WO2009155727A2 - Formulaciones de entrega lenta a base de extractos de quillay para el control de la enfermedad mal de pie en trigo - Google Patents

Formulaciones de entrega lenta a base de extractos de quillay para el control de la enfermedad mal de pie en trigo Download PDF

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WO2009155727A2
WO2009155727A2 PCT/CL2009/000003 CL2009000003W WO2009155727A2 WO 2009155727 A2 WO2009155727 A2 WO 2009155727A2 CL 2009000003 W CL2009000003 W CL 2009000003W WO 2009155727 A2 WO2009155727 A2 WO 2009155727A2
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control
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fungus
foot
gaeumannomyces
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Gastón Eduardo APABLAZA HIDALGO
Ernesto Antonio Moya Elizondo
Guillermo AGUIAR MÉNDEZ
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Pontificia Universidad Católica De Chile
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]

Definitions

  • the present invention relates to natural fungicides used in the treatment of seeds or soil treatment, which were obtained from the formulation of quillay extracts, rich in concentrations of saponins, to which synthetic polymers (latex and resins) that allow its slow delivery in the soil, and that have been proven in its effectiveness of control over the Gaeumannomyces graminis fungus, which causes wheat foot disease, at the level of potted and field experiments.
  • the work carried out within the framework of the COPEC-UC project has determined, under Vito conditions, the effectiveness of control of quillay saponins at concentrations greater than or equal to 100 ppm in the culture medium, and a fungistatic effect of lower concentrations of saponins
  • studies of optical and electronic microscopy allowed us to observe a lysis and disorganization effect of quillay extracts on the rhizoids of Gaeumannomyces graminis, (see, Fig. 1).
  • Control response curves have also been established at different concentrations of saponins in culture medium, for different isolates of the fungus and with various products extracted from the quillay.
  • these inventions allow expanding the marketing possibilities of quillay extracts, which have already been used successfully in agriculture as a product applied to the soil.
  • This product due to its natural product characteristics, is specially indicated to integrate Integrated Management Programs, and is certified to be used in organic productions, as well as its production process, which received a mention of Merit in the National Prize for Ia Agricultural Innovation in 1999 and that was patented.
  • formulations developed would have a lower cost than the chemical treatments on the market, so they can be transformed into an alternative treatment for traditional farmers.
  • Figure 3 Results of infection according to the Mal foot index (TAI) obtained in the evaluation of different doses of SRL 14, a sawdust strengthened with quillay extract, and QL 1000 as seed treatment with respect to a commercial control (Latitude® ia Silthiofam, Monsanto), an uninoculated control (s / i) and an inoculated control (c / i). Green columns present the best treatments.
  • Figure 4 Results of the evaluation of the control effect of SRL 25, SRL 70 GIB and different doses of SRL 14 on Ggt in wheat with respect to a commercial control (Latitude® ia Silthiofam, Monsanto), an uninoculated control (s / i ) and an inoculated control (c / i). Sowing Date: 03/23/2005. Green columns present the best treatments.
  • TAI Mal foot index
  • FIG. 5 Results of infection according to the Mal foot index (TAI) obtained in the evaluation of different slow-release "Slow relée” formulations with respect to a commercial control (Latitude® ia Silthiofam, Monsanto), an uninoculated control (s / i) and an inoculated witness (c / i). Sowing date 03/30/2005. Green columns present the best treatments.
  • TAI Mal foot index
  • FIG 7 Result of infection according to the Mal Mali infection index (TAI), to evaluate the effect of different concentrations of saponins present in quillay extracts QL 1000 used to prepare SRL 25 formulations. Saponin concentrations present in QL 1000 used in the preparation of SRL 25 are shown in brackets.
  • TAI Mal Mali infection index
  • Figure 8 Curves adjustment for the first experiment to evaluate the behavior of leaching of saponins from treated seeds, by measuring foam height during 16 cycles of washing in quartz leaching columns.
  • Figure 9 Curves adjustment for the second experiment to evaluate the behavior of leaching of saponins from treated seeds, by measuring foam height during 16 cycles of washing in quartz leaching columns.
  • Figure 10 Observation of mycelium treated with a dose of 0 ppm of saponins, treated with a dose of 50, 100 and 500 ppm of saponins. Deformation of hyphae in the mycelium of Ggt, ruptures in the joining membranes of the mycelial cords between hyphae of the fungus.
  • Figure 11 Approach in 15,000 times to the mycelium of Ggt treated with a dose of 50 ppm of saponins, where deformation and thinning of hyphae in the mycelium of Ggt and breaks in the connection membranes of the mycelial cords between hyphae of Ggt treated with a dose of 100 ppm saponins and increased by 15,000 times.
  • the invention essentially corresponds to six formulations, two SRL 25 formulations, which is a mixture of latex plus QL 1000 extract, oven dried and, its SRL 25 Dust variant using QP 1000, which corresponds to QL 1000 powder, dried Spray.
  • the formulations of this SRL Plus correspond to the same formulation of SRL 25, but with aggregations of vegetable hormones (indole butyric acid) and fertilizers (nitrogen, phosphorus and potassium).
  • the fourth product of this SRL VAX Plus group corresponds to the mixture of Vax Sap (powder formulation with 83% quillay saponins) with latex, plus the aggregations described above in SRL Plus.
  • the last products correspond to two formulations used as treatments applied to the soil that are a powder formulation based on keel extracts mixed with a polymer -urea formaldehyde- (SRL 14) and another in granules or pellets in latex mixture with a clay Bentonite (SRL 14B Gran). All these formulations correspond to natural fungicides based on quillay extracts for the control of bad foot in wheat that have a conformation that allows a slow delivery of the quillay saponins in the soil.
  • SRL 25, SRL 25 Dust, SRL Plus and SRL VAX Plus formulations are concentrated liquid suspensions that are used as seed treatment.
  • SRL 25 has 3.85% saponins in the suspension, and is obtained by mixing 66.19% of Mowilith DM 530 latex (polymeric aqueous dispersion of vinyl acetate and an ester of acrylic acid, free of plasticizers , with a solids concentration of 50%) with 17.99% of the QL 1000 extract (Quillay concentrated aqueous extract, dark brown, sweet to the touch and a slight caramel smell. With a concentration of 42% w / p of soluble solids and 9% w / w of saponins), oven drying, and 15.83% water. Drying of QL 1000 extract It allows the saponins to be concentrated in approximately 21.4% w / w of saponins and is obtained by the following operations.
  • Mowilith DM 530 latex polymeric aqueous dispersion of vinyl acetate and an ester of acrylic acid, free of plasticizers , with a solids concentration of 50%
  • QL 1000 extract Quillay concentrated aqueous extract,
  • the plates with the QL 1000 are placed in an oven at a regulated temperature of 105 +/- 1 0 C. In this step it is critical that the thermostat of the stove works properly, because if the temperature rises uncontrollably the risk of that the saponins or other products present in the QL 1000 break down and become unusable.
  • the first step is to weigh the powder of QL1000 in a container. The water is then added, and mixed until all the powder is well moistened but not necessarily dissolved, then the Mowilith DM 530 latex is slowly added, and everything is mixed with a glass rod. When the dried QL 1000 is mixed with the latex, the saponins precipitate, by a simple solvent change effect. This process must be done slowly and with agitation to avoid the formation of agglomerations of solids that can precipitate or separate into phases.
  • the proportions of products required to prepare 100 g of SRL 25 composition are described below:
  • SRL 25 Dust has a similar content of saponins (3.85%) than SRL 25, and in turn it follows the same procedure of preparation and concentrations of adjuvants in The mixture described above.
  • the formulation uses QP 1000, instead of QL 1000 powder.
  • QP 1000 corresponds to a fine powder with a concentration of 21.4% w / w saponins, chocolate colored, slightly hygroscopic, irritating to the nasal mucous membranes with great sneezing effect, very soluble in water with which it forms dark and transparent solutions similar to QL 1000.
  • QP 1000 is obtained from the aqueous extracts of keel and subjected to a spray drying process, so that this powder It consists of the solids dissolved in the QL 1000.
  • the spray drying process is a technology developed by Natural Response SA
  • the QL 1000 dried by the procedure described above, and the QP 1000 behave very differently when incorporated into the polymeric latex. While the QL1000 powder forms stable, creamy-looking suspensions, the suspensions of the QP 1000 tend to separate in phases, the solids separate from the liquid and form lumps. In both cases, if the suspension is allowed to stand for a while, its viscosity increases considerably, but in the case of the QL 1000 powder when it is again stirred, the mixture again becomes fluid and creamy, instead with the QP 1000 at stirring only occurs the separation of the liquid from the solids, which makes the production of SRL 25 Dust somewhat difficult.
  • SRL Plus has 3.85% saponins, with a 17.99% extract of dried QL 1000 or QP1000, 68, 92% of Mowilith DM 530 latex and a water ratio of 14.42%, in which it is added Ia vegetable hormone indole butyric acid (AIB), in a concentration of 100 ⁇ M (784 ⁇ L of an AIB solution at a concentration of 1500 ppm in 65 grams of the solution), and fertilizing salts that provide nitrate, phosphate and potassium.
  • AIB Ia vegetable hormone indole butyric acid
  • the salts used were potassium di-hydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ) and potassium nitrate (KNO 3 ), each applied in a proportion that corresponds to 0.86% of the concentrated suspension (approximately 0.5 g per 65g of the mixture).
  • KH 2 PO 4 potassium di-hydrogen phosphate
  • KNO 3 potassium nitrate
  • KH 2 PO 4 and KNO 3 are weighed in containers and both are joined in one of the containers and diluted in a part of the quantity of grams of distilled water required. The dissolution process is accelerated by placing the container in hot water. • Once the solution is completed, it is allowed to cool
  • the SRL VAX Plus product is prepared in a similar way as SRL 25 Plus and contains the same additional ingredients described for it. This is different because it uses Vax Sap Ia which is a powder formulation with 83% quillay saponins in its formulation, which increases the concentration of saponins to 12.4% in the product. The proportions of each compound of the formulation vary slightly with those described above, SRL VAX Plus uses 14.94% of Vax Sap, 69.72% of Mowilith DM 530 Latex, 15.34% of water, which contains the AIB (100 ⁇ M) and KH 2 PO 4 and KNO3 in a proportion of each of 0.97% of the total product composition.
  • Vax Sap Ia is a powder formulation with 83% quillay saponins in its formulation, which increases the concentration of saponins to 12.4% in the product.
  • the proportions of each compound of the formulation vary slightly with those described above, SRL VAX Plus uses 14.94% of Vax Sap, 69.72% of Mowilith DM 530 Latex, 15.
  • Vax Sap is a very fine cream-colored powder very irritating to the nasal mucous membranes with great stomudogenic effect, very soluble in water with which it forms clear and transparent solutions.
  • VaxSap is obtained by subjecting successive stages of purification of Quillay extracts until an almost white solid is obtained that has 83% saponins. Due to this refinement VaxSap is a high cost product that was used more with a comparative interest than commercial, since it allowed to use almost pure saponins in the formulations. Through its use it is possible to obtain formulations with a high polymeric load and a greater proportion of saponins.
  • SRL 14 is a powder formulation with 6.92% saponins, which is obtained by the combination of 76.92% of keel extracts and QL1000, which are mixed with 19.23% urea formaldehyde polymer and 3 , 85% ammonium chloride. SRL 14, has low stability over time, because the QL 1000 has a low pH, which favors the cross-linking of urea formaldehyde resin. After 24 hours of being prepared, the formulation is observed as a soft gelatinous gel.
  • the preparation is based on the fact that the urea formaldehyde polymer blends very well with QL 1000 and that this polymer, when crosslinked in the air with ammonium chloride, easily emerges from a hard and smooth surface. Crosslinking with ammonium chloride allows to obtain a harder, stronger and more brittle crosslink.
  • the preparation of SRL 14 consists of the mixture of urea formaldehyde polymer, with QL 1000 and ammonium chloride in the proportions already described. This mixture is dried in an oven at a temperature of 105 0 C, where it is allowed to crosslink for 72 hours. Finally, when the product is dry it is ground with a mortar.
  • SRL 14 generates a very hard powder since it is based on the fact that it requires thermosetting resin, which implies a grinding operation that could not be carried out with the resources that the project and the Laboratory had, together with the difficulty of having urea formaldehyde, prevented the continued elaboration of SRL 14, despite the good results obtained in pots.
  • SRL 14B Gran is a solid formulation in the form of pellets or granules that uses Mowilith DM 530 latex as a binder, as a filling a suspension of bentonite of concentration 140 g • L "1 and kaolin, in addition to KH2PO4 and KNO 3 in quality of fertilizers.
  • the formulation has the appearance of a plastic paste very similar to the school plasticine or the clay of the potters. This mixture is extruded in an empty plastic tube, inside this tube, the mixture is placed and by means of a plunger it is pressed the mixture toward a die of two millimeters in diameter, which allows a tubular mold of 2mm in diameter is placed on a clean metal surface for subsequent drying in an oven at 95 0 C for 24 hours for final drying and grinding to obtain small pellets between two and ten millimeters long.
  • composition of the formulation that are required to prepare 108.6g of dry mass of SRL 14B Gran are described below:
  • SRL 14B Gran The procedure followed to obtain SRL 14B Gran was as follows:
  • the QL 1000 is weighed in a suitable container. • Dissolve the heavy fertilizers in section 9 with a little of the QL 1000.
  • the invention includes using quillay extracts and powders with other substances such as water-insoluble synthetic polymers (latex and resins), salts with fertilizer compounds (potassium, phosphate and nitrogen), natural clays, and plant phyto-hormones, which can be applied to the soil or to the seeds for the control of the Gaeumannomyces graminis fungus, in order to ensure the results that have been obtained as a result of the work done in the aforementioned project. It is important to note that except for synthetic polymers, the rest of the adjuvants can be considered compounds that are present in nature.
  • Mowilith DM 530 latex it is a polymeric aqueous dispersion of vinyl acetate and an ester of acrylic acid, free of plasticizers, with a solids concentration of 50%. Which can be classified as a water insoluole polymer.
  • Potassium di-hydrogen phosphate (KH 2 PO 4 ) is a soluble salt that is used as a fertilizer, and depending on the dose and mode of application as a food additive and fungicide.
  • KNO 3 Potassium nitrate
  • Indolbutyric acid corresponds to a phyto-hormone that resembles plant hormones called auxins.
  • Urea formaldehyde resin is a thermosetting polymer resin that is obtained from urea and formaldehyde. It is a synthetic polymer.
  • Bentonite ((Na 1 Ca) C Sa (AI 1 Mg) 2 Si 4 O 10 (OH) 2 - (H 2 O) n ) consists of pure mineral clays used in very fine-grained (colloidal) ceramic type of montmorillinite containing bases and iron.
  • Kaolin is a pure mineral clay (AI 2 Si 2 Os (OH) 4 ) that is used in the preparation of porcelain pastes and varnishes. Its color is white.
  • Figure 10 shows the mycelium treated with a dose of 0 ppm of saponins, treated with a dose of 50, 100 and 500 ppm of saponins.
  • Figure 11 the approach in 15,000 times to the mycelium of Ggt treated with a dose of 50 ppm of saponins, where deformation and thinning of hyphae is observed in the mycelium of
  • Ggt while at a dose of 100 ppm of saponins, ruptures in the binding membranes of the mycelial cords between hyphae of Ggt that were treated are observed.
  • Figure 8 shows the adjustment of curves for the first experiment to evaluate the behavior of leaching of saponins from treated seeds, by measuring foam height during 16 wash cycles in quartz columns.
  • Figure 9 shows the adjustment of curves for the second experiment to evaluate the behavior of leaching of saponins from treated seeds, by measuring foam height during 16 wash cycles in quartz columns.
  • the SRL 25 and SRL 25 Dust treatments delayed the process of loss of saponins from the seeds between 6 and 8 days with respect to QL 1000, during these days the turning point between the elaborated curves was produced.
  • the treatments with “slow relée” allowed delaying the delivery of saponins from the seeds between 12 and 22% more with respect to the use of pure quillay extract applied to the seed within the first four washes of the experimentation.
  • each quartz column has a volume of 5 ce, for four washes it receives 120 ml of water / hour. If this is extrapolated to one hectare with a volume of soil 4,000 m 3 , this would be equivalent to having passed 96,000 liters of water per one hectare / hour.
  • the agronomic evaluation of the effectiveness of control of the formulations developed on the Ggt fungus was carried out by establishing 26 experiments in pots. These experiments allowed evaluating the new formulations, or correcting defective aspects of the developed formulations.
  • the evaluation methodology was carried out under greenhouse and shader conditions, considering: Yerbas Buenas soil use (VII Region) autoclaved and inoculated with Ggt grown in oat grains for 40 days. The soil was put in PVC pots arranged on a wooden board, where it was sown with a wheat seed cv. Dalcahue-INIA.
  • Figure 6 shows the evaluation experiment of SRL 25 Plus and SRL VAX Plus formulations, which are natural slow-release fungicides based on quillay extracts with the addition of fertilizers and plant hormones, which did not have a level of control that can be considered agronomically acceptable.
  • SRL 25 the product that maintained a more constant efficiency during experimental work.
  • 12 formulations of SRL 25 were prepared, based on quillay extracts QL 1000, with different concentrations of saponin and with the addition of compounds that in experiments In the past, there was a decrease in the level of control of the SRL 25 product.
  • SRL 25 prepared with a quillay extract with 11.2% p / p saponins, and to which they were attached gibberellins presented the highest level of control in quillay-based products (67.1% control with respect to the inoculated control without treatments), not being statistically different from Silthiofam, the commercial control. SRL 25 formulations without the additive did not show statistically significant differences with respect to the inoculated control; In spite of the above, all of them reduced the disease and the SRL 25 prepared from an extract with 11.2% of saponins was the one that presented the best level of control with respect to the sick control (47.1% of control ).

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Abstract

La presente invención se refiere a fungicidas naturales utilizados en el tratamiento de semillas o tratamiento al suelo, que fueron obtenidos a partir de la formulación de extractos de quillay, ricos en concentraciones de saponinas, a los cuales se les ha adherido polímeros sintéticos (látex y resinas) que permiten su entrega lenta en el suelo, y que han sido probados en su eficacia de control sobre el hongo Gaeumannomyces graminis, causante del mal del pie del trigo, a nivel de experimentos en maceta y de campo.

Description

FORMULACIONES DE ENTREGA LENTA A BASE DE EXTRACTOS DE QUILLAY PARA EL CONTROL DE LA ENFERMEDAD MAL DE PIE EN TRIGO.
MEMORIA DESCRIPTIVA
Campo de Ia Invención Fungicidas naturales de entrega lenta a base de extractos de quillay para el control de Ia enfermedad Mal de pie en trigo
Descripción breve de Ia invención
La presente invención se refiere a fungicidas naturales utilizados en el tratamiento de semillas o tratamiento al suelo, que fueron obtenidos a partir de Ia formulación de extractos de quillay, ricos en concentraciones de saponinas, a los cuales se les ha adherido polímeros sintéticos (látex y resinas) que permiten su entrega lenta en el suelo, y que han sido probados en su eficacia de control sobre el hongo Gaeumannomyces graminis, causante del mal del pie del trigo, a nivel de experimentos en maceta y de campo. Las experiencias realizadas en macetas, han mostrado efectos de control de las formulaciones desarrolladas, mientras que pruebas de campo realizadas en Ia IX Región de Chile, para evaluar su efectividad, mostraron que a pesar de no observarse que las formulaciones de quillay probadas lograron reducir Ia pudrición radical en las plantas de trigo, dada Ia condición climática de alta pluviometría de Ia temporada en que se realizaron las experiencias y al hecho que el fungicida comercial Latitude® (i.a. Silthiofam, Monsanto), incorporado como producto de referencia en todos los ensayos de campo no manifestó tal propiedad en ninguno de los cuatro ensayos de campo. Por tanto, aparece razonable señalar que el nulo efecto demostrado por las distintas formulaciones evaluadas, en inhibir el desarrollo temprano de Ia infección, no obedece necesariamente a una nula o baja efectividad de las mismas, sino que intervinieron otros factores que pudieron neutralizar tal cualidad.
La importancia de estos productos está dada porque en Ia actualidad no existen compuestos de origen natural que se utilicen para el control del hongo Gaeumannomyces graminis, y los productos químicos existentes en el mercado no logran controlar de manera efectiva esta enfermedad. Dada esta situación, y con el financiamiento de Ia Fundación COPEC-UC, se han desarrollado distintas formulaciones de fungicidas naturales a partir de extractos de quillay que presentan niveles de control interesantes que pueden ser una alternativa económica, biológica y ambientalmente sustentable en el control de esta enfermedad del trigo.
Arte Previo
El mal del pie tiene importancia a nivel mundial, y en Chile representa en términos económicos $5.000 millones de pesos anuales, concentrándose sus pérdidas en Ia IX Región, donde se observan de manera moderada pérdidas de un 10% en los rendimientos, Io cual significa pérdidas estimadas de $2.400 millones de pesos a nivel regional. Adicionalmente, las escasas alternativas de sustitución de cultivos en Ia zona afectada y Ia disminución en Ia siembra de raps, hacen prever un aumento de este mal en los próximos años.
La ausencia de efectivos métodos de control químico para Ia pudrición radical del trigo ha sido una frustración por décadas (Hornby, 2003). Recientemente, algunas aplicaciones de ciertos fungicidas aplicados como tratamientos de semilla han favorecido el decrecimiento del mal del pie (Jenkyn, eí al. 2000), pero no han sido totalmente efectivas. Aunque, en los últimos años, productos químicos en base a silthiofam y triticonazole recomendados para el control del "mal del pie" han presentado una mayor eficacia, pero a Ia vez un alto costo.
Estudios con extractos de quillay han permitido el desarrollo de productos naturales con acción para Botryϋs, Eryshipe y Blumería (Apablaza eí ai, 2002; Moya, 2003; Villegas, 1999). Del mismo modo, estudios de microscopía a través de técnicas histológicas permitieron observar conidióforos afectados y/o totalmente desorganizadas y conidias en tisis, Io cual sustenta el efecto de control de un extracto de quillay sobre oídio (Apablaza et al, 2004).
En este contexto, hay considerable interés en Ia importancia de las saponinas presentes en Ia raíz de Ia avena, pues determinan Ia resistencia de Ia avena a las infecciones por el hongo que produce Ia enfermedad "mal del pie" (Turner, 1953; Osboum, 1996a; Papadopoulou eí al,, 1999). La posibilidad de poder utilizar extractos de plantas ricos en saponinas, obtenidos del quillay, abrió Ia posibilidad de utilizarlos en el control de enfermedades fungosas; y en este caso particular, permitió investigar los efectos de las saponinas sobre el hongo Gaeumannomyces graminis, Io cual se transformó en una alternativa de control que no ha sido estudiada en profundidad y en Ia que el equipo del Laboratorio de Patología de Cultivos de Ia Pontificia Universidad Católica ha sido pionero en desarrollar formulaciones con extractos naturales de quillay que presentan características especiales de entrega.
Los trabajos realizados dentro del marco del proyecto COPEC-UC, han determinado bajo condiciones ¡n Vito, Ia efectividad de control de las saponinas de quillay en concentraciones mayores o iguales a 100 ppm en el medio de cultivo, y un efecto fungistático de concentraciones menores de saponinas. Al igual que con el oidio, estudios de microscopía óptica y electrónica permitieron observar un efecto de lisis y desorganización de los extractos de quillay sobre las rizoides de Gaeumannomyces graminis, (ver, Fig. 1). También se han establecido curvas de respuesta de control a distintas concentraciones de saponinas en medio de cultivo, para distintos aislamientos del hongo y con diversos productos extraídos del quillay. Además, y a pesar de Ia variabilidad en los resultados que se han obtenidos en los experimentos realizados en macetas, las formulaciones: SRL 14 (productos para tratamiento al suelo), y SRL 25 (producto para tratamiento de semillas), han presentado los mejores resultados con niveles de control cercanos a los obtenidos con el producto comercial Latitude® (i.a. Silthiofam). Estos son los tratamientos con mayores proyecciones comerciales y de patentamiento, entre las 68 formulaciones y variantes de éstas que han sido elaboradas por nosotros. Finalmente, trabajos realizados han permitido demostrar niveles de retención de saponinas en el suelo entre un 53 y un 89%, Io que indica una alta viabilidad de los triterpenos saponínicos en el suelo (Saquimux 2007).
La búsqueda realizada, durante el 2004, en las bases de datos de patentes de Ia Oficina Europea, Oficina Americana, Oficina Española y en Ia base de datos nacional del Departamento de Propiedad Industrial sobre alternativas de patentes asociadas al uso de saponinas de quillay en formulaciones para el control del hongo Gaeumannomyces graminis, determinó que no existen antecedentes en torno a este tópico que puedan influenciar a futuro en Ia obtención de una patente. Sumado a Io anterior, Ia investigación realizada, corresponde a los primeros intentos por desarrollar un producto proveniente de saponinas de quillay que permita controlar este patógeno, y que los pocos estudios que se han realizado al respecto han sido llevados a cabo por los proponentes de este proyecto. Por lo anterior la posibilidad de patentar estos fungicidas naturales a base de extractos de quillay que pueden ser utilizados para el control de hongos como tratamiento de semillas o como tratamiento de suelo; es alta, ya que a nivel internacional existen las siguientes patentes: U.S. 6.482.770: inventores: Dutcheshen, J., y Danyluk T. "Method and composition for protecting plants from disease"; U.S. 5.639.794: inventores: Emerson, R.; Crandall, Jr., y Bradford G. "Use of saponin in methods and compositions for pathogen control; US2006/0121126 inventores: Peters, Verny, Jones, Schmith & Aston:"Environmentally Friendly pesticide and method of use") referidas al uso de saponinas como agentes que permitan el control de hongos. El problema que soluciona esta invención a través de estos fungicidas naturales es que ofrece productos potencialmente comerciales, que son amigables con el medioambiente, y que tiene una alta posibilidad de comercialización considerando las nuevas tendencias que tienden hacia una alimentación sana y libre de agroquímicos. Por ejemplo, Ia respuesta de los consumidores a esta nueva tendencia puede verse reflejada, en el desarrollo de Ia agricultura orgánica de cultivos en los Estados Unidos. Esta actividad ocupa actualmente 350.000 ha, de las cuales aproximadamente 56.750 son dedicadas al cultivo de trigo orgánico. Las ventas obtenidas en los Outlets orgánicos alcanzaron los US$ 7,8 billones en el 2000 y ha tenido un crecimiento anual del 25% en los últimos diez años, tendencia de crecimiento que probablemente continuará en el mundo (Greene y Dobbs, 2001). De este modo, se ha desarrollado una alternativa de control al de Ia pudrición radical del trigo en base a una molécula natural como las saponinas de quillay que permiten ser usadas en las explotaciones productivas tradicionales, que no cuentan con un adecuado sistema de control de esta enfermedad, y para las producciones de tipo orgánico, considerando que el uso de las saponinas de quillay ha sido certificado para este tipo de explotaciones.
También debe considerarse que estas tendencias de los consumidores se están transformando en acciones concretas, como los programas de reducción dei uso de pesticidas en cultivos agrícolas que se están desarrollando en Estados Unidos y Europa. Por ejemplo, los Pesticida Action Network (PAN) de Alemania y Reino Unido están financiando investigaciones con microorganismos o compuestos naturales que controlen enfermedades en cultivos y que buscan eliminar el uso de peligrosos pesticidas por alternativas ecológicas. A su vez buscan que por etapas, productores de cultivos, compañías de alimentos y gobiernos concreten acciones en Ia reducción de pesticidas dentro de las cadenas productivas. Esta situación plantea que a futuro acciones similares deberán ser establecidas en Chile, ya que este tipo de acciones pueden ser utilizadas para establecer medidas para-arancelarias que reduzcan el comercio entre países, y afectar otras áreas de exportación desarrolladas en Chile. Como efecto secundario estas invenciones permiten ampliar las posibilidades de comercialización de los extractos de quillay, los cuales ya han sido utilizados con éxito en Ia agricultura como producto aplicado al suelo. Ese es el caso del producto QL Agri 35, que es un nematicida 100% de origen natural, especialmente indicado para el control de nemátodos en vides y cítricos. Este producto, por sus características de producto natural, está especialmente indicado para integrar Programas de Manejo Integrado, y está certificado para ser utilizado en producciones orgánicas, al igual que su proceso de producción, el que recibió una mención de Mérito en el Premio Nacional a Ia Innovación Agraria en 1999 y que fue patentado.
También, las formulaciones desarrolladas tendrían un menor costo que los tratamientos químicos existentes en el mercado, por Io que pueden transformarse en una alternativa de tratamiento para agricultores tradicionales.
Además, Ia característica que presentan las saponinas de quillay de promover el crecimiento de bacterias, descritas por Sen, et al (1998) en su artículo "Effect of Quillaja saponaria saponins and Yucca schidigera plant extract on growth of Escherichia colf (Letters in Applied Microbiology 27 (1), 35-38), plantea Ia interrogante acerca del uso integrado de este producto con "Plant Growth Promoter Rhizobacteria" (PGPR), como Pseudomonas fluorescens 2-79, que se han descrito como controladores de Ggt y que viven en Ia rizósfera del trigo. También es probable que esta característica de las saponinas permita mantener Ia población de bacterias supresoras por un tiempo más largo en suelos supresivos a Ggt.
Dado que esta invención ha desarrollado formulaciones de fungicidas naturales a partir de las saponinas de quillay, su desarrollo presenta las siguientes ventajas:
Son productos que podrían ser una alternativa más natural al control del Mal del pie en trigo frente a Ia falta de alternativas que existen en Ia actualidad y al hecho que sus competidores más cercanos no han presentado resultados del todo satisfactorios.
El hecho de ser productos que podrían entrar en programas de manejo integrado de plagas, ya que por ser productos naturales disminuirían Ia presión de uso de agroquímicos o podría mejorar el efecto de control de otros microorganismos antagónicos a Ggt.
Son productos de relativo bajo costo frente a sus competidores. Por ejemplo, a precio a distribuidor del Silthiofam es de US$ 66 por litro, mientras que SRL 25 Dust a base del extracto de quillay en polvo QP 1000, tendrían un valor aproximado de US$ 8,1 por kilo.
Al ser el quillay una especie endémica de Chile, Ia posibilidad de obtener un adecuado suministro de materia prima para responder a las necesidades del mercado nacional e internacional es real. Se considera que existe capacidad instalada de producción que pueda asegurar dicho suministro, por el hecho que el quillay está adaptado a las condiciones agroclimatológicas del país y que existe investigación adelantada de su explotación en forma sustentable, según Ia cual bastaría con producir comercialmente unas 3000 ha.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1 Observación microscópica (100X). Gaeumannomyces graminis var tritici. Sin aplicación de saponinas (izquierda) y con aplicación de 200 ppm de saponinas (derecha).
Se puede observar el efecto directo sobre el micelio del hongo Gaeumannomyces graminis var trítici, sin aplicación de saponinas y con aplicación de 200 ppm de saponinas (Observación microscópica (100X)).
Figura 2 Resultados de infección según el índice de Mal del pie (TAI) obtenidos en Ia evaluación de formulaciones de entrega lenta a base de extracto de quillay con respecto a un testigo comercial (Latitude® i.a. Silthiofam, Monsanto), un testigo sin inocular (s/i) y un testigo inoculado (c/i). Columnas en verde presentan los mejores tratamientos.
Figura 3 Resultados de infección según el índice de Mal del pie (TAI) obtenidos en Ia evaluación de distintas dosis de SRL 14, un aserrín fortalecido con extracto de quillay, y QL 1000 como tratamiento de semillas con respecto a un testigo comercial (Latitude® i.a. Silthiofam, Monsanto), un testigo sin inocular (s/i) y un testigo inoculado.(c/i). Columnas en verde presentan los mejores tratamientos. Figura 4 Resultados de Ia evaluación del efecto de control de SRL 25, SRL 70 GIB y distintas dosis de SRL 14 sobre Ggt en trigo con respecto a un testigo comercial (Latitude® i.a. Silthiofam, Monsanto), un testigo sin inocular (s/i) y un testigo inoculado (c/i). Fecha de Siembra: 23/03/2005. Columnas en verde presentan los mejores tratamientos.
Figura 5 Resultados de infección según el índice de Mal del pie (TAI) obtenidos en Ia evaluación de distintas formulaciones de entrega lenta "Slow reléase" con respecto a un testigo comercial (Latitude® i.a. Silthiofam, Monsanto), un testigo sin inocular (s/i) y un testigo inoculado (c/i). Fecha siembra 30/03/2005. Columnas en verde presentan los mejores tratamientos.
Figura 6 Resultados de experimento para evaluar formulaciones de liberación lenta "Slow reléase" a base de extractos de quillay tipo Plus (con adición de fertilizantes y hormonas vegetales) con respecto a SRL 25, SRL 49, un testigo comercial (Latitude® i.a. Silthiofam, Monsanto), un testigo sin inocular (s/i) y un testigo inoculado (c/i).. Cosechado el 03-octubre -2005. Columnas en verde presentan los mejores tratamientos.
Figura 7 Resultado de infección según el índice de infección de Mal del pie (TAI), para evaluar efecto de distintas concentraciones de saponinas presentes en extractos de quillay QL 1000 utilizadas para preparar formulaciones del SRL 25. Las concentraciones de saponinas presentes en el QL 1000 usado en Ia preparación del SRL 25 se muestran entre paréntesis.
Figura 8 Ajuste de curvas para el primer experimento de evaluación del comportamiento de Ia lixiviación de saponinas desde semillas tratadas, mediante Ia medición de altura de espuma durante 16 ciclos de lavados en columnas de lixiviación de cuarzo.
Figura 9 Ajuste de curvas para el segundo experimento de evaluación del comportamiento de Ia lixiviación de saponinas desde semillas tratadas, mediante Ia medición de altura de espuma durante 16 ciclos de lavados en columnas de lixiviación de cuarzo. Figura 10 Observación de micelio tratado con una dosis de 0 ppm de saponinas, tratado con una dosis de 50, 100 y 500 ppm de saponinas. Se observa deformación de hifas en el micelio de Ggt, roturas en las membranas de unión de los cordones miceliales entre hifas del hongo.
Figura 11 Acercamiento en 15.000 veces al micelio de Ggt tratado con una dosis de 50 ppm de saponinas, donde se observa deformación y adelgazamiento de hifas en el micelio de Ggt y roturas en las membranas de unión de los cordones miceliales entre hifas de Ggt tratadas con una dosis de 100 ppm de saponinas y aumentado en 15.000 veces.
Descripción detallada de Ia Invención
La invención esencialmente corresponde a seis formulaciones, dos formulaciones de SRL 25, el cual es una mezcla de látex más extracto QL 1000, secado en estufa y, su variante SRL 25 Dust que usa QP 1000, que corresponde a QL 1000 en polvo, secado Spray. Las formulaciones de este SRL Plus, corresponden a Ia misma formulación de SRL 25, pero con agregaciones de hormonas vegetales (ácido indol butírico) y fertilizantes (nitrógeno, fósforo y potasio). El cuarto producto de este grupo SRL VAX Plus, corresponde a Ia mezcla de Vax Sap (formulación en polvo con un 83% de saponinas de quillay) con látex, más las agregaciones descritas anteriormente en SRL Plus. Los últimos productos corresponden a dos fomulaciones usadas como tratamientos aplicados al suelo que son una formulación en polvo a base de extractos de quillay mezclados con un polímero -urea formaldehído- (SRL 14) y otra en granulos o pellets en mezcla de látex con una arcilla bentonita (SRL 14B Gran). Todas estas formulaciones corresponden a fungicidas naturales a base de extractos de quillay para el control del mal del pie en trigo que poseen una conformación que permite una entrega lenta de las saponinas de quillay en el suelo.
Las formulaciones SRL 25, SRL 25 Dust, SRL Plus y SRL VAX Plus son suspensiones líquidas concentradas que se utilizan como tratamiento de semillas.
SRL 25, posee un 3,85% de saponinas en Ia suspensión, y es obtenido mediante Ia mezcla de un 66,19% de látex Mowilith DM 530 (dispersión acuosa polimérica de acetato de vinilo y un éster del ácido acrílico, libre de plastificantes, con una concentración de sólidos del 50 %) con un 17,99% del extracto QL 1000 (extracto acuoso concentrado de Quillay, de coloración pardo oscura, meloso al tacto y un ligero olor a caramelo. Con una concentración de 42% p/p de sólidos solubles y un 9% p/p de saponinas), secado en estufa, y un 15,83% de agua. El secado del extracto QL 1000 permite concentrar las saponinas aproximadamente en un 21,4% p/p de saponinas y es obtenido mediante las siguientes operaciones.
• Se colocan 10 mi de QL 1000 en varias placas de Petri.
• Se colocan las placas con el QL 1000 en una estufa a una temperatura regulada de 105 +/- 1 0C. En este paso es crítico que el termostato de Ia estufa funcione adecuadamente, pues si Ia temperatura sube descontroladamente se corre el riesgo de que las saponinas u otros productos presentes en el QL 1000 se descompongan y se hagan inservibles.
• Se dejan las placas en Ia estufa durante cuatro horas. • Después de este tiempo se sacan las placas y se colocan en una campana desecadora con gel de sílice.
• Una vez frías, se desprende el sólido de las placas empleando una espátula.
• Se tritura el polvo de QL 1000 en un mortero de porcelana hasta obtener un polvo fino e intangible. « Se guarda este sólido en un frasco herméticamente cerrado y se coloca en una campana desecadora con sílica gel.
Para preparar Ia formulación de SRL 25 Ia primera etapa es pesar el polvo de QL1000 en un recipiente. Luego se añade el agua, y se mezcla hasta que todo el polvo esté bien humedecido pero no necesariamente disuelto, a continuación se agrega lentamente el látex Mowilith DM 530, y se mezcla todo con una varilla de vidrio. Cuando el QL 1000 secado se mezcla con el látex, las saponinas precipitan, por un simple efecto de cambio de solvente. Este proceso debe hacerse lentamente y con agitación para evitar Ia formación de aglomeraciones de sólidos que puedan precipitar o separarse en fases. Las proporciones de productos requeridos para preparar 100 g de composición de SRL 25 se describen a continuación:
Figure imgf000010_0001
SRL 25 Dust, posee un contenido similar de saponinas (3,85%) que SRL 25, y a su vez éste sigue el mismo procedimiento de preparación y concentraciones de adyuvantes en Ia mezcla descrita anteriormente. Sin embargo Ia formulación utiliza QP 1000, en vez de polvo de QL 1000. QP 1000 corresponde a un polvo fino con una concentración de 21 ,4 % p/p de saponinas, de coloración chocolate, ligeramente higroscópico, irritante a las mucosas nasales con gran efecto estornudógeno, muy soluble en agua con Ia que forma disoluciones oscuras y transparentes parecida al QL 1000. No obstante, QP 1000 se obtiene a partir de los extractos acuosos de quillay sometidos a un proceso de secado por spray, de modo que este polvo está constituido por los sólidos disueltos en el QL 1000. El proceso de secado por spray es una tecnología desarrollada por Natural Response S.A.
Las proporciones de productos requeridos para preparar 100 g de SRL 25 Dust se describen a continuación:
Figure imgf000011_0001
El QL 1000, secado mediante el procedimiento descrito arriba, y el QP 1000 se comportan de formas muy diferentes al ser incorporados al látex polimérico. Mientras el polvo de QL1000 forma suspensiones estables de aspecto cremoso, las suspensiones del QP 1000 tienden a separarse en fases, los sólidos se separan del líquido y forman grumos. En ambos casos si Ia suspensión se deja reposar durante un tiempo, su viscosidad aumenta considerablemente, pero en el caso del polvo de QL 1000 cuando se somete nuevamente a agitación Ia mezcla vuelve nuevamente a ser fluida y cremosa, en cambio con el QP 1000 al agitar nuevamente solo ocurre Ia separación del liquido de los sólidos, Io cual dificulta en alguna medida Ia producción de SRL 25 Dust.
SRL Plus posee 3,85% saponinas, con un 17,99% de extracto de QL 1000 secado o QP1000, 68, 92% de látex Mowilith DM 530 y una proporción de agua de un 14,42%, en Ia cual se agrega Ia hormona vegetal ácido indol butírico (AIB), en una concentración de 100 μM (784 μL de una disolución de AIB a una concentración de 1500 ppm en 65 gramos de Ia solución), y sales fertilizantes que aportan nitrato, fosfato y potasio. Las sales usadas fueron di-hidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4) y Nitrato de potasio (KNO3), cada una aplicada en una proporción que corresponde a un 0,86% de Ia suspensión concentrada (aproximadamente 0,5 g por 65g de Ia mezcla). Las proporciones de productos requeridos para preparar 65 g de SRL 25 Plus se describen a continuación:
SRL-25Plus
Figure imgf000012_0001
*784 μL de una disolución de AIB a una concentración de 1500 ppm agregada a Ia masa de agua descrita arriba.
La preparación del SRL 25 Plus sigue el siguiente procedimiento:
• En recipientes se pesan el KH2PO4 y el KNO3 y ambos se unen en uno de los recipientes y se diluye en una parte de Ia cantidad de gramos de agua destilada requerida. El proceso de disolución se acelera al colocar el recipiente en agua caliente. • Una vez completada Ia disolución se deja refrescar
• Se añade una gota de antiespumante.
• Se agregan Ia cantidad necesaria de una disolución de AIB de 1500 ppm.
• Se completa con agua destilada hasta Ia masa total de agua requerida, Ia cual debe incluir el peso de ambas sales fertilizantes. • Lentamente se agrega a Ia disolución anterior los gramos de látex Mowilith DM 530 requeridos, mientras se mezcla enérgicamente con una varilla de vidrio.
• Se agrega el QL1000 secado o QP1000, se mezcla y se continúa mezclando con Ia varilla de vidrio.
• Completada Ia mezcla esta debe quedar pastosa y puede ser trasvasada a contenedores con cierre hermético. El producto SRL VAX Plus, es preparado en similar forma que SRL 25 Plus y contiene los mismos adicionales ingredientes descritos para éste. Este se diferencia por que utiliza Vax Sap Ia cual es una formulación en polvo con un 83% de saponinas de quillay en su formulación, Io cual incrementa Ia concentración de saponinas a 12,4% en el producto. Las proporciones de cada compuesto de Ia formulación varían levemente con los descritos anteriormente, SRL VAX Plus utiliza un 14,94% de Vax Sap, 69,72% de Látex Mowilith DM 530, 15,34% de agua, Ia cual contiene el AIB (100 μM) y KH2PO4 y KNO3 en una proporción de cada uno de 0,97% de Ia composición total del producto.
Vax Sap es un polvo muy fino de color crema muy irritante a las mucosas nasales con gran efecto estomudógeno, muy soluble en agua con Ia que forma disoluciones claras y transparentes. El VaxSap se obtiene sometiendo a sucesivas etapas de purificación los extractos de Quillay hasta obtener un sólido casi blanco que tiene un 83% de saponinas. Debido a este refinamiento el VaxSap es un producto de alto costo que fue utilizado más con un interés comparativo que comercial, ya que permitió emplear saponinas casi puras en las formulaciones. Mediante su empleo se logra obtener formulaciones con alta carga polimérlca y mayor proporción de saponinas.
Las proporciones de productos requeridos para preparar 24 g de SRL Vax Plus se describen a continuación:
Figure imgf000013_0001
*271 μL de una disolución de AIB a una concentración de 1500 ppm agregada a Ia masa de agua descrita arriba.
Los tres extractos de quillay mencionados (QL 1000, QP 1000 y Vax Sap) son producidos por Natural Response S.A. y comercializados por Desert King Chile. Los productos de aplicación al suelo corresponden al SRL 14 y SRL 14B Gran. SRL 14 es una formulación en polvo con un 6,92% de saponinas, que es obtenido por Ia combinación de un 76,92% de extractos de quillay QL1000, los cuales son mezclados con un 19,23% de polímero urea formaldehído y 3,85% de cloruro de amonio. El SRL 14, presenta baja estabilidad en el tiempo, debido a que el QL 1000 posee un pH bajo, que favorece Ia reticulación de Ia resina urea formaldehído. A las 24 horas de ser preparada Ia formulación se observa como un gel blando gelatinoso. Ese gel se desmenuza fácilmente en un mortero y luego se retícula totalmente en Ia estufa a 1050C para obtener un polvo color ámbar muy duro. Cuando este sólido se sumerge en agua, se observan señales de difusión de saponinas, el agua sobrenadante se colorea y hace espuma. Las partículas no manifiestan tendencia a Ia disolución y permanecen en el fondo del recipiente sin variar de tamaño ante consecutivas adiciones de agua durante semanas.
La preparación es basada en el hecho que el polímero urea formaldehído mezcla muy bien con QL 1000 y que este polímero al reticular al aire con cloruro de amonio se desprende fácilmente de una superficie dura y lisa. El reticulado con cloruro de amonio permite obtener un reticulado más duro, resistente y quebradizo. La preparación de SRL 14 consiste en Ia mezcla del polímero urea formaldehído, con QL 1000 y cloruro de amonio en las proporciones ya descritas. Esta mezcla es secada en una estufa a temperatura de 1050C, donde se deja reticular por 72 horas. Finalmente, cuando el producto está seco es molido con un mortero.
Las proporciones de productos requeridos para preparar 26 g de SRL 14 se describen a continuación:
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SRL 14 genera un polvo muy duro ya que es basado en que requiere resina termoendurecible, Io cual implica realizar una operación de molido que no se podía realizar con los recursos con que contaba el proyecto y el Laboratorio, sumado a Ia dificultad para disponer de urea formaldehído, impidieron que se continuar elaborando el SRL 14, a pesar de los buenos resultados obtenidos en macetas. SRL 14B Gran es una formulación sólida en forma de pellet o granulos que utiliza el látex Mowilith DM 530 en calidad de aglutinante, como relleno una suspensión de bentonita de concentración 140 g • L"1 y caolín, además de KH2PO4 y KNO3 en calidad de fertilizantes. La formulación tiene el aspecto de una pasta plástica muy parecida a Ia plastilina escolar o al barro de los alfareros. Esta mezcla se extrusa en un tubo plástico vacío, dentro de este tubo, se coloca Ia mezcla y mediante un embolo se presiona Ia mezcla hacia una boquilla de dos milímetros de diámetro, que permite obtener un molde tubular de 2mm de diámetro que es colocado sobre una superficie metálica limpia, para su posterior secado en una estufa a 950C por 24 horas para su secado final y triturado para obtener pequeños pellets entre los dos y diez milímetros de largo.
La composición de Ia formulación que son requeridos para preparar 108,6g de masa seca de SRL 14B Gran se describen a continuación:
Figure imgf000015_0001
*n/d: La concentración o porcentaje de saponinas de quillay no fueron determinadas para este compuesto.
El procedimiento seguido para obtener SRL 14B Gran fue el siguiente:
• Pesar en un contenedor de 2 L 140 g de Bentonita.
• Completar con agua destilada hasta una masa total de un Kilogramo.
• Agitar Ia mezcla de Bentonita y agua • Dejar reposar Ia mezcla durante tres días. Agitar vigorosamente de vez en cuando con una varilla de vidrio.
• Filtrar por una gasa cuando Ia Bentonita esta totalmente hidratada.
• Pesar el látex Mowilith DM 530 en un contenedor de 2 Litros.
• Agregar al látex Mowilith DM 530 a Ia masa de Ia suspensión de bentonita hidratada • Mezclar bien hasta formar un barro.
• Pesar el nitrato de potasio y el di-h¡drogenofosfato de potasio en sendos beakers pequeños.
• Se pesa el QL 1000 en un contenedor adecuado. • Disolver los fertilizantes pesados en el acápite 9 con un poco del QL 1000.
• Agregar lentamente el QL 1000 con los demás aditivos al barro formado por el látex y Ia Bentonita.
• Agregar Ia masa de QP 1000
• Agregar Ia masa de Caolín. • Agitar constantemente para homogeneizar bien.
• Colocar Ia masa en el equipo extrusor.
• Aplicar presión al extrusor y recoger los moldes cilindricos desde su extremo, en bandejas metálicas limpias.
• Dejar secar los moldes al aire durante una noche completa. • Colocar las bandejas de Zinc en una estufa regulada a una temperatura de 8O0C.
• Subir Ia temperatura de Ia estufa a 105° C durante dos horas cuando los moldes estén secos,
• Sacar de Ia estufa los moldes y dejar enfriar al aire.
• Separar los moldes de las láminas de metal o Zinc con una espátula. • Colocar en un recipiente plástico.
• Deben quedar pellets cilindricos con una longitud entre los dos y los diez milímetros.
Además, Ia invención incluye utilizar extractos y polvos de quillay con otras sustancias como polímeros sintéticos insolubles en agua (látex y resinas), sales con compuestos fertilizantes (potasio, fosfato y nitrógeno), arcillas naturales, y fito-hormonas vegetales, que puedan ser aplicados al suelo o a las semillas para el control del hongo Gaeumannomyces graminis, con el fin de asegurar los resultados que se han obtenido como fruto del trabajo realizado en el proyecto antes mencionado. Es importante destacar que exceptuando los polímeros sintéticos, el resto de los coadyuvantes pueden considerarse compuestos que están presentes en Ia naturaleza. Una descripción de los compuestos coadyuvantes utilizados en Ia elaboración de estas formulaciones se describe a continuación: • Látex Mowilith DM 530: es una dispersión acuosa polimérica de acetato de vinilo y un éster del ácido acrílico, libre de plastificantes, con una concentración de sólidos del 50 %. El cual puede ser clasificado como un polímero insoluole en agua.
• Di-hidrógeno fosfato de potasio (KH2PO4) es una sal soluble que es usada como fertilizante, y dependiendo de Ia dosis y modo de aplicación como aditivo alimenticio y fungicida.
• Nitrato de potasio (KNO3) es una sal natural que es utilizada como fuente de fertilizantes.
• Ácido indolbutírico corresponde a una fito-hormona que asemeja a las hormonas vegetales llamadas auxinas.
• La resina Urea formaldehído es una resina polimérica termoendurecible que se obtiene a partir de Ia urea y del formaldehído. Es un polímero sintético.
• La bentonita ((Na1Ca)CSa(AI1Mg)2Si4O10(OH)2-(H2O)n) está formada por arcillas minerales puras utilizadas en cerámica de grano muy fino (coloidal) del tipo de Ia montmorilinita que contiene bases y hierro.
• Caolín es una arcilla mineral (AI2Si2Os(OH)4) pura que se usa en Ia preparación de pastas y barnices de porcelana. Su color es blanco.
Procedimiento y evaluación de las formulaciones descritas.
Durante el desarrollo de las formulaciones se realizaron trabajos de observación por microscopía electrónica que permitieron observar el efecto de un extracto de quillay sobre el micelio de Ggt Estas, mediciones permitieron evaluar el efecto de Ia aplicación del extracto de quillay a diferentes concentraciones saponinas sobre las estructuras morfológicas del hongo y sus hifas a aumentos de 5000 y 15.000 veces, y permitieron validar el efecto de control que posee el ingrediente activo de las formulaciones desarrolladas. El estudio observacional fue realizado mediante microscopía electrónica de barrido, en el microscopio electrónico de barrido de Ia Facultad de Física y de Agronomía de Ia Universidad Católica. Esta experiencia permitió observar diferencias entre dosis de saponinas pero no un efecto permanente o continuo de daño en los tratamientos. Se encontraron mediante este estudio de microscopía efectos en las membranas que tendían a generar roturas en las capas que ligan a los cordones miceliales del hongo a dosis de 100 y 500 ppm de saponinas aplicados directamente sobre el micelio, Io cual es corroborado al ser observado a microscopía óptica, donde el efecto dosis es más notorio que cuando se realiza mediante el microscopio electrónico (Figura 1). También en dosis de 50 ppm se observaron deformaciones de hifas en el micelio de Ggt (Figuras 10 y 11).
Se observa en Ia Figura 10 el micelio tratado con una dosis de 0 ppm de saponinas, tratado con una dosis de 50, 100 y 500 ppm de saponinas. En todas estas imágenes se puede observar deformación de hifas en el micelio de Ggt y roturas en las membranas de unión de los cordones miceliales entre hifas del hongo. En Ia Figura 11 el acercamiento en 15.000 veces al micelio de Ggt tratado con una dosis de 50 ppm de saponinas, donde se observa deformación y adelgazamiento de hifas en el micelio de
Ggt, mientras que a una dosis de 100 ppm de saponinas se observan roturas en las membranas de unión de los cordones miceliales entre hifas de Ggt que fueron tratadas.
Durante el desarrollo de las formulaciones también fue evaluado el efecto de liberación lenta de éstas y su efecto residual en el suelo. Durante Septiembre y Noviembre de 2005 se realizaron trabajos tendientes a desarrollar una metodología que permitiese evaluar el efecto de liberación lenta de saponinas provenientes extractos de quillay utilizados en las formulaciones "Slow reléase" (coadyuvantes de entrega lenta), que se utilizaron para tratar semillas de trigo en experimentos realizados en Ia zona sur de Chile. Este trabajo consistió en pruebas del efecto de liberación de saponinas desde semillas tratadas de trigo realizadas en columnas de lixiviación de cuarzo.
El protocolo de medición basado en el uso de columnas de lixiviación de cuarzo y el análisis de Ia liberación de saponinas desde semillas de trigo tratadas con productos consideró: un sistema que permitiese un lavado continuo de las semillas, para imitar el clima de Ia zona Sur; un módulo experimental que contenga un sistema de sujeción de las semillas a través de Columnas de PVC rellenas con cuarzo y una cantidad de semillas tratadas en Ia parte superior de Ia columna. Además contó con un sistema de recolección de lixiviados, los cuales fueron medidos mediante afrosimetría para detectar el ingrediente activo y determinar Ia cantidad de saponinas liberadas desde las semillas que presenta cada producto después de cada ciclo de lavado, a fin de ajustar una curva de comportamiento de cada producto en el tiempo y realizar una comparación entre estos. Esta experiencia fue repetida en dos ocasiones para validar los resultados obtenidos.
Los productos evaluados correspondieron a un control agua y las formulaciones QL 1000, SRL 25 y SRL 25 Dust, utilizados en una dosis de 450 ppm de saponinas por tonelada de semilla tratada. Los resultados obtenidos se presentan en las Figuras 8 y 9.
Se observa en Ia Figura 8 el ajuste de curvas para el primer experimento de evaluación del comportamiento de Ia lixiviación de saponinas desde semillas tratadas, mediante Ia medición de altura de espuma durante 16 ciclos de lavados en columnas de cuarzo.
Se observa en Ia Figura 9 el ajuste de curvas para el segundo experimento de evaluación del comportamiento de Ia lixiviación de saponinas desde semillas tratadas, mediante Ia medición de altura de espuma durante 16 ciclos de lavados en columnas de cuarzo. En ambos experimentos se pudo apreciar que los tratamientos SRL 25y SRL 25 Dust demoraron el proceso de pérdida de saponinas desde las semillas entre 6 y 8 días con respecto a QL 1000, en estos días se producía el punto de inflexión entre las curvas elaboradas. Del mismo modo, en los primeros cuatro lavados QL 1000 las semillas tratadas con QL 1000, lixiviaron un 74, 35% y 84,60% de todas las saponinas detectadas para cada experimento respectivamente, mientras que SRL 25 lixivió un 61,50% y un 59,32%, y SRL 25 Dust lixivió un 62,50% y un 58,09% para cada experimento respectivamente. Es decir los tratamientos con "slow reléase" (coadyuvantes de entrega lenta) permitieron demorar Ia entrega de saponinas desde las semillas entre un 12 y 22% más con respecto al uso de extracto puro de quillay aplicado a Ia semilla dentro de los primeros cuatro lavados de Ia experimentación.
Debe considerarse que si cada columna de cuarzo posee un volumen de 5 ce, durante cuatro lavados recibe 120 mi de agua/ hora. Si se extrapola esto a una hectárea con un volumen de suelo 4.000 m3, esto equivaldría a haber pasado 96.000 litros de agua por una hectárea/hora.
El análisis estadístico para evaluar Ia diferencia entre las pendientes de las curvas ajustadas después de transformar los datos a su Logaritmo natural, permitió encontrar diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) entre los dos tratamiento con "Slow reléase", con respecto al testigo y QL 1000, en ambos experimentos. Estos resultados permiten afirmar que Ia formulación base para Ia entrega lenta donde se agregó el La. polvos de extracto de quillay que se desarrolló para los SRL 25 y SRL 25 Dust, cumple su efecto, Io cual da una matriz donde se podría evaluar Ia efectividad de esta característica en otros compuestos fungistáticos.
La evaluación agronómica de Ia efectividad de control de las formulaciones desarrolladas sobre el hongo Ggt fue realizada mediante el establecimiento de 26 experimentos en macetas. Estos experimentos permitieron evaluar las nuevas formulaciones, o corregir aspectos defectuosos de las formulaciones desarrolladas. La metodología de evaluación se realizó bajo condiciones de invernadero y sombreadero, considerando: uso de suelo de Yerbas Buenas (VII Región) esterilizado en autoclave e inoculado con Ggt crecido en granos de avena durante 40 días. El suelo fue puesto en macetas de PVC dispuestas sobre una plancha de madera, donde se sembró con una semilla de trigo cv. Dalcahue-INIA.
En estas experiencias se utilizaron dos tratamiento testigos (con y sin inoculo) y un testigo comercial silthiofam (Latitude®, Monsanto) en dosis de 2 L/ton de semilla para comparar Ia efectividad de las distintas formulaciones de entrega lenta o "Slow reléase" a base del extracto de quillay.
Los resultados obtenidos en esta experiencia mostraron que el extracto de quillay QL 1000 utilizados en forma pura como tratamiento de semillas no tuvieron efecto de control en Ia dosis de 4 L/ ton de semilla, Io cual reafirma el hecho que tratamiento de semillas con extractos puros no serían adecuados para el control de Ia enfermedad. Las formulaciones de entrega lenta permitieron en algunas experiencias ver efectos de disminución de los valores de infección determinados a través del índice de Mal del Pie (TAI: Take-all index) para el SRL 25 y SRL VAX Plus, los que fueron cercanos a los obtenidos por silthiofam. Como se observa en la Figura 2, silthiofam alcanzó un 44% de control con respecto al testigo inoculado, pero el tratamiento que alcanzó el mayor nivel de control fue el SRL VAX Plus, que alcanzó un 52% de control disminuyendo Ia severidad de Ia enfermedad (Figura 2); mientras SRL 25 obtuvo un 45% de control.
La evaluación del tratamiento al suelo SRL 14, en dosis de 1.990 (0,25 g por maceta) y 3.980 kg por ha (0,5 g por maceta), junto con aserrín de quillay fortalecido, con extractos de QL 1000, y los tratamientos de semillas con QL 1000 en dosis de 4L por ha y silthiofam, permitieron observar excelentes resultados de control para SRL 14 (Figura 3). Los resultados obtenidos mostraron que el testigo comercial Silthiofam logró un efecto de control del 50,8%, mientras que el uso de extracto puro de quillay alcanzó un 34,5% de control con respecto al testigo inoculado. Las dosis de 0,25 g por maceta alcanzaron niveles de control de 54,7% para el aserrín fortalecido, y de un 79,2% para el SRL 14, el cual fue el tratamiento que presentó el menor nivel de infección y por ende el mayor efecto de control, pues estuvo un 57,7% más de efectividad que el testigo comercial. Las dosis de 0,5 g por maceta presentaron resultados de control promedio de 72,1% con respecto al testigo. Estos resultados llevaron a evaluar formulaciones para tratamiento al suelo que puede ser usado como tratamiento curativo en zonas del potrero donde se presente manchas Ia enfermedad, disminuyendo a futuro Ia incidencia de mal de pie.
En general, los resultados obtenidos en los experimentos realizados en macetas, han sido variables y en algunos casos contradictorios, pero en el experimento donde se evaluaron el producto SRL 14, producto para tratamiento al suelo formulado en polvo a base de quillay con compuestos de liberación lenta, y SRL 25, producto para tratamiento de semillas, presentaron los mejores resultados con niveles de control, cercanos a los obtenidos con el producto comercial Latitude® (¡.a. Silthlofam, Monsanto). Estos son los tratamientos con mayores proyecciones comerciales entre las 66 formulaciones y variantes de éstas que fueron elaboradas. El SRL 25 fue mejorado con otros compuestos (hormonas y fertilizantes), pero en ciertos experimentos presentó resultados contradictorios (Figuras 4, 5 y 6). También el uso de del producto QP 1000® (Natural Response Ltda.), como ingrediente activo en las formulaciones, el cual es una formulación en polvo de QL 1000 secado a Spray, se considera un factor que influye en los resultados, ya que los mejores formulaciones fueron obtenidos con QL 1000 líquido secado en estufa, mientras que las formulaciones que usaron QP 1000 tendieron a solidificarse y formar grumos.
Los mejores resultados obtenidos en los experimentos se grafican en Ia Figura 4, El experimento en que se evaluó el efecto de control de un SRL 25 de quillay, SRL 70 GIB (más glberelinas), distintas dosis de SRL 14 de quillay y Silthiofam sobre Ggt en trigo. En este experimento realizado en marzo del 2005, se observó un 75,4% de control del SRL 25 con respecto al testigo, el cual sólo varió en un 4,0% del nivel de control obtenido por Silthiofam, en dosis comercial. SRL 14 obtuvo un nivel de control casi similar al obtenido por SRL 25, en su dosis de 3.980 kg por ha (0,5 g por maceta), mientras que Ia dosis menor obtuvo un 47,6% de control con respecto al testigo no tratado. Estos resultados dan un fuerte soporte agronómico y comercial a los fungicidas naturales desarrollados. Se observa en Ia Figura 5 otra evaluación de SLR 25 en comparación a otras formulaciones de entrega lenta y a Silthiofam. Este experimento permitió observar un menor efecto de control de SRL 25 sobre Ggt, pues sólo obtuvo un 30,8% de control con respecto al testigo inoculado, y una diferencia de 31 ,6 puntos porcentuales en el índice de mal del pie (take-AII Index) con respecto al Silthiofam. Sin embargo, SRL 25 junto con Silthiofam en un experimento cosechado el 03 de Octubre de 2005, presentaron diferencias con respecto al testigo que alcanzó niveles de infestación en el sistema radicular superior al 97% como índice de mal de Pie (Take all Index, TAI); mientras que Silthiofam y SRL 25 presentaron niveles de infestación menores, con un TAI de 28 y 60, respectivamente (Figura 6). Esto implica un 71 % y un 38% de control con respecto al testigo no tratado, respectivamente. También, se observa en Ia Figura 6 el experimento de evaluación de formulaciones SRL 25 Plus y SRL VAX Plus, que son fungicidas naturales de liberación lenta a base de extractos de quillay con adición de fertilizantes y hormonas vegetales, los cuales no tuvieron un nivel de control que pueda ser considerado agronómicamente aceptable.
Dada Ia variabilidad presentada en los experimentos con las formulaciones de entrega lenta y su comportamiento de control, se realizó una evaluación de alguno de los posibles factores que afectan las formulaciones elaboradas, colocando especial atención en SRL 25 el producto que mantuvo una eficiencia más constante durante el trabajo experimental. De este modo, durante el transcurso del cuarto semestre de experimentación (Agosto a Septiembre, 2005) se elaboraron 12 formulaciones del SRL 25, a base de extractos de quillay QL 1000, con distintas concentraciones de saponina y con Ia adición de compuestos que en experimentos pasados presentaron una disminución en el nivel de control del producto SRL 25. En base a este trabajo se demostró una diferencia notoria al secar estos extractos, por ejemplo: si un lote de extracto de quillay tiene 10,26% de saponinas implica que en un kilo de producto hay 102,6 g de saponinas, al secarlo quedan 22,5% de saponinas en el polvo. Lo anterior muestra que hay diferencias entre los distintos lotes de producto seco que varían entre 1 ,47 a 5,5% en su contenido de saponinas totales. Los resultados de esta experiencia permitieron determinar diferencias significativas (p<0,05) en los porcentajes de infección evaluados entre los tratamientos con respecto al tratamiento sin infección (Figura 7). Del análisis de resultados el SRL 25, elaborado con un extracto de quillay con un 11 , 2% de saponinas p/p, y al cual fueron adheridas giberelinas presentó el mayor nivel de control dentro de los productos a base de quillay (67,1% de control con respecto al testigo inoculado sin tratamientos) no siendo estadísticamente diferente a Silthiofam, el testigo comercial. Las formulaciones de SRL 25 sin el aditivo no presentaron diferencias estadísticamente significativas con respecto al testigo inoculado; a pesar de Io anterior, todas ellas redujeron Ia enfermedad y el SRL 25 elaborado a partir de un extracto con un 11 ,2% de saponinas fue el que presentó el mejor nivel de control con respecto al testigo enfermo (47,1% de control).
Estos resultados no concordaron con los obtenidos en experimentos anteriores, donde las formulaciones con compuestos adicionados presentaron niveles de infestación menores. Un análisis estadístico de las formulaciones de SRL 25 sin compuestos adicionales mostró diferencias con respecto al testigo inoculado, mientras que el SRL 25 con el nivel más bajo de saponinas (9,3%), no fue diferente del testigo inoculado y fue el que presentó un menor nivel de control, un 12,8%. Estos resultados reafirman el hecho que Ia diferencia en el contenido de saponinas entre otros factores asociados a los extractos influye en Ia formulación del mismo, dado Io errático de los resultados. Un ejemplo más claro corresponde al Lote 6 del extracto QL 1000, que poseía un 10,26% de saponinas y que al ser formulado no permitió una adecuada consistencia del productos favoreciendo Ia formación de grumos en el producto, razón por lo cual no pudo ser evaluado en experimentos en macetas. Finalmente y en general, el testigo con inoculo presentó, en promedio entre todas las experiencias, un nivel de índice de mal de Pie (Take all Index, TAI) de un 75,7, mientras silthiofam alcanzó un 24,6, SRL 25 un 38,3 y SRL 14 un 24,7. Estos resultados implican que en promedio el nivel de control alcanzado con respecto al testigo inoculado fueron de un 67,5%, un 49,4% y un 67,3%, respectivamente. Considerando los valores obtenidos por las formulaciones basadas en extractos de quillay, difieren al tratamiento comercial, pero consiguen niveles de control aceptables dentro de una explotación comercial agrícola.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola CARACTERIZADO porque esta compuesta por un ingrediente activo y polímeros sintéticos.
2. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 1 CARACTERIZADO porque el ingrediente activo es un extracto de Quillay
3. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 1 CARACTERIZADO porque el polímero sintético se selecciona de látex o resinas poliméricas, para permitir una entrega lenta del ingrediente activo presente en Ia combinación.
4. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a la reivindicación 3 CARACTERIZADO porque el polímero sintético permite generar una dispersión acuosa, un polvo, un granulo o un pellet.
5. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 4 CARACTERIZADO porque Ia dispersión acuosa utiliza un polímero sintético compuesto de acetato de vinilo, ester del ácido acrílico, libre de plastificantes y con una concentración de 50 % de plastificantes.
6. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 1 CARACTERIZADO por usar un extracto de quillay que aporta un 3.85% de saponinas a Ia composición, en una dispersión acuosa.
7. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 6 CARACTERIZADO porque Ia mezcla esta conformada en al menos 67 % de látex, al menos 18 % de extracto de Quillay y al menos 16 % de agua.
8. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 1 a 6 CARACTERIZADO porque comprende, adicionalmente, sales fertilizantes de potasio, fósforo, nitrógeno y hormonas vegetales.
9. Composición destinada al control del hongo Gaeυmannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 8 CARACTERIZADO porque opcionalmente comprende hormonas vegetales como ácido indol butírico.
10. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 9 CARACTERIZADO porque opcionalmente comprende fertilizantes que aportan nitrato, fosfato y potasio como di-hidrógeno fosfato de potasio y nitrato de potasio.
11. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 10 CARACTERIZADO porque los fertilizantes se aplican en una proporción de aproximadamente entre un 0,50 % y un 1,00 % de Ia suspensión concentrada.
12. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5, 8, 9,10 y 11 CARACTERIZADO porque comprende un extracto de quillay en polvo con al menos un 83% de saponinas de quillay.
13. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 12
CARACTERIZADO por usar un extracto de quillay que aporta un 12,4% de saponinas a Ia composición.
14. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 1 , 2, 3, y 4 CARACTERIZADO porque es una formulación en polvo con un polímero urea formaldehído, utilizado como un tratamiento al suelo.
15. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 14 CARACTERIZADO porque el producto en polvo esta compuesto de una resina polimérica termoendurecible que se obtiene a partir de Ia urea y del formaldehído, el cual es un polímero sintético plastificante.
16. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 15 CARACTERIZADO porque Ia mezcla está conformada en al menos un 6,92% de saponinas, que son obtenidas por Ia combinación de al menos un 76,92% de extractos de quillay QL1000, mezclados con al menos un 19,23% de polímero urea formaldehído y al menos 3,85% de cloruro de amonio.
17. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 1 , 2, 3, 4, 5 y 10 CARACTERIZADO porque es una formulación en granulos o pellets en mezcla con una arcilla bentonita y caolín, utilizado como un tratamiento al suelo.
18. Composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a la reivindicación 17
CARACTERIZADO porque el producto en granulos o pellets está compuesto de al menos un 46,05% de látex, al menos un 12,89% bentonita, al menos un 9,21% de caolín, al menos un 51 ,72% de extractos de quillay, al menos un 3,68% de dihidrógeno fosfato de potasio y nitrato de potasio.
19. Composición denominadas SRL 14 B Gran destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola, de acuerdo a Ia reivindicación 18 CARACTERIZADO porque Ia mezcla está conformada en al menos un 6,03% de saponinas, que son obtenidas por Ia combinación de al menos un 23,56% de extractos de quillay QL1000 y al menos un un 28,16% de QP 1000.
20. Procedimiento para preparar una composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola de acuerdo a Ia reivindicaciones 1 , 7, 11 y 12 CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: a) Pesaje de Ia cantidad de extracto de Quillay secado en estufa o spray en un recipiente, b) Adherir agua como solvente, c) Mezclar hasta que el polvo quede humedecido, d) Agregar el polimérico sintético, e) Mezclar hasta precipitar los solventes y generar una mezcla que debe quedar como una suspensión concentrada acuosa, con capacidad para ser trasvasada a contenedores con cierre hermético, f) Opcionalmente, previo a Ia mezcla, se pueden agregar sales fertilizantes y hormonas
21. Procedimiento para preparar una composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola de acuerdo a Ia reivindicación 20 CARACTERIZADO porque comprende utilizar sales fertilizantes en Ia etapa f) que aporten nitrato, fosfato y potasio como dihidrógeno fosfato de potasio y nitrato de potasio y trazas de hormonas vegetales tales como ácido indol butírico que son disueltos en Ia cantidad de agua presente en Ia composición.
22. Procedimiento para preparar una composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola de acuerdo a Ia reivindicaciones 1 , 13, 14 y 16 CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: a) Pesaje de Ia cantidad de extracto de Quillay en un recipiente, b) Agregar agua, c) Mezclar hasta que el polvo quede humedecido, d) Agregar el polímero urea formaldehído y cloruro de amonio como reticulante, e) Mezclar y secar en una estufa hasta que reticule. f) Moler el producto obtenido. g) Trasvasar el producto a contenedores con cierre hermético.
23. Procedimiento para preparar una composición destinada al control del hongo Gaeumannomyces causante del Mal de pie en trigo presente en Ia industria agrícola de acuerdo a Ia reivindicaciones 1 y 18 CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: a) Pesaje de Ia bentonita y reposado en agua por un tiempo, b) Filtrar Ia bentonita reposada y mezclar con el polimérico sintético hasta formar un barro, c) Pesar el extracto de quillay y mezclar con las sales fertilizantes, d) Mezclar los elementos descritos en b y c, más caolín hasta homogenizar, e) Extrusar Ia mezcla por un tubo plástico vacío, para generar los pellets o granulos, f) Secar los pellets o granulos, g) Trasvasar el producto a contenedores con cierre hermético.
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