WO2010001078A2 - Production d'alcenes par decarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoïques - Google Patents

Production d'alcenes par decarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoïques Download PDF

Info

Publication number
WO2010001078A2
WO2010001078A2 PCT/FR2009/051332 FR2009051332W WO2010001078A2 WO 2010001078 A2 WO2010001078 A2 WO 2010001078A2 FR 2009051332 W FR2009051332 W FR 2009051332W WO 2010001078 A2 WO2010001078 A2 WO 2010001078A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
enzyme
decarboxylase
sequence
hydroxy
microorganism
Prior art date
Application number
PCT/FR2009/051332
Other languages
English (en)
Other versions
WO2010001078A3 (fr
WO2010001078A4 (fr
Inventor
Philippe Marliere
Original Assignee
Philippe Marliere
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Philippe Marliere filed Critical Philippe Marliere
Priority to JP2011515586A priority Critical patent/JP5787756B2/ja
Priority to EP09772760.6A priority patent/EP2304040B1/fr
Priority to ES09772760.6T priority patent/ES2647785T3/es
Priority to DK09772760.6T priority patent/DK2304040T3/da
Priority to BRPI0914215-0A priority patent/BRPI0914215B1/pt
Priority to AU2009265373A priority patent/AU2009265373B2/en
Priority to PL09772760T priority patent/PL2304040T3/pl
Priority to CA2729187A priority patent/CA2729187C/fr
Priority to CN200980125840.8A priority patent/CN102083990B/zh
Priority to US13/002,504 priority patent/US9909146B2/en
Priority to LTEP09772760.6T priority patent/LT2304040T/lt
Priority to RU2011103650/10A priority patent/RU2571933C2/ru
Publication of WO2010001078A2 publication Critical patent/WO2010001078A2/fr
Publication of WO2010001078A3 publication Critical patent/WO2010001078A3/fr
Publication of WO2010001078A4 publication Critical patent/WO2010001078A4/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2/00—Preparation of hydrocarbons from hydrocarbons containing a smaller number of carbon atoms
    • C07C2/02—Preparation of hydrocarbons from hydrocarbons containing a smaller number of carbon atoms by addition between unsaturated hydrocarbons
    • C07C2/04—Preparation of hydrocarbons from hydrocarbons containing a smaller number of carbon atoms by addition between unsaturated hydrocarbons by oligomerisation of well-defined unsaturated hydrocarbons without ring formation
    • C07C2/06—Preparation of hydrocarbons from hydrocarbons containing a smaller number of carbon atoms by addition between unsaturated hydrocarbons by oligomerisation of well-defined unsaturated hydrocarbons without ring formation of alkenes, i.e. acyclic hydrocarbons having only one carbon-to-carbon double bond
    • C07C2/08—Catalytic processes
    • C07C2/26—Catalytic processes with hydrides or organic compounds
    • C07C2/28—Catalytic processes with hydrides or organic compounds with ion-exchange resins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01033—Diphosphomevalonate decarboxylase (4.1.1.33), i.e. mevalonate-pyrophosphate decarboxylase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention describes a process for generating alkenes biologically. It relates more particularly to a process for producing terminal alkenes (especially propylene, ethylene, 1-butylene, iso-butylene or iso-amylene) from molecules of 3-hydroxy-alkanoate type.
  • terminal alkenes especially propylene, ethylene, 1-butylene, iso-butylene or iso-amylene
  • Alkenes such as ethylene, propylene, the various butenes, or even pentenes, for example
  • Ethylene the simplest alkene, occupies a central place in industrial organic chemistry: it is the most produced organic compound in the world. In particular, it makes it possible to generate polyethylene, a leading plastic.
  • reaction oxidation, halogenation
  • ethylene can also be converted into many products useful to the industry.
  • Propylene plays a role of comparable importance: it is derived by polymerization a plastic material, polypropylene.
  • bioplastics are booming. Motivation comes from economic considerations related to the cost of oil, and global environmental considerations (carbon-neutral products) or local environmental considerations (waste management).
  • PHAs polyhydroxyalkanoates
  • PHAs polymers obtained by condensation of molecules comprising both an acid group and an alcohol group. The condensation takes place by esterification of the acid with the alcohol of the following monomer. This ester bond is not as stable as the direct carbon-carbon bond found in conventional plastic polymers, which explains the biodegradability of PHAs within a few weeks to a few months.
  • PHAs poly-3-hydroxy-butyrate (PHB), a polymer of 3-hydroxy-butyrate, or poly-hydroxy-butyrate-valerate (PHBV), a polymer alternating 3- hydroxybutyrate and 3-hydroxy valerate.
  • PHB is naturally produced by particular bacterial strains, such as Alcaligenes eutrophus or Bacillus megaterium.
  • Laboratory bacteria such as Escherichia coli, having integrated synthetic routes leading to PHB or PHA in general, have been constructed.
  • the compound or its polymer may represent, under certain laboratory conditions, up to 80% of the mass of the bacterium. (Wong MS et al, Biotech, Bioeng 2008). Attempts at industrial production of PHB were made in the 1980s, but the cost of manufacturing by fermentation was considered too high. Projects for the direct production of these compounds in genetically modified plants (having integrated the key enzymes of the pathway of PHB synthesis of the producing bacteria) are in progress. They could be associated with better operating costs.
  • the biological generation of alkanes or other organic molecules that can be used as fuels or as precursors of synthetic resins is needed in the context of sustainable industrial exploitation in harmony with geochemical cycles.
  • the first generation of biofuels has been the fermentative production of ethanol, with fermentation and distillation processes already in place in the agri-food industry.
  • the production of second-generation biofuels is in an exploratory phase, covering in particular the production of long-chain alcohols (butanol and pentanol), terpenes, linear alkanes and fatty acids.
  • Two recent reviews provide a general picture of research in this area: Ladygina N et al., Process
  • isoprene (2-methyl-1,3-butadiene) is the terpene unit which leads by polymerization to rubber.
  • Other terpenes could be developed, chemically, biologically or mixed, into products that can be used as biofuels or to make plastics.
  • mevalonate pathway (a key intermediate in steroid biosynthesis in many organisms) could be used to produce effectively products of the terpenes family with industrial yields (Withers ST et al., Appl Environ Microbiol 2007 73: 6277).
  • the present invention describes a process for performing the synthesis of alkene compounds biologically.
  • the invention results from the design of a novel synthesis route for terminal alkenes based on the conversion of 3-hydroxyalkanoates.
  • the invention is also based on the demonstration that this conversion can be carried out biologically, using a decarboxylase enzyme or variants thereof.
  • the invention can be implemented in vitro, in cell-free systems, or by using microorganisms.
  • the invention also relates to the production of alkenes from a carbon source, and in particular a carbohydrate (in particular glucose), a polyol (in particular glycerol), a biodegradable polymer (in particular starch, cellulose, poly-3-hydroxyalkanoate); the carbon source being converted by a microorganism into a metabolic intermediate of the 3-hydroxyalkanoate family, which will then be converted to the terminal alkene.
  • a carbon source and in particular a carbohydrate (in particular glucose), a polyol (in particular glycerol), a biodegradable polymer (in particular starch, cellulose, poly-3-hydroxyalkanoate); the carbon source being converted by a microorganism into a metabolic intermediate of the 3-hydroxyalkanoate family, which will then be converted to the terminal alkene.
  • an object of the invention resides in a process for the production of a terminal alkene, characterized in that it comprises a step of conversion of a 3-hydroxy-alkanoate in the presence of an enzyme exhibiting a decarboxylase activity.
  • Another object of the invention is the use of 3-hydroxyalkanoate compounds, as a precursor compound or substrate, for the production of terminal alkenes.
  • 3-hydroxypropionate is converted to ethylene; or 3-hydroxy-butyrate is converted to propylene; or - the 3-hydroxy valerate is converted to 1-butylene; or 3-hydroxy-3-methyl-butyrate (or 3-hydroxyisovalerate) is converted to iso-butylene; or 3-hydroxy-3-methyl valerate is converted to iso-amylene.
  • the invention further relates to the use of a decarboxylase enzyme, or a decarboxylase producing microorganism, for the production of terminal alkenes from 3-hydroxyalkanoates.
  • the invention also relates to a composition
  • a composition comprising a microorganism producing a decarboxylase, a suitable culture medium and a 3-hydroxyalkanoate compound, or a carbon source convertible by the microorganism into a 3-hydroxyalkanoate compound.
  • Another subject of the invention relates to a biocatalyst comprising a decarboxylase enzyme, or a microorganism producing a decarboxylase decarboxylating end-alkene a 3-hydroxy-alkanoate compound.
  • Another subject of the invention relates to a terminal alkene compound obtained by a process as described in the invention.
  • Another subject of the invention is an isolated or purified enzyme having a decarboxylase activity and comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 6 or an enzyme having a sequence homology of at least 15% with this.
  • Another subject of the invention relates to the use of an enzyme having a decarboxylase activity and comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 6, or an enzyme having a sequence homology of at least 15% with this, to produce a terminal alkene.
  • Another subject of the invention relates to a process for producing an enzyme having a decarboxylase activity and comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 6 or an enzyme having a sequence homology of at least 15% with the latter, the process comprising culturing a microorganism comprising a recombinant nucleic acid encoding said sequence under conditions permitting the expression of this sequence.
  • Another subject of the invention relates to a mbroorganism comprising a nucleic acid recombinant enzyme encoding enzyme having a decarboxylase activity and comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 6 or an enzyme having a sequence homology of at least 15% therewith.
  • 3-hydroxy-alkanoate any molecule comprising, as a common unit, 3-hydroxy-propionate (FIG. 1), and optionally one or two alkyl substitutions on carbon 3.
  • residues or alkyl radicals may be linear or connected.
  • alkyl and alkyl have the same meaning and are interchangeable.
  • the terms “residue” and “radical” have the same meaning and are interchangeable.
  • Methyl, ethyl, propyl, iso-propyl, butyl, isobutyl residues are examples of these alkyl residues.
  • Carbon 3 becomes a chiral center if the two alkyl substitutions are different.
  • the present definition encompasses both chiral forms, although one of the two forms, for example the R form, is the main naturally occurring form.
  • Examples of 3-hydroxyalkanoates are shown in Figure 3.
  • alkyl substitutions may be added to the carbon 2, which is then likely to become chiral (if the two substituents are different).
  • the configurations of the 3-hydroxyalkanoate substrates in the present invention encompass all stereoisomers.
  • the 3-hydroxy-alkanoates correspond to either 3-hydroxy-propionate or to 3-hydroxy-propionate variants or derivatives in which one or both of the hydrogen atoms carried by the carbon 3 are substituted by a unit composed only of carbon and hydrogen atoms, the carbon number of these substituents varying from 1 to 5, preferably from 1 to 3, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl or isobutyl.
  • the suffix "oate” can mean indifferently either the carboxylate ion (COO-) or the carboxylic acid (COOH). It is not used to designate an ester.
  • the 3-hydroxyalkanoates have the following formula: HO-CO-CH 2 -C (R 1 ) (R 2 ) -OH or O " -CO-CH 2 -C (R 1 ) (R 2 ) - OH.
  • terminal alkenes is intended to mean only molecules composed of carbon and hydrogen (unsaturated hydrocarbons of formula CnH2n) comprising ethylene and organic molecules derived from ethylene by mono- or bi- substitution of the two carbon-bonded hydrogen atoms with linear or branched alkyl radicals.
  • terminal alkenes include branched iso-alkenes, such as iso-butylene.
  • Preferred examples of terminal alkenes according to the invention is especially ethylene, propylene, iso-butylene, and iso-amylene ( Figure 4), or 1-butylene and 1-amylene.
  • Carbon source here means any carbon compound that can be used as a substrate for the organisms according to the invention. This term includes glucose or any other hexose, xylose or any other pentose, polyols such as glycerol, sorbitol or mannitol, or polymers such as starch, cellulose or hemicellulose, or poly -3-hydroxy-alkanoates such as poly-
  • 3-hydroxy-butyrate It can be any substrate for the growth of microorganisms, such as formate for example. It can also be CO 2 in the case where the body is likely to perform photosynthesis.
  • recombinant is meant here the artificial genetic modification of an organism, either by addition, subtraction, or modification of a chromosomal or extra-chromosomal gene or a regulatory unit such as a promoter, or by fusion of organisms, or by addition of a vector of any kind, for example plasmidic.
  • Recombinant expression refers to the production of a protein involving genetic modification, preferably to produce a protein of foreign origin or heterologous with respect to its host, that is to say which does not occur naturally in the production host, or to produce a modified or mutated endogenous protein.
  • overexpression or “overexpressing” is meant here the recombinant expression of a protein, preferably derived from an organism different from that in which it is expressed, increased by at least 10% and preferably by 20% , 50%, 100%, 500% or possibly more than the natural expression of said protein. Also within the scope of this definition is the case where there is no natural expression of said protein.
  • a "co-substrate” is a product added to the enzymatic reaction, so as to improve certain parameters and in the first place its activity, said product and the main substrate being consumed in equal amounts.
  • the co-substrate must therefore be added to the reaction in a concentration comparable to that of the main substrate.
  • the presence of a co-substrate may be necessary for the enzymatic reaction.
  • a “co-factor” is a product added to the enzymatic reaction, so as to improve certain parameters and in the first place its activity, said product not being consumed during the reaction, and thus requiring to be added in low concentration, proportional to the amount of enzyme, this concentration is therefore called “catalytic”.
  • a “portion” of an amino acid sequence refers to a fragment comprising at least 10, preferably at least 20, 30, 40 or 50 consecutive amino acid residues of said sequence.
  • homoology is meant the existence of a similarity between two sequences as measured by the percentage identity between said two sequences.
  • Chemical compounds are often known by many names, official or customary. Here, the usual names of the molecules have been preferred. So :
  • butylene is used to refer to butene -
  • isobutylene is used to refer to 2-methyl-propene or isobutene
  • Isoamylene is used to designate 2-methyl-but-1-ene or isopentene
  • Propionate is used to designate propanoic acid or propionate ion
  • butyrate is used to designate butanoic acid or butanoate ion
  • valerate is used to designate pentanoic acid or pentanoate ion
  • the invention notably describes a process for the production of terminal alkenes comprising a step of enzymatic decarboxylation of 3-hydroxyalkanoate compounds.
  • the invention also results from the use of decarboxylases to catalyze this reaction, and in particular from mevalonate diphosphate decarboxylase enzymes, and substrates such as 3-hydroxy-butyrate, 3-hydroxyvalerate, 3- hydroxy-3-methyl-butyrate (or 3-hydroxy-isovalerate) and 3-hydroxy-propionate.
  • the invention describes the use of co-factors, including ethyl diphosphate, propyl diphosphate, methyl diphosphate, analogs of these molecules, and pyrophosphate.
  • co-substrates such as ATP or other compounds having a phosphoanidide linkage.
  • the invention also relates to the use of carbon sources, such as glucose, to directly produce terminal alkenes from whole cells, the synthetic route passing through 3-hydroxyalkanoates.
  • the invention also relates to organisms, natural or modified, endogenously producing a 3-hydroxyalkanoate, and further expressing a decarboxylase converting said 3-hydroxyalkanoates to terminal alkenes.
  • the product alkenes including propylene, ethylene and iso-butylene, are key molecules in the plastics and fuels industry, and their biological industrial manufacture from renewable resources is an innovation. major.
  • the invention thus derives from the design of a new synthesis route for compounds of the type terminal alkene based on the conversion of 3-hydroxy-alkanoate compounds.
  • the invention demonstrates that this conversion can be carried out biologically, using a decarboxylase-type enzyme, which makes it possible to convert a 3-hydroxyalkanoate to a terminal alkene. As illustrated in FIG. 2, this conversion is carried out via a reaction intermediate of 3-phospho-hydroxyalkanoate structure.
  • the conversion step according to the invention can be carried out in vitro, in the presence of an isolated enzyme (or of an enzymatic system further comprising one or more co-factors) or in culture, in the presence of a microorganism. organism producing the enzyme.
  • MDP-decarboxylases could use 3-hydroxy-alkanoate-like molecules as substrates in general, and in particular 3-hydroxy-isovalerate, which differs from non-mevalonate diphosphate. only by size (MW of 118 against 308 for mevalonate diphosphate) but also by the electrical charges of the diphosphate group present on the natural substrate, mevalonate diphosphate.
  • a co-factor is added to the reaction so as to perform steric or electronic complementation in the catalytic throat.
  • the co-factor is advantageously chosen from pyrophosphate ion, methyl diphosphate, ethyl diphosphate or propyl diphosphate.
  • the cofactor is a compound containing the phosphoanhydride unit, of general formula RO-PO 2 HO-PO 3 H 2 in which R is in particular a hydrogen atom, an alkyl residue, linear, branched or cyclic, of preferably 1 to 10 or 1 to 5 carbon atoms, or any other monovalent organic radical.
  • analogous units corresponding to the mono-esters of methylene diphosphonate, of general formula RO-PO 2 H-CH 2 -PO 3 H 2 , in which the phosphoanhydride is replaced by a methylene bridge having the advantage of not hydrolyzing, are also part of the invention.
  • the conversion is in the presence of a co-substrate, said co-substrate being preferably a compound containing a phosphoanhydride, and preferably being ATP, an rNTP, a dNTP or a mixture of several of these molecules, a polyphosphate, or pyrophosphate.
  • the co-substrate is generally present in the host.
  • a co-substrate may be added to the reaction, preferably selected from ATP, rNTP, dNTP, a mixture of several rNTPs or dNTPs, a polyphosphate, and preferably pyrophosphate, or a phosphoanhydride-containing compound (corresponding to the general formula X-PO 3 H 2 of Figure 2).
  • a microorganism producing the decarboxylase is used.
  • the microorganism is recombinant in that it produces a heterologous decarboxylase relative to the production host.
  • the process can thus be carried out directly in the culture medium, without the need to separate or purify the enzyme system.
  • a microorganism having the natural or artificial property of producing endogenously one or more 3-hydroxyalkanoates and expressing or overexpressing a natural or modified decarboxylase in order to produce terminal alkenes is used. directly from a carbon source present in solution.
  • the microorganisms used in the invention may be prokaryotes or eukaryotes, and especially bacteria, yeasts, plant cells, fungi and molds, animal cells.
  • the microorganisms are bacteria, in particular of strain Alcaligenes eutrophus or Bacillus megaterium.
  • the microorganisms are recombinant Escherichia coli bacteria having been modified so as to endogenously produce one or more 3-hydroxyalkanoates, and converting them to terminal alkenes.
  • the mbro-organisms are recombinant yeasts, producing 3-hydroxy-alkanoates, and converting them to terminal alkenes.
  • a microorganism producing one or more 3-hydroxyalkanoates is used, on the one hand, and a decarboxylase, optionally expressed by a second microorganism, on the other hand.
  • the two organisms are cultivated and used concomitantly in the process according to the invention.
  • whole plants or animals are used to produce terminal alkenes from 3-hydroxyalkanoates, whether these are endogenously produced or exogenously provided.
  • a photosynthetic microorganism having the natural or artificial property of producing one or more 3-hydroxy-alkanoates endogenously, and overexpressing otherwise natural or modified decarboxylase, to produce terminal alkenes directly from CO 2 present in solution.
  • the microorganism is a photosynthetic bacterium, or a micro-algae.
  • the method of the invention can be carried out by micro-aerophilia.
  • the process is carried out in the presence of a gaseous collection system of the terminal alkenes degassing from the reaction.
  • decarboxylase any enzyme capable of converting a 3-hydroxyalkanoate with a number n of carbon atoms to a terminal alkene compound with an n-1 number of carbon atoms.
  • the process of the invention is preferably carried out via a 3-phospho-hydroxyalkanoate reaction intermediate, and the enzyme used advantageously has a decarboxylase activity and a phosphorylase activity.
  • the decarboxylase is a representative of the phylogenetic superfamily of mevalonate diphosphate (MDP) decarboxylase (enzymatic nomenclature EC 4.1.1.33), that is to say a natural or artificial enzyme, specified by a native or synthetic gene, possibly capable of catalyzing the reaction shown in FIG.
  • MDP mevalonate diphosphate
  • MDP Decarboxylase is an enzyme involved in the biosynthesis of cholesterol. This enzyme has been isolated from various organisms such as animals, fungi, yeasts, and certain bacteria. It could also be expressed by some plants (Lalitha et al, 1985). Many genes specifying this enzyme have been cloned and sequenced. These enzymes are generally composed of 300 to 400 amino acids, and involve ATP as a co-substrate, which is converted during the reaction to ADP and inorganic phosphate. The phosphate group is transferred from the ATP molecule to the tertiary alcohol of the mevalonate diphosphate, releasing ADP. The reaction intermediate phosphorylated on the 3-hydroxyl group then undergoes removal of the phosphate group, releasing in the physiological case isopentenyl-pyrophosphate ( Figure 2).
  • MDP decarboxylases from different organisms are given in the sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 16.
  • the enzyme used is a decarboxylase, preferably comprising an amino acid sequence selected from SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5,
  • Preferred enzymes advantageously comprise at least 50% sequence homology, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferentially, at least 90, 95, 96, 97, 98 or 99% homologous homology. sequence with one of the primary sequences SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6,
  • the degree of sequence homology can be determined by different methods and by means of software known to those skilled in the art, for example according to the CLUSTAL method or the BLAST or derivative software, or using a sequence comparison algorithm such as that of Needleman and Wunsch (J. Mol .. BbI, 1970 48: 443) or Smith and Waterman (J. Mol Biol. 1981 147: 195).
  • a preferred decarboxylase of the invention is represented by the enzyme of sequence SEQ ID NO: 6, as well as any enzyme having significant sequence homology therewith.
  • Preferred enzymes advantageously comprise at least 50% sequence homology, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, even more preferentially, at least 90, 95, 96, 97, 98 or 99% homologous homology. sequence with the primary sequence SEQ ID NO: 6.
  • This enzyme was cloned from Picrophilus toridus and produced recombinantly in the context of the present invention. As illustrated in the examples, this enzyme is particularly effective for producing terminal alkenes according to the present invention.
  • This enzyme also represents an object of the present invention, as well as its preparation and its use as a catalyst.
  • an object of the invention lies in the use of a decarboxylase enzyme comprising all or part of SEQ ID NO: 6 or an enzyme having a significant sequence homology and preferably at least 15% with SEQ ID NO: 6, for the production of terminal alkenes.
  • significant sequence homology is meant a detectable sequence homology using the aforementioned algorithms, and preferably sequence homology greater than 15%.
  • the phylogenetically closest organisms of Picrophilus torridus such as Ferroplasma acidarmanus, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanoium and Picrophilus oshimae are likely to produce the closest MDP decarboxylases to that of SEQ ID NO 6.
  • the sequence homology vis-à-vis of the SEQ ID No. 6 of the MDP Decarboxylase Thermoplasma acidophilum (AC number Q9HIN1) is thus 38%; that of Thermoplasma volumium (Q97BY2) is homologous to SEQ ID No. 6 at about 42%.
  • the use of these MDP decarboxylases is particularly contemplated in the present invention.
  • a selection test comprises contacting the purified enzyme, or an enzyme producing microorganism, with the reaction substrate and measuring the production of the terminal alkene compound. Examples of such tests are provided in the experimental part, which exposes tests on more than 60 different enzymes.
  • the enzyme used can be any natural decarboxylase or artificially produced or optimized.
  • a decarboxylase having an optimized activity with respect to one or more 3-hydroxyalkanoates is advantageously used.
  • the enzyme can be produced or selected from a reference decarboxylase (natural or itself already synthetic or optimized) by protein engineering techniques such as random mutagenesis, massive mutagenesis, site-directed mutagenesis , DNA-shuffling, synthetic shuffling, in vivo evolution, or complete gene synthesis.
  • an object of the invention also relates to a process for preparing an enzyme having a decarboxylase activity with respect to a 3-hydroxyalkanoate substrate, the method comprising a step of treating a source of enzyme and the selection of an enzyme having increased properties with respect to said substrate, as compared to the untreated enzyme.
  • the enzyme used in the invention can thus be natural or synthetic, and produced chemically, biologically, or genetically. It can also be modified chemically, for example to improve its activity, its resistance, its specificity, its purification, or to immobilize it on a support.
  • the invention is characterized by the use of a decarboxylase, in particular a natural or modified MDP decarboxylase, for converting 3-hydroxyalkanoates to terminal alkenes.
  • the natural substrate for MDP decarboxylase is mevalonate diphosphate, which does not fall within the definition of 3-hydroxyalkanoates.
  • the presence of the terminal alkene is optionally measured using any detection system known to those skilled in the art, such as gas chromatography or colorimetric tests for measuring the appearance of the product. alkene, free phosphate, or to measure the disappearance of the substrate 3-hydroxy-alkanoate or ATP.
  • co-factors are added so as to best mimic the natural reaction.
  • the 3-hydroxy-alkanoates have a structure generally corresponding to a fragment of the MDP, and a large space of the catalytic throat is left empty during the enzyme / substrate combination. The filling of this space by a co-factor replacing the missing part in the substrate is based on mimicking the CDM molecule as closely as possible. Since it is not modified by the reaction, the co-factor must therefore be added to the reaction only in catalytic quantities.
  • the reaction substrate is 3-hydroxy-propionate
  • the complementary cofactor will be propyl diphosphate.
  • the complementary co-factor will be ethyl-diphosphate.
  • the complementary cofactor will be methyl diphosphate.
  • the cofactor complementary to a reaction has a positive effect on the reaction of another substrate.
  • the co-factor can be any molecule comprising a phosphoanhydride, and thus having the general formula R-PO 2 HO-PO 3 H 2 , in which R is in particular H, an alkyl, linear, branched or cyclic residue. , or any other monovalent organic radical.
  • analogous units corresponding to the mono-esters of methylene diphosphonate, of general formula RO-PO 2 H-CH 2 -PO 3 H 2 , in which the phosphoanhydride is replaced by a methylene bridge having the advantage of not hydrolyzing, are also part of the invention.
  • the co-factors may be the monophosphate or even phosphate-free analogs of the preceding molecules, or any other molecule capable of improving the yield of the reaction by performing steric or electronic complementation in the catalytic site of the enzyme. .
  • a co-substrate is added to the reaction.
  • Said cosubstrate may be either ATP, that is to say the natural co-substrate of the MDP decarboxylase, or any rNTP (ribonucleoside triphosphate) or dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate) or any mixture rNTP or dNTP, or pyrophosphate, or another polyphosphate, or any molecule containing a phosphoanhydride group (X-PO 3 H 2 of Figure 2).
  • an enzyme having a sequence homology of at least 15%, and preferably at least 30%, 50%, and more, is used to convert a 3-hydroxyalkanoate to a terminal alkene. preferably at least 80, 90, 95, 96, 97, 98 or 99% with a natural enzyme having a decarboxylase activity and in particular with one of the enzymes corresponding to SEQ sequences. ID: 1-16.
  • the enzyme may have been engineered from one of the SEQ enzymes. ID: 1 to 16, or any other decarboxylase identified from other origins.
  • Such an enzyme may have lost its MDP decarboxylase activity, in particular by engineering the gene in the laboratory, but also during the natural evolution (we can then speak of a remnant of MDP decarboxylase) and preserved or increased its activity on one or more molecules of the type 3-hydroxy-alkanoate.
  • the generation of variants of these enzymes, more reactive towards said substrates, makes it possible to improve the yield of the reaction according to the invention.
  • the reactivity of wild type MDP decarboxylase to 3-hydroxyalkanoates is not necessarily optimal. Any approaches known to those skilled in the art for making and selecting such variants, such as random mutagenesis, site-directed mutagenesis, massive mutagenesis, DNA-shuffling, or in vivo evolution may be used.
  • the invention is also characterized by the use of a totally artificial enzyme, obtained by designing and producing a synthetic gene specifying a novel enzyme for the purpose of converting a 3-hydroxyalkanoate to a terminal alkene, using or not the known data of MDP decarboxylases to design it.
  • Another subject of the invention resides in an isolated or purified enzyme having a decarboxylase activity and comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 6.
  • Another subject of the invention relates to the use of an enzyme having a decarboxylase activity and comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 6, or of an enzyme having sequence homology as described above, to produce a terminal alkene.
  • the sequence may further include additional residues, such as an N-terminal Histidine tag.
  • Another subject of the invention relates to a process for producing an enzyme having a decarboxylase activity and comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 6, or an enzyme having sequence homology as described above.
  • the method comprising culturing a microorganism comprising a recombinant nucleic acid encoding said sequence under conditions permitting expression of that sequence.
  • the present invention describes, in addition to the native nucleic acid (SEQ ID NO: 19), a nucleic acid having a sequence optimized for the expression of the enzyme SEQ ID NO: 6 in bacteria, especially in E. coli (SEQ ID NO: 17).
  • This nucleic acid, as well as any optimized nucleic acid represents an object of the present application.
  • Another subject of the invention relates to a mbroorganism comprising a recombinant nucleic acid encoding an enzyme having a decarboxylase activity and comprising all or part of the sequence SEQ ID NO: 6, or an enzyme having a sequence homology as described herein. -above.
  • the microorganism is preferably a bacterium, a yeast or a fungus.
  • the invention also relates to any non-human plant or animal comprising a recombinant nucleic acid encoding a decarboxylase according to the invention.
  • the MDP decarboxylase is used in a purified form to convert 3-hydroxyalkanoates to terminal alkenes.
  • the costs associated with this process are high, the costs of production and purification of the enzyme and substrates being important.
  • the MDP decarboxylase is present in the reaction in the form of an unpurified extract, or in the form of non-lysed bacteria, in order to save the costs of purification of the protein.
  • the costs associated with this process are still quite high because of the costs of producing and purifying the substrates.
  • the method uses a living organism producing the enzyme to perform the conversion.
  • the invention is thus also characterized by the genetic modification of a bacterial strain producing one or more 3-hydroxy-alkanoate (for example Alcaligenes eutrophus or Bacillus megaterium, or a strain of E. coli modified in the laboratory so as to produce the one or more products), so that said bacterial strain overexpresses the decarboxylase, said enzyme being preferably derived from an organism different from the host microorganism, and can directly generate one or more terminal alkenes.
  • 3-hydroxy-alkanoate for example Alcaligenes eutrophus or Bacillus megaterium, or a strain of E. coli modified in the laboratory so as to produce the one or more products
  • the genetic modification may consist of a chromosomal integration of a decarboxylase gene, the expression of the enzyme by a plasmid containing a promoter upstream of the coding sequence of the enzyme, the promoter and the coding sequence being preferably from different organisms, or any other means known to those skilled in the art.
  • other bacteria or yeasts may have particular benefits and be retained.
  • a yeast such as Saccharomyces cerevisiae, an extremophilic bacterium such as Thermus thermophilus, or anaerobic bacteria of the family Closthdiae for example, microalgae, photosynthetic bacteria can be used.
  • the strains may also have been genetically engineered, i.e. by in vitro recombination or in vivo directed evolution.
  • the process of the invention is characterized by converting a carbon source such as glucose to 3-hydroxyalkanoate and then converting said primary product to a secondary product, that is, ie in terminal alkene.
  • a carbon source such as glucose
  • a secondary product that is, ie in terminal alkene.
  • the invention is characterized by the conversion of polyhydroxyalkanoates to 3-hydroxy-alkanoate, using a suitable enzyme or physicochemical process, then by the transformation of said primary product into a secondary product, that is to say say in terminal alkene.
  • the polyhydroxyalkanoate has been produced by a plant that has been modified in its metabolic pathways so as to produce high yields of polyhydroxyalkanoate.
  • the invention consists of the integrated process for producing products from atmospheric CO2 or artificially added to the culture medium.
  • the process of the invention is carried out in an organism capable of carrying out photosynthesis, such as microalgae for example.
  • the method of the invention is further characterized by the mode of recovery of the products, which degas of the culture.
  • the short terminal alkenes, and in particular ethylene, propylene, isomers of butene take indeed a gaseous state at ambient temperature and at atmospheric pressure.
  • the method of the invention therefore does not require extraction of the product from the liquid medium of the culture, which step is still a significant cost source at the industrial level.
  • the evacuation and storage of the gaseous hydrocarbons, and their eventual physical separation and subsequent chemical conversion, can be carried out according to any method known to those skilled in the art.
  • the invention also comprises the detection of the alkene (propylene, ethylene and iso-butylene in particular) present in the gaseous phase of the process.
  • alkene propylene, ethylene and iso-butylene in particular
  • the presence of the targeted compounds in an air or other gas environment, even in small amounts, can be achieved using a variety of technologies, including using gas chromatography and infrared detection, by ionization flame, or by coupling with a mass spectrometer.
  • the resulting terminal alkenes are condensed and then optionally reduced, using techniques known to those skilled in the art, to produce longer chain alkenes, or longer chain alkanes.
  • isobutylene can be used to synthesize isooctane: the catalytic processes for carrying out this reaction are already amply described.
  • the method involves the cultivation of microorganisms under usual culture conditions (30 to 37 ° C under 1 atmosphere, in a fermentor allowing aerobic growth of bacteria) or non-usual (higher temperature for match the growing conditions of a thermophilic organism, for example).
  • the microorganisms are cultured microaerophilic, the amount of air injected being limiting in order to minimize the residual oxygen concentration in the gaseous effluents loaded with alkenic hydrocarbons.
  • Figure 3 Examples of 3-hydroxy-alkanoates.
  • FIG. 5 Co-factors that can be used for the reaction in order to carry out the structural complementation in the catalytic site
  • FIG. 7 Chromatogram carried out on enzymatic reactions carried out under conditions No. 1 of Example 4.
  • Figure 8 SDS-PAGE of the overexpression steps and purification of the enzyme SEQ ID NO 6.
  • Figure 9 Chromatogram of an analysis of the conversion reaction from HIV to IBN by CPG / MS. 1 and 2: Negative controls corresponding to the background noise observed without enzyme 3 and 4: Reactions in the presence of the enzyme SEQ ID NO: 6.
  • Figure 10 Ratio of IBN production in the presence and absence of ATP.
  • Figure 12 Enzymatic activity as a function of temperature. Ratio: amount of IBN formed in the presence of enzyme relative to the background.
  • Figure 13 Production of the NBI as a function of the concentration of the HIV substrate.
  • Figure 14 Optimized reaction measurement and comparison to background noise. Measurement by gas chromatography coupled to a flame ionization detector.
  • FIG. 15 Improvement of the Expression Level by Optimization of the Nucleotide Sequence Encoding SEQ ID NO: 6.
  • Lane M Molecular Weight Markers
  • Lanes 1, 2, 3 native nucleotide sequence (1) Cell lysate, soluble fraction deposited on the purification column
  • Saccharomyces cerevisiae MDP decarboxylase is synthesized from overlapping oligonucleotides and inserted into a pET plasmid (Novagen) for expression in bacteria. Said plasmid is then transformed by electroporation into bacteria of strain BL21 (Invitrogen). The bacteria are plated on a Petri dish containing ampicillin, and incubated at 37 ° C. The next day, a bacterial colony is randomly selected, and used to seed a culture of 50 ml of LB medium containing ampicillin. The culture is incubated for 24 hours with stirring.
  • the culture is centrifuged, the bacteria are lysed by sonication, and a total protein extract is produced. An aliquot of the extract is deposited on an electrophoresis gel, together with a protein extract from bacteria of the same strain, but not transformed, and a molecular weight marker. On the track corresponding to the transformed bacterial strain, a single band at approximately 30 kD, corresponding to the size expected for the protein, is observed, this band not existing on the track corresponding to the non-transformed bacteria.
  • Example 2 Measurement of the activity of the protein extracts for 3-hydroxy-3-methyl-butyrate.
  • Mevalonate diphosphate is synthesized from mevalonolactone and other reagents (Sigma), according to the conventional technique, and is resuspended at a concentration of 10 g / L.
  • Six chromatography flasks are prepared. In all the flasks, 50 ⁇ l of buffer containing 50 mM Bistris / HCl, 1 mM dithiothreitol, 10 mM MgCl 2, 5 mM ATP are introduced.
  • the vials are sealed using a septum cap and a sealing forceps. All flasks are incubated at 37 ° C for 4 hours at 3 days. At the end of this incubation, a sample of the gas present in each flask is taken using a gas syringe, and the concentration of CO 2 in these samples is measured using gas chromatography. We can see that the CO 2 concentration is very significant in vial 5, and a lower CO 2 concentration is also observable in vial 6, reflecting a significant reaction of the enzyme preparation to 3-hydroxy-3-methyl-butyrate.
  • the presence of iso-butylene in the gas sample corresponding to vial 6 is then measured using a gas chromatography system coupled to an infra-red or flame ionization detector.
  • the first contains buffers, ATP, enzymatic extract in the amounts described in the previous example.
  • the second contains the same elements, in addition to 3-hydroxy-3-methyl-butyrate in the amounts described in the previous example.
  • the third bottle contains, in addition to 3-hydroxy-3-methyl-butyrate, 10 ⁇ l of ethyl diphosphate at 10 mg / l.
  • iso-butylene is measured using a gas chromatography apparatus coupled with infra-red or flame ionization detection. It is found that when ethyl diphosphate is present, the amount of iso-butylene produced per unit time is significantly higher.
  • a collection of sixty-three genes encoding enzymes of the family of MDP decarboxylase were obtained and tested for their activity on the HIV substrate.
  • the genes corresponding to the family diphosphate mevalonate (MDP) decarboxylases EC 4.1.1.33 were cloned in the vector pET 25b (Novagen) for the genes of eukaryotic origin and pET 22b (Novagen) for the genes of origin prokaryotic with 6 residues His added N-terminal just after the initiator methionine codon.
  • the competent cells E.coli BL21 (DE3) (Novagen) were transformed with the vectors by thermal shock.
  • the cells were cultured on TB medium containing 0.5 M sorbitol, 5 mM betaine, 100 ⁇ g / ml ampicillin at 30 ° C., with shaking (160 rpm) to an OD (600 nm) of between 0.8. and 1.
  • Isopropyl-BD-thiogalactopyranoside (IPTG) was then added to the final 1 mM concentration and protein expression was continued at 20 ° C overnight ( ⁇ 16H).
  • IPTG Isopropyl-BD-thiogalactopyranoside
  • the cells were collected by centrifugation at 4 ° C., 10,000 rpm, 20 minutes and the pellets frozen at -80 ° C. Lyse cells
  • Clarified bacterial lysates were deposited on the PROTINO-1000 Ni-IDA (Macherey-Nagel) column allowing the absorption of proteins bearing a tag of 6 consecutive histidines (His tag).
  • the columns were washed and the enzymes of interest were eluted with 4 ml of 50 mM Na2HPO4 containing 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 250 mM imidazole pH 8. The eluates were then concentrated in Amicon cells. Ultra-4 10 kDa (Millipore) to a final volume of
  • the amount of enzymes was determined by the Bradford method.
  • the desired enzymatic activity conversion of 3-methyl-3-hydroxy butyrate, or 3-hydroxy isovalerate, or also HIV was tested under two experimental conditions differing by the buffer 0 and the pH of the reaction.
  • Microorganisms Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (strain ATCC 11842 / DSM 20081)
  • Microorganisms Lactobacillus salivarius subsp. salivarius (strain UCC118)
  • Streptococcus gordonii strain Challis / ATCC 35105 / CH1 / DL1 / V288)
  • Streptococcus pyogenes serotype M6 ATCC BAA-946 / MGAS10394
  • the recombinant enzyme was purified as described in Example 4.
  • the activity of the isolated enzyme has been confirmed.
  • the reaction was conducted under the following conditions: 100 mM Tris-HCl pH 7.0 45 10mM MgCl 2 1 mM ATP 20 mM KCI 25 mM HIV final pH was adjusted to 6.0 3 mg / mL enzyme
  • Test conditions 100 m M buffer 5O mM KCI 1 O mM ATP
  • Optimum conditions were obtained at a pH of 5.5, in 100 mM citrate.
  • Enzymatic parameters A substrate range was produced under the conditions described above, with an incubation at 50 ° C. The Km of the enzyme is estimated at 40 mM of HIV.
  • the signal-to-noise ratio is about 100
  • the initial level of expression in E coli BL21 was low, since the band was hardly visible in SDS-PAGE before purification.
  • the Codon Optimization Index (CAI) of the native sequence for E coli expression was measured using the software " Optimizer »available on 5 http // genomes urv es / QPTIMIZER /, and inspired by the method of Sharp and Li (1987) The value obtained was only 0.23, reflecting the limited level of expression of the studied protein in E coli
  • a coding sequence for an identical protein but having codons better adapted to expression in E coli was generated.
  • the CAI of this sequence, 0.77 was closer to the optimum.
  • SEQ ID NO 17 Optimized sequence of P torridus MDP decarboxylase (AAT43941) including His tag
  • SEQ ID NO 19 Native sequence of P torridus MDP decarboxylase (AAT43941) including His tag
  • PET25 expression vector After transformation of the vector into E. coli strain BL21 (DE3) and induction using the previously described protocol, the proteins were produced, purified and analyzed on a gel in a manner similar to that previously described. was conducted with the native sequence for comparison Comparison of candidate expression levels 224 using either the native nucleotide sequence or the optimized sequence for expression in E. coli.
  • the reaction medium used in this test was the following reaction medium
  • Example 7 Process for the synthesis of iso-butylene from 3-hydroxy-3-methyl-butyrate and conversion to iso-octane
  • a reaction identical to that of bottle 3 of Example 3 is carried out in a volume of 1 liter, placed in a fermenter with a gas extraction system.
  • the presence of the recombinant enzyme induces the conversion of 3-hydroxy-3-methyl-butyrate to iso-butylene, which naturally degasses, and is recovered by a gas extraction system located in the upper part of the fermenter.
  • Iso-butylene is then used to generate isooctene by addition catalyzed by Amberlyst 35wet or 36wet resin (Rohm and Haas). Isooctene is finally reduced by catalytic hydrogenation to isooctane.
  • Example 8 Engineering the enzyme to improve its efficiency for substrates. Random mutagenesis technology is used to generate a library containing thousands of mutants from the gene described in Example 1. This mutant bank is then integrated into the expression plasmid, and the library is transformed into competent bacteria. strain BL21. A thousand bacteria are then isolated, which are transplanted into eppendorf tubes containing 500 ⁇ l of LB medium supplemented with amp- billin. These samples are incubated in a shaker for 15 hours. The next day, the amount of isobutylene produced was measured using one or the other of the experimental protocols presented in the previous examples.
  • Clones with a significantly increased amount of iso-butylene are then re-validated using the same experimental protocol. Once validated, the plasmid is extracted from each improved strain and sequenced. The mutations responsible for the improvement of activity are identified and combined on the same plasmid. The plasmid containing the different enhancer mutations is in turn transformed into competent bacteria, and the same analysis system is performed.
  • the clone combining the different mutations, having a significantly greater activity than that containing only one enhancer mutation, is then used as the basis for a new round of mutation / screening, looking for mutants with further enhanced activity.
  • the gene coding for the enzyme described in Example 1 is inserted into a plasmid allowing the expression of recombinant proteins in a strain of E. coli. coli.
  • the plasmid is transformed into bacteria of said strain.
  • the transformant bacteria are then incubated in a fermentor in the presence of propyl diphosphate (10 mg / L) and 3-hydroxypropionate (1 g / L).
  • the presence of the recombinant enzyme induces the conversion of 3-hydroxy-propionate to ethylene, which degasses spontaneously, and is recovered by a gas extraction system located in the upper part of the fermenter.
  • the presence of ethylene in the corresponding gas sample is then measured using a gas chromatography system coupled to an infra-red detector. red, part of the spectrum in which ethylene has a strong emission.
  • Example 10 Process for the synthesis of propylene from 3-hydroxy-butyrate
  • the gene coding for the enzyme described in Example 1 or for an enzyme described in Example 4 is inserted into a plasmid allowing the expression of recombinant proteins in a strain of E. coli. coli.
  • the plasmid is transformed into bacteria of said strain.
  • the transformant bacteria are then incubated in a fermentor in the presence of ethyl diphosphate (10 mg / L) and 3-hydroxy-butyrate (1 g / L) (Sigma, reference 166898).
  • the presence of the recombinant enzyme induces the conversion of 3-hydroxy-butyrate to propylene, which degasses spontaneously, and is recovered by a gas extraction system located in the upper part of the fermenter.
  • the presence of propylene in the corresponding gas sample is then measured using a gas chromatography system coupled to an infra-red detector, part of the spectrum in which the propylene has a high emission.
  • Example 11 Process for the synthesis of propylene from glucose
  • the gene coding for the enzyme described in Example 1 or for an enzyme described in Example 4 is inserted into a plasmid allowing the expression of recombinant proteins in the bacterium Alcaligenes eutrophus.
  • the plasmid is transformed into bacteria of said strain.
  • the bacteria are then incubated in a fermentor in the presence of glucose and ethyl diphosphate and under micro-aerophilic conditions, and then subjected to heat stress which causes them to produce large quantities of 3-hydroxy-butyrate. .
  • the presence of the recombinant enzyme induces the simultaneous conversion of 3-hydroxy-butyrate to propylene. Propylene degasses naturally, and is recovered by a gas extraction system located in the upper part of the fermenter.
  • Example 12 Process for the synthesis of propylene from glucose
  • the present example describes a process very similar to that of Example 11.
  • the main difference consists in the use of a strain of E. coli modified so as to produce 3-hydroxy-butyrate and not a natural strain such that Alcaligenes eutrophus. Said strain was obtained by engineering metabolic pathways so as to result in the accumulation of 3-hydroxy-butyrate.
  • the addition of a decarboxylase MDP as described in Example 1 or Example 4 allows the conversion of 3-hydroxy-butyrate to propylene.
  • Example 13 Process for the synthesis of isobutylene from glucose
  • the gene coding for the enzyme described in Example 1 is inserted into a plasmid allowing the expression of recombinant proteins in a strain of E. coli bacteria which has also undergone metabolic alterations so as to endogenously synthesize 3- hydroxy-3-methyl-butyrate.
  • the bacteria are then incubated in a fermentor in the presence of glucose and under micro-aerophilic conditions.
  • the presence of the recombinant enzyme induces the simultaneous conversion of 3-hydroxy-3-methyl-butyrate to isobutylene, which naturally degasses and is recovered by a gas extraction system located in the upper part of the fermenter.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un procédé de génération d'alcènes par voie biologique. Elle concerne plus particulièrement un procédé de production d'alcènes terminaux par décarboxylation enzymatique de molécules de type 3-hydroxy-alcanoate. L'invention concerne également les systèmes enzymatiques et les souches microbiennes mis en œuvre, ainsi que les produits obtenus.

Description

Production d'alcènes par décarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoïques
Introduction
La présente invention décrit un procédé de génération d'alcènes par voie biologique. Elle concerne plus particulièrement un procédé de production d'alcènes terminaux (notamment de propylène, d'éthylène, de 1 -butylène, d'iso-butylène ou d'iso-amylène) à partir de molécules de type 3-hydroxy- alcanoate.
Arrière Plan de l'invention
De la pétrochimie sont actuellement dérivés un grand nombre de composés chimiques. Les alcènes (tels que l'éthylène, le propylène, les différents butènes, ou encore les pentènes, par exemple) sont utilisés dans l'industrie des plastiques, par exemple pour réaliser du polypropylène ou du polyéthylène, ainsi que dans d'autres domaines de l'industrie chimique et de celle des carburants. L'éthylène, l'alcène le plus simple, tient une place centrale dans la chimie organique industrielle : c'est le composé organique le plus produit au monde. Il permet notamment de générer le polyéthylène, un plastique de premier plan. Par réaction (d'oxydation, d'halogénation), on peut aussi transformer l'éthylène en de nombreux produits utiles à l'industrie. Le propylène tient un rôle d'importance comparable : on en dérive par polymérisation une matière plastique, le polypropylène. Les caractéristiques techniques de ce produit, en termes de résistance, de densité, de solidité, de déformabilité, de transparence n'ont pas d'équivalents. Le marché mondial du polypropylène se développe constamment depuis son invention en 1954. Le butylène existe sous quatre formes dont l'une, l'iso-butylène, entre dans la composition du méthyl- tertio-butyl-ether (MTBE), un additif antidétonant pour les carburants automobiles. L'iso-butylène peut également être utilisé pour générer de l'iso-octène, que l'on peut ensuite réduire en iso-octane (2,2,4- triméthyl-pentane) ; le ratio combustion/explosion très élevé de l'iso-octane en fait le meilleur carburant pour les moteurs dits « à essence ». L'amylène, l'hexène et l'heptène existent sous de nombreuses formes selon l'emplacement et la configuration de la double chaîne. Ces produits connaissent des applications industrielles réelles, mais de moindre importance que l'éthylène, le propylène, ou les butènes.
Tous ces alcènes sont actuellement produits par cracking catalytique des produits pétroliers (ou par un dérivé du procédé Fisher-Tropsch dans le cas de l'hexène, à partir de charbon ou de gaz). Leur coût est donc naturellement indexé sur celui du pétrole. Par ailleurs, le cracking catalytique présente parfois des difficultés techniques importantes, qui se traduisent en complexité du procédé et en coût de production.
Indépendamment des considérations précédentes, la bioproduction des matières plastiques (« bioplastiques ») connaît un essor important. La motivation vient de considérations économiques liées au coût du pétrole, et de considérations environnementales globales (produits neutres en carbone) ou locale (gestion des déchets).
La principale famille de bioplastiques est celle des polyhydroxyalcanoates (PHA). Il s'agit de polymères obtenus par condensation de molécules comprenant à la fois un groupement acide et un groupement alcool. La condensation a lieu par estérification de l'acide sur l'alcool du monomère suivant. Ce lien ester n'est pas aussi stable que le lien direct carbone-carbone que l'on retrouve dans les polymères de plastique classiques, ce qui explique la biodégradabilité, en quelques semaines à quelques mois, des PHA. Dans la famille des PHA, on peut notamment citer le poly-3-hydroxy-butyrate (PHB), un polymère du 3-hydroxy-butyrate, ou le poly-hydroxy-butyrate-valérate (PHBV), un polymère alternant le 3-hydroxy- butyrate et le 3-hydroxy-valérate.
Le PHB est produit naturellement par des souches bactériennes particulières, telles que Alcaligenes eutrophus ou Bacillus megaterium. Des bactéries de laboratoire, telles qu'Escherichia coli, ayant intégré des voies de synthèses menant au PHB ou aux PHA en général, ont été construites. Le composé ou son polymère peut représenter, dans certaines conditions de laboratoire, jusqu'à 80% de la masse de la bactérie. (Wong MS et al, Biotech. Bioeng 2008). Des tentatives de production industrielle du PHB ont été menées dans les années 1980, mais le coût de fabrication par fermentation était considéré alors comme trop élevé. Des projets de production directe de ces composés dans des plantes génétiquement modifiées (ayant intégré les enzymes clé de la voie de synthèse de PHB des bactéries productrices) sont en cours. Ils pourraient être associés à de meilleurs coûts d'exploitation.
La génération par voie biologique d'alcanes ou d'autres molécules organiques utilisables comme carburants ou comme précurseurs de résines synthétiques s'impose dans le contexte d'une exploitation industrielle durable en harmonie avec les cycles géochimiques. La première génération de biocarburants a consisté en la production fermentative d'éthanol, les procédés de fermentation et de distillation étant déjà en place dans l'industrie agroalimentaire. La production de biocarburants de seconde génération est dans une phase exploratoire, couvrant notamment la production d'alcools à chaînes longues (butanol et pentanol), de terpènes, d'alcanes linéaires et d'acides gras. Deux revues récentes dressent un tableau général des recherches dans ce domaine : Ladygina N et al., Process
Biochemistry 2006 41 :1001 , et Wackett LP Current Opinion in Chemical Biology, 2008, 21 :187.
Dans la famille chimique des alcènes, l'isoprène (2-méthyl-1 ,3-butadiène) est le motif terpénique qui conduit par polymérisation au caoutchouc. D'autres terpènes pourraient être développés, par voie chimique, biologique ou mixte, en produits utilisables comme biocarburants ou pour fabriquer des plastiques. Des publications récentes montrent que la voie du mévalonate (un intermédiaire clé dans la biosynthèse des stéroïdes chez de nombreux organismes) pourrait être utilisée de façon à produire efficacement des produits de la famille des terpènes avec des rendements industriels (Withers ST et al., Appl. Environ Microbiol 2007 73 :6277).
La production d'alcènes terminaux (éthylène mono- ou bi-substitué en position 2, H2C=C(R1)(R2) a été apparemment moins explorée : la production d'iso-butylène à partir d'iso-valérate par la levure Rhodotorula minuta, a été détectée (Fujii T. et al, Appl. Environ. Microbiol. 1988 54 :583), mais l'efficacité de cette conversion, inférieure à 1 millionième par minute, soit environ 1 pour 1000 par jour, est loin de permettre une application industrielle. Le mécanisme réactionnel a été élucidé dans Fukuda H et al., BBRC 1994 201 :2 :516 : il fait intervenir une enzyme de la famille des cytochromes P450 qui effectue une réaction de décarboxylation de l'iso-valérate, par réduction d'un groupe oxoferryle Fev=O. A aucun moment la réaction ne fait intervenir l'hydroxylation de l'iso-valérate. L'iso- valérate est par ailleurs un composé intermédiaire du catabolisme de la leucine. La biosynthèse massive d'iso-butylène par cette voie paraît très défavorable, puisqu'il faudrait synthétiser et dégrader une molécule de leucine pour former une molécule d'iso-butylène. Enfin, l'enzyme catalysant la réaction emploie un hème comme co-facteur, se prêtant mal à l'expression recombinante chez les bactéries et à l'amélioration des paramètres enzymatiques. Pour toutes ces raisons, il paraît peu probable que cette voie de l'art antérieur puisse servir de base à un déploiement industriel. D'autres micro-organismes ont été mentionnés comme marginalement capables de générer naturellement de l'iso-butylène à partir d'iso-valérate. Les rendements obtenus sont encore plus faibles que ceux obtenus en utilisant Rhodotorula minuta (Fukuda H. et al, Agric. BbI. Chem. 1984 48 :1679).
Ces mêmes travaux font également état de la production naturelle de propylène : de nombreux microorganismes peuvent produire du propylène, avec un rendement là encore extrêmement faible.
La production d'éthylène par les plantes est décrite depuis longtemps (Meigh et al, 1960 Nature 186 :902). La méthionine constitue le précurseur de l'éthylène suivant la voie métabolique élucidée (Adams et Yang, PNAS 1979 76 :170). Une conversion à partir du 2-oxoglutarate a également été rapportée (Ladygina N et al., Process Biochemistry 2006 41 :1001 ). Puisqu'une seule molécule d'éthylène nécessite la production préalable d'une chaîne de quatre ou cinq atomes de carbone, les bilans matériel et énergétique de toutes ces voies sont défavorables et augurent mal de leur application industrielle pour la bioproduction d'alcènes.
Antérieurement à la caractérisation des étapes enzymatiques qui, chez les plantes, convertissent en éthylène son véritable précurseur métabolique, la S-adénosyl-méthionine (SAM), via la formation d'1- amino-cyclopropane-1-carboxylate (ACC) (Adams et Yang, PNAS 1979 76 :170 ), plusieurs autres hypothèses ont été proposées dans la littérature scientifique pour expliquer la production d'éthylène, parmi lesquelles la décarboxylation de l'acrylate (H2C=CH-CO2H) lequel proviendrait de la déshydratation du 3-hydroxy-propionate. Plusieurs articles spéculent explicitement sur la voie métabolique qui convertirait en éthylène, via l'acrylate, le 3-hydroxy-propionate, pour interpréter des expériences de traçage radio-actif de l'éthylène en fournissant des substrats marqués au 14C à des préparations de tissus végétaux, la béta-alanine-2-14C à des extraits de cotylédon de haricot (Stinson and Spencer, Plant Physiol., 1969, 44 :1217 ; Thompson and Spencer, Nature 1966, 210 :5036), et le propionate-2-14C à des homogénats de pulpe de banane. (Shimokawa et Kasai, Agr. Biol. Chem. 1970 34 :11 :1640). Toutes ces spéculations sur l'implication de 3-hydroxypropionate et d'acrylate dans la production métabolique d'éthylène, qui n'ont pas conduit à la caractérisation d'activités enzymatiques, ont disparu de la littérature scientifique dès que le rôle de la méthionine, du SAM et de l'ACC a été découvert (Hanson et Kende, Plant Physiology 1976 57 :528 ; Adams et Yang, PNAS 1979 76 :170).
II n'existe donc actuellement pas, à ma connaissance, de procédé efficace pour produire par synthèse microbiologique des alcènes terminaux tels que l'éthylène, le propylène, le 1 -butylène, l'iso-butylène, le 1 -amylène ou l'iso-amylène. Un tel procédé permettrait d'éviter de consommer des produits pétroliers, et de réduire les coûts de production de matière plastique et de carburant. Enfin, il pourrait éventuellement avoir un effet global important sur l'environnement en permettant de stocker du carbone sous forme solide.
Résumé de l'invention
La présente invention décrit un procédé permettant de réaliser la synthèse de composés alcènes par voie biologique.
L'invention découle de la conception d'une nouvelle voie de synthèse de composés alcènes terminaux basée sur la conversion de 3-hydroxy-alcanoates. L'invention est également basée sur la démonstration que cette conversion peut être réalisée par voie biologique, en utilisant une enzyme de type décarboxylase ou des variants de celle-ci. L'invention peut être mise en œuvre in vitro, dans des systèmes acellulaires, ou en utilisant des micro-organismes. L'invention vise également la production des alcènes à partir d'une source de carbone, et notamment un hydrate de carbone (notamment le glucose), un polyol (notamment le glycérol), un polymère biodégradable (notamment l'amidon, la cellulose, le poly-3-hydroxy-alcanoate) ; la source de carbone étant convertie par un micro-organisme en un intermédiaire métabolique de la famille des 3-hydroxy-alcanoates, qui sera ensuite converti en alcène terminal.
Plus précisément, un objet de l'invention réside dans un procédé de production d'un alcène terminal, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de conversion d'un 3-hydroxy-alcanoate en présence d'une enzyme présentant une activité décarboxylase.
Un autre objet de l'invention réside dans l'utilisation de composés 3-hydroxy-alcanoate, à titre de composé précurseur ou substrat, pour la production de composés alcènes terminaux. Dans des modes de réalisation particuliers de l'invention : on convertit le 3-hydroxy-propionate en éthylène ; ou on convertit le 3-hydroxy-butyrate en propylène ; ou - on convertit le 3-hydroxy-valérate en 1 -butylène ; ou on convertit le 3-hydroxy-3-methyl-butyrate (ou 3-hydroxy-isovalérate) en iso-butylène ; ou on convertit le 3-hydroxy-3-methyl-valérate en iso-amylène.
L'invention concerne encore l'utilisation d'une enzyme décarboxylase, ou d'un micro-organisme produisant une décarboxylase, pour la production de composés alcènes terminaux à partir de 3- hydroxy-alcanoates.
L'invention concerne également une composition comprenant un micro-organisme produisant une décarboxylase, un milieu de culture approprié et un composé 3-hydroxy-alcanoate, ou une source de carbone convertible par le micro-organisme en composé 3-hydroxy-alcanoate.
Un autre objet de l'invention concerne un biocatalyseur comprenant une enzyme décarboxylase, ou un micro-organisme produisant une décarboxylase décarboxylant en alcène terminal un composé 3- hydroxy-alcanoate.
Un autre objet de l'invention concerne un composé alcène terminal obtenu par un procédé tel que décrit dans l'invention.
Un autre objet de l'invention réside dans une enzyme isolée ou purifiée ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6 ou d'une enzyme présentant une homologie de séquence d'au moins 15% avec celle-ci.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une enzyme ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6, ou d'une enzyme présentant une homologie de séquence d'au moins 15% avec celle-ci, pour produire un alcène terminal.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'une enzyme ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6 ou d'une enzyme présentant une homologie de séquence d'au moins 15% avec celle-ci, le procédé comprenant la culture d'un microorganisme comprenant un acide nucléique recombinant codant ladite séquence dans des conditions permettant l'expression de cette séquence.
Un autre objet de l'invention concerne un mbroorganisme comprenant un acide nucléique recombinant codant une enzyme ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6 ou d'une enzyme présentant une homologie de séquence d'au moins 15% avec celle-ci.
Définitions
Par « 3-hydroxy-alcanoate », on définit ici toute molécule comprenant comme motif commun le 3- hydroxy-propionate (figure 1 ), et éventuellement une ou deux substitutions alcoyles sur le carbone 3. Ces résidus ou radicaux alcoyles peuvent être linéaires ou branchés. Dans la présente demande, les termes « alcoyle » et « alkyle » ont la même signification et sont interchangeables. De même, les termes « résidu » et « radical » ont la même signification et sont interchangeables. Les résidus méthyle, éthyle, propyle, iso-propyle, butyle, iso-butyle sont des exemples de ces résidus alcoyles. Le carbone 3 devient un centre chiral si les deux substitutions alcoyles sont différentes. La présente définition englobe les deux formes chirales, même si l'une des deux formes, par exemple la forme R, est la principale forme produite naturellement. Des exemples de 3-hydroxy-alcanoates sont exposés en figure 3. Eventuellement, des substitutions alcoyles peuvent être ajoutées sur le carbone 2, qui est alors susceptible lui aussi de devenir chiral (si les deux substituants sont différents). Indifféremment, les configurations des substrats 3-hydroxy-alcanoates dans la présente invention recouvrent l'ensemble des stéréo-isomères. D'une manière préférée, les 3-hydroxy-alcanoates correspondent soit au 3-hydroxy-propionate soit à des variantes ou dérivés du 3-hydroxy-propionate dans lesquels un des deux ou les deux atomes d'hydrogène portés par le carbone 3 sont substitués par un motif composé seulement d'atomes de carbone et d'hydrogène, le nombre de carbone de ces substituants variant de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, tel que le méthyle, l'éthyle, le propyle, l'isopropyle, le butyle ou isobutyle. Le suffixe « oate » peut signifier ici indifféremment soit l'ion carboxylate (COO-) soit l'acide carboxylique (COOH). Il n'est pas utilisé pour désigner un ester. Dans un mode particulier, les 3-hydroxy-alcanoates ont la formule suivante : HO-CO-CH2-C(R1)(R2)-OH ou O"-CO-CH2-C(R1)(R2)- OH.
Par « alcènes terminaux », on entend au sens de la présente invention les molécules composées seulement de carbone et d'hydrogène (hydrocarbures insaturés de formule CnH2n) comprenant l'éthylène et les molécules organiques dérivant de l'éthylène par mono- ou bi-substitution des deux atomes d'hydrogène liés au carbone 2 par des radicaux alcoyles, linéaires ou branchés. Les alcènes terminaux répondent préférentiellement à la formule H2C=C(R1)(R2) dans laquelle R1 et R2 sont choisis, indépendamment, parmi un atome d'hydrogène et un radical alcoyle, linéaire ou ramifié, ayant de préférence de 1 à 4 atomes de carbone, de manière encore plus préférée de 1 à 3 atomes de carbone. De préférence, l'un au moins des deux substituants du carbone 2 de l'alcène est un radical alcoyle linéaire ou ramifié. Les alcènes terminaux comprennent les composés ramifiés iso-alcènes, comme par exemple l'iso-butylène. Des exemples préférés de composés alcènes terminaux selon l'invention sont notamment, l'éthylène, le propylène, l'iso-butylène, et l'iso-amylène (figure 4), ou encore le 1 -butylène et le 1-amylène.
« Source de carbone » désigne ici tout composé carboné utilisable comme substrat pour les organismes selon l'invention. Ce terme englobe le glucose ou tout autre hexose, le xylose ou tout autre pentose, des polyols comme le glycérol, le sorbitol ou le mannitol, ou encore des polymères tels que l'amidon, la cellulose ou l'hémicellulose, ou encore des poly-3-hydroxy-alcanoates comme le poly-
3-hydroxy-butyrate. Il peut s'agir de tout substrat permettant la croissance de micro-organismes, comme le formate par exemple. Il peut également s'agir de CO2 dans le cas où l'organisme est susceptible de réaliser de la photosynthèse.
Par « recombinant », on désigne ici la modification génétique artificielle d'un organisme, soit par addition, soustraction, ou modification d'un gène chromosomique ou extra-chromosomique ou d'un motif de régulation tel qu'un promoteur, soit par fusion d'organismes, soit par addition d'un vecteur de toute nature, par exemple plasmidique. L' « expression recombinante » désigne la production d'une protéine impliquant une modification génétique, préférablement pour produire une protéine d'origine étrangère ou hétérologue vis-à-vis de son hôte, c'est-à-dire qui ne survient pas naturellement dans l'hôte de production, ou pour produire une protéine endogène modifiée ou mutée.
Par « surexpression », ou « surexprimant », on désigne ici l'expression recombinante d'une protéine, de préférence issue d'un organisme différent de celui dans lequel elle est exprimée, augmentée de 10% au moins et de préférence de 20%, 50%, 100%, 500% ou éventuellement plus par rapport à l'expression naturelle de ladite protéine. Entre également dans le cadre de cette définition le cas où il n'y a pas d'expression naturelle de ladite protéine.
Un « co-substrat » est un produit ajouté à la réaction enzymatique, de façon à en améliorer certains paramètres et en premier lieu son activité, ledit produit et le substrat principal étant consommés en quantités égales. Le co-substrat doit donc être ajouté à la réaction en concentration comparable à celle du substrat principal. Selon l'enzyme, la présence d'un co-substrat peut être nécessaire à la réaction enzymatique.
Un « co-facteur » est un produit ajouté à la réaction enzymatique, de façon à en améliorer certains paramètres et en premier lieu son activité, ledit produit n'étant pas consommé au cours de la réaction, et nécessitant donc de n'être ajouté qu'en concentration faible, proportionnelle à la quantité d'enzyme, cette concentration étant donc dite « catalytique ».
Une « partie » d'une séquence d'acides aminés désigne un fragment comprenant au moins 10, de préférence au moins 20, 30, 40 ou 50 résidus d'acides aminés consécutifs de ladite séquence. Par « homologie », on entend l'existence d'une similarité entre deux séquences telle qu'elle est mesurée par le pourcentage d'identité entre lesdites deux séquences.
Les composés chimiques sont souvent connus sous plusieurs noms, officiels ou d'usage. Ici, les noms habituels des molécules ont été préférés. Ainsi :
« éthylène » est utilisé pour désigner l'éthène
« propylène » est utilisé pour désigner le propène
« butylène » est utilisé pour désigner le butène - « isobutylène » est utilisé pour désigner le 2-méthyle-propène ou isobutène
« amylène » est utilisé pour désigner le pentène
« isoamylène » est utilisé pour désigner le 2-méthyle-but-1-ène ou isopentène
« propionate » est utilisé pour désigner l'acide propanoïque ou l'ion propanoate
« butyrate » est utilisé pour désigner l'acide butanoïque ou l'ion butanoate - « valérate » est utilisé pour désigner l'acide pentanoïque ou l'ion pentanoate
Description détaillée de l'invention
L'invention décrit notamment un procédé de production d'alcènes terminaux comprenant une étape de décarboxylation enzymatique de composés 3-hydroxy-alcanoates. L'invention découle également de l'utilisation de décarboxylases pour catalyser cette réaction, et en particulier d'enzymes de type mévalonate diphosphate décarboxylase, et de substrats tels que le 3-hydroxy-butyrate, le 3-hydroxy- valérate, le 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate (ou 3-hydroxy-isovalérate) et le 3-hydroxy-propionate.
L'invention décrit l'utilisation de co-facteurs, dont l'éthyle diphosphate, le propyle diphosphate, le méthyle diphosphate, des analogues de ces molécules, et le pyrophosphate. L'invention décrit encore l'utilisation de co-substrats, tels que l'ATP ou d'autres composés comportant une liaison phospho- anhydride.
L'invention porte aussi sur l'utilisation de sources de carbone, telles que le glucose, pour produire directement les alcènes terminaux à partir de cellules entières, la voie de synthèse passant par des 3- hydroxy-alcanoates.
L'invention porte aussi sur des organismes, naturels ou modifié, produisant de façon endogène un 3- hydroxy-alcanoate, et exprimant par ailleurs une décarboxylase transformant lesdits 3-hydroxy- alcanoates en alcènes terminaux.
Les composés alcènes produits, notamment le propylène, l'éthylène et l'iso-butylène, sont des molécules clés dans l'industrie des plastiques et des carburants, et leur fabrication industrielle par voie biologique, à partir de ressources renouvelables, constitue une innovation majeure.
L'invention découle ainsi de la conception d'une nouvelle voie de synthèse de composés de type alcène terminal basée sur la conversion de composés de type 3-hydroxy-alcanoate. L'invention démontre que cette conversion peut être réalisée par voie biologique, en utilisant une enzyme de type décarboxylase, qui permet de transformer un 3-hydroxy-alcanoate en alcène terminal. Comme illustré dans la figure 2, cette conversion se fait via un intermédiaire réactionnel de structure 3-phospho- hydroxy-alcanoate.
L'étape de conversion selon l'invention peut être réalisée in vitro, en présence d'une enzyme isolée (ou d'un système enzymatique comprenant en outre un ou plusieurs co-facteurs) ou en culture, en présence d'un micro-organisme produisant l'enzyme.
Comme décrit ici dans l'exemple 5, un rapport signal sur bruit de fond (mesuré en absence d'enzyme) du taux de conversion d'un facteur 100 environ a pu être observé dans certaines conditions. L'affinité vis-à-vis du 3-hydroxy-isovalerate (HIV) a été mesuré de l'ordre de 40 mM. Il n'était pas évident qu'une telle activité enzymatique, très significative, ait pu être obtenue : en effet, il est bien connu des biochimistes considérant la théorie et la pratique de l'enzymologie que les sites actifs des enzymes contiennent des éléments structurels permettant la reconnaissance, la liaison et la conversion chimique de certains substrats spécifiques. La littérature scientifique regorge de données expérimentales indiquant que les modifications de taille ou de charge électrique, même mineures, sont des critères d'exclusion pour les substrats. Spécifiquement, aucune prédiction scientifique ne pouvait permettre de prévoir que les MDP-décarboxylases pourraient utiliser des molécules de type 3- hydroxy-alcanoate comme substrat en général, et en particulier le 3-hydroxy-isovalerate, celui-ci différant du mévalonate-diphosphate non seulement par la taille (MW de 118 contre 308 pour le mévalonate diphosphate) mais également par les charges électriques du groupe diphosphate présent sur le substrat naturel, le mévalonate-diphosphate.
Dans un mode particulier, un co-facteur est ajouté à la réaction de façon à réaliser une complémentation stérique ou électronique dans la gorge catalytique. Le co-facteur est avantageusement choisi parmi l'ion pyrophosphate, le méthyl-diphosphate, l'éthyl-diphosphate, ou le propyl-diphosphate. Plus généralement, le co-facteur est un composé contenant le motif phosphoanhydride, de formule générale R-O-PO2H-O-PO3H2 dans laquelle R est notamment un atome d'hydrogène, un résidu alcoyle, linéaire, branché ou cyclique, de préférence de 1 à 10 ou de 1 à 5 atomes de carbone, ou tout autre radical organique monovalent. Les motifs analogues correspondant aux mono-esters du méthylène diphosphonate, de formule générale R-O-PO2H-CH2- PO3H2, dans lesquels le phosphoanhydride est remplacé par un pont méthylène présentant l'avantage de ne pas s'hydrolyser, font également partie de l'invention.
Dans un mode préférée, la conversion se fait en présence d'un co-substrat, ledit co-substrat étant de préférence un composé contenant un phosphoanhydride, et étant préférentiellement l'ATP, un rNTP, un dNTP ou un mélange de plusieurs de ces molécules, un polyphosphate, ou le pyrophosphate. Le co-substrat est généralement présent dans l'hôte. Cependant, dans un autre mode particulier, un co- substrat peut être ajouté à la réaction, choisi de préférence parmi l'ATP, un rNTP, un dNTP, un mélange de plusieurs rNTP ou dNTP, un polyphosphate, et de préférence le pyrophosphate, ou un composé contenant un phosphoanhydride (correspondant à la formule générale X-PO3H2 de la figure 2).
Dans un mode de mise en œuvre particulier de l'invention, on utilise un micro-organisme produisant la décarboxylase. Dans un mode de réalisation préféré, le microorganisme est recombinant dans le sens où il produit une décarboxylase hétérologue par rapport à l'hôte de production. Le procédé peut ainsi être réalisé directement dans le milieu de culture, sans qu'il soit nécessaire de séparer ou de purifier le système enzymatique. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un micro-organisme ayant la propriété naturelle ou artificielle de produire un ou plusieurs 3-hydroxy-alcanoates de façon endogène, et exprimant ou surexprimant par ailleurs une décarboxylase, naturelle ou modifiée, afin de produire des alcènes terminaux directement à partir d'une source de carbone présente en solution.
Les micro-organismes mis en œuvre dans l'invention peuvent être des procaryotes ou des eucaryotes, et notamment des bactéries, levures, cellules végétales, champignons et moisissures, cellules animales. Dans un mode particulier, les micro-organismes sont des bactéries, notamment de souche Alcaligenes eutrophus ou Bacillus megaterium.
Dans un autre mode particulier, les micro-organismes sont des bactéries recombinantes de souche Escherichia coli ayant été modifiées de façon à produire de façon endogène un ou des 3-hydroxy- alcanoates, et convertissant ceux-ci en alcènes terminaux.
Dans un autre mode particulier les mbro-organismes sont des levures recombinantes, produisant des 3-hydroxy-alcanoates, et convertissant ceux-ci en alcènes terminaux.
Dans un autre mode particulier, on utilise un micro-organisme producteur d'un ou plusieurs 3-hydroxy- alcanoates d'une part, et une décarboxylase, éventuellement exprimée par un second microorganisme, d'autre part. Eventuellement, on cultive et on utilise concomitamment les deux organismes dans le procédé selon l'invention.
Dans un autre mode particulier, des plantes entières ou des animaux, éventuellement modifiés par transgénèse, sont utilisés pour produire des alcènes terminaux à partir de 3-hydroxy-alcanoates, que ceux-ci soient produits de manière endogène ou apportés de manière exogène.
Dans un autre mode particulier de mise en œuvre, on utilise un micro-organisme photosynthétique ayant la propriété naturelle ou artificielle de produire un ou plusieurs 3-hydroxy-alcanoates de façon endogène, et surexprimant par ailleurs une décarboxylase, naturelle ou modifiée, afin de produire des alcènes terminaux directement à partir de CO2 présent en solution. De préférence, le micro-organisme est une bactérie photosynthétique, ou une micro-algue.
Les organismes décrits ci-dessus représentent d'autres objets de la présente invention, de même que leur utilisation pour la production de composés alcènes terminaux.
Comme il sera décrit dans la suite, le procédé de l'invention peut être mené en micro-aérophilie.
Par ailleurs, dans un mode de réalisation préféré, le procédé est réalisé en présence d'un système de collecte gazeuse des alcènes terminaux dégazant de la réaction.
Par décarboxylase on entend toute enzyme capable de convertir un 3-hydroxy-alcanoate avec un nombre n d'atomes de carbone en un composé alcène terminal avec un nombre n-1 d'atomes de carbone. Comme illustré dans la figure 2, le procédé de l'invention se fait de préférence via un intermédiaire réactionnel 3-phospho-hydroxy-alcanoate, et l'enzyme mise en œuvre présente avantageusement une activité décarboxylase et une activité phosphorylase.
Dans un mode particulier de mise en œuvre, la décarboxylase est un représentant de la superfamille phylogénétique de la mévalonate-diphosphate (MDP) décarboxylase (nomenclature enzymatique EC 4.1.1.33), c'est-à-dire une enzyme, naturelle ou artificielle, spécifiée par un gène natif ou synthétique, éventuellement capable de catalyser la réaction présentée en figure 2.
La MDP décarboxylase est une enzyme impliquée dans la biosynthèse du cholestérol. Cette enzyme a été isolée à partir d'organismes divers tels que les animaux, les champignons, les levures, et certaines bactéries. Elle pourrait également être exprimée par certaines plantes (Lalitha et al, 1985). De nombreux gènes spécifiant cette enzyme ont été clones et séquences. Ces enzymes sont généralement composées de 300 à 400 acides-aminés, et font intervenir de l'ATP comme co-substrat, qui est transformé au cours de la réaction en ADP et en phosphate inorganique. Le groupement phosphate est transféré de la molécule d'ATP à l'alcool tertiaire du mévalonate diphosphate en libérant de l'ADP. L'intermédiaire réactionnel phosphorylé sur le groupe 3-hydroxyle subit ensuite une élimination du groupe phosphate, libérant dans le cas physiologique l'isopentenyl-pyrophosphate (figure 2).
La structure tridimensionnelle de plusieurs enzymes de cette famille a été résolue. Relativement peu de travaux ont été menés à ce jour sur les enzymes de cette famille, qui n'ont été étudiées que dans le cadre de la description précise de la voie de biosynthèse du cholestérol. En revanche, à ma connaissance, aucune étude n'a encore été conduite pour détourner cette enzyme de sa fonction naturelle et en faire un catalyseur industriel.
Plusieurs exemples de MDP décarboxylases provenant de différents organismes sont donnés dans les séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO: 16.
Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, l'enzyme mise en œuvre est une décarboxylase, comprenant de préférence une séquence en acides aminés choisie parmi SEQ ID NOs : 1 , 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 ou 16 ou une séquence présentant au moins 15% d'homologie de séquence avec l'une de celles-ci et conservant une activité décarboxylase. Des enzymes préférées comportent avantageusement au moins 50% d'homologie de séquence, préférentiellement au moins 80%, plus préférentiellement au moins 85%, encore plus préférentiellement, au moins 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'homologie de séquence avec l'une des séquences primaires SEQ ID NO : 1 , 2, 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 et 16. Le degré d'homologie de séquence peut être déterminé par différentes méthodes et au moyen de logiciels connus de l'homme du métier, comme par exemple selon la méthode CLUSTAL ou les logiciels BLAST ou dérivés, ou en utilisant un algorithme de comparaison de séquences tel que celui de Needleman et Wunsch (J. Mol. BbI. 1970 48 :443 ) ou de Smith et Waterman (J. Mol. Biol. 1981 147 :195).
Une décarboxylase préférée de l'invention est représentée par l'enzyme de séquence SEQ ID NO : 6, ainsi que toute enzyme présentant une homologie de séquence significative avec celle-ci. Des enzymes préférées comportent avantageusement au moins 50% d'homologie de séquence, préférentiellement au moins 80%, plus préférentiellement au moins 85%, encore plus préférentiellement, au moins 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% d'homologie de séquence avec la séquence primaire SEQ ID NO : 6. Cette enzyme a été clonée à partir de Picrophilus torήdus et produite par voie recombinante dans le cadre de la présente invention. Comme illustré dans les exemples, cette enzyme est particulièrement efficace pour produire des composés alcènes terminaux selon la présente invention. Cette enzyme représente également un objet de la présente invention, de même que sa préparation et son utilisation comme catalyseur. Notamment, un objet de l'invention réside dans l'utilisation d'une enzyme décarboxylase comprenant tout ou partie de SEQ ID NO : 6 ou d'une enzyme présentant une homologie de séquence significative et de préférence d'au moins 15% avec SEQ ID NO : 6, pour la production de composés alcènes terminaux. Par homologie de séquence significative, on entend une homologie de séquence détectable en utilisant les algorithmes précédemment cités, et de préférence une homologie de séquence supérieure à 15%. Les organismes phylogénétiquement les plus proches de Picrophilus torridus, tels que Ferroplasma acidarmanus, Thermoplasma acidophilum, Thermoplasma volcanium et Picrophilus oshimae sont susceptibles de produire les MDP décarboxylases les plus proches de celle de la SEQ ID NO 6. L'homologie de séquence vis-à-vis de la SEQ ID NO 6 de la MDP décarboxylase de Thermoplasma acidophilum (AC number Q9HIN1 ) est ainsi de 38% ; celle de Thermoplasma volcanium (Q97BY2) est homologue à la SEQ ID NO 6 à 42% environ. L'utilisation de ces MDP décarboxylases est tout particulièrement envisagée dans la présente invention.
D'autres enzymes de type décarboxylase, naturelles ou synthétiques, peuvent être sélectionnées pour leur capacité à produire des alcènes terminaux selon l'invention. Ainsi, un test de sélection comprend la mise en contact de l'enzyme purifiée, ou d'un microorganisme produisant l'enzyme, avec le substrat de la réaction et la mesure de la production du composé alcène terminal. Des exemples de tels tests sont fournis dans la partie expérimentale, qui expose des tests sur plus de 60 enzymes différentes.
L'enzyme mise en œuvre peut être toute décarboxylase naturelle ou produite ou optimisée de manière artificielle. En particulier, on utilise avantageusement une décarboxylase présentant une activité optimisée vis-à-vis d'un ou de plusieurs 3-hydroxy-alcanoates.
L'enzyme peut être produite ou sélectionnée, à partir d'une décarboxylase de référence (naturelle ou elle-même déjà synthétique ou optimisée), par des techniques d'ingénierie des protéines telles que la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse massive, la mutagenèse dirigée, le DNA-shuffling, le shuffling synthétique, l'évolution in vivo, ou la synthèse complète de gènes.
A cet égard, un objet de l'invention concerne également un procédé de préparation d'une enzyme ayant une activité décarboxylase vis-à-vis d'un substrat 3-hydroxy-alcanoate, le procédé comprenant une étape de traitement d'une source d'enzyme et la sélection d'une enzyme ayant des propriétés accrues vis-à-vis dudit substrat, par comparaison à l'enzyme non traitée.
L'enzyme utilisée dans l'invention peut ainsi être naturelle ou synthétique, et produite par voie chimique, biologique, ou génétique. Elle peut également être modifiée chimiquement, par exemple pour améliorer son activité, sa résistance, sa spécificité, sa purification, ou pour l'immobiliser sur support.
L'invention est caractérisée par l'utilisation d'une décarboxylase, en particulier d'une MDP décarboxylase naturelle ou modifiée, pour convertir des 3-hydroxy-alcanoates en alcènes terminaux.
Le substrat naturel de la MDP décarboxylase est le mévalonate diphosphate, qui n'entre pas dans la définition des 3-hydroxy-alcanoates.
La réaction générique réalisée par la MDP carboxylase en utilisant divers 3-hydroxy-alcanoates est représentée dans la figure 2B. On conçoit que ces réactions mènent directement et en une seule étape à des alcènes terminaux. Dans un premier mode de réalisation, on utilise de l'enzyme native ou recombinante, purifiée ou non, pour transformer un 3-hydroxy-alcanoate en alcène terminal. Pour ce faire, on incube la préparation d'enzyme en présence du substrat dans des conditions physico-chimiques permettant à l'enzyme d'être active, et on laisse l'incubation se faire pendant un temps suffisant. A l'issue de l'incubation, on mesure éventuellement la présence de l'alcène terminal en utilisant tout système de détection connu de l'homme du métier comme la chromatographie en phase gazeuse ou des tests colorimétriques permettant de mesurer l'apparition du produit alcène, de phosphate libre, ou encore permettant de mesurer la disparition du substrat 3-hydroxy-alcanoate ou de l'ATP.
Dans un mode de réalisation préféré, des co-facteurs sont ajoutés de façon à mimer au mieux la réaction naturelle. En effet, les 3-hydroxy-alcanoates ont une structure correspondant généralement à un fragment du MDP, et un espace important de la gorge catalytique est laissé vide lors de l'association enzyme/substrat. Le comblement de cet espace par un co-facteur remplaçant la partie manquante dans le substrat a pour fondement de mimer au plus proche la molécule de MDP. Ne se trouvant pas modifié par la réaction, le co-facteur devra donc n'être ajouté à la réaction qu'en quantités catalytiques, Dans le cas où le substrat de la réaction est le 3-hydroxy-propionate, le co- facteur complémentaire sera le propyl-diphosphate. Dans le cas où le substrat est le 3-hydroxy- butyrate ou le 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate, le co-facteur complémentaire sera l'éthyl-diphosphate. Dans le cas où le substrat est le 3-hydroxy-valérate ou le 3-hydroxy-3-méthyl-valérate, le co-facteur complémentaire sera le méthyl-diphosphate. Ces différentes molécules sont présentées en figure 5. Incidemment, il pourra survenir que le co-facteur complémentaire d'une réaction ait un effet positif sur la réaction d'un autre substrat. Généralement, le co-facteur peut être n'importe quelle molécule comprenant un phosphoanhydride, et ayant donc pour formule globale R-PO2H-O-PO3H2, dans laquelle R est notamment H, un résidu alcoyle, linéaire, branché ou cyclique, ou tout autre radical organique monovalent. Les motifs analogues correspondant aux mono-esters du méthylène diphosphonate, de formule générale R-O-PO2H-CH2-PO3H2, dans lesquels le phosphoanhydride est remplacé par un pont méthylène présentant l'avantage de ne pas s'hydrolyser, font également partie de l'invention. Plus généralement, les co-facteurs peuvent être les analogues monophosphates, voire sans phosphate, des molécules précédentes, ou encore toute autre molécule susceptible d'améliorer le rendement de la réaction en effectuant une complémentation stérique ou électronique dans le site catalytique de l'enzyme.
Dans un mode de réalisation particulier, un co-substrat est ajouté à la réaction. Ledit co-substrat peut être soit l'ATP, c'est-à-dire le co-substrat naturel de la MDP décarboxylase, soit n'importe quel rNTP (ribonucléoside triphosphate) ou dNTP (désoxyribonucléoside triphosphate) ou n'importe quel mélange de rNTP ou dNTP, ou encore du pyrophosphate, ou un autre polyphosphate, ou encore n'importe quelle molécule contenant un groupement phosphoanhydride (X-PO3H2 de la Figure 2).
Dans un mode préféré de réalisation, on utilise pour transformer un 3-hydroxy-alcanoate en alcène terminal une enzyme présentant une homologie de séquence d'au moins 15%, et de préférence d'au moins 30%, 50%, et encore plus préférentiellement d'au moins 80, 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% avec une enzyme naturelle présentant une activité décarboxylase et en particulier avec une des enzymes correspondant aux séquences SEQ. ID : 1 à 16. Notamment, l'enzyme peut avoir été modifiée par ingénierie à partir de l'une des enzymes SEQ. ID : 1 à 16, ou de toute autre décarboxylase identifiée à partir d'autres origines. Une telle enzyme peut avoir perdu son activité MDP décarboxylase notamment par ingénierie du gène en laboratoire, mais aussi lors de l'évolution naturelle (on peut alors parler de vestige de MDP décarboxylase) et conservé ou accru son activité sur une ou plusieurs molécules de type 3-hydroxy-alcanoate. La génération de variants de ces enzymes, plus réactifs envers lesdits substrats, permet d'améliorer le rendement de la réaction selon l'invention. Ainsi, la réactivité de la MDP décarboxylase de type sauvage vis-à-vis des 3-hydroxy-alcanoates n'est pas nécessairement optimale. Toutes les approches connues de l'homme du métier pour réaliser et sélectionner de tels variants, telles que la mutagenèse aléatoire, la mutagenèse dirigée, la mutagenèse massive, le mélange de gènes (DNA-shuffling), ou l'évolution in vivo peuvent être utilisées.
L'invention est également caractérisée par l'utilisation d'une enzyme totalement artificielle, obtenue par conception et réalisation d'un gène synthétique spécifiant une enzyme inédite dans le but de convertir un 3-hydroxy-alcanoate en alcène terminal, en utilisant ou non les données connues des MDP décarboxylases pour le concevoir.
Un autre objet de l'invention réside dans une enzyme isolée ou purifiée ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'une enzyme ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6, ou d'une enzyme présentant une homologie de séquence telle que décrite ci-dessus, pour produire un alcène terminal. Dans une variante, la séquence peut comprendre en outre des résidus supplémentaires, comme par exemple une étiquette Histidine en N-terminal.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de production d'une enzyme ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6, ou d'une enzyme présentant une homologie de séquence telle que décrite ci-dessus, le procédé comprenant la culture d'un microorganisme comprenant un acide nucléique recombinant codant ladite séquence dans des conditions permettant l'expression de cette séquence. Dans ce contexte, la présente invention décrit, en plus de l'acide nucléique natif (SEQ ID NO : 19), un acide nucléique présentant une séquence optimisée pour l'expression de l'enzyme SEQ ID NO : 6 dans des bactéries, notamment dans E. coli (SEQ ID NO : 17). Cet acide nucléique, de même que tout acide nucléique optimisé (c'est-à-dire permettant une expression améliorée de 30% au moins par rapport à la séquence sauvage) représente un objet de la présente demande.
Un autre objet de l'invention concerne un mbroorganisme comprenant un acide nucléique recombinant codant une enzyme ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6, ou d'une enzyme présentant une homologie de séquence telle que décrite ci-dessus. Le microorganisme est de préférence une bactérie, une levure ou un champignon. L'invention concerne également toute plante ou animal non humain comprenant un acide nucléique recombinant codant une décarboxylase selon l'invention.
Dans un mode de réalisation, la MDP décarboxylase est utilisée sous une forme purifiée pour transformer des 3-hydroxy-alcanoates en alcènes terminaux. Toutefois, les coûts associés à ce procédé sont élevés, les coûts de production et de purification de l'enzyme et des substrats étant importants.
Dans un autre mode de réalisation, la MDP décarboxylase est présente dans la réaction sous forme d'un extrait non purifié, ou encore sous forme de bactéries non lysées, afin d'économiser les coûts de purification de la protéine. Toutefois, les coûts associés à ce procédé sont encore assez élevés à cause des coûts de production et de purification des substrats.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé met en œuvre un organisme vivant produisant l'enzyme permettant de réaliser la conversion. L'invention est ainsi également caractérisée par la modification par génie génétique d'une souche bactérienne productrice d'un ou de plusieurs 3- hydroxy-alcanoate (par exemple Alcaligenes eutrophus ou Bacillus megaterium, ou encore une souche de E. coli modifiée en laboratoire de façon à produire le ou lesdits produits), de façon à ce que ladite souche bactérienne surexprime la décarboxylase, ladite enzyme étant de préférence issue d'un organisme différent du microorganisme hôte, et puisse générer directement un ou plusieurs alcènes terminaux. La modification génétique peut consister en une intégration chromosomique d'un gène de la décarboxylase, l'expression de l'enzyme par un plasmide contenant un promoteur en amont de la séquence codante de l'enzyme, le promoteur et la séquence codante étant de préférence issus d'organismes différents, ou de tout autre moyen connu de l'homme du métier. Alternativement, d'autres bactéries ou levures peuvent présenter des avantages particuliers et être retenus. Ainsi, une levure telle que Saccharomyces cerevisiae, une bactérie extrémophile telle que Thermus thermophilus, ou des bactéries anaérobies de la famille des Closthdiae par exemple, des microalgues, des bactéries photosynthétiques peuvent être utilisées. De façon à produire optimalement le ou les 3-hydroxy-alcanoate, qui seront ensuite convertis en alcènes terminaux, les souches peuvent également avoir été modifiées par génie génétique, c'est-à-dire par recombinaison in vitro ou par évolution dirigée in vivo.
Dans un mode de réalisation, le procédé de l'invention est caractérisé par la transformation d'une source de carbone telle que le glucose, en 3-hydroxy-alcanoate, puis par la transformation dudit produit primaire en produit secondaire, c'est-à-dire en alcène terminal. Les différentes étapes dudit procédé sont explicitées en figure 6.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention est caractérisée par la transformation de polyhydroxyalcanoates en 3-hydroxy-alcanoate, en utilisant une enzyme ou un procédé physicochimique adapté, puis par la transformation dudit produit primaire en produit secondaire, c'est-à-dire en alcène terminal. Eventuellement, le polyhydroxyalcanoate a été produit par une plante ayant été modifiée au niveau de ses voies métaboliques de façon à produire de hauts rendements de polyhydroxyalcanoate.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention consiste en le procédé intégré de production des produits à partir de CO2 atmosphérique ou artificiellement ajouté au milieu de culture. Le procédé de l'invention est réalisé dans un organisme capable d'effectuer de la photosynthèse, tel que les microalgues par exemple.
Dans ces modes de réalisation, le procédé de l'invention est encore caractérisé par le mode de récupération des produits, qui dégazent de la culture. Les alcènes terminaux courts, et notamment l'éthylène, le propylène, les isomères du butène, prennent en effet un état gazeux à température ambiante et à la pression atmosphérique. Le procédé de l'invention ne requiert donc pas d'extraction du produit à partir du milieu liquide de la culture, étape qui constitue toujours une source de coûts importante au niveau industriel. L'évacuation et le stockage des hydrocarbures gazeux, et leur éventuelle séparation physique et conversion chimique ultérieures, peuvent être opérés suivant tout procédé connu de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend également la détection de l'alcène (propylène, d'éthylène et d'iso-butylène notamment) présent dans la phase gazeuse du procédé. La présence des composés ciblés dans un environnement d'air ou d'un autre gaz, même en faibles quantités, peut se faire en utilisant diverses technologies, et notamment en utilisant des systèmes de chromatographie en phase gazeuse et la détection aux infrarouges, par ionisation de flamme, ou par couplage avec un spectromètre de masse.
Dans un mode de réalisation particulier, les alcènes terminaux obtenus sont condensés, puis éventuellement réduits, en utilisant des techniques connues de l'homme du métier, afin de produire des alcènes de plus longue chaîne, ou des alcanes de plus longue chaîne. En particulier, l'iso- butylène peut être utilisé pour synthétiser de l'iso-octane : les procédés catalytiques pour mener à bien cette réaction sont déjà amplement décrits.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé implique la culture des micro-organismes dans des conditions de culture habituelles (30 à 37°C sous 1 atmosphère, dans un fermenteur permettant la croissance aérobie des bactéries) ou non habituelles (température plus élevée pour correspondre aux conditions de culture d'un organisme thermophile, par exemple).
Dans un mode de réalisation particulier, les micro-organismes sont cultivés en microaérophilie, la quantité d'air injectée étant limitante afin de minimiser la concentration de dioxygène résiduelle dans les effluents gazeux chargés d'hydrocarbures alcéniques.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des Figures
Figure 1 : Motif 3-hydroxy-propionate
Figure 2 : Décarboxylation du mévalonate di-phosphate par la MDP-décarboxylase - activité générique
Figure 3 : Exemples de 3-hydroxy-alcanoates.
Figure 4 : Utilisation de la MDP décarboxylase pour générer des alcènes terminaux
Figure 5 : Co-facteurs utilisables pour la réaction afin de réaliser la complémentation structurelle dans le site catalytique
Figure 6 : Procédé intégré de production d'un alcène à partir de glucose
Figure 7 : Chromatogramme réalisé sur des réactions enzymatiques menées dans les conditions n°1 de l'exemple 4.
Figure 8 : SDS-PAGE des étapes de surexpression et purification de l'enzyme SEQ ID NO 6.
1. Marqueurs
2. Culture avant induction 3. Lysat
4. Fraction non absorbée sur la colonne
5. Fraction de lavage de la colonne
6. Enzyme purifiée, Mw=36,8 kDa
Figure 9 : Chromatogramme d'une analyse de la réaction de conversion de HIV en IBN par CPG/MS. 1 et 2 : Contrôles négatifs correspondants au bruit de fond observé sans enzyme 3 et 4 : Réactions en présence de l'enzyme SEQ ID NO : 6.
Figure 10 : Ratio de la production d'IBN en présence et absence d'ATP.
Figure 11 : Ratio de la production d'IBN en présence et absence de Mg2+.
Figure 12 : Activité enzymatique en fonction de la température. Ratio : quantité d'IBN formée en présence d'enzyme par rapport au bruit de fond.
Figure 13 : Production de l'IBN en fonction de la concentration du substrat HIV.
Figure 14 : Mesure de la réaction optimisée et comparaison au bruit de fond. Mesure par chromatographie gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme.
Figure 15 : Amélioration du niveau d'expression par optimisation de la séquence nucléotidique codant SEQ ID NO : 6. Piste M : marqueurs de poids moléculaire
Pistes 1 , 2, 3: séquence nucléotidique native (1 ) Lysat cellulaire, fraction soluble déposée sur la colonne de purification
(2) Fraction de lysat non retenue par la colonne de purification
(3) Fraction éluée: 10μg enzyme purifiée
Pistes 4, 5, 6: Séquence nucléotidique optimisée
(4) Lysat cellulaire, fraction soluble déposée sur la colonne de purification (5) Fraction de lysat non retenue par la colonne de purification
(6) Fraction éluée: 10μg enzyme purifiée Exemples
Exemple 1 : clonage et expression de plusieurs MDP décarboxylases.
Le gène codant pour la MDP décarboxylase de Saccharomyces cerevisiae est généré par synthèse à partir d'oligonucléotides chevauchants, puis inséré dans un plasmide pET (Novagen) permettant l'expression en bactéries. Ledit plasmide est ensuite transformé par électroporation dans des bactéries de souche BL21 (Invitrogen). Les bactéries sont étalées sur une boite de Pétri contenant de l'ampicilline, et mises à incuber à 37°C. Le jour suivant, une colonie bactérienne est sélectionnée au hasard, et utilisée pour ensemencer une culture de 50 ml de milieu LB contenant de l'ampicilline. La culture est incubée pendant 24 heures sous agitation. A l'issue des 24 heures, la culture est centrifugée, les bactéries sont lysées par sonication, et un extrait protéique total est réalisé. Un aliquote de l'extrait est déposé sur un gel l'électrophorèse, en même temps qu'un extrait protéique provenant de bactéries de la même souche, mais non transformées, et d'un marqueur de poids moléculaire. On observe sur la piste correspondant à la souche bactérienne transformée une bande unique à 3OkD environ, correspondant à la taille attendue pour la protéine, cette bande n'existant pas sur la piste correspondant aux bactéries non transformées.
Exemple 2 : mesure de l'activité des extraits protéiques pour le 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate.
Du 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate (commandé chez Sigma, référence 55453 sous le nom de β- hydroxyisovaleric acid), et suspendu à la concentration de 10 g/L. Du mévalonate-diphosphate est synthétisé à partir de mevalonolactone et d'autres réactifs (Sigma), selon la technique classique, et est resuspendu à la concentration de 10 g/L. On prépare six flacons de chromatographie. Dans tous les flacons, on introduit 50 μL de tampon contenant 50 mM de Bistris/HCI, 1 mM de dithiothréitol, 10 mM de MgCI2, 5 mM d'ATP.
Dans les flacons 1 et 4, on n'ajoute 5 μL d'eau (aucun substrat).
Dans les flacons 2 et 5, on ajoute, 5 μL de la préparation de mévalonate di-phosphate (contrôle positif) Dans les flacons 3 et 6, on ajoute 5 μL de la préparation de 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate (HIV)
Dans les flacons 1 , 2, et 3, on ajoute ensuite 5 μL d'eau (aucune enzyme)
Dans les flacons 4,5, et 6, on ajoute 5 μL de la préparation enzymatique décrite dans l'exemple 1.
On scelle les flacons en utilisant un bouchon à septum et une pince à sceller. On incube tous les flacons à 37°C pendant 4 heures à 3 jours. A l'issue de cette incubation, on prélève un échantillon du gaz présent dans chaque flacon en utilisant une seringue à gaz, et on mesure la concentration du CO2 dans ces échantillons en utilisant la chromatographie en phase gazeuse. On s'aperçoit que la concentration en CO2 est très significative dans le flacon 5, et qu'une concentration en CO2, plus faible, est également observable dans le flacon 6, ce qui reflète une réaction significative de la préparation enzymatique sur le 3-hydroxy-3-méthyl- butyrate.
On mesure ensuite la présence d'iso-butylène dans l'échantillon de gaz correspondant au flacon 6 en utilisant un système de chromatographie gazeuse couplée à un détecteur à infra-rouges ou à ionisation de flamme.
Exemple 3 : optimisation des conditions de réaction en utilisant un co-facteur.
On effectue la même réaction que celle décrite dans le flacon 6 de l'exemple précédent, mais en utilisant, dans l'un des échantillons, de l'éthyl-diphosphate comme co-facteur, synthétisé à façon.
Dans cet exemple, on dispose de trois flacons. Le premier contient les tampons, l'ATP, l'extrait enzymatique dans les quantités décrites dans l'exemple précédent. Le second contient les même éléments, avec en plus du 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate dans les quantités décrites dans l'exemple précédent. Le troisième flacon contient, en plus du 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate, 10μL d'éthyl- diphosphate à 10mg/L.
On mesure, comme dans l'exemple précédent, la formation de l'iso-butylène en utilisant un appareillage de chromatographie gazeuse couplée à de la détection aux infra-rouges ou à ionisation de flamme. On s'aperçoit que lorsque l'éthyl-diphosphate est présent, la quantité d'iso-butylène produite par unité de temps est nettement supérieure.
Exemple 4. Criblage d'une collection d'enzymes
Une collection de soixante trois gènes codant pour des enzymes de la famille de la MDP décarboxylase ont été obtenus et testés pour leur activité sur le substrat HIV.
Clonage, cultures bactériennes et expression des protéines.
Les gènes correspondant à la famille diphosphate mevalonate (MDP) décarboxylases EC 4.1.1.33 ont été clones dans le vecteur pET 25b (Novagen) pour les gènes d'origine eucaryote et pET 22b (Novagen) pour les gènes d'origine procaryote avec 6 résidus His ajoutés en N-terminal, juste après le codon méthionine initiateur. Les cellules compétentes E.coli BL21 (DE3) (Novagen) ont été transformées avec les vecteurs par choc thermique. Les cellules ont été cultivées sur le milieu TB contenant 0,5 M sorbitol, 5 mM betaïne, 100 μg/ml ampicilline à 300C, sous agitation (160 rpm) jusqu'à une DO (600 nm) comprise entre 0,8 et 1. L'isopropyl-B-D-thiogalactopyranoside (IPTG) a ensuite été ajouté à la concentration finale 1 mM et l'expression des protéines a été poursuivie à 200C durant la nuit (environ 16H). Les cellules ont été collectées par centrifugation à 4°C, 10 000 rpm, 20 minutes et les culots congelés à -800C. Lyse des cellules
1 ,6 g de cellules a été décongelé sur glace ; les cellules ont été re-suspendues dans 5 ml de 50 mM Na2HPO4 contenant 300 mM NaCI, 5 mM MgCI2 , 1 mM DTT pH 8. 20 μl de lysonase (Novagen) ont été rajoutés puis une incubation 10 min à la température ambiante a été menée, et suivie d'un retour 5 20 min sur glace. La lyse des cellules bactériennes a été complétée par sonication dans un bain-marie à ultrason 3 fois 5 minutes à 00C avec une homogénéisation des échantillons entre les puises. Les extraits bactériens ont été ensuite clarifiés par centrifugation à 4°C, 10 000 rpm, 20 minutes.
Purification et concentration des protéines (kit PROTINO)
10 Des lysats bactériens clarifiés ont été déposés sur la colonne PROTINO-1000 Ni-IDA (Macherey- Nagel) permettant l'absorption des protéines portant une étiquette de 6 histidines consécutives (His tag). Les colonnes ont été lavées et les enzymes d'intérêt ont été éluées avec 4 ml de 50 mM Na2HPO4 contenant 300 mM NaCI, 5 mM MgCI2 , 1 mM DTT, 250 mM imidazole pH 8. Les éluats ont ensuite été concentrés dans des cellules Amicon Ultra-4 10 kDa (Millipore) jusqu'à un volume final de
15 250 μL. La quantité d'enzymes a été déterminée par la méthode Bradford.
Réactions enzymatiques
L'activité enzymatique recherchée (conversion du 3-méthyl 3-hydroxy butyrate, ou 3-hydroxy isovalerate, ou encore HIV) a été testée dans deux conditions expérimentales différant par le tampon 0 et le pH de la réaction.
Conditions expérimentales N°1 . 100 mM citrate 10mM MgCI2 5 1 O mM ATP 20 mM KCI 20O mM HIV pH final a été ajusté à 5,5
30 Conditions expérimentales N°2.
100 mM Tris-HCI pH 7,0
10mM MgCI2
1 O mM ATP
20 mM KCI 35 20O mM HIV pH final a été ajusté à 7,0 L'enzyme a ensuite été ajoutée au mélange réactionnel. Le rendement de production de protéine étant variable, la quantité d'enzyme ajoutée variait d'un échantillon à l'autre entre 0,01 et 1 mg/ml. Les réactions de contrôle, sans enzyme, ont été menées en parallèle.
Les réactions (1 mL) on été placées dans des flacons de 2 ml (Interchim), scellés avec des septums en téflon/silice/téflon (Interchim). Les réactions ont été incubées à 37 0C sans agitation pendant 72 heures.
Analyse des réactions Le gaz présent au-dessus des réactions a été prélevé avec une seringue équipée d'un système antiretour. Le gaz a ensuite été analysé par chromatographie en phase gazeuse (CPG) couplé à un spectromètre de masse (SM). L'appareil était préalablement étalonné en utilisant une gamme de concentration d' isobutylène. Colonne : BPX5 (SGE) CPG/SM : MSD 5973 (HP)
Pour chaque chromatogramme réalisé, on obtient trois pics principaux, le premier correspondant à l'air, le second à l'eau, et le troisième à l'isobutylène. Sur les soixante trois enzymes produites et testées, onze candidats potentiels ont été identifiés au premier criblage. Certains de ces candidats sont identifiés par une flèche sur la Figure 7. Leur identité est présentée dans la liste ci-dessous, et leurs séquences sont présentées dans les SEQ NO 6 à 16 (his-tag non figuré).
Candidat 1 : SEQ ID NO: 7
Numéro d'accession Genebank: CAI97800.1 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : Q1 GAB2
Microorganismes: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (souche ATCC 11842 / DSM 20081 )
Candidat 2: SEQ ID NO: 8
Numéro d'accession Genebank : CAJ51653 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : Q18K00
Microorganismes: Haloquadratum walsbyi DSM 16790
Candidat 3: SEQ ID NO: 9
Numéro d'accession Genebank : ABD99494.1 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : Q1WU41
Microorganismes: Lactobacillus salivarius subsp. salivarius (strain UCC118)
Candidat 4: SEQ ID NO: 10
Numéro d'accession Genebank : ABJ57000.1 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : Q04EX2
Microorganismes: Oenococcus oeni (strain BAA-331 / PSU-1 )
Candidat 5: SEQ ID NO: 11
Numéro d'accession Genebank : ABJ67984.1 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : Q03FN8 Microorganismes: Pediococcus pentosaceus ATCC 25745
Candidat 6: SEQ ID NO: 12
Numéro d'accession Genebank : ABV09606.1
5 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : A8AUU9
Microorganismes: Streptococcus gordonii (souche Challis / ATCC 35105 / CH 1 / DL1 / V288)
Candidat 7: SEQ ID NO: 13
Numéro d'accession Genebank : ABQ14154.1
10 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : A5EVP2
Microorganismes: Dichelobacter nodosus VCS1703A
Candidat 8: SEQ ID NO: 14
Numéro d'accession Genebank : EDT95457.1 15 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : B2DRT0
Microorganismes: Streptococcus pneumoniae CDC0288-04
Candidat 9: SEQ ID NO: 15
Numéro d'accession Genebank : AAT86835 20 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : Q5XCM8
Microorganismes: Streptococcus pyogenes sérotype M6 (ATCC BAA-946 / MGAS10394)
Candidat 10 : SEQ ID NO: 6
Numéro d'accession Genebank : AAT43941
25 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : Q6KZB1
Microorganismes: Picrophilus torridus DSM 9790
Candidat 11 : SEQ ID NO: 16
Numéro d'accession Genebank : AAV43007.1
30 Numéro d'accession Swissprot/TrEMBL : Q5FJW7
Microorganismes: Lactobacillus acidophilus NCFM
La production la plus élevée d'IBN a été observée avec le candidat 10, c'est-à-dire avec l'enzyme 35 décarboxylase purifiée de SEQ ID NO : 6 provenant de Picrophilus torridus. Cette enzyme a été retenue pour être caractérisée en détail.
Exemple 5 : Caractérisation de l'enzyme de SEQ ID NO : 6
40 L'enzyme recombinante a été purifiée comme décrit dans l'exemple 4. Les résultats, présentés sur la Figure 8, montrent que la pureté de l'enzyme dans l'échantillon protéique final est estimée à 90%.
L'activité de l'enzyme isolée a été confirmée. La réaction a été menée dans les conditions suivantes : 100 mM Tris-HCI pH 7,0 45 10mM MgCI2 1 O mM ATP 20 mM KCI 25O mM HIV pH final a été ajusté à 6,0 3 mg/mL enzyme
Après une incubation à 300C pendant 72h, on mesure le signal par CPG/SM. Les résultats sont présentés sur la Figure 9. En présence d'enzyme, la production de l'IBN est augmentée ici d'un 5 facteur environ 2,3 en comparaison du bruit de fond. Le bruit de fond observé ici est homogène avec la littérature de la chimie organique, qui mentionne que l'acide 3-hydroxy-isovalérique en solution aqueuse et à une température de l'ordre de 1000C se décarboxyle lentement en tertio-butanol, lequel se convertit partiellement par déshydratation en isobutylène, suivant un équilibre favorable à la formation de tertio-butanol (Pressman et Luca, J. Am. Chem. Soc. 1940). 10
Effet du co-su bstrat ATP
Conditions de test
100 mM citrate
50 mM KCI 15 10 mM MgCI2
20O mM HIV ( à préciser)
1 mg/ml enzyme purifiée pH 5,5
Incubation à 30°C pendant 72 H 0
Figure imgf000026_0001
Les résultats sont présentés sur la figure 10 et montrent que l'activité enzymatique n'est observée qu'en présence de co-substrat ATP. D'autres molécules, et notamment des molécules contenant une liaison phospho-anhydride, sont susceptibles de constituer des co-substrats efficaces pour l'enzyme. 5
Effet du co-facteur Mq , 2+ Conditions de test 100 mM citrate pH 5,5 50 mM KCI 30 1 O mM ATP
20O mM HIV ( à préciser) pH 5,5 1 mg/ml enzyme purifiée Incubation à 300C pendant 72 H
Figure imgf000027_0001
Les résultats sont présentés sur la figure 11 et montrent que l'activité de l'enzyme est améliorée en présence d'ions Mg 2+. D'autres ions, et notamment d'autres ions divalents, sont susceptibles d'être utilisés comme co-facteur en substitution ou en plus des ions Mg2+.
Activité enzvmatique en fonction de la température Conditions des tests
100 mM tampon
50 mM KCI
1 O mM ATP
20O mM HIV ( à préciser) 1 mg/ml enzyme purifiée
Incubation pendant 72 H à une température variable.
Les résultats présentés sur la figure 12 montrent que l'enzyme est modérément thermoactive et présente un optimum de température d'environ 500C.
Activité en fonction de pH
Conditions des tests 100 m M tampon 5O mM KCI 1 O mM ATP
20O mM HIV ( à préciser) 1 mg/ml enzyme purifiée Incubation à 30°C pendant 72 H
Les conditions optimales a été obtenues à un pH de 5,5, dans 100 mM citrate.
Paramètres enzvmatiques Une gamme de substrat a été réalisée dans les conditions précédemment décrites, avec une incubation à 500C Le Km de l'enzyme est estimé à 40 mM d'HIV
5 Optimisation des conditions réactionnelles
Les conditions réactionnelles optimales ont été recherchées Les conditions suivantes ont été retenues
10 100 m M citrate
50 mM KCI
40 mM ATP
20O mM HIV
1 mg/ml enzyme 15 Incubation à 500C pendant 48 H
Comme montré sur la figure 14, le signal rapport sur bruit de fond est d'environ 100
Exemple 6. Optimisation du niveau d'expression de la MDP décarboxylase de P. torridus dans 0 E. coli
Le niveau d'expression initial dans E coli BL21 était faible, puisque la bande était difficilement visible en SDS-PAGE avant purification Le Codon Optimisation Index (CAI) de la séquence native pour une expression en E coli a été mesuré en utilisant le logiciel « Optimizer » disponible sur 5 http //génomes urv es/QPTIMIZER/, et s'inspirant de la méthode de Sharp et Li (1987) La valeur obtenue était de seulement 0,23, reflétant le niveau d'expression limité de la protéine étudiée dans E coli
Une séquence codant pour une protéine identique, mais ayant des codons mieux adaptés à l'expression dans E coli a été générée Le CAI de cette séquence, 0,77 était plus proche de l'optimum
30 de 1
La séquence native et la séquence optimisée sont présentées SEQ ID NO 17 (Séquence optimisée de la MDP décarboxylase de P torridus (AAT43941 ) incluant le His Tag) et SEQ ID NO 19 (Séquence native de la MDP décarboxylase de P torridus (AAT43941 ) incluant le His Tag) La séquence optimisée a été synthétisée par concaténation d'oligonucléotides, et clonée dans un
35 vecteur d'expression pET25 Après transformation du vecteur dans la souche E coli BL21(DE3) et induction en utilisant le protocole précédemment décrit, les protéines ont été produites, purifiées et analysées sur gel de façon similaire à celle décrite précédemment Le même protocole a été mené avec la séquence native à titre de comparaison Comparaison des niveaux d'expression du candidat 224 en utilisant soit la séquence nucléotidique native soit la séquence optimisée pour l'expression dans E.coli.
Les résultats présentés en Figure 15 montrent que la protéine correspondant au gène optimisé est clairement visible sur gel dans le lysat cellulaire non purifié (piste 4), ce qui traduit un gain d'expression très significatif. La pureté de la protéine après l'étape de purification est également plus importante dans le cas du gène optimisé.
L'activité a été mesurée sur le lysat brut. En effet, cette activité était indétectable sur le lysat brut obtenu avec la séquence nucléique native. L'expression de la protéine a été améliorée de telle manière que le lysat brut obtenu à partir de la séquence nucléique améliorée (clone 224 optimisé) présente maintenant cette activité.
Le milieu réactionnel utilisé dans ce test a été le suivant Milieu réactionnel
Figure imgf000029_0001
Incubation 2 jours à 500C.
Résultats
Condition n°1 : Lysat du clone 224 optimisé
Condition n°2 : Lysat du clone GB6 (plasmide pET vide)
Figure imgf000029_0002
Exemple 7 : procédé de synthèse d'iso-butylène à partir de 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate et conversion en iso-octane. Une réaction identique à celle du flacon 3 de l'exemple 3 est réalisée dans un volume de 1 litre, disposé dans un fermenteur disposant d'un système d'extraction gazeuse. La présence de l'enzyme recombinante induit la conversion du 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate en iso-butylène, qui dégaze naturellement, et est récupéré par un système d'extraction gazeuse situé dans la partie supérieure du fermenteur. L'iso-butylène est ensuite utilisé pour générer de l'iso-octène par addition catalysée par la résine Amberlyst 35wet ou 36wet (Rohm and Haas). L'iso-octène est enfin réduit par hydrogénation catalytique en iso-octane.
Exemple 8 : ingénierie de l'enzyme pour améliorer son efficacité pour les substrats. On utilise la technologie de mutagenèse aléatoire pour générer une banque contenant des milliers de mutants à partir du gène décrit dans l'exemple 1. On intègre ensuite cette banque de mutants dans le plasmide d'expression, et on transforme la banque dans des bactéries compétentes de souche BL21. On isole ensuite un millier de bactéries, qu'on repique dans des tubes eppendorf contenant 500μL de milieu LB supplémenté en ampbilline. On incube ces échantillons dans un agitateur pendant 15 heures. Le lendemain, on mesure la quantité d'iso-butylène produite en utilisant l'un ou l'autre des protocoles expérimentaux présentés dans les exemples précédents.
Les clones présentant une quantité d'iso-butylène significativement augmentée sont ensuite validés de nouveau en utilisant le même protocole expérimental. Une fois validée leur amélioration, le plasmide est extrait de chaque souche améliorée, et séquence. Les mutations à l'origine de l'amélioration d'activité sont identifiées, et combinées sur un même plasmide. Le plasmide contenant les différentes mutations améliorantes est à son tour transformé dans des bactéries compétentes, et le même système d'analyse est effectué.
Le clone combinant les différentes mutations, présentant une activité significativement supérieure à celle ne contenant qu'une seule mutation améliorante, est ensuite utilisé comme base pour un nouveau tour de mutation/criblage, à la recherche de mutants présentant une activité encore améliorée.
A l'issue de ce protocole, le clone contenant plusieurs mutations et ayant la meilleure activité est sélectionné.
Exemple 9 : procédé de synthèse d'éthylène à partir de 3-hydroxy-propionate.
Le gène codant pour l'enzyme décrite dans l'exemple 1 est inséré dans un plasmide permettant l'expression de protéines recombinantes dans une souche d'£. coli. Le plasmide est transformé dans des bactéries de ladite souche. Les bactéries transformantes sont ensuite incubées dans un fermenteur en présence de propyl-diphosphate (10 mg/L) et de 3-hydroxy-propionate (1 g/L). La présence de l'enzyme recombinante induit la conversion du 3-hydroxy-propionate en ethylène, qui dégaze spontanément, et est récupéré par un système d'extraction gazeuse situé dans la partie supérieure du fermenteur. On mesure ensuite la présence d'éthylène dans l'échantillon de gaz correspondant en utilisant un système de chromatographie gazeuse couplée à un détecteur à infra- rouges, partie du spectre dans lequel l'éthylène présente une forte émission.
Exemple 10 : procédé de synthèse de propylène à partir de 3-hydroxy-butyrate.
Le gène codant pour l'enzyme décrite dans l'exemple 1 ou pour une enzyme décrite dans l'exemple 4 est inséré dans un plasmide permettant l'expression de protéines recombinantes dans une souche d'E. coli. Le plasmide est transformé dans des bactéries de ladite souche. Les bactéries transformantes sont ensuite incubées dans un fermenteur en présence d'éthyl-diphosphate (10 mg/L) et de 3-hydroxy-butyrate (1 g/L) (Sigma, référence 166898). La présence de l'enzyme recombinante induit la conversion du 3-hydroxy-butyrate en propylène, qui dégaze spontanément, et est récupéré par un système d'extraction gazeuse situé dans la partie supérieure du fermenteur. On mesure ensuite la présence de propylène dans l'échantillon de gaz correspondant en utilisant un système de chromatographie gazeuse couplée à un détecteur à infra-rouges, partie du spectre dans lequel le propylène présente une forte émission.
Exemple 11 : procédé de synthèse de propylène à partir de glucose.
Le gène codant pour l'enzyme décrite dans l'exemple 1 ou pour une enzyme décrite dans l'exemple 4 est inséré dans un plasmide permettant l'expression de protéines recombinantes dans la bactérie Alcaligenes eutrophus. Le plasmide est transformé dans des bactéries de ladite souche. Les bactéries sont ensuite incubées dans un fermenteur en présence de glucose et d'éthyl- diphosphate et dans des conditions de micro-aérophilie, puis soumise à un stress thermique qui a pour conséquence de leur faire produire de grandes quantités de 3-hydroxy-butyrate. La présence de l'enzyme recombinante induit la conversion simultanée du 3-hydroxy-butyrate en propylène. Le propylène dégaze naturellement, et est récupéré par un système d'extraction gazeuse situé dans la partie supérieure du fermenteur.
Exemple 12 : procédé de synthèse de propylène à partir de glucose.
Le présent exemple décrit un procédé très voisin de celui de l'exemple 11. La différence principale consiste en l'utilisation d'une souche de E. coli modifiée de façon à produire du 3-hydroxy-butyrate et non une souche naturelle telle que Alcaligenes eutrophus. Ladite souche été obtenue par ingénierie de voies métaboliques de façon à aboutir à l'accumulation de 3-hydroxy-butyrate. L'ajout d'une MDP décarboxylase telle que décrite dans l'exemple 1 ou dans l'exemple 4 permet de convertir le 3- hydroxy-butyrate en propylène.
Exemple 13 : procédé de synthèse d'isobutylène à partir de glucose. Le gène codant pour l'enzyme décrite dans l'exemple 1 est inséré dans un plasmide permettant l'expression de protéines recombinantes dans une souche de bactéries E. coli ayant par ailleurs subi des altérations métaboliques de façon à synthétiser de façon endogène du 3-hydroxy-3-méthyl- butyrate. Les bactéries sont ensuite incubées dans un fermenteur en présence de glucose et dans des conditions de micro-aérophilie. La présence de l'enzyme recombinante induit la conversion simultanée du 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate en isobutylène, qui dégaze naturellement et est récupéré par un système d'extraction gazeuse situé dans la partie supérieure du fermenteur.

Claims

Revendications
1. Procédé de production d'un alcène terminal, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de conversion d'un 3-hydroxy-alcanoate par une enzyme présentant une activité décarboxylase.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'un au moins des deux substituants du carbone 2 de l'alcène est un radical alcoyle linéaire ou ramifié.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant une étape de conversion de 3-hydroxy- butyrate en propylène.
4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant une étape de conversion de 3-hydroxy- valérate en 1 -butylène.
5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant une étape de conversion de 3-hydroxy-3- méthyl-butyrate en iso-butylène.
6. Procédé selon la revendication 1 ou 2, comprenant une étape de conversion de 3-hydroxy-3- méthyl-valérate en iso-amylène.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel l'enzyme possède une activité MDP décarboxylase, EC 4.1.1 .33.
8. Procédé selon l'une ou plusieurs des revendications précédentes, dans lequel l'enzyme comprend une séquence en acides aminés choisie parmi SEQ ID Nos 1-16, ou une séquence présentant au moins 15% d'homologie de séquence avec l'une de celles-ci, et de préférence 50, 80 ou 90%.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6, ou d'une séquence présentant au moins 15% d'homologie de séquence avec celle-ci, et de préférence 50, 80 ou 90%.
10. Procédé selon l'une ou plusieurs des revendications précédentes dans lequel l'enzyme est une décarboxylase mutée présentant une activité accrue de conversion d'un ou plusieurs 3-hydroxy- alcanoates en alcène terminal.
11 . Procédé de production d'isobutylène, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de conversion de 3-hydroxy-3-méthyl-butyrate par une enzyme présentant une activité décarboxylase, de préférence une enzyme comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6, ou d'une séquence présentant au moins 15% d'homologie de séquence avec celle-ci, et de préférence 50, 80 ou 90%.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, selon lequel on ajoute à la 5 réaction un co-facteur, de préférence de la famille des phosphoanhydrides, de formule générale R-O- PO2H-O-PO3H2 dans laquelle R est préférentiellement un atome d'hydrogène, un radical méthyle, éthyle ou propyle, et peut également être tout radical alcoyle, linéaire, branché ou cyclique, ou tout autre radical organique monovalent.
10 13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, selon lequel on ajoute à la réaction un co-facteur, de préférence de la famille des mono-ester du méthylène diphosphonate, de formule générale R-O-PO2H-CH2-PO3H2, dans laquelle R est préférentiellement un atome d'hydrogène, un radical méthyle, éthyle ou propyle, et peut également être tout radical alcoyle, linéaire, branché ou cyclique, ou tout autre radical organique monovalent.
15
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, selon lequel la conversion se fait en présence d'un co-substrat, ledit co-substrat étant de préférence un composé contenant un phosphoanhydride, et étant préférentiellement l'ATP, un rNTP, un dNTP ou un mélange de plusieurs de ces molécules, un polyphosphate, ou le pyrophosphate.
20
15. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape de conversion est réalisée in vitro, en système acellulaire.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'étape 25 de conversion est réalisée en présence d'un micro-organisme produisant ladite décarboxylase, de préférence en présence d'un micro-organisme surexprimant ladite décarboxylase, naturelle ou modifiée.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé par l'utilisation 30 d'un mbro-organisme ayant la propriété naturelle ou artificielle de produire un ou plusieurs 3-hydroxy- alcanoates de façon endogène, et exprimant ou surexprimant par ailleurs ladite décarboxylase, naturelle ou modifiée, afin de produire des alcènes terminaux directement à partir d'une source de carbone.
35 18. Procédé selon la revendication 17, où le micro-organisme est une bactérie de souche Alcaligenes eutrophus ou Bacillus megaterium, ou une bactérie, une levure ou un champignon recombinant, de préférence par modification chromosomique ou par transformation plasmidique, de façon à surproduire un ou plusieurs 3-hydroxy-alcanoates.
19. Un procédé selon l'une des revendications 17 ou 18, où la source de carbone est le glucose ou tout autre hexose, le xylose ou tout autre pentose, le glycérol ou tout autre polyol, ou encore l'amidon, la cellulose, l'hémicellulose, un poly-3-hydroxy-alcanoate ou tout autre polymère, le procédé
5 étant alors réalisé en présence d'un système pour dégrader ledit polymère en monomère, comme par exemple une enzyme adaptée (amylase, hémicellulase, cellulase, poly-3-hydroxy-alcanoase) et/ou des conditions chimiques particulières.
20. Procédé selon la revendication 17, caractérisé par l'utilisation d'un micro-organisme 10 photosynthétique, en particulier une cyanobactérie ou une micro-algue, ayant la propriété naturelle ou artificielle de produire un ou plusieurs 3-hydroxy-alcanoates de façon endogène, et surexprimant par ailleurs la décarboxylase, naturelle ou modifiée, afin de produire des alcènes terminaux directement à partir de CO2 présent en solution.
15 21 . Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par l'utilisation d'un premier micro-organisme permettant la transformation d'une source de carbone en 3-hydroxy- alcanoate, et d'une décarboxylase, isolée ou exprimée par un second micro-organisme, permettant la conversion du 3-hydroxy-alcanoate en alcène terminal.
20 22. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par l'utilisation d'organismes multicellulaires, tels que les plantes ou les animaux non humains, exprimant une décarboxylase, pour produire des alcènes terminaux par décarboxylation de 3-hydroxy-alcanoates.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que les organismes multicellulaires ont 25 par ailleurs été modifiés au niveau de certaines voies métaboliques de façon à synthétiser un ou plusieurs 3-hydroxy-alcanoates.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape de collecte gazeuse des alcènes terminaux dégazant de la réaction.
30
25. Procédé selon une ou plusieurs des revendications précédente caractérisé par le fait que le procédé est mené en micro-aérophilie.
26. Utilisation d'une enzyme décarboxylase, ou d'un micro-organisme produisant une 35 décarboxylase, pour la production de composés alcènes terminaux à partir de 3-hydroxy-alcanoates.
27. Utilisation d'une enzyme décarboxylase selon la revendication 26, caractérisée en ce que l'enzyme comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6 ou d'une séquence présentant au moins 15% d'homologie de séquence avec celle-ci, et de préférence 50, 80 ou 90%.
28. Composition comprenant un micro-organisme produisant une décarboxylase, un milieu de culture approprié et un composé 3-hydroxy-alcanoate ou une source de carbone transformable par le micro-organisme en composé 3-hydroxy-alcanoate.
29. Un organisme multicellulaire ou un micro-organisme ayant la propriété naturelle ou artificielle de produire un ou plusieurs 3-hydroxy-alcanoates de façon endogène, et exprimant ou surexprimant par ailleurs une décarboxylase, naturelle ou modifiée, afin de produire des alcènes terminaux directement à partir d'une source de carbone.
30. Les alcènes terminaux synthétisés selon l'une ou plusieurs des revendications précédentes.
31 . Enzyme isolée ou purifiée ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6.
32. Procédé de production d'une enzyme ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6, le procédé comprenant la culture d'un mbroorganisme recombinant comprenant un acide nucléique codant ladite séquence dans des conditions permettant l'expression de cette séquence.
33. Microorganisme recombinant comprenant un acide nucléique codant une enzyme ayant une activité décarboxylase et comprenant tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 6.
PCT/FR2009/051332 2008-07-04 2009-07-06 Production d'alcenes par decarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoïques WO2010001078A2 (fr)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011515586A JP5787756B2 (ja) 2008-07-04 2009-07-06 ３−ヒドロキシアルカン酸の酵素的脱炭酸によるアルケンの製造法
EP09772760.6A EP2304040B1 (fr) 2008-07-04 2009-07-06 Production d'alcenes par decarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoïques
ES09772760.6T ES2647785T3 (es) 2008-07-04 2009-07-06 Producción de alquenos mediante descarboxilación enzimática de ácidos 3-hidroxi-alcanoicos
DK09772760.6T DK2304040T3 (da) 2008-07-04 2009-07-06 Fremstilling af alkener ved enzymatisk decarboxylering af 3-hydroxyalkansyrer
BRPI0914215-0A BRPI0914215B1 (pt) 2008-07-04 2009-07-06 Produção de alcenos por descarboxilação enzimática de ácidos 3-hidróxi-alcanoicos
AU2009265373A AU2009265373B2 (en) 2008-07-04 2009-07-06 Production of alkenes by enzymatic decarboxylation of 3-hydroxyalkanoic acids
PL09772760T PL2304040T3 (pl) 2008-07-04 2009-07-06 Wytwarzanie alkenów za pomocą dekarboksylacji enzymatycznej kwasów 3-hydroksyalkanowych
CA2729187A CA2729187C (fr) 2008-07-04 2009-07-06 Production d'alcenes par decarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoiques
CN200980125840.8A CN102083990B (zh) 2008-07-04 2009-07-06 通过3-羟基烷酸的酶促脱羧制备烯
US13/002,504 US9909146B2 (en) 2008-07-04 2009-07-06 Production of alkenes by enzymatic decarboxylation of 3-hydroxyalkanoic acids
LTEP09772760.6T LT2304040T (lt) 2008-07-04 2009-07-06 Alkenų gamyba, fermentiniu būdu dekarboksilinant 3-hidroksialkano rūgštis
RU2011103650/10A RU2571933C2 (ru) 2008-07-04 2009-07-06 Получение терминальных алкенов с помощью ферментативного декарбоксилирования 3-гидроксиалканоевых кислот

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR0854550 2008-07-04
FR0854550 2008-07-04
US7882408P 2008-07-08 2008-07-08
US61/078,824 2008-07-08

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2010001078A2 true WO2010001078A2 (fr) 2010-01-07
WO2010001078A3 WO2010001078A3 (fr) 2010-07-01
WO2010001078A4 WO2010001078A4 (fr) 2010-09-02

Family

ID=40566143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2009/051332 WO2010001078A2 (fr) 2008-07-04 2009-07-06 Production d'alcenes par decarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoïques

Country Status (13)

Country Link
US (1) US9909146B2 (fr)
EP (1) EP2304040B1 (fr)
JP (2) JP5787756B2 (fr)
CN (1) CN102083990B (fr)
AU (1) AU2009265373B2 (fr)
CA (1) CA2729187C (fr)
DK (1) DK2304040T3 (fr)
ES (1) ES2647785T3 (fr)
LT (1) LT2304040T (fr)
PL (1) PL2304040T3 (fr)
PT (1) PT2304040T (fr)
RU (1) RU2571933C2 (fr)
WO (1) WO2010001078A2 (fr)

Cited By (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011088206A1 (fr) * 2010-01-15 2011-07-21 Mogene Lc Production d'hydrocarbures dans des micro-organismes
WO2012018624A2 (fr) 2010-07-26 2012-02-09 Genomatica, Inc. Microorganismes et procédé de biosynthèse d'hydrocarbures aromatiques 2,4-pentadienoate et 1,3-butadiène
WO2012052427A1 (fr) 2010-10-19 2012-04-26 Global Bioenergies Production d'alcènes par conversion enzymatique combinée d'acides 3-hydroxyalcanoïques
WO2013007786A1 (fr) 2011-07-12 2013-01-17 Scientist Of Fortune S.A. Micro-organisme recombiné pour la production de métabolites utiles
EP2563926A1 (fr) * 2010-04-30 2013-03-06 Genomatica, Inc. Micro-organismes et méthodes de biosynthèse de propylène
EP2578559A1 (fr) 2011-10-07 2013-04-10 Metabolic Explorer Procédé de production d'isobutène à partir d'isobutylamine
US8569562B2 (en) 2009-12-18 2013-10-29 Danisco Us Inc. Purification of isoprene from renewable resources
WO2014005846A1 (fr) * 2012-07-02 2014-01-09 Oxea Gmbh Procédé de préparation de l'acide téréphtalique et des dérivés dudit acide téréphtalique
WO2014064198A1 (fr) 2012-10-25 2014-05-01 Scientist Of Fortune S.A. Production d'alcènes à partir d'acides 3-hydroxy-1-carboxyliques par l'intermédiaire d'acides 3-sulfonyloxy-1-carboxyliques
WO2014085612A1 (fr) * 2012-11-28 2014-06-05 INVISTA North America S.á r.l. Procédés de biosynthèse d'isobutène
WO2014086780A2 (fr) 2012-12-07 2014-06-12 Global Bioenergies Procédé de fermentation perfectionné
WO2014086781A1 (fr) 2012-12-07 2014-06-12 Global Bioenergies Production d'un hydrocarbure par fermentation
WO2013092567A3 (fr) * 2011-12-20 2014-07-17 Scientist Of Fortune S.A. Production de 1,3-diènes par conversion enzymatique de 3-hydroxyalc-4-énoates et/ou de 3-phosphonoxyalc-4-énoates
WO2014152434A2 (fr) 2013-03-15 2014-09-25 Genomatica, Inc. Micro-organismes et procédés de production de butadiène et de composés associés par assimilation de formiate
US9045445B2 (en) 2010-06-04 2015-06-02 Albany Molecular Research, Inc. Glycine transporter-1 inhibitors, methods of making them, and uses thereof
WO2015082447A1 (fr) 2013-12-03 2015-06-11 Global Bioenergies Production d'alcènes à partir d'acides 3-hydroxycarboxyliques par l'intermédiaire d'acides 3-hydroxycarboxyl-nucléotidyliques
WO2016042011A1 (fr) 2014-09-17 2016-03-24 Global Bioenergies Procédé pour la production d'isobutène à partir de 3-méthylcrotonyl-coa
US9422578B2 (en) 2011-06-17 2016-08-23 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
US9422580B2 (en) 2011-06-17 2016-08-23 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
WO2017017124A1 (fr) 2015-07-28 2017-02-02 Global Bioenergies Variants de la kinase hiv
WO2017085167A2 (fr) 2015-11-17 2017-05-26 Global Bioenergies Procédés de production d'isobutène à partir d'acide 3-méthylcrotonique
US9738875B2 (en) 2015-10-13 2017-08-22 Lanzatech New Zealand Limited Genetically engineered bacterium comprising energy-generating fermentation pathway
WO2017162738A1 (fr) 2016-03-22 2017-09-28 Global Bioenergies Procédé de production d'isobutène à partir de 3-méthylcrotonyl-coa
WO2017191239A1 (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Global Bioenergies Variantes de la décarboxylase de l'acide 3-méthylcrotonique (mdc)
US9862973B2 (en) 2013-08-05 2018-01-09 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesis of isoprene
US9938543B2 (en) 2014-06-16 2018-04-10 Invista North America S.A.R.L. Methods, reagents and cells for biosynthesizing glutarate methyl ester
WO2018206262A1 (fr) 2017-05-10 2018-11-15 Global Bioenergies Procédés améliorés de production d'isobutène à partir d'acide 3-méthylcrotonique
US10294496B2 (en) 2013-07-19 2019-05-21 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
EP3502216A1 (fr) 2017-12-21 2019-06-26 Global Bioenergies Composition d'essence permettant de réduire les émissions de particules
WO2020007886A1 (fr) 2018-07-03 2020-01-09 Global Bioenergies Variants de l'acide 3-méthylcrotonique (mdc)
US10533193B2 (en) 2013-08-05 2020-01-14 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesis of isobutene
WO2020021051A1 (fr) 2018-07-27 2020-01-30 Global Bioenergies Procédé de production de fructose-6-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycéraldéhyde-3-phosphate
WO2020188033A1 (fr) 2019-03-20 2020-09-24 Global Bioenergies Moyens et procédés améliorés de production d'isobutène à partir d'acétyl-coa
WO2021063958A1 (fr) 2019-09-30 2021-04-08 Global Bioenergies Moyens et procédés améliorés pour augmenter le rendement d'acétyl-coa à partir du glucose
US11162115B2 (en) 2017-06-30 2021-11-02 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons
WO2021228824A1 (fr) 2020-05-14 2021-11-18 Global Bioenergies Composition cosmétique à base d'isododécane biosourcé et son procédé de préparation
WO2022013375A1 (fr) 2020-07-15 2022-01-20 Global Bioenergies Composition cosmétique à base d'isododécane présentant une teneur élévée en 2,2,4,6,6-pentaméthylheptane
WO2022136207A1 (fr) 2020-12-21 2022-06-30 Global Bioenergies Moyens et procédés améliorés pour la production d'isobutène à partir d'acide 3-méthylcrotonique
WO2022207684A1 (fr) 2021-03-31 2022-10-06 Global Bioenergies Variants de la décarboxylase de l'acide 3-méthylcrotonique (mdc)
US11505809B2 (en) 2017-09-28 2022-11-22 Inv Nylon Chemicals Americas Llc Organisms and biosynthetic processes for hydrocarbon synthesis
EP4144838A1 (fr) 2021-09-06 2023-03-08 Global Bioenergies Organismes produisant moins d'acide crotonique
WO2023031482A1 (fr) 2021-09-06 2023-03-09 Global Bioenergies Organismes produisant moins d'acide crotonique
US11634733B2 (en) 2017-06-30 2023-04-25 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, materials, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons and derivatives thereof
WO2023110750A1 (fr) 2021-12-13 2023-06-22 Global Bioenergies Variants d'acyl-coa hydrolase
EP4389904A2 (fr) 2014-07-03 2024-06-26 Genomatica, Inc. Micro-organismes pour la production de composés 4c-5c avec insaturation et procédés associés

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2639564C2 (ru) 2011-12-16 2017-12-21 Браскем С.А. Модифицированные микроорганизмы и способы получения бутадиена с их применением
EP2859105B1 (fr) * 2012-06-11 2018-02-14 Shell Internationale Research Maatschappij B.V. Procédé enzymatique de préparation d'hydrocarbures
DE102012105879A1 (de) 2012-07-02 2014-01-02 Oxea Gmbh Verfahren zur Herstellung von Isononylderivaten
DE102012105874A1 (de) 2012-07-02 2014-01-02 Oxea Gmbh Verfahren zur Herstellung von Isononansäurevinylestern
DE102012105877A1 (de) * 2012-07-02 2014-01-02 Oxea Gmbh Verfahren zur Herstellung von Diisobuten
DE102012105878A1 (de) 2012-07-02 2014-01-02 Oxea Gmbh Verfahren zur Herstellung von Isopentanderivaten
JP5638041B2 (ja) 2012-07-25 2014-12-10 住友ゴム工業株式会社 タイヤ用ゴム組成物、タイヤ部材、及び空気入りタイヤ
JP5536840B2 (ja) 2012-09-07 2014-07-02 住友ゴム工業株式会社 タイヤ用ゴム組成物、タイヤ部材、及び空気入りタイヤ
ES2824029T3 (es) * 2013-07-09 2021-05-11 Global Bioenergies Variantes de mevalonato difosfato descarboxilasa
MA40644A (fr) * 2014-09-17 2016-03-24 Global Bioenergies Procédés pour produire de l'acide 3-hydroxy-3-méthylbutyrique
CN109996865B (zh) 2016-07-12 2023-02-03 布拉斯肯有限公司 通过烷醇的酶促脱水形成烯烃
EP3720944A1 (fr) 2017-12-07 2020-10-14 Zymergen Inc. Voies de biosynthèse manipulées pour la production de (6e)-8-hydroxygéraniol par fermentation
EP3728212A1 (fr) 2017-12-21 2020-10-28 Zymergen Inc. Népétalactol oxydoréductases, népétalactol synthases et microbes capables de produire une népétalactone
CN109251940B (zh) * 2018-10-30 2020-10-16 浙江华睿生物技术有限公司 一种产β-羟基-β-甲基丁酸工程菌的构建方法
JP2022179159A (ja) 2021-05-21 2022-12-02 住友ゴム工業株式会社 キャップトレッド及び乗用車タイヤ
JP2022179157A (ja) 2021-05-21 2022-12-02 住友ゴム工業株式会社 キャップトレッド及び乗用車タイヤ
JP2022179158A (ja) 2021-05-21 2022-12-02 住友ゴム工業株式会社 乗用車タイヤ用ゴム組成物及び乗用車タイヤ

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0178153A2 (fr) * 1984-10-09 1986-04-16 Hideo Fukuda Méthode de production de mélanges d'hydrocarbures
EP0205303A2 (fr) * 1985-06-06 1986-12-17 Hideo Fukuda Méthode microbiologique de production d'éthylène
WO2002099095A2 (fr) * 2001-06-06 2002-12-12 Roche Vitamins Ag Production amelioree d'isoprenoides

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05336981A (ja) * 1992-06-10 1993-12-21 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 光学活性なβ−ヒドロキシ酸の製造方法
US6998471B2 (en) * 2001-07-25 2006-02-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Polynucleotides encoding an acetyl-CoA acetyltransferase from Hevea brasiliensis, related products, and methods
TW200508393A (en) * 2003-01-20 2005-03-01 Kaneka Corp Method of collecting highly pure polyhydroxyalkanoate from microbial cells
EP1778843B1 (fr) * 2004-08-19 2012-09-19 DSM IP Assets B.V. Production d'isoprenoïdes

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0178153A2 (fr) * 1984-10-09 1986-04-16 Hideo Fukuda Méthode de production de mélanges d'hydrocarbures
EP0205303A2 (fr) * 1985-06-06 1986-12-17 Hideo Fukuda Méthode microbiologique de production d'éthylène
WO2002099095A2 (fr) * 2001-06-06 2002-12-12 Roche Vitamins Ag Production amelioree d'isoprenoides

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 66, no. 4, April 2000 (2000-04-01), pages 1311 - 1320, ISSN: 0099-2240 *
DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 1977, WATANABE T ET AL: "AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF AN ETHYLENE SYNTHESIZING ENZYME FROM RED ALGA PORPHYRA-TENERA ON AN IMMOBILIZED INHIBITOR OF ETHYLENE EVOLUTION", XP002579930, Database accession no. PREV197764059311 *
DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; April 2000 (2000-04-01), REN QUN ET AL: "Properties of engineered poly-3-hydroxyalkanoates produced in recombinant Escherichia coli strains", XP002579931, Database accession no. PREV200000216573 *
DATABASE UniProt [online] 5 July 2004 (2004-07-05), XP002579929, Database accession no. Q6KZB1_PICTO *
FÜTTERER O ET AL: "Genome sequence of Picrophilus torridus and its implications for life around pH 0.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, vol. 101, no. 24, 15 June 2004 (2004-06-15), pages 9091 - 9096, XP002583295, ISSN: 0027-8424, DOI: doi:10.1073/PNAS.0401356101 *
JABALQUINTO A M ET AL: "Substrate binding order in mevalonate 5-diphosphate decarboxylase from chicken liver", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA - PROTEIN STRUCTURE AND MOLECULAR ENZYMOLOGY, vol. 996, no. 3, 6 July 1989 (1989-07-06), ELSEVIER SCIENCE BV, AMSTERDAM, NL, pages 257 - 259, XP023579897, ISSN: 0167-4838, [retrieved on 19890706] *
MEIER I K ET AL: "Olefin synthesis by vanadium(V)-induced oxidative decarboxylation- deoxygenation of 3-hydroxy carboxylic acids", JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 55, 1 January 1990 (1990-01-01), AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, EASTON.; US, pages 5619 - 5624, XP002249270, ISSN: 0022-3263 *
PLANT AND CELL PHYSIOLOGY, vol. 18, no. 2, 1977, pages 387 - 392, ISSN: 0032-0781 *
SHIMOKAWA K ET AL: "The role of beta-hydroxy propionate in ethylene biosynthesis, part 2. Ethylene formation from propionate-2-carbon-14 in banana pulp slices and homogenates", AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 34, no. 11, 1970, pages 1640 - 1645, XP002526028, ISSN: 0002-1369 *
STINSON R A ET AL: "Beta-alanine as an ethylene precursor. Investigations towards preparation, and properties, of a soluble enzyme system from a subcellular particulate fraction of bean cotyledons", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 44, no. 9, 1969, ROCKVILLE, Maryland (US), pages 1217 - 1226, XP002526026, ISSN: 0032-0889 *
THOMPSON J E AND SPENCER M: "Preparation and properties of an enzyme system for ethylene production", NATURE, vol. 210, no. 5036, 7 May 1966 (1966-05-07), LONDON (U.K.), pages 595 - 597, XP002526027 *
TOTH M J ET AL: "Molecular cloning and expression of the cDNAs encoding human and yeast mevalonate pyrophosphate decarboxylase.", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 271, no. 14, 5 April 1996 (1996-04-05), AMERICAN SOCIETY OF BIOLOCHEMICAL BIOLOGISTS, BIRMINGHAM, US, pages 7895 - 7898, XP000612170, ISSN: 0021-9258 *

Cited By (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8569562B2 (en) 2009-12-18 2013-10-29 Danisco Us Inc. Purification of isoprene from renewable resources
US9751820B2 (en) 2009-12-18 2017-09-05 Danisco Us Inc. Purification of isoprene from renewable resources
WO2011088206A1 (fr) * 2010-01-15 2011-07-21 Mogene Lc Production d'hydrocarbures dans des micro-organismes
US8637283B2 (en) 2010-01-15 2014-01-28 Mogene Lc Production of hydrocarbons in microorganisms
US9023636B2 (en) 2010-04-30 2015-05-05 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of propylene
EP2563926A1 (fr) * 2010-04-30 2013-03-06 Genomatica, Inc. Micro-organismes et méthodes de biosynthèse de propylène
EP2563926A4 (fr) * 2010-04-30 2013-11-20 Genomatica Inc Micro-organismes et méthodes de biosynthèse de propylène
US9045445B2 (en) 2010-06-04 2015-06-02 Albany Molecular Research, Inc. Glycine transporter-1 inhibitors, methods of making them, and uses thereof
US10793882B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of aromatics, 2,4-pentadienoate and 1,3-butadiene
EP3312284A2 (fr) 2010-07-26 2018-04-25 Genomatica, Inc. Micro-organismes et procédés pour la biosynthèse de composés aromatiques, 2,4-pentadienoate et 1,3-butadiène
US9556461B2 (en) 2010-07-26 2017-01-31 Genomatica, Inc. Microorganisms and methods for the biosynthesis of aromatics, 2,4-pentadienoate and 1,3-butadiene
WO2012018624A2 (fr) 2010-07-26 2012-02-09 Genomatica, Inc. Microorganismes et procédé de biosynthèse d'hydrocarbures aromatiques 2,4-pentadienoate et 1,3-butadiène
EP2607340A1 (fr) 2010-07-26 2013-06-26 Genomatica, Inc. Microorganismes et procédé de biosynthèse d'hydrocarbures aromatiques 2,4-pentadienoate et 1,3-butadiène
AU2011317682B2 (en) * 2010-10-19 2015-01-22 Global Bioenergies Production of alkenes by combined enzymatic conversion of 3-hydroxyalkanoic acids
RU2609656C2 (ru) * 2010-10-19 2017-02-02 Глобаль Биоэнержи Способ получения алкенов путем комбинированного ферментативного превращения 3-гидроксиалкановых кислот
JP2014501495A (ja) * 2010-10-19 2014-01-23 グローバル・バイオエナジーズ ３−ヒドロキシアルカン酸の組合わせ酵素変換によるアルケンの製造
CN103261410B (zh) * 2010-10-19 2018-05-11 环球生物能源公司 通过3-羟基链烷酸的组合酶促转化来产生烯
US9193978B2 (en) 2010-10-19 2015-11-24 Scientist of Fortune, S.A. Production of alkenes by combined enzymatic conversion of 3-hydroxyalkanoic acids
KR20140023250A (ko) * 2010-10-19 2014-02-26 글로벌 바이오에너지스 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조
KR101883511B1 (ko) * 2010-10-19 2018-07-30 글로벌 바이오에너지스 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조
WO2012052427A1 (fr) 2010-10-19 2012-04-26 Global Bioenergies Production d'alcènes par conversion enzymatique combinée d'acides 3-hydroxyalcanoïques
CN103261410A (zh) * 2010-10-19 2013-08-21 环球生物能源公司 通过3-羟基链烷酸的组合酶促转化来产生烯
US9663801B2 (en) 2011-06-17 2017-05-30 Invista North America S.A.R.L. Methods of producing four carbon molecules
US9422580B2 (en) 2011-06-17 2016-08-23 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
US9422578B2 (en) 2011-06-17 2016-08-23 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
WO2013007786A1 (fr) 2011-07-12 2013-01-17 Scientist Of Fortune S.A. Micro-organisme recombiné pour la production de métabolites utiles
RU2658770C2 (ru) * 2011-07-12 2018-06-22 Сайентист Оф Фортчун С.А. Рекомбинантный микроорганизм для получения полезных метаболитов
JP2014520539A (ja) * 2011-07-12 2014-08-25 サイエンティスト・オブ・フォーチュン・ソシエテ・アノニム 有用な代謝産物の生産のための組み換え微生物
EP3031911A1 (fr) 2011-07-12 2016-06-15 Scientist of Fortune S.A. Micro-organisme recombinant pour la production de métabolites utiles
EP2578559A1 (fr) 2011-10-07 2013-04-10 Metabolic Explorer Procédé de production d'isobutène à partir d'isobutylamine
WO2013092567A3 (fr) * 2011-12-20 2014-07-17 Scientist Of Fortune S.A. Production de 1,3-diènes par conversion enzymatique de 3-hydroxyalc-4-énoates et/ou de 3-phosphonoxyalc-4-énoates
AU2012357857B2 (en) * 2011-12-20 2016-01-21 Scientist Of Fortune S.A. Production of 1,3-dienes by enzymatic conversion of 3-hydroxyalk-4-enoates and/or 3-phosphonoxyalk-4-enoates
US9873895B2 (en) 2011-12-20 2018-01-23 Scientist Of Fortune S.A. Production of 1,3-dienes by enzymatic conversion of 3-hydroxyalk 4-enoates and/or 3-phosphonoxyalk-4-enoates
WO2014005846A1 (fr) * 2012-07-02 2014-01-09 Oxea Gmbh Procédé de préparation de l'acide téréphtalique et des dérivés dudit acide téréphtalique
WO2014064198A1 (fr) 2012-10-25 2014-05-01 Scientist Of Fortune S.A. Production d'alcènes à partir d'acides 3-hydroxy-1-carboxyliques par l'intermédiaire d'acides 3-sulfonyloxy-1-carboxyliques
WO2014085612A1 (fr) * 2012-11-28 2014-06-05 INVISTA North America S.á r.l. Procédés de biosynthèse d'isobutène
US9777295B2 (en) 2012-11-28 2017-10-03 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesis of isobutene
WO2014086781A1 (fr) 2012-12-07 2014-06-12 Global Bioenergies Production d'un hydrocarbure par fermentation
WO2014086780A2 (fr) 2012-12-07 2014-06-12 Global Bioenergies Procédé de fermentation perfectionné
WO2014152434A2 (fr) 2013-03-15 2014-09-25 Genomatica, Inc. Micro-organismes et procédés de production de butadiène et de composés associés par assimilation de formiate
US10294496B2 (en) 2013-07-19 2019-05-21 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene
US10538789B2 (en) 2013-08-05 2020-01-21 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesis of isoprene
US9862973B2 (en) 2013-08-05 2018-01-09 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesis of isoprene
US10533193B2 (en) 2013-08-05 2020-01-14 Invista North America S.A.R.L. Methods for biosynthesis of isobutene
CN105940111A (zh) * 2013-12-03 2016-09-14 环球生物能源公司 从3-羟基羧酸经3-羟基羧基-核苷酸制备烯烃
WO2015082447A1 (fr) 2013-12-03 2015-06-11 Global Bioenergies Production d'alcènes à partir d'acides 3-hydroxycarboxyliques par l'intermédiaire d'acides 3-hydroxycarboxyl-nucléotidyliques
CN105940111B (zh) * 2013-12-03 2020-03-27 环球生物能源公司 从3-羟基羧酸经3-羟基羧基-核苷酸制备烯烃
AU2014359396B2 (en) * 2013-12-03 2018-06-14 Global Bioenergies Production of alkenes from 3-hydroxycarboxylic acids via 3-hydroxycarboxyl-nucleotidylic acids
US10017787B2 (en) 2013-12-03 2018-07-10 Global Bioenergies Production of alkenes from 3-hydroxycarboxylic acids via 3-hydroxycarboxyl-nucleotidylic acids
US9938543B2 (en) 2014-06-16 2018-04-10 Invista North America S.A.R.L. Methods, reagents and cells for biosynthesizing glutarate methyl ester
EP4389904A2 (fr) 2014-07-03 2024-06-26 Genomatica, Inc. Micro-organismes pour la production de composés 4c-5c avec insaturation et procédés associés
WO2016042011A1 (fr) 2014-09-17 2016-03-24 Global Bioenergies Procédé pour la production d'isobutène à partir de 3-méthylcrotonyl-coa
WO2017017124A1 (fr) 2015-07-28 2017-02-02 Global Bioenergies Variants de la kinase hiv
US9738875B2 (en) 2015-10-13 2017-08-22 Lanzatech New Zealand Limited Genetically engineered bacterium comprising energy-generating fermentation pathway
US9957531B1 (en) 2015-10-13 2018-05-01 Lanzatech New Zealand Limited Genetically engineered bacterium for the production of 3-hydroxybutyrate
EP3901267A1 (fr) 2015-10-13 2021-10-27 Lanzatech New Zealand Limited Bactérie génétiquement modifiée comprenant une voie de fermentation à production d'énergie
WO2017085167A2 (fr) 2015-11-17 2017-05-26 Global Bioenergies Procédés de production d'isobutène à partir d'acide 3-méthylcrotonique
WO2017162738A1 (fr) 2016-03-22 2017-09-28 Global Bioenergies Procédé de production d'isobutène à partir de 3-méthylcrotonyl-coa
WO2017191239A1 (fr) 2016-05-04 2017-11-09 Global Bioenergies Variantes de la décarboxylase de l'acide 3-méthylcrotonique (mdc)
WO2018206262A1 (fr) 2017-05-10 2018-11-15 Global Bioenergies Procédés améliorés de production d'isobutène à partir d'acide 3-méthylcrotonique
US11634733B2 (en) 2017-06-30 2023-04-25 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, materials, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons and derivatives thereof
US11162115B2 (en) 2017-06-30 2021-11-02 Inv Nylon Chemicals Americas, Llc Methods, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons
US11505809B2 (en) 2017-09-28 2022-11-22 Inv Nylon Chemicals Americas Llc Organisms and biosynthetic processes for hydrocarbon synthesis
EP3502216A1 (fr) 2017-12-21 2019-06-26 Global Bioenergies Composition d'essence permettant de réduire les émissions de particules
WO2020007886A1 (fr) 2018-07-03 2020-01-09 Global Bioenergies Variants de l'acide 3-méthylcrotonique (mdc)
WO2020021051A1 (fr) 2018-07-27 2020-01-30 Global Bioenergies Procédé de production de fructose-6-phosphate à partir de dihydroxyacétone phosphate et de glycéraldéhyde-3-phosphate
WO2020188033A1 (fr) 2019-03-20 2020-09-24 Global Bioenergies Moyens et procédés améliorés de production d'isobutène à partir d'acétyl-coa
WO2021063958A1 (fr) 2019-09-30 2021-04-08 Global Bioenergies Moyens et procédés améliorés pour augmenter le rendement d'acétyl-coa à partir du glucose
FR3110081A1 (fr) 2020-05-14 2021-11-19 Global Bioenergies Composition cosmétique à base d’isododécane biosourcé et son procédé de préparation
WO2021228824A1 (fr) 2020-05-14 2021-11-18 Global Bioenergies Composition cosmétique à base d'isododécane biosourcé et son procédé de préparation
WO2022013375A1 (fr) 2020-07-15 2022-01-20 Global Bioenergies Composition cosmétique à base d'isododécane présentant une teneur élévée en 2,2,4,6,6-pentaméthylheptane
FR3112477A1 (fr) 2020-07-15 2022-01-21 Global Bioenergies Composition cosmétique à base d’isododécane présentant une teneur élévée en 2,2,4,6,6-pentaméthylheptane
WO2022136207A1 (fr) 2020-12-21 2022-06-30 Global Bioenergies Moyens et procédés améliorés pour la production d'isobutène à partir d'acide 3-méthylcrotonique
WO2022207684A1 (fr) 2021-03-31 2022-10-06 Global Bioenergies Variants de la décarboxylase de l'acide 3-méthylcrotonique (mdc)
EP4144838A1 (fr) 2021-09-06 2023-03-08 Global Bioenergies Organismes produisant moins d'acide crotonique
WO2023031482A1 (fr) 2021-09-06 2023-03-09 Global Bioenergies Organismes produisant moins d'acide crotonique
WO2023110750A1 (fr) 2021-12-13 2023-06-22 Global Bioenergies Variants d'acyl-coa hydrolase

Also Published As

Publication number Publication date
RU2571933C2 (ru) 2015-12-27
AU2009265373B2 (en) 2013-10-17
JP5787756B2 (ja) 2015-09-30
JP2015142577A (ja) 2015-08-06
CA2729187C (fr) 2016-04-19
WO2010001078A3 (fr) 2010-07-01
US20110165644A1 (en) 2011-07-07
DK2304040T3 (da) 2017-11-27
EP2304040B1 (fr) 2017-09-06
US9909146B2 (en) 2018-03-06
CN102083990A (zh) 2011-06-01
AU2009265373A1 (en) 2010-01-07
PT2304040T (pt) 2017-11-21
CA2729187A1 (fr) 2010-01-07
ES2647785T3 (es) 2017-12-26
CN102083990B (zh) 2016-05-04
JP2011526489A (ja) 2011-10-13
PL2304040T3 (pl) 2018-01-31
EP2304040A2 (fr) 2011-04-06
WO2010001078A4 (fr) 2010-09-02
RU2011103650A (ru) 2012-08-10
BRPI0914215A2 (pt) 2016-01-05
LT2304040T (lt) 2017-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2304040B1 (fr) Production d'alcenes par decarboxylation enzymatique d'acides 3-hydroxy-alcanoïques
KR101883511B1 (ko) 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조
US20180023097A1 (en) Methods of producing four carbon molecules
AU2011317682A1 (en) Production of alkenes by combined enzymatic conversion of 3-hydroxyalkanoic acids
RU2710714C2 (ru) Композиции и способы для биологического получения лактата из с1-соединений с применением трансформантов лактат дегидрогеназы
KR20150036502A (ko) 바이오리파이너리 시스템, 이의 방법 및 조성물
KR20100119877A (ko) 단리된 알코올 디하이드로게나제 효소 및 이의 용도
KR102311152B1 (ko) 메탄으로부터 3-하이드록시부티레이트-3-하이드록시프로피오네이트 공중합체(poly(3HB-co-3HP)) 생산능을 가지는 형질전환 메탄자화균 및 이를 이용한 3-하이드록시부티레이트-3-하이드록시프로피오네이트 공중합체의 제조방법
KR101957471B1 (ko) 신규한 베타-아가레이즈 생산 유전자를 이용한 네오아가로바이오스 또는 네오아가로테트라오스의 효소적 생산방법
RU2375451C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕНЫ СИНТЕЗА БУТАНОЛА ИЗ Clostridium acetobutylicum (ВАРИАНТЫ), РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Lactobacillus brevis - ПРОДУЦЕНТ Н-БУТАНОЛА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА Н-БУТАНОЛА
US20120015414A1 (en) Production of organic compounds
US20240102057A1 (en) Methods and compositions useful for the production of 4-vinylphenol
EP4144838A1 (fr) Organismes produisant moins d'acide crotonique
Locker Engineering Cupriavidus necator H16 for 3-hydroxypropionic acid production
CN117836419A (zh) 转导免疫细胞的方法
Wojcik Metabolic engineering for gaseous biofuels production
BRPI0914215B1 (pt) Produção de alcenos por descarboxilação enzimática de ácidos 3-hidróxi-alcanoicos
Verhagen et al. Key Role for Sulfur in Peptide Metabolism

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980125840.8

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09772760

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2729187

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009265373

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2011515586

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 7/CHENP/2011

Country of ref document: IN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2009772760

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009772760

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2009265373

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20090706

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011103650

Country of ref document: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13002504

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0914215

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20110104