WO2010031611A1 - Method for producing stilbenoids - Google Patents

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WO2010031611A1
WO2010031611A1 PCT/EP2009/059214 EP2009059214W WO2010031611A1 WO 2010031611 A1 WO2010031611 A1 WO 2010031611A1 EP 2009059214 W EP2009059214 W EP 2009059214W WO 2010031611 A1 WO2010031611 A1 WO 2010031611A1
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WO
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stilbenoids
acid
resveratrol
polyether
cell
Prior art date
Application number
PCT/EP2009/059214
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German (de)
French (fr)
Inventor
Nicole Decker
Thomas Hüller
Wilfried BLÜMKE
Steffen Schaffer
Original Assignee
Evonik Degussa Gmbh
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Filing date
Publication date
Application filed by Evonik Degussa Gmbh filed Critical Evonik Degussa Gmbh
Publication of WO2010031611A1 publication Critical patent/WO2010031611A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of stilbenoids, comprising the steps of I) bringing into contact a cell which is capable of forming stilbenoids, with a nutrient medium comprising at least one polyether and II) cultivating the cell under conditions which it enable the cell to form stilbenoids.
  • Stilbenoids are derivatives of stilbene.
  • the stilbenoids is in particular the resveratrol (3,4 ', 5-trihydroxystilbene), which also belongs to the class of polyphenols, more specifically the polyphenolic phytoalexins.
  • Stilbenoide such as Resveratrol, in particular in fungal infections or strong UV exposure formed.
  • Resveratrol is a secondary metabolite of plants of considerable commercial interest due to its antioxidant properties and biological activity as an ingredient in cosmetic formulations and dietary supplements. Resveratrol is currently obtained exclusively from plant extractive methods, in particular from Polygonum cuspidatum and Vitis vinifera. Disadvantage of the extractive process is the low yield at high solvent and plant levels.
  • microorganisms used in biochemical processes are mostly recombinant, since the biosynthetic pathway towards the
  • Resveratrol is realized only in some plants and this metabolic pathway must be transferred into microorganisms. Resveratrol is produced by three enzymes from the metabolites tyrosine and malonyl-CoA (Intermediate of the
  • the three enzymes are i) tyrosine ammonium lyase (TAL), which converts tyrosine into 4-coumaric acid by deamination, ii) 4-coumaryl CoA ligase, which catalyzes the activation of coumaric acid to 4-coumaryl CoA, and finally, iii) the stilbene synthase, which condenses three molecules of malonyl-CoA with one molecule of 4-coumaryl-CoA to the resveratrol in three steps.
  • TAL tyrosine ammonium lyase
  • 4-coumaryl CoA ligase which catalyzes the activation of coumaric acid to 4-coumaryl CoA
  • the stilbene synthase which condenses three molecules of malonyl-CoA with one molecule of 4-coumaryl-CoA to the resveratrol in three steps.
  • the object of the invention was therefore to provide a method which overcomes the disadvantages of the prior art described.
  • the present invention is therefore a biotechnological process for the preparation of
  • Another object of the invention are the stilbenoids themselves as well as chemical products with these
  • Stilbenoids are produced.
  • An advantage of the invention is that no large amounts of plant are needed for the production of stilbenoids.
  • Another advantage of the invention is the reduction in required organic extractants.
  • Yet another advantage of the invention is that in the biochemical process less carbon source based on manufactured stilbenoids than before must be used and thus the resource-saving handling of raw materials can be taken into account.
  • stilbenoids are understood to mean hydroxylated structural derivatives of stilbene (1,2-ethenediyl bisbenzene) with at least one hydroxyl group, “stilbene” comprising the E and Z isomer or the cis and trans isomer; Examples of stilbenoids are therefore
  • Resveratrol Piceatannol, Pinosylvin and Pterostilben.
  • the invention relates to a process for the preparation of stilbenoids, comprising the steps of I) bringing into contact a cell which is capable of forming stilbenoids, with a nutrient medium comprising at least one polyether and II) cultivating the cell under conditions which it enable the cell to form stilbenoids.
  • all cells, preferably recombinant, ie genetically modified, cells which are capable of producing stilbenoids can be used in the process; these may be prokaryotes or eukaryotes.
  • These may be mammalian cells (such as human cells), plant cells or microorganisms such as yeasts, fungi or bacteria, microorganisms being particularly preferred and bacteria and yeasts being most preferred.
  • Particularly suitable bacteria, yeasts or fungi are those bacteria, yeasts or fungi which are deposited in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany, as bacterial, yeast or fungal strains.
  • Bacteria that are suitable according to the invention belong to the genera listed on the filing date of this application under http: // www. dsmz. de / species / bacteria .htm are listed, yeasts which are suitable according to the invention belong to the genera listed on the filing date of this application at http: // www. dsmz. de / species / yeasts. htm and fungi suitable according to the invention are those listed on the filing date of this application at http: // www. dsmz. de / species / fungi .htm are listed.
  • particularly preferred cells of the genera Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia and Clostridium are used in the method according to the invention, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida utilis, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutroph
  • Genetically modified cells are preferred to their wild type, which are able to produce more stilbenoids than their wild type compared to their wild type.
  • the wording "that they are able to make more stilbenoids compared to their wild type” also applies to the case that the wild-type of the genetically modified cell does not have any stilbenoids at all, preferably none
  • Resveratrol but at least no detectable amounts of these compounds can form and only after the genetic modification detectable amounts of these components can be formed. Examples of such cells are described in WO 2006/089898 and this document is hereby incorporated by reference and forms part of the disclosure of the present invention.
  • all cells capable of being derived from any carbon source such as sugars, hexoses, pentoses, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, fats, triglycerides, glycerol, fatty acids, alkanes, methane, methanol, ethanol, alcohols can be used in the process , Carbon dioxide, lactate, pyruvate, acetate, propionate, butyrate or organic acids, stilbenoids, preferably resveratrol.
  • Preferred cells according to the invention are those which are capable of forming stilbenoids, preferably resveratrol, from glucose, sucrose or glycerol as the carbon source.
  • Culture medium must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981).
  • the nutrient medium As carbon source in the nutrient medium used are carbohydrates, such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such. As soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such. As palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such. As glycerol and methanol, amino acids such as L-glutamate or L-valine or organic acids such as acetic acid used. These substances can be used individually or as a mixture. In addition to the carbon sources, the nutrient medium may contain in particular nitrogen and phosphorus sources, salts and pH control agents.
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used.
  • the nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
  • Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source in or in the nutrient medium / nutrient media used in process step a).
  • the nutrient medium used in the process should further contain salts of metals necessary for growth, such as magnesium sulfate, copper sulfate, zinc sulfate, manganese sulfate or iron sulfate.
  • essential growth factors such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above-mentioned substances in the nutrient medium.
  • the preferably water-soluble polyether used in process step I) is preferably a polyalkylene glycol.
  • Polyethers used are in particular polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG), with PEG being particularly preferred.
  • Further preferred polyethers used in process step I) are octoxinol-9 (also Triton X-100, a p-tert-butyl). Octylphenol derivative with a polyethylene glycol side chain, from 9-10 ethylene oxide units) and polysorbate 20 (commercial name Tween® 20, a polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate)
  • the molecular weight of the polyether used in the process according to the invention is in a range from 100 g / mol to 200,000 g / mol, preferably from 200 g / mol to 200,000 g / mol and more preferably from 300 g / mol to 100,000 g / mol. It is known to the person skilled in the art that the polyethers may be in the form of a mixture with a distribution of molecular weight regulated essentially by statistical laws. The values for the molecular weight therefore usually represent an average value.
  • Concentrations of from 1 g / l to 1000 g / l, preferably from 2 g / l to 800 g / l and particularly preferably from 10 g / l to 600 g / l, based on the total volume of the polymer are used in the polyether used in process step I) Nutrient medium used.
  • the cultivation of the microorganisms in process step II) can be carried out continuously or discontinuously in the batch process (batch cultivation), in the fed-batch process (feed process) or in the repeated-fed-batch process (repetitive feed process) for the purpose of producing biomass by Reaching a relevant biomass dry done. Also conceivable is a semi-continuous process, as described in GB-A-1009370 is described. A summary of known cultivation methods can be found in the textbook by Chmiel ("Bioprocessing Technology 1. Introduction to the
  • suitable precursors such as 4-hydroxycinnamic acid, malonic acid, tyrosine, phenylalanine, cinnamic acid, coumaric acid, ferulic acid, caffeic acid or other cinnamic acid derivatives may be added to the culture medium during the cultivation.
  • the said feedstocks may be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • the temperature of the culture is normally from 20 0 C to 45 0 C and preferably at 25 0 C to 40 0 C, with a use of thermophilic bacteria, the temperatures can be up to 80 0 C.
  • this method includes additionally the process step III) isolation of the formed stilbenoids.
  • the stilbenoids formed by the cells can optionally be isolated from the cells and / or the nutrient medium, all methods known to those skilled in the art for isolating low molecular weight substances from complex compositions being suitable for isolation.
  • the precipitation by means of suitable solvents the extraction by means of suitable solvents, the
  • the polyether can be used as extractant.
  • Another object of the invention are the stilbenoids and the resveratrol obtained by the method according to the invention
  • Yet another object of the invention are chemical products, in particular cosmetic formulations, foods, drinks and pharmaceutical formulations containing the stilbenoids and / or the resveratrol obtained by the method according to the invention.
  • the present invention is described by way of example, without the invention, the scope of application of which is apparent from the entire description and the claims, to be limited to the embodiments mentioned in the examples.
  • Figure 1 shows the course of Resveratrol Struktur without or with the addition of PEG3350 or PPG4000.
  • Example 1 Cloning of a vector for expressing the Coumaryl-CoA ligase and the stilbene synthase-encoding genes in Escherichia coli
  • Amplification of DNA by means of PCR (Polymerase Chain Reaction), restriction digestion, DNA purification, ligation and transformation of chemically competent E. coli cells were carried out in a manner known to the person skilled in the art. All required enzymes were purchased from New England Biolabs, Schwalbach. The synthesis of oligonucleotides was carried out by MWG Biotech, Ebersberg. First, the lac promoter containing the LacI operator was replaced in the commercially available vector pUC19 (New England Biolabs, Schwalbach) by recloning a synthetic fragment of the lac promoter without operator based on Watts et al.
  • the synthetic fragment of the lac promoter without operator (SEQ ID No.1) was cut in the same way the modified lac promoter, and the resulting fragment after purification on an agarose gel using QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) with the ligated, similarly purified vector backbone of pUC19 (2240 bp) (T4 DNA ligase, New England Biolabs, Schwalbach), resulting in the vector pUCmodll (2452 bp). Ligation and transformation of competent Escherichia coli DH5a were carried out according to the specifications of the manufacturer (New England Biolabs, Schwalbach).
  • the vector pUCmodll was cut in the next step with Xbal and NotI.
  • Starting from the vector pCR2.1-TOPO-VvSTS (SEQ ID NO: 2) was determined by PCR using Phusion DNA polymerase (New England Biolabs, Schwalbach) and the oligonucleotides VvSTScod- Xbal-fw (5'-TAT ATA TCT AGA AGG AGG ATT ACA AAA TGG CTT CAG TCG AGG AAA TTAG-3 ') and VvSTScod-Notl-rv (5'-TAT ATA GCG GCC GCT TTA ATT TGT AAC CAT AGG-3') the gene from Vinis stilbene synthase vinifera (VvSTS) according to the manufacturer's instructions, resulting in an approximately 1200 bp fragment (SEQ ID No.
  • Arabidopsis thaliana coumaryl CoA ligase At4Cll was generated from Arabidopsis thaliana cDNA (United States Biological, Swampscott, USA) by PCR and the oligonucleotides At4Cll-Not-fw (5'-TAT ATA GCG GCC GCA GGA GGA TTA CAA AAT GGC GCC ACA AGA AC-3 ') and At4Cll-Not (5'-TAT ATA GCG GCC GCT CAC AAT CCA TTT GCT AGT TTT-3').
  • the resulting PCR product (SEQ ID NO: 4) was purified on an agarose gel and cut with NotI.
  • the resulting 1708 bp fragment was ligated with the similarly cut vector pUCmod-VvSTS after its dephosphorylation with CIP (New England Biolabs, Schwalbach) according to the manufacturer's instructions, from which the vector pUCmod-VvSTS-At4CII (alternative
  • GPDH Dehydrogenase
  • Escherichia coli DH5a cells New England Biolabs
  • Phusion DNA polymerase and the oligonucleotides EcGAP-Sapl-fw (5'-TAT ATA GCT CTT CAA GCG CGT AAT GCT TAG GCA CAG G-3 ') and EcGAP-XbaI-rv (5'-TAT ATA TCT AGA TGA ATA AAA GGT TGC CTG TAA-3').
  • the resulting PCR product (ca.HObp; SEQ ID NO: 5) was grown on an agarose gel as previously described, and subsequently subjected to SapI and XbaI digestion.
  • the vector pUCmod-VvSTS-At4Cll was also cut with XbaI and SapI and the vector backbone (5139bp) ligated with the PCR product containing the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter, resulting in the
  • Vector pUC-GAP-VvSTS-At4Cll resulted (5244bp; SEQ ID NO: 6).
  • modified M9 medium M9 with 10 g / l yeast extract, 1% glycerol as carbon source, 200 mM MOPS as buffer;
  • Base medium M9 6.8 g / l disodium hydrogen phosphate dihydrate, 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / l sodium chloride, 1 g / l ammonium chloride, 15 mg / l calcium chloride dihydrate, 250 mg / 1 magnesium sulfate heptahydrate, 1% MEM vitamin Solution (Sigma-Aldrich), pH 7.0), which is 100 ⁇ g / ml
  • Ampicllin contained was in the morning with E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll of freshly streaked and grown overnight at 37 0 C incubated LB agar plates (LB agar after MILLER, 37 g / l) containing 100 ug / ml Ampicillin, and incubated for 6 h at 37 ° C. and 225 rpm in 10 ml tubes. In the afternoon, 100 ml of modified M9 medium in a 500 ml shake flask with baffles with cell suspension from the preculture with an optical density at 600 nm (OD600). inoculated of 0.1.
  • Example 3 Quantification of resveratrol and 4-hydroxycinnamic acid in the cell suspension
  • Resveratrol as well as 4-hydroxycinnamic acid was identified by comparison with the residence time and the UV / VIS spectrum of a reference substance (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen and Merck, Darmstadt, respectively).
  • a reference substance SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen and Merck, Darmstadt, respectively.
  • Extracts were prepared from standard curves by plotting the peak areas of reference samples of known concentration against the appropriate concentration in these reference samples. Resveratrol and 4-hydroxycinnamic acid were detected and quantified at a wavelength of 308 nm.
  • FIG. 1 shows that the cultures of the recombinant E. coli strain BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4CII in the presence of PEG or PPG have significantly increased resveratrol titers after 4 h of culture without control of PEG or PPG.
  • Example 4 Cultivation of the recombinant E. coli strains for the production of resveratrol in the presence of various concentrations of PEG
  • modified M9 medium M9 with 10 g / l yeast extract, 1% glycerol as carbon source, 200 mM MOPS as buffer, basal medium M9: 6.8 g / l disodium hydrogen phosphate dihydrate, 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / l sodium chloride, 1 g / l ammonium chloride, 15 mg / l calcium chloride dihydrate, 250 mg / 1 magnesium sulfate heptahydrate, 1% MEM Vitamin Solution (Sigma-Aldrich), pH 7.0) containing 100 ⁇ g / ml Ampicllin was incubated in the morning with E.
  • modified M9 medium M9 with 10 g / l yeast extract, 1% glycerol as carbon source, 200 mM MOPS as buffer
  • basal medium M9 6.8 g / l disodium hydrogen phosphate dihydrate, 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 0.5
  • 50 ml of modified M9 medium was inoculated in a 250 ml shake flask with cell culture pre-culture cell suspensions at an optical density of 600 nm (OD600) of 0.1. The incubation of the shake flasks was carried out overnight for 16-18 h at 37 0 C and 225 rpm.
  • FIG. 2 shows that the cultures of the recombinant E.
  • coli strain BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4CII have significantly increased resveratrol titer compared to the control without PEG after 6 h cultivation, even in the presence of 10 g / l PEG3350 caused by an increased space-time yield.
  • FIG. 3 shows that the cultures of the recombinant E. coli strain BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4CII have significantly increased resveratrol titer in the presence of PEG in comparison with the control without PEG after 6 h of culture.
  • the molecular weight of PEG (MW 1000-20000) is almost negligible for the observed positive effect on resveratrol formation.
  • Example 6 Cultivation of the recombinant E. coli strains for the production of resveratrol in the presence and absence of PEG, Triton-X 100 and TWEEN 20, respectively
  • modified M9 medium M9 with 10 g / l yeast extract
  • Base medium M9 6.8 g / l disodium hydrogen phosphate dihydrate, 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / l sodium chloride, 1 g / l ammonium chloride, 15 mg / l calcium chloride dihydrate, 250 mg / 1 magnesium sulfate heptahydrate, pH 7.0 ) which
  • 100 ⁇ g / ml ampicillin was in the morning with E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll freshly streaked and incubated overnight at 37 0 C incubated LB agar plates (LB agar according to MILLER, 37 g / l) with 100 ⁇ g / ml ampicillin, and incubated for 6 h at 37 ° C and 250 rpm in 10 ml tubes.
  • 50 ml of modified M9 medium was inoculated in a 250 ml shake flask with baffles containing the whole cell suspension from the preculture. The shake flasks were incubated overnight at 37 ° C. and 250 rpm for 16-18 h. The next morning the
  • PPG-3 myristyl ether 3, 0

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Abstract

The invention relates to a method for producing stilbenoids, comprising the following steps: I) bringing a cell, which is able to form stilbenoids, in contact with a nutrient medium comprising at least one polyether, and II) cultivating the cell under conditions that allow the cell to form stilbenoids.

Description

Verfahren zur Herstellung von StilbenoidenProcess for the preparation of stilbenoids
Gebiet der ErfindungField of the invention
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Stilbenoiden, umfassend die Verfahrensschritte I) in Kontakt Bringen einer Zelle, welche in der Lage ist, Stilbenoide zu bilden, mit einem Nährmedium beinhaltend mindestens einen Polyether und II) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die es der Zelle ermöglichen, Stilbenoide zu bilden.The invention relates to a process for the preparation of stilbenoids, comprising the steps of I) bringing into contact a cell which is capable of forming stilbenoids, with a nutrient medium comprising at least one polyether and II) cultivating the cell under conditions which it enable the cell to form stilbenoids.
Stand der TechnikState of the art
Stilbenoide sind Derivate des Stilbens. Zu den Stilbenoiden gehört insbesondere das Resveratrol (3,4',5- Trihydroxystilben) , welches ebenfalls zur Stoffklasse der Polyphenole, genauer der polyphenolischen Phytoalexine, zu zählen ist. In Pflanzen werden Stilbenoide, wie etwa Resveratrol, insbesondere bei Pilzinfektionen oder starker UV-Belastung gebildet.Stilbenoids are derivatives of stilbene. Among the stilbenoids is in particular the resveratrol (3,4 ', 5-trihydroxystilbene), which also belongs to the class of polyphenols, more specifically the polyphenolic phytoalexins. In plants Stilbenoide, such as Resveratrol, in particular in fungal infections or strong UV exposure formed.
Resveratrol ist ein pflanzlicher Sekundärmetabolit, der aufgrund seiner antioxidativen Eigenschaften und biologischen Wirksamkeit als Inhaltsstoff für kosmetische Formulierungen und Nahrungsergänzungsmittel von erheblichem kommerziellem Interesse ist. Resveratrol wird aktuell ausschließlich durch extraktive Verfahren aus Pflanzen gewonnen, vor allem aus Polygonum cuspidatum und Vitis vinifera . Nachteil der extraktiven Verfahren ist die geringe Ausbeute bei hohen Lösungsmittel- und Pflanzenmengen.Resveratrol is a secondary metabolite of plants of considerable commercial interest due to its antioxidant properties and biological activity as an ingredient in cosmetic formulations and dietary supplements. Resveratrol is currently obtained exclusively from plant extractive methods, in particular from Polygonum cuspidatum and Vitis vinifera. Disadvantage of the extractive process is the low yield at high solvent and plant levels.
Alternative Herstellverfahren für Resveratrol wurden sowohl in Form von chemischen Synthesen (z. B. US 6,552,213, WO 2005023740, US 7,235,324) als auch von biotechnologischen Verfahren in Mikroorganismen entwickelt.Alternative preparation methods for resveratrol have been developed both in the form of chemical syntheses (for example US Pat. No. 6,552,213, WO 2005023740, US Pat. No. 7,235,324) and biotechnological processes in microorganisms.
Die in biochemischen Verfahren eingesetzten Mikroorganismen sind meist rekombinante, da der Biosyntheseweg hin zumThe microorganisms used in biochemical processes are mostly recombinant, since the biosynthetic pathway towards the
Resveratrol lediglich in einigen Pflanzen realisiert ist und dieser Stoffwechselweg in Mikroorganismen übertragen werden muss. Resveratrol wird durch drei Enzyme aus den Metaboliten Tyrosin und Malonyl-CoA (Intermediat derResveratrol is realized only in some plants and this metabolic pathway must be transferred into microorganisms. Resveratrol is produced by three enzymes from the metabolites tyrosine and malonyl-CoA (Intermediate of the
Fettsäurebiosynthese) , die in allen Organismen vorkommen, synthetisiert. Die drei Enzyme sind i) die Tyrosin- Ammonium-Lyase (TAL) , die Tyrosin durch Deaminierung in 4- Coumarsäure umwandelt, ii) die 4-Coumaryl-CoA-Ligase, die die Aktivierung der Coumarsäure zum 4-Coumaryl-CoA katalysiert, und schließlich, iii) die Stilben-Synthase, die in drei Schritten drei Moleküle Malonyl-CoA mit einem Molekül 4-Coumaryl-CoA zum Resveratrol kondensiert. Wird Coumarsäure als Vorläufermolekül gefüttert, kann man auch nur unter Verwendung der letzten beiden Enzyme, 4-Coumaryl- CoA-Ligase und Stilben-Synthase, Resveratrol auf biotechnologischem Wege herstellen.Fatty acid biosynthesis) that occur in all organisms. The three enzymes are i) tyrosine ammonium lyase (TAL), which converts tyrosine into 4-coumaric acid by deamination, ii) 4-coumaryl CoA ligase, which catalyzes the activation of coumaric acid to 4-coumaryl CoA, and finally, iii) the stilbene synthase, which condenses three molecules of malonyl-CoA with one molecule of 4-coumaryl-CoA to the resveratrol in three steps. When coumaric acid is fed as a precursor molecule, biosynthesis of resveratrol can be achieved only by using the last two enzymes, 4-coumaryl-CoA ligase and stilbene synthase.
Eine funktionelle Expression von zwei der genannten Enzyme (4-Coumaryl-CoA-Ligase und Stilben-Synthase) bzw. des gesamten Stoffwechselweg wurde sowohl in Bakterien (Beekwilder et al . , 2006; Watts et al . , 2006, Katsuyama et al., 2007, WO05084305) als auch Hefen (Becker et al . , 2003; Beekwilder et al . , 2006, WO 06089898) bereits gezeigt. Es konnte Resveratrol entweder aus dem Vorläufermolekül Coumarsäure und Glukose (als Kohlenstoff- und Energiequelle für die Herstellung von Malonyl-CoA als zweitem Vorläufermolekül oder auch ausschließlich aus Glukose hergestellt werden.Functional expression of two of the enzymes mentioned (4-coumaryl-CoA ligase and stilbene synthase) and the entire metabolic pathway has been described both in bacteria (Beekwilder et al., 2006, Watts et al., 2006, Katsuyama et al. 2007, WO05084305) as well as yeasts (Becker et al., 2003; Beekwilder et al. , 2006, WO 06089898) already shown. It was possible to prepare resveratrol either from the precursor molecule coumaric acid and glucose (as a carbon and energy source for the production of malonyl-CoA as a second precursor molecule or also exclusively from glucose.
Nachteil aller oben beschriebenen biotechnologischen Verfahren ist, dass trotz massiver Überproduktion der Resveratrol synthetisierenden Enzyme das Produkt lediglich in einer Konzentration von 100 mg/1 bezogen auf die Kulturbrühe erreicht werden konnten. Dies ist sehr weit von Konzentrationen entfernt, die eine biotechnologische Herstellung sinnvoll machen.Disadvantage of all biotechnological methods described above is that despite massive overproduction of the resveratrol synthesizing enzymes, the product could be achieved only in a concentration of 100 mg / 1 based on the culture broth. This is very far removed from concentrations that make biotechnological production meaningful.
Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren bereitzustellen, welches die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwindet.The object of the invention was therefore to provide a method which overcomes the disadvantages of the prior art described.
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Überraschenderweise wurde gefunden, dass das im Folgenden beschriebene Verfahren die beschriebenen Nachteile desSurprisingly, it has been found that the method described below has the described disadvantages of
Standes der Technik überwindet.The state of the art overcomes.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung vonThe present invention is therefore a biotechnological process for the preparation of
Stilbenoiden .Stilbenoids.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die Stilbenoide selber so wie chemische Produkte, die mit diesenAnother object of the invention are the stilbenoids themselves as well as chemical products with these
Stilbenoiden hergestellt werden. Ein Vorteil der Erfindung ist es, dass keine großen Pflanzenmengen für die Herstellung der Stilbenoide benötigt werden. Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist die Reduzierung an benötigten, organischen Extraktionsmitteln. Noch ein weiterer Vorteil der Erfindung ist es, dass in dem biochemischen Verfahren weniger Kohlenstoffquelle bezogen auf hergestelltes Stilbenoide als bisher eingesetzt werden muss und somit dem ressourcenschonenden Umgang mit Rohstoffen Rechnung getragen werden kann.Stilbenoids are produced. An advantage of the invention is that no large amounts of plant are needed for the production of stilbenoids. Another advantage of the invention is the reduction in required organic extractants. Yet another advantage of the invention is that in the biochemical process less carbon source based on manufactured stilbenoids than before must be used and thus the resource-saving handling of raw materials can be taken into account.
Unter „Stilbenoide" werden im Rahmen der Erfindung mit mindestens einer Hydroxygruppe hydroxylierte strukturelle Derivate des Stilbens (1, 2-Ethendiylbisbenzen) verstanden, wobei „Stilben" das E- und Z-Isomer bzw. eis- und trans- Isomer umfasst; Beispiele für Stilbenoide sind daherIn the context of the invention, "stilbenoids" are understood to mean hydroxylated structural derivatives of stilbene (1,2-ethenediyl bisbenzene) with at least one hydroxyl group, "stilbene" comprising the E and Z isomer or the cis and trans isomer; Examples of stilbenoids are therefore
Resveratrol, Piceatannol, Pinosylvin und Pterostilben .Resveratrol, Piceatannol, Pinosylvin and Pterostilben.
Alle angegebenen Prozent (%) sind wenn nicht anders angegeben Massenprozent.All percentages (%) are percentages by weight unless otherwise specified.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Stilbenoiden, umfassend die Verfahrensschritte I) in Kontakt Bringen einer Zelle, welche in der Lage ist, Stilbenoide zu bilden, mit einem Nährmedium beinhaltend mindestens einen Polyether und II) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die es der Zelle ermöglichen, Stilbenoide zu bilden.The invention relates to a process for the preparation of stilbenoids, comprising the steps of I) bringing into contact a cell which is capable of forming stilbenoids, with a nutrient medium comprising at least one polyether and II) cultivating the cell under conditions which it enable the cell to form stilbenoids.
Erfindungsgemäß können in dem Verfahren sämtliche Zellen, bevorzugt rekombinante, d. h. gentechnisch veränderte Zellen, eingesetzt werden, die in der Lage sind, Stilbenoide zu bilden; dies können Prokaryonten oder Eukaryonten sein. Dabei kann es sich um Säugetierzellen (wie etwa Zellen aus dem Menschen) , um pflanzliche Zellen oder um Mikroorganismen wie Hefen, Pilze oder Bakterien handeln, wobei Mikroorganismen besonders bevorzugt und Bakterien und Hefen am meisten bevorzugt sind. Als Bakterien, Hefen oder Pilze sind insbesondere diejenigen Bakterien, Hefen oder Pilze geeignet, die bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, als Bakterien-, Hefe- oder Pilz-Stämme hinterlegt sind. Erfindungsgemäß geeignete Bakterien gehören zu den Gattungen, die am Anmeldetag dieser Anmeldung unter http : //www. dsmz . de/species/bacteria .htm aufgeführt sind, erfindungsgemäß geeignete Hefen gehören zu denjenigen Gattungen, die am Anmeldetag dieser Anmeldung unter http : //www. dsmz . de/species/yeasts .htm aufgeführt sind und erfindungsgemäß geeignete Pilze sind diejenigen, die am Anmeldetag dieser Anmeldung unter http : //www. dsmz . de/species/fungi .htm aufgeführt sind.According to the invention, all cells, preferably recombinant, ie genetically modified, cells which are capable of producing stilbenoids can be used in the process; these may be prokaryotes or eukaryotes. These may be mammalian cells (such as human cells), plant cells or microorganisms such as yeasts, fungi or bacteria, microorganisms being particularly preferred and bacteria and yeasts being most preferred. Particularly suitable bacteria, yeasts or fungi are those bacteria, yeasts or fungi which are deposited in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ), Braunschweig, Germany, as bacterial, yeast or fungal strains. Bacteria that are suitable according to the invention belong to the genera listed on the filing date of this application under http: // www. dsmz. de / species / bacteria .htm are listed, yeasts which are suitable according to the invention belong to the genera listed on the filing date of this application at http: // www. dsmz. de / species / yeasts. htm and fungi suitable according to the invention are those listed on the filing date of this application at http: // www. dsmz. de / species / fungi .htm are listed.
Erfindungsgemäß werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugte Zellen der Gattungen Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia und Clostridium eingesetzt, wobei Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida utilis, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, Ralstonia eutropha H16, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris und Pichia ciferrii ganz besonders bevorzugt eingesetzt werden.According to the invention, particularly preferred cells of the genera Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluyveromyces, Hansenula, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia and Clostridium are used in the method according to the invention, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida utilis, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, Ralstonia eutropha H16, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris and Pichia ciferrii are used with very particular preference.
Bevorzugt werden gegenüber ihrem Wildtyp gentechnisch veränderte Zellen eingesetzt, die im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Stilbenoide als ihr Wildtyp zu bilden vermögen. Die Formulierung „dass sie im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Stilbenoide zu bilden vermögen" betrifft auch den Fall, dass der Wildtyp der gentechnisch veränderten Zelle überhaupt keine Stilbenoide, vorzugsweise keinGenetically modified cells are preferred to their wild type, which are able to produce more stilbenoids than their wild type compared to their wild type. The wording "that they are able to make more stilbenoids compared to their wild type" also applies to the case that the wild-type of the genetically modified cell does not have any stilbenoids at all, preferably none
Resveratrol, zumindest aber keine nachweisbaren Mengen dieser Verbindungen zu bilden vermag und erst nach der gentechnischen Veränderung nachweisbare Mengen dieser Komponenten gebildet werden können. Beispiele solcher Zellen sind in der WO 2006/089898 beschrieben und dieses Dokument wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.Resveratrol, but at least no detectable amounts of these compounds can form and only after the genetic modification detectable amounts of these components can be formed. Examples of such cells are described in WO 2006/089898 and this document is hereby incorporated by reference and forms part of the disclosure of the present invention.
Erfindungsgemäß können in dem Verfahren sämtliche Zellen eingesetzt werden, die in der Lage sind, aus beliebiger Kohlenstoffquelle wie beispielsweise Zuckern, Hexosen, Pentosen, Disacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden, Fetten, Triglyceriden, Glycerin, Fettsäuren, Alkanen, Methan, Methanol, Ethanol, Alkoholen, Kohlendioxid, Lactat, Pyruvat, Acetat, Propionat, Butyrat oder organischen Säuren, Stilbenoide, bevorzugt Resveratrol, zu bilden. Erfindungsgemäß bevorzugt werden solche Zellen eingesetzt, die in der Lage sind aus Glucose, Saccharose oder Glycerin als Kohlenstoffquelle Stilbenoide, bevorzugt Resveratrol, zu bilden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden ganz besonders bevorzugt Zellen eingesetzt, die in der Lage sind, Stilbenoide, bevorzugt Resveratrol, über Malonsäure, Tyrosin, Phenylalanin, Zimtsäure, Coumarsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure oder andere Zimtsäureabkömmlinge als Edukte oder als Zwischenprodukte zu bilden.According to the invention, all cells capable of being derived from any carbon source such as sugars, hexoses, pentoses, disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, fats, triglycerides, glycerol, fatty acids, alkanes, methane, methanol, ethanol, alcohols can be used in the process , Carbon dioxide, lactate, pyruvate, acetate, propionate, butyrate or organic acids, stilbenoids, preferably resveratrol. Preferred cells according to the invention are those which are capable of forming stilbenoids, preferably resveratrol, from glucose, sucrose or glycerol as the carbon source. In the method according to the invention, very particular preference is given to using cells which are capable of forming stilbenoids, preferably resveratrol, via malonic acid, tyrosine, phenylalanine, cinnamic acid, coumaric acid, ferulic acid, caffeic acid or other cinnamic acid derivatives as starting materials or as intermediates.
Es ist dem Fachmann bewusst, dass an Stelle der genannten Säuren auch deren korrespondierenden Salze bzw. Mischungen der freien Säure und Salze eingesetzt werden können. Beispiele für solche Zellen sind der WO 2006/124999 zu entnehmen, und dieses Dokument wird hiermit als Referenz eingeführt und bildet einen Teil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung.It is known to the person skilled in the art that, instead of the acids mentioned, their corresponding salts or mixtures of the free acid and salts can also be used. Examples of such cells can be found in WO 2006/124999, and this document is hereby incorporated by reference and forms part of the disclosure of the present invention.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzendeTo be used in the process according to the invention
Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) enthalten.Culture medium must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C, USA, 1981).
Als Kohlenstoffquelle in dem eingesetzten Nährmedium werden Kohlehydrate, wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Methanol, Aminosäuren wie L-Glutamat oder L-Valin oder organische Säuren wie zum Beispiel Essigsäure eingesetzt. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung eingesetzt werden . Neben den Kohlenstoffquellen kann das Nährmedium insbesondere Stickstoff und Phosphorquellen, Salze sowie Mittel zur pH-Kontrolle enthalten.As carbon source in the nutrient medium used are carbohydrates, such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose, oils and fats such. As soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut oil, fatty acids such. As palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such. As glycerol and methanol, amino acids such as L-glutamate or L-valine or organic acids such as acetic acid used. These substances can be used individually or as a mixture. In addition to the carbon sources, the nutrient medium may contain in particular nitrogen and phosphorus sources, salts and pH control agents.
Als Stickstoffquelle in dem eingesetzten Nährmedium können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat eingesetzt werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung eingesetzt werden.As nitrogen source in the nutrient medium used, organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used. The nitrogen sources can be used individually or as a mixture.
Als Phosphorquelle in dem bzw. in den im Verfahrensschritt a) eingesetzten Nährmedium/Nährmedien können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze eingesetzt werden. Das im Verfahren eingesetzte Nährmedium sollte weiterhin Salze von Metallen enthalten, die für das Wachstum notwendig sind, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat, Kupfersulfat, Zinksulfat, Mangansulfat oder Eisensulfat.Phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts can be used as the phosphorus source in or in the nutrient medium / nutrient media used in process step a). The nutrient medium used in the process should further contain salts of metals necessary for growth, such as magnesium sulfate, copper sulfate, zinc sulfate, manganese sulfate or iron sulfate.
Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen im Nährmedium eingesetzt werden.Finally, essential growth factors such as amino acids and vitamins can be used in addition to the above-mentioned substances in the nutrient medium.
Bei dem im Verfahrensschritt I) eingesetzten, vorzugsweise wasserlöslichen Polyether handelt es sich vorzugsweise um ein Polyalkylenglykol . Als Polyether werden insbesondere Polyethylenglykol (PEG) oder Polypropylenglykol (PPG) eingesetzt, wobei PEG besonders bevorzugt ist. Weitere bevorzugt in Verfahrenssschritt I) eingesetzte Polyether sind Octoxinol-9 (auch Triton X-100, ein p-tert- Octylphenol-Derivat mit einer Polyethylenglykol- Seitenkette, aus 9-10 Ethylenoxid-Einheiten) und Polysorbate 20 (kommerzieller Namen Tween® 20, ein Polyoxyethylen (20) -sorbitan-monolaurat)The preferably water-soluble polyether used in process step I) is preferably a polyalkylene glycol. Polyethers used are in particular polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol (PPG), with PEG being particularly preferred. Further preferred polyethers used in process step I) are octoxinol-9 (also Triton X-100, a p-tert-butyl). Octylphenol derivative with a polyethylene glycol side chain, from 9-10 ethylene oxide units) and polysorbate 20 (commercial name Tween® 20, a polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate)
Das Molekulargewicht des in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Polyethers liegt in einem Bereich von 100 g/mol bis 200000 g/mol, bevorzugt von 200 g/mol bis 200000 g/mol und besonders bevorzugt von 300 g/mol bis 100000 g/mol. Es ist dem Fachmann geläufig, dass die Polyether in Form eines Gemisches mit einer im Wesentlichen durch statistische Gesetze geregelten Verteilung des Molekulargewichtes vorliegen bzw. vorliegen können. Die Werte für das Molekulargewicht stellen deshalb üblicherweise einen Mittelwert dar.The molecular weight of the polyether used in the process according to the invention is in a range from 100 g / mol to 200,000 g / mol, preferably from 200 g / mol to 200,000 g / mol and more preferably from 300 g / mol to 100,000 g / mol. It is known to the person skilled in the art that the polyethers may be in the form of a mixture with a distribution of molecular weight regulated essentially by statistical laws. The values for the molecular weight therefore usually represent an average value.
Bei dem im Verfahrensschritt I) eingesetzten Polyether werden Konzentrationen von 1 g/l bis 1000 g/l, bevorzugt von 2 g/l bis 800 g/l und besonders bevorzugt von 10 g/l bis 600 g/l bezogen auf das Gesamtvolumen des Nährmediums eingesetzt .Concentrations of from 1 g / l to 1000 g / l, preferably from 2 g / l to 800 g / l and particularly preferably from 10 g / l to 600 g / l, based on the total volume of the polymer are used in the polyether used in process step I) Nutrient medium used.
Erfindungsgemäß können auch Mischungen verschiedener Polyether eingesetzt werden.According to the invention, it is also possible to use mixtures of different polyethers.
Die Kultivierung der Mikroorganismen im Verfahrensschritt II) kann kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch- Verfahren (Satzkultivierung), im fed-batch-Verfahren (Zulaufverfahren) oder im repeated-fed-batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Herstellung von Biomasse bis zum Erreichen einer relevanten Biotrockenmasse erfolgen. Denkbar ist auch ein semikontinuierliches Verfahren, wie es in der GB-A-1009370 beschrieben wird. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel („Bioprozesstechnik 1. Einführung in dieThe cultivation of the microorganisms in process step II) can be carried out continuously or discontinuously in the batch process (batch cultivation), in the fed-batch process (feed process) or in the repeated-fed-batch process (repetitive feed process) for the purpose of producing biomass by Reaching a relevant biomass dry done. Also conceivable is a semi-continuous process, as described in GB-A-1009370 is described. A summary of known cultivation methods can be found in the textbook by Chmiel ("Bioprocessing Technology 1. Introduction to the
Bioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas („Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) beschrieben.Biochemical Engineering "(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (" Bioreactors and Peripheral Devices ", Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994).
Dem Kulturmedium können überdies im Rahmen der Kultivierung geeignete Vorstufen wie beispielsweise 4-Hydroxyzimtsäure, Malonsäure, Tyrosin, Phenylalanin, Zimtsäure, Coumarsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure oder andere Zimtsäureabkömmlinge zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.In addition, suitable precursors such as 4-hydroxycinnamic acid, malonic acid, tyrosine, phenylalanine, cinnamic acid, coumaric acid, ferulic acid, caffeic acid or other cinnamic acid derivatives may be added to the culture medium during the cultivation. The said feedstocks may be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Sollen aerobe Bedingungen aufrechterhalten werden, so werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20 0C bis 45 0C und vorzugsweise bei 25 0C bis 40 0C, bei einem Einsatz thermophiler Bakterien können die Temperaturen auch bis zu 80 0C betragen.For pH control of the culture, basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such as phosphoric acid or sulfuric acid are suitably used. To control the foam development antifoams such. B. fatty acid polyglycol esters are used. To maintain the stability of plasmids, the medium suitable selective substances such. B. antibiotics are added. If aerobic conditions are to be maintained, then oxygen or oxygen-containing gas mixtures such. For example, air is introduced into the culture. The temperature of the culture is normally from 20 0 C to 45 0 C and preferably at 25 0 C to 40 0 C, with a use of thermophilic bacteria, the temperatures can be up to 80 0 C.
Gemäß einer weiteren, besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens beinhaltet dieses Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt III) Isolierung der gebildeten Stilbenoide.According to a further, special embodiment of the method according to the invention, this method includes additionally the process step III) isolation of the formed stilbenoids.
Im Schritt III) des erfindungsgemäßen Verfahrens können die durch die Zellen gebildeten Stilbenoide gegebenenfalls aus den Zellen und/oder dem Nährmedium isoliert werden, wobei zur Isolierung alle dem Fachmann bekannten Methoden zur Isolierung von niedermolekularen Substanzen aus komplexen Zusammensetzungen in Betracht kommen. Beispielhaft seien an dieser Stelle die Fällung mittels geeigneter Lösungsmittel, die Extraktion mittels geeigneter Lösungsmittel, dieIn step III) of the method according to the invention, the stilbenoids formed by the cells can optionally be isolated from the cells and / or the nutrient medium, all methods known to those skilled in the art for isolating low molecular weight substances from complex compositions being suitable for isolation. By way of example, the precipitation by means of suitable solvents, the extraction by means of suitable solvents, the
Komplexierung, beispielsweise mittels Cyclodextrinen oder Cyclodextrin-Derivaten, die Kristallisation, die Aufreinigung bzw. Isolierung mittels chromatographischer Methoden oder die Überführung der Stilbenoide in leicht abtrennbare Derivate genannt.Complexation, for example by means of cyclodextrins or cyclodextrin derivatives, the crystallization, the purification or isolation by means of chromatographic methods or the conversion of the stilbenoids in easily separable derivatives called.
Für den Fall, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren ein wasserunlöslicher Polyether eingesetzt wird, kann der Polyether als Extraktionsmittel verwendet werden. Somit ist es dann bevorzugt, den Polyether von der Kulturbrühe, beispielsweise durch Zentrifugation oder Sedimentation zu trennen und aus diesem heraus das Stilbenoid weiter aufzuarbeiten .In the event that a water-insoluble polyether is used in the process according to the invention, the polyether can be used as extractant. Thus, it is then preferred to separate the polyether from the culture broth, for example by centrifugation or sedimentation, and to further work up the stilbenoid therefrom.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die Stilbenoide und das Resveratrol erhalten durch das erfindungsgemäße VerfahrenAnother object of the invention are the stilbenoids and the resveratrol obtained by the method according to the invention
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind chemische Produkte, insbesondere kosmetische Formulierungen, Nahrungsmittel, Getränke und pharmazeutische Formulierungen, beinhaltend die Stilbenoide und/oder das Resveratrol erhalten durch das erfindungsgemäße Verfahren In den nachfolgend aufgeführten Beispielen wird die vorliegende Erfindung beispielhaft beschrieben, ohne dass die Erfindung, deren Anwendungsbreite sich aus der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, auf die in den Beispielen genannten Ausführungsformen beschränkt sein soll .Yet another object of the invention are chemical products, in particular cosmetic formulations, foods, drinks and pharmaceutical formulations containing the stilbenoids and / or the resveratrol obtained by the method according to the invention In the examples given below, the present invention is described by way of example, without the invention, the scope of application of which is apparent from the entire description and the claims, to be limited to the embodiments mentioned in the examples.
Folgende Abbildungen sind Bestandteil der Beispiele:The following figures are part of the examples:
Die Abbildung 1 zeigt den Verlauf der Resveratrolbildung ohne bzw. mit Zugabe von PEG3350 oder PPG4000.Figure 1 shows the course of Resveratrolbildung without or with the addition of PEG3350 or PPG4000.
Die Abbildung 2 zeigt die Auswirkung unterschiedlicherFigure 2 shows the effect of different
Konzentrationen von PEG3350 auf die Resveratrolbildung. Die Abbildung 3 zeigt die Auswirkung unterschiedlicher PEG-Concentrations of PEG3350 on resveratrol formation. Figure 3 shows the effect of different PEG
Molekulargewichte auf die Resveratrolbildung bei Vorlage von jeweils 50g/l PEG.Molecular weights on the Resveratrolbildung upon submission of 50g / l PEG.
Beispiele :Examples:
Beispiel 1: Klonierung eines Vektors zur Expression der Coumaryl-CoA-Ligase- und der Stilben-Synthase-kodierenden Gene in Escherichia coliExample 1: Cloning of a vector for expressing the Coumaryl-CoA ligase and the stilbene synthase-encoding genes in Escherichia coli
Amplifikation von DNA mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) , Restriktionsverdau, DNA-Aufreinigung, Ligation sowie Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen erfolgten in dem Fachmann bekannter Art und Weise. Alle benötigten Enzyme wurden bezogen von New England Biolabs, Schwalbach. Die Synthese von Oligonukleotiden erfolgte durch MWG Biotech, Ebersberg. - Zunächst wurde der den Lacl-Operator enthaltenden lac- Promotor im kommerziell erhältlichen Vektor pUC19 (New England Biolabs, Schwalbach) durch Umklonierung eines synthetischen Fragments des lac-Promotors ohne Operator ersetzt in Anlehnung an Watts et al . , "Biosynthesis of plant-specific stilbene polyketides in metabolically engineered Escherichia coli" (BMC Biotechnology 2006, 6:22) . Der Vektor pUC19 (2686bp) wurde hierfür geschnitten mit PvuII und Ndel gemäß den Angaben des Herstellers (New England Biolabs, Schwalbach) . Das synthetische Fragment des lac-Promotors ohne Operator (SEQ-ID Nr.1) wurde in derselben Weise der modifizierte lac-Promotor geschnitten, und das resultierende Fragment nach Aufreinigung über ein Agarosegel mittels QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) mit dem verbliebenen, gleichermaßen aufgereinigten Vektorrückgrat von pUC19 (2240bp) ligiert (T4 DNA Ligase, New England Biolabs, Schwalbach), woraus der Vektor pUCmodll (2452bp) resultierte. Ligation und Transformation von kompetenten Escherichia coli DH5a erfolgten entsprechend der Vorgaben des Herstellers (New England Biolabs, Schwalbach) .Amplification of DNA by means of PCR (Polymerase Chain Reaction), restriction digestion, DNA purification, ligation and transformation of chemically competent E. coli cells were carried out in a manner known to the person skilled in the art. All required enzymes were purchased from New England Biolabs, Schwalbach. The synthesis of oligonucleotides was carried out by MWG Biotech, Ebersberg. First, the lac promoter containing the LacI operator was replaced in the commercially available vector pUC19 (New England Biolabs, Schwalbach) by recloning a synthetic fragment of the lac promoter without operator based on Watts et al. , "Biosynthesis of plant-specific stilbene polyketides in metabolically engineered Escherichia coli" (BMC Biotechnology 2006, 6:22). The vector pUC19 (2686 bp) was cut with PvuII and Ndel according to the manufacturer's instructions (New England Biolabs, Schwalbach). The synthetic fragment of the lac promoter without operator (SEQ ID No.1) was cut in the same way the modified lac promoter, and the resulting fragment after purification on an agarose gel using QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) with the ligated, similarly purified vector backbone of pUC19 (2240 bp) (T4 DNA ligase, New England Biolabs, Schwalbach), resulting in the vector pUCmodll (2452 bp). Ligation and transformation of competent Escherichia coli DH5a were carried out according to the specifications of the manufacturer (New England Biolabs, Schwalbach).
- Der Vektor pUCmodll wurde im nächsten Schritt mit Xbal und NotI geschnitten. Ausgehend von dem Vektor pCR2.1- TOPO-VvSTS (SEQ-ID Nr. 2) wurde mittels PCR unter Verwendung von Phusion DNA Polymerase (New England Biolabs, Schwalbach) und den Oligonukleotiden VvSTScod- Xbal-fw (5'-TAT ATA TCT AGA AGG AGG ATT ACA AAA TGG CTT CAG TCG AGG AAA TTAG-3 ' ) und VvSTScod-Notl-rv (5'-TAT ATA GCG GCC GCT TTA ATT TGT AAC CAT AGG-3') das Gen der Stilben-Synthase aus Vinis vinifera (VvSTS) gemäß den Angaben des Herstellers amplifiziert, woraus ein ca. 1200 bp-Fragment (SEQ-ID Nr. 3) resultierte. Dieses wurde über ein Agarosegel mittels QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden) aufgereinigt . Das PCR- Produkt wurde anschließend analog zum Vektor pUCmodll mit Xbal und NotI geschnitten und beide Fragmente ligiert, woraus der Vektor pUCmod-VvSTS resultierte- The vector pUCmodll was cut in the next step with Xbal and NotI. Starting from the vector pCR2.1-TOPO-VvSTS (SEQ ID NO: 2) was determined by PCR using Phusion DNA polymerase (New England Biolabs, Schwalbach) and the oligonucleotides VvSTScod- Xbal-fw (5'-TAT ATA TCT AGA AGG AGG ATT ACA AAA TGG CTT CAG TCG AGG AAA TTAG-3 ') and VvSTScod-Notl-rv (5'-TAT ATA GCG GCC GCT TTA ATT TGT AAC CAT AGG-3') the gene from Vinis stilbene synthase vinifera (VvSTS) according to the manufacturer's instructions, resulting in an approximately 1200 bp fragment (SEQ ID No. 3). This was purified on an agarose gel using QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden). The PCR product was then cut analogously to the vector pUCmodII with XbaI and NotI and both fragments ligated, resulting in the vector pUCmod-VvSTS
(3625bp) .(3625bp).
- Das Gen der Coumaryl-CoA-Ligase At4Cll aus Arabidopsis thaliana wurde ausgehend von Arabidopsis thaliana cDNA (United States Biological, Swampscott, USA) mittels PCR und den Oligonukleotiden At4Cll-Not-fw (5'- TAT ATA GCG GCC GCA GGA GGA TTA CAA AAT GGC GCC ACA AGA AC-3') und At4Cll-Not (5'- TAT ATA GCG GCC GCT CAC AAT CCA TTT GCT AGT TTT-3') amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt (SEQ-ID Nr. 4) wurde über ein Agarosegel aufgereinigt und mit NotI geschnitten. Das hieraus resultierende 1708bp-Fragment wurde mit dem gleichermaßen geschnittenen Vektor pUCmod-VvSTS nach dessen Dephosphorylierung mit CIP (New England Biolabs, Schwalbach) gemäß den Angaben des Herstellers ligiert, woraus der Vektor pUCmod-VvSTS-At4Cll (alternativeArabidopsis thaliana coumaryl CoA ligase At4Cll was generated from Arabidopsis thaliana cDNA (United States Biological, Swampscott, USA) by PCR and the oligonucleotides At4Cll-Not-fw (5'-TAT ATA GCG GCC GCA GGA GGA TTA CAA AAT GGC GCC ACA AGA AC-3 ') and At4Cll-Not (5'-TAT ATA GCG GCC GCT CAC AAT CCA TTT GCT AGT TTT-3'). The resulting PCR product (SEQ ID NO: 4) was purified on an agarose gel and cut with NotI. The resulting 1708 bp fragment was ligated with the similarly cut vector pUCmod-VvSTS after its dephosphorylation with CIP (New England Biolabs, Schwalbach) according to the manufacturer's instructions, from which the vector pUCmod-VvSTS-At4CII (alternative
Benennung: pUC-VvSTS-At4Cll) resultierte (5333bp) . Die Orientierung des Inserts wurde dabei so gewählt, dass VvSTS und At4Cll gleichgerichtet transkribiert und translatiert werden. - Der Promotor der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Designation: pUC-VvSTS-At4Cll) resulted (5333bp). The orientation of the insert was chosen such that VvSTS and At4Cll are transcribed and translated in the same direction. The promoter of glyceraldehyde-3-phosphate
Dehydrogenase (GAPDH) wurde mittels Kolonie-PCR mit Escherichia coli DH5a Zellen (New England Biolabs) , Phusion DNA Polymerase und den Oligonukleotiden EcGAP- Sapl-fw (5'-TAT ATA GCT CTT CAA GCG CGT AAT GCT TAG GCA CAG G-3') und EcGAP-Xbal-rv (5'-TAT ATA TCT AGA TGA ATA AAA GGT TGC CTG TAA-3') amplifiziert. Das resultierende PCR-Produkt (ca.HObp; SEQ-ID Nr. 5) wurde aufgereingt über ein Agarosegel wie bereits beschrieben, und anschließend einem SapI und Xbal-Verdau unterzogen. Der Vektor pUCmod-VvSTS-At4Cll wurde ebenfalls mit Xbal und SapI geschnitten, und das Vektorrückgrat (5139bp) mit dem den Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase- Promotor enthaltenden PCR-Produkt ligiert, woraus derDehydrogenase (GAPDH) was isolated by colony PCR with Escherichia coli DH5a cells (New England Biolabs), Phusion DNA polymerase and the oligonucleotides EcGAP-Sapl-fw (5'-TAT ATA GCT CTT CAA GCG CGT AAT GCT TAG GCA CAG G-3 ') and EcGAP-XbaI-rv (5'-TAT ATA TCT AGA TGA ATA AAA GGT TGC CTG TAA-3'). The resulting PCR product (ca.HObp; SEQ ID NO: 5) was grown on an agarose gel as previously described, and subsequently subjected to SapI and XbaI digestion. The vector pUCmod-VvSTS-At4Cll was also cut with XbaI and SapI and the vector backbone (5139bp) ligated with the PCR product containing the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter, resulting in the
Vektor pUC-GAP-VvSTS-At4Cll resultierte (5244bp; SEQ-ID Nr. 6) .Vector pUC-GAP-VvSTS-At4Cll resulted (5244bp; SEQ ID NO: 6).
- Zellen des Escherichia coli-Stammes BW27784 (E. coli Genetic Resource Center, New Haven, USA) wurde mit pUC- GAP-VvSTS-At4Cll transformiert. Die Herstellung und Transformation der kompetenten Zellen erfolgte in dem Fachmann bekannter Art und Weise.Cells of Escherichia coli strain BW27784 (E. coli Genetic Resource Center, New Haven, USA) were transformed with pUC-GAP-VvSTS-At4CII. The preparation and transformation of the competent cells was carried out in a manner known to the person skilled in the art.
Beispiel 2: Kultivierung der rekombinanten E. coli-Stämme zur Herstellung von Resveratrol in An- und Abwesenheit von PEG bzw. PPGExample 2 Cultivation of the Recombinant E. coli Strains for the Production of Resveratrol in the Presence and Absence of PEG or PPG
3 ml modifiziertes M9-Medium (M9 mit 10 g/l Hefeextrakt, 1 % Glycerin als Kohlenstoffquelle, 200 mM MOPS als Puffer;3 ml of modified M9 medium (M9 with 10 g / l yeast extract, 1% glycerol as carbon source, 200 mM MOPS as buffer;
Basismedium M9 : 6,8 g/l Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, 3 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l Ammoniumchlorid, 15 mg/1 Calciumchlorid Dihydrat, 250 mg/1 Magnesiumsulfat Heptahydrat, 1 % MEM Vitamin Solution (Sigma-Aldrich) , pH 7,0), welches 100 μg/mlBase medium M9: 6.8 g / l disodium hydrogen phosphate dihydrate, 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / l sodium chloride, 1 g / l ammonium chloride, 15 mg / l calcium chloride dihydrate, 250 mg / 1 magnesium sulfate heptahydrate, 1% MEM vitamin Solution (Sigma-Aldrich), pH 7.0), which is 100 μg / ml
Ampicllin enthielt, wurde am Morgen mit E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll von frisch ausgestrichenen und über Nacht bei 37 0C inkubierten LB-Agar Platten (LB-Agar nach MILLER, 37 g/l) mit 100 μg/ml Ampicillin angeimpft, und für 6 h bei 37 0C und 225 upm in 10-ml-Röhrchen inkubiert. Am Nachmittag wurden 100 ml modifiziertes M9-Medium in einem 500-ml-Schüttelkolben mit Schikanen mit Zellsuspension aus der Vorkultur mit einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,1 angeimpft. Die Inkubation der Schüttelkolben erfolgte über Nacht für 16 - 18 h bei 37 0C und 225 upm. Am nächsten Morgen wurde die Zellbrühe in 50-ml-Falconröhrchen überführt und diese bei 4000 upm für 10 min und Raumtemperatur abzentrifugiert . Das Zellpellet wurde in 100 ml frischem modifiziertem M9-Medium resuspendiert, supplementiert mit 3 - 4 mM 4-Hydroxyzimtsäure sowie 100 g/l PEG 3350 (Sigma Aldrich) bzw. 5 % PPG 4000 (v/v) (Sigma Aldrich), und jeweils in einen 500-ml-Schüttelkolben mit Schikanen überführt. Dieser wurde zur Bestimmung der Produktbildungsraten bei 37 0C und 250 upm für 4 - 6 h inkubiert. Das Wachstum der E. coli-Zellen wurde durch regelmäßige Messung der OD600 verfolgt. Die Ergebnisse sind in Abb. 1 gezeigt.Ampicllin contained was in the morning with E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll of freshly streaked and grown overnight at 37 0 C incubated LB agar plates (LB agar after MILLER, 37 g / l) containing 100 ug / ml Ampicillin, and incubated for 6 h at 37 ° C. and 225 rpm in 10 ml tubes. In the afternoon, 100 ml of modified M9 medium in a 500 ml shake flask with baffles with cell suspension from the preculture with an optical density at 600 nm (OD600). inoculated of 0.1. The incubation of the shake flasks was carried out overnight for 16-18 h at 37 0 C and 225 rpm. The next morning, the cell broth was transferred to 50 ml Falcon tubes and spun down at 4000 rpm for 10 min and room temperature. The cell pellet was resuspended in 100 ml of fresh modified M9 medium supplemented with 3-4 mM 4-hydroxycinnamic acid and 100 g / L PEG 3350 (Sigma Aldrich) and 5% PPG 4000 (v / v) (Sigma Aldrich), respectively each into a 500 ml shake flask with baffles. This was incubated at 37 ° C. and 250 rpm for 4 to 6 hours to determine the product formation rates. The growth of E. coli cells was followed by regular measurement of the OD600. The results are shown in FIG.
Beispiel 3: Quantifizierung von Resveratrol und 4- Hydroxyzimtsäure in der ZellsuspensionExample 3: Quantification of resveratrol and 4-hydroxycinnamic acid in the cell suspension
Zur Extraktion wurde 1 ml der Zellsuspension eingesetzt. Die Zellsuspension wurde in 2-ml-Reaktionsgefäße überführt und durch Zugabe von 50 μl 3 M HCl angesäuert. Nach Zugabe von 950 μl Ethylacetat wurden die Proben in einer Retschmühle MM100 (RETSCH, Hahn) für 30 sec bei 30 Hz extrahiert, und anschließend für 1 min bei 13.200 upm abzentrifugiert. Die Ethylacetat-Phase wurde in ein 1,5-ml- HPLC-Gefäß (Agilent Technologies, Waldbronn) überführt und fest verschlossen.For extraction, 1 ml of the cell suspension was used. The cell suspension was transferred to 2 ml tubes and acidified by the addition of 50 μl of 3 M HCl. After addition of 950 .mu.l of ethyl acetate, the samples were extracted in a recycle mill MM100 (RETSCH, Hahn) for 30 sec at 30 Hz, and then centrifuged for 1 min at 13,200 rpm. The ethyl acetate phase was transferred to a 1.5 ml HPLC vessel (Agilent Technologies, Waldbronn) and sealed.
2 μl der Extrakte wurden auf eine Zorbax SB-C18-Säule (4.6 x 150 mm, 3.5 μm; Agilent Technologies, Waldbronn) mittels des Agilent 1200 HPLC-Systems, ausgestattet mit einem Photodioden-Array-Detektor und einem binären Gradientenmischer, injiziert. Resveratrol wurde mit einer mobilen Phase bestehend aus 580 g Acetonitril, 265 g Wasser und 0,5 ml Trifluoressigsäure pro Liter (Laufmittel A) und Wasser (Laufmittel B) , beigemischt in einem Mischungsverhältnis von 48 : 52 (A : B) , mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min und einer Säulentemperatur von 25 0C eluiert. Resveratrol als auch 4- Hydroxyzimtsäure wurde durch einen Vergleich mit der Verweilzeit und dem UV/VIS-Spektrum einer Referenzsubstanz (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen bzw. Merck, Darmstadt) identifiziert. Zur Quantifizierung des Eduktes 4- Hydroxyzimtsäure bzw. Produktes Resveratrol in den2 μl of the extracts were injected onto a Zorbax SB-C18 column (4.6 x 150 mm, 3.5 μm, Agilent Technologies, Waldbronn) using the Agilent 1200 HPLC system equipped with a photodiode array detector and a binary gradient mixer. Resveratrol was treated with a mobile phase consisting of 580 g acetonitrile, 265 g water and 0.5 ml of trifluoroacetic acid per liter (eluent A) and water (eluent B) admixed in a mixing ratio of 48:52 (A: B) at a flow rate of 1.0 ml / min and a column temperature of 25 ° C. eluted. Resveratrol as well as 4-hydroxycinnamic acid was identified by comparison with the residence time and the UV / VIS spectrum of a reference substance (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen and Merck, Darmstadt, respectively). For the quantification of the reactant 4-hydroxycinnamic acid or product resveratrol in the
Extrakten wurden Standard-Kurven durch das Auftragen der Peak-Flächen von Referenzproben mit bekannter Konzentration gegen die entsprechende Konzentration in diesen Referenzproben angefertigt. Die Detektion und Quantifizierung von Resveratrol und 4-Hydroxyzimtsäure erfolgte bei einer Wellenlänge von 308 nm.Extracts were prepared from standard curves by plotting the peak areas of reference samples of known concentration against the appropriate concentration in these reference samples. Resveratrol and 4-hydroxycinnamic acid were detected and quantified at a wavelength of 308 nm.
Abbildung 1 zeigt, dass die Kulturen des rekombinanten E. coli-Stammes BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4Cll in Anwesenheit von PEG bzw. PPG im Vergleich zur Kontrolle ohne PEG oder PPG nach 4 h Kultivierung signifikant gesteigerte Resveratroltiter aufweisen.FIG. 1 shows that the cultures of the recombinant E. coli strain BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4CII in the presence of PEG or PPG have significantly increased resveratrol titers after 4 h of culture without control of PEG or PPG.
Beispiel 4: Kultivierung der rekombinanten E. coli-Stämme zur Herstellung von Resveratrol in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von PEGExample 4: Cultivation of the recombinant E. coli strains for the production of resveratrol in the presence of various concentrations of PEG
2,5 ml modifiziertes M9-Medium (M9 mit 10 g/l Hefeextrakt, 1 % Glycerin als Kohlenstoffquelle, 200 mM MOPS als Puffer; Basismedium M9 : 6,8 g/l Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, 3 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l Ammoniumchlorid, 15 mg/1 Calciumchlorid Dihydrat, 250 mg/1 Magnesiumsulfat Heptahydrat, 1 % MEM Vitamin Solution (Sigma-Aldrich) , pH 7,0), welches 100 μg/ml Ampicllin enthielt, wurde am Morgen mit E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll von frisch ausgestrichenen und über Nacht bei 37 0C inkubierten LB-Agar Platten (LB-Agar nach MILLER, 37 g/l) mit 100 μg/ml Ampicillin angeimpft, und für 6 h bei 37 0C und 225 upm in 10-ml-Röhrchen inkubiert. Am Nachmittag wurden 50 ml modifiziertes M9-Medium in einem 250-ml-Schüttelkolben mit Schikanen mit Zellsuspension aus der Vorkultur mit einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,1 angeimpft. Die Inkubation der Schüttelkolben erfolgte über Nacht für 16 - 18 h bei 37 0C und 225 upm. Am nächsten Morgen wurde die Zellbrühe in 50-ml-Falconröhrchen überführt und diese bei 4000 upm für 10 min und Raumtemperatur abzentrifugiert . Das Zellpellet wurde in 50 ml frischem modifiziertem M9-Medium resuspendiert, supplementiert mit 4 mM 4-Hydroxyzimtsäure sowie 0, 10, 25, 50 bzw. 100 g/l PEG 3350 (Sigma Aldrich) , und jeweils in einen 250-ml-Schüttelkolben mit Schikanen überführt. Dieser wurde zur Bestimmung der Produktbildungsraten bei 37 0C und 250 upm für 6 h inkubiert. Abbildung 2 zeigt, dass die Kulturen des rekombinanten E. coli-Stammes BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4Cll bereits bei Anwesenheit von 10 g/l PEG3350 im Vergleich zur Kontrolle ohne PEG nach 6 h Kultivierung signifikant gesteigerte Resveratroltiter aufweisen, was im Wesentlichen durch eine erhöhte Raum-Zeit-Ausbeute verursacht wird.2.5 ml of modified M9 medium (M9 with 10 g / l yeast extract, 1% glycerol as carbon source, 200 mM MOPS as buffer, basal medium M9: 6.8 g / l disodium hydrogen phosphate dihydrate, 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / l sodium chloride, 1 g / l ammonium chloride, 15 mg / l calcium chloride dihydrate, 250 mg / 1 magnesium sulfate heptahydrate, 1% MEM Vitamin Solution (Sigma-Aldrich), pH 7.0) containing 100 μg / ml Ampicllin was incubated in the morning with E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll of freshly streaked and overnight incubated at 37 0 C LB agar plates (LB agar according to MILLER, 37 g / l) at 100 ug / ml Ampicillin, and incubated for 6 h at 37 ° C. and 225 rpm in 10 ml tubes. In the afternoon, 50 ml of modified M9 medium was inoculated in a 250 ml shake flask with cell culture pre-culture cell suspensions at an optical density of 600 nm (OD600) of 0.1. The incubation of the shake flasks was carried out overnight for 16-18 h at 37 0 C and 225 rpm. The next morning, the cell broth was transferred to 50 ml Falcon tubes and spun down at 4000 rpm for 10 min and room temperature. The cell pellet was resuspended in 50 ml of fresh modified M9 medium supplemented with 4 mM 4-hydroxycinnamic acid and 0, 10, 25, 50 and 100 g / l PEG 3350 (Sigma Aldrich), respectively, into a 250 ml shake flask convicted with harassment. This was incubated for 6 h to determine the product formation rates at 37 ° C. and 250 rpm. FIG. 2 shows that the cultures of the recombinant E. coli strain BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4CII have significantly increased resveratrol titer compared to the control without PEG after 6 h cultivation, even in the presence of 10 g / l PEG3350 caused by an increased space-time yield.
Beispiel 5: Kultivierung der rekombinanten E. coli-Stämme zur Herstellung von Resveratrol in Anwesenheit von PEG unterschiedlicher MolekulargewichteExample 5 Cultivation of the Recombinant E. coli Strains for the Production of Resveratrol in the Presence of PEGs of Different Molecular Weights
2,5 ml modifiziertes M9-Medium (M9 mit 10 g/l Hefeextrakt, 1 % Glycerin als Kohlenstoffquelle, 200 mM MOPS als Puffer; Basismedium M9 : 6,8 g/l Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, 3 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l Ammoniumchlorid, 15 mg/1 Calciumchlorid Dihydrat, 250 mg/1 Magnesiumsulfat Heptahydrat, 1 % MEM Vitamin Solution (Sigma-Aldrich) , pH 7,0), welches 100 μg/ml Ampicllin enthielt, wurde am Morgen mit E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll von frisch ausgestrichenen und über Nacht bei 37 0C inkubierten LB-Agar Platten (LB-Agar nach MILLER, 37 g/l) mit 100 μg/ml Ampicillin angeimpft, und für 6h bei 37 0C und 225 upm in 10-ml-Röhrchen inkubiert. Am Nachmittag wurden 50 ml modifiziertes M9-Medium in einem2.5 ml modified M9 medium (M9 with 10 g / l yeast extract, 1% glycerol as carbon source, 200 mM MOPS as buffer, base medium M9: 6.8 g / l disodium hydrogen phosphate dihydrate, 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / l sodium chloride, 1 g / l ammonium chloride, 15 mg / l calcium chloride dihydrate, 250 mg / 1 magnesium sulfate heptahydrate, 1% MEM Vitamin Solution (Sigma-Aldrich), pH 7.0) containing 100 ug / ml Ampicllin was in the morning with E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll of freshly streaked and grown overnight at 37 0 C incubated LB agar plates (LB agar after MILLER, 37 g / l with 100 μg / ml ampicillin, and incubated for 6 h at 37 0 C and 225 rpm in 10 ml tubes. In the afternoon, 50 ml of modified M9 medium in one
250-ml-Schüttelkolben mit Schikanen mit Zellsuspension aus der Vorkultur mit einer optischen Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,1 angeimpft. Die Inkubation der Schüttelkolben erfolgte über Nacht für 16 - 18 h bei 37 0C und 225 upm. Am nächsten Morgen wurde die Zellbrühe in 50-ml-Falconröhrchen überführt und diese bei 4000 upm für 10 min und Raumtemperatur abzentrifugiert . Das Zellpellet wurde in 50 ml frischem modifiziertem M9-Medium resuspendiert, supplementiert mit 4 mM 4-Hydroxyzimtsäure sowie 50 g/l PEG 1000 (Fluka), PEG 3350 (Sigma Aldrich) , PEG 6000 (Fluka) bzw. PEG 20000 (Fluka), und jeweils in einen 250-ml- Schüttelkolben mit Schikanen überführt. Dieser wurde zur Bestimmung der Produktbildungsraten bei 37 0C und 250 upm für 6 h inkubiert. Abbildung 3 zeigt, dass die Kulturen des rekombinanten E. coli-Stammes BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4Cll bei Anwesenheit von PEG im Vergleich zur Kontrolle ohne PEG nach 6 h Kultivierung signifikant gesteigerte Resveratroltiter aufweisen. Das Molekulargewicht von PEG (MW 1000 - 20000) ist dabei nahezu unerheblich für den beobachteten positiven Effekt auf die Resveratrolbildung. Beispiel 6 Kultivierung der rekombinanten E. coli-Stämme zur Herstellung von Resveratrol in An- und Abwesenheit von PEG, Triton-X 100 bzw. TWEEN 20Inoculated 250 ml shake flasks with cell culture pre-culture cell suspension with an OD of 600 (OD600) of 0.1. The incubation of the shake flasks was carried out overnight for 16-18 h at 37 0 C and 225 rpm. The next morning, the cell broth was transferred to 50 ml Falcon tubes and spun down at 4000 rpm for 10 min and room temperature. The cell pellet was resuspended in 50 ml of fresh modified M9 medium supplemented with 4 mM 4-hydroxycinnamic acid and 50 g / l PEG 1000 (Fluka), PEG 3350 (Sigma Aldrich), PEG 6000 (Fluka) and PEG 20000 (Fluka), respectively. , and each transferred to a 250 ml shake flask with baffles. This was incubated for 6 h to determine the product formation rates at 37 ° C. and 250 rpm. FIG. 3 shows that the cultures of the recombinant E. coli strain BW27784 + pUC-GAP-VvSTS-At4CII have significantly increased resveratrol titer in the presence of PEG in comparison with the control without PEG after 6 h of culture. The molecular weight of PEG (MW 1000-20000) is almost negligible for the observed positive effect on resveratrol formation. Example 6 Cultivation of the recombinant E. coli strains for the production of resveratrol in the presence and absence of PEG, Triton-X 100 and TWEEN 20, respectively
1 ml modifiziertes M9-Medium (M9 mit 10 g/l Hefeextrakt,1 ml of modified M9 medium (M9 with 10 g / l yeast extract,
1 % Glycerin als Kohlenstoffquelle, 200 mM MOPS als Puffer; Basismedium M9 : 6,8 g/l Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, 3 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 1 g/l Ammoniumchlorid, 15 mg/1 Calciumchlorid Dihydrat, 250 mg/1 Magnesiumsulfat Heptahydrat, pH 7,0), welches1% glycerol as carbon source, 200 mM MOPS as buffer; Base medium M9: 6.8 g / l disodium hydrogen phosphate dihydrate, 3 g / l potassium dihydrogen phosphate, 0.5 g / l sodium chloride, 1 g / l ammonium chloride, 15 mg / l calcium chloride dihydrate, 250 mg / 1 magnesium sulfate heptahydrate, pH 7.0 ) which
100 μg/ml Ampicllin enthielt, wurde am Morgen mit E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll von frisch ausgestrichenen und über Nacht bei 370C inkubierten LB-Agar Platten (LB-Agar nach MILLER, 37 g/l) mit 100 μg/ml Ampicillin angeimpft, und für 6h bei 37°C und 250 UpM in 10-ml-Röhrchen inkubiert. Am Nachmittag wurden 50 ml modifiziertes M9- Medium in einem 250-ml-Schüttelkolben mit Schikanen mit der gesamten Zellsuspension aus der Vorkultur angeimpft. Die Inkubation der Schüttelkolben erfolgte über Nacht für 16-18 h bei 37 0C und 250 UpM. Am nächsten Morgen wurde die100 μg / ml ampicillin was in the morning with E. coli BW27784 pUC-GAP-VvSTS-At4Cll freshly streaked and incubated overnight at 37 0 C incubated LB agar plates (LB agar according to MILLER, 37 g / l) with 100 μg / ml ampicillin, and incubated for 6 h at 37 ° C and 250 rpm in 10 ml tubes. In the afternoon, 50 ml of modified M9 medium was inoculated in a 250 ml shake flask with baffles containing the whole cell suspension from the preculture. The shake flasks were incubated overnight at 37 ° C. and 250 rpm for 16-18 h. The next morning the
Zellbrühe in 50-ml-Falconröhrchen überführt und diese bei 4000 UpM für 10 min und Raumtemperatur abzentrifugiert . Das Zellpellet wurde in 50 ml frischem modifiziertem M9-Medium resuspendiert, supplementiert mit 4 mM 4-Hydroxyzimtsäure sowie 100 g/l PEG 3350 (Sigma Aldrich) bzw. 10 g/l Triton-X 100 (Fluka) bzw. lOg/1 TWEEN 20 (Roth), und jeweils in einen 250-ml-Schüttelkolben mit Schikanen überführt. Dieser wurde zur Bestimmung der Produktbildungsraten bei 37 0C und 250 UpM für 6 h inkubiert. Das Wachstum der E. coli-Zellen wurde durch regelmäßige Messung der OD6oo verfolgt. DieTransferred cell broth in 50 ml Falcon tube and centrifuged at 4000 rpm for 10 min and room temperature. The cell pellet was resuspended in 50 ml of fresh modified M9 medium supplemented with 4 mM 4-hydroxycinnamic acid and 100 g / l PEG 3350 (Sigma Aldrich) and 10 g / l Triton-X 100 (Fluka) and 10 μg / l TWEEN, respectively 20 (Roth), and each transferred to a 250 ml shake flask with baffles. This was incubated at 37 ° C. and 250 rpm for 6 hours to determine the product formation rates. The growth of E. coli cells was followed by regular measurement of OD 6 oo. The
Ergebnisse der Resveratrolbildung sind in Abb. 4 gezeigt. Beispiel 7; Kosmetische Formulierungen enthaltend nach erfindungsgemäßem Verfahren hergestelltes Resveratrol .Results of resveratrol formation are shown in FIG. Example 7; Cosmetic formulations containing resveratrol prepared by the process according to the invention.
Die folgenden kosmetischen Formulierungen werden nach dem Fachmann bekannter Art und Weise hergestellt.The following cosmetic formulations are prepared by methods known to those skilled in the art.
Fl. O/W-Lotion mit 0,1% ResveratrolFl. O / W lotion with 0.1% resveratrol
Decyl Oleate 5,7 %Decyl Oleate 5.7%
Ethylhexyl Stearate 6,5 %Ethylhexyl stearate 6.5%
Glyceryl Stearate 0,5 %Glyceryl Stearate 0.5%
Stearinsäure 0,7 %Stearic acid 0.7%
Cetearyl Glucoside 1,0 %Cetearyl Glucosides 1.0%
Creatine 0,5 %Creatine 0,5%
Glyzerin 3,0 %Glycerine 3.0%
Kathon CG 0, 015 %Kathon CG 0, 015%
Wasser ad 100 %Water ad 100%
Carbomer 0,2 %Carbomer 0.2%
Ethylhexyl Stearate 0,8 %Ethylhexyl stearate 0.8%
NaOH (10 %) 0,7 %NaOH (10%) 0.7%
Resveratrol 0,1 %Resveratrol 0.1%
F2. O/W-Creme mit 0,1% ResveratrolF2. O / W cream with 0.1% resveratrol
Glyceryl Stearate ? 5 %Glyceryl Stearate? 5%
Stearinsäure 1,0 %Stearic acid 1.0%
Stearylalkohol 1,5 %Stearyl alcohol 1.5%
Decyl Cocoate 8,0 %Decyl Cocoate 8.0%
Ethylhexyl Stearate 7,0 %Ethylhexyl Stearate 7.0%
Caprylic- 5,0 %Caprylic- 5.0%
/Caprictriglyceride/ Caprictriglyceride
Cetearyl Glucoside 1,0 %Cetearyl Glucosides 1.0%
Glyzerin 3,0 %Glycerine 3.0%
Kathon CG 0, 015 %Kathon CG 0, 015%
Wasser ad 100 % Carbomer 0,2 %Water ad 100% Carbomer 0.2%
Ethylhexyl Stearate 0,8 %Ethylhexyl stearate 0.8%
NaOH (10%) 0,75 %NaOH (10%) 0.75%
Polyglutaminsäure; 5,0 %polyglutamic; 5.0%
Hydrolised Sclerotium Gum; Betain; Harnstoff; Kaliumlaktat Resveratrol 0,1 %Hydrolised Sclerotium Gum; betaine; Urea; Potassium lactate resveratrol 0.1%
F3. W/O-Lotion mit 0,1% ResveratrolF3. W / O lotion with 0.1% resveratrol
Cetyl PEG/PPG-10/1 2,0Cetyl PEG / PPG-10/1 2.0
DimethiconeDimethicone
Ceresin 0,5Ceresin 0.5
Hydriertes Rizinusöl 0,5Hydrogenated Castor Oil 0.5
Decyl Oleate 9,0Decyl Oleate 9.0
Caprylic- 10,0Caprylic 10.0
/Caprictriglyceride/ Caprictriglyceride
Diethylhexyl Ccarbonate 5,0Diethylhexyl Ccarbonates 5.0
PPG-3 Myristyl Ether; 3, 0PPG-3 myristyl ether; 3, 0
Salicyloylsalicyloyl
Phytosphingosinephytosphingosine
Wasser ad 100Water ad 100
Natriumchlorid 0,5Sodium chloride 0.5
Kathon CG 0,015Kathon CG 0.015
Resveratrol 0,1 Resveratrol 0.1

Claims

Patentansprüche : Claims:
1. Ein Verfahren zur Herstellung von Stilbenoiden, umfassend die Verfahrensschritte:1. A process for the production of stilbenoids, comprising the process steps:
I) In Kontakt Bringen einer Zelle, welche in der Lage ist, Stilbenoide zu bilden, mit einem Nährmedium beinhaltend mindestens einen Polyether undI) bringing into contact a cell capable of forming stilbenoids with a nutrient medium containing at least one polyether and
II) Kultivieren der Zelle unter Bedingungen, die es der Zelle ermöglichen, Stilbenoide zu bilden.II) culturing the cell under conditions that allow the cell to form stilbenoids.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Zellen Mikroorganismen eingesetzt werden.2. The method according to claim 1, characterized in that microorganisms are used as cells.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass gegenüber ihrem Wildtyp gentechnisch veränderte Zellen eingesetzt werden, die im Vergleich zu ihrem Wildtyp mehr Stilbenoide als ihr Wildtyp zu bilden vermögen.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that compared to their wild type genetically modified cells are used, which are able to form more stilbenoids compared to their wild type than their wild type.
4. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen eingesetzt werden, die in der Lage sind, Stilbenoide, über Malonsäure, Tyrosin, Phenylalanin, Zimtsäure, Coumarsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure oder andere Zimtsäureabkömmlinge als Edukte oder als Zwischenprodukte zu bilden.4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that cells are used which are capable of stilbenoids, malonic acid, tyrosine, phenylalanine, cinnamic acid, coumaric acid, ferulic acid, caffeic acid or other Zimtsäureabkömmlinge as starting materials or as intermediates to build.
5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Polyether Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol eingesetzt wird.5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that as polyether Polyethylene glycol or polypropylene glycol is used.
6. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des eingesetzten Polyethers in einem Bereich von 200 g/mol bis 200000 g/mol liegt.6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that the molecular weight of the polyether used is in a range of 200 g / mol to 200,000 g / mol.
7. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Polyether in7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the polyether in
Konzentrationen von 1 g/l bis 1000 g/l bezogen auf das Gesamtvolumen des Nährmediums eingesetzt wird.Concentrations of 1 g / l to 1000 g / l based on the total volume of the nutrient medium is used.
8. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren zusätzlich den Verfahrensschritt8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the method additionally comprises the method step
III) Isolierung der gebildeten StilbenoideIII) Isolation of the formed stilbenoids
beinhaltet.includes.
9. Stilbenoide, erhalten durch ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8.9. Stilbenoids obtained by a process according to any one of claims 1 to 8.
10. Resveratrol, erhalten durch ein Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8.10. Resveratrol obtained by a process according to any one of claims 1 to 8.
11. Chemische Produkte, insbesondere kosmetische Formulierungen, Nahrungsmittel, Getränke und pharmazeutische Formulierungen, beinhaltend Stilbenoide nach Anspruch 9, vorzugsweise Resveratrol nach Anspruch 10. 11. Chemical products, in particular cosmetic formulations, foods, drinks and pharmaceutical formulations, including stilbenoids according to claim 9, preferably resveratrol according to claim 10.
PCT/EP2009/059214 2008-09-17 2009-07-17 Method for producing stilbenoids WO2010031611A1 (en)

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