WO2010070086A2 - Method for the enzymatic reaction of alkanes - Google Patents

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WO2010070086A2
WO2010070086A2 PCT/EP2009/067493 EP2009067493W WO2010070086A2 WO 2010070086 A2 WO2010070086 A2 WO 2010070086A2 EP 2009067493 W EP2009067493 W EP 2009067493W WO 2010070086 A2 WO2010070086 A2 WO 2010070086A2
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monooxygenase
cofactor
alkanes
carbon atoms
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Harald GRÖGER
Edyta Burda
Ulrich Schwaneberg
Jan Marienhagen
Karlheinz Drauz
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Evonik Degussa Gmbh
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones

Definitions

  • the invention relates to the hydroxylation of alkanes and the production of ketones from alkanes by enzymatic reactions.
  • cyclic ketones are of great importance to the chemical industry, with particular attention paid to cyclohexanone, cyclooctanone, cyclodecanone and cyclododecanone.
  • cyclohexanone there are various synthetic access routes starting from different basic chemicals. Particularly attractive is the selective direct conversion of cyclohexane to cyclohexanone using oxygen.
  • cyclododecanone also called cyclododecanone
  • cyclododecanone is considered to be a commercially attractive building block in the production of perfumes, UV absorbers and the monomers laurinlactam and dodecanedicarboxylic acid for the production of nylon-12 or nylon-6.12.
  • Cyclooctanone also called cyclooctanone
  • cyclododecanone consists in the aerial oxidation of the corresponding cycloalkane in the presence of boric acid to cycloalkylborate, followed by a subsequent hydrolysis of the borate to cycloalkanol and followed again by dehydration of the cycloalkanol.
  • a description of this technical process, for example for the synthesis of cyclododecanone can be found inter alia in T. Schiffer, G. Oenbrink, "cyclododecanol, cyclododecanone and laurolactam" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial
  • the object underlying the present invention is to provide a novel process for the preparation of ketones from alkanes, which does not have the above-described disadvantages of the prior art.
  • This object is achieved by a process in which the conversion of an alkane into the desired ketone is carried out by enzymatic reaction in the presence of a monooxygenase, alcohol dehydrogenase and a suitable cofactor in an aqueous reaction medium in the presence of molecular oxygen.
  • the cofactor used is accepted by both enzyme components (both monooxygenase and alcohol dehydrogenase).
  • NAD (P) H-dependent enzyme components are used.
  • alkanes are generally compounds selected from the group consisting of straight or branched chain, saturated and monounsaturated hydrocarbons having 1 to 20 carbon atoms, in particular 6 to 12
  • Carbon atoms and cyclic hydrocarbons optionally substituted with 1 to 5 carbon atoms, saturated or mono- or polyunsaturated, mononuclear or polynuclear, in which the ring or rings has a total of 6 to 20 carbon atoms, preferably mononuclear, saturated hydrocarbons with 8 , 10 or 12 carbon atoms used.
  • the aqueous reaction system may be single-phase or two-phase and optionally organic solvents such.
  • organic solvents especially isopropanol, dimethyl sulfoxide (DMSO) or methyl tert-butyl ether (MTBE), or emulsifiers.
  • the alkane component for example a cycloalkane
  • the alkane is hydroxylated using and consuming molecular oxygen (O 2) to form the corresponding alcohol (eg cycloalkanol).
  • O 2 molecular oxygen
  • the reduced form of a cofactor eg NAD (P) H
  • P oxidized
  • NAD (P) + oxidized
  • the reaction can also be carried out by isolating the alcohol as a product if no alcohol dehydrogenase suitable for the second reaction step from the alkanol to the alkanone is used.
  • no alcohol dehydrogenase suitable for the second reaction step from the alkanol to the alkanone is used.
  • the process has proven particularly advantageous for the conversion of cycloalkanes to cycloalkanones, with the process for the production of cyclohexanone, cyclooctanone, cyclodecanone and cyclododecanone being used very preferably.
  • the preparation of cyclooctanone (Examples 3 and 5) and cyclodecanone (Example 4) using the method of the invention is described.
  • the process according to the invention is generally at 0 -
  • Monooxygenases Selected Representatives The skilled person is free in the choice of monooxygenase.
  • Preferred monooxygenases are so-called cytochrome P450 monooxygenases (heme monooxygenases).
  • cytochrome P450 monooxygenases which are also recombinantly available and well expressed by means of a bacterial or eukaryotic host organism, are preferably used.
  • the host organism used is preferably Escherichia coli, although other proven host organisms can be used in an advantageous manner.
  • monooxygenases examples include the monooxygenases derived from Bacillus megaterium (in particular the enzyme CYP102A1, also referred to as P450 BM-3) and Thermus thermophilus (in particular the enzyme CYP175A1) and in this case very preferably corresponding mutants suitable for the hydroxylation (Schmid, J. Pleiss, V. Urlacher, Chemistry News 2004, 52, 767-772).
  • the monooxygenase from Bacillus megaterium is described, for example, in D. Appel, S. Lutz-Wahl, P. Fischer, U. Schwaneberg, RD Schmid, J. Biotechnol. 2001, 88, 167-171, U. Schwaneberg, A.
  • a very preferred mutant here is the monooxygenase from P450 BM-3, in which
  • P450 BM-3 mutant F87V This enzyme (hereinafter this polypeptide is referred to as "P450 BM-3 mutant F87V"; the sequence SEQ ID NO: 2 corresponds to this polypeptide) is described in W.T. Sulistyaningdyah, J.
  • Alcohol dehydrogenases Selected representatives
  • alcohol dehydrogenase is free in the choice of alcohol dehydrogenase and will be based on such representatives, which are particularly suitable for the oxidation of the respective alkanol component and in this case by high specific enzyme activities and a dependence on the cofactors NADH and / or NADPH distinguished.
  • preferred alcohol dehydrogenases are the alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir, described in W. Hummel, M. -R. KuIa, EP 456107, 1991, C.W. Bradshaw, W.
  • the genes can be selected for transformation of the host organism used to produce the encoded enzymes.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide that is at least 90%, 95%, or 99% identical to the sequence shown in SEQ ID NO: 2 is used, with the amino acid at position as compared to the wild-type sequence 87 is substituted for another proteinogenic amino acid (eg Phe ⁇ VaI) and the polypeptide has the activity of a monooxygenase.
  • Preferred is a 100% identity with SEQ ID NO: 2.
  • the invention is also a
  • polynucleotide having the sequence from SEQ ID NO: 1 b) polynucleotide having a sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 within the scope of the degeneracy of the genetic code c) polynucleotide having a sequence which corresponds to the complementary sequences to point a) or b ) hybridized under stringent conditions,
  • the invention also provides further mutants of SEQ ID NO: 2 which have been produced by deletion, transition, transversion or insertion at a maximum of 5 positions, which have a higher activity and / or stability and / or selectivity in comparison to the wild type.
  • SSC buffer at a temperature of about 50 0 C - 68 ° C are used.
  • probes can also hybridize with polynucleotides that have less than 70% identity to the sequence of the probe. Such hybrids are less stable and are removed by washing under stringent conditions. This can be achieved, for example, by lowering the salt concentration to 2 ⁇ SSC and optionally subsequently 0.5 ⁇ SSC (The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995), a temperature of about 50 ° C. - 68 ° C is set. It may be possible to lower the salt concentration to 0.1 x SSC. By gradually increasing the salt concentration to 2 ⁇ SSC and optionally subsequently 0.5 ⁇ SSC (The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995), a temperature of about 50 ° C. - 68 ° C is set. It may be possible to lower the salt concentration to 0.1 x SSC. By gradually
  • Hybridization temperature in steps of about 1 - 2 0 C from 50 ° C to 68 ° C polynucleotide fragments can be isolated, for example, at least 70% or at least 80% or at least 90% to 95% or at least 96% to 99% identity to the sequence possess the probe used. It is also possible to isolate polynucleotide fragments which have complete identity with the sequence of the probe employed. Further instructions for hybridization are available on the market in the form of so-called kits (eg DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1603558). In the method according to the invention, isolated enzymes but also whole-cell catalysts are used, with the use of recombinant whole-cell catalysts being quite preferred. In addition, both isolated enzymes and whole-cell catalysts can also be used in immobilized form, with the skilled person being free to choose the immobilization method.
  • kits eg DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1603558.
  • the cells used according to the invention which at least partially contain the enzymes required, preferably the monooxygenase and the alcohol dehydrogenase, can easily be separated off after the reaction. Also, the use of such (recombinant) cells is more economically attractive compared to isolated enzymes for the access of others
  • the reaction of the alkanes is preferably with quiescent cells. This refers to cells that are viable, but do not multiply under given conditions, and which have been transformed with the coding for the required enzymes nucleotide sequences.
  • Another object of the invention is the provision of in the selected host strains in general autonomously replicable vectors which are compatible with each other and contain at least one gene coding for one of the enzymes according to the invention.
  • Vector DNA can be introduced into eukaryotic or prokaryotic cells by known transformation techniques. Preference is given to vectors which contain nucleotide sequences coding for two enzymes, in particular z. For monooxygenase and alcohol dehydrogenase.
  • nucleotide sequences coding for monooxygenase and alcohol dehydrogenase on a vector.
  • the nucleotide sequence for the cofactor is typically located in the genomic DNA of the host organism.
  • a typical preparation of a whole-cell catalyst containing sufficient amounts of the cofactor formed in the recombinant strain for biotransformations see for example: H. Gröger, F. Chamouleau, N. Orologas, C. Rollmann, K. Drauz, W. Hummel, A. Weckbecker, O. May, Angew. Chem. 2006, 118, 5806-5809; Angew. Chem. In t. Ed. 2006, 45, 5677-5681.
  • the procedure is to clone a highly expressible or highly active gene into a low copy vector, lower expression genes on a higher copy vector and / or with a strong promoter.
  • the host cells are transformed with these vectors in such a way that compared to the starting organism they contain at least one additional copy of the nucleotide sequences coding for the two enzymes (monooxygenase and alcohol dehydrogenase).
  • the copy number of the corresponding genes can be increased, or the promoter and regulatory region or ribosome binding site located upstream of the structural gene can be mutated.
  • expression cassettes act, which are installed upstream of the structural gene.
  • genes or gene constructs may either be present in different copy number plasmids or be integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, overexpression of the genes in question can be achieved by changing the composition of the medium and culture.
  • the overexpression leads to an increase in the intracellular activity or concentration of the corresponding enzymes.
  • the increase is generally at least 10 to 500%, in particular 50 to 500% or 100 to 500%, up to a maximum of 1000 or 2000% compared to the concentration or activity of the enzyme in the transformation-based organism (start organism) ,
  • the expression of the gene or the catalytic properties of the enzyme proteins can be reduced or eliminated. If necessary, both measures can be combined.
  • the reduction of gene expression can be achieved by appropriate
  • Signaling structures of gene expression include repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon, and terminators. Details can be found on the
  • Mutations include transitions, transversions, insertions and deletions.
  • Suitable mutations in the genes can be incorporated into suitable strains by gene or allelic replacement.
  • the invention also relates to recombinant
  • Microorganisms in which a monooxygenase according to the invention and a suitable alcohol dehydrogenase are present in overexpressed form are present in overexpressed form.
  • such cells whole-cell catalysts
  • such cells typically still contain the cofactor NAD (P) H required for the biotransformation.
  • the cell walls are permeable by chemical or physical measures for the absorption of the substrates and delivery of the products.
  • the substrates are generally used in a concentration of> 0 to 700 g / L, preferably> 50 to 500 g / L, most preferably> 100 to 300 g / L.
  • the skilled person is free to choose in the way in which the substrate is added. In this case, for example, the entire amount of substrate already be submitted at the beginning of the reaction or alternatively the total amount or a subset of
  • Concentration is preferably understood to mean the ratio of the total amount of the substrate used / total amount of the aqueous reaction medium.
  • Another object of the invention are recombinant microorganisms in which only one mutant monooxygenase is present. These strains contain a polynucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1 and are used for the hydroxylation of said alkanes (e.g., cycloalkanes). In these strains, no alcohol dehydrogenase is overexpressed.
  • the cofactor necessary for the reaction can in any case also be added to the reaction mixture if the cells do not produce it in sufficient quantity.
  • the cofactor can be added both in reduced form (eg NAD (P) H) and in oxidized form (NAD (P) + ).
  • the reaction is carried out either by addition of the reduced form of the cofactor (eg NAD (P) H) as described in Examples 3 and 4 or alternatively starting from the oxidized form and an additive which is the formation of the first Reduction step required reduced form of the cofactor.
  • the additive is preferably an alcohol (in particular isopropanol) which is oxidized in the presence of the alcohol dehydrogenase present and in which the oxidized form reduces the cofactor (eg NAD (P) + ) to the reduced form (eg NAD (P) H) (see Example 5).
  • This expression culture is incubated at 30 ° C. in a shaking incubator (250 rpm) until, at a spectrophotometrically determined cell density of 0.8-1.0 (wavelength: 578 nm), the expression of the monooxygenase gene on the plasmid by addition of isopropyl- ⁇ -D thiogalactopyranoside (concentration: 100 ⁇ M) is induced.
  • the medium is also supplemented with the heme precursor 5-aminolevulinic acid (final concentration: 500 ⁇ M). After 20 hours of expression, the E.
  • coli cells with expressed monooxygenase protein are harvested by centrifugation and the cells in PBS buffer (2 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 , 0.24 g KH 2 PO4, pH 7, 4) once. After resuspension in phosphate buffer (50 mM, pH 7.5), the cells are lysed by ultrasound.
  • the monooxygenase proteins can be purified by anion exchange chromatography as previously described (U. Schwaneberg, U., A. Sprauer, C. Schmidt-Dannert, and RD Schmid. J. Chromatogr. 848, 149-159).
  • Example 2 Enzyme activities of the monooxygenase with the sequence ID NO. 2
  • the enzyme activity is determined spectrophotometrically at a wavelength of 340 nm by measuring the consumption of NADPH by oxidation to NADP + on the basis of a work protocol known from the literature (E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, Angew Chem., 2008, 120, 9693) determined in the presence of the respective cycloalkane as substrate mM ⁇ 1 cm ⁇ 1 ).
  • spectrophotometric determination of the enzyme activity are first in a cuvette (1 mL) 690 ⁇ L phosphate buffer (pH 7.0, 50 mM), 10 .mu.l of a DMSO solution of cycloalkane (100 mM) and 100 .mu.L enzyme solution of the monooxygenase with the sequence ID NO. 2 (partially purified, lyophilized, NADPH-dependent). The reaction is then started after 5 minutes by adding 200 ⁇ l of a solution of NADPH (NADPH: 0.8 mM, phosphate buffer: pH 7.0, 50 mM) and measuring the consumption of NADPH. The relative activities were determined by comparing the spectrophotometrically obtained enzyme activities (in U / mg) with the enzyme activity obtained for the substrate cyclohexane (as a reference experiment with the relative activity 100%).
  • Reaction started by adding 0.01 mmol of the cofactor NADPH (6.5 mg). After shaking the reaction mixture with the aid of a thermomixer for 67 hours at a reaction temperature of 25 ° C, add 1 mL of dichloromethane and extract. Subsequently, the organic phase is freed from the solvent under reduced pressure and the conversion is determined directly from the crude product obtained using 1 H NMR spectroscopy. The conversion is 50% based on the formation of cyclooctanone, wherein the amount of cyclooctanol formed is ⁇ 5%.
  • Example 5 Oxidation of cyclooctane to cyclooctanone with isopropanol as additive and NADP + as cofactor

Abstract

The invention relates to a method for producing ketones by the enzymatic oxidation of alkanes, in which these alkanes are reacted in the presence of a monooxygenase, an alcohol deydrogenase and a cofactor suitable for both enzymes in an aqueous reaction medium in the presence of molecular oxygen.

Description

Verfahren zur enzymatischen Umsetzung von AlkanenProcess for the enzymatic conversion of alkanes
Die Erfindung betrifft die Hydroxylierung von Alkanen sowie die Herstellung von Ketonen aus Alkanen durch enzymatische Reaktionen .The invention relates to the hydroxylation of alkanes and the production of ketones from alkanes by enzymatic reactions.
Die Herstellung von cyclischen Ketonen ist von großer Bedeutung für die chemische Industrie, wobei Cyclohexanon, Cyclooktanon, Cyclodekanon und Cyclododekanon besondere wirtschaftliche Aufmerksamkeit entgegengebracht wird. Für Cyclohexanon bestehen hierbei diverse synthetische Zugangswege ausgehend von verschiedenen Basischemikalien. Besonders attraktiv ist die selektive Direktumwandlung von Cyclohexan zu Cyclohexanon unter Einsatz von Sauerstoff. Eine solcheThe production of cyclic ketones is of great importance to the chemical industry, with particular attention paid to cyclohexanone, cyclooctanone, cyclodecanone and cyclododecanone. For cyclohexanone there are various synthetic access routes starting from different basic chemicals. Particularly attractive is the selective direct conversion of cyclohexane to cyclohexanone using oxygen. Such
Synthese konnte allerdings bis heute noch nicht realisiert werden: Stattdessen erfolgt zunächst im ersten Schritt eine wenig selektive Oxidation von Cyclohexan zu Cyclohexanol und Cyclohexanon, gefolgt von einer aufwändigen destillativen Trennung der beiden Verbindungen. Im zweiten Schritt kann dann eine „Restoxidation" des erhaltenen Cyclohexanols zu Cyclohexanon erfolgen, wobei hierfür typischerweise die aus Perspektive der Nachhaltigkeit und Atomökonomie problematische Salpetersäure zum Einsatz kommt. Der homologe Vertreter Cyclooktanon ist als Bausteine für Monomere ein wichtiges Produkt für die Polymerproduktion. Cyclododekanon (auch Cyclododecanon genannt) wiederum gilt als kommerziell attraktiver Building Block bei der Herstellung von Duftstoffen, UV-Absorber und den Monomeren Laurinlactam und Dodekandicarbonsäure für die Produktion von Nylon-12 oder Nylon-6.12.Synthesis, however, has not been realized until today: Instead, in the first step, a less selective oxidation of cyclohexane to cyclohexanol and cyclohexanone, followed by a complex separation by distillation of the two compounds. In the second step, a "residual oxidation" of the obtained cyclohexanol to cyclohexanone can be carried out, typically using the problematic nitric acid from the perspective of sustainability and atom economy.The homologous cyclooctanone is an important product for polymer production as building blocks for monomers. also called cyclododecanone), in turn, is considered to be a commercially attractive building block in the production of perfumes, UV absorbers and the monomers laurinlactam and dodecanedicarboxylic acid for the production of nylon-12 or nylon-6.12.
Stand der Technik / NachteileState of the art / disadvantages
Das derzeitige gängige Herstellungsverfahren zur Produktion von (insbesondere höher homologen) Cycloalkanonen wieThe current common production process for the production of (especially higher homologous) cycloalkanones such
Cyclooktanon (auch Cyclooctanon genannt) und Cyclododekanon besteht in der Luftoxidation des entsprechenden Cycloalkans in Anwesenheit von Borsäure zu Cycloalkylborat, gefolgt von einer anschließenden Hydrolyse des Borates zum Cycloalkanol und wiederum gefolgt von einer Dehydrierung des Cycloalkanols . Eine Beschreibung dieses technischen Verfahrens beispielsweise zur Synthese von Cyclododecanon findet sich unter anderem in T. Schiffer, G. Oenbrink, "Cyclododecanol, Cyclododecanon and Laurolactam" in Ullmann's Encyclopedia of IndustrialCyclooctanone (also called cyclooctanone) and cyclododecanone consists in the aerial oxidation of the corresponding cycloalkane in the presence of boric acid to cycloalkylborate, followed by a subsequent hydrolysis of the borate to cycloalkanol and followed again by dehydration of the cycloalkanol. A description of this technical process, for example for the synthesis of cyclododecanone can be found inter alia in T. Schiffer, G. Oenbrink, "cyclododecanol, cyclododecanone and laurolactam" in Ullmann's Encyclopedia of Industrial
Chemistry, 6th Edition, 2000, Electronic Release, Wiley VCH und PCT Pat. Appl . WO/2005/030689, Method for Producing Cyclododecanone . Diese Verfahrensweise weist gravierende Nachteile in der Prozessökonomie als auch der Nachhaltigkeit des Gesamtverfahrens auf. Diese Nachteile sind am Beispiel der Herstellung von Cyclododekanon verdeutlicht: Hierbei gewährleistet die Oxidation von Cyclododekan mit Sauerstoff in Gegenwart der Borsäure nur bei geringen Umsätzen eine akzeptable Selektivität, einhergehend mit der Notwendigkeit eines aufwändigen Trennverfahren des resultierendenChemistry, 6th Edition, 2000, Electronic Release, Wiley VCH and PCT Pat. Appl. WO / 2005/030689, Method for Producing Cyclododecanone. This procedure has serious disadvantages in the process economy as well as the sustainability of the overall process. These disadvantages are illustrated by the example of the preparation of cyclododecanone: Here, the oxidation of cyclododecane with oxygen in the presence of boric acid ensures only at low conversions an acceptable selectivity, along with the need for a complex separation process of the resulting
Produktgemisches. Selbst unter Zusatz von Borsäure, die zur Vermeidung einer Überoxidation des entstandenen Cyclododecanols durch Bildung von Borsäureester zugesetzt werden muss, liegt der Umsatz an Cyclododecan nicht über 30%. Das nichtumgesetzte Cyclododecan muss aufwändig abgetrennt und anschließend dem Prozess wieder zurückgeführt werden. Nach der Oxidation müssen die Borsäureester in einem separiert durchgeführten Schritt hydrolysiert werden, wobei sich Cyclododecanol und Cyclododecanon im Verhältnis 10:1 bildet. Resultat ist auch eine hohe Abfallmenge an schwer zu entsorgenden Bor-haltigen Abfällen. Das erhaltene Gemisch an Cyclododecanol und Cyclododecanon (10:1) muss in ebenfalls aufwändiger Weise destillativ aufgetrennt werden. Das Cyclododecanol muss dann schließlich durch Dehydrierung in Cyclododekanon überführt werden, wobei infolge einer exothermen Reaktion wiederum nur partielle Umsätze erhalten werden. Nicht umgesetztes Cyclododecanol muss erneut destillativ abgetrennt und in das Verfahren zurückgeführt werden. Entsprechend ist der bisherige Stand der Technik sowohl aus ökonomischer als auch ökologischer Perspektive mit gravierenden Nachteilen verknüpft. Weitere Bemühungen haben in einem Verfahren unter Einsatz von hochtoxischem Stickstoffmonoxid geführt (PCT Pat. Appl. WO/2005/030689, Method for Producing Cyclododecanone) , wobei auch mit diesem Verfahren erhebliche Nachteile verknüpft sind und das obig beschriebene Verfahren mit Borsäure und Sauerstoff somit nach wie vor den industriellen „Benchmark" darstellt.Product mixture. Even with the addition of boric acid, which must be added to prevent over-oxidation of the resulting cyclododecanol by formation of boric acid ester, the conversion of cyclododecane is not more than 30%. The unreacted cyclododecane must be laboriously separated and then returned to the process again. After oxidation, the boric acid esters must be hydrolyzed in a separated step, wherein cyclododecanol and cyclododecanone in a ratio of 10: 1 is formed. The result is also a high amount of waste in hard to dispose of boron-containing waste. The resulting mixture of cyclododecanol and cyclododecanone (10: 1) must also be distilled by distillation in a complicated manner. The cyclododecanol must then finally be converted by dehydrogenation in cyclododecanone, which again only partial conversions are obtained as a result of an exothermic reaction. Unreacted cyclododecanol has to be removed by distillation again and returned to the process. Accordingly, the current state of the art from both economic and environmental perspective with serious disadvantages. Further efforts have resulted in a process using highly toxic nitric oxide (PCT Pat. Appl. WO / 2005/030689, Method for Producing Cyclododecanone), also with this Significant disadvantages are associated with the process and thus the process described above with boric acid and oxygen is still the industrial benchmark.
Aufgabe der ErfindungObject of the invention
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist es, ein neues Verfahren zur Herstellung von Ketonen aus Alkanen bereitzustellen, das die obig beschriebenen Nachteile des Stands der Technik nicht aufweist.The object underlying the present invention is to provide a novel process for the preparation of ketones from alkanes, which does not have the above-described disadvantages of the prior art.
Beschreibung der Erfindung:Description of the invention:
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, in dem die Umwandlung eines Alkans in das gewünschte Keton durch enzymatische Umsetzung in Gegenwart einer Monooxygenase, Alkoholdehydrogenase und eines geeigneten Cofaktors in einem wässrigen Reaktionsmedium in Gegenwart von molekularem Sauerstoff erfolgt. Der verwendete Cofaktor wird dabei von beiden Enzymkomponenten (sowohl Monooxygenase als auch Alkoholdehydrogenase) akzeptiert. Vorzugsweise werden NAD (P) H- abhängige Enzymkomponenten verwendet.This object is achieved by a process in which the conversion of an alkane into the desired ketone is carried out by enzymatic reaction in the presence of a monooxygenase, alcohol dehydrogenase and a suitable cofactor in an aqueous reaction medium in the presence of molecular oxygen. The cofactor used is accepted by both enzyme components (both monooxygenase and alcohol dehydrogenase). Preferably, NAD (P) H-dependent enzyme components are used.
Als Alkane werden im allgemeinen Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus gerad- oder verzweigtkettigen, gesättigten und einfach ungesättigten Kohlenwasserstoffen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, insbesondere 6 bis 12As alkanes are generally compounds selected from the group consisting of straight or branched chain, saturated and monounsaturated hydrocarbons having 1 to 20 carbon atoms, in particular 6 to 12
Kohlenstoffatomen und cyclischen Kohlenwasserstoffen, gegebenenfalls mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert, gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt, ein- oder mehrkernig, bei denen der Ring oder die Ringe insgesamt 6 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist (en) , bevorzugt einkernige, gesättigten Kohlenwasserstoffen mit 8, 10 oder 12 Kohlenstoffatomen, eingesetzt. Besonders bevorzugt kommen als Alkankomponente unsubstituierte gesättigte Cycloalkane mit der Summenformel CnH2n (mit n = natürliche Zahl >4) zum Einsatz, wobei Cyclohexan, Cyclooktan, Cyclodekan und Cyclododekan ganz bevorzugte Alkankomponenten darstellen.Carbon atoms and cyclic hydrocarbons, optionally substituted with 1 to 5 carbon atoms, saturated or mono- or polyunsaturated, mononuclear or polynuclear, in which the ring or rings has a total of 6 to 20 carbon atoms, preferably mononuclear, saturated hydrocarbons with 8 , 10 or 12 carbon atoms used. Unsubstituted saturated cycloalkanes having the empirical formula C n H 2n (where n = natural number> 4) are particularly preferably used as the alkane component, with cyclohexane, cyclooctane, cyclodecane and cyclododecane representing very preferred alkane components.
Mit Hilfe dieses Reaktionssystems ist es nun überraschenderweise möglich, in einem einfachen wässrigen Reaktionssystem unter äußerst sanften Reaktionsbedingungen die gewünschten Zielverbindungen ausschließlich durch Sauerstoff als Oxidationsmittel in einer EintopfSynthese direkt ausgehend von den jeweiligen Alkanen in hochselektiver Art und Weise und auf einem äußerst nachhaltigen Synthesewege zu erhalten.With the help of this reaction system, it is now surprisingly possible, in a simple aqueous Reaction system under extremely mild reaction conditions to obtain the desired target compounds exclusively by oxygen as an oxidant in a one-pot synthesis directly from the respective alkanes in a highly selective manner and in a highly sustainable synthetic routes.
Das wässrige Reaktionssystem kann einphasig oder zweiphasig vorliegen und gegebenenfalls organische Lösungsmittel wie z. B. Alkohole, insbesondere Isopropanol, Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Methyl- tert-Butylether (MTBE), oder Emulgatoren enthalten .The aqueous reaction system may be single-phase or two-phase and optionally organic solvents such. As alcohols, especially isopropanol, dimethyl sulfoxide (DMSO) or methyl tert-butyl ether (MTBE), or emulsifiers.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird im ersten Schritt ausgehend von der Alkankomponente (z.B. ein Cycloalkan) durch die Monooxygenase das Alkan unter Einsatz und Verbrauch von molekularem Sauerstoff (O2) hydroxyliert unter Ausbildung des korrespondierenden Alkohols (z.B. Cycloalkanol) . Für diesen Schritt wird die reduzierte Form eines Cofaktors (z.B. NAD(P)H) benötigt, der hierbei oxidiert wird (z.B. zum NAD(P)+) . In situ erfolgt nun (ohne Isolierung einesIn the method according to the invention, in the first step starting from the alkane component (for example a cycloalkane) by the monooxygenase, the alkane is hydroxylated using and consuming molecular oxygen (O 2) to form the corresponding alcohol (eg cycloalkanol). For this step, the reduced form of a cofactor (eg NAD (P) H) is needed, which is oxidized (eg to NAD (P) + ). In situ takes place now (without isolation of a
Zwischenprodukts!) die Alkoholdehydrogenase-katalysierte Weiteroxidation des Alkohols zum gewünschten Keton, wobei gleichzeitig die oxidierte Form des Cofaktors mit Hilfe der Alkoholdehydrogenase wieder in die reduzierten Form überführt wird (z.B. zum NAD(P)H) . Die so wieder hergestellte (= regenierte) reduzierte Form des Cofaktors (z.B. NAD(P)H) steht nun für einen erneuten Monooxygenase-katalysierten Hydroxylierungsschritt zur Verfügung. Das beschriebene Reaktionssystem ist graphisch auch in nachfolgender Abbildung, exemplarisch am Beispiel der Herstellung von Cyclooktanon ausgehend von Cyclooktan, aufgezeigt. Die Umsetzung kann auch so geführt werden, dass man den Alkohol als Produkt isoliert, wenn man keine Alkoholdehydrogenase einsetzt, die für den zweiten Reaktionsschritt vom Alkanol zum Alkanon geeignet ist. In diesem Falle würde man zur Regenerierung des Cofaktors eine Glukosedehydrogenase (in Kombination mit Glukose als Cosubstrat) oder eine Formiatdehydrogenase (in Kombination mit Ameisensäure bzw. dessen Salzform) vorzugsweise verwenden, wobei auch andere Methoden der Cofaktorregenerierung Anwendung finden können.Intermediate!) The alcohol dehydrogenase-catalyzed further oxidation of the alcohol to the desired ketone, wherein at the same time the oxidized form of the cofactor with the aid of alcohol dehydrogenase is converted back into the reduced form (eg to NAD (P) H). The thus restored (= regenerated) reduced form of the cofactor (eg NAD (P) H) is now available for a new monooxygenase-catalyzed hydroxylation step. The described reaction system is also shown graphically in the following figure, by way of example using the example of the preparation of cyclooctanone starting from cyclooctane. The reaction can also be carried out by isolating the alcohol as a product if no alcohol dehydrogenase suitable for the second reaction step from the alkanol to the alkanone is used. In this case, it would be preferable to use a glucose dehydrogenase (in combination with glucose as cosubstrate) or a formate dehydrogenase (in combination with formic acid or its salt form) for the regeneration of the cofactor, although other methods of cofactor regeneration may find application.
Besonders vorteilhaft hat sich das Verfahren für die Umwandlung von Cycloalkanen zu Cycloalkanonen erwiesen, wobei ganz bevorzugt das Verfahren für die Herstellung von Cyclohexanon, Cyclooktanon, Cyclodekanon und Cyclododekanon genutzt wird. Im experimentellen Teil ist hierzu die Herstellung von Cyclooktanon (Beispiele 3 und 5) und Cyclodekanon (Beispiel 4) mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.The process has proven particularly advantageous for the conversion of cycloalkanes to cycloalkanones, with the process for the production of cyclohexanone, cyclooctanone, cyclodecanone and cyclododecanone being used very preferably. In the experimental part for this purpose, the preparation of cyclooctanone (Examples 3 and 5) and cyclodecanone (Example 4) using the method of the invention is described.
Es ist als unerwartet anzusehen, dass es mit Hilfe der beschriebenen - verglichen mit dem Stand der Technik - äußerst sanften enzymatischen Oxidationsmethode in Wasser gelingt, einen selektiveren und zugleich mit signifikant höheren Umsätzen verbundenen Syntheseweg zu Alkanonen, vorzugsweise Cycloalkanonen, ausgehend von der jeweiligen Alkankomponente herbeizuführen. In den bisherigen Verfahren hat sich gezeigt, dass Reaktionsbedingungen, die zu höheren It is to be regarded as unexpected that it is possible with the help of the described - compared to the state of the art - extremely gentle enzymatic oxidation method in water, a more selective and at the same time with significantly higher sales associated synthesis route to alkanones, preferably cycloalkanones, starting from the respective alkane component , In the previous methods it has been shown that reaction conditions leading to higher
Selektivitäten führen, typischerweise mit niedrigeren Umsätzen verknüpft sind (siehe Stand der Technik) . Auch als überraschend ist anzusehen, dass die beiden enzymatischen Schritte in einer solchen Art und Weise kompatibel sind, dass zur Regeneration des Cofaktors jeweils die andere enzymatische Reaktion dient und somit keine weiteren Arten der Cofaktorregenerierung (unter Zuhilfenahme weiterer Cosubstrate) notwendig sind. Da zudem gleich drei äußerst hydrophobe unnatürliche Komponenten in erhöhten Konzentrationen eingesetzt werden kann es als weiterhin überraschend angesehen werden, das keine (signifikanten) Inhibierungseffekte dieser Komponenten weder auf die Monooxygenase noch auf die Alkoholdehydrogenase beobachtbar sind.Selectivity, typically associated with lower sales (see prior art). It is also to be regarded as surprising that the two enzymatic steps are compatible in such a way that each of the other enzymatic reaction serves to regenerate the cofactor and thus no further types of cofactor regeneration (with the aid of further cosubstrates) are necessary. In addition, since three extremely hydrophobic unnatural components are used in increased concentrations, it can further be regarded as surprising that no (significant) inhibitory effects of these components on either the monooxygenase or the alcohol dehydrogenase are observable.
Im nachfolgenden Teil sind beispielhaft Gene und die dazugehörigen Enzyme enthalten, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können.The following part contains by way of example genes and the associated enzymes which can be used according to the invention.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird im Allgemeinen bei 0 -The process according to the invention is generally at 0 -
90°C, insbesondere 15 - 500C und ganz bevorzugt zwischen 20 - 40 0C durchgeführt.90 ° C, in particular 15 - 50 0 C and most preferably carried out between 20 - 40 0 C.
1. Monooxygenasen : Ausgewählte Vertreter Der Fachmann ist frei in der Wahl der Monooxygenase. Als bevorzugte Monooxygenasen gelten sogenannte Cytochrom P450- Monooxygenasen (Häm-Monooxygenasen) . Darunter werden insbesondere bakterielle Cytochrom P450-Monooxygenasen, die zudem rekombinant verfügbar sind und mit Hilfe eines bakteriellen oder eukaryontischen Wirtsorganismus gut exprimiert werden, vorzugsweise eingesetzt. Als Wirtsorganismus wird bevorzugt Escherichia coli verwendet, wobei auch andere bewährte Wirtsorganismen in vorteilhafter Weise zum Einsatz kommen können. Als Beispiele für besonders geeignete Monooxygenasen sind die aus Bacillus megaterium (insbesondere das Enzym CYP102A1, auch als P450 BM-3 bezeichnet) sowie Thermus thermophilus (insbesondere das Enzym CYP175A1) stammenden Monooxygenasen und hierbei ganz bevorzugt entsprechend für die Hydroxylierung geeignete Mutanten zu nennen (R. Schmid, J. Pleiss, V. Urlacher, Nachrichten aus der Chemie 2004, 52, 767-772) . Die Monooxygenase aus Bacillus megaterium ist beispielsweise beschrieben in D. Appel, S. Lutz-Wahl, P. Fischer, U. Schwaneberg, R. D. Schmid, J. Biotechnol. 2001, 88, 167-171, U. Schwaneberg, A. Sprauer, C. Schmidt-Dannert, R. D. Schmid, J. Chromatography A 1999, 848, 149-159 sowie J. Kuper, T. S. Wong, D. Roccatano, M. Wilmanns, U. Schwaneberg, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 5786 und für Hydroxylierungen geeignete Mutanten dieses Enzyms sind beispielsweise in D. Appel, S. Lutz-Wahl, P. Fischer, U.1. Monooxygenases: Selected Representatives The skilled person is free in the choice of monooxygenase. Preferred monooxygenases are so-called cytochrome P450 monooxygenases (heme monooxygenases). Of these, in particular bacterial cytochrome P450 monooxygenases, which are also recombinantly available and well expressed by means of a bacterial or eukaryotic host organism, are preferably used. The host organism used is preferably Escherichia coli, although other proven host organisms can be used in an advantageous manner. Examples of particularly suitable monooxygenases are the monooxygenases derived from Bacillus megaterium (in particular the enzyme CYP102A1, also referred to as P450 BM-3) and Thermus thermophilus (in particular the enzyme CYP175A1) and in this case very preferably corresponding mutants suitable for the hydroxylation (Schmid, J. Pleiss, V. Urlacher, Chemistry News 2004, 52, 767-772). The monooxygenase from Bacillus megaterium is described, for example, in D. Appel, S. Lutz-Wahl, P. Fischer, U. Schwaneberg, RD Schmid, J. Biotechnol. 2001, 88, 167-171, U. Schwaneberg, A. Sprauer, C. Schmidt-Dannert, RD Schmid, J. Chromatography A 1999, 848, 149-159 and J. Kuper, TS Wong, D. Roccatano, M. Wilmanns, U. Schwaneberg, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 5786 and mutants suitable for hydroxylations of this enzyme are described, for example, in D. Appel, S. Lutz-Wahl, P. Fischer, U.
Schwaneberg, R. D. Schmid, J. Biotechnol. 2001, 85, 167-171, T. S. Wong, F. H. Arnold, U. Schwaneberg, Biotechnol . Bioeng.Schwaneberg, R.D. Schmid, J. Biotechnol. 2001, 85, 167-171, T.S. Wong, F.H. Arnold, U. Schwaneberg, Biotechnol. Bioeng.
2004, 85, 351-358, S. C. Maurer, K. Kuehnel, L. A. Kaysser, S. Eiben, R. D. Schmid, V.B. Urlacher, Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1090-1098, P. Meinhold. M. W. Peters. M. M. Chen, T.2004, 85, 351-358, S.C. Maurer, K. Kuehnel, L.A. Kaysser, S.Eiben, R.D. Schmid, V.B. Urlacher, Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1090-1098, P. Meinhold. M.W. Peters. M.M. Chen, T.
Takahashi, F. H. Arnold, ChemBioChem 2005, 6, 1765-1768, und D. F. Munzer, P. Meinhold, M. W. Peters, S. Feichtenhofer, H. Griengl, F. H. Arnold, A. Glieder, A. de Raadt, Chem. Commun.Takahashi, F.H. Arnold, ChemBioChem 2005, 6, 1765-1768, and D.F. Munzer, P. Meinhold, M.W. Peters, S. Feichtenhofer, H. Griengl, F.H. Arnold, A.Glieder, A. de Raadt, Chem. Commun.
2005, 2597-2599 genannt. Eine ganz bevorzugte Mutante stellt hierbei die Monooxygenase aus P450 BM-3 dar, bei der im2005, called 2597-2599. A very preferred mutant here is the monooxygenase from P450 BM-3, in which
Vergleich zum Wildtypenzym das in Position 87 befindliche Phenylalanin durch Valin ausgetauscht ist. Dieses Enzym (im Folgenden wird dieses Polypeptid als „P450 BM-3 Mutante F87V" bezeichnet; die Sequenz SEQ ID NO: 2 entspricht diesem Polypeptid) ist beschrieben in W. T. Sulistyaningdyah, J.Compared to the wild-type enzyme, the phenylalanine in position 87 is replaced by valine. This enzyme (hereinafter this polypeptide is referred to as "P450 BM-3 mutant F87V"; the sequence SEQ ID NO: 2 corresponds to this polypeptide) is described in W.T. Sulistyaningdyah, J.
Ogawa, Q. -S. Li, C. Maeda, Y. Yano, R. D. Schmid, S. Shimizu, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 67, 556-562 sowie S. Graham-Lorence, G. Truan, J. A. Peterson, J. R. Falck, S. Wie, C. Helvig, J. H. Capdevila, J. Biol. Chem. 1997, 272, 1127- 1135. Die Monooxygenase aus Thermus thermophilus ist beispielsweise beschrieben in PCT Pat . Appl. WO0233057, 2002.Ogawa, Q. -S. Li, C. Maeda, Y. Yano, R.D. Schmid, S. Shimizu, Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, 67, 556-562 and S. Graham-Lorence, G. Truan, JA Peterson, JR Falck, S. Wie, C. Helvig, JH Capdevila, J. Biol. Chem. 1997, 272, 1127-1135 Monooxygenase from Thermus thermophilus is described for example in PCT Pat. Appl. WO0233057, 2002.
Die Anwendung von Monooxygenasen in präparativen Hydroxylierungsreaktionen ist in K. Kühnel, S. C. Maurer, Y. Galeyeva, W. Frey, S. Laschat, V. B. Urlacher, Adv. Synth.The use of monooxygenases in preparative hydroxylation reactions is described in K. Kühnel, S.C. Maurer, Y. Galeyeva, W. Frey, S. Laschat, V. B. Urlacher, Adv. Synth.
Catal. 2007, 349, 1451-1461 beschrieben. Hierbei wird eine C- H-Bindungseinheit des Substrats in eine C-OH-Einheit überführt. Für die Hydroxylierung wird Sauerstoff als Oxidationsmittel sowie eine reduzierte Form des Cofaktors (NAD(P)H) benötigt. Die bei der Reaktion erhaltene oxidierte Form des Cofaktors wird anschließend in situ in die reduzierte Form wieder umgewandelt. Bei diesem Schritt wird nun ein Co- Substrat sowie ein weiteres Enzym benötigt. Typischerweise wird Ameisensäure eingesetzt in Gegenwart einerCatal. 2007, 349, 1451-1461. Here, a C-H bond unit of the substrate is converted into a C-OH unit. For the hydroxylation, oxygen is used as the oxidant and a reduced form of the cofactor (NAD (P) H) needed. The oxidized form of the cofactor obtained in the reaction is then reconverted in situ to the reduced form. This step now requires a co-substrate and another enzyme. Typically, formic acid is used in the presence of a
Formiatdehydrogenase als Enzymkomponente. Die Notwendigkeit des Co-Substrats stellt allerdings einen (nachteiligen) zusätzlichen Kostenfaktor dar und vermindert auch die Atomökonomie des Gesamtprozesses als Kriterium für die Nachhaltigkeit einer Synthese in unvorteilhafter Weise. Es sei an dieser Stelle noch einmal darauf verwiesen, dass dieser Nachteil beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht mehr besteht und hierbei eine Cosubstrat-freie Synthese realisiert werden kann .Formate dehydrogenase as enzyme component. The necessity of the co-substrate, however, represents a (disadvantageous) additional cost factor and also reduces the atom economy of the overall process as a criterion for the sustainability of a synthesis in an unfavorable manner. It should again be pointed out at this point that this disadvantage no longer exists in the process according to the invention and in this case a cosubstrate-free synthesis can be realized.
2. Alkoholdehydrogenasen : Ausgewählte Vertreter2. Alcohol dehydrogenases: Selected representatives
Der Fachmann ist frei in der Wahl der Alkoholdehydrogenase und wird sich hierbei an solchen Vertretern orientieren, die in besonderer Form für die Oxidation der jeweiligen Alkanolkomponente geeignet sind und sich hierbei durch hohe spezifische Enzymaktivitäten und eine Abhängigkeit von den Cofaktoren NADH und/oder NADPH auszeichnen. Bevorzugt eingesetzte Alkoholdehydrogenasen sind die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir, die in W. Hummel, M. -R. KuIa, EP 456107, 1991, C. W. Bradshaw, W.The skilled person is free in the choice of alcohol dehydrogenase and will be based on such representatives, which are particularly suitable for the oxidation of the respective alkanol component and in this case by high specific enzyme activities and a dependence on the cofactors NADH and / or NADPH distinguished. Preferably used alcohol dehydrogenases are the alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir, described in W. Hummel, M. -R. KuIa, EP 456107, 1991, C.W. Bradshaw, W.
Hummel, C-H. Wong, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532-1536 und A. Weckbecker, W. Hummel, Biocat. Biotransf. 2006, 24, 380-389 beschrieben ist, als auch die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis, die u.a. in K. Niefind, B. Riebel, J. Müller, W. Hummel, D. Schomburg, Acta Cryst. Sect . D 2000,Hummel, C-H. Wong, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532-1536 and A. Weckbecker, W. Hummel, Biocat. Biotransf. 2006, 24, 380-389, as well as the alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis, which i.a. in K. Niefind, B. Riebel, J. Muller, W. Hummel, D. Schomburg, Acta Cryst. Sect. D 2000,
D56, 1696-1698 und N. H. Schlieben, K. Niefind, J. Müller, B. Riebel, W. Hummel, D. Schomburg, J. Mol. Biol. 2005, 349, 801- 813 beschrieben ist. Darüber hinaus lassen sich auch andere in der organischen Synthese bereits erfolgreich eingesetzte Alkoholdehydrogenasen verwenden. Eine Übersicht solcher weiterer bevorzugter Alkoholdehydrogenasen ist u.a. in S. Buchholz, H. Gröger in: Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industries (Hrsg.: R. N. Patel) , CRC Press, New York, 2006, Kapitel 32 enthalten. Die Herkunft der für die genannten Enzyme kodierenden Polynukleotide ist im Allgemeinen nicht auf die Gattung oder Spezies des rekombinanten Mikroorganismus beschränkt, der als Host dient.D56, 1696-1698 and NH Schlieben, K. Niefind, J. Muller, B. Riebel, W. Hummel, D. Schomburg, J. Mol. Biol. 2005, 349, 801-813. In addition, it is also possible to use other alcohol dehydrogenases already successfully used in organic synthesis. An overview of such further preferred alcohol dehydrogenases is contained, inter alia, in S. Buchholz, H. Gröger in: Biocatalysis in the Pharmaceutical and Biotechnology Industries (Ed .: RN Patel), CRC Press, New York, 2006, Chapter 32. The origin of the polynucleotides encoding the said enzymes is generally not limited to the genus or species of the recombinant microorganism which serves as a host.
Die Gene können ohne Rücksicht auf die Herkunft zur Transformation des Host-Organismus ausgewählt werden, die zur Herstellung der codierten Enzyme dienen.Regardless of their origin, the genes can be selected for transformation of the host organism used to produce the encoded enzymes.
Bevorzugt wird ein Polynukleotid eingesetzt, das für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Sequenz, dargestellt in der SEQ ID NO: 2, wobei im Vergleich zur Sequenz des Wildtyps die Aminosäure an der Position 87 gegen eine andere proteinogene Aminosäure ausgetauscht ist (z. B. Phe → VaI) , und das Polypeptid die Aktivität einer Monooxygenase besitzt. Bevorzugt ist eine 100%-ige Identität mit SEQ ID NO: 2. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls einPreferably, a polynucleotide encoding a polypeptide that is at least 90%, 95%, or 99% identical to the sequence shown in SEQ ID NO: 2 is used, with the amino acid at position as compared to the wild-type sequence 87 is substituted for another proteinogenic amino acid (eg Phe → VaI) and the polypeptide has the activity of a monooxygenase. Preferred is a 100% identity with SEQ ID NO: 2. The invention is also a
a) Polynukleotid mit der Sequenz aus SEQ ID NO: 1 b) Polynukleotid mit einer Sequenz korrespondierend zu SEQ ID NO: 1 im Umfang der Degeneriertheit des genetischen Kodes c) Polynukleotid mit einer Sequenz, die mit den komplementären Sequenzen zu Punkt a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,a) polynucleotide having the sequence from SEQ ID NO: 1 b) polynucleotide having a sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 within the scope of the degeneracy of the genetic code c) polynucleotide having a sequence which corresponds to the complementary sequences to point a) or b ) hybridized under stringent conditions,
das für das genannte Polypeptid kodiert.which encodes said polypeptide.
Gegenstand der Erfindung sind auch weitere durch Deletion, Transition, Transversion oder Insertion an maximal 5 Positionen entstandene Mutanten von SEQ ID NO: 2, die eine höhere Aktivität und/oder Stabilität und/oder Selektivität im Vergleich zum Wildtyp aufweisen.The invention also provides further mutants of SEQ ID NO: 2 which have been produced by deletion, transition, transversion or insertion at a maximum of 5 positions, which have a higher activity and / or stability and / or selectivity in comparison to the wild type.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al . (Internation Journal of Systemtic Bacteriology 41: 255-260 (1991)) . Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird vorzugsweise bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996) .Instructions for the identification of DNA sequences by means of hybridization can be found by the person skilled in the art, inter alia, in the manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" by Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993). and in Liebl et al. (International Journal of Systemic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). The hybridization takes place under stringent conditions, that is, only hybrids are formed in which the probe and target sequence, ie the polynucleotides treated with the probe, are at least 70% identical. It is known that the stringency of the hybridization including the washing steps is influenced or determined by varying the buffer composition, the temperature and the salt concentration. The hybridization reaction is preferably carried out at a relatively low stringency compared to the washing steps (Hybaid Hybridization Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996).
Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein 5 xFor the hybridization reaction, for example, a 5 x
SSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 500C - 68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde ausweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken der Salzkonzentration auf 2 x SSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5 x SSC (The DIG System Users Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 500C - 68°C eingestellt wird. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf 0,1 x SSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung derSSC buffer at a temperature of about 50 0 C - 68 ° C are used. In this case, probes can also hybridize with polynucleotides that have less than 70% identity to the sequence of the probe. Such hybrids are less stable and are removed by washing under stringent conditions. This can be achieved, for example, by lowering the salt concentration to 2 × SSC and optionally subsequently 0.5 × SSC (The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995), a temperature of about 50 ° C. - 68 ° C is set. It may be possible to lower the salt concentration to 0.1 x SSC. By gradually increasing the
Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 20C von 50°C auf 68°C können Polynukleotidfragmente isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% oder mindestens 96% bis 99% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Es ist ebenfalls möglich Polynukleotidfragmente zu isolieren, die eine vollständige Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z. B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland, Catalog No. 1603558) . Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden isolierte Enzyme aber auch Ganzzellkatalysatoren eingesetzt, wobei die Verwendung von rekombinanten Ganzzellkatalysatoren ganz bevorzugt ist. Darüber hinaus können sowohl isolierte Enzyme und Ganzzellkatalysatoren auch in immobilisierter Form verwendet werden, wobei der Fachmann frei in der Wahl der Immobilisierungsmethode ist.Hybridization temperature in steps of about 1 - 2 0 C from 50 ° C to 68 ° C polynucleotide fragments can be isolated, for example, at least 70% or at least 80% or at least 90% to 95% or at least 96% to 99% identity to the sequence possess the probe used. It is also possible to isolate polynucleotide fragments which have complete identity with the sequence of the probe employed. Further instructions for hybridization are available on the market in the form of so-called kits (eg DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Catalog No. 1603558). In the method according to the invention, isolated enzymes but also whole-cell catalysts are used, with the use of recombinant whole-cell catalysts being quite preferred. In addition, both isolated enzymes and whole-cell catalysts can also be used in immobilized form, with the skilled person being free to choose the immobilization method.
Beim Einsatz von rekombinanten Ganzzellkatalysatoren ergibt sich der Vorteil, dass die hierbei erfindungsgemäß eingesetzten Zellen, die die benötigten Enzyme zumindest teilweise enthalten, bevorzugt die Monooxygenase und die Alkoholdehydrogenase, nach der Reaktion leicht abgetrennt werden können. Auch ist der Einsatz von solchen (rekombinanten) Zellen ökonomisch attraktiver im Vergleich zu isolierten Enzymen, für deren Zugang weitereWhen recombinant whole-cell catalysts are used, there is the advantage that the cells used according to the invention, which at least partially contain the enzymes required, preferably the monooxygenase and the alcohol dehydrogenase, can easily be separated off after the reaction. Also, the use of such (recombinant) cells is more economically attractive compared to isolated enzymes for the access of others
Produktionsschritte wie ZellaufSchluss, Abtrennung ungelöster Zellbestandteile, Enzymreinigung und/oder -isolierung nötig sind. Auch ist die Stabilität von Enzymen in (rekombinanten) Zellen oftmals erhöht im Vergleich zur Stabilität der „freien" in Lösung vorliegenden Enzyme.Production steps such as cell disruption, separation of undissolved cell components, enzyme purification and / or isolation are necessary. Also, the stability of enzymes in (recombinant) cells is often increased compared to the stability of the "free" enzymes present in solution.
Die Umsetzung der Alkane (z.B. Cycloalkane) erfolgt bevorzugt mit ruhenden Zellen. Darunter versteht man Zellen, die lebensfähig sind, sich aber unter gegebenen Bedingungen nicht vermehren, und die mit den für die benötigten Enzyme kodierenden Nukleotidsequenzen transformiert wurden.The reaction of the alkanes (e.g., cycloalkanes) is preferably with quiescent cells. This refers to cells that are viable, but do not multiply under given conditions, and which have been transformed with the coding for the required enzymes nucleotide sequences.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von in den ausgewählten Host-Stämmen im allgemeinen autonom replizierbaren Vektoren, die miteinander kompatibel sind und mindestens ein Gen enthalten, das für eines der erfindungsgemäß notwendigen Enzyme kodiert.Another object of the invention is the provision of in the selected host strains in general autonomously replicable vectors which are compatible with each other and contain at least one gene coding for one of the enzymes according to the invention.
Vector DNA kann in eukaroyotische oder prokaryotische Zellen durch bekannte Transformationstechniken eingeführt werden. Bevorzugt werden Vektoren, die für zwei Enzyme kodierende Nukleotidsequenzen enthalten, insbesondere z. B. für Monooxygenase und Alkoholdehydrogenase .Vector DNA can be introduced into eukaryotic or prokaryotic cells by known transformation techniques. Preference is given to vectors which contain nucleotide sequences coding for two enzymes, in particular z. For monooxygenase and alcohol dehydrogenase.
Vorteilhaft ist auch die Kombination von für Monooxygenase und Alkoholdehydrogenase kodierenden Nukleotidsequenzen auf einem Vektor.Also advantageous is the combination of nucleotide sequences coding for monooxygenase and alcohol dehydrogenase on a vector.
Die Nukleotidsequenz für den Cofaktor befindet sich typischerweise in der genomischen DNA des Wirtsorganismus. Für eine typische Herstellung eines Ganzzellkatalysators enthaltend für Biotransformationen ausreichende Mengen des im rekombinanten Stamm gebildeten Cofaktors, siehe beispielsweise: H. Gröger, F. Chamouleau, N. Orologas, C. Rollmann, K. Drauz, W. Hummel, A. Weckbecker, O. May, Angew. Chem . 2006, 118, 5806-5809 ; Angew. Chem . In t . Ed . 2006, 45, 5677 -5681 .The nucleotide sequence for the cofactor is typically located in the genomic DNA of the host organism. For a typical preparation of a whole-cell catalyst containing sufficient amounts of the cofactor formed in the recombinant strain for biotransformations, see for example: H. Gröger, F. Chamouleau, N. Orologas, C. Rollmann, K. Drauz, W. Hummel, A. Weckbecker, O. May, Angew. Chem. 2006, 118, 5806-5809; Angew. Chem. In t. Ed. 2006, 45, 5677-5681.
Im Allgemeinen geht man so vor, dass man ein gut exprimierbares oder sehr aktives Gen in einen Vektor mit niedriger Kopienzahl, Gene mit schwächerer Expressionsleistung auf einem Vektor mit höherer Kopienzahl und/oder mit einem starken Promotor kloniert. Die Wirtszellen sind mit diesen Vektoren in der Weise transformiert, dass sie im Vergleich zum Startorganismus mindestens jeweils eine zusätzlicher Kopie der für die beiden Enzyme (Monooxygenase und Alkoholdehydrogenase) kodierenden Nukleotidsequenzen enthalten.In general, the procedure is to clone a highly expressible or highly active gene into a low copy vector, lower expression genes on a higher copy vector and / or with a strong promoter. The host cells are transformed with these vectors in such a way that compared to the starting organism they contain at least one additional copy of the nucleotide sequences coding for the two enzymes (monooxygenase and alcohol dehydrogenase).
Durch diese Maßnahme gelingt es, die genannten Nukleotidsequenzen zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren .By means of this measure it is possible to amplify the said nucleotide sequences, in particular to overexpress them.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, dieTo achieve overexpression, the copy number of the corresponding genes can be increased, or the promoter and regulatory region or ribosome binding site located upstream of the structural gene can be mutated. In the same way, expression cassettes act, which are installed upstream of the structural gene. By inducible promoters it is additionally possible, the
Expression zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.Increase expression. Through measures to extend the Life span of m-RNA also improves expression. Furthermore, by preventing degradation of the enzyme protein, enzyme activity is also enhanced. The genes or gene constructs may either be present in different copy number plasmids or be integrated and amplified in the chromosome. Alternatively, overexpression of the genes in question can be achieved by changing the composition of the medium and culture.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al . (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)) , Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al . (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Reinscheid et al .For instructions on this, the skilled person will find, inter alia, in Martin et al. (Bio / Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio / Technology 6, 428-430 (1988)), in Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), European Patent 0 472 869, U.S. Patent 4,601,893, Schwarzer and Pühler (Bio / Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid et al.
(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al . (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15 - 24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in the patent application WO 96/15246, in Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993)), Japanese Laid-Open Patent Publication JP-A-10-229891, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), Makrides (Microbiological Reviews 60: 512 -538 (1996)) and in known textbooks of genetics and molecular biology.
Die Überexpression führt zur Erhöhung der intrazellulären Aktivität oder Konzentration der entsprechenden Enzyme.The overexpression leads to an increase in the intracellular activity or concentration of the corresponding enzymes.
Die Steigerung liegt im allgemeinen bei mindestens 10 bis 500 %, insbesondere 50 bis 500 % oder 100 bis 500 %, bis zu einem Maximum von 1000 oder 2000 % verglichen mit der Konzentration oder Aktivität des Enzyms in dem der Transformation zugrunde liegenden Organismus (Startorganismus) .The increase is generally at least 10 to 500%, in particular 50 to 500% or 100 to 500%, up to a maximum of 1000 or 2000% compared to the concentration or activity of the enzyme in the transformation-based organism (start organism) ,
Zur Erzielung einer Abschwächung können beispielsweise die Expression des Gens oder die katalytischen Eigenschaften der Enzymproteine herabgesetzt bzw. ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen kombiniert werden. Die Verringerung der Genexpression kann durch geeigneteTo achieve a weakening, for example, the expression of the gene or the catalytic properties of the enzyme proteins can be reduced or eliminated. If necessary, both measures can be combined. The reduction of gene expression can be achieved by appropriate
Kulturführung, durch genetische Veränderung (Mutation) der Signalstrukturen der Genexpression oder auch durch Antisense- RNA Technik erfolgen. Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren, Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und Terminatoren. Angaben hierzu findet derCulture leadership, by genetic modification (mutation) of the Signal structures of gene expression or by antisense RNA technique done. Signaling structures of gene expression include repressor genes, activator genes, operators, promoters, attenuators, ribosome binding sites, the start codon, and terminators. Details can be found on the
Fachmann unter anderem beispielsweise bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), bei Carrier und Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999)), Franch und Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159-164 (2000)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie beispielsweise dem Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) .For example, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998)), Carrier and Keasling (Biotechnology Progress 15, 58-64 (1999)), Franch and Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3, 159 -164 (2000)) and in known textbooks of genetics and molecular biology such as the textbook by Knippers ("Molecular Genetics", 6th Edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995) or Winnacker's ("Genes and Clones"). , VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung beziehungsweise Herabsetzung der katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Als Beispiele seien die Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al . (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998)), Wente und Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991)) genannt. Zusammenfassende Darstellungen können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. dem von Hagemann („AllgemeineMutations that lead to an alteration or reduction of the catalytic properties of enzyme proteins are known from the prior art. As examples, the works of Qiu and Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 5511-5515 (1998)), Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839 (1991)). Summary presentations may be made of known textbooks of genetics and molecular biology such as e.g. that of Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden .Genetics ", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen, Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen („missense mutations") oder Nichtsinnmutationen („nonsense mutations") gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar in einem Gen führen zu Rasterverschiebungsmutationen („frame shift mutations"), die dazu führen, dass „falsche" Aminosäuren eingebaut werden oder die Translation vorzeitig abbricht. Entsteht als Folge der Mutation ein Stop-Kodon im Kodierbereich, so führt dies ebenfalls zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation. Deletionen von mehreren Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Generierung derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und können bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie wie z.B. demMutations include transitions, transversions, insertions and deletions. Depending on the effect of the amino acid exchange on the enzyme activity, one speaks of missense mutations or nonsense mutations. Insertions or deletions of at least one base pair in a gene result in frame shift mutations that result in the incorporation of "wrong" amino acids or the premature termination of translation. If, as a consequence of the mutation, a stop codon arises in the coding area, this also leads to a premature one Stop the translation. Deletions of several codons typically result in complete loss of enzyme activity. Instructions for generating such mutations are known in the art and may be familiar to known textbooks of genetics and molecular biology, such as US Pat
Lehrbuch von Knippers („Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker („Gene und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland, 1990) oder dem von Hagemann („Allgemeine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.Textbook by Knippers ("Molekulare Genetik", 6th edition, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995), the Winnacker ("Gene and clones", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990) or Hagemann ("General Genetics ", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).
Geeignete Mutationen in den Genen wie beispielsweise Deletionsmutationen können durch Gen- bzw. Allelaustausch in geeignete Stämme eingebaut werden.Suitable mutations in the genes, such as deletion mutations, can be incorporated into suitable strains by gene or allelic replacement.
Gegenstand der Erfindung sind auch rekombinanteThe invention also relates to recombinant
Mikroorganismen, in denen eine erfindungsgemäße Monooxygenase und eine geeignete Alkoholdehydrogenase in überexprimierter Form vorliegen. Zusätzlich enthalten solche Zellen (Ganzzellkatalysatoren) typischerweise noch den für die Biotransformation benötigten Cofaktor NAD(P)H.Microorganisms in which a monooxygenase according to the invention and a suitable alcohol dehydrogenase are present in overexpressed form. In addition, such cells (whole-cell catalysts) typically still contain the cofactor NAD (P) H required for the biotransformation.
Diese werden als Ganzzellkatalysatoren bezeichnet und bevorzugt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt.These are referred to as whole-cell catalysts and are preferably used in the process according to the invention.
Dabei werden die Zellwände durch chemische oder physikalische Maßnahmen durchlässig für die Aufnahme der Substrate und Abgabe der Produkte.The cell walls are permeable by chemical or physical measures for the absorption of the substrates and delivery of the products.
Die Substrate werden im Allgemeinen in einer Konzentration von > 0 bis 700 g/L, vorzugsweise >50 bis 500 g/L, ganz besonders bevorzugt >100 bis 300 g/L eingesetzt. Der Fachmann ist dabei frei in der Wahl in der Art und Weise, wie das Substrat zugegeben wird. Dabei kann beispielsweise die gesamte Substratmenge bereits am Beginn der Reaktion vorgelegt werden oder alternativ die Gesamtmenge oder eine Teilmenge desThe substrates are generally used in a concentration of> 0 to 700 g / L, preferably> 50 to 500 g / L, most preferably> 100 to 300 g / L. The skilled person is free to choose in the way in which the substrate is added. In this case, for example, the entire amount of substrate already be submitted at the beginning of the reaction or alternatively the total amount or a subset of
Substrats dosiert über einen bestimmten Zeitraum während der Reaktions zugegeben werden. Unter Konzentration wird dabei bevorzugt das Verhältnis der Gesamtmenge des eingesetzten Substrats/Gesamtmenge des wässrigen Reaktionsmediums verstanden.Substrate dosed over a period of time during the reaction are added. Concentration is preferably understood to mean the ratio of the total amount of the substrate used / total amount of the aqueous reaction medium.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind rekombinante Mikroorganismen, in denen nur eine mutierte Monooxygenase vorliegt. Diese Stämme enthalten eine Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 und werden zur Hydroxylierung der genannten Alkane (z.B. Cycloalkane) eingesetzt. In diesen Stämmen wird keine Alkoholdehydrogenase überexprimiert .Another object of the invention are recombinant microorganisms in which only one mutant monooxygenase is present. These strains contain a polynucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 1 and are used for the hydroxylation of said alkanes (e.g., cycloalkanes). In these strains, no alcohol dehydrogenase is overexpressed.
Der für die Reaktion notwendige Cofaktor kann in jedem Fall auch dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, wenn die Zellen diesen nicht in ausreichender Menge produzieren. Dabei kann der Cofaktor sowohl in reduzierter Form (z.B. NAD(P)H) als auch in oxidierter Form (NAD(P)+) zugesetzt werden.The cofactor necessary for the reaction can in any case also be added to the reaction mixture if the cells do not produce it in sufficient quantity. The cofactor can be added both in reduced form (eg NAD (P) H) and in oxidized form (NAD (P) + ).
Werden isolierte Enzyme verwendet, so erfolgt die Umsetzung entweder durch Zugabe der reduzierten Form des Cofaktors (z.B. NAD(P)H) wie in Beispiel 3 und 4 beschrieben oder alternativ ausgehend von der oxidierten Form und eines Additivs, das die Bildung der für den ersten Reduktionsschritt erforderlichen reduzierten Form des Cofaktors ermöglicht. Letztere Vorgehensweise ist in Beispiel 5 beschrieben. Vorzugsweise stellt das Additiv hierbei ein Alkohol dar (insbesondere Isopropanol) , der in Gegenwart der vorhandenen Alkoholdehydrogenase oxidiert wird und hierbei die oxidierte Form den Cofaktors (z.B. NAD(P)+) zur reduzierten Form (z.B. NAD(P)H) reduziert (siehe Beispiel 5) .If isolated enzymes are used, the reaction is carried out either by addition of the reduced form of the cofactor (eg NAD (P) H) as described in Examples 3 and 4 or alternatively starting from the oxidized form and an additive which is the formation of the first Reduction step required reduced form of the cofactor. The latter procedure is described in Example 5. In this case, the additive is preferably an alcohol (in particular isopropanol) which is oxidized in the presence of the alcohol dehydrogenase present and in which the oxidized form reduces the cofactor (eg NAD (P) + ) to the reduced form (eg NAD (P) H) (see Example 5).
Beispiel 1: Herstellung der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2Example 1: Preparation of the monooxygenase with the sequence ID NO. 2
Die Expression und Aufreinigung der Monooxygenase mit der Sequenz SEQ ID NO : 2 , die für die enzymatische Umsetzung von Alkanen (z.B. Cycloalkane) vorzugsweise eingesetzt wird und auch für die Beispiele 2 bis 5 verwendet wurde, erfolgte im präparativen Maßstab gemäß der in J. Nazor, S. Dannenmann, R. O. Adjei, Y. B. Fordjour, I. T. Ghampson, M. Blanusa, D. Roccatano, and U. Schwaneberg, Protein Eng. Des. Sei. 2008 21, 29-35 beschriebenen Arbeitsvorschrift.The expression and purification of the monooxygenase with the sequence SEQ ID NO: 2, which is preferably used for the enzymatic conversion of alkanes (eg cycloalkanes) and was also used for Examples 2 to 5 was carried out on a preparative scale according to the in J. Nazor, S. Dannenmann, RO Adjei, YB Fordjour, IT Ghampson, M. Blanusa, D. Roccatano, and U. Schwaneberg, Protein Eng. Of. Be. 2008 21, 29-35.
Dazu werden in 500 mL Schüttelkolben 50 ml TB-Medium (Pro Liter: 12 g Pepton, 24 g Hefe-Extrakt, 4 mL Glyerin, 2,31 g KH2PO4, 12,54, K2HPO4), das mit Ampicillin (lOOμg/ml) und 50 μl einer sterilen Spurenelement-Lösung (Pro Liter: 0,5 gIn 500 ml shake flasks add 50 ml of TB medium (per liter: 12 g peptone, 24 g yeast extract, 4 mL glycerol, 2.31 g KH 2 PO 4 , 12.54, K 2 HPO 4 ) Ampicillin (100 μg / ml) and 50 μl of a sterile trace element solution (per liter: 0.5 g
CaCl2x2H2O, 0,18g ZnSO4x7H2O, 0.1g MnSO4XH2O, 20.1 g Na2-EDTA, 16,7 g FeCl3x6H2O, 0,16 g CuSO4x5H2O, 0,18 g CoCl2x6H20) supplementiert ist, mit 500 μl einer LB-Übernachtkultur (Pro Liter LB-Medium: 10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl) eines E. coli Stammes inokuliert, der auf einem Plasmid das Monooxygenasegen für eine erhöhte Expression trägt. Diese Expressionskultur wird bei 300C in einem Schüttelinkubator (250 rpm) inkubiert bis bei einer spektrophotometrisch bestimmten Zelldichte von 0,8 - 1,0 (Wellenlänge: 578 nm) die Expression des Monooxygenasegens auf dem Plasmid durch Zugabe von Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (Enkonzentration : 100 μM) induziert wird. Für einen erhöhten Anteil aktiver Monooxygenasen im Zell-Rohextrakt wird das Medium außerdem mit der Häm-Vorstufe 5-Aminolävulinsäure (Endkonzentration: 500 μM) supplementiert. Nach 20 Stunden Expression werden die E. coli-Zellen mit exprimiertem Monooxygenaseprotein durch Zentrifugation geerntet und die Zellen in PBS-Puffer (2 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, pH 7, 4) einmal gewaschen. Nach Resuspension in Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5) werden die Zellen durch Ultraschall lysiert. DurchCaCl 2 .2H 2 O, 0.18 g ZnSO 4 .7H 2 O, 0.1 g MnSO 4 .XH 2 O, 20.1 g Na 2 -EDTA, 16.7 g FeCl 3 .6H 2 O, 0.16 g CuSO 4 .5H 2 O, 0.18 g of CoCl 2 .6H 2 O ) is inoculated with 500 .mu.l of an LB overnight culture (per liter of LB medium: 10 g of peptone, 5 g of yeast extract, 10 g of NaCl) of an E. coli strain which has been incubated on a plasmid the monooxygenase gene carries for increased expression. This expression culture is incubated at 30 ° C. in a shaking incubator (250 rpm) until, at a spectrophotometrically determined cell density of 0.8-1.0 (wavelength: 578 nm), the expression of the monooxygenase gene on the plasmid by addition of isopropyl-β-D thiogalactopyranoside (concentration: 100 μM) is induced. For an increased proportion of active monooxygenases in the crude cell extract, the medium is also supplemented with the heme precursor 5-aminolevulinic acid (final concentration: 500 μM). After 20 hours of expression, the E. coli cells with expressed monooxygenase protein are harvested by centrifugation and the cells in PBS buffer (2 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 , 0.24 g KH 2 PO4, pH 7, 4) once. After resuspension in phosphate buffer (50 mM, pH 7.5), the cells are lysed by ultrasound. By
Zentrifugation und anschließende Filtration des Zell-Lysats wird der Rohextrakt gewonnen. Die Monooygenase-Proteine können wie bereits beschrieben durch Anionenaustauschchromatographie aufgereinigt werden (U. Schwaneberg, U., A. Sprauer, C. Schmidt-Dannert, and R. D. Schmid. J. Chromatogr. 848, 149- 159) .Centrifugation and subsequent filtration of the cell lysate, the crude extract is recovered. The monooxygenase proteins can be purified by anion exchange chromatography as previously described (U. Schwaneberg, U., A. Sprauer, C. Schmidt-Dannert, and RD Schmid. J. Chromatogr. 848, 149-159).
Beispiel 2 : Enzymaktivitäten der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2Example 2: Enzyme activities of the monooxygenase with the sequence ID NO. 2
Die Enzymaktivität wird in Anlehnung an eine literaturbekannte Arbeitsvorschrift (E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, Angew. Chem. 2008, 120, 9693) spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in Gegenwart des jeweiligen Cycloalkans als Substrat bestimmt
Figure imgf000019_0001
mM~1cm~1) . Zur spektrophotometrischen Bestimmung der Enzymaktivität werden zunächst in einer Küvette (1 mL) 690 μL Phosphatpuffer (pH 7.0, 50 mM) , 10 μL einer DMSO-Lösung des Cycloalkans (100 mM) und 100 μL Enzymlösung der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2 (partiell gereinigt; lyophilisiert; NADPH-abhängig) vorgelegt. Die Reaktion wird anschließend nach 5 Minuten durch Zugabe von 200 μL einer Lösung von NADPH (NADPH: 0.8 mM; Phosphatpuffer: pH 7.0, 50 mM) gestartet und der Verbrauch an NADPH gemessen. Die relativen Aktivitäten wurden durch den Vergleich der spektrophotometrisch erhaltenen Enzymaktivitäten (in U/mg) mit der für das Substrat Cyclohexan erhaltenen Enzymaktivität (als Referenzexperiment mit der relativen Aktivität 100%) bestimmt.The enzyme activity is determined spectrophotometrically at a wavelength of 340 nm by measuring the consumption of NADPH by oxidation to NADP + on the basis of a work protocol known from the literature (E. Burda, W. Hummel, H. Gröger, Angew Chem., 2008, 120, 9693) determined in the presence of the respective cycloalkane as substrate
Figure imgf000019_0001
mM ~ 1 cm ~ 1 ). For the spectrophotometric determination of the enzyme activity are first in a cuvette (1 mL) 690 μL phosphate buffer (pH 7.0, 50 mM), 10 .mu.l of a DMSO solution of cycloalkane (100 mM) and 100 .mu.L enzyme solution of the monooxygenase with the sequence ID NO. 2 (partially purified, lyophilized, NADPH-dependent). The reaction is then started after 5 minutes by adding 200 μl of a solution of NADPH (NADPH: 0.8 mM, phosphate buffer: pH 7.0, 50 mM) and measuring the consumption of NADPH. The relative activities were determined by comparing the spectrophotometrically obtained enzyme activities (in U / mg) with the enzyme activity obtained for the substrate cyclohexane (as a reference experiment with the relative activity 100%).
RealativeRealative
Figure imgf000019_0002
Cyclooktan 5.8 414
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000019_0002
Cyclooctane 5.8 414
Figure imgf000020_0001
Cyclodekan I (?H2)3 9.8 700Cyclodecane I ( ? H2) 3 9.8 700
Beispiel 3 : Oxidation von Cyclooktan zu CyclooktanonExample 3: Oxidation of cyclooctane to cyclooctanone
In einem 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefäß werden zu 1 mL Puffer (50 mM; pH 7.0) nacheinander 0.392 U der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2 (als lyophilisierter Rohextrakt; 0.0098 U/mg bezogen auf Cyclooktan als Substrat), 0.1 mmol Cyclooktan (entsprechend einer Substratkonzentration von 0.1 M), (ca.) 1 mg Magnesiumchlorid und 20 U einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (20 μL) gegeben und danach wird dieIn a 2 mL Eppendorf reaction vessel, 0.392 U of the monooxygenase with the sequence ID NO. Are added successively to 1 mL buffer (50 mM, pH 7.0). 2 (as lyophilized crude extract, 0.0098 U / mg based on cyclooctane as substrate), 0.1 mmol cyclooctane (corresponding to a substrate concentration of 0.1 M), (about) 1 mg magnesium chloride and 20 U of an alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir (20 μL) and after that, the
Reaktion durch Zugabe von 0.01 mmol des Cofaktors NADPH (6.5 mg) gestartet. Nachdem das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines Thermomixers für 67 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 25°C geschüttelt wurde fügt man 1 mL Dichlormethan hinzu und extrahiert. Anschließend wird im Vakuum die organische Phase vom Lösungsmittel befreit und aus dem erhaltenen Rohprodukt direkt der Umsatz mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Der Umsatz liegt bei 50% bezogen auf die Bildung von Cyclooktanon, wobei die Menge an gebildetem Cyclooktanol bei <5% liegt.Reaction started by adding 0.01 mmol of the cofactor NADPH (6.5 mg). After shaking the reaction mixture with the aid of a thermomixer for 67 hours at a reaction temperature of 25 ° C, add 1 mL of dichloromethane and extract. Subsequently, the organic phase is freed from the solvent under reduced pressure and the conversion is determined directly from the crude product obtained using 1 H NMR spectroscopy. The conversion is 50% based on the formation of cyclooctanone, wherein the amount of cyclooctanol formed is <5%.
Beispiel 4 : Oxidation von Cyclodekan zu CyclodekanonExample 4: Oxidation of cyclodecane to cyclodecanone
In einem 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefaß werden zu 1 mL Puffer (50 mM; pH 7.0) nacheinander 0.392 U der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2 (als lyophilisierter Rohextrakt; 0.0098 U/mg bezogen auf Cyclooktan als Substrat), 0.1 mmol Cyclodekan (entsprechend einer Substratkonzentration von 0.1 M), (ca.) 1 mg Magnesiumchlorid und 20 U einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (20 μL) gegeben und danach wird dieIn a 2 mL Eppendorf reaction vessel, 0.392 U of the monooxygenase with the sequence ID NO. Are added successively to 1 mL buffer (50 mM, pH 7.0). 2 (as lyophilized crude extract, 0.0098 U / mg based on cyclooctane as substrate), 0.1 mmol cyclodecane (corresponding to a substrate concentration of 0.1 M), (about) 1 mg magnesium chloride and 20 U of an alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir (20 μL) and after that, the
Reaktion durch Zugabe von 0.01 mmol des Cofaktors NADPH (6.5 mg) gestartet. Nachdem das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines Thermomixers für 70 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 25°C geschüttelt wurde fugt man 1 mL Dichlormethan hinzu und extrahiert. Anschließend wird im Vakuum die organische Phase vom Losungsmittel befreit und aus dem erhaltenen Rohprodukt direkt der Umsatz mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Der Umsatz liegt bei 63% bezogen auf die Bildung von Cycloodekanon, wobei die Menge an gebildetem Cyclodekanol bei <5% liegt.Reaction by adding 0.01 mmol of the cofactor NADPH (6.5 mg). After the reaction mixture was shaken with the aid of a thermomixer for 70 hours at a reaction temperature of 25 ° C is added 1 mL of dichloromethane and extracted. The organic phase is then freed of the solvent in vacuo and the conversion is determined directly from the crude product obtained using 1 H-NMR spectroscopy. The conversion is 63% based on the formation of cycloodecanone, wherein the amount of cyclodecanol formed is <5%.
Beispiel 5 : Oxidation von Cyclooktan zu Cyclooktanon mit Isopropanol als Additiv und NADP+ als CofaktorExample 5: Oxidation of cyclooctane to cyclooctanone with isopropanol as additive and NADP + as cofactor
In einem 2 mL-Eppendorf-Reaktionsgefaß werden zu 1 mL Puffer (50 mM; pH 7.0) nacheinander ', „ ^ ' U der Monooxygenase mit der Sequenz ID NO. 2 (als lyophilisierter Rohextrakt; 0.0098 U/mg bezogen auf Cyclooktan), 0.1 mmol Cyclooktan (entsprechend einer Substratkonzentration von 0.1 M) , 10 μL Isopropanol (0.13 mmol), (ca.) 1 mg Magnesiumchlorid und 20 U einer Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (20 statt 0 μL) gegeben und danach wird die Reaktion durch Zugabe von 0.01 mmol des Cofaktors NADP+ (6.5 mg) gestartet. Nachdem das Reaktionsgemisch mit Hilfe eines Thermomixers für 67 Stunden bei einer Reaktionstemperatur von 25°C geschüttelt wurde fugt man 1 mL Dichlormethan hinzu und extrahiert. Anschließend wird im Vakuum die organische Phase vom Losungsmittel befreit und aus dem erhaltenen Rohprodukt direkt der Umsatz mit Hilfe der 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt. Der Umsatz liegt bei 79% bezogen auf die Bildung von Cyclooktanon, wobei die Menge an gebildetem Cyclooktanol bei <5% liegt. In a 2 mL Eppendorf reaction vessel, to 1 mL buffer (50 mM, pH 7.0) successively ', " ^ ' U of the monooxygenase with the sequence ID NO. 2 (as lyophilized crude extract, 0.0098 U / mg based on cyclooctane), 0.1 mmol of cyclooctane (corresponding to a substrate concentration of 0.1 M), 10 .mu.l of isopropanol (0.13 mmol), (approx.) 1 mg of magnesium chloride and 20 U of an alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir (20 instead of 0 μL) and then the reaction is started by adding 0.01 mmol of the cofactor NADP + (6.5 mg). After the reaction mixture was shaken with the aid of a thermomixer for 67 hours at a reaction temperature of 25 ° C is added to 1 mL of dichloromethane and extracted. The organic phase is then freed of the solvent in vacuo and the conversion is determined directly from the crude product obtained using 1 H-NMR spectroscopy. The conversion is 79% based on the formation of cyclooctanone, wherein the amount of cyclooctanol formed is <5%.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Herstellung von Ketonen durch enzymatische Oxidation von Alkanen, bei dem man diese Alkane in Gegenwart einer Monooxygenase, einer Alkoholdehydrogenase und eines für beide Enzyme geeigneten Cofaktors in einem wässrigen Reaktionsmedium in Gegenwart von molekularem Sauerstoff umsetzt.1. A process for the preparation of ketones by enzymatic oxidation of alkanes, which comprises reacting these alkanes in the presence of a monooxygenase, an alcohol dehydrogenase and a cofactor suitable for both enzymes in an aqueous reaction medium in the presence of molecular oxygen.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man eine NAD(P)H- abhängige Monooxygenase, eine NAD (P) H-abhängige Alkoholdehydrogenase und als Cofaktor NAD(P)H einsetzt.2. The method according to claim 1, wherein one uses an NAD (P) H-dependent monooxygenase, an NAD (P) H-dependent alcohol dehydrogenase and as cofactor NAD (P) H.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Monooxygenase mit der Sequenz SEQ ID NO .2 für das Polypeptid verwendet.3. The method according to claims 1 or 2, characterized in that one uses a monooxygenase having the sequence SEQ ID NO .2 for the polypeptide.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir oder Lactobacillus brevis verwendet.4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that one uses an alcohol dehydrogenase from Lactobacillus kefir or Lactobacillus brevis.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, bei dem man5. Process according to claims 1 to 3, in which one
Alkane, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gerad- oder verzweigtkettigen, gesättigten und einfach ungesättigten Kohlenwasserstoffen mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen und cyclischen Kohlenwasserstoffen, gegebenenfalls mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert, gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt, ein- oder mehrkernig, bei denen der Ring oder die Ringe insgesamt 6 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist (en) , einsetzt.Alkanes selected from the group consisting of straight or branched chain, saturated and monounsaturated hydrocarbons having 4 to 16 carbon atoms and cyclic hydrocarbons, optionally substituted with 1 to 5 carbon atoms, saturated or mono- or polyunsaturated, mono- or polycyclic, at in which the ring or the rings has a total of 6 to 20 carbon atoms (s).
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, bei dem man ein gesättigtes Cycloalkan enthaltend 6, 8, 10 oder 12 Kohlenstoffatome einsetzt. 6. Process according to claims 1 to 4, wherein a saturated cycloalkane containing 6, 8, 10 or 12 carbon atoms is used.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, bei dem man Enzyme und Cofaktor in isolierter Form einsetzt.7. Process according to claims 1 to 6, wherein enzymes and cofactor are used in isolated form.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, bei dem man das Produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert.8. Process according to claims 1 to 7, wherein the product is isolated from the reaction mixture.
9. Rekombinante Mikroorganismen, in denen die Aktivität einer Monooxygenase einer Alkoholdehydrogenase und des Cofaktors, insbesondere NAD(P)H, erhöht vorliegen.9. Recombinant microorganisms in which the activity of a monooxygenase of an alcohol dehydrogenase and of the cofactor, in particular NAD (P) H, are increased.
10. Mikroorganismen gemäß Anspruch 9, die eine NADP(H)- abhängige Monooxygenase und eine NAD (P) H-abhängige Alkoholdehydrogenase enthalten.10. Microorganisms according to claim 9, which contain an NADP (H) -dependent monooxygenase and an NAD (P) H-dependent alcohol dehydrogenase.
11. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass Mikroorganismen gemäß Anspruch 9 und 10 verwendet werden.11. The method according to claims 1 to 6 and 8, characterized in that microorganisms are used according to claim 9 and 10.
12. Polynukleotid, das für ein Polypeptid kodiert, das zu mindestens 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der12. polynucleotide encoding a polypeptide which is at least 90%, 95% or 99% identical to the
Sequenz, dargestellt in der SEQ ID NO: 2, wobei die Aminosäure an der Position 87 eine andere proteinogene Aminosäure als Phenylalanin (Phe) ist und das Polypeptid die Aktivität einer Monooxygenase besitzt.A sequence shown in SEQ ID NO: 2 wherein the amino acid at position 87 is a proteinaceous amino acid other than phenylalanine (Phe) and the polypeptide has the activity of a monooxygenase.
13. Polynukleotid gemäß Anspruch 12, enthaltend eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe:A polynucleotide according to claim 12 containing a nucleotide sequence selected from the group:
a) Polynukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 b) Polynukleotidsequenz korrespondierend zu SEQ ID NO: 1 im Umfang der Degeneriertheit des genetischen Kodes, c) Polynukleotidsequenz, die mit den komplementären Sequenzen zu Punkt a) oder b) unter stringenten Bedingungen hybridisiert.a) polynucleotide sequence according to SEQ ID NO: 1 b) polynucleotide sequence corresponding to SEQ ID NO: 1 within the scope of the degeneracy of the genetic code, c) polynucleotide sequence which hybridizes with the complementary sequences to point a) or b) under stringent conditions.
14. Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz zu mindestens 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Sequenz, dargestellt in der SEQ ID NO: 2, wobei die Aminosäure an der Position 87 durch eine andere proteinogene Aminosäure ersetzt ist (außer Phenylalanin (Phe) oder Valin (VaI)) und das Polypeptid die Aktivität einer Monooxygenase besitzt.14. A polypeptide whose amino acid sequence is at least 90%, 95% or 99% identical to the sequence shown in SEQ ID NO: 2, wherein the amino acid at position 87 is replaced by another proteinogenic amino acid (except phenylalanine (Phe) or valine (VaI)) and the polypeptide possesses the activity of a monooxygenase.
15. Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 9 bis 11, die ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 12 oder 13 enthalten.Microorganisms according to claims 9 to 11 containing a polynucleotide according to claims 12 or 13.
16. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 und 11, bei dem man die Mikroorganismen gemäß den Ansprüchen 9 bis 10 und 15 einsetzt .16. The method according to claims 1 to 8 and 11, wherein the microorganisms according to claims 9 to 10 and 15 are used.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16, bei dem man als Cofaktor NAD(P)H dem Reaktionsgemisch zusetzt.17. The method according to claim 16, wherein adding as the cofactor NAD (P) H the reaction mixture.
18. Verfahren zur Hydroxylierung von Alkanen durch enzymatische Umsetzung, bei dem man diese Alkane mit einer Monooxygenase und einem Cofaktor in Gegenwart von Sauerstoff umsetzt.18. A process for the hydroxylation of alkanes by enzymatic reaction, in which reacting these alkanes with a monooxygenase and a cofactor in the presence of oxygen.
19. Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Monooxygenase mit der Sequenz SEQ ID NO.2 für das19. The method according to claim 18, characterized in that one comprises a monooxygenase having the sequence SEQ ID NO.2 for the
Polypeptid verwendet.Polypeptide used.
20. Verfahren nach Anspruch 18 dadurch gekennzeichnet, dass man als Monooxygenase ein Polypeptid verwendet, das zu mindestens 90%, 95% oder 99% identisch ist mit der Sequenz dargestellt in der SEQ ID NO: 2.20. The method according to claim 18, characterized in that one uses as a monooxygenase a polypeptide which is at least 90%, 95% or 99% identical to the sequence shown in SEQ ID NO: 2.
21. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Regenerierung des Cofaktors eine Glukosedehydrogenase in Kombination mit Glukose verwendet wird.21. The method according to claims 18 to 20, characterized in that for the regeneration of the cofactor, a glucose dehydrogenase is used in combination with glucose.
22. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zur Regenerierung des Cofaktors eine Formiatdehydrogenase in Kombination mit Ameisensäure bzw. dessen Salzen verwendet wird. 22. The method according to claims 18 to 20, characterized in that for the regeneration of the cofactor a formate dehydrogenase in combination with formic acid or its salts is used.
23. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 20, bei dem man23. The method according to claims 18 to 20, wherein
Mikroorganismen einsetzt, die ein Polynukleotid gemäß den Ansprüchen 12 oder 13 enthalten.Microorganisms containing a polynucleotide according to claims 12 or 13.
24. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 23, bei dem Alkane, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus gerad- oder verzweigtkettigen, gesättigten und einfach ungesättigten Kohlenwasserstoffen mit 4 bis 16 Kohlenstoffatomen und cyclischen Kohlenwasserstoffen, gegebenenfalls mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen substituiert, gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt, ein- oder mehrkernig, bei denen der Ring oder die Ringe insgesamt 6 bis 20 Kohlenstoffatome aufweist (en) , einsetzt.24. The method according to claims 18 to 23, wherein the alkanes selected from the group consisting of straight or branched chain, saturated and monounsaturated hydrocarbons having 4 to 16 carbon atoms and cyclic hydrocarbons, optionally substituted by 1 to 5 carbon atoms, saturated or mono- or polyunsaturated, mononuclear or polynuclear, in which the ring or rings has a total of 6 to 20 carbon atoms (s), is used.
25. Verfahren gemäß den Ansprüchen 8 bis 24, bei dem man ein gesättigtes Cycloalkan enthaltend 6, 8, 10 oder 12 Kohlenstoffatome einsetzt.25. The method according to claims 8 to 24, wherein one uses a saturated cycloalkane containing 6, 8, 10 or 12 carbon atoms.
26. Verfahren gemäß den Ansprüchen 18 bis 25, bei dem man das hydroxylierte Produkt aus dem Reaktionsgemisch isoliert.26. A process according to claims 18 to 25, wherein the hydroxylated product is isolated from the reaction mixture.
27. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, 11 und 16 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge des verwendeten Substrats bezogen auf die Gesamtmenge des wässrigen Reaktionsmediums bei einer Konzentration von > 0 bis 500 g/L, vorzugsweise >50 bis 500 g/L, ganz besonders bevorzugt >100 bis 300 g/L liegt.27. The method according to claims 1 to 8, 11 and 16 to 26, characterized in that the total amount of the substrate used based on the total amount of the aqueous reaction medium at a concentration of> 0 to 500 g / L, preferably> 50 to 500 g / L, very particularly preferably> 100 to 300 g / L.
28. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge des Substrats bereits am Beginn der28. The method according to claim 27, characterized in that the total amount of the substrate already at the beginning of
Reaktion im Reaktionsgemisch vorliegt.Reaction in the reaction mixture is present.
29. Verfahren gemäß Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Gesamtmenge des Substrats oder eine Teilmenge des Substrats während der Reaktion zudosiert wird. 29. The method according to claim 27, characterized in that the total amount of the substrate or a subset of the substrate is added during the reaction.
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