WO2010113627A1 - 高病原性口腔細菌の高感度検出法 - Google Patents

高病原性口腔細菌の高感度検出法 Download PDF

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WO2010113627A1
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mutans
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梅村和夫
外村和也
仲野和彦
大嶋隆
野村良太
和田孝一郎
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国立大学法人浜松医科大学
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/18—Dental and oral disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting oral bacteria that cause bleeding exacerbations, a screening method for subjects with a high risk of bleeding exacerbations, a method for determining the risk of bleeding exacerbations in subjects, detection reagents and kits for use in these methods .
  • Examples of conditions involving bleeding due to blood vessel damage include bleeding due to trauma and blood vessel rupture, bleeding during childbirth, intracerebral hemorrhage, etc.
  • intracerebral hemorrhage nerve compression of the brain due to bleeding or necrosis due to necrosis
  • severe damage may occur due to neurological symptoms caused by cerebral vasospasm induced by bleeding.
  • hemorrhage hemomostasis
  • prevention of exacerbation of bleeding is necessary, and it is also important to diagnose the risk of exacerbation of bleeding.
  • Patent Document 1 In the diagnosis of a disease accompanied by bleeding, for example, as a marker for diagnosing the possibility of stroke, Apo ⁇ C-III, serum amyloid A, Apo CI, antithrombin III fragment, Apo AI, etc.
  • Patent Document 1 stroke and brain Cerebrospinal fluid markers of cerebral ischemia such as adenylate kinase, ⁇ -thromboglobulin, vascular cell adhesion factor (VCAM), natriuretic peptide, and predictive cerebral vasospasm as markers for prognosing injury
  • VCAM vascular cell adhesion factor
  • MMP-9 matrix metalloproteinase-9
  • these are all markers for detecting bleeding that has already occurred in the living body, and the risk of exacerbation of bleeding cannot be diagnosed.
  • PA Protein ⁇ Antigen, also known as PAc, SpaP, a protein antigen having a molecular weight of about 190 kDa, which is the main cell surface protein, exerts the pathogenicity of the most serious bleeding exacerbation.
  • the present invention is a method of detecting bleeding exacerbated oral bacteria, comprising detecting PA and / or CBP and / or cell surface charge of oral bacteria in a sample, wherein PA is not detected and / or
  • the present invention relates to the above-mentioned method, wherein CBP is detected and / or the cell surface charge is negative, whereby it is determined that bleeding-exacerbating oral bacteria are present.
  • the present invention is also a screening method for a subject at high risk of exacerbation of bleeding, comprising detecting PA and / or CBP and / or cell surface charge of oral bacteria in a biological sample obtained from the subject.
  • the present invention relates to the above-mentioned method, wherein it is judged that there is a high risk of exacerbation of bleeding because PA is not detected and / or CBP is detected and / or cell surface charge is negative.
  • the present invention is a method for determining the risk of exacerbation of bleeding in a subject, comprising detecting PA and / or CBP and / or cell surface charge of oral bacteria in a biological sample obtained from the subject, The method relates to determining that there is a high risk of exacerbation of bleeding in the subject due to the absence of PA detection and / or the detection of CBP and / or a negative cell surface charge.
  • the present invention also relates to any of the above methods, wherein the bleeding is ruptured bleeding.
  • the present invention also relates to any of the above methods, wherein the oral bacteria is Streptococcus mutans.
  • the present invention further provides PA, (1) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 17, 19, 21, or 23, (2) a polypeptide comprising one or more mutations with respect to the polypeptide of (1) but having a function equivalent to that of the polypeptide of (1), (3) comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 18, 20, 22 or 24 or a complementary sequence thereof or a fragment thereof; A polypeptide having the same function as the polypeptide of 1), (4) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 17, 19, 21, or 23, And wherein said method is selected from the group consisting of:
  • the present invention
  • the present invention also provides CBP (1) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 9, 27 or 31; (2) a polypeptide comprising one or more mutations with respect to the polypeptide of (1) but having a function equivalent to that of the polypeptide of (1), (3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 10, 28, or 32, or a complementary sequence thereof, or a fragment thereof, and (1) A polypeptide having a function equivalent to the polypeptide of (4) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 9, 27 or 31; And wherein said method is selected from the group consisting of:
  • the present invention also relates to the method, wherein the CBP comprises a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 9, 27, or 31.
  • the present invention also relates to a reagent for detecting bleeding-exacerbated oral bacteria, which comprises a PA detecting agent for oral bacteria and / or a CBP detecting agent.
  • the present invention also relates to an oral bacterial PA-specific antibody for detecting bleeding-exacerbated oral bacteria.
  • the present invention relates to a kit for detecting a bleeding exacerbated oral bacterium and / or screening for a subject at high risk of bleeding exacerbation and / or determining the risk of bleeding exacerbation in a subject, comprising at least a PA detection reagent and a CBP detection reagent.
  • the present invention also relates to a hemostatic agent comprising an oral bacterial PA protein or a nucleic acid encoding the PA protein.
  • the present invention also relates to a platelet aggregation inhibitor containing a substance that binds to oral bacterial PA protein or a nucleic acid encoding PA protein.
  • the present invention also relates to a bleeding exacerbation inhibitor comprising a substance that binds to a nucleic acid encoding oral bacterial CBP or CBP protein.
  • this invention relates to the detection agent of the collagen exposure site
  • the present invention also relates to a carrier for substance delivery to a collagen-exposed site containing oral bacteria CBP.
  • the present invention also relates to a therapeutic agent for bleeding, including oral bacterial CBP and a hemostatic agent. Furthermore, the present invention relates to the bleeding treatment agent for a subject having low platelet sensitivity to collagen. The present invention also relates to a bleeding exacerbation preventive agent containing an oral bacteria removing agent.
  • the present invention makes it possible to quickly and easily diagnose the risk that an individual causes bleeding exacerbations. Further, the method of the present invention makes it possible to detect a causative factor of exacerbation of bleeding using a readily available biological sample such as saliva or plaque without using a special analytical instrument. Thereby, it is possible to effectively prevent bleeding exacerbation by identifying a high-risk group of bleeding exacerbations and taking measures such as eradication of causative bacteria and dental hygiene guidance for individuals belonging to this group.
  • FIG. 1 is a flowchart of a system for detecting S. mutans strains that can cause bleeding exacerbation from saliva.
  • FIG. 2 is a scheme of a method for culturing and detecting S. mutans.
  • FIG. 3 is a scheme of a method for detecting PA-deficient S. mutans and CBP-carrying S. mutans.
  • FIG. 4 shows the results of inducing cerebral hemorrhage by infecting a mouse with the S. mutans strain.
  • (Ab) Representative macro images of mouse brain whole (a) and (b) coronal slices 24 hours after induction of cerebral hemorrhage and administration of PBS (control) or S. mutans TW295 strain. The arrowhead indicates the bleeding site.
  • (C) It is a graph which shows the difference in the bleeding area by the infection of various S. mutans strains. Each column represents the mean ⁇ SEM from 10-21 independent experiments ( * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01).
  • (D) A typical photomicrograph of a vascular damaged hemisphere isolated from a control or TW295 treated mouse 3 hours after induction of bleeding.
  • the magnified image shows microvascular bleeding.
  • E A sample was collected 24 hours after the administration of the bacteria, and MMP-9 activity was detected by gelatin gel zymography. MMP-9 activity was consistently higher in the vascular injury side hemisphere of the TW295 administration group than in the control group (Ips: cerebral vascular injury side hemisphere, Ctr: contralateral hemisphere).
  • FIG. 5 is a diagram showing accumulation of administered bacteria in damaged blood vessels and interaction with collagen around the blood vessels.
  • A In each organ 24 hours later in a mouse infected with the TW295 strain, detection was performed by PCR using a primer that specifically detects the cellular DNA of the infecting bacterium. Labels in each lane are M: molecular marker (100 bp ladder), Std: positive control (genomic DNA extracted from TW295 strain), Ips: brain vascular injury side hemisphere, Ctr: brain contralateral hemisphere, respectively.
  • B Tissues isolated from damaged and non-injured areas were plated on culture dishes to collect S. mutans. The number of isolated and recovered bacteria is shown as CFU / mg protein.
  • (C) Representative in-vivo scanning electron microscope image showing the interaction between damaged blood vessels and infected bacterial cells observed in a sample prepared from brain tissue extracted 3 hours after administration of TW295 strain. The right panel is an enlarged image of the frame. White arrowheads indicate that accumulated bacteria are leaking outside the blood vessel at the damaged site.
  • (D) In vivo scanning electron microscope image showing the interaction between bacteria in the damaged hemisphere and collagen fibers surrounding the blood vessels. White arrowheads indicate bacteria that interact with collagen fibers.
  • FIG. 6 is a diagram showing detection of bacteria accumulated in the damaged brain region by Gram staining. White arrowheads indicate accumulated bacteria. Scale bar: 25 ⁇ m.
  • FIG. 7 summarizes the effects of the presence of collagen binding protein (CBP) and the expression of protein antigen (PA) on pathogenicity.
  • CBP collagen binding protein
  • PA protein antigen
  • FIG. 8 shows the effect of S. mutans expressing CBP on collagen binding activity and cerebral hemorrhage.
  • A Collagen binding activity of various S. mutans strains was evaluated under constant conditions of 2 mg type I collagen and 1 ⁇ 10 10 bacterial cells. The results for each strain were expressed as a percentage with the TW871 strain as 100%.
  • B The size of the bleeding region in mice when infected with TW295CND strain prepared from TW295, TW295, MT8141PD strain prepared from MT8141 or MT8141. Each column represents the mean ⁇ SEM of 11-16 independent experiments.
  • C Correlation between collagen binding activity and total bleeding area.
  • FIG. 9 shows the relationship between collagen binding activity and platelet aggregation in various S. mutans strains.
  • A Platelet aggregation activity of various S. mutans strains. The assay was performed using mouse whole blood and a platelet aggregometer under constant conditions of 4 ⁇ g of collagen and 1 ⁇ 10 7 bacterial cells. The results for each strain are expressed as a percentage, where 100% is the case with collagen but no bacterial cells.
  • B Correlation between collagen binding activity and platelet aggregation.
  • FIG. 10 shows the effect on platelet aggregation by various S. mutans strains.
  • A Platelet aggregation rate by addition of standard strain MT8148 or pathogenic strain TW871 of various cell numbers. Aggregation of mouse whole blood was measured after addition of S. mutans and expressed as a percentage.
  • FIG. 11 is a diagram showing the relationship between the difference in the state of the bacterial cell surface and collagen-induced platelet aggregation.
  • A Representative findings of S. ⁇ mutans strain and platelet response to collagen by scanning electron microscope. After reacting with collagen, the platelet fraction was collected and observed with a scanning electron microscope.
  • B Zeta potential value of S. mutans strain. The zeta potential values of the reference strain MT8148 and its isogenic mutant MT8148PD were measured and expressed in mV. In addition, 7 oral isolates and 7 blood isolates were also measured. Each column represents data from 3-5 independent experiments.
  • C Transmission electron microscope findings on the bacterial surface.
  • D Scanning electron microscope findings on the bacterial surface.
  • FIG. 12 is a diagram showing the correlation between platelet aggregation and the zeta potential value. Each point represents one bacterial strain.
  • FIG. 13 is a diagram showing a three-dimensional reconstruction image of the bacterial surface. Bacterial membranes were compared using 3D reconstructed images created by TEM computed tomography.
  • A The peptidoglycan layer of MT8148 is observed as a transparent and very smooth layer in the three-dimensional image obtained by TEM.
  • B The peptidoglycan on the bacterial surface of TW295, which is a pathogenic strain, is opaque and its outline is unclear (arrowhead).
  • FIG. 14 shows the effect of bacteria isolated from human stroke patients on collagen binding activity and platelet aggregation.
  • A Collagen binding activity of S. mutans strains (SMH2 and SMH4) isolated from stroke patients. The activity was evaluated under constant conditions of 2 mg type I collagen and 1 ⁇ 10 10 bacterial cells. The results for each strain are expressed as a percentage with TW871 as 100%.
  • B Platelet aggregation activity of S. mutans strains isolated from stroke patients. The assay was performed under constant conditions of 4 ⁇ g of type I collagen and 1 ⁇ 10 7 bacterial cells by the impedance method using a platelet aggregometer using mouse whole blood. The results for each strain are expressed as a percentage where 100% is the condition where collagen is added but no bacterial cells are added.
  • FIG. 15 shows the effect of S. mutans expressing CBP isolated from stroke patients on cerebral hemorrhage.
  • A Representative macro image of the whole mouse brain 24 hours after the onset of cerebral hemorrhage, to which SMH4 isolated from a stroke patient was administered.
  • B A representative macro image of a brain section of a mouse administered with SMH4.
  • C Size of the cerebral hemorrhage area of a group of mice infected with S. mutans (SMH2 and SMH4) expressing CBP isolated from stroke patients. Each column represents the mean ⁇ SEM of 11-16 independent experiments ( * p ⁇ 0.05).
  • FIG. 16 is a schematic diagram showing a possible mechanism of exacerbation of cerebral hemorrhage by S. mutans cells.
  • A Normal hemostasis induced by platelet aggregation at the site of endothelial cell injury.
  • B Since S. mutans cells having a high negative charge accumulate on exposed positive charge collagen, and S. mutans cells having a collagen binding protein have a high affinity for the exposed collagen, Both of these lead to activation of MMP-9 and inhibition of platelet aggregation at the site of endothelial cell injury, causing persistent bleeding.
  • FIG. 17 is a schematic diagram of an experimental protocol for photochemically inducing injury to mouse mesencephalic artery epithelial cells.
  • A Schematic diagram of hypothesis and experimental protocol.
  • B Time schedule of experimental procedure.
  • FIG. 18 is a diagram showing an example of analysis results for determining the presence of PA-deficient S. mutans and CBP-carrying S. mutans.
  • FIG. 19 is a graph showing the examination results of optimal conditions (culture under aerobic / anaerobic conditions, antibiotic concentration, nutrient concentration) when culturing S. mutans.
  • FIG. 20 is a graph showing the results of examining the storage period of saliva that can be used to detect pathogenic S. mutans.
  • the present invention provides a method of detecting bleeding exacerbated oral bacteria, the method comprising detecting PA and / or CBP and / or cell surface charge of oral bacteria in a sample, wherein PA is not detected and The presence of bleeding exacerbated oral bacteria is determined by the detection of CBP and / or the negative cell surface charge.
  • the present invention in another aspect, provides a method for screening a subject at high risk of exacerbation of bleeding, the method comprising PA and / or CBP and / or cell surface of oral bacteria in a biological sample obtained from the subject. It is determined that there is a high risk of exacerbation of bleeding, including detection of charge, no PA detected and / or CBP detected and / or negative cell surface charge.
  • the present invention provides a method for determining the risk of exacerbation of bleeding in a subject, the method comprising: PA and / or CBP and / or cell surface of oral bacteria in a biological sample obtained from the subject It is determined that there is a high risk of exacerbation of bleeding in the subject, including detection of charge, and detection of PA and / or detection of CBP and / or negative cell surface charge.
  • S. mutans is also known as a bacteremia of infectious endocarditis and infectious endocarditis, and bacterial DNA of S. mutans was detected in heart valve and aortic aneurysm specimens. It has also been reported to be associated with organ diseases (Nakano et al., 2008, Japanese Dental Science Review, 44: 29-37) However, the relationship between S. mutans and other diseases such as cerebrovascular disease has not been studied at all.
  • the present inventors have found that these highly pathogenic S. mutans strains lack PA, which is a major cell surface protein. Moreover, the present inventors have found that among strains lacking PA, a strain having CBP, which is another cell surface protein, has particularly high pathogenicity. Furthermore, the present inventors show that when a gene encoding CBP of TW295 strain is deleted by genetic manipulation, bleeding exacerbation as in TW295 strain is not exhibited, and a gene encoding PA of MT8148 strain is lacking. The lost strain was confirmed to show exacerbation of bleeding, and CBP and PA were confirmed to be involved in the bleeding exacerbation effect of S. mutans. The inventors have further found that S.
  • ansmutans strains carrying CBP are detected in the oral cavity of human hemorrhagic stroke patients, and that CBP carrying S. mutans strains isolated from such patients are It was confirmed that it causes exacerbation of cerebral hemorrhage. Furthermore, the inventors have found that the cell surface charge of the highly pathogenic S. mutans strain is negative. Based on these findings, the present inventors have identified the surface protein and cell surface charge of these cells for the detection of S. mutans strains that exacerbate bleeding, and for screening subjects with a high risk of exacerbation of bleeding. And can be used as a useful marker for determining the risk of exacerbation of bleeding in subjects.
  • Oral bacteria detected by the method of the present invention may exacerbate any bleeding, but in particular, exacerbate ruptured bleeding caused by damage to the blood vessel wall due to trauma, ulcer, aneurysm rupture, etc. It is.
  • Representative examples of disruptive bleeding include cerebral hemorrhage (intracerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, chronic subdural hematoma), trauma or pressure bleeding, postpartum hemorrhage, disease-related subcutaneous bleeding, and the like.
  • Diseases that cause bleeding tendencies include connective tissue abnormalities (such as allergic purpura), platelet reduction (disseminated intravascular coagulation syndrome, aplastic anemia, etc.) or platelet abnormalities (such as asthenia gravis), or the coagulation system.
  • Endogenous or exogenous circulating anticoagulants such as lupus anticoagulant, factor VIII anticoagulants may cause a tendency to bleed.
  • exacerbation of bleeding means that spontaneous hemostasis against bleeding caused by such intrinsic or exogenous factors is delayed, reduced or lost compared to normal subjects. means.
  • a subject with a high risk of exacerbation of bleeding means that the spontaneous hemostasis by platelets is delayed compared to a normal subject when bleeding occurs due to an intrinsic or extrinsic factor in the subject. Means it is more likely to be lost, reduced or lost.
  • PA Protein Antigen
  • PAc Protein Antigen c
  • SpaP antigen I / II
  • Antigen I / II antigen I / II
  • Many aliases such as antigen B (Antigen B), P1 and MSL-1 are known.
  • the PA polypeptide includes three alanine-rich repeat domains (A region) at the N-terminal side, three proline-rich repeat domains (P region) at the center, and a cell wall-transmembrane domain at the C-terminus, It has been reported that the A region is involved in the adhesion of bacterial cells to teeth (Matsumoto-Nakano et al., 2008, Oral Microbiology and Immunology, 23: 265-270). In addition, PA is involved in infective endocarditis caused by S.
  • serotype k strains frequently detected in patients with infective endocarditis have a high rate of deletion of PA, and in this serotype, the hydrophobicity of bacterial cells is low, and phagocytosis (phagocytosis) (Nakano et al., 2008, Journal of Dental Research, 87 (10): 964-968).
  • PAs include, for example, PA of serotype c MT8148 (DDBJ accession number: X14490, amino acid: SEQ ID NO: 1, nucleic acid: SEQ ID NO: 2), PA of LJ23 strain (DDBJ accession number: AB364261, amino acid: sequence) No. 17, nucleic acid: SEQ ID NO: 18), PA of SA98 strain (DDBJ accession number: AB364285, amino acid: SEQ ID NO: 19, nucleic acid: SEQ ID NO: 20), antigen I / II spaP gene (DDBJ accession number: X17390, Kelly et al., 1989, FEBS Lett.
  • CBP Another anchor protein of S. mutans, CBP (also described as Cnm) is a type I collagen binding protein with a molecular weight of about 120 kDa, a collagen binding domain (CBD, residues 152 to 316), a B repeat domain (residue) Groups 328-455) and the LPXTG motif (residues 507-511) (SatoSet al., 2004, Journal of Dental Research, 83 (7): 534-539).
  • the CBP gene possession frequency of S. mutans is about 10-20%, and CBP positive strains are mainly expressed in serotypes f and k (Nakano et al., 2007, J. Clin. Microbiol., 45: 2616). -2625).
  • CBD (amino acid: SEQ ID NO: 5, nucleic acid: SEQ ID NO: 4) was obtained for CBP (DDBJ accession number: AB102689, amino acid: SEQ ID NO: 3, nucleic acid: SEQ ID NO: 4) of serotype k. 6) and the LPXTG motif are highly conserved between strains (eg, TW871, SA53, LJ32 strains, etc.), but the number of B repeat domain repeats (repeats) has been found to vary from strain to strain (Nomura et. Al , 2009, J. Med. Microbiol., 58: 469-75).
  • PA is (1) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 17, 19, 21, or 23, (2) The polypeptide of (1) contains 1 or 2 or more, preferably 1-20, 1-15, 1-10, 1 or several mutations to the polypeptide of (1)
  • a polypeptide having a function equivalent to (3) comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 18, 20, 22 or 24 or a complementary sequence thereof or a fragment thereof; 1) a polypeptide having a function equivalent to that of the polypeptide, or (4) an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 17, 19, 21 or 23 and 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90 %, More preferably 95% or more of an amino acid sequence having homology and having a function equivalent to the polypeptide of (1), Is defined as Preferably, PA comprises a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • PA that can be used in the method of the present invention is a condition that is stringent to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 18, 20, 22 or 24 (nucleic acid sequence encoding PA protein) or a complementary sequence thereof or a fragment thereof.
  • a function equivalent to a polypeptide comprising an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes underneath and comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 17, 19, 21, or 23 (amino acid sequence of PA protein) As long as it has, it may be a polypeptide containing a mutation (deletion, substitution, addition) of one or more amino acids.
  • the mutation may be a natural one or one produced by any known method, for example, cleavage or insertion of a nucleic acid with a restriction enzyme, site-directed mutagenesis, irradiation with radiation or ultraviolet light, etc. .
  • the number of mutated amino acids may be, for example, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1, or several.
  • CBP is: (1) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 9, 27 or 31; (2) The polypeptide of (1) contains 1 or 2 or more, preferably 1-20, 1-15, 1-10, 1 or several mutations to the polypeptide of (1) A polypeptide having a function equivalent to (3) an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions to the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 10, 28, or 32, or a complementary sequence thereof, or a fragment thereof, and (1) A polypeptide having the same function as the polypeptide of (4), or (4) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 9, 27 or 31 and 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, A polypeptide comprising an amino acid sequence preferably having a homology of 95% or more and having a function equivalent to that of the polypeptide of (1), Is defined as
  • the CBP polypeptide that can be used in the method of the present invention is a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, 10, 28, or 32 (a nucleic acid encoding CBD of S. mutans TW295, TW871, SA53, or LJ32) Sequence) or a complementary sequence thereof or a fragment thereof, an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions, and represented by SEQ ID NO: 5, 9, 27, or 31 (S.
  • the CBP polypeptide is a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, 8, 26 or 30 (S. mutans TW295 strain, TW871 strain (DDBJ accession number AB469914), SA53 strain (AB465299) or LJ32 strain (same as above).
  • CBP comprises a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, 9, 27 or 31.
  • a PA or CBP variant has the same function as PA or CBP can be confirmed using known means.
  • a specific antibody against the mutant peptide is prepared by a known method, and Kawato et al., 2008, Oral Microbiology and Immunology, 23:14 Inhibition of adhesion of the antibody cells to hydroxyapatite can be determined by the method described in No.-20.
  • the binding ability of CBP mutants to type I collagen can be determined by a collagen binding assay described in Nomura et al., 2009, J. Med. Microbiol, 58 (4): 469-475. .
  • the function of the mutant can be evaluated by comparing with an appropriate negative control or PA or CBP as a positive control.
  • an appropriate negative control or PA or CBP as a positive control.
  • the function of the mutant can be evaluated by comparing with an appropriate negative control or PA or CBP as a positive control.
  • an appropriate negative control or PA or CBP as a positive control.
  • the function is greater than 1/100, 1/50, 1/25, 1/10, 1/5, or even 1/2 of the positive control Include in genetic variants.
  • the surface charge of bacterial cells can be measured by any known method such as a zeta potential measurement method.
  • the zeta potential is also referred to as an electrokinetic potential, and is a potential difference that occurs at the interface between a solid and a liquid that are in contact with each other, and is used as one of the indices representing the surface charge of bacterial cells. it can.
  • ⁇ the zeta potential
  • ⁇ the viscosity of the solvent
  • u the electrophoretic mobility
  • ⁇ 0 the vacuum dielectric constant
  • ⁇ r the solvent dielectric constant, Can be obtained.
  • the electrophoresis method suitable for zeta potential measurement is not particularly limited as long as it can measure the velocity of the bacterial cell to be migrated.
  • capillary electrophoresis, microscope electrophoresis, rotational diffraction grating method, laser Doppler Examples include electrophoresis.
  • the negative surface charge of bacterial cells is an indicator of highly pathogenic oral bacteria, and is a criterion for the presence of bleeding exacerbated oral bacteria and the risk of bleeding exacerbation. That is, collagen fibers exposed in damaged blood vessels have a positive charge. If the surface charge of bacterial cells is negative, the bacterial cells are more likely to interact with exposed collagen fibers, and platelet aggregation is suppressed. Causes exacerbation of bleeding.
  • the surface charge measured as zeta potential is ⁇ 1.0 mV or less, more preferably ⁇ 3.0 mV or less, even more preferably ⁇ 4.0 mV or less, even more preferably ⁇ 5.0 mV or less, particularly preferably ⁇ 8.0 mV or less. If so, it is determined that the oral bacteria are highly pathogenic.
  • the oral bacteria PA, CBP and cell surface charge may be used alone or in combination.
  • detecting only PA, only CBP, or only cell surface charge any combination of PA, CBP and cell surface charge, ie, both PA and CBP, both PA and cell surface charge, CBP and Both cell surface charges or all of PA, CBP and cell surface charges may be detected.
  • the determination criteria may be used independently or in combination, that PA is not detected, CBP is detected, and cell surface charge is negative.
  • the main bacteria identified as bleeding exacerbating oral bacteria are Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Streptococcus cricetus, Streptococcus ⁇ cricetus, Streptococcus (Streptococcus downei), such as Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus gordonii, Strococcus gordonii, Strococcus gordonii Can be mentioned.
  • TW295, TW871, SA53 and LJ32 strains of S. mutans cause severe bleeding exacerbations.
  • GenBank registered trademark of NCBI
  • DDBJ DNA Data Bank of Japan: http://www.ddbj.nig.ac.jp/
  • the present invention provides a reagent for detecting bleeding-exacerbated oral bacteria, comprising an oral bacterial PA detection agent and / or a CBP detection agent.
  • the PA detection agent comprises an oral bacterial PA specific antibody.
  • the presence or absence of highly pathogenic S. mutans can be detected quickly and easily using PA-specific antibodies developed by the present inventors.
  • the PA-specific antibody is preferably an antibody or fragment thereof derived from a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an immunogenic fragment thereof.
  • the PA-specific antibody has a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 17, 19, 21 or 23.
  • an antibody or fragment thereof induced by a polypeptide having immunogenicity and inducing antibody production against a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 17, 19, 21, or 23 can be obtained using a recombinant PA containing the above-described polypeptide (see, for example, Nakano et al., 2006, Microbes and Infection, 8: 114-121) as an antigen.
  • the CBP detection agent includes a substrate (microplate, test tube, slide glass, etc.) coated with type I collagen.
  • a substrate microplate, test tube, slide glass, etc. coated with type I collagen.
  • CBP binding to type I collagen Nomura et al., 2009, J. Med. Microbiol., 58 (4): 469-475
  • cells expressing CBP are coated with type I collagen. It can be easily detected by adhering it to the substrate.
  • the CBP detection agent comprises a specific antibody against CBP of oral bacteria.
  • the CBP-specific antibody may be a specific antibody against the collagen-binding domain of CBP, preferably induced by a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, 9, 27 or 31 or an immunogenic fragment thereof. An antibody or fragment thereof.
  • the CBP-specific antibody has a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, 9, 27 or 31.
  • antibody fragments include, but are not limited to, various functional fragments such as Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, scFv, dsFv (disulfide stabilized V region fragment), and CDR-containing fragments. including.
  • the present invention provides kits for the detection of bleeding exacerbated oral bacteria and / or screening of subjects at high risk of bleeding exacerbation and / or determination of the risk of bleeding exacerbation in a subject.
  • the kit includes at least a PA detection reagent and a CBP detection reagent.
  • the kit includes an oral bacterial PA specific antibody as a PA detection reagent.
  • the kit includes a substrate (microplate, test tube, slide glass, etc.) coated with type I collagen as a CBP detection reagent.
  • the kit includes a CBP specific antibody as a CBP detection reagent.
  • the kit of the present invention may further comprise one or more of the following for cultivation of S. mutans: -Saliva collection devices such as saliva collection spitz (material and shape are not particularly limited as long as they are sterilized and can be collected and seeded easily). -A collection device such as a dropper capable of collecting about 10 ⁇ l of saliva. -S. mutans selective medium (special medium A). For example, MSB agar medium (Mitis-salivarius agar medium (Difco Laboratories, etc.) and antibiotics (for example, bacitracin (SIGMA-ALDRICH, etc.)) and sucrose (Wako Pure Chemicals, etc.) added to a sterilized substrate Coated.
  • S. mutans -Saliva collection devices such as saliva collection spitz (material and shape are not particularly limited as long as they are sterilized and can be collected and seeded easily).
  • -A collection device such as a dropper capable of collecting about 10 ⁇ l of saliva
  • the substrate is not particularly limited as long as it is a dish or a well plate, but typically a plate of about 24 wells (for example, 24 well with Lid MICROPLATE (IWAKI)) is used.
  • Bacitracin is preferably used at about 100 unit / ml.
  • Sucrose is preferably used at about 15%.
  • a sealing and / or deoxygenating device for culturing under anaerobic conditions, such as an anero pack or a CO 2 chamber.
  • -A sterilization stick like a toothpick or tip) to pick up fungal colonies.
  • -Liquid medium (dedicated medium B) for culturing picked colonies.
  • a disposable test tube with sterilized Brain Heart Infusion (BHI) liquid medium (Difco Laboratories).
  • the kit of the present invention may further comprise one or more of the following for detection of S. mutans: -A collection device such as a dropper that can collect about 10 ⁇ l of bacterial solution.
  • -Dedicated medium for detection of S. mutans (dedicated medium C).
  • sucrose Waako Pure Chemicals
  • BHI solution 100 ⁇ l is added to the base material.
  • the substrate is not particularly limited as long as it is a well plate or a test tube. Typically, a 96-well plate (for example, MULTI WELL PLATE for ELISA (Sumilon)) is used. Sucrose is used at about 1%.
  • -Washing solution PBS solution or sterilized water can be used, but preferably PBS solution is used
  • -Gram-positive bacteria detection reagent buffer 1: for example, a solution obtained by adding approximately 0.5% crystal violet (Wako Pure Chemicals, etc.) as gram-positive bacteria detection reagent to sterile distilled water.
  • -Mordant reagent Buffer 2: A suitable mordant reagent can be selected according to the bacteria detection reagent. For example, for crystal violet, a 7% acetic acid (Wako Pure Chemicals, etc.) solution or sterilized water can be used. (Although acetic acid solution is preferably used.)
  • the kit of the present invention may further comprise one or more of the following for detection of PA-deficient S. mutans: -Plates for detection of PA-deficient S. mutans. Although it will not specifically limit if it is a sterilized well plate, A 96 well plate (MICROTEST U-Bottom (BECTON DICKINSON) etc.) is used typically.
  • -Cleaning solution (Washing solution B: PBS solution or a solution obtained by adding about 0.05% of a surfactant such as Triton X-100 (Wako Pure Chemicals, etc.) to sterilized water.
  • a PBS solution is used.
  • Buffer 3 Tris salt buffer solution at pH 6.8, 100 mM dithiothreitol (Wako Pure Chemicals, etc.), 20% glycerin (Wako Pure Chemicals, etc.) mixed
  • -Blocking solution buffer 4: a solution obtained by adding about 5% skim milk (such as BECTON DICKINSON) to PBST solution
  • Primary antibody Buffer 5: PBST solution containing approximately 0.1% anti-PA antiserum
  • -Secondary antibody buffer 6: a solution obtained by adding about 0.1% of an antibody (eg Dakopatts) against the primary antibody host immunoglobulin to PBST
  • Buffer 7 AP (100 mM 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5 mM magnesium chloride, 100 mM sodium chloride) buffer solution with NBT solution (Wako Pure Chemical Industries) at
  • the kit of the present invention may further comprise one or more of the following for detection of CBP-bearing S. mutans: -Dedicated medium for detection of CBP-bearing S. mutans (dedicated medium D: 9: 1 of sterile distilled water supplemented with 0.6% acetic acid and type I collagen (Sigma) on the dedicated plate used in Analysis 3) (A solution mixed in proportion is added.) -Washing solution (Washing solution A: PBS solution or sterilized water can be used, but preferably PBS solution is used) -Buffer (Buffer 8: Washing solution A plus about 5% bovine albumin (Sigma)) -Washing solution (Washing solution C: PBS solution or a solution obtained by adding a surfactant such as Tween 20 (Wako Pure Chemical Industries) to about 0.01% in sterilized water.
  • a surfactant such as Tween 20 (Wako Pure Chemical Industries)
  • a PBS solution is used.
  • -Fixing solution buffer 9: for example, about 25% formaldehyde (Wako Pure Chemical Industries) added to sterile distilled water
  • -Gram-positive bacteria detection reagent for example, the above buffer 1: a solution obtained by adding about 0.5% crystal violet (Wako Pure Chemical) as gram-positive bacteria detection reagent to sterile distilled water
  • a mordant reagent for example, the above buffer 2: 7% acetic acid (Wako Pure Chemicals, etc.) solution or sterilized water can be used, but preferably an acetic acid solution is used.
  • the method for detecting a bleeding exacerbated oral bacterium according to the present invention is performed in a scheme including the following four steps as shown in FIGS. Analysis 1.
  • Culture analysis of S. mutans 2.
  • Detection of S. mutans Analysis 3.
  • Detection of PA-deficient S. mutans Analysis Detection of S. mutans possessed by CBP
  • the culture of the bacteria is performed in the following procedure using, for example, the apparatus and reagents for culturing mutans streptococci in the above-described kit.
  • the detection of S. mutans is performed in the following procedure using, for example, the instruments and reagents for detection of S. mutans in the above-described kit.
  • 10 ⁇ l of the bacterial solution cultured by the method of Analysis 1 is added to a medium (for example, the above-described dedicated medium C), and incubated at 37 ° C. for 3 hours.
  • the medium is washed three times with a washing solution (for example, the washing solution A), and then allowed to stand for about 15 minutes with the third washing solution added.
  • a buffer containing a Gram-positive bacteria staining reagent for example, the above-mentioned buffer 1 is added and left to stand for 1 minute.
  • a washing solution wash three times with a washing solution and add a buffer containing a mordant (eg, buffer 2 above).
  • a buffer containing a mordant eg, buffer 2 above.
  • S. mutans positive When the color of the medium changes, it is determined as S. mutans positive, and when there is no change in the color of the medium, it is determined as S. mutans negative.
  • a reagent in a form in which a staining reagent and a mordant are already combined may be used.
  • a coloring reagent for example, the buffer 7
  • the change in the color of the solution is observed.
  • the color of the liquid changes, it is determined as PA positive, and when the color of the liquid does not change, it is determined as PA negative.
  • a washing solution for example, the washing solution A
  • a fixing solution for example, the buffer 9
  • a washing solution for example, the buffer 9
  • a Gram-positive bacteria staining reagent for example, the above-mentioned buffer 1
  • a mordant for example, the buffer 2
  • any of the above detection methods detection is possible if the bacterial concentration is 1 CFU or more.
  • cultures such as S. sobrinus, S. sanguinis, S. oralis, S. gordonii, and S. salivarius were used as controls, and in analysis 1, no bacteria other than S. mutans and S. sobrinus grew.
  • analysis 3 it can be confirmed that bacteria other than PA-bearing S. mutans do not show a positive reaction, and in analysis 4, bacteria other than CBP-bearing S. mutans do not show a positive reaction.
  • Those skilled in the art can appropriately modify the method of the present invention according to the purpose.
  • the bacteria that are not bound to the substrate are removed by washing. Only the bacteria bound to the substrate may be detected with a Gram-positive bacteria staining reagent.
  • a primer or probe for a nucleic acid encoding PA or CBP may be used to detect whether or not the cultured bacterium has a PA or CBP gene.
  • S. mutans MT8148 strain may be used as a positive control in the detection of PA-deficient oral bacteria and / or as a negative control in the detection of CBP-carrying oral bacteria.
  • a positive control in detection of PA-deficient oral bacteria an isolated PA protein, a nucleic acid or vector containing DNA encoding PA or a fragment thereof, a cell transformed with the vector, or the like is used depending on the detection method.
  • a negative control in the detection of CBP-bearing oral bacteria a CND strain in which the gene encoding CBP of the TW295 strain is deleted, a Gram-positive bacterium that does not express CBP, and the like can also be used.
  • the present invention provides a hemostatic agent comprising an oral bacterial PA protein or a nucleic acid encoding a PA protein.
  • a hemostatic agent comprising an oral bacterial PA protein or a nucleic acid encoding a PA protein.
  • a subject is infected with a highly pathogenic bacterium that lacks PA, supplementing the PA protein or expressing PA in the subject or bacterium provides a hemostatic effect by inducing platelet aggregation.
  • the present invention also provides a method for hemostasis comprising the use of oral bacterial PA protein or nucleic acid encoding PA protein for the production of a hemostatic agent, and further comprising administering oral bacterial PA protein or nucleic acid encoding PA protein. provide.
  • the present invention provides an inhibitor of platelet aggregation by PA-expressing oral bacteria, comprising a substance that binds to oral bacterial PA protein or a nucleic acid encoding PA protein.
  • a substance that binds to oral bacterial PA protein or a nucleic acid encoding PA protein When the subject is infected with oral bacteria that express PA, the PA on the surface of the cell is blocked by a substance that binds to the PA protein, or the PA production of the cell is inhibited by a substance that inhibits the expression of the PA protein.
  • the platelet aggregation action of bacteria can be suppressed.
  • the present invention also provides the use of a substance that binds to oral bacterial PA protein or a nucleic acid encoding PA protein for the production of an inhibitor of platelet aggregation by PA-expressing oral bacteria, and further comprising oral bacterial PA protein or PA protein.
  • a method for inhibiting platelet aggregation by PA-expressing oral bacteria comprising the step of administering a substance that binds to an encoded nucleic acid.
  • the present invention provides a bleeding exacerbation inhibitor comprising a substance that binds to a nucleic acid encoding oral bacterial CBP or CBP protein.
  • a bleeding exacerbation inhibitor comprising a substance that binds to a nucleic acid encoding oral bacterial CBP or CBP protein.
  • a substance that binds to a CBP protein-encoding nucleic acid can inhibit CBP production by the cells and inhibit the cells from binding to the exposed collagen site. Therefore, the present invention also provides use of a substance that binds to a nucleic acid encoding oral bacterial CBP or CBP protein for the production of a bleeding exacerbation inhibitor, and further a substance that binds to a nucleic acid encoding oral bacterial CBP or CBP protein.
  • a method for suppressing bleeding exacerbation comprising a step of administering.
  • the present invention provides an agent for detecting a collagen-exposed site in a tissue, including oral bacteria CBP.
  • a collagen-exposed site in a tissue, including oral bacteria CBP.
  • the damaged site can be detected by using the detection agent of the present invention.
  • the detection agent of the present invention a damaged site can be detected non-invasively even in a region where it is difficult to specify a bleeding site such as the head.
  • Various labels can be attached to the detection agent for the convenience of detection.
  • the label may be any known substance, for example, any radioisotope, magnetic substance, substance that binds to the component (eg, antibody), biotin, fluorescent substance, fluorophore, chemiluminescent substance, nuclear magnetic resonance element (hydrogen , Phosphorus, sodium, fluorine, etc.) and enzymes. Therefore, the present invention also provides a method for detecting a collagen-exposed site in tissue, comprising the use of producing an agent for detecting a collagen-exposed site in tissue of oral bacteria CBP, and further, a step of administering oral bacteria CBP.
  • the present invention provides a carrier for delivering a substance to a collagen-exposed site, which contains oral bacteria CBP.
  • the hemostatic agent or other drug of the present invention for example, an antibiotic or an anti-inflammatory agent
  • the carrier may be, for example, a liposome fused to CBP protein or its collagen binding domain (CBD).
  • CBD collagen binding domain
  • the carrier of the present invention may incorporate the hemostatic agent or other agent of the present invention.
  • the carrier of the present invention may be CBP protein itself, and in this case, the therapeutic agent and CBP protein or CBD can be directly bound and used.
  • the present invention provides a bleeding treatment agent comprising oral bacterial CBP and a hemostatic agent.
  • the hemorrhage therapeutic agent of the present invention is particularly useful in a subject having low platelet sensitivity to collagen.
  • Targets with low platelet sensitivity to collagen include aplastic anemia, acute leukemia, thrombocytopenic purpura, disseminated intravascular coagulation, thrombotic thrombocytopenic purpura, systemic lupus erythematosus, asthenia gravis, storage pool Examples include subjects suffering from syndromes.
  • the bleeding treatment agent of the present invention is particularly useful in subjects suffering from diseases caused by abnormal coagulation factors such as hemophilia.
  • the CBP for use in the carrier for substance delivery to the exposed collagen site and the therapeutic agent for bleeding of the present invention is obtained by, for example, incorporating a nucleic acid construct containing a CBP gene into a suitable expression vector and expressing the CBP protein in a suitable host cell. Obtainable. Such techniques are well known in the art.
  • plasmid vectors containing CBP genes, cosmids, phages, viruses, YACs, BACs can be transformed into various nucleic acid transfer methods such as calcium phosphate method, lipofection method, Introducing into the host cell and expressing the CBP gene by the sonic introduction method, electroporation method, particle gun method, microinjection method, liposome method (for example, using cationic liposomes), competent cell method, protoplast method, etc. Can do.
  • the CBP may be a CBP positive bacterium itself or a CBP-containing component of a CBP positive bacterium. Such components can be isolated, for example, by lysis and / or homogenization of CBP positive bacteria and exposure to a substrate coated with type I collagen. When the CBP positive bacterium itself is used, the bacterium may be inactivated by a conventional method.
  • the present invention relates to a bleeding exacerbation preventive agent containing an oral bacteria removing agent.
  • an oral bacteria removing agent When bleeding exacerbated oral bacteria are detected by the method of the present invention, it is required to sterilize bleeding exacerbated oral bacteria from the subject in order to reduce the risk of bleeding exacerbation and prevent bleeding exacerbation.
  • the oral bacteria removing agent ⁇ -lactam antibacterial agents and the like can be used. Examples of ⁇ -lactam antibacterial agents include penicillin, methicillin, cephalosporin, cephamycin, carbapenem and the like.
  • the hemostatic agent, platelet aggregation inhibitor, bleeding exacerbation inhibitor, bleeding exacerbation agent, bleeding treatment agent, collagen exposed site detection agent and substance delivery carrier to the collagen exposed site of the present invention are both oral and parenteral.
  • Various routes including, but not limited to, oral, buccal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, transmucosal, transdermal, intranasal, It may be administered by routes such as intraperitoneal, intrapulmonary and intrauterine, and may be formulated into a dosage form suitable for each route of administration. Any known dosage form and formulation method can be adopted as appropriate (see, for example, Standard Pharmacology, Yoshiteru Watanabe, Nankodo, 2003, etc.).
  • dosage forms suitable for oral administration include, but are not limited to, powders, granules, tablets, capsules, solutions, suspensions, emulsions, gels, syrups, etc.
  • Suitable dosage forms include solution injections, suspension injections, emulsion injections, injections such as injections prepared at the time of use.
  • Formulations for parenteral administration can be in the form of aqueous or non-aqueous isotonic sterile solutions or suspensions.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterilized water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspending agent, surfactant, stabilizer, excipient, vehicle, Appropriate combinations with preservatives, binders and the like can be formulated into suitable unit dosage forms.
  • the amount of the active ingredient in these preparations can be appropriately set so that a dose effective for treatment can be supplied to the subject with the expected number of administrations.
  • aqueous solution for injection examples include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • alcohols specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80, HCO-50, etc. may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol or the like as a solubilizing agent.
  • buffering agents such as a phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizers, such as benzyl alcohol, phenol, antioxidant, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in a container such as an appropriate ampoule, vial, tube, bottle or pack.
  • the hemostatic agent, platelet aggregation inhibitor, bleeding exacerbation inhibitor, bleeding exacerbation agent, bleeding treatment agent, collagen exposure site detection agent and substance delivery carrier to the collagen exposure site of the present invention into the body of the subject
  • parenteral administration is preferred, local administration or intravenous administration is more preferred, and portal vein or intratumoral administration is particularly preferred.
  • the number of administration is preferably one time, but can be administered multiple times depending on the situation. Further, the administration time may be short or continuous. More specifically, the compositions of the present invention can be administered by injection or transdermally.
  • Examples of administration by injection include, for example, local injection, intravenous injection, intraarterial injection, selective intraarterial injection, intraportal injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intratumoral injection, intrathecal Examples include, but are not limited to, injection, intra-articular injection, and intraventricular injection.
  • intravenous injection or the like administration in the manner of normal blood transfusion is possible, and it is not necessary to operate the subject, and further, local anesthesia is not required, so that both the subject and the operator can be reduced in burden. Moreover, it is advantageous in that the administration operation can be performed outside the operating room.
  • the present invention relates to a method for treating bleeding, which comprises administering to the subject an effective amount of the hemostatic agent, bleeding exacerbation inhibitor, bleeding exacerbation agent and / or bleeding treatment agent.
  • the present invention also relates to a method for treating a disease state caused by platelet aggregation, comprising administering an effective amount of the platelet aggregation inhibitor to a subject. Examples of the disease state caused by platelet aggregation include thrombosis and disseminated intravascular coagulation syndrome.
  • the present invention also relates to a method for diagnosing a bleeding site, comprising administering the above-described agent for detecting a collagen exposed site to a subject.
  • the present invention relates to a method for treating a disease associated with bleeding, comprising administering to a subject an effective amount of a substance delivery carrier to the exposed collagen site.
  • the effective amount is an amount that suppresses, reduces, or prevents bleeding for the hemostatic agent, bleeding exacerbation inhibitor, and / or bleeding treatment agent
  • the platelet aggregation inhibitor is a disease caused by platelet aggregation.
  • an amount that does not cause adverse effects exceeding the benefits of administration is preferred.
  • Such an amount can be appropriately determined by an in vitro test using cultured cells or the like, or a test in a model animal such as a mouse, rat, dog or pig.
  • the specific dose of the treatment or diagnostic composition of the present invention administered in the method of treatment or diagnosis of the present invention can vary depending on various conditions relating to the subject in need of treatment, such as severity of symptoms, general health of the subject, It may be determined taking into account age, body weight, subject sex, diet, timing and frequency of administration, medications used in combination, responsiveness to treatment, compliance with treatment, etc. However, even in such cases, these methods are still within the scope of the present invention.
  • Administration routes include various routes including both oral and parenteral, such as oral, buccal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, topical, intratumoral, rectal, intraarterial, intraportal, intraventricular, Transmucosal, transdermal, intranasal, intraperitoneal, intrathecal, intraarticular, intraventricular, intrapulmonary, and intrauterine routes are included.
  • the frequency of administration varies depending on the properties of the composition used and the conditions of the subject as described above. For example, many times a day (that is, 2, 3, 4 or 5 times a day), once a day, several times It may be every day (ie every 2, 3, 4, 5, 6, 7 days, etc.), every week, every few weeks (ie every 2, 3, 4 weeks, etc.).
  • the method for treating bleeding according to the present invention in addition to the hemostatic agent, bleeding exacerbation inhibitor and / or therapeutic agent for bleeding according to the present invention, other drugs effective for the treatment of the aforementioned bleeding-related diseases can be used in combination. .
  • other drugs effective for the treatment of a disease state caused by platelet aggregation in addition to the platelet aggregation inhibitor of the present invention, other agents effective for treatment of a disease state caused by platelet aggregation can be used in combination.
  • subject in the present invention means any individual organism, preferably an animal, more preferably a mammal, more preferably a human individual.
  • BHI Brain Heart Infusion
  • Collagen binding assay Collagen binding properties of the mutant and parent strains were evaluated by a modification of the method described in reference 27 (reference 22). The results for each strain were expressed as a percentage compared to TW871 binding of 100%.
  • Platelet Aggregation Assay Platelet aggregation assay was performed using mouse whole blood by the impedance method with a platelet aggregometer (Whole-blood aggregometer C540, Baxter Ltd., Tokyo, Japan). Briefly, mice (ICR, male, 8 weeks old, weighing 35 ⁇ 40g, CLEA Japan, Inc. , Tokyo, Japan) whole blood was collected from the whole blood, various amounts (10 3, 10 5 Or 10 7 CFU) with bacterial cells for 5 minutes at 37 ° C.
  • zeta potential The cell surface charge of the test bacteria was measured using a zeta potential analyzer (ELSZ-2, Otsuka Electronics, Co., Ltd., Hirakawa, Osaka, Japan). .
  • the analyzer automatically calculates the zeta potential from the electrophoretic mobility using the Smoluchowski formula. Bacterial cells cultured overnight were washed with PBS, adjusted to 10 7 CFU, applied to an analyzer, and the zeta potential of the cells was automatically measured at 5 standard points. Results are expressed as average values.
  • the animals were euthanized 24 hours after the bacterial infection, the excised brain tissue was sliced at regular intervals, and the area of the total bleeding site from all brain sections was calculated by computer analysis according to the method described above in mm 2 units. (Reference 12, 28, DP controller, model DP70, OLYMPUS).
  • MMP-9 Matrix Metaprotease 9
  • Gelatin gel zymography was performed by a modification of the method described above (Reference 13). Briefly, tissue samples collected 24 hours after administration of the test bacteria or vehicle were treated with 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.1 with protease inhibitors. Homogenized in% SDS and 0.1% deoxycholic acid, pH 7.4 buffer. Subsequently, the sample was separated using a gelatin zymo electrophoresis kit (Cosmo Bio., Tokyo, Japan).
  • the cleaved sample was dried with t-butyl alcohol by freeze-drying equipment, adhered to the sample stage with a conductive paste so that the section was on top, and coated with osmium to provide conductivity.
  • the sample was observed with SEM.
  • Three-dimensional computed tomography bacterial membranes of bacterial cells using a transmission electron microscope were compared using three-dimensional reconstructed images prepared by TEM CT (JEM 1220: JEOL Co., Tokyo).
  • a TEM image of the bacterial cells was taken at 150,000 ⁇ magnification in increments of ⁇ 60 ° to + 60 ° in 1 ° increments.
  • Three-dimensional reconstructed CT images were created using Radon transform software. These CT images can be displayed in any direction.
  • Detection of bacteria in tissue samples Detection of infected bacteria in several organs was performed by PCR as follows. Total DNA was extracted from isolated tissues such as brain damaged hemisphere, non-injured hemisphere, lung, liver and intestine, and examined by PCR method using the following S. mutans specific primer (Reference 9). S. mutans specific primers: Forward: 5'-GGC ACC ACA ACA TTG GGA AGC TCA GTT-3 '(SEQ ID NO: 11) Reverse: 5'-GGA ATG GCC GCT AAG TCA ACA GGA T-3 '(SEQ ID NO: 12) The detection limit of bacteria was 5-50 cells in each sample.
  • each extracted tissue was compressed in sterile PBS, and the stock solution and the diluted solution were used as bacitracin (100 units / ml) which is a selective culture agar plate for S. mutans. Streaked on Mitis-Salivarius agar plates (Difco) containing Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA).
  • CBP gene-deficient strain (CND strain): Preparation of TW295CD The cnm gene fragment of TW295 strain was prepared using the following primers designed based on the entire cnm gene sequence (SEQ ID NO: 4: DDBJ accession number AB469913) encoding the CBP of TW295 strain. Amplified. cnm amplification primers: cnm1F 5'-GAC AAA GAA ATG AAA GAT GT-3 '(SEQ ID NO: 13) cnm1R 5'-GCA AAG ACT CTT GTC CCT GC-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • the amplified fragment was incorporated into pGEM-T Easy vector (Promega, Madison, Wi, USA) to prepare plasmid pTN11.
  • pTN11 was treated with the restriction enzyme BsmI, and the central part of the cnm open reading frame (Open (reading frame) was digested to prepare a plasmid pTN12 incorporating the erythromycin resistance gene fragment taken out from the plasmid pKN100.
  • PstI homologous recombination was performed on the TW295 strain by a chemical technique using horse serum. Screening of a strain (CND strain) having an erythromycin resistance gene in the center of the cnm gene was performed using an S. mutans selection medium containing erythromycin. The produced strain was confirmed by Southern hybridization and measurement of collagen binding ability.
  • PA gene deficient strain Preparation of MT8148PD In accordance with the method described in Nakano et al. Microbes Infect. 2006 8 (1): 114-21, the entire pac gene sequence encoding the PA of MT8148 strain (SEQ ID NO: 2) Using a primer based on DDBJ accession number X14490), a PD strain was prepared and confirmed by the same method as the above CND strain.
  • pac amplification primer pac-F 5'-GCG CGC ATG CTT TAT TCA GAT TTG GAG GAT-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • pac-R 5'-GCG AAA GCG CAT GCT GTG ATT TAT CGC TTC-3 '(SEQ ID NO: 16)
  • Example 2 Examination of the relationship between collagen binding activity and cerebral hemorrhage To prove the hypothesis that the administered fungus is specifically localized at the site of injury, in a mouse cerebral hemorrhage model, S. The localization of mutans was investigated. When the transfer of bacteria to each organ was examined by PCR, the transferred TW295 strain was observed only in the hemisphere on the same side as the vascular injury and was not detected in other parts of the brain or other organs. (FIGS. 5a and 5b). Furthermore, by in vivo electron microscopic observation (FIG. 5c) and optical microscopic observation (FIG.
  • CBP collagen-binding protein
  • the present inventors produced a mutant strain (TW295CND, Table 1) having a defect in the expression of collagen-binding adhesin from the TW295 strain.
  • the suppression of platelet aggregation observed in the TW295 strain was completely recovered in the TW295CND strain (FIG. 9a).
  • the present inventors administered the TW295CND strain to a mouse cerebral hemorrhage model.
  • the cerebral hemorrhage area in the mice administered with TW295CND was dramatically smaller than that administered with the TW295 strain.
  • Clear correlations were observed between collagen binding activity and bleeding area (FIG. 8c) and between collagen binding activity and the ability to inhibit platelet aggregation (FIG. 9b).
  • MT8148PD PA-deficient mutant strain derived from MT8148, which is a standard strain of S. mutans, exacerbated cerebral hemorrhage as compared to the control (FIG. 8b). This result indicates that the loss of PA expression is involved in exacerbation of cerebral hemorrhage by highly pathogenic strains expressing collagen binding proteins.
  • the surface ionic charge of platelets is one of the important factors that lead to the interaction of damaged blood vessels with exposed collagen fibers.
  • the anionic nature of the platelet surface causes an interaction with the cationic charge of collagen (References 17-19). Therefore, the ionic charge on the surface of the microbial cell that could affect the interaction with collagen was measured.
  • the average value of zeta potential (used as an indicator of cell surface ionic charge) of MT8148 cells dissolved in physiological saline was ⁇ 0.75 mV, which was almost nonionic (FIG. 11b).
  • the PA expression-deficient strain has a reduced antigenicity compared to a strain that normally expresses PA, and thus has been shown to have a longer bacteremia (Reference 21).
  • the cell surface state of a PA expression-deficient isogenic mutant (MT8148PD, Reference 21) prepared from MT8148 was measured.
  • the average value of the zeta potential of MT8148PD was much lower than that of the MT8148 strain (FIG. 11b). The presence or absence of these molecules is thought to be involved in determining the surface ionic charge of serotype k S. mutans.
  • TEM Transmission electron microscope observation
  • SEM SEM observation
  • FIG. 11d SEM observation
  • the PA expression-deficient strain prepared from the MT8148 strain showed a surface state very similar to that of the TW295 strain (FIG. 11c).
  • the structure of the bacterial membrane by TEM of ultrathin sections may change depending on the observation direction.
  • CT TEM computed tomography
  • the peptidoglycan layer of MT8148 was observed as a transparent and smooth layer in the three-dimensional TEM image (FIG. 13a), whereas the peptidoglycan layer of TW295 was opaque and the boundary was ambiguous (FIG. 13b). These results clearly show that the bacterial surface containing the peptidoglycan layer varies greatly depending on the deficiency or presence of PA, which results in an ionic charged surface state of serotype k S. mutans Yes.
  • strains having strong collagen binding properties accumulate in the exposed collagen layer, activate MMP-9, and inhibit platelet aggregation, thereby causing further bleeding. For this reason, strains with collagen binding proteins should be considered highly pathogenic strains of cerebral hemorrhage. In fact, in vivo SEM images of blood vessels on the damaged side of the damaged mouse brain showed that infectious bacteria were present but platelet aggregation did not occur.
  • Another potential cerebral hemorrhagic virulence factor is a defect in protein antigen (PA) expression.
  • PA protein antigen
  • All of the highly pathogenic strains TW295, SA53 and LJ32 were deficient in PA expression.
  • TW871 expresses the PA antigen (FIG. 7 and Table 1), so the area of cerebral hemorrhage in mice treated with the TW871 strain is compared to the area of cerebral hemorrhage in mice treated with other highly pathogenic strains. Was much smaller (Fig. 4c).
  • the PA-deficient mutant strain (MT8148PD) derived from MT8148 which is a standard strain of S. mutans, showed an exacerbation of cerebral hemorrhage compared to the control (FIG. 8b).
  • collagen is cationic under physiological conditions, and thus the surface ionic properties of bacteria are thought to be important for interaction with exposed collagen fibers.
  • PA-deficient isogenic mutants showed the lowest zeta potential value, and other PA expression-deficient strains also tended to have low zeta potential values. This indicates that PA affects the zeta potential value. Since the zeta potential value and the collagen-induced platelet aggregation rate showed a positive correlation, a strain having a low zeta potential value can also be classified as a highly pathogenic strain. From these results, the strain expressing the collagen-binding protein of S. ansmutans has a high affinity for the exposed collagen fibers, and the low level of PA expression in S.
  • identifying patients infected with highly pathogenic S. mutans strains is important for the prevention of cerebral hemorrhage.
  • the inventors have isolated CBP-expressing highly pathogenic TW295 type S. mutans from stroke patients very frequently.
  • some of these strains also caused exacerbation of cerebral hemorrhage in a mouse hemorrhagic infarct model, indicating the involvement of highly pathogenic S. mutans in the development of hemorrhagic stroke.
  • Detection Example 1 Detection of Streptococcus mutans having a cell surface structure that is a risk at the time of bleeding Materials and methods
  • Test bacteria The following bacteria were used to establish a detection system. S. mutans MT8148 (PA + / CBP-) / TW295 (PA- / CBP +) S. sobrinus B13 / 667 S. sanguinis ATCC10556 S. oralis ATCC10557 S. gordonii ATCC10558 S. salivarius HHT
  • S. mutans is cultured as follows. Collect a small amount of test subject's saliva using a saliva collection spitz. 10 ⁇ l of saliva is collected from Spitz using a special dropper, seeded on the special medium A, and cultured at 37 ° C. for 48 hours, preferably under anaerobic conditions. After culturing, it is confirmed with the naked eye that colonies of fungi have grown, and the colonies (preferably rough colonies) are picked up and added to the special medium B, and cultured at 37 ° C. for 18 hours. Used for 4. S. sobrinus, S. sanguinis, S. oralis, S. gordonii, and S. salivarius cultures are used as controls to confirm that no bacteria other than S. mutans and S. sobrinus grow in Analysis 1.
  • mutans streptococci (mutans streptococci) (operation time about 15 minutes, waiting time (bacteria culture etc.) about 3 hours)
  • the mutans streptococcus culture method of Analysis 1 above has conditions for easy growth of mutans streptococci (S. mutans / S. Sobrinus), but bacteria other than mutans streptococci having resistance to bacitracin grow. In some cases, confirmation is performed at this step.
  • Dedicated dropper capable of collecting 10 ⁇ l of bacterial solution
  • Dedicated medium C 96-well plate (eg MULTI WELL PLATE for ELISA (Sumilon)) with 1% sucrose (Wako Pure Chemicals) -containing BHI solution 100 ⁇ l)
  • Cleaning liquid A PBS solution
  • Buffer 1 Step distilled water with 0.5% crystal violet (Wako Pure Chemical Industries) added
  • Buffer 2 7% acetic acid (Wako Pure Chemicals) solution)
  • Detection is performed as follows. 10 ⁇ l of the bacterial solution cultured by the method of Analysis 1 is added to the dedicated medium C and incubated at 37 ° C. for 3 hours. After the special medium C is washed three times with the washing liquid A, it is allowed to stand for about 15 minutes with the third washing liquid A added. The washing solution A is removed and the dedicated medium C is washed once again with the washing solution A, and then 100 ⁇ l of buffer 1 is added to the dedicated medium C and left for 1 minute. Wash 3 times with Wash A and add 200 ⁇ l of Buffer 2. When the color of the medium changes, it is determined as S. mutans positive, and when there is no change in the color of the medium, it is determined as S. mutans negative.
  • Detection of PA-deficient S. mutans is performed as follows. (1) Sample preparation Buffer 100 is added to 100 ⁇ l of the bacterial solution cultured by the method of Analysis 1, and after immersing in boiling water for 10 minutes, the sample is stored frozen. (2) Detection of PA-deficient S. mutans 1) Add 100 ⁇ l of the sample prepared in (1) above to a dedicated plate and let stand at 4 ° C. overnight. 2) After washing the dedicated plate 3 times with Washing Solution B, add 100 ⁇ l of Buffer 4 and let stand at room temperature for 1 hour. 3) After washing the dedicated plate 3 times with the washing solution B, 100 ⁇ l of buffer 5 is added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • Buffer 8 washing liquid A plus 5% bovine albumin (Sigma)
  • Cleaning liquid C cleaning liquid in which 0.01% Tween 20 (Wako Pure Chemical Industries) was added to cleaning liquid A
  • Buffer 9 sterilized distilled water plus 25% formaldehyde (Wako Pure Chemical Industries)
  • Buffer 1 (same as used in Analysis 2 above)
  • Buffer 2 (same as used in Analysis 2 above)
  • Detection of S. mutans possessing CBP is performed as follows. (1) After washing the special medium D three times with the washing solution A, 200 ⁇ l of buffer 8 is added, and left at 37 ° C. for 1 hour. (2) After washing 3 times with the washing solution C, 200 ⁇ l of the bacterial solution cultured by the above method 1 is added and incubated at 37 ° C. for 2 hours. (3) After washing 3 times with the washing solution A, 200 ⁇ l of buffer 9 is added and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. (4) After washing 3 times with Washing Solution A, add 200 ⁇ l of Buffer 1 to a 96-well plate and let stand for 1 minute. (5) After washing 3 times with washing solution A, 200 ⁇ l of buffer 2 is added.
  • FIG. 11 is an example of the result of analyzing whether or not S. mutans in saliva samples (A, B and C) collected from three subjects are PA and / or CBP-bearing strains.
  • the step of Analysis 1 as a result of culturing the saliva sample on the dedicated medium A (bacitracin selective agar medium), all of A, B, and C confirmed colony formation. The formed colonies were picked up and cultured in the special medium B at 37 ° C. for 18 hours.
  • S. sobrinus, S. sanguinis, S. oralis, S. gordonii, and S. salivarius cultures were similarly cultured, and in Analysis 1, no bacteria other than S. mutans and S. sobrinus grew. It was confirmed.
  • the bacterial solution cultured in analysis 1 was added to the dedicated medium C, incubated at 37 ° C. for 3 hours, washed with washing solution A, and then stained with buffer 1 containing crystal violet. Since the buffer changed to blue-violet in the medium in which samples A and B were cultured, it was determined that S. mutans was present. In the medium in which sample C was cultured, the buffer remained transparent, so it was determined that S. mutans were not present.
  • the bacterial solution of Samples A and B cultured in Analysis 1 was boiled for 10 minutes after adding Buffer 3, and frozen and stored in a special plate (96 well plate: MICROTEST U-Bottom (BECTON DICKINSON )) And left at 4 ° C. overnight.
  • buffer 4 was added and blocked at room temperature for 1 hour, and buffer 5 containing rabbit anti-PA antiserum was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • buffer 6 containing porcine anti-rabbit immunoglobulin antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • buffer 8 containing 5% bovine albumin was added to the special medium D coated with type I collagen (Sigma) and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • Washing Solution C the bacterial solution cultured in Analysis 1 was added and incubated at 37 ° C. for 2 hours.
  • a buffer 9 containing 25% formaldehyde was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • buffer 1 was added and allowed to stand for 1 minute.
  • buffer B was added and the change in the color of the solution was observed. In the plate containing Sample A, the color of the liquid remained transparent, so it was determined that there was no S. mutans holding CBP.
  • Example 4 Optimum conditions for culturing S. mutans
  • As conditions for culture (1) culture under aerobic / anaerobic conditions, (2) antibiotic (bacitracin) concentration, and (3) nutrient (sucrose) concentration were examined.
  • FIG. 12 shows (a) 1 equivalent and (b) 5 equivalents of bacitracin in the conventional MSB medium, 1 equivalent of bacitracin, and 1 equivalent of sucrose in the regular MSB medium.
  • 3 is a graph showing the ratio of S.
  • Example 5 Sample storage period When analysis was performed using saliva after the collection, the storage period of saliva that can be used to detect pathogenic S. mutans under the optimal conditions determined in Example 4 is as follows. investigated. Fig. 13 shows that 0 to 6 months have passed since the collection of S. mutans, which was separated when saliva serially diluted with sterile saline on the day of collection was seeded on MSB agar, as 100%. It is a graph which shows the isolation

Abstract

　本発明は、試料中の口腔細菌のタンパク質抗原であるＰＡおよび／またはコラーゲン結合タンパク質であるＣＢＰを検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることにより、出血増悪口腔細菌の検出および／または出血増悪の危険性が高い対象のスクリーニングおよび／または対象における出血増悪の危険性の判定を行う方法、ならびにかかる方法に用いるための検出試薬およびキットを提供する。

Description

高病原性口腔細菌の高感度検出法
　本発明は、出血増悪を引き起こす口腔細菌を検出する方法、出血増悪の危険性が高い対象のスクリーニング方法、対象における出血増悪の危険性の判定方法、これらの方法に用いるための検出試薬およびキットに関する。
　血管の損傷による出血を伴う状態として、外傷や圧力による血管の破綻による出血、出産時の出血、脳内出血などが挙げられ、例えば脳内出血の場合、出血に伴う脳の圧迫や壊死による神経組織の損傷、またはくも膜下出血などの場合は出血により誘導される大脳血管攣縮による神経症状などにより、重度の障害を生じる可能性がある。出血の予後を改善するためには、効果的な出血の治療（止血）のみならず、出血の増悪の予防が必要であり、また、出血が増悪するリスクを診断することも重要である。
　出血を伴う疾患の診断においては、例えば、脳卒中の可能性を診断するマーカーとして、Apo C-III、血清アミロイドＡ、Apo C-I、アンチトロンビンIIIフラグメント、Apo A-Iなど（特許文献１）、脳卒中および脳損傷の予後を診断するマーカーとして、アデニレートキナーゼなどの脳虚血の脳脊髄液マーカー、β－トロンボグロブリン、血管細胞接着因子（VCAM）、ナトリウム利尿ペプチド、また、後に起こる脳血管痙攣を予測するマーカーとして、フォン・ビルブラント因子（vWF）、血管内皮増殖因子（VEGF）およびマトリクスメタロプロテアーゼ－９（MMP-9）など（特許文献２）が用いられている。しかし、これらはいずれも生体内において既に起こっている出血を検出するためのマーカーであり、出血の増悪のリスクを診断することはできない。
　したがって、出血の増悪を引き起こすリスクや、かかるリスクを有する個体を判定またはスクリーニングするための方法、および出血の増悪を予防または治療する方法の確立が必要とされている。
特表２００７－５０２４０１号公報 特表２００５－５２２６６９号公報
　したがって、本発明の課題は、出血の増悪を引き起こす原因因子を同定し、出血の増悪リスクを有する患者を迅速且つ容易に特定できるシステムを構築することにある。また、本発明の別の課題は、かかるリスクを有する個体において、出血の増悪を防止することにある
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を行う中で、特定の株のS. mutansに感染した対象において、出血が悪化するという知見を得た。本発明者らによるさらなる研究により、最も重篤な出血増悪の病原性を発揮するのは、主要な菌体表層タンパクであり分子量約１９０ｋＤａのタンパク質抗原であるＰＡ（Protein Antigen、別名PAc、SpaP、antigen I/II、antigen B、SR、IF、P1、MSL-1）を保有せず、かつ分子量約１２０ｋＤａのコラーゲン結合タンパクであるＣＢＰ（Collagen Binding Protein、別名Ｃｎｍ）を保有する菌株であるという知見を得るとともに、かかる病原性菌株が、いずれも低い細胞表面電荷を有することも見出した。S. mutansが出血に及ぼす影響についてはこれまで全く報告されておらず、S. mutansの特定の株が出血の予後を悪化させること、またＰＡおよびＣＢＰ、さらには細胞表面電荷がかかる病原性に関与しているという発見は、驚くべき結果であった。本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、ＣＢＰ陽性菌が血小板凝集抑制能を有することなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、出血増悪口腔細菌を検出する方法であって、試料中の口腔細菌のＰＡおよび／またはＣＢＰおよび／または細胞表面電荷を検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることおよび／または細胞表面電荷が陰性であることにより、出血増悪口腔細菌が存在すると判断する、前記方法に関する。
　また、本発明は、出血増悪の危険性が高い対象のスクリーニング方法であって、対象から得られた生体試料中の口腔細菌のＰＡおよび／またはＣＢＰおよび／または細胞表面電荷を検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることおよび／または細胞表面電荷が陰性であることにより、出血増悪の危険性が高いと判断する、前記方法に関する。
　あるいは、本発明は、対象における出血増悪の危険性の判定方法であって、対象から得られた生体試料中の口腔細菌のＰＡおよび／またはＣＢＰおよび／または細胞表面電荷を検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることおよび／または細胞表面電荷が陰性であることにより、前記対象において出血増悪の危険性が高いと判断する、前記方法に関する。
　また、本発明は、出血が破綻性出血である、前記いずれかの方法に関する。
　本発明はまた、口腔細菌が、Streptococcus mutansである、前記いずれかの方法に関する。
　本発明はさらに、ＰＡが、
（１）配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）（１）のポリペプチドに対して１または２以上の変異を含むが、（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
（３）配列番号２、１８、２０、２２または２４で表される核酸配列もしくはその相補配列またはその断片にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
（４）配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
からなる群より選択される、前記方法に関する。
　本発明はさらに、ＰＡが、配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、前記方法に関する。
　本発明はまた、ＣＢＰが、
（１）配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）（１）のポリペプチドに対して１または２以上の変異を含むが、（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
（３）配列番号６、１０、２８または３２で表される核酸配列もしくはその相補配列またはその断片にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
（４）配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
からなる群より選択される、前記方法に関する。
　本発明はまた、ＣＢＰが、配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、前記方法に関する。
　また、本発明は、口腔細菌のＰＡ検出剤および／またはＣＢＰ検出剤を含む、出血増悪口腔細菌の検出用試薬に関する。
　また、本発明は、出血増悪口腔細菌の検出のための、口腔細菌ＰＡ特異的抗体に関する。
　さらに、本発明は、
　ＰＡ検出試薬、および
　ＣＢＰ検出試薬
を少なくとも含む、出血増悪口腔細菌の検出および／または出血増悪の危険性が高い対象のスクリーニングおよび／または対象における出血増悪の危険性の判定のためのキットに関する。
　また、本発明は、口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸を含む、止血剤に関する。
　また、本発明は、口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸に結合する物質を含む、血小板凝集抑制剤に関する。
　また、本発明は、口腔細菌ＣＢＰまたはＣＢＰタンパク質をコードする核酸に結合する物質を含む、出血増悪抑制剤に関する。
　あるいは、本発明は、口腔細菌ＣＢＰを含む、組織におけるコラーゲン露出部位の検出剤に関する。
　また、本発明は、口腔細菌ＣＢＰを含む、コラーゲン露出部位への物質送達用担体に関する。
　本発明はまた、口腔細菌ＣＢＰおよび止血剤を含む、出血治療剤に関する。
　さらに、本発明は、コラーゲンに対する血小板の感受性が低い対象のための、上記出血治療剤に関する。
　また、本発明は、口腔細菌除去剤を含む、出血増悪予防剤に関する。
　本発明により、個体が出血増悪を引き起こすリスクを迅速且つ簡易に診断することが可能となる。また、本発明の方法により、唾液やプラークなどの容易に入手可能な生体試料を用いて、特別な分析機器を使用することなく、出血増悪の原因因子を検出することが可能となる。これにより、出血増悪のハイリスク集団を特定し、この集団に属する個体に対して原因菌の除菌や歯科衛生指導などの措置を行うことにより、出血増悪を効果的に予防することができる。
図１は、出血増悪をもたらし得るS. mutans株を唾液から検出する系のフローチャートである。 図２は、S. mutansの培養方法および検出方法のスキームである。 図３は、ＰＡ欠失S. mutansおよびＣＢＰ保有S. mutansの検出方法のスキームである。
図４は、マウスにS. mutans株を感染させ、脳出血増悪を誘導した結果を示した図である。（ａ～ｂ）脳出血を誘導し、ＰＢＳ（コントロール）またはS. mutansTW295株を投与した２４時間後のマウス脳の全体（ａ）および（ｂ）冠状スライスの代表的マクロ像である。矢頭は出血部位を示す。（ｃ）種々のS. mutans株の感染による出血面積の相違を示すグラフである。各コラムは、独立した１０～２１回の実験からの平均値±SEMを表す（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。（ｄ）出血誘導の３時間後にコントロールまたはTW295投与マウスから単離した血管損傷側半球の典型的な顕微鏡写真である。拡大像は、微小血管出血を示す。（ｅ）菌投与の２４時間後にサンプルを回収し、MMP-9活性をゼラチンゲルザイモグラフィーにより検出した。MMP-9活性は、TW295投与群の血管損傷側半球において、コントロール群に比べ一貫して高かった（Ips：脳の血管損傷側半球、Ctr：対側半球）。
図５は、投与菌の損傷血管への集積および血管周囲のコラーゲンとの相互作用を示した図である。（ａ）TW295株を感染させたマウスにおける２４時間後の各臓器において、感染菌の細胞DNAを特異的に検出するプライマーを用いたＰＣＲで検出した。各レーンのラベルは、それぞれ、M：分子マーカー（100bpラダー）、Std：陽性対照（TW295株から抽出したゲノムDNA）、Ips：脳の血管損傷側半球、Ctr：脳の対側半球である。（ｂ）損傷領域および非損傷領域から単離した組織を、S. mutansを採取するために培養ディッシュにプレーティングした。単離回収した菌数をCFU／タンパク質mgで示す。（ｃ）TW295株を投与して３時間後に摘出した脳組織から作製したサンプルにおいて観察された損傷血管と感染細菌細胞との相互作用を示す代表的なin vivo走査型電子顕微鏡画像。右のパネルは枠部の拡大像である。白矢頭は、損傷部位において、集積した菌が血管外部に漏出していることを示す。（ｄ）損傷半球における菌と血管周囲のコラーゲン線維との相互作用を示すin vivo走査型電子顕微鏡画像。白矢頭は、コラーゲン線維と相互作用している菌を示す。
図６は、損傷脳領域に集積した細菌のグラム染色による検出を示した図である。白矢頭は、集積した細菌を示す。スケールバー：２５μｍ。 図７は、コラーゲン結合タンパク質（ＣＢＰ）の存在およびタンパク質抗原（ＰＡ）の発現の病原性に対する効果をまとめた図である。
図８は、ＣＢＰを発現するS. mutansがコラーゲン結合活性および脳出血に与える効果を示した図である。（ａ）種々のS. mutans株のコラーゲン結合活性を、２ｍｇのＩ型コラーゲンと１×１０１０個の細菌細胞の一定条件下において評価した。各株についての結果を、TW871株を１００％とした場合のパーセンテージで表した。（ｂ）TW295、TW295から作製したTW295CND株、MT8141またはMT8141から作製したMT8141PD株を感染させた場合のマウスにおける出血領域の大きさ。各コラムは、１１～１６の独立した実験の平均値±SEMを表す。（ｃ）コラーゲン結合活性と合計出血面積との相関関係。
図９は、種々のS. mutans株におけるコラーゲン結合活性と血小板凝集との関係を示した図である。（ａ）種々のS. mutans株の血小板凝集活性。アッセイは、マウス全血と血小板凝集計を用いて、４μｇのコラーゲンおよび細菌細胞数１×１０７個の一定条件下において行った。各株についての結果を、コラーゲンを含むが細菌細胞を含まない場合を１００％とした場合のパーセンテージで表す。（ｂ）コラーゲン結合活性と血小板凝集との相関関係。
図１０は、種々のS. mutans株による血小板凝集に対する効果を示した図である。（ａ）種々の細胞数の標準株MT8148または病原性株TW871の添加による血小板凝集率。S. mutansの添加後にマウス全血の凝集を測定し、パーセンテージで表した。（ｂ～ｃ）５８種の臨床株における血小板凝集率を（ａ）と同じ方法により評価した。結果を、（ｂ）その血清型（ｃ；ｎ＝２０、ｅ；ｎ＝１５、ｆ；ｎ＝１０、およびｋ；ｎ＝１３）、または（ｃ）単離株のソース（口腔；ｎ＝４５、血液；ｎ＝１３）により表した。白丸および黒丸は、それぞれ口腔および血液単離株を示す。水平の太いバーは、各群の平均値を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。（ｄ）ヒト多血小板血漿を用いた血小板凝集アッセイの典型的チャート。MT8141またはTW871の細菌細胞（１０７CFU）とヒト多血小板血漿とをインキュベーションし、５分後にコラーゲン（４μｇ）を添加した。（ｅ）アラキドン酸誘導血小板凝集に対する細菌の効果。全血凝集において、コラーゲンの代わりにアラキドン酸を凝集試薬として用いた。各コラムは、８～１４の独立した実験からの平均値±ＳＥＭを表す。
図１１は、細菌細胞表面の状態の相違とコラーゲン誘導血小板凝集との関係を示した図である。（ａ）S. mutans株および血小板のコラーゲンに対する反応の走査型電子顕微鏡による代表的な所見。コラーゲンと反応させた後で、血小板画分を回収して走査型電子顕微鏡で観察した。（ｂ）S. mutans株のゼータ電位値。基準株MT8148およびそのアイソジェニック変異株MT8148PDのゼータ電位値を測定し、ｍＶで表した。さらに、７種の口腔単離株および７種の血液単離株も測定した。各コラムは、３～５の独立した実験からのデータを表す。（ｃ）細菌表面の透過型電子顕微鏡所見。（ｄ）細菌表面の走査型電子顕微鏡所見。
図１２は、血小板凝集とゼータ電位値との相関関係を示した図である。各点は、１細菌株を表す。 図１３は、細菌表面の３次元再構成画像を示した図である。ＴＥＭコンピューター断層撮影法により作成した３次元再構成画像を用いて、細菌膜を比較した。（ａ）MT8148のペプチドグリカン層は、ＴＥＭにより得られた３次元画像において透明で非常に滑らかな層として観察される。（ｂ）病原性株であるTW295の細菌表面のペプチドグリカンは、不透明でその外形が不明瞭である（矢頭）。
図１４は、ヒト脳卒中患者から単離した細菌の、コラーゲン結合活性および血小板凝集に対する効果を示した図である。（ａ）脳卒中患者から単離したS. mutans株（SMH2およびSMH4）のコラーゲン結合活性。活性は、２ｍｇのＩ型コラーゲンおよび細菌細胞数１×１０１０個の一定条件下で評価した。各株についての結果を、TW871を１００％とした場合のパーセンテージとして表す。（ｂ）脳卒中患者から単離したS. mutans株の血小板凝集活性。アッセイは、マウス全血を用いた、血小板凝集計でのインピーダンス法により、４μｇのＩ型コラーゲンおよび細菌細胞数１×１０７個の一定条件下で行った。各株についての結果を、コラーゲンを添加したが細菌細胞を添加しない条件を１００％とした場合のパーセンテージとして表す。
図１５は、脳卒中患者から単離したＣＢＰを発現するS. mutansの、脳出血に対する効果を示した図である。（ａ）脳卒中患者から単離したSMH4を投与した、脳出血発症２４時間後のマウス脳全体の代表的マクロ像。（ｂ）SMH4を投与したマウスの脳切片の代表的マクロ像。（ｃ）脳卒中患者から単離したＣＢＰを発現するS. mutans（SMH2およびSMH4）を感染させたマウス群の脳出血領域のサイズ。各コラムは、１１～１６の独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す（＊ｐ＜０．０５）。
図１６は、S. mutans細胞による脳出血増悪の想定されるメカニズムを表した模式図である。（ａ）内皮細胞損傷部位において血小板凝集により誘導される正常な止血。（ｂ）高い負の電荷を有するS. mutans細胞が、露出した正の電荷を有するコラーゲン上に集積し、コラーゲン結合タンパク質を有するS. mutans細胞は、露出コラーゲンに対して高いアフィニティーを有するため、これらの両方により、内皮細胞損傷部位においてMMP-9の活性化および血小板凝集の阻害がもたらされ、持続的な出血を引き起こす。
図１７は、マウスの中脳動脈上皮細胞に光化学的に傷害を誘導する実験プロトコルの模式図である。（ａ）仮説および実験プロトコルの模式図。（ｂ）実験手順のタイムスケジュール。
図１８は、ＰＡ欠失S. mutansおよびＣＢＰ保有S. mutansの存在を判定する分析結果の例を示した図である。 図１９は、S. mutansを培養する際の至適条件（好気条件／嫌気条件での培養、抗生物質濃度、栄養濃度）の検討結果を示すグラフである。 図２０は、病原性S. mutansを検出するために使用可能な唾液の保存期間を検討した結果を示すグラフである。
　本発明は、出血増悪口腔細菌を検出する方法を提供し、該方法は、試料中の口腔細菌のＰＡおよび／またはＣＢＰおよび／または細胞表面電荷を検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることおよび／または細胞表面電荷が陰性であることにより、出血増悪口腔細菌が存在すると判断する。
　本発明は、別の態様において、出血増悪の危険性が高い対象のスクリーニング方法を提供し、該方法は、対象から得られた生体試料中の口腔細菌のＰＡおよび／またはＣＢＰおよび／または細胞表面電荷を検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることおよび／または細胞表面電荷が陰性であることにより、出血増悪の危険性が高いと判断する。
　本発明は、さらに別の態様において、対象における出血増悪の危険性の判定方法を提供し、該方法は、対象から得られた生体試料中の口腔細菌のＰＡおよび／またはＣＢＰおよび／または細胞表面電荷を検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることおよび／または細胞表面電荷が陰性であることにより、前記対象において出血増悪の危険性が高いと判断する。
　齲蝕の主要な病原細菌である口腔細菌、ミュータンスレンサ球菌Streptococcus mutansには、４つの血清型（ｃ、ｅ、ｆおよびｋ）が公知である。S. mutansはまた、菌血症および感染性心内膜炎の起炎菌としても知られており、また、心臓弁および大動脈瘤検体からS. mutansの細菌ＤＮＡが検出されたことから、循環器疾患との関連性についても報告されている（Nakano et al., 2008, Japanese Dental Science Review, 44: 29-37）。しかしながら、S. mutansと他の疾患との関連性、例えば脳血管疾患などに与える影響については、これまで全く検討されていなかった。
　本明細書において開示する本発明者らの研究により、S. mutansのいくつかの異なる株を静脈投与すると、中大脳動脈損傷により軽度の脳出血を誘導した場合に、自発的な止血作用を阻害し、出血の増悪を引き起こすことが明らかとなった。口腔から一般的に単離されるMT8148株（血清型ｃ）（Minami et al., 1990, Oral Microbiol. Immunol., 5: 189-194）は、かかる作用を引き起こさないが、血清型ｋの中には出血増悪を引き起こす株があり、特にTW295株およびTW871株（Nakano et al., 2004, Journal of Clinical Microbiology, 42(1): 198-202）、SA53株（Nakano et al., 2007, J. Clin. Microbiol., 45: 2614-2625）、ならびにLJ32株（Nakano, K. et al., 2008, J.Dent. Res. 87: 964-968）は、著しい出血増悪を引き起こす。
　本発明者らは、これらの高病原性のS. mutans株が、主要な菌体表層タンパク質であるＰＡを欠失していることを見出した。また、本発明者らは、ＰＡを欠失する株の中でも、別の菌体表層タンパク質であるＣＢＰを保有する株の病原性が特に高いことを見出した。さらに、本発明者らは、遺伝子操作によりTW295株のＣＢＰをコードする遺伝子を欠失させた場合、TW295株のような出血増悪を示さないこと、および、MT8148株のＰＡをコードする遺伝子を欠失させた株は、出血増悪を示すことを確認し、ＣＢＰおよびＰＡがS. mutansの出血増悪作用に関与することを確認した。本発明者らはさらに、ヒト出血性脳卒中患者の口腔においてＣＢＰを保有するS. mutans株が検出されることを見出し、さらに、かかる患者から単離されたＣＢＰ保有S. mutans株が、in vivoで脳出血の増悪を引き起こすことを確認した。本発明者らはさらにまた、高病原性のS. mutans株の細胞表面電荷が陰性であることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、これらの菌体表層タンパク質および細胞表面電荷が、出血を増悪させるS. mutans株の検出のため、出血増悪の危険性が高い対象のスクリーニングのため、および対象における出血増悪の危険性の判定のための有用なマーカーとして利用できることを実証した。
　本発明の方法により検出される口腔細菌は、あらゆる出血を増悪させる可能性があるが、特に、外傷や潰瘍、動脈瘤破裂などにより血管壁に損傷が生じることにより起こる破綻性出血を増悪させるものである。破綻性出血の代表的な例としては、脳出血（脳内出血、くも膜下出血、慢性硬膜下血腫）、外傷もしくは圧力による出血、分娩後出血、疾患に関連する皮下出血などが挙げられる。また、出血傾向を生じる疾患として、結合組織異常（アレルギー性紫斑病など）、血小板の減少（播種性血管内凝固症候群、再生不良性貧血など）もしくは血小板異常（血小板無力症など）、または凝固系障害（肝臓病関連凝固異常、ビタミンＫ欠乏症など）などが挙げられる。内因性または外因性の循環抗凝固物質（ループスアンチコアグラント、VIII因子抗凝固物質など）により出血傾向を生じる場合もある。
　本明細書において、出血増悪とは、かかる内因性または外因性の要因により起こる出血に対する自発的な止血作用が、正常な対象と比較して、遅延するか、低下するか、または失われることを意味する。また、出血増悪の危険性が高い対象とは、当該対象において、内因性又は外因性の要因により出血が起こった場合に、血小板による自発的な止血作用が、正常な対象と比較して、遅延するか、低下するか、または失われる可能性が高いことを意味する。
　ＰＡ（Protein Antigen）は、S. mutansの野生株であるMT8148株において見出された約190ｋＤａの表面タンパク質であり、ＰＡｃ（Protein Antigen c）、SpaP、抗原I/II（Antigen I/II）および抗原Ｂ（Antigen B）、Ｐ１およびＭＳＬ－１などの多くの別名が公知である。ＰＡポリペプチドは、Ｎ末端側に３つのアラニンリッチな反復ドメイン（Ａ領域）、中央部に３つのプロリンリッチな反復ドメイン（Ｐ領域）を含み、Ｃ末端に細胞壁－細胞膜貫通ドメインを有し、Ａ領域が菌体の歯への付着に関与することが報告されている（Matsumoto-Nakano et al., 2008, Oral Microbiology and Immunology, 23:265-270）。また、ＰＡがS. mutansによる感染性心内膜炎に関与すること（Nakano et al., 2008, Japanese Dental Science Review, 44: 29-37）、ＰＡに対する抗体が菌体のヒドロキシアパタイト基質への付着を阻害すること（Kawato et al., 2008, Oral Microbiology and Immunology, 23:14-20）、およびＰＡに対する抗血清が齲蝕のワクチンとして有用であることが報告されている（Okahashi et al., 1989, Molecular Microbiology, 3(2): 221-228）。ＰＡのＡ領域とＰ領域との間には株間でのアミノ酸配列の変化に富む領域（例えばMT8148株では残基679～827）が存在するが、反復ドメインや細胞膜貫通ドメインは株間において保存性が高い。
　また、感染性心内膜炎の患者において多く検出される血清型ｋの株は、ＰＡを欠失している率が高く、この血清型では、菌体の疎水性が低く、食作用（貪食）に対する感受性も低いことが報告されている（Nakano et al., 2008, Journal of Dental Research, 87(10): 964-968）。
　既知のＰＡとしては、例えば血清型ｃのMT8148のＰＡ（DDBJアクセッション番号：X14490、アミノ酸：配列番号１、核酸：配列番号２）、LJ23株のＰＡ（DDBJアクセッション番号：AB364261、アミノ酸：配列番号１７、核酸：配列番号１８）、SA98株のＰＡ（DDBJアクセッション番号：AB364285、アミノ酸：配列番号１９、核酸：配列番号２０）の他、antigen I/IIのspaP遺伝子（DDBJアクセッション番号：X17390、Kelly et al., 1989, FEBS Lett. 258(1), 127-132、アミノ酸：配列番号２１、核酸：配列番号２２）、髄膜炎菌Neisseria meningitidisの鉄結合タンパク質fbp遺伝子（X53469、Berish et al., 1990, Nucleic Acid Research, 18(15): 4596-4596、アミノ酸：配列番号２３、核酸：配列番号２４）などが知られている。
　S. mutansの別のアンカータンパク質であるＣＢＰ（Ｃｎｍとも記載される）は、分子量約１２０ｋＤａのＩ型コラーゲン結合タンパク質であり、コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ、残基152～316）、Ｂ反復ドメイン（残基328～455）およびLPXTGモチーフ（残基507～511）を有する（Sato et al., 2004, Journal of Dental Research, 83(7): 534-539）。S. mutansのＣＢＰ遺伝子保有頻度は、約１０～２０％であり、ＣＢＰ陽性株は血清型ｆおよびｋにおいて主に発現する（Nakano et al., 2007, J. Clin. Microbiol., 45: 2616-2625）。
　本発明者らの研究により、血清型ｋのTW295株のＣＢＰ（DDBJアクセッション番号：AB102689、アミノ酸：配列番号３、核酸：配列番号４）について、ＣＢＤ（アミノ酸：配列番号５、核酸：配列番号６）およびLPXTGモチーフは株間（例えばTW871、SA53、LJ32株など）での保存性が高いが、Ｂ反復ドメインの反復（リピート）の数は株によって異なることが明らかとなった（Nomura et. al., 2009, J. Med. Microbiol., 58:469-75）。
　本発明の一態様において、ＰＡは、
（１）配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）（１）のポリペプチドに対して１または２以上、好ましくは１～２０個、１～１５個、１～１０個、１または数個の変異を含むが、（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
（３）配列番号２、１８、２０、２２または２４で表される核酸配列もしくはその相補配列またはその断片にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、または
（４）配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
として定義される。
　好ましくは、ＰＡは、配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。より好ましくは、ＰＡは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
　本発明の方法において用いることができるＰＡは、配列番号２、１８、２０、２２または２４で表される核酸配列（ＰＡタンパク質をコードする核酸配列）もしくはその相補配列またはその断片にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列（ＰＡタンパク質のアミノ酸配列）を含むポリペプチドと同等の機能を有する限り、１または２以上のアミノ酸の変異（欠失・置換・付加）を含むポリペプチドであってもよい。変異は、天然のものであっても、既知の任意の手法、例えば、制限酵素による核酸の切断または挿入、部位特異的変異導入、放射線もしくは紫外線の照射などにより作製されたものであってもよい。また、変異アミノ酸の数は、例えば１～２０個、１～１５個、１～１０個、１または数個であってもよい。
　また、本発明の一態様において、ＣＢＰは、
（１）配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）（１）のポリペプチドに対して１または２以上、好ましくは１～２０個、１～１５個、１～１０個、１または数個の変異を含むが、（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
（３）配列番号６、１０、２８または３２で表される核酸配列もしくはその相補配列またはその断片にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、または
（４）配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
として定義される。
　本発明の方法において用いることができるＣＢＰポリペプチドは、配列番号６、１０、２８または３２で表される核酸配列（S. mutans　TW295株、TW871株、SA53株またはLJ32株のＣＢＤをコードする核酸配列）もしくはそれらの相補配列またはその断片にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列（S. mutans　TW295株、TW871株、SA53株またはLJ32株のＣＢＤアミノ酸配列）を含むポリペプチドと同等の機能を有する限り、１または２以上、例えば、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１または数個のアミノ酸の変異（欠失・置換・付加）を含むポリペプチドであってもよい。
　例えば、ＣＢＰポリペプチドは、配列番号４、８、２６または３０で表される核酸配列（S. mutans　TW295株、TW871株（DDBJアクセッション番号AB469914）、SA53株（同AB465299）またはLJ32株（同AB465263）のＣＢＰをコードする核酸配列）もしくはそれらの相補配列またはその断片にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ配列番号３、７、２５または２９で表されるアミノ酸配列（S. mutans　TW295株、TW871株、SA53株またはLJ32株のＣＢＰタンパク質のアミノ酸配列）を含むポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチドであってもよい。
　好ましくは、ＣＢＰは、配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む。
　ＰＡまたはＣＢＰの変異体がＰＡまたはＣＢＰと同等の機能を有するか否かは、公知の手段を用いて確認することができる。例えば、ＰＡの変異体が菌体をヒドロキシアパタイト基質へ付着させる能力については、公知の方法により変異体ペプチドに対する特異的抗体を作製し、Kawato et al., 2008, Oral Microbiology and Immunology, 23:14-20に記載の方法により、該抗体菌体のヒドロキシアパタイトへの付着の阻害を判定することができる。あるいは、ＣＢＰの変異体のＩ型コラーゲンへの結合性は、Nomura et al., 2009, J. Med. Microbiol., 58(4): 469-475に記載のコラーゲン結合アッセイにより判定することができる。かかる手段により、変異体が有する機能を、適切な陰性対照や、陽性対照としてのＰＡまたはＣＢＰと比較することによって評価することができる。例えば、ある変異体において、上記の少なくとも１つの機能が陰性対照より優れている場合、例えば、１０％以上、２５％以上、５０％以上、７５％以上、さらには１００％以上優れている場合、および／または、同機能が陽性対照の１／１００以上、１／５０以上、１／２５以上、１／１０以上、１／５以上、さらには１／２以上である場合、この変異体を機能的変異体に含める。
　本発明の方法において、細菌細胞の表面電荷は、既知の任意の方法、例えば、ゼータ電位測定法などにより測定できる。ゼータ電位は、界面動電位ともいい、互いに接している固体と液体とが相対運動を行なったときに両者の界面に生じる電位差であり、細菌細胞の表面電荷を表す指標の１つとして用いることができる。ゼータ電位は、細菌細胞の電気泳動移動度からSmoluchowskiの公式：
ζ＝ηｕ／ε０εｒ
式中、ζはゼータ電位、ηは溶媒の粘度、ｕは電気泳動移動度、ε０は真空の誘電率、εｒは溶媒の誘電率を示す、
で求めることができる。ゼータ電位測定に適した電気泳動法としては、泳動する細菌細胞の速度を測定できるものであれば特に限定されず、例えば、キャピラリー電気泳動法、顕微鏡電気泳動法、回転回折格子法、レーザー・ドップラー電気泳動法などが挙げられる。
　本発明の方法においては、細菌細胞の表面電荷が陰性であることが、高病原性口腔細菌の指標となり、出血増悪口腔細菌の存在および出血増悪の危険性の判定基準となる。すなわち、損傷血管内に露出しているコラーゲン線維は正電荷を有するところ、細菌細胞の表面電荷が陰性であると、細菌細胞が露出しているコラーゲン線維と相互作用し易くなり、血小板凝集抑制等による出血の増悪をもたらす。典型的には、ゼータ電位として測定した表面電荷が-1.0mV以下、より好ましくは-3.0mV以下、さらに好ましくは-4.0mV以下、より一層好ましくは-5.0mV以下、特に好ましくは-8.0mV以下である場合に、口腔細菌が高病原性であると判断する。
　上記の本発明の方法において、口腔細菌のＰＡ、ＣＢＰおよび細胞表面電荷は、そのそれぞれを単独で用いても、組み合わせて用いてもよい。したがって、ＰＡのみ、ＣＢＰのみ、または細胞表面電荷のみを検出しても、ＰＡ、ＣＢＰおよび細胞表面電荷の任意の組合わせ、すなわち、ＰＡとＣＢＰの両方、ＰＡと細胞表面電荷の両方、ＣＢＰと細胞表面電荷の両方、または、ＰＡ、ＣＢＰおよび細胞表面電荷の全てを検出してもよい。また、判断基準も、上記検出項目に合わせて、ＰＡが検出されないこと、ＣＢＰが検出されることおよび細胞表面電荷が陰性であることのそれぞれを単独で用いても、組み合わせて用いてもよい。
　出血増悪口腔細菌として同定される主な菌としては、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）、ストレプトコッカス・クリセツス（Streptococcus cricetus）、ストレプトコッカス・ラッタス（Streptococcus rattus）、ストレプトコッカス・ダウネイ（Streptococcus downei）、などのミュータンス連鎖球菌（mutans streptococci）、ストレプトコッカス・サンギニス（Streptococcus sanguinis）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）、などが挙げられる。特に、S. mutansのTW295株、TW871株、SA53株、およびLJ32株は、重篤な出血増悪を引き起こす。
　出血増悪を引き起こし得る他の細菌のスクリーニングは、ＮＣＢＩのGenBank（登録商標）、ＤＤＢＪ（DNA Data Bank of Japan：日本DNAデータバンク、http://www.ddbj.nig.ac.jp/）、ＥＭＢＬなどのデータベース、およびBLASTなどの一般に公開された公衆が利用可能な検索ツールを利用して行うことができる。
　本発明は、一態様において、口腔細菌のＰＡ検出剤および／またはＣＢＰ検出剤を含む、出血増悪口腔細菌の検出用試薬を提供する。
　一態様において、ＰＡ検出剤は、口腔細菌ＰＡ特異的抗体を含む。本発明者らにより開発されたＰＡ特異的抗体を用いて、高病原性のS. mutansの存在または非存在を、迅速且つ容易に検出することができる。ＰＡ特異的抗体は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその免疫原性断片によって誘導される抗体またはそのフラグメントである。あるいは、ＰＡ特異的抗体は、配列番号１、１７、１９、２１または２３のアミノ酸配列に対し、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ配列番号１、１７、１９、２１または２３のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有するポリペプチドによって誘導される抗体またはそのフラグメントであってもよい。例えば、上記ポリペプチドを含むリコンビナントＰＡ（例えば、Nakano et al., 2006, Microbes and Infection, 8:114-121を参照）を抗原として、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を得ることができる。
　一態様において、ＣＢＰ検出剤は、Ｉ型コラーゲンによりコートされた基材（マイクロプレート、試験管、スライドグラスなど）を含む。ＣＢＰのＩ型コラーゲンへの結合性（Nomura et al., 2009, J. Med. Microbiol., 58(4): 469-475）を利用して、ＣＢＰを発現する菌体をＩ型コラーゲンによりコートされた基材へ付着させ、容易に検出することができる。
　別の態様において、ＣＢＰ検出剤は、口腔細菌のＣＢＰに対する特異的抗体を含む。ＣＢＰ特異的抗体は、ＣＢＰのコラーゲン結合ドメインに対する特異的抗体であってもよく、好ましくは、配列番号５、９、２７または３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその免疫原性断片によって誘導される抗体またはそのフラグメントである。あるいは、ＣＢＰ特異的抗体は、配列番号５、９、２７または３１のアミノ酸配列に対し、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有し、かつ配列番号５、９、２７または３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する抗体産生を誘導する免疫原性を有するポリペプチドによって誘導される抗体またはそのフラグメントであってもよい。
　本発明において、抗体のフラグメントは、例えば限定されずに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ（ジスルフィド安定化Ｖ領域断片）、およびＣＤＲ含有断片などの種々の機能的断片を含む。
　本発明は一態様において、出血増悪口腔細菌の検出および／または出血増悪の危険性が高い対象のスクリーニングおよび／または対象における出血増悪の危険性の判定のためのキットを提供する。キットは、ＰＡ検出試薬およびＣＢＰ検出試薬を少なくとも含む。
　一態様において、キットは、ＰＡ検出試薬として、口腔細菌ＰＡ特異的抗体を含む。
　一態様において、キットは、ＣＢＰ検出試薬として、Ｉ型コラーゲンによりコートされた基材（マイクロプレート、試験管、スライドグラスなど）を含む。
　別の態様において、キットは、ＣＢＰ検出試薬として、ＣＢＰ特異的抗体を含む。
　本発明のキットは、S. mutansの培養のための以下の１または２以上をさらに含んでもよい：
　－　唾液採取スピッツなどの唾液採取用器具（滅菌で採取および播種しやすいものであれば材質や形状は特に限定されない）。
　－　唾液を１０μｌ程度採取することができるスポイトなどの採取器具。
　－　S. mutans選択培地（専用培地Ａ）。例えば、滅菌基材に、ＭＳＢ寒天培地（Mitis-salivarius寒天培地（Difco Laboratoriesなど）に抗生物質（例えば、バシトラシン（SIGMA-ALDRICHなど））とスクロース（和光純薬など）とを添加したもの）をコートしたもの。基材は、ディッシュやウェルプレートであれば特に限定されないが、典型的には、24ウェル程度のプレート（例えば24 well with Lid MICROPLATE（IWAKI）など）を用いる。バシトラシンは、好ましくは約100 unit／ｍｌで用いる。スクロースは、好ましくは約15％で用いる。
　－　アネロパックやＣＯ２チャンバーなどの、嫌気条件下において培養を行うための密封および／または脱酸素装置。
　－　菌のコロニーをピックアップするための、滅菌棒（つまようじやチップのようなもの）。
　－　ピックアップしたコロニーを培養するための液体培地（専用培地Ｂ）。例えば、ディスポーサブルの試験管に、滅菌したBrain Heart Infusion（ＢＨＩ）液体培地（Difco Laboratories）を加えたもの。
　本発明のキットは、S. mutansの検出のための以下の１または２以上をさらに含んでもよい：
　－　菌液を１０μｌ程度採取できるスポイトなどの採取器具。
　－　S. mutans検出のための専用培地（専用培地Ｃ）。例えば、基材に、スクロース（和光純薬）含有ＢＨＩ溶液１００μｌを添加したもの。基材は、ウェルプレートや試験管などであれば特に限定されないが、典型的には、96ウェルプレート（例えばMULTI WELL PLATE for ELISA（スミロン）など）を用いる。スクロースは、約１％で用いる。
　－　洗浄液（洗浄液Ａ：ＰＢＳ溶液または滅菌水を用いることができるが、好ましくはＰＢＳ溶液を用いる。）
　－　グラム陽性菌検出試薬（バッファー１：例えば、滅菌蒸留水にグラム陽性菌検出試薬として約0.5％のクリスタルバイオレット（和光純薬など）を加えた溶液）。
　－　媒染試薬（バッファー２：前記菌検出試薬に応じて好適な媒染試薬を選択することができる。例えばクリスタルバイオレットに対しては、７％酢酸（和光純薬など）溶液または滅菌水を用いることができるが、好ましくは酢酸溶液を用いる。）
　本発明のキットは、ＰＡ欠失S. mutansの検出のための以下の１または２以上をさらに含んでもよい：
　－　ＰＡ欠失S. mutansの検出のためのプレート。滅菌のウェルプレートであれば特に限定されないが、典型的には96ウェルプレート（MICROTEST U-Bottom（BECTON DICKINSON）など）を用いる。
　－　洗浄液（洗浄液Ｂ：ＰＢＳ溶液または滅菌水にTriton X-100（和光純薬など）などの界面活性剤を約0.05％添加した溶液。好ましくはＰＢＳ溶液を用いる。）
　－　バッファー（バッファー３：ｐＨ6.8のトリス塩緩衝液、100ｍＭ　ジチオスレイトール（和光純薬など）、20％グリセリン（和光純薬など）を混合したもの。）
　－　ブロッキング液（バッファー４：ＰＢＳＴ溶液にスキムミルク（BECTON DICKINSONなど）を約５％加えた溶液。）
　－　一次抗体（バッファー５：ＰＢＳＴに抗ＰＡ抗血清を約0.1％添加した溶液）
　－　二次抗体（バッファー６：ＰＢＳＴに一次抗体宿主の免疫グロブリンに対する抗体（Dakopattsなど）を約0.1％添加した溶液。）
　－　発色試薬（バッファー７：ＡＰ（１００ｍＭ　２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール、５ｍＭ　塩化マグネシウム、１００ｍＭ　塩化ナトリウム）緩衝液に、ＮＢＴ溶液（和光純薬）を終濃度０．６％で、ＢＣＩＰ溶液（和光純薬）を終濃度０．３３％で加えた溶液。）
　本発明のキットは、ＣＢＰ保有S. mutansの検出のための以下の１または２以上をさらに含んでもよい：
　－　ＣＢＰ保有S. mutansの検出のための専用培地（専用培地Ｄ：分析３で使用した専用プレートに、０．６％酢酸を添加した滅菌蒸留水とＩ型コラーゲン（Sigma）を ９：１の割合で混合した溶液を添加したもの。）
　－　洗浄液（洗浄液Ａ：ＰＢＳ溶液または滅菌水を用いることができるが、好ましくはＰＢＳ溶液を用いる。）
　－　バッファー（バッファー８：洗浄液Ａに約５％ウシアルブミン（Sigma）を加えたもの。）
　－　洗浄液（洗浄液Ｃ：ＰＢＳ溶液または滅菌水に約0.01％のTween 20（和光純薬）などの界面活性剤を加えた溶液。好ましくはＰＢＳ溶液を用いる。）
　－　固定液（バッファー９：例えば滅菌蒸留水に約25％のホルムアルデヒド（和光純薬）を加えたもの。）
　－　グラム陽性菌検出試薬（例えば上記バッファー１：滅菌蒸留水に、グラム陽性菌検出試薬として約0.5％のクリスタルバイオレット（和光純薬）を加えた溶液）
　－　媒染試薬（例えば上記バッファー２：７％酢酸（和光純薬など）溶液または滅菌水を用いることができるが、好ましくは酢酸溶液を用いる。）
　当業者は、上記の成分、例えば抗血清、二次抗体、ホルムアルデヒド、クリスタルバイオレットなどの濃度を、実験条件に応じて至適濃度になるように適宜調整することができる。
　本発明の出血増悪口腔細菌の検出方法は、具体的には例えば図１～３に示すように、以下の４つのステップを含むスキームにおいて行う。
　分析１．S. mutansの培養
　分析２．S. mutansの検出
　分析３．ＰＡ欠失S. mutansの検出
　分析４．ＣＢＰ保有S. mutansの検出
　分析１において、菌の培養は、例えば上述のキット中のミュータンスレンサ球菌の培養のための器具および試薬を用いて、以下の手順において行う。
　唾液採取スピッツで被験者の唾液を少量採取する。スポイトで唾液をスピッツから１０μｌ採取し、S. mutans選択寒天培地（例えば上記の専用培地Ａ）に播種して、３７℃で４８時間、好ましくは嫌気条件下において培養を行う。培養後、菌のコロニーが生えていることを肉眼で確認し、コロニーをピックアップして液体培地（例えば上記の専用培地Ｂ）に加えて、３７℃で１８時間培養し、以下の分析２、３、４に使用する。S. sobrinusがスムースコロニーを形成するのに対してS. mutansはラフコロニーを形成するので、好ましくはラフコロニーをピックアップする。
　分析２において、S. mutansの検出は、例えば上述のキット中のS. mutansの検出のための器具および試薬を用いて、以下の手順において行う。
　培地（例えば上記の専用培地Ｃ）に分析１の方法により培養した菌液を１０μｌ加えて、３７℃で３時間インキュベートする。前記培地を洗浄液（例えば上記洗浄液Ａ）で３回洗った後、３回目の洗浄液を加えた状態で約１５分静置する。洗浄液を除去し、再度前記培地を洗浄液Ａで１回洗った後、グラム陽性菌染色試薬を含むバッファー（例えば上記バッファー１）を加え、１分静置する。洗浄液で３回洗浄し、媒染剤を含むバッファー（例えば上記バッファー２）を加える。培地の色が変化した場合、S. mutans陽性と判定し、培地の色に変化がない場合、S. mutans陰性と判定する。染色試薬と媒染剤が既に組み合わされた形態の試薬を用いてもよい。
　分析３において、ＰＡ欠失S. mutansの検出は、例えば上述のキット中のＰＡ欠失S. mutansの検出のための器具および試薬を用いて、以下の手順において行う。
（１）サンプル調整
　上記分析１の方法により培養した菌液に適当なバッファー（例えば上記バッファー３）を加えて、沸騰した湯に１０分間浸漬した後、保存する場合は冷凍保存する。
（２）ＰＡ欠失S. mutansの検出
　１）上記（１）により作製したサンプルをプレートに加え、４℃で一晩静置する。
　２）プレートを洗浄液（例えば上記洗浄液Ｂ）で３回洗浄した後、スキムミルク（例えば上記バッファー４）を加え、常温で１時間静置する。
　３）プレートを洗浄液で３回洗浄した後、一次抗体（例えば上記バッファー５）を加え、常温で１時間反応させる。
　４）プレートを洗浄液で３回洗浄した後、標識二次抗体（例えば上記バッファー６）を加え、常温で１時間反応させる。
　５）プレートを洗浄液で３回洗浄した後、発色試薬（例えば上記バッファー７）を加え、適切な時間の経過後、液の色の変化を観察する。液の色が変化した場合、ＰＡ陽性と判定し、液の色が変化しない場合、ＰＡ陰性と判定する。
　分析４において、ＣＢＰ保有S. mutansの検出は、例えば上述のキット中のＣＢＰ保有S. mutansの検出のための器具および試薬を用いて、以下の手順において行う。
（１）培地（例えば上記用培地Ｄ）を洗浄液（例えば上記洗浄液Ａ）で３回洗浄した後、アルブミンを含むバッファー（例えば上記バッファー８）を加え、３７℃で１時間静置する。
（２）界面活性剤を含む洗浄液（例えば上記洗浄液Ｃ）で３回洗浄した後、上記１の方法により培養した菌液を加え、３７℃で２時間インキュベートする。
（３）洗浄液（例えば上記洗浄液Ａ）で３回洗浄した後、固定液（例えば上記バッファー９）を加え、常温で３０分静置する。
（４）洗浄液で３回洗浄した後、グラム陽性菌染色試薬（例えば上記バッファー１）を加え、１分静置する。
（５）洗浄液Ａで３回洗浄した後、媒染剤（例えば上記バッファー２）を加える。
　液の色が変化した場合、ＣＢＰ陽性と判定し、液の色が変化しない場合、ＣＢＰ陰性と判定する。
　上記いずれの検出方法においても、菌の濃度は、１ＣＦＵ以上であれば検出可能である。
　また、S. sobrinus 、S. sanguinis、S. oralis、S. gordonii、およびS. salivariusなどの培養物をコントロールとして用い、分析１ではS. mutansおよびS. sobrinus以外の菌が生育しないことを、分析３ではＰＡ保有S. mutans以外の菌が陽性反応を示さないこと、また、分析４ではＣＢＰ保有S. mutans以外の菌が陽性反応を示さないことを、それぞれ確認することができる。
　当業者は、本発明の方法を、目的に応じて適宜改変することができる。例えば、ＰＡ欠失S. mutansを検出するために、ＰＡまたはＣＢＰに対する特異的抗体を結合させた基材と、菌液を接触させた後、洗浄して基材と結合していない菌を除去し、基材に結合した菌のみを、グラム陽性菌染色試薬により検出してもよい。あるいは、ＰＡまたはＣＢＰをコードする核酸に対するプライマーまたはプローブを用いて、培養した菌がＰＡまたはＣＢＰの遺伝子を有するか否かを検出してもよい。
　本発明の好ましい態様において、ＰＡ欠失口腔細菌の検出における陽性対照として、および／または、ＣＢＰ保有口腔細菌の検出における陰性対照として、S. mutans　MT8148株を用いてもよい。ＰＡ欠失口腔細菌の検出における陽性対照として、検出方法に応じて、単離されたＰＡタンパク質、ＰＡをコードするＤＮＡまたはそのフラグメントを含む核酸もしくはベクター、該ベクターにより形質転換された細胞などを用いることもできる。また、ＣＢＰ保有口腔細菌の検出における陰性対照として、TW295株のＣＢＰをコードする遺伝子を欠失させたCND株、ＣＢＰを発現しないグラム陽性細菌などを用いることもできる。
　本発明は、一態様において、口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸を含む、止血剤を提供する。対象がＰＡを欠失する高病原性菌に感染している場合に、ＰＡタンパク質を補うか、または対象もしくは菌においてＰＡを発現させることにより、血小板凝集を誘導することによる止血効果がもたらされる。
　したがって、本発明はまた、口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸の止血剤の製造への使用、さらには、口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸を投与する工程を含む止血方法を提供する。
　本発明は、別の態様において、口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸に結合する物質を含む、ＰＡ発現口腔細菌による血小板凝集の抑制剤を提供する。対象がＰＡを発現する口腔細菌に感染している場合、ＰＡタンパク質に結合する物質により菌体表層のＰＡをブロックするか、またはＰＡタンパク質の発現を阻害する物質により菌体のＰＡ産生を阻害することにより、細菌の血小板凝集作用を抑制することができる。
　したがって、本発明はまた、口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸に結合する物質のＰＡ発現口腔細菌による血小板凝集の抑制剤の製造への使用、さらには、口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸に結合する物質を投与する工程を含む、ＰＡ発現口腔細菌による血小板凝集を抑制する方法を提供する。
　本発明は、別の態様において、口腔細菌ＣＢＰまたはＣＢＰタンパク質をコードする核酸に結合する物質を含む、出血増悪抑制剤を提供する。対象がＣＢＰを発現する出血増悪口腔細菌に感染している場合、例えばＣＢＰ特異的抗体などのＣＢＰタンパク質に結合する物質により、菌体表層のＣＢＰタンパク質をブロックし、菌体がコラーゲン露出部位（すなわち、血管内皮の損傷部位）に結合することを阻害し、これにより出血増悪を処置または予防することができる。あるいは、ＣＢＰタンパク質をコードする核酸に結合する物質（例えばsiRNA、アンチセンス核酸など）により、菌体によるＣＢＰ産生を阻害し、菌体がコラーゲン露出部位に結合することを阻害することができる。
　したがって、本発明はまた、口腔細菌ＣＢＰまたはＣＢＰタンパク質をコードする核酸に結合する物質の出血増悪抑制剤の製造への使用、さらには、口腔細菌ＣＢＰまたはＣＢＰタンパク質をコードする核酸に結合する物質を投与する工程を含む、出血増悪抑制方法を提供する。
　本発明は、別の態様において、口腔細菌ＣＢＰを含む、組織におけるコラーゲン露出部位の検出剤を提供する。血管内皮の損傷などにより結合組織のコラーゲンが露出している場合、本発明の検出剤を用いることにより、損傷部位を検出することができる。特に本発明の検出剤により、例えば頭部などの出血部位を特定することが困難な領域であっても、非侵襲的に損傷部位を検出することができる。本検出剤には、検出の便宜のために、種々の標識を付すことができる。標識は、既知の任意のもの、例えば、任意の放射性同位体、磁性体、前記成分に結合する物質（例えば抗体）、ビオチン、蛍光物質、フルオロフォア、化学発光物質、核磁気共鳴する元素(水素、リン、ナトリウム、フッ素など）および酵素などから選択することができる。
　したがって、本発明はまた、口腔細菌ＣＢＰの組織におけるコラーゲン露出部位の検出剤の製造への使用、さらには、口腔細菌ＣＢＰを投与する工程を含む、組織におけるコラーゲン露出部位の検出方法を提供する。
　また、本発明は、さらに別の態様において、口腔細菌ＣＢＰを含む、コラーゲン露出部位への物質送達用担体を提供する。本発明の止血剤または他の薬剤（例えば、抗生物質または抗炎症剤など）を前記輸送用担体に組み込み、生体に投与することにより、止血剤や薬剤を損傷部位に標的化することができ、損傷部位特異的な治療を行うことが期待される。担体は、例えば、ＣＢＰタンパク質またはそのコラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）と融合させたリポソームであってもよい。本発明の担体には、本発明の止血剤または他の薬剤を組み込んでもよい。あるいは、本発明の担体はCBPタンパク質自体であってもよく、この場合、治療剤とＣＢＰタンパク質またはＣＢＤとを直接的に結合させて用いることができる。
　本発明は、別の態様において、口腔細菌ＣＢＰおよび止血剤を含む、出血治療剤を提供する。本発明の出血治療剤は、コラーゲンに対する血小板の感受性が低い対象において、特に有用である。コラーゲンに対する血小板の感受性が低い対象として、再生不良性貧血、急性白血病、血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、血小板無力症、ストレージ・プール症候群などを罹患する対象が挙げられる。また、本発明の出血治療剤は、血友病などの凝固因子異常による疾患などを罹患する対象において、特に有用である。
　本発明のコラーゲン露出部位への物質送達用担体および出血治療剤に用いるためのＣＢＰは、例えばＣＢＰ遺伝子を含む核酸構築物を好適な発現ベクターに組み込み、好適な宿主細胞においてＣＢＰタンパク質を発現させることによって得ることができる。かかる技術は当該分野において周知であり、例えば、例えば、ＣＢＰの遺伝子を含むプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、ＹＡＣ、ＢＡＣのベクター系を、種々の核酸導入法、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、リポソーム法（例えば、カチオン性リポソームによるもの）、コンピテントセル法、プロトプラスト法などにより、宿主細胞に導入し、ＣＢＰ遺伝子を発現させることができる。また、ＣＢＰは、ＣＢＰ陽性菌自体であってもよく、ＣＢＰ陽性菌のＣＢＰ含有成分であってもよい。かかる成分は、例えば、ＣＢＰ陽性菌を溶菌および／またはホモジェナイズし、Ｉ型コラーゲンでコートした基材に曝すことにより単離することができる。ＣＢＰ陽性菌自体を用いる場合、同菌は、慣用の方法で不活化されていてもよい。
　また、本発明は、別の態様において、口腔細菌除去剤を含む、出血増悪予防剤に関する。本発明の方法により出血増悪口腔細菌が検出された場合、出血増悪の危険性を軽減し、出血増悪を予防するために、出血増悪口腔細菌を対象から除菌することが求められる。口腔細菌除去剤としては、βラクタム系抗菌薬などを用いることができる。βラクタム系抗菌薬としては、例えばペニシリン、メチシリン、セファロスポリン、セファマイシン、カルバペネムなどが挙げられる。
　本発明の止血剤、血小板凝集抑制剤、出血増悪抑制剤、出血増悪予防剤、出血治療剤、コラーゲン露出部位の検出剤およびコラーゲン露出部位への物質送達用担体等は、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、限定することなく、経口、口腔内、静脈内、筋肉内、皮下、局所、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、肺内および子宮内等の経路で投与してもよく、各投与経路に適した剤形に製剤してもよい。かかる剤形および製剤方法は任意の公知のものを適宜採用することができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年等を参照）。
　例えば、経口投与に適した剤形としては、限定することなく、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤等が挙げられ、また非経口投与に適した剤形としては、溶液性注射剤、懸濁性注射剤、乳濁性注射剤、用時調製型注射剤等の注射剤が挙げられる。非経口投与用製剤は、水性または非水性の等張性無菌溶液または懸濁液の形態であることができる。具体的には、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食 塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、適切な単位投与形態に製剤化することができる。これら製剤における有効成分量は、処置に有効な用量を想定された投与回数で対象に供給できるように適宜設定することができる。
　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助剤を含む等張液、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０等と併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプル、バイアル、チューブ、ボトル、パック等の容器に充填する。
　本発明の止血剤、血小板凝集抑制剤、出血増悪抑制剤、出血増悪予防剤、出血治療剤、コラーゲン露出部位の検出剤およびコラーゲン露出部位への物質送達用担体等の対象の体内への投与は上記いずれの経路によってもよいが、好ましくは非経口投与、より好ましくは局所投与または静脈内投与、特に好ましくは門脈内もしくは腫瘍内投与である。投与回数は１回が好ましいが、状況に応じて複数回投与することもできる。また、投与時間は短時間でも長時間持続投与でもよい。本発明の組成物は、より具体的には、注射によりまたは経皮的に投与することができる。注射による投与の例としては、例えば、局所注射、静脈内注射、動脈内注射、選択的動脈内注入、門脈内注入、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、腫瘍内注射、髄腔内注射、関節内注射、脳室内注射等によるものが挙げられるが、これらに限られない。静脈内注射等の場合、通常の輸血の要領での投与が可能となり、対象を手術する必要がなく、さらに局所麻酔も必要ないため、対象および術者双方の負担を軽減することができる。また手術室以外での投与操作が可能である点で有利である。
　さらに本発明は一態様において、対象へ上記止血剤、出血増悪抑制剤、出血増悪予防剤および／または出血治療剤の有効量を投与することを含む、出血の処置方法に関する。また、本発明は一態様において、対象へ上記血小板凝集抑制剤の有効量を投与することを含む、血小板の凝集による疾患状態の処置方法に関する。血小板の凝集による疾患状態として、血栓症、播種性血管内凝固症候群などが挙げられる。
　また、本発明は一態様において、対象へ上記コラーゲン露出部位の検出剤を投与することを含む、出血部位の診断のための方法に関する。さらに、本発明は一態様において、対象へ上記コラーゲン露出部位への物質送達用担体の有効量を投与することを含む、出血に関連する疾患の処置方法に関する。
　本発明の処置または診断の方法において、本発明の処置または診断用組成物の対象への投与は、例えば、上述の投与方法に従って好適に実施することができる。また、医師または獣医師においては、上記投与方法を適宜改変して、本発明の剤を対象へ投与することが可能である。ここで、有効量とは、上記止血剤、出血増悪抑制剤および／または出血治療剤については、出血を抑制、軽減または防止する量であり、上記血小板凝集抑制剤については、血小板の凝集による疾患状態の発症を低減し、症状を軽減し、または進行を防止する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、培養細胞等を用いたin vitro試験や、マウス、ラット、イヌまたはブタ等のモデル動物における試験により適宜決定することができる。
　本発明の処置または診断の方法において投与する本発明の処置または診断用組成物の具体的な用量は、処置を要する対象に関する種々の条件、例えば、症状の重篤度、対象の一般健康状態、年齢、体重、対象の性別、食事、投与の時期および頻度、併用している医薬、治療への反応性、および治療に対するコンプライアンス等を考慮して決定され得るため、一般的な有効量と異なることもあるが、かかる場合であっても、これらの方法はなお本発明の範囲に含まれる。
　投与経路としては、経口および非経口の両方を包含する種々の経路、例えば、経口、口腔内、静脈内、筋肉内、皮下、局所、腫瘍内、直腸、動脈内、門脈内、心室内、経粘膜、経皮、鼻内、腹腔内、髄腔内、関節内、脳室内、肺内および子宮内等の経路が含まれる。
　投与頻度は、用いる組成物の性状や、上記のような対象の条件によって異なるが、例えば、１日多数回（すなわち１日２、３、４回または５回以上）、１日１回、数日毎（すなわち２、３、４、５、６、７日毎等）、１週間毎、数週間毎（すなわち２、３、４週間毎等）であってもよい。
　また、本発明の出血の処置法においては、本発明の止血剤、出血増悪抑制剤および／または出血治療剤のほか、上述の出血関連疾患の処置に有効な他の薬剤を併用することができる。また、本発明の血小板の凝集による疾患状態の処置法においては、本発明の血小板凝集抑制剤のほか、血小板の凝集による疾患状態の処置に有効な他の薬剤を併用することができる。
　本発明における用語「対象」は、任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体である。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
材料と方法
動物実験およびヒト被験者
　本研究中の全ての動物実験は、米国国立衛生研究所（NIH）により公開される実験動物の管理と使用に関する指針（the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）に従い、大阪大学大学院歯学研究科および浜松医科大学の動物管理使用委員会の承認を得て行った。
　ヒトの試料を用いる研究プロトコルについては、大阪大学大学院歯学研究科、浜松医科大学、および市立吹田市民病院の倫理委員会による承認を受けた。全ての被験者について、本研究への参加前に、プロトコルについて説明した上で同意書への署名を得た。
S. mutans菌株および培養条件
　本研究において用いる主要なS. mutans株を表１に示す（文献１１、２１、２４、２５、２９）。さらに、５８種の臨床S. mutans株（血液から単離したもの：ｎ＝１３、口腔から単離したもの：ｎ＝４５）を、本研究において用いた。全ての株を、Brain Heart Infusion（ＢＨＩ）ブロス（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA）中で培養し、変異株の選択のためにエリスロマイシンを添加した。各アッセイ毎に細菌細胞をＰＢＳで洗浄し、希釈して細胞数を調整した。
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コラーゲン結合アッセイ
　変異株および親株のコラーゲン結合特性を、文献２７に記載される方法の変法（文献２２）により評価した。各株についての結果を、TW871の結合を１００％として、これと比較したパーセンテージとして表した。
血小板凝集アッセイ
　血小板凝集アッセイを、マウス全血を用いて、血小板凝集計（Whole-blood aggregometer C540, Baxter Ltd., Tokyo, Japan）によるインピーダンス法で行った。簡単に述べると、マウス（ＩＣＲ、オス、８週齢、体重３５～４０ｇ、CLEA Japan, Inc., Tokyo, Japan）から全血を採取し、全血と、種々の量（１０３、１０５または１０７ＣＦＵ）の細菌細胞との混合物を３７℃で５分間インキュベートした後、4.0μｇのコラーゲン（未変性コラーゲン原線維（Ｉ型）、Chrono-log Co., Havertown, PA, USA）を添加した。各株についての凝集率を、細菌細胞を添加した場合と添加しない場合とのインピーダンス（Ω）値により計算し、ビヒクル（コラーゲンのみを加えた場合）を１００％として、これに対するパーセンテージとして表した。また、５８種の臨床株および３種のMT8148のアイソジェニック変異株の血小板凝集特性を、１０７個の細菌細胞の存在下で分析した。
菌体表面電荷（ゼータ電位）の評価
　供試菌の菌体表面の電荷を、ゼータ電位分析器（ELSZ-2、Otsuka Electronics, Co., Ltd., Hirakawa, Osaka, Japan）を用いて測定した。前記分析器は、Smoluchowskiの公式を用いて、電気泳動移動度からゼータ電位を自動的に計算する。一晩培養した細菌細胞を、PBSで洗浄し、１０７ＣＦＵになるように調整し、分析器にかけ、５個の標準点で細胞のゼータ電位を自動的に測定した。結果を平均値として表す。
マウス脳動脈損傷モデル
　マウスにおいて、既述の光化学的方法の変法（文献１２、２８、図１７）を用いて、中大脳動脈の血管内皮細胞に損傷を誘導した。BALB/c系マウス（８週齢オス、体重２０～３０ｇ）に、１×１０７ＣＦＵ／マウスの供試菌懸濁液を頸静脈より感染させ、その後、Rose Bengalを投与し、熱吸収フィルターを備えたキセノンランプ（０．０４Ｗ／ｃｍ２、波長５４０ｎｍ、Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japan）とマイクロマニュピレータ上に設置した１．５ｍｍ直径の光ファイバーとを用いて、１０分間、光増感反応によって片側の中大脳動脈に損傷を与え、軽度の脳出血を発症させた。菌感染の２４時間後に動物を安楽死させ、摘出した脳組織を一定間隔ごとにスライスして、既述の方法に従い、コンピューター分析により、全ての脳切片からの総出血部位の面積をｍｍ２単位で定量化した（文献１２、２８、ＤＰコントローラ、モデルＤＰ７０、OLYMPUS）。
マトリックスメタプロテアーゼ（MMP-9）の活性化
　既述の方法の変法によりゼラチンゲルザイモグラフィーを行った（文献１３）。簡単に述べると、供試菌またはビヒクルの投与の２４時間後に回収した組織サンプルを、プロテアーゼ阻害剤を添加した、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のNonidet P-40、０．１％のＳＤＳおよび０．１％のデオキシコール酸、ｐＨ７．４の緩衝液中でホモジナイズした。次いで、ゼラチンザイモ電気泳動キット（Cosmo Bio., Tokyo, Japan）を用いて、サンプルを分離した。
in vivo電子顕微鏡観察
　脳出血誘導の３時間後に、マウスから脳組織を摘出し、脳出血領域を電子顕微鏡観察した。簡単に述べると、出血が生じた脳を、２％のグルタルアルデヒドで固定し、障壁（obstacle）の一部を含むようにカットし、１％の四酸化オスミウムで再度固定し、エタノール系列で脱水した。サンプルを凍結し、液体窒素を満たした凍結割断デバイスにより２～４片に割断した。割断面は、大脳表面に対して垂直であり、出血部位を含んでいた。割断サンプルをｔ－ブチルアルコールでフリーズドライ装置により乾燥させ、切片が上になるように伝導性のペーストを用いてサンプルステージに接着し、伝導性を与えるためにオスミウムでコートした。試料をＳＥＭで観察した。
透過型電子顕微鏡を用いた菌体の三次元コンピューター断層撮影
　細菌膜を、ＴＥＭのＣＴ（JEM 1220：JEOL Co., Tokyo）により作成した三次元再構成画像を用いて比較した。菌体のＴＥＭ画像を１５０，０００倍の倍率で、－６０°～＋６０°の傾斜範囲で１°ずつ撮影した。三次元再構成のＣＴ画像は、Radonトランスフォームソフトウェアを用いて作成した。これらのＣＴ画像は、あらゆる方向で表示することができる。
組織サンプル中の細菌の検出
　いくつかの器官における感染細菌の検出を、以下のようにＰＣＲにより行った。脳の損傷半球、非損傷半球、肺、肝臓および腸などの摘出組織から全ＤＮＡを抽出し、以下のS. mutans特異的プライマー（文献９）を用いたＰＣＲ法にて検討した。
　S. mutans特異的プライマー：
　フォワード：5’-GGC ACC ACA ACA TTG GGA AGC TCA GTT-3’（配列番号１１）
　リバース：5’-GGA ATG GCC GCT AAG TCA ACA GGA T-3’（配列番号１２）
　細菌の検出限界は、各試料において、細胞数５～５０個であった。組織中に生菌が存在することを確認するために、摘出した各組織を滅菌ＰＢＳ中で圧搾し、原液および希釈液を、S. mutans用の選択培養寒天プレートであるバシトラシン（１００単位／ｍｌ；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. USA）含有Mitis-Salivarius寒天プレート（Difco）上で画線培養した。
５．ＣＢＰ遺伝子欠損株（CND株）：TW295CDの作製
　TW295株のＣＢＰをコードするcnm遺伝子全配列（配列番号４：DDBJアクセッション番号AB469913）に基づき設計した以下のプライマーにより、TW295株のcnm遺伝子断片を増幅した。
　cnm増幅用プライマー：
　cnm1F　5’-GAC AAA GAA ATG AAA GAT GT-3’（配列番号１３）
　cnm1R　5’-GCA AAG ACT CTT GTC CCT GC-3’（配列番号１４）
　増幅された断片をpGEM-T Easyベクター（Promega, Madison, WI, USA）に組み込み、プラスミドpTN11を作製した。pTN11を制限酵素BsmIで処理し、cnmのオープンリーディングフレーム（Open reading frame）の中央部あたりを消化し、プラスミドpKN100から取り出したエリスロマイシン耐性遺伝子断片を組み込んだプラスミドpTN12を作製した。制限酵素PstIを用いて、pTN12を一本鎖にした後、馬血清を用いた化学的手法によってTW295株に相同組み換えを行った。cnm遺伝子中央部にエリスロマイシン耐性遺伝子を有する株（CND株）のスクリーニングは、エリスロマイシン含有のS. mutans選択培地を用いた。作製した株は、サザンハイブリダイゼーションとコラーゲン結合能の測定で確認した。
ＰＡ遺伝子欠損株（PD株）：MT8148PDの作製
　Nakano et al. Microbes Infect. 2006 8(1):114-21に記載の方法に従い、MT8148株のＰＡをコードするpac遺伝子全配列（配列番号２：DDBJアクセッション番号X14490）に基づいたプライマーを用いて、上記CND株と同様の方法により、PD株を作成し、確認を行った。
　pac増幅用プライマー
　pac-F 5’-GCG CGC ATG CTT TAT TCA GAT TTG GAG GAT-3’（配列番号１５）
　pac-R 5’-GCG AAA GCG CAT GCT GTG ATT TAT CGC TTC-3’（配列番号１６）
統計学的分析
　統計学的分析は、Prism 4ソフトウェア（GraphPad Software Inc., San Diego, CA., USA）により行った。Fisher's PLSD、Studentのｔ－検定、回帰分析およびANOVAを行った。ｐ＜０．０５である場合、結果を有意差があるものとみなした。
S. mutansの菌体表層タンパク質の保有頻度の統計
　2002年～2003年に大阪大学歯学部小児歯科を受診した小児患者170人から分離した170株のS. mutansについて、ＰＡおよびＣＢＰの保有頻度を調べた。また、代表的な菌株における出血増悪の悪性度を、マウス脳出血モデルにおいて判定した。
結果
例１.マウス脳出血モデルにおけるStreptococcus mutansの病原性の検討：
　脳出血発症の２４時間後の時点において、全く菌を投与しないコントロール群において、血管損傷側半球の中大脳動脈の下流において軽度の脳出血が認められた（図４ａおよび４ｂ）。この大脳出血は大脳梗塞を引き起こす（文献１２）。MT8148株を感染させた群においては、ビヒクルコントロールと比較して脳出血の悪化は認められなかった（図４ｃ）。一方、くも膜下出血患者から分離された血清型ｋのTW871株を投与した群では、脳出血の劇的な悪化が認められた（図４ｃ）。同様に、他の血清型ｋ株であるTW295、SA53またはLJ32株を感染させた群のマウスにおいても、コントロール群およびMT8148株を感染させた群と比較して有意な出血面積の増大を認めた（図４）。TW295およびSA53株は、最大の大脳出血面積の増大を引き起こした。しかし、TW295株の投与自体によっては、血圧、心拍数および脳血流には何ら変化は観察されなかった（表２、３）。顕微鏡観察により、脳出血誘導の３時間後において、TW295株を感染させたマウスにおいて明らかな出血を確認した（図４ｄ）。
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　さらに、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）－９の活性化に対するTW295株の効果を調べた。活性化されたMMP-9による血管障壁の破壊は、さらなる出血を引き起こす重要な増幅経路である（文献１２、１３）。図４ｅに示されるように、損傷したマウス脳の血管損傷側半球において、MMP-9の活性化が確認された。TW295株の投与は、コントロールと比較して、血管損傷側半球におけるMMP-9のさらなる活性化を刺激した。しかし、大脳動脈損傷のないマウスにおけるTW295株の投与は、脳出血発症の２４時間後においても、マウスの組織に何らのダメージも与えなかったことは注目すべきである（図４ａおよび４ｂ）。これらの結果から、脳血管イベントと血清型ｋの細菌の存在との両方が、脳出血の増悪に必要であることが示唆される。
例２．コラーゲン結合活性と脳出血との関係についての検討
　投与された菌が損傷部位に特異的に局在化しているという仮説を証明するために、マウス脳出血モデルにおいて、菌の投与後の損傷組織におけるS. mutansの局在を調べた。PCR法によって各臓器への菌の移行を検討したところ、投与されたTW295株は、血管損傷と同側の半球にのみ移行が観察され、脳の他の部位や他の器官においては検出されなかった（図５aおよび５ｂ）。さらに、in vivo電子顕微鏡観察（図５ｃ）および光学顕微鏡観察（図６）により、菌体が、血管内皮が損傷し、コラーゲン線維が露出している損傷半球の血管に局在していることを確認した。さらに、損傷を受けた血管において菌体とコラーゲン線維との結合を確認した（図５ｄ）。これらの結果は、投与された菌が、in vivoで、特に露出されたコラーゲン線維を介して、損傷を受けた血管と特異的に相互作用していることを示唆している。
　したがって、本発明者らは、血清型ｋのS. mutansとコラーゲン線維との直接相互作用に着目した。内皮細胞の破断により損傷された血管の表面に露出コラーゲン線維が存在し、コラーゲン線維と血小板との相互作用が血小板凝集にとって重要であることは知られている。最近になって、細胞表面の120kDaのコラーゲン結合タンパク質（ＣＢＰ、別名としてコラーゲン結合アドヘシンまたはCnmなどがある）がS. mutansにおいて同定され、そのコード遺伝子（cnm）がクローニングされて配列が明らかとなった（文献１４）。S. mutans臨床株のうちＣＢＰを有するものは約１０％であり、その分布は血清型ｋまたはｆ株において優勢である（文献１５および１６）。興味深いことに、後述するヒト脳出血症例において観察された高病原性株（TW871、TW295、SA53およびLJ32、図４ｃを参照）の全てが、この表面タンパク質を有する（図７）。実際に、in vitroでの高病原性株のコラーゲン結合活性は、MT8148株よりも劇的に高いことが示された（図８ａ）。さらに、血小板凝集もまた、in vitroで血液を高病原性菌で処理すると、MT8148株と比較して低下することも明らかとなった（図９ａ）。
　本発明者らは、TW295株から、コラーゲン結合アドヘシンの発現に欠損を有する変異株（TW295CND、表１）を作製した。TW295株において観察される血小板凝集の抑制は、TW295CND株において完全に回復した（図９ａ）。これらの結果は、TW295株のコラーゲン結合活性および血小板凝集抑制活性に、コラーゲン結合タンパク質が必要であることを示している。
　次いで、本発明者らは、TW295CND株をマウス脳出血モデルに投与した。図８ｂに示すとおり、TW295CNDを投与したマウスにおける脳出血面積は、TW295株を投与したものと比較して劇的に小さかった。コラーゲン結合活性と出血面積（図８ｃ）、およびコラーゲン結合活性と血小板凝集の阻害能（図９ｂ）との間にそれぞれ明らかな相関関係が認められた。これらの結果は、血清型ｋのS. mutansにおけるコラーゲン結合タンパク質が、この血清型の菌の脳出血における高病原性の主要な原因であることを示すものである。また、S. mutans標準株であるMT8148から誘導されたＰＡ欠損変異株（MT8148PD）は、コントロールと比較して脳出血を増悪させた（図８ｂ）。この結果は、ＰＡ発現の欠損が、コラーゲン結合タンパク質を発現する高病原性株による脳出血の増悪に関与していることを示すものである。
３．血清型ｋのS. mutansによる血小板凝集の阻害
　血小板凝集は、血管の損傷後の止血への最も重要な段階である。マウス全血を用いて、コラーゲンにより誘導される血小板凝集に対する種々の血清型のS. mutansの効果を調べた。標準株であるMT8148株は、ビヒクル対照と比較して、全血における血小板凝集阻害作用を全く示さなかった（図１０ａ）。これに対し、血清型ｋのTW871株は、１０７個の細胞を全血に添加した場合に血小板凝集の有意な阻害を示した（図１０ａ）。
　また、臨床で単離された５８種の他のS. mutans株の血小板凝集に対する作用について調査した。血清型ｋ株を添加した場合の血小板凝集率は、他の血清型のものより有意に低かった（ｐ＜０．０５；図１０ｂ）。これらのうちで、TW295株が最も強力な血小板凝集阻害を示した。興味深いことに、血液から単離された株を添加した場合の血小板凝集率は、口腔から単離された株のものよりも有意に低いことが明らかとなった（ｐ＜０．００１；図１０ｃ）。TW871株を多血小板血漿を用いた血小板凝集系に添加した場合も、同様の結果が観察された。また、マウスにTW295株を投与した後に、出血時間が長くなる傾向が観察された（データは示さず）。
　しかしながら、アラキドン酸により誘導される血小板凝集は、TW295株の投与によっては阻害されなかった（図１０ｅ）。本発明者らは、TW295株がコラーゲンを妨害し、その結果血小板凝集を阻害するという仮説を立てた。図１１ａの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像が示すとおり、コラーゲンによる刺激の後で血小板画分を回収すると、血小板の活性化をもたらす血小板とコラーゲンとの相互作用が観察された（左パネル、ビヒクル）。ビヒクル対照群において、例えば仮足や血小板の接着などの血小板凝集に関係する形態学的変化が観察された。MT8148株の添加は、対照と比較して、血小板とコラーゲンとの相互作用に何ら影響を示さなかった（図１１ａ、右パネル）。これに対し、TW295株の添加は、血小板とコラーゲンとの相互作用を明らかに抑制し、血小板の活性化の阻害をもたらすことが示された（図１１ａ、中央パネル）。これらの結果は、TW295がコラーゲンに結合することにより血小板とコラーゲンとの相互作用が阻害され、その結果凝集が阻害されることを明確に示すものである。
４．菌表面のイオン電荷の評価
　血小板の表面イオン電荷は、損傷血管の露出したコラーゲン線維との相互作用を導く重要な因子の一つである。血小板表面のアニオン性は、コラーゲンのカチオン電荷との相互作用をもたらす（文献１７～１９）。したがって、コラーゲンとの相互作用に影響を及ぼし得る菌体表面のイオン電荷を測定した。生理食塩水中に溶解したMT8148細胞のゼータ電位（細胞表面イオン電荷の指標として用いる）の平均値は、－0.75ｍＶであり、ほぼ非イオン性であった（図１１ｂ）。これに対して、TW295株およびTW871株などの血清型ｋ株のゼータ電位は、それぞれ－13.51ｍＶおよび－8.42ｍＶと、MT8148株のものよりはるかに低い値を示し、血清型ｋ株の細胞表面の条件がアニオン性であることが明らかとなった（図１１ｂ）。ゼータ電位値と血小板凝集率との回帰分析は、有意な正の相関を示した（図１２）。
　S. mutansの表面タンパク質抗原について、その齲蝕の病原因子としての役割を明らかにするために研究が行われており、190kDaのタンパク質抗原（ＰＡ）が、歯の表面への初期の付着と関連することが知られている（文献２０）。ＰＡ発現欠損株は、ＰＡを正常に発現する株と比較して抗原性が低下しており、そのため菌血症がより長期間持続することが示されている（文献２１）。MT8148から作製したＰＡ発現欠損アイソジェニック変異株（MT8148PD、文献２１）の細胞表面の状態を測定した。MT8148PDのゼータ電位の平均値は、MT8148株よりもはるかに低かった（図１１ｂ）。これらの分子の存在または不在は、血清型ｋのS. mutansの表面イオン電荷の決定に関与していると考えられる。
　透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ、図１１ｃ）およびＳＥＭ観察（図１１ｄ）により、MT8148株と、TW295株などの血清型ｋ株との間での細胞表面の顕著な違いが示された。MT8148株から作製されたＰＡ発現欠損株は、TW295株のものと非常に類似した表面状態を示した（図１１ｃ）。超薄切片のＴＥＭによる細菌膜の構造は、観察方向により変化することがある。加えて、超微細構造の観察においては、切片の厚みを考慮する必要がある。したがって、細菌膜を、ＴＥＭのコンピューター断層撮影法（ＣＴ）により再構成した３次元画像を用いて比較した。MT8148のペプチドグリカン層は、３次元ＴＥＭ画像において透明で滑らかな層として観察される（図１３ａ）のに対して、TW295のペプチドグリカン層は、不透明で境界が曖昧であった（図１３ｂ）。これらの結果は、ペプチドグリカン層を含む菌表面が、ＰＡの欠損または存在に依存して大きく異なり、これが血清型ｋのS. mutansのイオン性に荷電された表面状態をもたらすことを明確に示している。
５．ヒト脳卒中患者から単離されるS. mutans株
　ＣＢＰ遺伝子を発現するS. mutansの感染が脳卒中の危険因子であるという仮説を証明するために、口腔サンプルを用いて、脳卒中患者におけるコラーゲン結合タンパクを有するS. mutansの出現頻度を検討した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　１７症例の脳卒中患者のうち、１１症例において患者からS. mutansが単離された。このうち、５症例は、ＣＢＰ遺伝子を発現するS. mutansに感染していた（５／１１、４５．５％、表４）。これは、健常人においてコラーゲン結合タンパク保有S. mutansが検出される頻度（10％）と比較してはるかに高い。これらの結果は、ＣＢＰ遺伝子発現S. mutansの感染が脳卒中の危険因子である可能性を示唆している。
　さらに、単離されたＣＢＰ遺伝子発現S. mutansの病原性をマウスにおいて試験した。脳卒中患者から単離されたＣＢＰ発現S. mutans株のうち、コラーゲン結合活性および血小板凝集阻害活性が野生型MT8148株と比較していずれも高い２株（SMH4およびSMH6、図１４ａおよび１４ｂ）を、マウス脳出血モデルにおいて検討した。SMH4株またはSMH6株のいずれかを投与されたマウスにおいて、コントロール（野生型MT8148株）と比較して劇的な脳出血の増悪が観察された（図１５ａ、１５ｂおよび１５ｃ）。これらの結果は、脳卒中患者から単離されたS. mutans株が、脳卒中を引き起こす危険因子であることを明確に示している。
６．ＰＡおよびＣＢＰ保有株の出現頻度と出血増悪の悪性度との相関関係
　表５は、小児患者１７０人から分離した１７０株のS. mutansについて、S. mutansの菌体表層タンパク質の保有頻度を調べた結果をまとめたものである。悪性度とはマウス脳出血モデルにおける各菌株が及ぼす出血領域の面積から推定している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＰＡを発現しない株は全体の３％であり、ＣＢＰを保有しない株は全体の９０％を占めた。マウスモデルにおける各菌株が及ぼす出血領域の面積から、ＰＡを保有せずＣＢＰを保有する1.8％の株が、脳出血における悪性度が最も高いと判定し、これを悪性度100%と定義した。この定義に従い、ＰＡを発現せずＣＢＰを保有していない株（頻度＝約1.2％）、およびPAを発現しＣＢＰを保有している株（頻度＝約8.2％）の悪性度を、それぞれ約50～70％および約40～60％と判定した。この結果は、ＰＡおよびＣＢＰの遺伝子欠損株を用いた上記の実験結果と一致する。
考察
　本研究において、ＣＢＰを発現する、および／またはＰＡを発現しないS. mutansが、出血を伴う疾患、特に出血性脳卒中の潜在的危険因子であることが初めて示された。
　本研究において、血清型ｋのS. mutans株による脳出血の増悪が確認された。さらに、感染性細菌が血管損傷側半球のみにおいて同定され、対側半球には見られなかったことから、血清型ｋのS. mutansと損傷血管との相互作用が、脳出血の発症における重要なイベントであることが示された。これらの株は、共通するタンパク質発現パターンとして、コラーゲン結合タンパク質（ＣＢＰ）の発現および／またはタンパク質抗原（ＰＡ）の欠損を示し、これらは脳出血の増悪に重要であり得ることが明らかとなった（図７）。血清型ｋのS. mutansのコラーゲン結合タンパク質が脳出血の発症に関与するという本発明者らの仮説は、コラーゲン結合タンパク質欠損変異株TW295CNDが脳出血の増悪を引き起こさないという今回の結果により支持される。高病原性株TW295、TW871、SA53およびLJ32は、いずれもその表面にコラーゲン結合タンパク質を発現し、強力なコラーゲン結合特性を有する。したがって、強力なコラーゲン結合特性を有する菌株が露出したコラーゲン層に集積し、MMP-9を活性化し、血小板凝集を阻害することにより、さらなる出血を引き起こすと推測される。このため、コラーゲン結合タンパク質を有する株は、脳出血の高病原性株とみなされるべきである。実際に、損傷を受けたマウス脳の血管損傷側の血管のin vivoＳＥＭ画像により、感染細菌は存在したが、血小板凝集は生じていないことが観察された。
　別の潜在的な脳出血病原因子は、タンパク質抗原（ＰＡ）発現の欠損である。高病原性株TW295、SA53およびLJ32はいずれも、ＰＡ発現に欠損が認められた。これに対し、TW871はＰＡ抗原を発現し（図７および表１）、このため、TW871株で処置したマウスにおける脳出血の面積は、他の高病原性株で処置したマウスにおける脳出血面積と比較してはるかに小さかった（図４ｃ）。さらに、S. mutans標準株であるMT8148から誘導されたＰＡ欠損変異株（MT8148PD）は、コントロールと比較して脳出血の増悪を示した（図８ｂ）。さらに、ＰＡ発現を示さない株は、ＰＡ発現を示す株と比較して、血小板凝集率が有意に低かった（データは示さず）。これらの結果は、ＰＡ発現の欠損が、コラーゲン結合タンパク質を発現する高病原性株による脳出血の増悪に関与していることを示すものである。
　一般に、コラーゲンは、生理学的条件下においてカチオン性であり、したがって、細菌の表面イオン特性は、露出されたコラーゲン線維との相互作用にとって重要であると考えられる。実際に、ＰＡ欠損アイソジェニック変異体は、最も低いゼータ電位値を示し、他のＰＡ発現欠損株も、低いゼータ電位値をとる傾向があった。これは、ＰＡがゼータ電位値に影響を及ぼすことを示すものである。ゼータ電位値とコラーゲン誘導血小板凝集率とが正の相関を示したため、低いゼータ電位値を有する株もまた、高病原性株と分類できる。これらのことから、S. mutansのコラーゲン結合タンパク質を発現する株が、露出されたコラーゲン線維に対して高いアフィニティーを有し、また、S. mutansにおける低レベルのＰＡ発現が、細胞表面状態をアニオン性にし、これがさらにカチオン性のコラーゲン線維とのアフィニティーを増大することが考えられる。コラーゲン結合タンパク質の存在と１９０ｋＤａのタンパク質の欠損との相乗効果により、コラーゲン線維への強力な結合が生じ、コラーゲンが露出した血管への高病原性細菌の集積がもたらされる。細菌の集積は、続いて、損傷血管におけるMMP-9の活性化および血小板凝集の阻害をもたらし出血の加速および出血性梗塞を生じる（図１６）。
　S. mutansに感染した患者のうちでコラーゲン結合タンパク質を発現する株に感染した者の割合は、８～１０％と推測される（文献１６、２２）。これに対し、ＰＡは、S. mutansの殆どの株において正常に発現し、発現を示さない株はわずか４％である（文献２１）。したがって、コラーゲン結合タンパク質を発現し、ＰＡの発現に欠損を有するS. mutans株、すなわち極めて高い病原性を有する株は、非常に希少であり、S. mutans菌血症による脳出血の増悪の潜在的危険因子となる株の数は限定されている。脳出血は、発症した後ではその治療的アプローチが限られるため、予防が最も重要なアプローチであると考えられる（文献２３）。したがって、高病原性のS. mutans株に感染している患者を同定することは、脳出血の予防のために重要である。実際に、本発明者らは、ＣＢＰを発現する、高病原性TW295型のS. mutansを脳卒中患者から極めて高い頻度で単離している。さらに、かかる株のいくつかは、マウス出血性梗塞モデルにおいても脳出血の増悪を引き起こしたが、これは出血性脳卒中の発症における高病原性S. mutansの関与を示すものである。
　以上より、高病原性の脳卒中を誘導するS. mutansの感染が、脳卒中の潜在的危険因子であることが結論付けられる。脳出血の重要な病原因子は、コラーゲン結合タンパク質の存在と、ＰＡ発現の欠損であり、これらは血清型ｋの臨床単離株の多くに共通する特徴である。したがって、S. mutans株によるＰＡおよび／またはＣＢＰの保有の有無は、保菌者における出血時のリスクを判定する指標となり、脳出血の予防に役立てることができる。
検出例１．出血時のリスクとなる菌体表層構造を有するStreptococcus mutansの検出
材料と方法
供試菌：検出系の確立には以下の菌を用いた。
　S. mutans　MT8148株（PA＋／CBP－）／TW295株（PA－／CBP＋）
　S. sobrinus　B13株／6715株
　S. sanguinis　ATCC10556株
　S. oralis　ATCC10557株
　S. gordonii　ATCC10558株
　S. salivarius　HHT株
分析１．S. mutans（ミュータンスレンサ球菌）の培養方法
　（操作時間約５分、待ち時間（菌の培養など）２日）
　S. mutansの培養には以下のものを用いる：
・唾液採取スピッツ（滅菌で採取および播種しやすいものなら特に限定されない）
・唾液を１０μｌ採取することができる専用スポイト
・専用培地Ａ（寒天培地）（２４ウェルプレート(例えば、24 well with Lid MICROPLATE（IWAKI）など、２４ウェル程度のプレートであれば特に限定されない）に、Mitis-salivarius寒天培地（Difco Laboratories）にバシトラシン（100 unit／ｍｌ；SIGMA-ALDRICH）と１５％スクロース（和光純薬）とを添加したＭＳＢ寒天培地をコートしたもの。アネロパックを添付することが好ましい。）
・菌のコロニーをピックアップするための、滅菌したつまようじのようなもの
・専用培地Ｂ（液体培地）（滅菌したBrain Heart Infusion（ＢＨＩ）液体培地（Difco Laboratories）を加えたディスポーサルの試験管）
　S. mutansの培養は以下の通り行う。
　唾液採取スピッツで被験者の唾液を少量採取する。専用スポイトで唾液をスピッツから１０μｌ採取し、専用培地Ａに播種して、３７℃で４８時間、好ましくは嫌気条件下において培養を行う。培養後、菌のコロニーが生えていることを肉眼で確認し、コロニー（ラフコロニーが望ましい）をピックアップして専用培地Ｂに加えて、３７℃で１８時間培養し、以下の分析２、３、４に使用する。S. sobrinus 、S. sanguinis、S. oralis、S. gordonii、およびS. salivarius培養物をコントロールとして用い、分析１において、S. mutansおよびS. sobrinus以外の菌が生育しないことを確認する。
分析２．S. mutans（ミュータンスレンサ球菌）の検出方法
（操作時間約１５分、待ち時間（菌の培養など）約３時間）
　上記分析１のミュータンスレンサ球菌培養法は、ミュータンスレンサ球菌群（S. mutans／S. sobrinus）が生育しやすい条件を整えているが、バシトラシン耐性を有するミュータンスレンサ球菌以外の菌が生えることもあるため、このステップで確認を行う。
　検出には以下のものを用いる：
・菌液を１０μｌ採取できる専用スポイト
・専用培地Ｃ（９６ウェルプレート（例えばMULTI WELL PLATE for ELISA（スミロン））に、１％スクロース（和光純薬）含有ＢＨＩ溶液１００μｌを添加したもの）
・洗浄液Ａ（ＰＢＳ溶液）
・バッファー１（滅菌蒸留水に０．５％クリスタルバイオレット（和光純薬）を加えた溶液）
・バッファー２（７％酢酸（和光純薬）溶液）
　検出は以下の通り行う。
　専用培地Ｃに分析１の方法により培養した菌液を１０μｌ加えて、３７℃で３時間インキュベートする。専用培地Ｃを洗浄液Ａで３回洗った後、３回目の洗浄液Ａを加えた状態で約１５分静置する。洗浄液Ａを除去し、再度専用培地Ｃを洗浄液Ａで１回洗った後、１００μｌのバッファー１を専用培地Ｃに加え、１分静置する。洗浄液Ａで３回洗浄し、バッファー２を２００μｌ加える。
　培地の色が変化した場合、S. mutans陽性と判定し、培地の色に変化がない場合、S. mutans陰性と判定する。
分析３．ＰＡ欠失S. mutansの検出方法
（操作時間約３０分、待ち時間（菌の培養など）約１１時間３０分）
　ＰＡ欠失S. mutansを検出するために、以下のものを用いる：
・専用プレート（９６ウェルプレート；MICROTEST U-Bottom（BECTON DICKINSON））
・洗浄液Ｂ（分析２で使用した洗浄液ＡにTriton X-100（和光純薬）を０．０５％添加したＰＢＳＴ溶液）
・バッファー3（ｐＨ６．８のトリス塩緩衝液、１００ｍＭ　ジチオスレイトール（和光純薬）、２０％グリセリン（和光純薬）を混合したもの）
・バッファー４（ＰＢＳＴ溶液にスキムミルク（BECTON DICKINSON）を５％加えた溶液）
・バッファー５（ＰＢＳＴにウサギ抗ＰＡ抗血清（当教室保有）を０．１％添加した溶液）
・バッファー６（ＰＢＳＴにブタ抗ウサギ免疫グロブリン抗体（Dakopatts）を０．１％添加した溶液）
・バッファー７（ＡＰ（１００ｍＭ　２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－１，３－プロパンジオール、５ｍＭ　塩化マグネシウム、１００ｍＭ　塩化ナトリウム）緩衝液に、ＮＢＴ溶液（和光純薬）を終濃度０．６％で、ＢＣＩＰ溶液（和光純薬）を終濃度０．３３％で加えた溶液）
　ＰＡ欠失S. mutansの検出を以下のとおり行う。
（１）サンプル調整
　上記分析１の方法により培養した菌液１００μｌにバッファー３を加えて、沸騰した湯に１０分間浸漬した後、保存する場合は冷凍保存する。
（２）ＰＡ欠失S. mutansの検出
　１）上記（１）により作製したサンプルを専用プレートに１００μｌ加え、４℃で一晩静置する。
　２）専用プレートを洗浄液Ｂで３回洗浄した後、バッファー４を１００μｌ加え、常温で１時間静置する。
　３）専用プレートを洗浄液Ｂで３回洗浄した後、バッファー５を１００μｌ加え、常温で１時間反応させる。
　４）専用プレートを洗浄液Ｂで３回洗浄した後、バッファー６を１００μｌ加え、常温で１時間反応させる。
　５）専用プレートを洗浄液Ｂで３回洗浄した後、バッファー７を１００μｌ加え、１５分後液の色の変化を観察する。液の色が変化した場合、ＰＡ陽性と判定し、液の色が変化しない場合、ＰＡ陰性と判定する。S. sobrinus 、S. sanguinis、S. oralis、S. gordonii、およびS. salivarius培養物をコントロールとして用い、分析３においてＰＡ保有S. mutans以外の菌が陽性反応を示さないことを確認する。
分析４．ＣＢＰ保有S. mutansの検出方法
（作業時間約３０分、待ち時間（菌の培養など）約３時間３０分）
　ＣＢＰ保有S. mutansの検出には、以下のものを用いる
・専用培地Ｄ（分析３で使用した専用プレートに、０．６％酢酸を添加した滅菌蒸留水とＩ型コラーゲン（Sigma）を ９：１の割合で混合した溶液を添加したもの）
・洗浄液Ａ（上記分析２（S. mutansの検出方法）で使用しているものと同じもの）
・バッファー８（洗浄液Ａに５％ウシアルブミン（Sigma）を加えたもの）
・洗浄液C（洗浄液Ａに０．０１％　Tween 20（和光純薬）を加えたＰＢＳＴ溶液）
・バッファー９（滅菌蒸留水に２５％ホルムアルデヒド（和光純薬）を加えたもの）
・バッファー１（上記分析２で使用しているものと同じもの）
・バッファー２（上記分析２で使用しているものと同じもの）
　ＣＢＰ保有S. mutansの検出は、以下のとおり行う。
（１）専用培地Ｄを洗浄液Ａで３回洗浄した後、バッファー８を２００μｌ加え、３７℃で１時間静置する。
（２）洗浄液Ｃで３回洗浄した後、上記１の方法により培養した菌液を２００μｌ加え３７℃で２時間インキュベートする。
（３）洗浄液Ａで３回洗浄した後、バッファー９を２００μｌ加え、常温で３０分静置する。
（４）洗浄液Ａで３回洗浄した後、バッファー１を２００μｌを９６ウェルプレートに加え、１分静置する。
（５）洗浄液Ａで３回洗浄した後、バッファー２を２００μｌ加える。
　液の色が変化した場合、ＣＢＰ陽性と判定し、液の色が変化しない場合、ＣＢＰ陰性と判定する。S. sobrinus 、S. sanguinis、S. oralis、S. gordonii、およびS. salivarius培養物をコントロールとして用い、分析４においてＣＢＰ保有S. mutans以外の菌が陽性反応を示さないことを確認する。
　分析例１
　図１１は、３個体の対象から採取した唾液サンプル（Ａ、ＢおよびＣ）中のS. mutansがＰＡおよび／またはＣＢＰ保有株であるか否かを分析した結果の例である。分析１のステップにおいて、専用培地Ａ（バシトラシン選択寒天培地）で唾液サンプルを培養した結果、Ａ、ＢおよびＣのいずれも、コロニー形成を確認した。形成されたコロニーをピックアップし、専用培地Ｂ中で３７℃で１８時間培養した。また、S. sobrinus 、S. sanguinis、S. oralis、S. gordonii、およびS. salivarius培養物をコントロールとして同様の培養を行い、分析１において、S. mutansおよびS. sobrinus以外の菌が生育しないことを確認した。
　次いで、分析２のステップにおいて、分析１で培養した菌液を専用培地Ｃに加え、３７℃で３時間インキュベートし、洗浄液Ａで洗浄の後、クリスタルバイオレットを含むバッファー１で染色した。サンプルＡおよびＢを培養した培地においてバッファーが青紫色に変化したので、S. mutansが存在すると判定した。サンプルＣを培養した培地においては、バッファーは透明なままであったので、S. mutansが存在しないと判定した。
　分析３のステップにおいて、分析１で培養したサンプルＡおよびＢの菌液を、バッファー３を加えて１０分間煮沸し、冷凍保存したものを、専用プレート（９６ウェルプレート：MICROTEST U-Bottom（BECTON DICKINSON））に加え、４℃で一晩静置した。洗浄液Ｂで洗浄の後、バッファー４を加えて常温で１時間ブロッキングし、ウサギ抗ＰＡ抗血清を含むバッファー５を加えて常温で１時間反応させた。洗浄液Ｂで洗浄の後、ブタ抗ウサギ免疫グロブリン抗体を含むバッファー６を加えて常温で一時間反応させた。洗浄液Ｂで洗浄の後、アルカリホスファターゼ反応検出試薬を含むバッファー７を添加し、１５分後に液の色の変化を観察した。サンプルＡのプレートにおいては、液がピンク色に変化したので、ＰＡを保有するS. mutansが存在するものと判定した。サンプルＢについては、液の色は透明のままであったので、ＰＡを保有するS. mutansは存在しないものと判定した。S. sobrinus 、S. sanguinis、S. oralis、S. gordonii、およびS. salivarius培養物をコントロールとして同様の分析を行い、ＰＡ保有S. mutans以外の菌が陽性反応を示さないことを確認した。
　分析４のステップにおいて、Ｉ型コラーゲン（Sigma）でコートした専用培地Ｄに、５％ウシアルブミンを含むバッファー８を加えて３７℃で１時間静置した。洗浄液Ｃで洗浄の後、分析１で培養した菌液を加えて３７℃で２時間インキュベートした。洗浄液Ａで洗浄の後、２５％ホルムアルデヒドを含むバッファー９を加え、常温で３０分間静置した。洗浄液Ａで洗浄の後、バッファー１を加えて１分間静置した。洗浄液Ａで洗浄の後、バッファーＢを加えて液の色の変化を観察した。サンプルＡを含むプレートにおいては、液の色は透明のままであったので、ＣＢＰを保有するS. mutansは存在しないものと判定した。サンプルＢを含むプレートでは、液の色が青紫色に変化したので、ＣＢＰを保有するS. mutansが存在するものと判定した。S. sobrinus 、S. sanguinis、S. oralis、S. gordonii、およびS. salivarius培養物をコントロールとして同様の分析を行い、ＣＢＰ保有S. mutans以外の菌が陽性反応を示さないことを確認した。
例４．S. mutans培養の至適条件
　上記分析２～４においてより精度の高い判定を得るためには、分析１においてできるだけ多くのS. mutansを培養し、かつできるだけS. mutans以外の菌が混入していないことが重要であると考えられる。培養のための条件として、（１）好気条件／嫌気条件での培養、（２）抗生物質（バシトラシン）濃度、（３）栄養（スクロース）濃度について検討を行った。図１２は、バシトラシンを、定法のＭＳＢ培地中のバシトラシンを１当量としたときの（ａ）１当量および（ｂ）５当量で、スクロースを、定法のＭＳＢ培地中のスクロースを１当量としたときの１～４当量で、各々ＭＳＢ培地に添加した場合に分離された菌全量に対するS. mutansの割合を示すグラフである。嫌気条件下において、１当量のバシトラシンおよび１当量のスクロースを用いた場合に、最も高い濃度でS. mutansが単離できることが明らかとなった。したがって、より精度の高い判定を得るためには、密封できる容器中で嫌気条件において（例えばアネロパックを添付した密封パック中で）、通常のＭＳＢ培地中に含まれているものと同じ濃度のバシトラシン（100 unit／ｍｌ程度）およびスクロース（15％程度）を培地に添加して培養することが必要であることが明らかとなった。
例５．サンプルの保存期間
　採取後時間が経過した唾液を用いて分析を行った場合に、例４で求めた至適条件下において、病原性S. mutansを検出するために使用可能な唾液の保存期間を検討した。
　図１３は、採取した当日に滅菌生理食塩水で段階希釈した唾液をＭＳＢ寒天培地に播種した場合に分離できたS. mutansの分離率を100％として、採取してから０～６ヶ月間経過した唾液をサンプルとして分析１を行った場合のS. mutansの分離率を示すグラフである。唾液は採取後－20℃で凍結保存したものを用いた。サンプル数：Ｎ＝８、ただし１～２ヶ月前のサンプルのみＮ＝６。結果から、サンプルとする唾液は、好ましくは３ヶ月以内、好ましくは２ヶ月以内、最も好ましくは１ヶ月以内に使用することが望ましいと考えられる。
　本明細書において使用したタンパク質、ポリペプチドおよび核酸などの配列については、添付の配列表に以下の通り記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　参考文献一覧
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009

Claims (20)

  1. 　出血増悪口腔細菌を検出する方法であって、試料中の口腔細菌のＰＡおよび／またはＣＢＰおよび／または細胞表面電荷を検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることおよび／または細胞表面電荷が陰性であることにより、出血増悪口腔細菌が存在すると判断する、前記方法。
  2. 　出血増悪の危険性が高い対象のスクリーニング方法であって、対象から得られた生体試料中の口腔細菌のＰＡおよび／またはＣＢＰおよび／または細胞表面電荷を検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることおよび／または細胞表面電荷が陰性であることにより、出血増悪の危険性が高いと判断する、前記方法。
  3. 　対象における出血増悪の危険性の判定方法であって、対象から得られた生体試料中の口腔細菌のＰＡおよび／またはＣＢＰおよび／または細胞表面電荷を検出することを含み、ＰＡが検出されないことおよび／またはＣＢＰが検出されることおよび／または細胞表面電荷が陰性であることにより、前記対象において出血増悪の危険性が高いと判断する、前記方法。
  4. 　出血が破綻性出血である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　口腔細菌が、Streptococcus mutansである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　ＰＡが、
    （１）配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    （２）（１）のポリペプチドに対して１または２以上の変異を含むが、（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
    （３）配列番号２、１８、２０、２２または２４で表される核酸配列もしくはその相補配列またはその断片にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
    （４）配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
    からなる群より選択される、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　ＰＡが、配列番号１、１７、１９、２１または２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　ＣＢＰが、
    （１）配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
    （２）（１）のポリペプチドに対して１または２以上の変異を含むが、（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
    （３）配列番号６、１０、２８または３２で表される核酸配列もしくはその相補配列またはその断片にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
    （４）配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ（１）のポリペプチドと同等の機能を有するポリペプチド、
    からなる群より選択される、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  9. 　ＣＢＰが、配列番号５、９、２７または３１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　口腔細菌のＰＡ検出剤および／またはＣＢＰ検出剤を含む、出血増悪口腔細菌の検出用試薬。
  11. 　出血増悪口腔細菌の検出のための、口腔細菌ＰＡ特異的抗体。
  12. 　ＰＡ検出試薬、および
    　ＣＢＰ検出試薬
    を少なくとも含む、出血増悪口腔細菌の検出および／または出血増悪の危険性が高い対象のスクリーニングおよび／または対象における出血増悪の危険性の判定のためのキット。
  13. 　口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸を含む、止血剤。
  14. 　口腔細菌ＰＡタンパク質またはＰＡタンパク質をコードする核酸に結合する物質を含む、ＰＡ発現口腔細菌による血小板凝集抑制剤。
  15. 　口腔細菌ＣＢＰまたはＣＢＰタンパク質をコードする核酸に結合する物質を含む、出血増悪抑制剤。
  16. 　口腔細菌のＣＢＰを含む、組織におけるコラーゲン露出部位の検出剤。
  17. 　口腔細菌のＣＢＰを含む、コラーゲン露出部位への物質送達用担体。
  18. 　口腔細菌のＣＢＰおよび止血剤を含む、出血治療剤。
  19. 　コラーゲンに対する血小板の感受性が低い対象のための、請求項１８に記載の出血治療剤。
  20. 　口腔細菌除去剤を含む、出血増悪予防剤。
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