WO2010079802A1 - ヒトｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの一部の配列を用いてＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３依存的に任意の遺伝子を発現させる方法、及びそれらの転写誘導能を抑制又は測定する方法 - Google Patents

ヒトｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの一部の配列を用いてＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３依存的に任意の遺伝子を発現させる方法、及びそれらの転写誘導能を抑制又は測定する方法 Download PDF

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts

Definitions

  • the present invention relates to a method for expressing any gene in a C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ or p53-dependent manner, and to suppress or measure the transcriptional induction ability of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ or p53 On how to do.
  • the p53 gene is a gene in which mutations and deletions are observed most frequently in human multiple cancer tissues and cancer cells (see, for example, Non-Patent Document 1 below). Since cancer frequently occurs in patients with Li-Fraumeni syndrome and p53 knockout mice having a mutated p53 gene, abnormalities in the p53 gene are considered to be closely related to the development and progression of cancer (for example, the following non- (See Patent Documents 2 and 3).
  • p53 comprises an N-terminal region containing a transcriptional activity regulatory domain, a DNA-binding region involved in DNA binding, and a C-terminal region containing a tetramer-forming domain.
  • the mutation observed in cancer cells is a DNA-binding region. Concentrate on.
  • Wild-type p53 functions as a transcriptional regulator and is known to be involved in the expression of many genes involved in the cell cycle, DNA repair, and apoptosis.
  • the wild-type p53 protein activates transcription of the p21 gene (also known as WAF1, CIP1, SDI1), which is an inhibitor of cyclin-dependent kinase, and induces cell cycle arrest.
  • Wild-type p53 is known to activate apoptosis by activating transcription of Bax gene, Noxa gene, Puma gene and the like (see, for example, Non-Patent Documents 4 to 6 below).
  • C / EBP is a bZIP protein having a basic amino acid region and a leucine zipper, and is composed of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , CRP1, and CHOP encoded by different genes. It constitutes the EBP family (for example, see Non-Patent Document 7 below).
  • C / EBP ⁇ and C / EBP ⁇ are transcription factors important for the acute phase reaction.
  • C / EBP ⁇ stops the cell cycle via p21 and exhibits a cell growth inhibitory action (see, for example, Non-Patent Document 8 below), and is one of cancer suppressor genes (see, for example, Non-Patent Document 9 below).
  • decorin belongs to a family of molecules called low molecular weight leucine-rich proteoglycans, and binds to growth factor receptors such as EGFR, ErbB4, IGF-IR, etc. and influences strong cell proliferation and apoptosis (for example, see Non-Patent Document 10 below). ).
  • the present invention identifies a region where C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ or p53 acts on the human decorin promoter, and expresses any gene depending on these transcription factors. It is an object of the present invention to provide a method, a method for suppressing or measuring their transcription-inducing ability, and a DNA used therefor.
  • the DNA according to one means for solving the above-mentioned problems is obtained by substituting or deleting one or a plurality of bases in the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 2 and the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 2. Or a base sequence that hybridizes with these base sequences under stringent conditions, and has a function of controlling the transcription induction ability of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , or C / EBP ⁇ .
  • a method for expressing a gene according to another means for solving the above-mentioned problem is the base sequence described in SEQ ID NOs: 1 and 2, and one or more of the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 2
  • a DNA comprising a base sequence in which bases are substituted or deleted, or a base sequence that hybridizes with these base sequences under stringent conditions is connected upstream of any other gene, and C / EBP ⁇ , C / Other genes are expressed depending on EBP ⁇ or C / EBP ⁇ .
  • a method for expressing a gene according to another means for solving the above-mentioned problem is the base sequence described in SEQ ID NOs: 1 and 2, and one or more of the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 2 Transcription of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , or C / EBP ⁇ using a base sequence formed by substitution or deletion of the base, or a DNA comprising a base sequence that hybridizes with these base sequences under stringent conditions Suppress or measure inducibility.
  • a DNA according to another means for solving the above-mentioned problem is obtained by replacing or deleting one or more bases in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3. Or a base sequence that hybridizes with these base sequences under stringent conditions, and has a function of controlling the transcription-inducing ability of p53.
  • a method of expressing a gene according to another means for solving the above-described problem is a method of substituting or replacing one or more bases in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • a method of expressing an arbitrary gene depending on C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ or p53, or suppressing the transcription-inducing ability of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , or C / EBP ⁇ It is possible to provide a method for measuring, a method for suppressing or measuring the transcription-inducing ability of p53, and DNA used for this.
  • the ras-NIH3T3 cells obtained by transforming mouse fibroblasts NIH3T3 with the activated Ha-ras gene have the appearance of cancer cells.
  • COUP-TFI, HNF4 and C / EBP ⁇ genes are introduced and expressed there, It was discovered that the cell morphology reverted to normal.
  • gene expression differences were comprehensively analyzed by the microarray method between these gene-transferred cells and the parental ras-NIH3T3 cells, the expression of the decorin gene was increased. That is, it was thought that the expression of the decorin gene might be induced by the action of the COUP-TFI, HNF4, and C / EBP ⁇ genes.
  • p53 is a typical tumor suppressor gene, and when the gene was introduced into ras-NIH3T3 cells, morphological normal reversion similar to the above was observed. Moreover, even when the mouse decorin gene was introduced, the same morphological normal return was observed. From these facts, it was estimated that there was some relationship among COUP-TFI, HNF4, and C / EBP ⁇ , p53, and decorin.
  • the expression regulation mechanism of the decorin gene was analyzed.
  • the analysis will be apparent from the Examples described below, but the human cultured esophageal cancer cell line T.
  • the promoter region ( ⁇ 1338 to ⁇ 205) of the decorin gene was isolated by amplification by PCR, incorporated into the luciferase reporter plasmid pGL3 (Promega), and the reporter plasmid deco ( ⁇ 1338: ⁇ 205) -Luc was prepared.
  • This reporter plasmid was introduced into mouse fibroblast ras-NIH3T3 together with expression vectors of COUP-TFI, HNF4, C / EBP ⁇ , and p53, and luciferase activity was measured 2 days later.
  • the luciferase activity was increased 2-46 times in cells transfected with C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , COUP-TFI, and p53 genes, which are the same gene family as C / EBP ⁇ (see FIG. 1 described later). ).
  • HNF4 had almost no effect.
  • This decorin promoter region ( ⁇ 252 to ⁇ 205) contained a sequence (AGGCAAGTAG) similar to the p53 binding consensus sequence (5′-PuPuPuC (A / T) (A / T) GPyPyPy-3 ′).
  • AGGCAAGTAG p53 binding consensus sequence
  • 5′-PuPuPuC A / T
  • a / T GPyPyPy-3 ′
  • a reporter plasmid Deco ( ⁇ 252: ⁇ 205) m-Luc in which CAAG, which is presumed to be the most important among these sequences, was mutated to AAAT was prepared and examined. It decreased to about 1 (refer FIG. 2 and 3 mentioned later). From these results, it was considered that p53 acts on the region of ⁇ 252 to ⁇ 205 of the decorin promoter to induce the expression of downstream genes.
  • the chromatin immunoprecipitation method is used to immunoprecipitate the chromatin fraction of human glioma cells U-87 treated with adriamycin using an anti-p53 antibody, and the PCR method is performed using a primer designed in the decorin promoter region. As a result of amplification, an expected DNA band was detected (see FIG. 5 described later). This suggests that p53 binds directly to the decorin promoter region.
  • EMSA electrophore mobility shift assay
  • alkaline phosphatase-labeled anti-digoxigenin antibody and CSPD [Disodium 3- (4-methyspiro ⁇ 1,2-dioxetane-3,2 ′-(5′-chloro)] Triticlo [3.3.1.1 3,7 ] Ddecan ⁇ -4-yl) phenyl phosphate] was detected as a band with reduced mobility (FIG. 6). This band was not observed in the absence of nuclear extract. It disappeared when an excessive amount of unlabeled probe was added. In addition, when the anti-p53 antibody (N-19 or M-19) was added, the band became thinner than the sample to which the control anti-NF- ⁇ B antibody was added. This indicates that p53 binds to the -256 to -232 region of the decorin promoter.
  • C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , and C / EBP ⁇ were highest in the reporter plasmid containing the region of ⁇ 204 to +42 (see FIGS. 7, 8, and 9 described later). From this, it was considered that these C / EBP families mainly act on the region of ⁇ 204 to +42 of the decorin promoter.
  • C / EBP ⁇ and C / EBP ⁇ were high in the region of ⁇ 414 to ⁇ 205 and decreased in the region of ⁇ 287 to ⁇ 205 (see FIGS. 7, 8, and 9 described later). From this, it was considered that C / EBP ⁇ and C / EBP ⁇ also act on the region of ⁇ 414 to ⁇ 288 of the decorin promoter to induce downstream gene expression.
  • HNF4 showed the highest expression-inducing activity against Deco (-252: -205) -Luc as with p53 (see FIG. 10 described later).
  • COUP-TFI showed high activity with Deco ( ⁇ 204 to +42) -Luc and Deco ( ⁇ 287: ⁇ 205) -Luc, and decreased with Deco ( ⁇ 252: ⁇ 205) -Luc (described later).
  • FIG. 11 shows expression-inducing activity against Deco (-252: -205) -Luc, their action region was not clear.
  • one or a plurality of bases in the base sequence described in SEQ ID NOs: 1 and 2 and the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 2 are substituted or deleted. Or a base sequence that hybridizes with these base sequences under stringent conditions, and has a function of controlling the transcription induction ability of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , or C / EBP ⁇ .
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1 represents the region of ⁇ 414 to ⁇ 288 of the decorin promoter
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 2 represents the region of ⁇ 204 to +42 of the decorin promoter.
  • 3 indicates the region of ⁇ 252 to ⁇ 205 of the decorin promoter.
  • the base sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 2 are preferably part of the promoter region of the decorin gene.
  • the method for expressing the gene according to the second aspect of the present invention is dependent on C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , or C / EBP ⁇ by linking the DNA according to the first aspect upstream of another gene. Any other gene is expressed.
  • the method for suppressing or measuring the transcription induction ability of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ or C / EBP ⁇ according to the third aspect of the present invention is carried out using the DNA according to the first aspect.
  • the DNA according to the fourth aspect of the present invention includes a base sequence represented by SEQ ID NO: 3, a base sequence obtained by substituting or deleting one or more bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, Alternatively, it consists of a base sequence that hybridizes with these base sequences under stringent conditions, and has a function of controlling the transcription-inducing ability of p53.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 3 is preferably a part of the promoter region of the decorin gene.
  • the method for suppressing or measuring the transcription-inducing ability of p53 according to the fifth aspect of the present invention is performed using the DNA according to the fourth aspect.
  • hybridizes under stringent conditions means a DNA base sequence obtained by using a DNA as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like.
  • leaf hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl, and 0. Examples include those that can be identified by washing the filter under a condition of 65 ° C. using a 1 to 2 ⁇ SSC solution (composition of 1 ⁇ SSC is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate).
  • Hybridization was performed in Molecular Cloning 2nd Edt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and the like.
  • the reporter plasmid used in the present invention is not limited to a plasmid containing a luciferase gene, and examples thereof include chloramphenicol acetyltransferase (CAT) and owan jellyfish fluorescent chromogen (GFP).
  • CAT chloramphenicol acetyltransferase
  • GFP owan jellyfish fluorescent chromogen
  • the gene to be connected is not limited, but a drug resistance gene, an apoptosis-inhibiting gene, a cell-killing gene, and C / EBP ⁇ , C / A gene that causes abnormal expression at the target of EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , or p53 can be considered.
  • drug resistance genes include dhfr, gpt, neo, hygro, trpB, hisD, ODC and the like.
  • dhfr is a gene that confers resistance to methotrexate
  • gpt is a gene that confers resistance to mycophenolic acid
  • neo is a gene that confers resistance to aminoglycoside G-418
  • hygro confers resistance to hygromycin. It is a gene.
  • TrpB is a gene that allows cells to use indole instead of tryptophan
  • hisD is a gene that allows cells to use histinol instead of histidine
  • ODC ornithine decarboxylase gene
  • DFMO 2- (difluoromethyl) -DL-ornithine
  • an apoptosis inhibiting gene is IAP. If the gene of SEQ ID NO: 2 is incorporated upstream of the IAP gene and introduced into the cell in advance, apoptosis does not occur when p53 is activated by drug treatment, and cell cycle arrest can be preferentially caused. . Conversely, when it is desired to kill cancer cells, the purpose can be achieved by connecting a cell killing gene.
  • the target gene having the promoter DNA is adenovirus, adeno-associated virus.
  • the target gene is expressed under normal transcriptional control of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , and p53 by inserting it into a vector such as a retrovirus or encapsulating it in a liposome. Can be made.
  • DNA of SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 is excessively introduced into a cell and C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ or p53 is bound thereto to control their functions
  • the DNA containing at least a part of this promoter DNA can competitively inhibit the binding to C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ or p53.
  • the DNA used for competitive inhibition usually has a chain length of at least 6 bases.
  • the decorine promoter DNA can adopt a base sequence in which one or more bases in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 are substituted or deleted.
  • a person skilled in the art will be able to use various Bunsei biological techniques such as restriction enzyme method, deletion introduction by DNA exonuclease, modification of promoter sequence by PCR method using mutation primer, mutation introduction by site-specific induction method, synthetic mutation Promoter DNA equivalent to the natural type by substituting a part of the base sequence of the natural promoter DNA with another base, or deleting or adding a part of the base by a method such as DNA introduction
  • a DNA having the same promoter activity and having a base sequence in which the solution is substituted, deleted, and / or added are also possible.
  • Example 1 Human cultured esophageal cancer cells Extracting genomic DNA from Tn and using this as a template, AC007115.1 Homo sapiens chromosome 12 clone 12030 base to 13163 base [decorin gene promoter region (-38 to -205); total length 1134 base pairs], and 13164 base pairs to A region of 13409 base pairs [decorin gene promoter region (-204 to +42); full length 246 base pairs] was amplified by PCR.
  • This reporter plasmid is SV40, a control plasmid that constantly expresses Renilla luciferase by the CMV promoter-pGL4.73 [hRluc / SV40] vector, or pGL4.75 [hRluc / CMV] vector, and COUP-TFI, HNF4 Introduced into mouse fibroblasts ras-NIH3T3 with Lipofectamine-Plus reagent (Invitrogen) together with an expression vector of C, EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , or p53, or an empty control vector containing no insert gene did.
  • luciferase activity was measured using a dual luciferase quantification system (Promega), and the ratio of firefly luciferase activity to Renilla luciferase activity was calculated.
  • C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , COUP-TFI, and p53 gene-introduced cells had a 2- to 46-fold increase in luciferase activity compared to the control vector (FIG. 1).
  • HNF4 had almost no effect.
  • Luciferase reporter plasmid Deco ( ⁇ 1338: ⁇ 205) —The promoter region ( ⁇ 1338 to ⁇ 205) of the decorin gene incorporated in Luc was gradually deleted from the 5 ′ side to form seven reporter plasmids (Deco ( ⁇ 1237: -205) -Luc, Deco (-1037: -205) -Luc, Deco (-736: -205) -Luc, Deco (-599: -205) -Luc, Deco (-414: -205)- Luc, Deco (-287: -205) -Luc, Deco (-252: -205) -Luc) were prepared by reverse PCT method using KOD Mutagenesis Kit (Toyobo).
  • the region from ⁇ 252 to ⁇ 205 of the decorin promoter contained a sequence (AGGCAAGTAG) similar to the p53 binding consensus sequence (5′-PuPuPuC (A / T) (A / T) GPyPyPy-3 ′).
  • AGGCAAGTAG p53 binding consensus sequence
  • 5′-PuPuPuC (A / T) (A / T) GPyPyPy-3 ′ The region from ⁇ 252 to ⁇ 205 of the decorin promoter contained a sequence (AGGCAAGTAG) similar to the p53 binding consensus sequence (5′-PuPuPuC (A / T) (A / T) GPyPyPy-3 ′).
  • CAAG which is presumed to be the most important among these sequences
  • Example 6 On the other hand, activation of the decorin promoter by C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , and C / EBP ⁇ was similarly examined using the reporter plasmid shown in Example 2, and the increase in firefly luciferase activity was ⁇ 204 to +42, and It was high in the reporter plasmid containing the region from ⁇ 414 to ⁇ 205 and decreased in the region from ⁇ 287 to ⁇ 205 (FIGS. 7, 8, and 9). From this, it was considered that C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , and C / EBP ⁇ act on the ⁇ 204 to +42 and ⁇ 414 to ⁇ 288 regions of the decorin promoter to induce the expression of granule genes.
  • the present invention relates to DNA, functional analysis of C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , and p53 using this DNA, gene expression dependent on C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , and p53, And C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , and p53 functions can be suppressed, and significant progress can be expected in the elucidation and prevention of various diseases involving cell proliferation, differentiation, and cell death. There is a possibility.
  • Control plasmid pGL4.73 [hRluc / SV40] vector (0.01 ⁇ g), which expresses Renilla luciferase constitutively with the SV40 promoter, and Deco ( ⁇ 1338: ⁇ 205) -Luc (0.1 ⁇ g), and C / EBP ⁇ , Lipofectamine in mouse fibroblast ras-NIH3T3 with C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , COUP-TFI, HNF4, or p53 expression vector, or empty control vector without insert gene (pEF-BOS) (0.3 ⁇ g) -Introduced using Plus reagent (Invitrogen).
  • pEF-BOS empty control vector without insert gene
  • luciferase activity was measured using a dual luciferase quantification system (Promega), and the ratio of firefly luciferase activity to Renilla luciferase activity was calculated.
  • C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , C / EBP ⁇ , COUP-TFI, and p53 gene-introduced cells had a 2- to 46-fold increase in luciferase activity compared to the control vector.
  • HNF4 had little effect. It is a figure which shows activation of a decorin promoter by p53.
  • Deco ( ⁇ 252: ⁇ 205) m-Luc is a p53 binding consensus sequence (5′-PuPuPuC (A / T) (A / T) GPyPyPy-3 ′) found in the region ⁇ 252 to ⁇ 205 of the decorin promoter.
  • the chromatin fraction of human glioma cells U-87 treated with adriamycin was immunoprecipitated using anti-p53 antibodies (DO-1 and Bp53-12; Santa Cruz), and the coprecipitated DNA was added to the decorin promoter region ( ⁇ 413 to Amplified by PCR using the primer (AACTGGTGGACAGGGAGAAAG) designed in -232).
  • a predicted 182 base pair DNA band was detected only with the p53 antibody. This suggests that p53 binds directly to the decorin promoter.
  • the arrow indicates the position of the expected PCR product. It is a figure which shows the coupling
  • COUP-TFI Activation of the decorin promoter by COUP-TFI was examined using a reporter plasmid as in FIG. COUP-TFI showed the highest activity against Deco (-287: -205) -Luc and Deco (-204: +42) -Luc, while Deco (-252: -205) -Luc was less active. It did not disappear completely. Therefore, their area of action was not determined.

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Abstract

【課題】ヒトｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの一部の配列を用いてＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３依存的に任意の遺伝子を発現させる方法、及び、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法、更には、これに用いられるＤＮＡを提供すること。 【解決手段】配列番号１、２及び３に記載の塩基配列、前記配列番号１、２及び３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３の転写誘導能を制御する機能を有するＤＮＡとする。

Description

ヒトｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの一部の配列を用いてＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３依存的に任意の遺伝子を発現させる方法、及びそれらの転写誘導能を抑制又は測定する方法
　本発明は、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３依存的に任意の遺伝子を発現させる方法、及びＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法に関する。
　ｐ５３遺伝子は、人の多がん組織及びがん細胞において、最も高頻度で変異・欠失が観察されている遺伝子である（例えば下記非特許文献１参照）。変異ｐ５３遺伝子を有するリー・フラウメニ症候群患者やｐ５３ノックアウトマウスにおいてがんが多発することから、ｐ５３遺伝子の異常はがんの発生・進展に密接に関連していると考えられている（例えば下記非特許文献２、３参照）。
　ｐ５３は、転写活性調節ドメインを含むＮ末端領域と、ＤＮＡ結合に関与するＤＮＡ結合領域と、四量体形成ドメインを含むＣ末端領域からなり、がん細胞で観察される変異は、ＤＮＡ結合領域に集中している。
　野生型ｐ５３は転写調節因子として機能し、細胞周期、ＤＮＡ修復、アポトーシスに関わる多くの遺伝子の発現に関与していることが知られている。例えば野生型ｐ５３蛋白質は、サイクリン依存性キナーゼのインヒビターであるｐ２１遺伝子（別名：ＷＡＦ１、ＣＩＰ１、ＳＤＩ１）の転写を活性化して細胞周期停止を誘導する。また野生型ｐ５３は、Ｂａｘ遺伝子、Ｎｏｘａ遺伝子、Ｐｕｍａ遺伝子等の転写を活性化してアポトーシスを誘導することが知られている（例えば下記非特許文献４乃至６参照）。
　これらのことから、ｐ５３の転写調節因子としての活性を測定することによって、発がんやアポトーシスの進行程度を推測することが可能であり、また、ｐ５３の転写誘導活性を調節することによって発がんやアポトーシスを抑制することが可能である。
　Ｃ／ＥＢＰは塩基性アミノ酸の領域とロイシンジッパーをもったｂＺＩＰタンパク質であり、異なった遺伝子にコードされたＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、Ｃ／ＥＢＰγ、ＣＲＰ１、ＣＨＯＰからなるＣ／ＥＢＰファミリーを構成している（例えば下記非特許文献７参照）。Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδは急性期反応に重要な転写因子である。Ｃ／ＥＢＰαはｐ２１を介して細胞周期を止め、細胞増殖抑制作用を示し（例えば下記非特許文献８参照）、がん抑制遺伝子の一つである（例えば下記非特許文献９参照）。
　ところでｄｅｃｏｒｉｎは低分子ロイシンリッチ・プロテオグリカンと呼ばれる分子ファミリーに属し、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ４、ＩＧＦ－ＩＲ等の増殖因子受容体に結合して強い細胞増殖やアポトーシスに影響を及ぼす（例えば下記非特許文献１０参照）。
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，５４，４８５５－４８７８ Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，１９９７，７６，１－１４ Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，３５６，２１５－２２１ Ｃｅｌｌ，１９９５，８０，２９３－２９９ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８，１０５３－１０５８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ，２００１，７，６８３－６９４ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ　１９９８，７９，３６９－３９１ Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１９９６，１０，８０４－８１５ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２００５，２０２，８５－９６ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２００８，２８３，２１３０５－２１３０９
　上記従来の技術には、Ｃ／ＥＢＰファミリー、及びｐ５３の標的遺伝子のプロモーターを用いた遺伝子発現制御に関する記載もあるが、これらの生物学的重要性を考慮すれば１つでも多くの標的遺伝子の同定が求められている。
　そこで、本発明は、上記課題を鑑み、ヒトｄｅｃｏｒｉｎプロモーターにＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３が作用する領域を同定し、それらの転写因子に依存して任意の遺伝子を発現させる方法、及び、それらの転写誘導能を抑制又は測定する方法、更には、これに用いられるＤＮＡを提供することを目的とする。
　上記課題を解決するための一手段に係るＤＮＡは、配列番号１及び２に記載の塩基配列、配列番号１及び２に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を制御する機能を有するものである。
　また、上記課題を解決するための他の一手段に係る遺伝子を発現させる方法は、配列番号１及び２に記載の塩基配列、配列番号１及び２に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを他の任意の遺伝子の上流につないで、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、若しくはＣ／ＥＢＰδ依存的に他の遺伝子を発現させる。
　また、上記課題を解決するための他の一手段に係る遺伝子を発現させる方法は、配列番号１及び２に記載の塩基配列、配列番号１及び２に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを用いて、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を抑制又は測定する。
　また、上記課題を解決するための他の一手段に係るＤＮＡは、配列番号３に記載の塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、ｐ５３の転写誘導能を制御する機能を有するものである。
　また、上記課題を解決するための他の一手段に係る遺伝子を発現させる方法は、配列番号３に記載の塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡを用いて、ｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法。
　以上、本発明により、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３に依存して任意の遺伝子を発現させる方法、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を抑制又は測定する方法、及び、ｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法、更には、これに用いられるＤＮＡを提供することが可能となる。
　マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を活性化型Ｈａ－ｒａｓ遺伝子により形質転換したｒａｓ－ＮＩＨ３Ｔ３細胞はがん細胞の様相を呈するが、そこにＣＯＵＰ－ＴＦＩ、ＨＮＦ４及びＣ／ＥＢＰα遺伝子を導入し発現させたところ、細胞の形態が正常型に復帰することを発見した。そして、これらの遺伝子導入細胞と親株のｒａｓ－ＮＩＨ３Ｔ３細胞について遺伝子発現の差をマイクロアレイ法により網羅的に解析したところ、いずれもｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子の発現が上昇していた。すなわち、ＣＯＵＰ－ＴＦＩ、ＨＮＦ４、及びＣ／ＥＢＰα遺伝子の作用により、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子の発現が誘導されるのではないかと考えられた。
　一方、ｐ５３は代表的ながん抑制遺伝子であり、その遺伝子をｒａｓ－ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入したところ、上記と同様の形態的正常復帰が観察された。またマウスｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子を導入しても同様の形態的正常復帰が観察された。これらのことから、ＣＯＵＰ－ＴＦＩ、ＨＮＦ４、及びＣ／ＥＢＰαとｐ５３、及びｄｅｃｏｒｉｎの間に何らかの関係があると推定された。
　そこで次に、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子の発現調節機構について解析した。解析は、後述の実施例から明らかとなるが、ヒト培養食道がん細胞株Ｔ．ＴｎのゲノムＤＮＡを鋳型として、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（－１３３８～－２０５）をＰＣＲ法により増幅して単離し、ルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＧＬ３（プロメガ社）に組み込み、レポータープラスミドｄｅｃｏ（－１３３８：－２０５）－Ｌｕｃを作製した。そしてこのレポータープラスミドをＣＯＵＰ－ＴＦＩ、ＨＮＦ４、Ｃ／ＥＢＰα、及びｐ５３の発現ベクターとともにマウス線維芽細胞ｒａｓ－ＮＩＨ３Ｔ３に導入し、２日後にルシフェラーゼ活性を測定した。Ｃ／ＥＢＰαと同じ遺伝子ファミリーであるＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＣＯＵＰ－ＴＦＩ、及びｐ５３遺伝子の導入細胞ではルシフェラーゼ活性が２～４６倍に上昇していた（後述の図１参照）。なおＨＮＦ４はほとんど影響がなかった。
　次にこのルシフェラーゼ・レポータープラスミドに組み込まれたｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（－１３３８～－２０５）を段階的に５’側から削除して７種類のレポータープラスミド（Ｄｅｃｏ（－１２３７：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－１０３７：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－７３６：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－５９９：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－４１４：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－２８７：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃ）を作製した。またＤｅｃｏ（－２０４：＋４２）－Ｌｕｃも別途作製した。ｐ５３によるこれらのプラスミド由来のルシフェラーゼ活性の変動を調べたところ、－２５２～－２０５の領域で最も顕著なルシフェラーゼ活性の上昇が認められた（後述の図２参照）。この活性上昇はｐ５３の用量に依存しており（後述の図３参照）、ヒトグリオーマ細胞Ｕ－８７でも同様の結果が得られた（後述の図４参照）。
　このｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域（－２５２～－２０５）にはｐ５３の結合コンセンサス配列（５’－ＰｕＰｕＰｕＣ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＧＰｙＰｙＰｙ－３’）に類似した配列（ＡＧＧＣＡＡＧＴＡＧ）が含まれていた。そこでこの配列のうち最も重要であると推定されているＣＡＡＧをＡＡＡＴに変異させたレポータープラスミドＤｅｃｏ（－２５２：－２０５）ｍ－Ｌｕｃを作製して調べたところ、ｐ５３による活性化は５分の１程度に減少した（後述の図２、及び３参照）。これらのことからｐ５３はｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５２～－２０５の領域に作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。
　次に、クロマチン免疫沈降法により、アドリアマイシン処理したヒトグリオーマ細胞Ｕ－８７のクロマチン分画を抗ｐ５３抗体を用いて免疫沈降し、共沈したＤＮＡをｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域に設計したプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅したところ、予想されたＤＮＡのバンドが検出された（後述の図５参照）。このことはｐ５３がｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域に直接結合することを示唆している。
　次にＥＭＳＡ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｓｈｉｆｔ　ａｓｓａｙ）法によりｐ５３とｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの結合を調べた。ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５６～－２３２の領域の配列を持つ合成ＤＮＡをプローブとしてｄｉｇｏｘｉｇｅｉｎで標識し、Ｕ－８７細胞の核抽出液と混合し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＤＮＡをメンブレンに転写した後、アルカリフォスファターゼ標識抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体とＣＳＰＤ［Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　３－（４－ｍｅｔｈｏｓｙｓｐｉｒｏ｛１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－（５’－ｃｈｌｏｒｏ）Ｔｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］Ｄｄｅｃａｎ｝－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］を用いて検出した結果、ＤＮＡ－タンパク質複合体が移動度の低下したバンドとして検出された（図６）。このバンドは核抽出液の非存在下では観察されなかった。また、過剰量の非標識プローブを加えると消失した。また、抗ｐ５３抗体（Ｎ－１９、またはＭ－１９）を加えるとコントロールの抗ＮＦ－κＢ抗体を加えたサンプルに比べ、バンドが薄くなった。このことはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５６～－２３２の領域にｐ５３が結合することを示す。
　一方、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδによるルシフェラーゼ活性の上昇は－２０４～＋４２の領域を含むレポータープラスミドで最も高かった（後述の図７、８、９参照）。このことからこれらのＣ／ＥＢＰファミリーはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２０４～＋４２の領域に主に作用すると考えられた。また、Ｃ／ＥＢＰα、及びＣ／ＥＢＰβでは－４１４～－２０５の領域で高く、－２８７～－２０５の領域では減少した（後述の図７、８、９参照）。このことからＣ／ＥＢＰαとＣ／ＥＢＰβはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－４１４～－２８８の領域にも作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。
　ＨＮＦ４はｐ５３と同様にＤｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃに対して最も高い発現誘導活性を示した（後述の図１０参照）。また、ＣＯＵＰ－ＴＦＩはＤｅｃｏ（－２０４～＋４２）－Ｌｕｃ、及びＤｅｃｏ（－２８７：－２０５）－Ｌｕｃで高い活性を示し、Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃでは活性が低下した（後述の図１１参照）。しかしながら、これらはＤｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃに対しても発現誘導活性を示したことからそれらの作用領域は明確でなかった。
　すなわち、本発明の第一の形態に係るＤＮＡは、配列番号１及び２に記載の塩基配列、配列番号１及び２に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を制御する機能を有する。なお配列番号１に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－４１４～－２８８の領域を示すものであり、配列番号２に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２０４～＋４２の領域を、配列番号３は、ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５２～－２０５の領域をそれぞれ示している。
　なおこの形態において、配列番号１及び２に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域の一部であることが好ましい。
　また本発明の第二の形態に係る遺伝子を発現させる方法は、上記第一の形態に係るＤＮＡを、他の遺伝子の上流につないで、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ若しくはＣ／ＥＢＰδ依存的に他の任意の遺伝子を発現させる。
　また本発明の第三の形態に係るＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を抑制又は測定する方法は、上記第一の形態に係るＤＮＡを用いて行なう。
　また、本発明の第四の形態に係るＤＮＡは、配列番号３に記載の塩基配列、配列番号３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、ｐ５３の転写誘導能を制御する機能を有する。
　なおこの形態において、配列番号３に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域の一部であることが好ましい。
　また本発明の第五の形態に係るｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法は、上記第四の形態に係るＤＮＡを用いて行なう。
　ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニー、プラーク由来のＤＮＡ又はこのＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在か６５℃で葉イブリダイゼーションを行なった後、０．１～２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣの組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるものを挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｏｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　Ｅｄｔ．，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行なうことができる。
　また、本発明において用いられるレポータープラスミドはルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドに限られず、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、オワンクラゲ蛍光発色体（ＧＦＰ）を挙げることができる。
　また、また、本発明の一に係る遺伝子を発現させる方法において、接続させる遺伝子は、限定されるわけではないが、薬剤耐性遺伝子、アポトーシス阻害遺伝子、殺細胞遺伝子、及び、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ若しくはｐ５３の標的で発現異常を引き起こした遺伝子などが考えられる。薬剤耐性遺伝子の例としては、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、ｈｙｇｒｏ、ｔｒｐＢ、ｈｉｓＤ、ＯＤＣなどがある。ｄｈｆｒはメトトレキセートへの耐性を与える遺伝子であり、ｇｐｔはミコフェノール酸への耐性を与える遺伝子であり、ｎｅｏはアミノグリコシドＧ－４１８への耐性を与える遺伝子であり、ｈｙｇｒｏはハイグロマイシンへの耐性を与える遺伝子である。またｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを許容する遺伝子であり、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを許容する遺伝子であり、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子）は、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤である２－（ジフルオロメチル）－ＤＬ－オルニチン（ＤＦＭＯ）に対する耐性を与える遺伝子である。アポトーシス阻害遺伝子の例としてはＩＡＰを挙げることができる。ＩＡＰ遺伝子の上流に配列番号２の遺伝子を組み込んで細胞に予め導入しておけば、薬物処理によりｐ５３を活性化させた場合にアポトーシスは起こさず、細胞周期の停止を優先的に起こすことができる。逆に、がん細胞などを死滅させたい場合には殺細胞遺伝子を接続させることによって目的を達成できる。Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ｐ５３の標的で発現異常を引き起こした遺伝子の発現を正常に戻すためには、本実施形態に係るプロモーターＤＮＡを有する標的遺伝子をアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどのベクターに挿入し、又は、リポソームなどに封入して体細胞に導入することにより、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ｐ５３の正常な転写制御下に標的遺伝子を発現させることができる。
　配列番号１、配列番号２又は配列番号３に記載のＤＮＡを過剰に細胞内に導入し、そこにＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ又はｐ５３を結合させてそれらの機能を制御する際、このプロモーターＤＮＡの少なくとも一部を含むＤＮＡは、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ又はｐ５３との結合を拮抗阻害しうる。拮抗阻害に用いるＤＮＡは、通常少なくとも６塩基の鎖長を有する。
　またｄｅｃｏｒｉｎｅプロモーターＤＮＡは、配列番号１、配列番号２及び配列番号３のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列を採用することができる。当業者であれば、種々の文政生物学的手法、例えば制限酵素法、ＤＮＡエキソヌクレアーゼによる欠失導入、変異プライマーを用いたＰＣＲ法によるプロモーター配列の改変、部位特異誘発法による変異導入、合成変異ＤＮＡの導入などの方法で、天然型プロモーターＤＮＡの塩基配列の一部を他の塩基に置換したり、あるいは、一部塩基を欠失、または、付加させることにより、天然型と同等のプロモーターＤＮＡと同等のプロモーター活性を有し、液が置換、欠失、及び／又は付加した塩基配列を有するＤＮＡも使うことができる。
　以下、本発明の具体的な実施の例について詳細に説明する。
（実施例１）
　まず、ヒト培養食道癌細胞Ｔ．ＴｎからゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として、ＡＣ００７１１５．１　Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　１２　ｃｌｏｎｅの１２０３０ｂａｓｅ～１３１６３ｂａｓｅ［ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（－３８～－２０５）；全長１１３４塩基対］、及び１３１６４塩基対～１３４０９塩基対［ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（－２０４～＋４２）；全長２４６塩基対］の領域をＰＣＲ法により増幅した。その際、ＸｈｏＩ、及びＨｉｎｄＩＩＩサイトをそれぞれ末端に導入し、ＴＡクローニングにてサブクローニングを行い、ホタル・ルシフェラーゼ・レポータープラスミドｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃ　ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社）のＸｈｏｌ－ＨｉｎｄＩＩＩ間に組み込み、レポータープラスミドＤｅｃｏ（－１３３８：－２０５）－Ｌｕｃを作製した。
　そして、このレポータープラスミドをＳＶ４０、ＣＭＶプロモーターにより恒常的にウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現するコントロールプラスミド－ｐＧＬ４．７３［ｈＲｌｕｃ／ＳＶ４０］ｖｅｃｔｏｒ、又はｐＧＬ４．７５［ｈＲｌｕｃ／ＣＭＶ］ｖｅｃｔｏｒ、及びＣＯＵＰ－ＴＦＩ、ＨＮＦ４、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、又はｐ５３の発現ベクター、又はインサート遺伝子を含まない空の対照ベクターとともにマウス線維芽細胞ｒａｓ－ＮＩＨ３Ｔ３にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－Ｐｌｕｓ試薬（インビトロジェン社）を用いて導入した。そして２日間培養した後、ルシフェラーゼ活性をデュアル・ルシフェラーゼ定量システム（プロメガ社）を用いて測定し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対するホタル・ルシフェラーゼ活性の比を算出した。この結果、対照ベクターに比べＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＣＯＵＰ－ＴＦＩ、及びｐ５３遺伝子の導入細胞ではルシフェラーゼ活性が２～４６倍に上昇していた（図１）。なおＨＮＦ４に関しては殆ど影響がなかった。
（実施例２）
　ルシフェラーゼ・レポータープラスミドＤｅｃｏ（－１３３８：－２０５）－Ｌｕｃに組み込まれたｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域（－１３３８～－２０５）を段階的に５’側から削除して７種類のレポータープラスミド（Ｄｅｃｏ（－１２３７：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－１０３７：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－７３６：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－５９９：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－４１４：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－２８７：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃ）をｒｅｖｅｒｓｅ　ＰＣＴ法により、ＫＯＤ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡社）を用いて作製した。そして、これらのプラスミドまたはＤｅｃｏ（－２０４：＋４２）－Ｌｕｃとコントロールプラスミド－ｐＧＬ４．７３［ｈＲｌｕｃ／ＳＶ４０］ｖｅｃｔｏｒ、及びｐ５３発現ベクターをｒａｓ－ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性の変動を調べたところ、－２５２～－２０５の領域で最も顕著なホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた（図２）。なおこの活性上昇は、ｐ５３の用量に依存しており、（図３）、ヒトグリオーマ細胞Ｕ－８７でも同様の結果が得られた（図４）。
（実施例３）
　ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５２～－２０５の領域にはｐ５３の結合コンセンサス配列（５’－ＰｕＰｕＰｕＣ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＧＰｙＰｙＰｙ－３’）に類似した配列（ＡＧＧＣＡＡＧＴＡＧ）が含まれていた。そこで、この配列のうち最も重要であると推定されるＣＡＡＧをＡＡＡＴに変異させたレポータープラスミドＤｅｃｏ（－２５２：－２０５）ｍ－ＬｕｃをＫＯＤ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔを用いて作製して調べたところ、ｐ５３による活性化は１７０倍から３０倍程度に減少した（図３）。このことからｐ５３はｄｅｃｏｒｉｎプロモーターのＡＧＧＣＡＡＧＴＡＧを含む－２５２～－２０５の領域に作用して顆粒の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。
（実施例４）
　ＣｈＩＰ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｆ社）を用いて、クロマチン免疫沈降解析を行なった。アドリアマイシン処理したヒトグリオーマ細胞Ｕ－８７のクロマチン分画を抗ｐ５３抗体（ＤＯ－１、及びＢｐ５３－１２；サンタクルーズ社）を用いて免疫沈降し、共沈したＤＮＡをｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域（－４１３～－２３２）に設計したプライマー（ＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧ、及び、ＴＣＧＧＡＴＴＣＣＴＡＣＴＴＧＣＣＴＴＧＧ）を用いてＰＣＴ法により増幅したところ、予想された１８２塩基対のＤＮＡのバンドが検出された（図５）。このことは、ｐ５３がｄｅｃｏｒｉｎプロモーターに直接結合することを示唆している。
（実施例５）
　ＥＭＳＡ法によりｐ５３とｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの結合を調べた。ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５６～－２３２の領域の配列を持つ合成ＤＮＡをプローブとしてｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎで標識し、Ｕ－８７細胞の核抽出液と混合し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＤＮＡをメンブレンに転写した後、アルカリフォスファターゼ標識抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体とＣＳＰＤ［Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　３－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－（５’－ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃａｎ｝－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］を用いて検出した。ＤＮＡ－タンパク質複合体を示す移動度の低いバンドが検出された（図６、レーン２）。このバンドは核抽出液の非存在下では観察されなかった（レーン１）。また、過剰量の非標識プローブを加えると消失した（レーン６）。また、抗ｐ５３抗体（Ｎ－１９、またはＭ－１９）を加える（レーン３、４）とコントロールの抗ＮＦ－κＢ抗体を加えたサンプル（レーン５）に比べ、バンドが薄くなった。このことはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５６～－２３２の領域にｐ５３が結合することを示す。
（実施例６）
　一方、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を同様に実施例２に示すレポータープラスミドを用いて調べたところ、ホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇は－２０４～＋４２、及び－４１４～－２０５の領域を含むレポータープラスミドで高く、－２８７～－２０５の領域では減少した（図７、８、９）。このことからＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２０４～＋４２、及び－４１４～－２８８の領域に作用して顆粒の遺伝子の発現を誘導すると考えた。
　ＨＮＦ４について同様に、ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターへの影響を調べた結果、Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃに対して最も高い発現誘導活性を示した（図１０）。また、ＣＯＵＰ－ＴＦＩはＤｅｃｏ（－２８７：－２０５）－Ｌｕｃで最も高い活性を示し、Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃでは活性化が減弱したが完全には消失しなかった（図１１）。したがって、それらの作用領域については確定しなかった。
　本発明は、ＤＮＡ、このＤＮＡを利用したＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びｐ５３の機能解析、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びｐ５３に依存的な遺伝子発現、及びＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、及びｐ５３の機能抑制が可能となり、細胞増殖、分化、細胞死の関与する種々の疾患の解明と予防に大きな進展が期待でき、産業上の利用可性がある。
種々の転写因子によるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化である。　Ｄｅｃｏ（－１３３８：－２０５）－Ｌｕｃ（０．１μｇ）をＳＶ４０プロモーターにより恒常的にウミシイタケ・ルシフェラーゼを発現するコントロールプラスミドｐＧＬ４．７３［ｈＲｌｕｃ／ＳＶ４０］ｖｅｃｔｏｒ（０．０１μｇ）、及びＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＣＯＵＰ－ＴＦＩ、ＨＮＦ４、またはｐ５３の発現ベクター、またはインサート遺伝子を含まない空の対照ベクター（ｐＥＦ－ＢＯＳ）（０．３μｇ）とともにマウス線維芽細胞ｒａｓ－ＮＩＨ３Ｔ３にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－Ｐｌｕｓ試薬（インビトロジェン社）を用いて導入した。２日間培養した後、ルシフェラーゼ活性をデュアル・ルシフェラーゼ定量システム（プロメガ社）を用いて測定し、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対するホタル・ルシフェラーゼ活性の比を算出した。その結果、対照ベクターに比べＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、ＣＯＵＰ－ＴＦＩ、及びｐ５３遺伝子の導入細胞ではルシフェラーゼ活性が２～４６倍に上昇していた。ＨＮＦ４はほとんど影響がなかった。 ｐ５３によるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。　レポータープラスミド、Ｄｅｃｏ（－１３３８：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－１２３７：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－１０３７：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－７３６：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－５９９：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－４１４：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－２８７：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃ、又はＤｅｃｏ（－２０４：＋４２）－Ｌｕｃ（０．１μｇ）をコントロールプラスミドｐＧＬ４．７３［ｈＲｌｕｃ／ＳＶ４０］ｖｅｃｔｏｒ（０．０１μｇ）、及びｐ５３発現ベクター（０．３μｇ）とともにｒａｓ－ＮＩＨ３Ｔ３細胞に共導入し、ルシフェラーゼ活性の変動を調べた。その結果、－２５２～－２０５の領域を持つレポーターに対して最も顕著なホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。 ｒａｓ－ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｐ５３によりｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。　図２と同様にレポータープラスミド、Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃ、またはＤｅｃｏ（－２５２：－２０５）ｍ－Ｌｕｃに対するｐ５３の用量依存的活性化を調べた。Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）ｍ－Ｌｕｃはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５２～－２０５の領域に見られるｐ５３の結合コンセンサス配列（５’－ＰｕＰｕＰｕＣ（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＧＰｙＰｙＰｙ－３’）に類似した配列（ＡＧＧＣＡＡＧＴＡＧ）のＣＡＡＧをＡＡＡＴに変異させたレポータープラスミドである。この活性化はｐ５３の用量に依存しており、ｐ５３結合コンセンサス配列に依存していた。 Ｕ－８７グリオーマ細胞におけるｐ５３によるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。　図３と同様にレポータープラスミド、Ｄｅｃｏ（－１３３８：－２０５）－Ｌｕｃ、Ｄｅｃｏ（－２８７：－２０５）－Ｌｕｃ、またはＤｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃに対するｐ５３用量依存的活性化をヒトグリオーマ細胞Ｕ－８７を用いて調べた。Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃに対して最も高い活性化を示した。 クロマチン免疫沈降法によるｐ５３とｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの結合解析を示す図である。図中の矢印はＰＣＲ産物の位置を示す。　ＣｈＩＰ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ　Ｍｏｔｉｆ社）を用いてクロマチン免疫沈降解析を行なった。アドリアマイシン処理したヒトグリオーマ細胞Ｕ－８７のクロマチン分画を抗ｐ５３抗体（ＤＯ－１、及びＢｐ５３－１２；サンタクルーズ社）を用いて免疫沈降し、共沈したＤＮＡをｄｅｃｏｒｉｎプロモーター領域（－４１３～－２３２）に設計したプライマー（ＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧ）を用いてＰＣＲ法により増幅した。ｐ５３抗体を用いた時にのみ予想された１８２塩基対のＤＮＡのバンドが検出された。このことはｐ５３がｄｅｃｏｒｉｎプロモーターに直接結合することを示唆している。矢印は予想されるＰＣＲ産物の位置を示す。 ＥＭＳＡによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターとｐ５３の結合を示す図である。　ＥＭＳＡ法によりｐ５３とｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの結合を調べた。ｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５６～－２３２の領域の配列を持つ合成ＤＮＡをプローブとしてｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎで標識し、アドリアマイシン処理Ｕ－８７細胞の核抽出液と混合し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ＤＮＡをメンブレンに転写した後、アルカリフォスファターゼ標識抗ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ抗体を反応させ、ＣＳＰＤ［Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　３－（４－ｍｅｔｈｏｘｙｓｐｉｒｏ｛１，２－ｄｉｏｘｅｔａｎｅ－３，２’－（５’－ｃｈｌｏｒｏ）ｔｒｉｃｙｃｌｏ［３．３．１．１３，７］ｄｅｃａｎ｝－４－ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］を用いて検出した。移動度の低いバンドはＤＮＡ－タンパク質複合体を示す。レーン１：標識プローブのみ、核抽出液なしレーン２：標識プローブ＋核抽出液レーン３：標識プローブ＋核抽出液＋抗ｐ５３抗体（Ｎ－１９）レーン４：標識プローブ＋核抽出液＋抗ｐ５３抗体（Ｍ－１９）レーン５：標識プローブ＋核抽出液＋抗ＮＦ-κＢ抗体レーン６：標識プローブ＋核抽出液＋非標識プローブ（×８０）これらの結果はｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２５６～－２３２の領域にｐ５３が結合することを示す。 Ｃ／ＥＢＰαによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。　Ｃ／ＥＢＰαによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を図２と同様にレポータープラスミドを用いて調べた。ホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇は－２０４～＋４２の領域に対して最も著しく、次いで－４１４～－２０５の領域を含むレポータープラスミドで高く、－２８７～－２０５の領域では低下した。このことからＣ／ＥＢＰαはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２０４～＋４２、及び－４１４～－２８８の領域に作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。 Ｃ／ＥＢＰβによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。　Ｃ／ＥＢＰβによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を図２と同様にレポータープラスミドを用いて調べた。ホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇は－２０４～＋４２、及び－４１４～－２０５の領域を含むレポータープラスミドで高く、－２８７～－２０５の領域では低かった。このことからＣ／ＥＢＰβはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２０４～＋４２、及び－４１４～－２８８の領域に作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。 Ｃ／ＥＢＰδによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。　Ｃ／ＥＢＰδによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を図２と同様にレポータープラスミドを用いて調べた。ホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇は－２０４～＋４２の領域に対して最も高く、その他のレポーターでは３分の１以下であった。このことからＣ／ＥＢＰδはｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの－２０４～＋４２の領域に主に作用して下流の遺伝子の発現を誘導すると考えられた。 ＨＮＦ４によるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。　ＨＮＦ４について図２と同様にｄｅｃｏｒｉｎプロモーターへの影響を調べた。Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃに対して最も高い発現誘導活性を示した。 ＣＯＵＰ－ＴＦＩによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を示す図である。　ＣＯＵＰ－ＴＦＩによるｄｅｃｏｒｉｎプロモーターの活性化を図２と同様にレポータープラスミドを用いて調べた。ＣＯＵＰ－ＴＦＩはＤｅｃｏ（－２８７：－２０５）－ＬｕｃとＤｅｃｏ（－２０４：＋４２）－Ｌｕｃに対して最も高い活性を示し、Ｄｅｃｏ（－２５２：－２０５）－Ｌｕｃでは活性化が減弱したが完全には消失しなかった。従って、それらの作用領域は確定しなかった。

Claims (7)

  1. 　配列番号１及び２に記載の塩基配列、前記配列番号１に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を制御する機能を有するＤＮＡ。
  2. 　前記配列番号１及び２に記載の塩基配列が、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域の一部である請求項１記載のＤＮＡ。
  3. 　請求項１及び２に記載のＤＮＡを、他の遺伝子の上流につないで、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ若しくはＣ／ＥＢＰδ依存的に前記他の遺伝子を発現させる方法。
  4. 　請求項１に記載のＤＮＡを用いてＣ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ若しくはＣ／ＥＢＰδの転写誘導能を抑制又は測定する方法。
  5. 　配列番号３に記載の塩基配列、前記配列番号３に記載の塩基配列のうち１若しくは複数個の塩基が置換又は欠失してなる塩基配列、又は、これら塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、ｐ５３の転写誘導能を制御する機能を有するＤＮＡ。
  6. 　前記配列番号３に記載の塩基配列は、ｄｅｃｏｒｉｎ遺伝子のプロモーター領域の一部である請求項５記載のＤＮＡ。
  7. 　請求項５に記載のＤＮＡを用いてｐ５３の転写誘導能を抑制又は測定する方法。
     
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