acompaña la presente invención.
El método de la invención comprende en la etapa (ii), una reacción de amplificación del ADN extraído en la etapa (i) anteriormente citada por PCR cuantitativa, empleando unos oligonucleótidos especialmente diseñados para amplificar específicamente fragmentos de las regiones espaciadores internas del ADN ribosómico de P. arborescens. Las condiciones particulares empleadas en la reacción de amplificación para la pareja de oligonucleótidos cebadores, denominada en la presente invención P6 (SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:6), se describen en el Ejemplo 1.
Para llevar a cabo las amplificaciones por PCR en tiempo real se puede utilizar la mezcla de reacción iQ SYBR Green Supermix (BioRad, Madrid, España) y el aparato iCycler IQ (BioRad), tal como se pone de manifiesto en el Ejemplo 1. Los oligonucleótidos cebadores óptimos utilizados en la amplificación son la pareja
OMPac7fw/ OMPac7rv (SEQ ID NO:5 y 6, respectivamente).
P. arborescens es un oomiceto fitopatógeno que puede infectar cualquier parte y órgano de sus plantas huésped. Por tanto, en una realización particular del método de la invención, la muestra biológica es una muestra de material vegetal, o una muestra de una estructura de P. arborescens.
A modo ilustrativo, no limitativo, dicha muestra de material vegetal incluye tejidos de semillas, cubiertas de semillas, hojas, tallos, cápsulas, raíces, etc., y mezclas de las mismas.
Resulta importante destacar que el método de la invención permite detectar y cuantificar la presencia de P. arborescens en semillas o tejidos procedentes de semillas (como las cubiertas de éstas, pericarpio y endocarpio). Esto es de suma importancia, pues de este modo se puede detectar y evitar la transmisión de P. arborescens a través de las semillas, las cuales se ha demostrado que pueden dar lugar a plantas adultas infectadas.
En una realización particular, dicha muestra biológica está infectada por P. arborescens.
A modo ilustrativo, no limitativo, las estructuras del oomiceto incluyen estructuras somáticas, como el micelio, y estructuras reproductoras, tales como los esporangio foros, los esporangios, y las oosporas.
En una realización particular, la muestra biológica es una muestra de estructuras de P. arborescens, que contiene micelio, esporangios, esporangióforos u oosporas.
El término "micelio" se refiere al conjunto de filamentos provistos de pared celular que forma el oomiceto. Cada filamento del mismo se denomina hifa.
El término "esporangióforo" se refiere a la estructura filamentosa y arborescente del oomiceto sobre cuyos extremos distales se forman los esporangios, una estructura globosa con una membrana peridial simple que contiene numerosas "esporangiosporas".
El término "esporangiosporas" se refiere a la espora producida y contenida en un esporangio.
El término "oospora" se refiere a esporas que resultan de la reproducción sexual del oomiceto mediada por heterogametangios (reproducción oógama) capaces de permanecer viables en los restos de los tejidos vegetales en que se forman y en el suelo durante un largo periodo de tiempo.
En otra realización todavía más particular, la muestra biológica procede de P. somniferum. Dicha planta, puede encontrarse en un estado asintomático, es decir, sin síntomas ni signos distintivos que permitan saber si la planta ha sido infectada por P. arborescens, o en un estado sintomático, es decir, la planta presenta los síntomas propios de la infección del patógeno como son, entre otros, enanismo, desarrollo de áreas cloróticas en el limbo foliar, deformaciones del limbo foliar y agregación de las hojas infectadas formando rosetas.
El método de la invención para cuantificar Peronospora arborescens presenta, entre otras, las siguientes ventajas:
(i) es posible obtener datos cuantitativos muy fiables, incluso con ADN del huésped. (ii) una considerable flexibilidad, puesto que puede aplicarse a diferentes muestras vegetales incluyendo cápsulas, hojas, raíces, semillas y tallos;
(iii) alta especificidad, puesto que no se produce amplificación cruzada con otros patógenos estrechamente relacionados, especialmente con tejidos de adormidera infectados por P. cristata.
(iv) alta reproducibilidad, al utilizarse los oligonucleótidos cebadores del conjunto P6 (SEQ ID NO:5 y 6), incluso en presencia de ADN de huésped.
Como se ha mencionado anteriormente, el método de la invención se basa en la cuantificación de Peronospora arborescens por PCR cuantitativa en una muestra biológica utilizando unos oligonucleótidos que amplifican de forma específica P. arborescens.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una pareja de oligonucleótidos identificados por las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 en la reacción de amplificación por PCR cuantitativa con el fin de cuantificar la presencia de P. arborescens en una muestra biológica. Dichos oligonucleótidos hibridan con las regiones espaciadoras transcritas internas del ADN ribosómico de P. arborescens .
El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado como limitativo del alcance de la misma.
EJEMPLO 1
Cuantificación de Peronospora arborescens en plantas de adormidera (Papaver somniferum) MATERIALES Y MÉTODOS
1. Material vegetal
Se utilizaron semillas de adormidera comercial cv. Nigrum proporcionadas por Alcaliber S.A. en todo el estudio. Se sometieron a ensayo las semillas para determinar que estaban sanas mediante amplificación negativa de P. arborescens usando un protocolo de PCR anidada específico de esta especie (Montes-Borrego, M. et al. 2008; Plant Dis. 92:834). La superficie de las semillas se desinfestó sumergiendo éstas en NaOCl al 1% durante 5 min., y después las semillas se enjuagaron dos veces con agua estéril ultrapura (AEU), se secaron en una campana de flujo y se almacenaron en condiciones estériles hasta su uso para los experimentos. Se cultivaron plántulas para obtener tejidos foliares maduros a partir de semillas germinadas en capas estériles de papel de filtro humedecido con 2 mi de solución de Hoagland al 50% estéril (Hoagland, D. R., and D. I. Arnon. 1950; Calif. Agrie. Exp. Stn. Circ. No. 347) en placas Petri de 9 cm de diámetro a 2O0C durante una semana. Después se trasplantaron las plántulas en una mezcla de suelos (franco arcilloso/turba, 2:1, vol/vol) pasteurizada (7O0C, 60 min.) en macetas y se incubaron en una cámara de cultivo (Sanyo MLR-350 H, Sanyo Electric Co., Ltd. Japón) a 2O0C y humedad relativa (HR) del 70/90% y un fotoperiodo de 12 h de luz fluorescente a 360 μE-rn^-s"1.
2. Material de Peronospora arborescens
Se obtuvieron muestras de P. arborescens a partir de hojas frescas con esporulación de plantas usadas para experimentos de inoculación artificial en la cámara de cultivo (M. Montes-Borrego et al, resultados no publicados), y a partir de hojas de plantas de adormidera infectadas de manera natural en cultivos comerciales en las granjas
"Ruidero" y "Casilla San José", Écija, provincia de Sevilla, España.
3. Construcción de plásmidos control.
Se amplificaron las regiones ITS y 5.8S de ADNr de dos muestras diferentes de P. arborescens (P38ESJ y M2ERUI, Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380- 1390) de nuestra colección de cultivos usando pares de cebadores DC6/ITS4 y ITS5/ITS4. Se purificaron los amplicones y se ligaron en el Sistema I de vector pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, EE.UU.) usando la cepa JM 109 de Escherichia coli para su transformación, tal como se describió anteriormente (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390). Se confirmó la clonación correcta secuenciando los insertos clonados (dos de cada producto de PCR) en ambas direcciones usando un kit de reacción rápida de secuenciación del ciclo de terminación (BigDye, Perkin-Elmer Applied Biosystems, Madrid, España) y los cebadores DC6, ITS4 y ITS5, y cebadores universales M13-20fw M13rev. Los productos resultantes se purificaron y se hicieron pasar por un secuenciador multicapilar de ADN (ABI Prism 3100 genetic analyzer, Applied Biosystems) en las instalaciones de secuenciación de la Universidad de Córdoba. Se almacenaron los clones transformados en glicerol (al 20%) a -8O0C y se cultivaron cuando fue necesario.
4. Extracción y cuantifícación de ADN
Se extrajo ADN genómico de P. arborescens y de semillas y hojas de adormidera usando el kit de extracción de ADN genómico de plantas 'G-Spin™ Hp' (Intron Biotechnology, Corea) y el Fast Prep System Bio 101 (Qbiogene, Madrid, España) según Landa et al. (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390).
Se extrajo ADN de plásmido de cultivos de la cepa JM 109 de E. coli cultivada durante la noche a 370C en caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) (10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 1 litro de H2O [pH 7,2]) complementado con ampicilina (100 μg/ml) usando el kit de plásmidos QuickGene (Fujifilm Corporation, Tokyo, Japón) y el dispositivo QuickGene-Mini80 (Fujifilm Corporation, Tokyo, Japón) según las instrucciones del fabricante.
Se evaluó la calidad del ADN mediante electro foresis en gel y tinción con bromuro de etidio. Se cuantificaron de manera exacta todas las muestras de ADN usando el ensayo fluorométrico de amplio espectro del kit de ensayo de ADN Quant-iT (Molecular Probes Inc., Leiden, Países Bajos) y un fluoroespectrómetro Tecan Safire (Tecan España, Barcelona, España) (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390). Se tuvo especial cuidado en tomar concentraciones exactas de los ADN de plásmido, patógeno y huésped cuantificando cada muestra de ADN por triplicado, en dos microplacas independientes. Para tener un control interno de cuantificación de ADN se incluyeron muestras de ADN de adormidera y P. arborescens de concentración conocida en cada placa de cuantificación. Se diluyeron el ADN genómico y de plásmido con AEU en caso apropiado.
5. Curvas patrón de ADN
Se obtuvieron curvas patrón de ADN a partir de diluciones de 10 veces de ADN genómico de P. arborescens (serie G) o de ADN de plásmido (serie P). Para este fin se diluyó en serie ADN genómico de P. arborescens (1 ng/μl) o ADN de plásmido (1 ng/μl; equivalente a 2,33 x 108 copias/μl) [1 :1, 1 :10, l :102, l :103, l :104, l :105 yl :106 (sólo para la serie P)] en AEU (Curvas Gw y Pw) así como en un fondo fijado de ADN de P. somniferum (40 ng/μl) extraído de las hojas (Curvas GL y PL) y de las semillas (Curvas Gs y Ps) de adormidera sana. Cada curva patrón siempre incluía ADN de P. somniferum y/o ningún ADN como controles negativos. Se obtuvieron diez curvas patrón de ADN independientes (cinco para la serie G, denominada G 1-5, y cinco para la serie P, denominada P 1-5) usando diferentes fuentes de ADN de planta y patógeno (Tabla 1), es decir: hojas de adormidera de diferente edad (hojas maduras y cotiledones), hojas y semillas de diferente origen, esporangios de P. arborescens de hojas con esporulación en el campo o cámara de cultivo, diferentes cultivos de plásmido, etc. Finalmente, tras construir las curvas patrón de ADN Gl-5w y Pl-5w se cuantificó por triplicado cada punto de dilución usando el kit de ensayo de ADN de alta sensibilidad Quant-iT fluorométrico (Molecular Probes Inc.), suponiendo el mismo ADN del patógeno en las curvas patrón de ADN G1-5L G1-5S y P1-5L y P1-5S.
6. Optimización, reproducibilidad y sensibilidad del protocolo de qPCR en tiempo real
Todas las amplificaciones por PCR en tiempo real se realizaron utilizando una mezcla de reacción iQ SYBR Green Supermix (BioRad, Madrid, España) y el aparato iCycler IQ (BioRad). En las fases iniciales de optimización del ensayo de PCR en tiempo real, se evaluaron las condiciones de ciclado y los pares de cebadores P3Pa2fw (SEQ ID NO: 1) /P3Pa2rv (SEQ ID NO: 2) (conjunto P2), OMPaclfw (SEQ ID NO: 3)/OMPaclrv (SEQ ID NO: 4) (conjunto P3) y OMPac7fw (SEQ ID NO: 5)/OMPac7rv (SEQ ID NO: 6) (conjunto P6) usando curvas patrón de ADN G Iw-G Is. Estos pares de cebadores se habían diseñado para amplificar específicamente un fragmento de la región ITS de P. arborescens desarrollada por Landa et al. (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390). Para este experimento se incluyó una concentración inicial de 10 ng, pero no la concentración de patógeno más baja de 100 fg. Se ajustaron experimentalmente las condiciones de reacción, tales como el volumen de reacción, la temperatura de hibridación, la concentración del cebador y la temperatura para medir la señal de fluorescencia del amplicón, para optimizar el protocolo de qPCR en tiempo real. Tras el ciclo de amplificación final se obtuvo un perfil de temperatura de la curva de fusión calentando hasta 950C, enfriando hasta 720C y calentando lentamente hasta 950C a 0,50C cada 1O s con medición continua de la fluorescencia a 520 nm. Se analizaron todas las reacciones mediante electroforesis en gel para confirmar que sólo se amplificó un producto de PCR en las muestras con ADN genómico de P. arborescens y no se obtuvo ningún producto de amplificación en los controles negativos.
Para investigar cualquier posible influencia del ADN del huésped en la exactitud de la amplificación y en la cuantificación del ADN diana (genómico o de plásmido), se usaron dos curvas patrón de ADN G1W,L,S-G2W,L,S y P1W,L,S-P2W,L,S y el par de cebadores OMPac7fw/OMPac7rv (conjunto P6). Se realizaron independientemente las reacciones en tiempo real para cada curva patrón de ADN. Todos los fondos de ADN se realizaron en la misma placa para PCR de 96 pocilios, replicándose cada combinación experimental dos veces y en dos experimentos diferentes (diferentes placas para PCR y técnicos diferentes).
Para evaluar adicionalmente la robustez y la eficacia del protocolo de qPCR recientemente desarrollado, se evaluaron las cinco series de curvas patrón de ADN obtenidas con ADN genómico de P. arborescens (G1-5L y Gl-5s, ADN de fondo de las hojas y de las semillas, respectivamente) y/o ADN del plásmido seleccionado EC3_P38ESJ (P1-5L y P1-5S, ADN de fondo de las hojas y de las semillas, respectivamente) en series de dos en dos (G1L,S-P1L,S, G2L,S-P2L,S, G3L,S-P3L,S, G4L,S- P4L,S y G5L,S-P5L,S) en la misma placa para PCR. Las amplificaciones por PCR cuantitativa de cada serie de curvas patrón de ADN incluían dos repeticiones por placa y se repitieron dos veces en experimentos independientes (placas para PCR y técnicos).
Se determinó la reproducibilidad del ensayo de qPCR en tiempo real comparando parámetros y resultados de CT (ordenada en el origen y pendientes) de las rectas de regresión patrón obtenidas con curvas patrón de ADN G1-5L,S y P1-5L,S que se obtuvieron en experimentos independientes y por diferentes personas (véase el análisis de datos a continuación). Estas curvas patrón se dedujeron de muestras de ADN obtenidas a partir de hojas de adormidera de diferente edad, y de hojas y semillas de origen diferente, después de hasta 10 ciclos de congelación (-20°C)/descongelación.
Además, para determinar la sensibilidad del protocolo de qPCR en tiempo real utilizando el conjunto de cebadores P6, se usaron dos series de curvas patrón de ADN (G1-2W,S,L y P 1-2 W,S,L) para comparar el nuevo protocolo de qPCR en tiempo real específico de especie con los protocolos de PCR simple y anidada desarrollados previamente para la detección in planta de P. arborescens (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390). 7. Análisis de semillas y plantas de adormidera infectadas por Peronospora arborescens mediante qPCR en tiempo real
Para validar la utilidad de la técnica de qPCR en tiempo real para caracterizar la resistencia o la tolerancia a P. arborescens en germoplasma de adormidera, se utilizaron 50 plantas de adormidera de un estudio anterior (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81) que estaban infectadas sistémicamente por P. arborescens (tal como se determinó mediante el ensayo de detección de PCR anidada) pero que no mostraban ningún síntoma de enfermedad. Esas plantas se cultivaron en condiciones controladas en un suelo infestado de manera natural por P. arborescens, y se tomaron muestras cuando habían formado una cápsula en el tallo principal. Se extrajo ADN de un trozo de 4 a 5 cm de longitud del tallo basal de cada planta, tal como se describió anteriormente (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81) y se usó para detectar y cuantificar el nivel de infección por P. arborescens . En estos ensayos de qPCR en tiempo real se usaron curvas patrón de ADN G4L y P4L y se incluyeron en cada una de las tres placas independientes, con dos repeticiones por cada muestra de ADN.
Para validar la utilidad del protocolo de qPCR en tiempo real para cuantificar el inoculo de P. arborescens en semillas, se usaron muestras de ADN de un estudio anterior (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81) obtenidas de 11 lotes de semillas comerciales (tres repeticiones/lote de semillas) proporcionadas por ALCALIBER S. A. Dicha compañía seleccionó los lotes de semillas para siembras comerciales de campos comerciales del año anterior en los que no se observaron ataques de Mildiu o bien el ataque de la enfermedad se consideró bajo (de O a I planta afectada por m2; Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). Además, se extrajo ADN tal como se describió anteriormente (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390) a partir de semillas obtenidas de cápsulas de 30 plantas de adormidera elegidas aleatoriamente cultivadas en un campo con un incidencia de enfermedad de aproximadamente el 5%. De las 30 cápsulas, 19 mostraban síntomas de Mildiu de diferente severidad y 11 no tenían síntomas. En estos ensayos de qPCR en tiempo real, se usaron curvas patrón de ADN G4s y P4s y se incluyeron en cada una de las dos placas independientes, con dos repeticiones por cada muestra de ADN.
Se diluyó 1/2 o 1/5 veces ADN de semilla o planta de adormidera en AEU para obtener una concentración de ADN en un intervalo similar al usado en la curva patrón de ADN. Después se cuantificaron muestras de ADN de manera exacta, por triplicado, usando el ensayo fluorométrico de amplio espectro del kit de ensayo de ADN Quant-iT, tal como se describió anteriormente y se usaron para normalizar ADN de P. arborescens con respecto al ADN de planta total presente en cada reacción. Se compararon los resultados de qPCR de muestras desconocidas (semillas y tallos) con los obtenidos anteriormente con los ensayos de PCR simple y anidada usando el conjunto de cebadores P6 (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). Finalmente, se estimó la cantidad de ADN del patógeno en muestras desconocidas a partir de las rectas de regresión de la serie G universales, una vez que se comprobó que las rectas de regresión patrón P4s no diferían estadísticamente (P > 0,05) de las rectas de regresión de la serie P universales (véase a continuación).
8. Análisis de datos
Se calcularon en primer lugar los valores de ciclo umbral (CT) para cada reacción determinando el número de ciclos de PCR en el que la señal de fluorescencia supera el fondo usando los criterios de estimación por defecto en el software iCycler IQ versión 3.0a (Bio-Rad). Posteriormente, con el fin de comparar y establecer relaciones entre diferentes curvas patrón de ADN generadas a partir de diferentes tratamientos, se definió manualmente la posición umbral y se fijo a la misma posición para todos los tratamientos y experimentos para comparar de manera apropiada todas las curvas patrón (Vaerman, J. L. et al. 2004; J. Biol. Regul. Homeost. Agents 18: 212-214). Se calculó la eficacia de la amplificación (EA), a partir de las pendientes de las curvas patrón usando la ecuación EA = io(1/peildieirte) - 1 (Adams, P. S. 2006. Data analysis and reporting, p. 39- 62. In: M. Tevfik Dorak (ed.), Real-Time PCR. Taylor & Francis, New York).
Se realizaron regresiones lineales del logaritmo natural de concentraciones conocidas del ADN diana frente a los valores de CT para cada curva patrón de ADN usando Statistix 8.0 (Analytical Software, Tallahassee, EE.UU.). Se usaron las rectas de regresión patrón de cada placa elegida como curvas de referencia para transformar los valores de CT experimentales en cantidades de ADN del patógeno (nanogramos). Se determinaron las diferencias estadísticas en CT, y la eficacia de la amplificación (EA) entre las rectas de regresión patrón obtenidas para las curvas G y las curvas P en diferentes fondos mediante el análisis de la varianza (ANOVA) univariable. Además, se compararon estadísticamente todas las rectas de regresión patrón obtenidas para ADN genómico de P. arborescesns (curvas G) y ADN plasmídico (curvas P) en diferentes fondos (W, L, y S) para determinar la homogeneidad (P > 0,05) de la varianza (prueba de Bartlett) y para determinar la igualdad de las pendientes y ordenadas en el origen usando una prueba F a P < 0,05. RESULTADOS
1. Optimización de qPCR en tiempo real
La optimización de qPCR en tiempo real implicaba el ajuste fino paso a paso de los siguientes parámetros de PCR: selección del conjunto de cebadores (P2 frente a P3 frente a P6), concentración de cebadores, temperatura de hibridación y volumen final de las reacciones de PCR. Ésto se realizó usando curvas patrón de ADN (GIw y Gis) en dos experimentos independientes para cada conjunto de cebadores.
La reducción del volumen de reacción patrón desde 50 hasta 20 μl no tuvo efecto sobre la exactitud del ensayo (datos no mostrados). En consecuencia, se eligió un volumen final de 20 μl para minimizar el coste por ensayo de qPCR en tiempo real. Ocasionalmente, en el análisis de la curva de fusión se observó que se producían picos débiles entre 60-750C, tal como se muestra en la Figura IB, D. Teóricamente, estos picos se suelen notificar como productos no específicos o dímeros de cebadores. En los presentes ensayos no se detectaron estas amplificaciones no específicas mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,2 % (p/vol) (datos no mostrados). Para evitar la medición de esta señal de fluorescencia emitida por estas amplificaciones no específicas, se detectó la fluorescencia del amplicón diana [temperatura de fusión (Tm) = 86,50C] a 830C (Weng, T. et al, 2005. Anal. Biochem. 342:167-169). No se produjo fluorescencia del amplicón diana para los controles negativos usando cualquiera de los tres conjuntos de cebadores a 830C; pero ocasionalmente, los controles negativos mostraron también picos débiles entre 60-800C, tal como se muestra en la Figura 1B,D.
La mezcla de reacción de PCR optimizada era similar para cada uno de los conjuntos de cebadores y contenía (volumen final de 20 μl): 1 μl de muestra de ADN, lχ iQ SYBR Green Supermix (BioRad) y 0,3 μM de cada cebador. Las condiciones de ciclado térmico consistían en una desnaturalización inicial a 950C durante 2 min. seguido de 35 ciclos de 1 min. a 950C, 1 min. a 630C, 2 min. a 720C y 830C durante 15 s. Se añadió una etapa de extensión final a 720C durante 10 min. Se detectó la fluorescencia del amplicón diana a 830C. Se fijó una posición umbral de 400 para todos los experimentos para determinar los valores de CT.
Tras la optimización de los ensayos de qPCR en tiempo real, se generaron rectas de regresión patrón para cada conjunto de cebadores usando un intervalo de ADN de desde 10 ng hasta 100 fg. La reproducibilidad más alta de amplificaciones se obtuvo con el conjunto de cebadores P6 (Figura 1A,C), para el que se constató una eficacia elevada por encima de seis órdenes de magnitud de la concentración de ADN mostrando un intervalo dinámico lineal de amplificación. Además, no se produjeron diferencias significativas (P > 0,05) para valores de CT con el conjunto de cebadores P6 para ambos fondos de ADN (GIw y Gis) y experimentos independientes; mientras que se encontraron diferencias significativas (P < 0,0019) en valores de CT para los conjuntos de cebadores 2 y 3 entre experimentos independientes al menos en una de las curvas de ADN GIw y Gis. Las rectas de regresión patrón obtenidas para el conjunto de cebadores P6 mostraron amplificaciones muy reproducibles, mejores eficacias y valores de coeficiente de determinación superiores (EA = 90,6-100,3%; R2 = 0,990-0,992) en comparación con los conjuntos de cebadores P2 (EA = 92,2-112,3%; R2 =0,778-0,955) y P3 (EA = 83,3-107,8%; R2 =0,979-0,980) (Figura 2). En consecuencia, se seleccionó el conjunto de cebadores P6 para los experimentos posteriores. 2. Reproducibilidad, eficacia y sensibilidad de PCR cuantitativa en tiempo real
El ANOVA univariable de valores de CT derivados de curvas patrón de ADN G1W,L,S-G2W,L,S indicó la homogeneidad de varianzas (P > 0,05) así como que ni el origen de la muestra de ADN (serie de ADN Gl frente a G2) (P = 0,9330) ni el técnico (P = 0,8898) o el ADN de fondo (W, L y S) (P = 0,8831) influían significativamente en los resultados de qPCR en tiempo real. En consecuencia, se combinaron las cuatros series de datos de la qPCR en tiempo real obtenidas en ensayos independientes para análisis adicionales (Tabla 2). La eficacia y la reproducibilidad de los ensayos de qPCR en tiempo real de curvas patrón de ADN de la serie G y de la serie P se vieron afectadas positivamente por la presencia de la fuente de ADN del huésped (es decir, tejidos de las hojas y de las semillas). Por tanto, para la serie G, la exactitud y la EA de los ensayos de PCR en tiempo real fueron superiores (0,2<DE<0,6; R2 > 0,993; EA = 93,0-93,1%) cuando el ADN de P. arborescens estaba diluido en ADN de las hojas (GL) O de las semillas (Gs) en comparación con cuando el ADN estaba diluido en agua (Gw) (0,5<DE<0,8; R2 = 0,978; EA = 90,5%) (Tabla 2; Figura 3A). Las comparaciones estadísticas indicaron que las rectas de regresión patrón de las tres curvas diferían significativamente en la ordenada en el origen (P < 0,0001) pero no en las pendientes (P = 0,7664). De hecho, la ordenada en el origen de la recta de regresión patrón Gw era significativamente superior que la de las rectas de regresión patrón GL y Gs, lo que indica una sensibilidad inferior con respecto a la anterior. Por tanto, no se cuantificó de manera exacta el ADN de P. arborescens a concentraciones inferiores a 1 pg si estaba diluido en agua (serie Gw) y se perdió el intervalo dinámico lineal de amplificación a esta concentración de patógeno. Por el contrario, pudo cuantificarse ADN de P. arborescens hasta 0,1 pg cuando estaba diluido en ADN de las semillas o de las hojas del huésped, y las desviaciones estándar de la repetición no aumentaron para las curvas GL y Gs a una concentración inferior de este tipo (Tabla 2; Figura 3A).
Tal como se encuentra para la serie G, las rectas de regresión patrón Pw mostraron EA y reproducibilidad de amplificaciones inferiores (0,3<DE<l,9; R2 > 0,964; EA > 96,1%) en comparación con la curvas PL y Ps (0,2<DE<0,5; R2 > 0,990; EA = 109,1- 110,2%). Además, en consecuencia no pudo cuantificarse el ADN diana en algunas repeticiones a la concentración más alta de 10 ng debido a la inhibición de la reacción de amplificación. La comparación de rectas de regresión patrón indicó que tanto la pendiente como la ordenada en el origen de la recta de regresión patrón Pw diferían significativamente (P < 0,001) de las de las rectas de regresión PL y Ps- No se produjeron diferencias significativas (P > 0,05) entre las rectas de regresión PL y Ps (Tabla 2; Figura 3B). Puesto que el uso de fondo de ADN del huésped proporcionó resultados sumamente reproducibles y los valores de eficacia de la amplificación estaban dentro de los valores ideales para los ensayos de qPCR en tiempo real, elegimos usar curvas patrón de ADN GL, GS, PL y Ps para los experimentos posteriores.
Se determinó la sensibilidad del protocolo de qPCR en tiempo real usando un conjunto de cebadores P6 para dos series de curvas patrón de ADN (G1-2W,S,L y Pl-2 W,S,L) y se compararon los resultados con los obtenidos mediante electroforesis en gel usando los protocolos de PCR simple y anidada desarrollados anteriormente (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390; Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). Cuando se usaron las curvas G1-2W,S,L, los límites de detección de PCR para los ensayos de PCR simple y anidada fueron similares a los notificados anteriormente (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390; Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81); amplificando la PCR anidada hasta la cantidad más baja de ADN del patógeno sometido a ensayo de 0,01 pg (Figura 4, Tabla 2). El límite de detección del ensayo de qPCR en tiempo real usando ADN de P. arborescens diluido en AEU (serie Gw) fue mayor que cuando se usó ADN de las hojas (serie GL) O ADN de las semillas (serie Gs) del huésped. Por tanto, había una tendencia de aumento de la sensibilidad y de la detección cuando estaba presente el ADN del huésped en la reacción de amplificación (Figura 4, Tabla 2), tal como se mostró anteriormente para los protocolos de PCR simple y anidada (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390; Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). El límite de detección de qPCR en tiempo real fue de 0,10 pg de ADN de P. arborescens para G1-2W y de 0,01 pg para las curvas Gl-2SiL, tal como se determinó mediante la señal de fluorescencia del amplicón, pero la banda de ADN amplificado apenas podía discernirse mediante electroforesis en gel a las concentraciones de ADN del patógeno (Figura 4, Tabla 2). El uso del protocolo de detección de qPCR en tiempo real con curvas patrón de ADN construidas de manera independientemente o mediante diferentes técnicos no influyó en la reproducibilidad ni en la coherencia de los resultados (Tabla 2). Cuando se usaron las curvas P1-2W,S,L de ADN de plásmido, el límite de detección para el ensayo de qPCR en tiempo real aumentó en dos (serie Pw) o en tres (serie PL,s) órdenes de magnitud en comparación con los obtenidos con sus respectivas curvas de ADN de la serie G. En todos los casos, pudo cuantificarse de manera exacta hasta 0,001 pg de ADN de plásmido (aproximadamente 233 copias de inserto) aunque la serie Pw mostró resultados menos reproducibles (DE > 1,9) (Tabla 2).
3. Desarrollo de un modelo universal para cuantiΩcar ADN de P. arborescens en tejidos vegetales
El protocolo de qPCR en tiempo real recientemente desarrollado es sumamente reproducible y preciso tal como se indica por el ANOVA univariable de valores de CT derivados de 10 experimentos independientes para cada una de las series G o P [cinco curvas patrón de ADN independientes (Tabla 1) cada una procesada dos veces por técnicos independientes]. Por tanto, había homogeneidad de las varianzas (P > 0,05) y ni el origen de la muestra de ADN (P = 0,9990 y P = 0,9724 para las series G o P, respectivamente) ni el técnico (P = 0,9759 y P = 0,9467 para las series G o P, respectivamente) o el ADN de fondo (L y S) (P = 0,7934 y P = 0,8558 para las series G o P, respectivamente) influyeron significativamente en los resultados de los ensayos de qPCR en tiempo real. Todas las rectas de regresión patrón mostraron alta eficacia y reproducibilidad de amplificaciones, oscilando los valores de EA desde el 89,6 hasta el 99,6% para la serie G, y desde el 95,7 hasta el 111,1% para la serie P, y las desviaciones estándar de los CT fueron inferiores a 0,5 en casi todos los casos (Figura 5A). Además, la comparación de las 10 rectas de regresión patrón para cada una de G o P no mostró diferencias significativas entre las pendientes (P = 0,3243 y P = 0,1962 para la serie G y la serie P, respectivamente) y las ordenadas en el origen (P = 0,0998 y P = 0,3366 para la serie G y la serie P, respectivamente) de las rectas de regresión. En consecuencia, para obtener un modelo de regresión robusto y universal se combinaron las 10 series de datos de la qPCR en tiempo real obtenidas independientemente para cada serie de ADN G o P y se usaron para ajustar un modelo de regresión simple para cada una de las series G o P (Figura 5B), es decir, el modelo de regresión patrón de G y el modelo de regresión patrón de P, respectivamente. Con este modelo de ecuación de regresión pueden validarse los datos de cada experimento o placa usando sólo la curva patrón de ADN de la serie P. Por tanto, puede determinarse estadísticamente ahora si las pendientes y las ordenadas en el origen de la recta de regresión patrón de P para cada experimento no difieren estadísticamente (P≥ 0,05) de las del modelo de ecuación de regresión patrón de P, y entonces se supone que lo mismo se produciría para una supuesta recta de regresión patrón de G frente al modelo de ecuación de regresión patrón de G. Para validar esto hemos incluido además una curva patrón de ADN de la serie G en cada experimento y hemos comparado las dos rectas de regresión. Entonces pueden estimarse las concentraciones logarítmicas de ADNG sustituyendo directamente los valores de CT en el modelo de ecuación de regresión patrón de G (véase a continuación).
4. Validación del modelo de regresión y cuantiΩcación de ADN de P.
arborescens en tejidos vegetales
No hubo diferencias significativas (P > 0,405) entre las pendientes y las ordenadas en el origen de las rectas de regresión G4L, G4S y P4L, P4S para las placas para PCR independientes usadas para la cuantificación del ADN de P. arborescens en tejidos vegetales en cada uno de los diferentes experimentos realizados. En consecuencia, se reunieron los datos de la qPCR en tiempo real obtenidos en placas independientes y se adaptaron las rectas de regresión individuales para las series G4L, G4s y P4L, P4s dentro de cada experimento (Figura 6A, Figura 7A). La comparación de las rectas de regresión P4L y P4s frente al modelo de ecuación de regresión de serie P universal indicó que no hubo diferencias significativas entre las pendientes (P > 0,2061) y las ordenadas en el origen (P > 0,1035). Por tanto, se podía lanzar la hipótesis de que se habrían obtenido resultados similares para las rectas de regresión G4L y G4s frente al modelo de ecuación de regresión de serie G universal si no estuviera disponible ADN genómico de P. arborescens para construir una curva patrón de ADN de serie G. Esto se demostró adicionalmente por la falta de diferencias significativas entre las pendientes (P > 0,0905) y las ordenadas en el origen (P > 0,0771) cuando se compararon estadísticamente las rectas de regresión G4L y G4s con el modelo de ecuación de regresión de serie G universal. Por tanto, ahora está validada la utilidad de usar los modelos de ecuación de regresión de serie P y serie G universales para cuantificar el ADN de P. arborescens en tejidos vegetales, y pueden estimarse las concentraciones logarítmicas de ADNG, sustituyendo directamente los valores de CT en el modelo de ecuación de regresión patrón de G una vez que se ha validado el experimento con una curva patrón de ADN de serie P y su correspondiente modelo de regresión.
El uso del protocolo de qPCR en tiempo real permitió la detección de ADN de P. arborescens en el 68,2% de las muestras de tallo de 22 plantas de adormidera asintomáticas que se demostraron infectadas sistémicamente con P. arborescens mediante ensayos de PCR anidada en un trabajo anterior (Figura 6; Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). El patógeno no pudo cuantificarse con el ensayo de qPCR en tiempo real en aquellas muestras de tallos que mostraron una amplificación débil en el ensayo de PCR anidada (datos no mostrados). La cantidad de ADN de P. arborescens en las muestras de ADN del tallo de plantas asintomáticas fue muy variable, oscilando desde 0,110 ppm hasta 5.557 ppm (5,6%o) (Figura 6B).
El uso del protocolo de qPCR en tiempo real permitió la detección de ADN de P. arborescens en el 100% de los lotes de semillas comerciales y en el 97,0% de las muestras de semillas analizadas, y cuantificar una biomasa de patógeno de tan solo 1 ,2 pg de ADN diana por microgramo de ADN de semilla (Figura 7B), que corresponde al 0,0013%o de P. arborescens en el ADN de P. somniferum. El nivel de detección del patógeno en las muestras de semillas mediante ensayos de qPCR en tiempo real se correlacionó con el encontrado en los ensayos de detección anteriores de aquellas muestras de semillas usando ensayos de PCR simple o anidada (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). La cantidad de ADN de P. arborescens osciló desde el 0,074 hasta el 0,0013%o (Figura 7B), del 0,0004 al 0,09 l%o (Figura 7C) y del 0,05 al l,275%o (Figura 7D) en las muestras de semillas que produjeron respectivamente amplificaciones nulas, débiles, o positivas, en el ensayo de PCR simple; y amplificaciones débiles, positivas o positivas, en los ensayos de PCR anidada, respectivamente. En los lotes de semillas altamente infestados (por ejemplo, número 923, Figura 7D) P. arborescens representó como máximo el 0,077% en ADN de P. somniferum lo que representa aproximadamente 0,256 mg de ADN de P. arborescens por kg de semillas. La cantidad de patógeno dentro de un lote de semillas varió entre las tres muestras independientes sometidas a ensayo, lo que indica la necesidad de realizar varias repeticiones por lote de semillas para conseguir una cuantificación de patógenos exacta (Figura 7).
Finalmente, el uso del protocolo de qPCR en tiempo real para el ensayo de las muestras de semillas de 30 cápsulas individuales (11 asintomáticas, 6 con síntomas leves de Mildiu y 13 con esporulación patógena evidente) de adormidera cultivada en campo permitió la detección de P. arborescens en el 70,0% (21/30) de todas las muestras sometidas a ensayo y en el 36,4% (4/11) de las cápsulas asintomáticas. En las muestras de semillas de las cápsulas asintomáticas en las que podía cuantificarse el patógeno, P. arborescens representó el 0,0003-0,007%o en el ADN de P. somniferum. Por otra parte, en las cápsulas sintomáticas, P. arborescens representó el 0,006-0,6 l%o (cápsulas son síntomas leves) o el 0,12-2,53% (cápsulas con esporulación patógena) en el ADN de P. somniferum {datos no mostrados).
DISCUSIÓN
En los últimos años, se han desarrollado protocolos de PCR específicos de especie usando cebadores que seleccionan como diana la región ITS del ADNr para diagnosticar cualquiera de los dos patógenos causantes del Mildiu de la adormidera descritos en la bibliografía, P. arborescens y P. cristata, pero los métodos publicados no son cuantitativos (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81, Scott, J. B. et al. 2004. Mycol. Res. 108:198- 295). El objetivo general de esta investigación fue el desarrollo de un método de cuantificación exacto de P. arborescens en tejidos vegetales y lotes de semillas comerciales usando la tecnología de la PCR cuantitativa en tiempo real que permitiría una mejor comprensión de la biología de este biotrofo obligado estricto y su interacción en la planta huésped.
Para la presente investigación, resultó vital considerar cada fase del protocolo experimental, comenzando con los procedimientos y la organización del laboratorio a través de la adquisición de muestras, la preparación de secuencias del ADN dianas (tanto curvas patrón de ADN como muestras de prueba), y finalmente la etapa de la qPCR en tiempo real. En dicho estudio fue posible obtener datos cuantitativos muy fiables y un ensayo de qPCR en tiempo real robusto, dado que cada una de estas fases se validaron apropiadamente. La detección y la cuantificación exacta y fiable de una secuencia diana mediante qPCR necesita un proceso de optimización estricto dado que depende de varios factores incluyendo linealidad, precisión, especificidad, sensibilidad, eficacia de la amplificación, calidad del ADN genómico que va a cuantificarse y exactitud de las curvas patrón de ADN, entre otros (Wong, M. L. et al. 2005. BioTechniques 39:75-85).
Se resolvieron los problemas de inespecificidad del reactivo SYBR Green I, que se une a cualquier ADN bicatenario, mediante el uso del conjunto de cebadores altamente específicos P6 (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390, Montes- Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81) y mediante la cuantificación del amplicón diana a una Tm de 830C a la que se desnaturalizarían los posibles productos no específicos y sólo se cuantifica la emisión fluorogénica del amplicón diana (Silvar, C.et al. 2005. Phytopathology 95: 1423-1429). Además, esto se realizó sin reducir la eficacia de la amplificación de las reacciones tal como se describe en otras situaciones experimentales (Weng, T. et al. 2005. Anal. Biochem. 342:167-169). Adicionalmente, tras el ciclo de amplificación final, el perfil de temperaturas de la curva de fusión y el análisis de electroforesis en gel confirmaron que sólo se amplificó un producto de la PCR en las muestras con el ADN genómico de P. arborescens y no se obtuvo ningún producto de amplificación en los controles negativos (ADN del huésped o agua).
Para la cuantificación absoluta en los ensayos de qPCR en tiempo real, la exactitud de la cuantificación de muestras desconocidas depende enteramente de la exactitud de las curvas patrón de ADN (Vaerman, J. L. et al. 2004. J. Biol. Regul. Homeost. Agents 18: 212-214). Cuando se desarrollan protocolos de qPCR en tiempo real, la técnica usada más comúnmente para medir la concentración de ácido nucleico es la determinación de la absorbancia a 260 nm, dado que es fácil de realizar, económica y permite una comprobación rápida de la pureza del ADN (razón de 260/280 nm). Las principales desventajas de este método son la sensibilidad relativa inferior del ensayo y la interferencia con ARN, ADNs, o contaminantes y nucleótidos individuales que pueden contribuir a la señal (Rengarajan, K. et al. 2002. Mol. Vision 8:416-21). Como alternativa, algunos colorantes fluorescentes, tal como el presente en el kit usado en la presente invención, son altamente selectivos para ADNds frente al ARN, su señal de fluorescencia no resulta afectada por muchos contaminantes comunes y proporciona un aumento de la sensibilidad lo que amplía el intervalo de detección significativamente en comparación con la determinación de la absorbancia; una desventaja es el aumento del coste de la técnica.
Creemos que uno de los motivos para la alta reproducibilidad, precisión y exactitud del método de la presente invención fue el especial cuidado que se tuvo para conseguir concentraciones exactas de ADN de plásmido y patógeno para construir las curvas patrón de ADN. Ésto se llevó a cabo mediante la cuantificación de cada muestra de ADN con el kit de ensayo de ADN Quant-iT por triplicado, en dos microplacas independientes y usando controles internos de cuantificación de ADN en cada ensayo. Podrían obtenerse resultados similares usando otros kits y colorantes de ADN de intercalación fluorescente tras los ajustes apropiados (Rengarajan, K. et al. 2002. Mol. Vision 8:416-21). Adicionalmente, otra ventaja de dicho kit fue que se pudo introducir una etapa de normalización final en el ensayo ya que se dedujo la razón del ADN del patógeno (cuantificado mediante el ensayo de qPCR en tiempo real) para el ADN del huésped en cada muestra de prueba (cuantificado anteriormente mediante fluorescencia) ajustando la variación introducida por las diferencias de una muestra a otra en la extracción del ADN; además, ésto evitó el coste de cuantificar el ADN del huésped mediante ensayos de qPCR adicionales (Gachón, C, y P. Saindrenan. 2004. Plant Physiol. Biochem. 42:367-371).
Otro motivo probable para la alta reproducibilidad, precisión y exactitud del método de la invención fue la forma en que se calcularon los ciclos umbrales (CT). En la mayoría de los ensayos de qPCR en tiempo real desarrollados para cuantificar patógenos de plantas no se facilita información con respecto al cálculo de la posición umbral o normalmente se calcula mediante el software del equipo. En la actualidad, muchos instrumentos calculan automáticamente el mejor nivel inicial para cada reacción- experimento proporcionando individualmente de esta manera los CT más exactos para cada placa. Los CT constituyen la base de cualquier ensayo de qPCR en tiempo real ya que se usan para determinar los números de copia. Sin embargo, dado que los Cτ se definen basándose en la posición umbral y la fluorescencia de fondo no es un valor constante o absoluto, ya que está influida por las condiciones de reacción cambiantes, calcular un umbral diferente para cada tratamiento o placa podría dar como resultado un error, especialmente cuando se intentan combinar diferentes placas para un único experimento (Bustin, S. A., y Nolan, T. 2004. J. Biomol. Tech. 15:155-166). Por tanto, en la presente invención, se incluyó una curva patrón de ADN en cada microplaca cuando se realiza un ensayo de qPCR en tiempo real, y la posición umbral se definió y se fijó manualmente, tras la validación apropiada, en la misma posición para que todos los tratamientos y experimentos pudieran comparar placas independientes y combinar los resultados tras la verificación adecuada de resultados estadísticamente similares (P≥ 0,05). La posición se escogió partiendo de la base del establecimiento de un compromiso de detección de los CT en la fase exponencial de la reacción y evitando al mismo tiempo la fluorescencia de fondo (Bustin, S. A., y Nolan, T. 2004. J. Biomol. Tech. 15:155- 166).
En la presente invención, la EA, la sensibilidad y la reproducibilidad de las reacciones de qPCR de ambas curvas patrón de ADN de la serie G y de la serie P resultó positivamente afectada por la presencia de ambos tipos de ADN del huésped (de los tejidos de las hojas y de las semillas). Por tanto, hubo una tendencia de obtener mayor sensibilidad cuando estaba presente el ADN del huésped en la reacción, tal como se demostró anteriormente por el protocolo de la PCR simple y anidada. Otros estudios han encontrado una reducción (Li, W. et al. 2007. Plant Dis. 91 :51-58) o no han encontrado ninguna diferencia (Atallah, Z. K. et al. 2007. Phytopathology 97:865-872) en la EA, la exactitud y el límite de detección cuando se usa un ADN de fondo de tejidos vegetales del huésped en los ensayos de qPCR. Sin embargo, la mayoría de los estudios no evaluaron la influencia del ADN del huésped en estos parámetros del ensayo de qPCR (por ejemplo, Hukkanen, A et al. 2006. Eur. J. Plant Pathol. 116:225-235). Se ha notificado que a bajas concentraciones del ADN diana, se favorece la formación de dímeros de cebador disminuyendo la sensibilidad y produciendo sesgos de las curvas patrón, y también que el ADN puede adherirse al depósito de plástico, por lo que la adición de parte del ADN de matriz del huésped o foráneo a la mezcla de qPCR puede minimizar la pérdida de ADN diana (Atallah, Z. K. et al. 2007. Phytopathology 97:865- 872).
Dado que la variación experimental es inevitable, es importante validar los resultados de un ensayo de qPCR midiendo la variación dentro de un ensayo y entre ensayos. La mayoría de los estudios estiman la variación usando valores de CT únicamente, cuando ésta probablemente no es la forma más apropiada puesto que éstas son unidades logarítmicas y falsearán la variabilidad real (Wong, M. L. et al. 2005. BioTechniques 39:75-85). En la presente invención se compararon estadísticamente ambos parámetros de las rectas de regresión patrón (pendientes y ordenadas en el origen) obtenidos tanto para las curvas patrón de ADN genómico de P. arborescens (serie G) como para las del ADN de plásmido (serie P) y para los diferentes fondos (ADN de las hojas y de las semillas. En la presente invención, el ANOVA univariable de los valores de CT y la comparación estadística entre las pendientes y las ordenadas en el origen de las rectas de regresión patrón derivadas de 10 experimentos independientes indicaron una alta precisión y reproducibilidad, lo que demuestra la alta fiabilidad de nuestro ensayo de qPCR en tiempo real. Todas las rectas de regresión patrón mostraron alta eficacia y reproducibilidad de las amplificaciones, con bajas desviaciones estándar de los CT, oscilando los valores de EA desde el 89,6 hasta el 111,1% para las series G y P, y un intervalo dinámico lineal sobre 6 órdenes de magnitud superando los valores de R2 0,99. Además, el análisis estadístico de las diez curvas patrón de ADN independientes obtenidas usando diferentes fuentes de ADN del patógeno y de plantas (Tabla 1), incluyendo hojas y semillas de adormidera de diferente origen y diferente edad, esporangios de P. arborescens procedentes de hojas en esporulación en la cámara de cultivo o en el campo, diferentes cultivos de plásmidos, etc., indicó que ni el origen de la muestra de ADN, ni el ADN de fondo (ADN de las hojas y de las semillas) ni el técnico que realiza el experimento influyeron significativamente en los resultados de la qPCR en tiempo real, lo que validó de nuevo la robustez de nuestro ensayo de qPCR en tiempo real. Esto permitió fijar modelos de ecuación de regresión individuales para cada una de las series G o P (Figura 5B). Con estos modelos de ecuación de regresión, pueden validarse los datos de los experimentos usando sólo la curva patrón de ADN de la serie P basándose en el ADN de plásmido que contiene el gen diana de P. arborescens. Ésto permitió establecer un protocolo universal para cuantificar P. arborescens en tejidos de adormidera, puesto que la curva patrón de ADN de la serie P puede construirse y almacenarse durante un periodo de tiempo prolongado sin perder exactitud en la cuantifϊcación y, lo que es más importante, puede intercambiarse con diferentes laboratorios lo que facilita el uso del método de la invención a una escala mayor y por laboratorios diferentes.
La mayoría de los estudios en la bibliografía realizan un único o pocos experimentos para la optimización del ensayo de qPCR en tiempo real y muestran resultados de sólo una única recta de regresión patrón para el ADN del patógeno diluido en agua o el ADN del huésped (por ejemplo, Atallah, Z. K. et al. 2007. Phytopathology 97:865-872). Probablemente, tal como indican algunos autores (Bustin, S. A., y Nolan, T. 2004. J. Biomol. Tech. 15:155-166) resulta valioso y necesario comenzar a introducir más procedimientos de análisis y notificación convencionales para el análisis de qPCR en tiempo real, tal como se ha realizado para la tecnología de micromatrices en el establecimiento de las directrices de MÍAME (www.mged.org/miame). Ciertamente, en ausencia de tales patrones para la qPCR en tiempo real, los autores no pueden garantizar que el trabajo experimental que incluye esta tecnología está validado apropiadamente y que cualquier conclusión se soporta rigurosamente por los datos reales, con el fin de reproducirse en otros laboratorios.
Una de las principales características del método de la invención usando el conjunto de cebadores P6 fue su alta sensibilidad ya que podían detectarse fácilmente hasta 10 fg de ADN de P. arborescens en 40 ng de ADN del huésped sin perder exactitud. Comparando con otros métodos, la sensibilidad del nuevo método de qPCR usando este conjunto de cebadores fue intermedia entre los protocolos de PCR simple (10 pg) y de PCR anidada (1 fg) desarrollados anteriormente (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73- 81) usando el mismo conjunto de cebadores. Resulta interesante que el método de la invención por qPCR mostró una sensibilidad superior a la notificada para otros ensayos de qPCR usando sondas Taq Man para cuantificar Plasmopara vitícola en hojas de Vitis vinifera (Valsesia, G. et al. 2005. Phytopathology 95:672-678) o cuatro especies de Phytophthora {Phytophthora ramorum, Ph. kernoviae, Ph. quercina y Ph. citricolά) en diferentes especies de plantas (Schena, L. et al. 2004. Eur. J. Plant Pathol. 110: 893- 908), o usando SYBR Green I para cuantificar P. sparsa en Rubus spp. (Hukkanen, A et al. 2006. Eur. J. Plant Pathol. 116:225-235), Alternaría brassicae en semillas de crucifera (Guillemette, T. et al. 2004. Plant Dis. 88:490-496), Ph. capsici en genotipos de pimiento (Silvar, C. et al. 2005. Phytopathology 95: 1423-1429) y Verticillium dahliae en líneas de patata (Atallah, Z. K. et al. 2007. Phytopathology 97:865-872), o usando cebadores Scorpion para cuantificar Ph. nicotianae y Ph. citrophthora en raíces de cítricos (Ippolito, A. et al. 2004. Eur. J. Plant Pathol. 110:833-843). Este nivel superior de sensibilidad puede deberse al hecho de que el conjunto de cebadores P6 se desarrolló en las regiones de ITS del ADNr, lo que se produce en múltiples copias (por ejemplo, 414 ± 12 copias por genoma haploide en Ph. infestans); sin embargo, algunos de los estudios hacían referencia a los cebadores usados anteriormente que seleccionan como diana el mismo gen (Ippolito, A. et al. 2004. Eur. J. Plant Pathol. 110:833-843).
Las principales ventajas de la alta sensibilidad del método de la invención fue que el método podía detectar y cuantificar la biomasa de patógeno en muestras infestadas de manera natural complejas a partir de múltiples orígenes, incluyendo semillas de cápsulas asintomáticas y lotes de semillas comerciales así como de plantas de adormidera asintomáticas infectadas sistémicamente por P. arborescens. Los Mildius están entre las enfermedades más destructivas de los cultivos en todo el mundo y puede transportarse por las semillas. En consecuencia, deben realizarse esfuerzos para evitar la introducción de semillas infectadas en zonas en las que no se produce el patógeno. Aunque se ha documentado la presencia de Peronospora spp. en lotes de semillas comerciales mediante el uso de ensayos de PCR tradicionales o específicos (Belbahri, L. et al. 2005. Mycol. Res. 109:1276-1287), hasta ahora no se ha desarrollado ningún estudio con ensayos de qPCR en tiempo real para cuantificar Peronospora spp. en semillas, tal como se ha realizado para otros hongos patógenos de plantas (Guillemette, T. et al. 2004. Plant Dis. 88:490-496). Recientemente, se ha demostrado que P. arborescens puede transmitirse por las semillas (Landa, B. B. et al; 2007. Phytopathology 97:1380-1390) y que el patógeno puede detectarse en lotes de semillas comerciales recogidas de cultivos de adormidera que o bien no tienen evidencia o bien tienen baja incidencia de la enfermedad (Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73-81). En la presente invención se ha demostrado que la cantidad de ADN de P. arborescens en lotes de semillas comerciales puede oscilar desde el 0,0013%o hasta el l,275%o en ADN de P. somniferum y que representa hasta 0,256 mg de ADN de P. arborescens por kg de semillas. También se ha demostrado que P. arborescens puede detectarse en las semillas obtenidas de cápsulas asintomáticas representando el 0,006-0,6 l%o de ADN de P. somniferum. Este hecho es particularmente importante para las compañías oficialmente autorizadas para el cultivo de adormidera, como ALCALIBER S. A., y puede explicar el hecho de que incluso seleccionando lotes de semillas para las siembras del siguiente año de aquellos campos en los que no se ha demostrado ningún síntoma de la enfermedad, la enfermedad de Mildiu se ha extendido, no obstante, rápidamente a grandes zonas en las que la adormidera no se había cultivado anteriormente.
La mayoría de los protocolos de qPCR en tiempo real desarrollados para cuantificar patógenos de plantas se desarrollaron o se usan con tejidos sintomáticos del huésped (Hukkanen, A et al. 2006. Eur. J. Plant Pathol. 116:225-235, Valsesia, G. et al. 2005. Phytopathology 95:672-678), y sólo algunos han notificado la capacidad de cuantificar el patógeno en respuestas a la enfermedad de baja severidad o asintomáticas (Silvar, C. et al. 2005. Phytopathology 95: 1423-1429). La adormidera cv. Nigrum en la que se han establecido infecciones sistémicas asintomáticas se considera tolerante al Mildiu (F. J. Muñoz-Ledesma, comunicación personal), en consecuencia los presentes resultados también serían de gran interés para la detección de resistencia, puesto que la falta de síntomas no garantiza que la infección no tenga lugar.
Para concluir, se puede mencionar que el método de la invención desarrollado para identificar y cuantificar P. arborescens en diferentes tejidos vegetales y lotes de semillas será de gran importancia en relación con la comprensión y la gestión de la epidemiología de esta enfermedad de Mildiu puesto que puede proporcionar la información requerida para determinar la necesidad y o el grado de estrategias de control apropiadas incluyendo esquemas de cuarentena y certificación y también para evaluar nuevas variedades de adormidera para determinar su respuesta frente a P. arborescens.
TABLA 1. Fuentes de ADN de Peroitυspora υrhorcscem y Ptφuvcr soinnifcrwn usadas para construir las diferentes series de curvas patrón de ADN usadas en este estudio
Fuente de Serie de ΛDN1'
AI)N" I 2 3 4 S
Perυtwsnυru urhorescens
SG O Genómico ADN fresco extraído de ADN fresco extraído de ADN congelado (-2O0C) de ADN fresco extraído de ADN congelado (-200C) de micelio congelado (-8O0C). micelio fresco, muestra Ia muestra C85EX-2007. micelio fresco, muestra Ia muestra C85EX-2007 de muestra P98CSJ-2004, C79CI IO-2008. Ruidero" experimentos en cámara de C 168EX-2008, la serie 3
S Casilla San José" Écija. Écija. Sevilla. España cultivo experimentos en cámara de
Sevilla, España cultivo
r Plásmido ADN fresco extraído del ΛDN de plásmido ADN fresco extraído del ADN de plásmido ΛDN de plásmido
>
N clon EC3_P38ESJ en junio congelado (-200C) de Ia clon EC3 P38ESJ en congelado (-200C) de Ia congelado (-200C) de Ia
O de 2008 serie 1 septiembre de 2008 serie 3 serie I
50
Papaver somniferum cv. Nigrum
Ω
r >• Hojas ADN fresco extraído de ADN congelado (-2O0C) de ADN fresco extraído de ADN congelado (-2O0C) de ADN congelado (-200C) de lo hojas de plántula germinadas plántulas de Ia serie 1 hojas maduras de plantas hojas maduras de Ia serie 3 plántulas de Ia serie 1 en placas Petri. lote semillas en experimentos en cámara
L l de cultivo, lote semillas L2
Semillas ADN fresco extraído del lote ADN fresco extraído del ADN congelado (-200C) ADN congelado (-2O0C) ADN congelado (-200C) de de semillas comercial S2, lote de semillas comercial del lote de semillas D200 del lote de semillas D205 lote de semillas D205 del
ALCALIBKR S.A., 2007 S2, ΛLCΛ LI BER S.Λ., del experimento en cámara del experimento en cámara experimento en cámara de
2007 de cultivo, 2007 de cultivo, 2007 cultivo, 2007
Leyenda Tabla 1
a El ADN genómico de P. arborescens y de las semillas y hojas de la adormidera se extrajo usando el kit de extracción de ADN genómico de plantas "G-SpinTM Hp" y el Fast Prep System Bio 101 según Landa et al. El ADN de plásmido de la cepa de E. coli JM 109 se extrajo con el kit QuickGene Plasmid usando el dispositivo QuickGene-
Mini80 según las instrucciones del fabricante.
b Se obtuvieron cinco series de curvas patrón de ADN a partir de diluciones de 10 veces [1 :1, 1 :10, l :102, l :103, l :104, l :105 y l :106] de ADN genómico de P. arborescens (1 ng/μl) o de ADN de plásmido (1 ng/μl; equivalente a 2,33 x 108 copias/μl) en AEU (Curvas Gw y Pw) así como en un fondo fijo de ADN de Pap. somniferum (40 ng/μl) extraído de las hojas (Curvas GL y PL) O de las semillas (Curvas Gs y Ps) sanas de adormidera.
TABLA 2. Sensibilidad de cebadores específicos de Peronospora arborescens usados en ensayos de PCR anidada, simple y de PCR cuantitativa (qPCR) usando ADN purificado de P. arborescens individualmente o mezclado con ADN del huésped
Protocolo CP de ADN ADN de Peronospora arborescens (pg/μl)b Control de PCRa ADN b ng/μlb 1.000 100 10 1 0,1 0,01 0,001 negativo
Simple Gw 0 +/+ +/+ ±/± -/- -/- -/- np -/-
GL 40 +/+ +/+ +/+ ±/± -/- -/- np -/-
G8 40 +/+ +/+ +/+ ±/± -/- -/- np -/-
+/+ +/+ +/+ ±/- ±1- -/- -/-
Gw 0 np
Cuantitativa 16,l±0,8 18,8±0,5 22,8±0,6 26,7±0,7 30,6±0,8 NA na
+/+ +/+ +/+ ±/± ±/± ±/± -/-
GL 40 np
14,8±0,3 17,9±0,5 21,6±0,5 25,0±0,4 28,5±0,6 31,9±0,4 na
+/+ +/+ +/+ ±/± ±/± ±/± -/-
G8 40
14,8±0,3 17,9±0,4 21,5±0,4 24,8±0,5 28,5±0,6 31,6±0,2 np
na
+/+ +/+ +/+ ±/± ±/± ±1- -/- -/-
Pw 0
l l,l±0,3 12,3±0,4 15,6±0,9 19,5±1,1 23,2±1,1 27,1±1,9 30,8±l,5 na
+/+ +/+ +/+ ±/± ±/± ±/± ±1- -/-
PL 40
l l,4±0,3 14,4±0,5 17,2±0,4 20,2±0,3 23,3±0,5 26,7±0,4 30,7±0,4 na
+/+ +/+ +/+ ±/± ±/± ±/± ±1- -/-
Ps 40
l l,6±0,3 14,3±0,3 17,4±0,2 19,8±0,3 23,0±0,4 26,5±0,4 30,6±0,5 na
Anidada Gw 0 +/+ +/+ +/+ ±/± ±/± ±/± np -/-
GL 40 +/+ +/+ +/+ ±/± ±/± ±/± np -/-
G8 40 ±/± ±/± ±/± ±/± ±/± ±/± np -/-
Leyenda Tabla 2
a Se usaron cebadores OMPac7fw/OMPac7rv (conjunto P6) en protocolos de PCR simple y anidada tal como se describió anteriormente (Landa, B. B. et al.; 2007. Phytopathology 97:1380-1390, Montes-Borrego, M. et al. 2009; Phytopathology 99:73- 81) o en un en ensayo de PCR cuantitativa (este estudio).
b Se obtuvieron cuatro curvas patrón (CP) de ADN independientes mediante diluciones en series de ADN de P. arborescens (1 ng/μl; serie G) o ADN del plásmido EC3 P38ESJ (1 ng/μl; serie P) que contenían la región ITS del patógeno, para obtener desde 1 ng hasta 10 fg de ADN por reacción de qPCR en agua destilada estéril (Gw y Pw; 0 ng de ADN de fondo) o en ADN de Pap. somniferum extraído de las hojas (GL y PL; 40 ng de ADN de fondo) o de las semillas (GL y PL; 40 ng de ADN de fondo) para investigar cualquier posible influencia del ADN del huésped en la amplificación del ADN del patógeno. Los resultados mostrados se obtuvieron para dos series y por dos técnicos independientes con las mismas series de dilución. + = Amplificación positiva; ± = Amplificación débil positiva; - = Sin señal; na = sin amplificación (es decir, los valores de CT estaban bajo un valor de fluorescencia umbral de 400); np = no realizado. Los números mostrados en los ensayos de PCR cuantitativa corresponden a ocho valores de CT ± la desviación estándar de dos CP independientes, realizada cada una por dos técnicos independientes y con dos repeticiones dentro de cada placa.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un método para la cuantifϊcación de Peronospora arborescens por PCR cuantitativa en una muestra biológica, que comprende:
(i) extracción del ADN contenido en dicha muestra biológica; y
(ii) amplificación del ADN extraído en la etapa (i) mediante PCR cuantitativa con los oligonucleótidos identificados por las secuencias SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO:6.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica es una muestra de material vegetal, o una muestra de estructuras de P. arborescens.
3. Método según la reivindicación 2, en el que dicha muestra de material vegetal se selecciona entre tejidos de semillas, cubiertas de semillas, hojas, tallos, cápsulas, raíces y mezclas de las mismas.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra biológica está infectada por P. arborescens.
5. Método según la reivindicación 2, en el que dicha muestra de estructuras de P. arborescens contiene micelio, esporangios, esporangióforos u oosporas.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha muestra biológica procede de Papaver somniferum.
7. Empleo de una pareja de oligonucleótidos SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 en una reacción de amplificación por PCR cuantitativa para cuantificar la presencia de Peronospora arborescens en una muestra biológica.
8. Empleo de la pareja de oligonucleótidos según la reivindicación 7, en el que dicha muestra biológica es una muestra de material vegetal, o una muestra de estructuras de P. arborescens.
9. Empleo de la pareja de oligonucleótidos según la reivindicación 7, en el que dicha muestra biológica es (i) una muestra de material vegetal, o (ii) una muestra de estructuras de P. arborescens.
10. Empleo según la reivindicación 8, en el que dicha muestra de material vegetal se selecciona entre tejidos de semillas, cubiertas de semillas, hojas, tallos, cápsulas, raíces y mezclas de las mismas.
11. Empleo según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha muestra biológica está infectada por P. arborescens.
12. Empleo según la reivindicación 8, en el que la muestra de estructuras de P. arborescens contiene micelio, esporangios, esporangióforos u oosporas.
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