WO2009153428A2 - Utilisation du trilostane pour le traitement de la depression - Google Patents

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WO2009153428A2
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trilostane
mice
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Claude Laruelle
Tangui Maurice
Julie Espallergues
Jamal Temsamani
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Cll Pharma
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the invention relates to the use of trilostane and its derivatives for the manufacture of medicaments for the treatment of depression, particularly in the elderly, as well as in patients suffering from Alzheimer's disease.
  • Depression is a major public health problem. It has been steadily increasing for many years. More and more people will experience a depressive episode in their lifetime. This is why it is considered the disease of the century by some specialists. It affects 340 million people worldwide and is currently the fifth leading cause of death and disability in the world.
  • the depressive syndrome associates a mental syndrome (depressed mood: pessimistic vision of the world and of oneself and psychomotor slowing), and a physical syndrome (sleep, diet and sexuality disorders).
  • the risk of suicide is high, absenteeism and the psychological and motor slowing down of patients represent a significant cost for society.
  • the depressions are divided into two major groups: major (or unipolar) depressions and bipolar depressions (or manic-depressive psychoses). These are characterized by the very rapid transition from depression to euphoria and vice versa.
  • the major depressions can be endogenous, that is to say without objective triggering factor, or psychogenic: they occur after a major stress such as a mourning, a rejection, a loss of work, health.
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease of brain tissue that causes progressive and irreversible loss of mental function. The leading cause of dementia in the elderly, it affects more than 30 million people worldwide. It is estimated that 40% of people with Alzheimer's disease suffer from depression. The relationship between depression and Dementia is very complex and is not completely understood.
  • Depression is associated with physical disability and cognitive decline in people with Alzheimer's disease. Depression is most commonly seen in the early phase of the pathology when patients are still aware of emerging gaps and in the later phase when the various neurotransmitter systems involved in the mood are dissociated (Urani et al, 2002). , in Behavioral Brain Research, 134, pp239-247). In this article, it is also indicated that the neuropathological attacks caused in depressed elderly people suffering from vascular dementia or by Alzheimer's disease appear to be more structural and less genetic compared to those observed during a classic depression. in the adult. Nevertheless, in both cases, the therapeutic strategies employed to date do not differ; it is still conventional antidepressants that are prescribed with controversial efficacy. Indeed, most patients are insensitive to these therapies. Thus, new therapies are needed to treat people with vascular dementia or Alzheimer's disease.
  • Conventional antidepressants all work on the same principle: to increase the lifespan of a neurotransmitter, and in particular biogenic amines (such as serotonin and norepinephrine) in the synaptic cleft. These neurotransmitters are released by the presynaptic element. The principle of neurotransmission is to be fast. After release, neurotransmitters must be removed from the synaptic cleft. For this, they are either degraded by monoamine oxidases or recaptured by the presynaptic element. Treatments include: - Monoamine oxidase inhibitors (MAOIs) that inhibit degradation and increase the availability of biogenic amines for release into the synaptic cleft.
  • MAOIs Monoamine oxidase inhibitors
  • Tricyclic antidepressants that inhibit reuptake and prolong the life of biogenic amines in the synaptic cleft and therefore their action on postsynaptic receptors.
  • Selective serotonin reuptake inhibitors that perform the same role as tricyclics but, as the name suggests, selectively on serotonin reuptake. This selectivity reduces the side effects of antidepressants.
  • the HPA axis consists of the hypothalamus, pituitary and adrenal glands.
  • Deregulation of the HPA axis is characterized by a increased release of adrenocorticotropin (ACTH) and thus circulating corticosterone (CORT), which may cause mood disorders.
  • ACTH adrenocorticotropin
  • CORT corticosterone
  • the CORT exerts a negative feedback on the HPA axis, whereas during the depression, it has been shown that this feedback exerted by the CORT is altered.
  • antidepressants correct the disturbances of the HPA axis (Boyle et al, PNAS, 2005, 102 (2): 473-478).
  • hippocampus modulates the activation of the HPA axis, in particular by exerting an inhibitory action on the hypothalamus.
  • the Applicant has investigated the use of trilostane (4,5-epoxy-17-hydroxy-3-oxoandrostane-17 ⁇ -ol-3-one) which is a modulator of enzymatic activity affecting the synthesis of neuroactive steroids. It blocks 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase (3 ⁇ -HSD) which converts pregnenolone into progesterone and then allopregnanolone (Potts GO et al., (1978) Steroids 32: 257-
  • Trilostane is currently marketed in England under the Modrenal® specialty; this is prescribed in pathologies related to hypercortisolemia, and also for the treatment of advanced breast cancer in postmenopausal women.
  • GBl patent application 123,770 discloses the use of trilostane in the treatment of pathologies such as Addison's disease (slow adrenal insufficiency), replacing deoxycorticosterone.
  • Various publications have shown that trilostane can be used to treat breast cancer, but in combination with another molecule (Coombes et al, Trilostane Therapy for Advanced Breast Cancer., Cancer Treat Rep 69: 4, 351-4, Apr, 1985, Chu et al, Trilostane with hydrocortisone in treatment of metastatic breast cancer., Breast Cancer Res Treat 13: 2, 117-21, Mar, 1989; Ingle et al, Evaluation of trilostane plus hydrocortisone in women with metastatic breast cancer and prior hormonal therapy exposure., Am J Clin Oncol 13: 2, 93-7, Apr, 1990; Williams et al., Multicentre cross-over study of aminoglutethimide and trilostane in postmenopausal advanced breast cancer., Clin Oncol (R CoI
  • EP1455831A discloses the combination of an antiprogestin which has FSH, meiotic activity and LRH - such as trilostane - with a progestin in order to promote controlled ovarian stimulation.
  • an antiprogestin which has FSH, meiotic activity and LRH - such as trilostane - with a progestin in order to promote controlled ovarian stimulation.
  • Le Roux et al Inhibition of progesterone secretion with trilostane for mid-trimester termination of pregnancy: randomized controlled trials., Hum Reprod 17: 6, 1483-9, Jun, 2002), which reports results of a clinical study at the end of which trilostane was considered effective during a termination of pregnancy; trilostane having been administered as pretreatment prior to administration of misoprostol.
  • Trilostane is already described for the treatment of hypercorticism (Cushing's syndrome) in dogs (Neiger R et al., (2002) Vet Rec 150: 799-804).
  • the application WO02080930 describes the use of trilostane as an inhibitor of the production of cortisol in the treatment of pathologies associated with high levels of adrenal hormone, and in particular alopecia in dogs, lamitis in horses, and Cushing in the dog and the horse.
  • trilostane possessed antidepressant and anxiolytic properties, acting on completely different targets than conventional antidepressants; it also shows that trilostane has the potential to effectively treat these conditions in the elderly, which is also an interesting alternative to known treatments.
  • the present invention thus relates to the use of trilostane or a derivative thereof in the preparation of a medicament for treating depression; trilostane being the preferred active ingredient.
  • trilostane means any active ingredient having a chemical structure very similar to that of trilostane such as epostane described in application DE2855091, and the active metabolites of trilostane and derivatives such as 17-ketotrilostane for trilostane.
  • anxiety is another indication that can be treated with trilostane or a derivative thereof.
  • Trilostane is particularly recommended for the treatment of depression in persons who have previously experienced adverse effects, such as, but not limited to, headache, hallucinations, or sleep disturbances after conventional antidepressants have been used.
  • trilostane makes it possible to reduce increased plasma levels of corticosterone which is a glucocorticoid marker for activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis.
  • trilostane or a derivative thereof is used in the preparation of a medicament for the treatment of depression in patients with Alzheimer's disease.
  • the Applicant has demonstrated in the present invention that trilostane has a potentiated (or increased) antidepressant effect in a murine model of Alzheimer's disease.
  • trilostane or one of the derivatives could therefore be a candidate to treat depressed patients who suffer from Alzheimer's disease in whom there are no suitable treatments i.e. not responding to conventional antidepressant treatments.
  • the antidepressant treatment of trilostane in persons with Alzheimer's disease is particularly suitable for elderly depressed persons.
  • a drug according to this invention may be administered: - orally, such as, for example, in the form of coated tablets or not, capsules, powders, granules, suspensions or oral solutions.
  • Such a form for oral administration may be either immediate release or extended or delayed release;
  • parenterally such as, for example, in the form of injectable preparations subcutaneously, intravenously or intramuscularly;
  • intranasally for example in the form of aerosols and sprays.
  • diluents, excipients and / or vehicles of the active molecule may be included.
  • the dose of trilostane or one of its derivatives to be administered is between 1 and 300 mg per patient; this range having been determined according to FDA recommendations "Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, July 2005 Pharmacology and Toxicology".
  • the dose to be administered will be between 10 and 100 mg per patient.
  • Figure 1 illustrates the dose-response effect obtained after short-term administration of trilostane in the forced swimming test in normal mice and castrated and adrenalectomized mice.
  • Figure 2 illustrates the antidepressant effect of trilostane in chronically stressed mice.
  • Figure 3 shows the antidepressant effect of trilostane in combination with conventional antidepressants.
  • Figure 4 shows the effect of trilostane administration on plasma levels of ACTH and CORT.
  • FIG. 5 represents the semi-quantitative analysis by RT-PCR of the expression of the 3 ⁇ -HSD gene as a function of stress and the administration of trilostane.
  • Figure 6 shows the effect of an inhibitor of 3 ⁇ -HSD (cyanoketone) in the forced swimming test
  • Figure 7 illustrates the effect of administration of an estrogen receptor downregulator (ICI 182,780, fulvestrant) on the antidepressant effect of trilostane.
  • ICI 182,780 an estrogen receptor downregulator
  • Figure 8 shows the semi-quantitative RT-PCR analysis of ⁇ -type estrogen receptor gene expression as a function of stress and trilostane administration.
  • Figure 9 shows the effects on locomotion and anxiolytic effects of trilostane in mice.
  • Figure 10 shows the effect of trilostane on the BDNF content of the hippocampus and hypothalamus.
  • Figure 11 shows the potentiated antidepressant effect of trilostane in a mouse model of Alzheimer's disease.
  • Anhedonia is one of the symptoms of depressed animals. During this test was evaluated the preference for drinking a solution of sucrose (4%) compared to tap water. Previously, 4 mice were placed in the same cage one week before the test and were deprived of water 16 hours before each measurement. They were presented with 2 bottles of previously weighed liquids: one containing tap water and the other a solution containing 4% sucrose. The bottles were weighed 1 hour later to estimate the average fluid consumption per hour and per mouse. Then the mice had free access to tap water for 6 hours. The test was performed daily during the last 6 days of chronic stress.
  • the forced swimming test was performed in control mice (non-adrenalectomized and castrated) and in adrenalectomized and castrated mice (AdX / Cx), in order to determine whether the administration of trilostane systemically (subcutaneous route) ) could have properties as an antidepressant, and also if its action is peripheral or central.
  • the AdX / Cx mice thus no longer produce endogenous glucocorticoids and allow the study of exogenous glucocorticoid effects after their administration.
  • the forced swimming test is the most commonly used animal test for the demonstration of potential antidepressant activity.
  • the principle is to induce a behavioral despair evaluated by measuring the immobility time of the animals. This test has several variants. The one we use runs on two separate 24-hour sessions:
  • the forced swimming test was performed on a batch of 12 Swiss male mice (Debou, St Doulchard, France), aged 6 to 8 weeks and weighing 32 ⁇ 2g.
  • the groups of animals are housed in plastic cages. They have free access to food and water, except during behavioral experiments where they are kept in a controlled environment (22 ⁇ 1 ° C, 40-60% moisture) under a day / night cycle from 12 o'clock (day to 7:00).
  • the experiments are carried out between 09h00 and 17h00 in an experimental room located in the animal room and are preceded by a period of 30 minutes of rest. All animal procedures are conducted in strict compliance with EC directives of 24/11/1986.
  • Trilostane was purchased commercially; it was suspended in pure sesame oil and injected subcutaneously (se) in a volume of 100 ⁇ l per 20 g of body weight. Recording and data processing
  • the session was recorded by a CDD camcorder connected to a microcomputer and the movements were analyzed using Videotracks® software (Viewpoint, Champagne-au-Mont-d'Or, France). Two levels of pixel changes were analyzed to discriminate on the one hand between immobility and fight, and on the other hand between fight and swim. Since only immobility is unequivocally considered as a parameter of behavioral despair, the other behaviors have not been analyzed.
  • mice were found to show persistent weight loss compared with unstressed controls 1, 2 or 3 weeks after stress initiation. Mice sacrificed 24 hours after the last restraint session show a very significant increase in the weight of the adrenal glands. The group of stressed mice consumes more fluid over time than the controls. Anhedonia (preferably sucrose in our case) is significantly superior in unstressed control mice (approximately 80%) compared to stressed mice (approximately 60%) for each day of measurement.
  • Anhedonia preferably sucrose in our case
  • mice 1 to 12 per group
  • mice were immobilized in plastic tubes for 3 hours a day, between 11:00 and 14:00, for 21 days. Thus, the movements of their head and their limbs are limited. Control mice stay at the pet shop during the stress period. 24 hours after the last restraint session, the animals were subjected to a 6-minute forced swimming session. Trilostane was administered subcutaneously 16 hours and 2 hours before the session
  • Sertraline an antidepressant that inhibits the serotonin transporter, also has a very important affinity for the sigma-1 receptor. thus contributing to its pharmacological activity.
  • Fluoxetine is another antidepressant that selectively inhibits the serotonin transporter which significantly reduces the immobility time of the mice at 30 and 60 mg / kg ip ( Figure 3B).
  • Desipramine a tricyclic antidepressant that inhibits serotonin and norepinephrine transporters, reduces the immobility time of mice at
  • Imipramine another tricyclic antidepressant, has an antidepressant effect in the forced swim test at the same doses as desipramine ( Figure 3D).
  • Trilostane treatment shows an antidepressant effect that is additive to that of the classical antidepressants tested here. This effect appears to be greater when trilostane treatment is combined with SSRI antidepressants ( Figure 3A and 3B) and is significant with high dose sertraline.
  • ACTH hormone is synthesized by the corticotropic cells of the anterior pituitary. ACTH stimulates the production of CORT by the adrenal cortex. Secretion of ACTH is controlled by a hypothalamic-pituitary-adrenal regulatory mechanism and depends mainly on the plasma CORT rate.
  • ELSA ACTH radioactive kit
  • ORIS Group ORIS Group
  • Gif-sur-Yvette France
  • Two monoclonal antibodies were prepared against two antigenic sites distant from each other on the ACTH molecule, the first is absorbed on the ELSA solid phase and recognizes the N-terminal portion, the second labeled with 125 I-iodine is used as a tracer and recognizes the C-terminal part.
  • the ACTH molecules present in the standards or the samples to be tested are sandwiched between the two antibodies. The excess tracer is easily removed by a washing step, so there remains on the ELSA only the adsorbed antibody / antigen / labeled antibody complex.
  • the radioactivity related to the ELSA is then proportional to the amount of ACTH initially present in the test.
  • the blood samples are collected from the brains in 1 mg / ml of EDTA; they are centrifuged at 40 ° C., and the plasma is stored at -20 ° C. with addition of 5 ⁇ l of aprotinin (7.6 ⁇ LVmI, Sigma-Aldrich) until it is used.
  • Plasma ACTH is tested using an RIA kit in 50 ⁇ l of non-extracted samples, according to the manufacturer's instructions. The minimum detectable ACTH concentration was 2 ⁇ g / ml and the variation coefficients of the internal and external assay were 6% and 5%, respectively. Plasma corticosterone concentration was measured using an ELISA test using 100 ⁇ l of non-extracted samples as recommended by the manufacturer (Oxford Biomedical Research, Oxford, MI, USA).
  • Trilostane is a modulator of enzymatic activity affecting the synthesis of neuroactive steroids. It blocks 3 ⁇ -HSD, which converts pregnenolone into progesterone and then allopregnanolone.
  • the effect of short-term administration of trilostane is analyzed by RT-PCR in the brain, on hippocampal mRNA preparations, and peripherally on adrenal gland mRNA preparations as a function of stress and administration of trilostane.
  • RNAs that will be used for the analysis of 3 ⁇ -HSD and ER ⁇ mRNAs and for semi-quantitative analysis by RT-PCR, the control and stressed animals are sacrificed by decapitation after 15 minutes of swimming. forced.
  • RNA extraction The total RNAs are then extracted from the tissues using the High Pure RNA Tissue Kit (Roche, Meylan, France) according to the manufacturer's recommendations. The concentration and purity of the RNAs are evaluated by optical density spectrometry (measurements at 260 and 280 nm).
  • the cDNA synthesis is then carried out by means of the reverse transcriptase from a reaction mixture of 20 ⁇ l.
  • 1 ⁇ g of total RNA is mixed with 2 ⁇ l of random hexamer primers (0.5 ⁇ g / ⁇ l) (Amersham, Orsay, France) and is left incubate at 70 ° C for 5 minutes.
  • the solution is mixed with 8 ⁇ l of 5X buffer, 2 ⁇ l of each of dATP, dTTP, dCTP, dGTP (each 10 mM) and 1 ⁇ l (200 ⁇ l, Promega) of reverse transcriptase of Moloney murine leukemia virus ( M-MLV RT) and the reaction is carried out according to the instructions of the kit. Parallel reactions are carried out in the absence of enzyme to evaluate a possible contamination.
  • amplification of PCR 1 ⁇ l of total cDNA synthesized in reverse transcription reaction is used for the following primers.
  • the primers used to detect 3 ⁇ -HSD are those described by Schulte et al. (2007): AATCTGAAAGGTACCCAGAA (sense) and TCATCATAGCTTTGGTGAGG (antisense).
  • the primers used to detect ER ⁇ are those described by Thakur et al. (2007): ACAGTCCTGCTGTGATGAAC (meaning) and
  • PCR reactions are performed using the Quantum RNA Classic 18S kit (Ambion).
  • the amplified cDNAs are separated by electrophoresis on 2% agarose gel and revealed with ethidium bromide. The ratios are expressed as a percentage of the control value.
  • fulvestrant is a molecule that does not pass the blood-brain barrier, so this confirms once again a peripheral rather than central action of trilostane.
  • Trilostane at 25 mg / kg sc, induces a significant increase in ER ⁇ expression in the hippocampus and adrenal glands, but the expression is not increased by stress. This increase, related to treatment, is greater in the hippocampus ( Figure 8A) than in the adrenal glands ( Figure 8B). In untreated animals, forced swimming stress also increases ER ⁇ expression.
  • the open-field session consists of placing the mouse in the center circle and measuring its movements for 10 minutes using a video camera. The following parameters were evaluated: (1) locomotion activity, in terms of numbers of traversed parts, is then calculated as distance traveled in meters; (2) duration of immobility; (3) speed of locomotion; (4) locomotion activity in the 5 central parts; (5) recoil frequency; (6) grooming frequency, and (7) number of bowel movements.
  • Locomotion activity in terms of numbers of traversed parts, is then calculated as distance traveled in meters; (2) duration of immobility; (3) speed of locomotion; (4) locomotion activity in the 5 central parts; (5) recoil frequency; (6) grooming frequency, and (7) number of bowel movements.
  • the locomotion activity was measured specifically in transparent PVC cages (40X40X25cm high), using an infrared ray counter (Columbus Instruments). The animals were placed 2 hours in the cages and the horizontal activity was recorded after 1 hour and for 1 hour with 10 minute intervals.
  • mice The anxiety state of the mice was assessed using their ability to explore a cross-shaped labyrinth, where 2 open and unprotected branches painted white, and 2 closed branches painted black.
  • the branches that extend from the central platform, and the labyrinth are raised 50 cm from the ground.
  • Each mouse was placed in the center of the labyrinth and his exploratory behavior was recorded for 10 minutes.
  • the time spent and the number of entries in the open or closed branches have been recorded. The results are expressed in total time spent in the branches; total number of entries in the branches as well as time spent in each branch per visit.
  • Exploration box light / dark (or "Light / dark exploratory box")
  • Anxiety was also assessed by measuring the presence of a lit compartment in the light / dark exploratory box.
  • the PVC device has been divided into 2 compartments, one with a bottom and walls in white (30X25X25cm high); the second with a bottom and walls in black (15X25X25cm high), separated by a 6X6cm door.
  • a bulb bulb (75W) was placed 1.5m above a white compartment.
  • Each mouse was placed in the white compartment and the exploratory activity was videotaped and analyzed using Videotrack® software (Viewpoint).
  • Trilostane was administered in 2 injections, in the dose range of 6.3 to 50 mg / kg SC.
  • Figure 9c shows that during the "elevated plus-maze test", trilostane increases the time spent in open branches with a dose-response effect in Gauss curve. A significant effect was observed at a dose of 12.5 mg / kg.
  • Treatment also reduced entry into the closed limb (see Figure 9d), in a strictly dose-dependent relationship with a significant effect for the highest dose, but not for open limbs (see Figure 9d).
  • trilostane increases the time spent in the white compartment (see Figure 9e) with a Gauss dose-response effect, a significant effect being observed at a dose of 12.5 mg / kg.
  • BDNF neurotrophin has been reported to be involved in the regulation of the HPA axis in response to acute or chronic stress, and in particular there has been a rapid increase in mRNA levels encoding BDNF in the hippocampus, the hypothalamus and the pituitary gland. Else On the other hand, some studies reveal that BDNF is involved in depression. Thus, it has been undertaken in the context of the invention to perform assays of this neurotrophin in the hippocampus and the hypothalamus.
  • Figure 10 shows the BDNF assays for hippocampi (a) and hypothalamus (b) after administration of trilostane in a range of doses ranging from 6.3 to 50 mg / kg subcutaneously, in unstressed control mice and in mice that had undergone 15 minutes of forced swimming on days 1 and 2.
  • the stress induces a significant 29% increase in BDNF concentration, which was not attenuated by the administration of trilostane, and that in the hypothalamus, no significant change in BDNF content was observed after administration of trilostane.
  • Stress due to forced swimming induced a 27% increase in BDNF, which was not attenuated in a dose dependent manner by trilostane.
  • Doses of 25 and 50mg / kg induce significant blockade of stress-induced increase in BDNF content.
  • EXAMPLE 10 Antidepressant effect of trilostane on a murine model of Alzheimer's disease. Forced swimming test.
  • Alzheimer's disease was artificially developed in mice by injecting intracerebroventricular (icv) peptides 25-35 of the ⁇ amyloid protein (hereinafter referred to as A ⁇ 25-35 ).
  • a ⁇ 25-35 intracerebroventricular peptides 25-35 of the ⁇ amyloid protein
  • the results are compared to those obtained on control mice in which a control peptide (called “scrambled” or ScA ⁇ ) is injected. Then all the mice are injected with trilostane before being forced to swim.
  • mice Male Swiss OF1 mice (Debou, Saint Doulchard, France) aged 7 weeks and weighing 32 ⁇ 2 g, were used in this study. The animals were placed in plastic cages, in groups, in a standard pet shop; in a regulated environment (23 ⁇ 1 ° C, hygrometry 40-60%) and under a cycle of 12h of day / 12h of night. Except during behavioral experiments, standard water and food was freely available,
  • the peptide P 25-35 amyloid (Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met, Ap 25-35 ) and the control peptide (Ala-Lys-Ile-Gly-Asn- Ser-Ile-Gly-Leu-Met-Gly, ScAP) were provided by Genepep (Prades-le-Lez, France). They are solubilized and aliquoted in sterile double distilled water at a concentration of 3 mg / ml and stored at -20 ° C. before use. Trilostane is suspended in sesame oil (Sigma / Aldrich, Saint Quentin-Fallavier, France).
  • the peptide solutions are incubated for 4 days at 37 ° C. to cause aggregation of the Ap 25-35 peptide (Maurice et al., 1996,
  • Trilostane is injected subcutaneously (s.c.) at doses of 3.12 mg.kg; 6.25 mg / kg;
  • mice received vehicle solution (sesame oil).
  • the planning of the experiment is thus the following one: o to J 0: injection in icv of the peptides Ap 25-35 or ScA ⁇ o to J 6
  • results are analyzed by an independent two-parameter analysis of variance (ANOVA) (i.c.v. processing and s.c) followed by a Dunnett posterior comparison test.
  • ANOVA independent two-parameter analysis of variance
  • trilostane is effective as an antidepressant in animals treated with Ap 25-35 (reproducing Alzheimer's disease) as well as in those treated with the control peptide (not reproducing Alzheimer's disease). Nevertheless, it is important to note that the effective dose is significantly lower in the case of mice in which Alzheimer's disease is induced. Indeed, a dose of 6.25 mg / kg of trilostane is sufficient in mice treated with the amyloid peptide Ap 25-35 while a significantly higher dose of trilostane is required - 25 mg / kg- to obtain an effect. antidepressant in control mice (treated with ScA ⁇ ). Finally, it should be noted that at higher trilostane doses, the antidepressant effect of trilostane is substantially reduced in Ap 25-35 peptide treated mice when compared to the lower dose.

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Abstract

La présente invention se rapporte à des nouvelles indications thérapeutiques du trilostane ou d'un de ses dérivés, comme antidépresseur et comme anxiolytique. En particulier, l'invention montre que le trilostane a un effet antidépresseur potentialisé (accru) chez des patients atteints par la maladie d'Alzheimer. De plus, la population des personnes âgées est particulièrement visée par cette invention.

Description

UTILISATION DU TRILOSTANE POUR LE TRAITEMENT DE LA DEPRESSION
L'invention concerne l'utilisation du trilostane et de ses dérivés pour la fabrication de médicaments dans le traitement de la dépression, en particulier chez les sujets âgés, ainsi que chez des patients atteints par la maladie d'Alzheimer.
La dépression est un problème majeur de santé publique. Elle est en augmentation constante depuis de nombreuses années. De plus en plus de personnes connaîtront un épisode dépressif au cours de leur vie. C'est pourquoi, elle est d'ailleurs considérée comme la maladie du siècle par certains spécialistes. Elle touche 340 millions de personnes dans le monde et est actuellement la cinquième cause de mortalité et de handicap dans le monde. Le syndrome dépressif associe un syndrome mental (humeur dépressive : vision pessimiste du monde et de soi-même et ralentissement psychomoteur), et un syndrome physique (troubles du sommeil, de l'alimentation et de la sexualité). Le risque de suicide est important, l'absentéisme et le ralentissement psychique et moteur des malades représentent un coût important pour la société.
Les dépressions sont divisées en deux grands groupes : les dépressions majeures (ou unipolaires) et les dépressions bipolaires (ou psychoses maniaco- dépressives). Ces dernières sont caractérisées par le passage très rapide de la dépression à l'euphorie et vice versa. Les dépressions majeures peuvent être endogènes, c'est à dire sans facteur déclenchant objectif, ou psychogènes : elles surviennent après un stress important tel qu'un deuil, un rejet, une perte du travail, de la santé. La maladie d'Alzheimer est une maladie neurodégénérative du tissu cérébral qui entraîne la perte progressive et irréversible des fonctions mentales. Principale cause de démence chez les personnes âgées, elle touche plus de 30 millions de personnes dans le monde. On estime que 40% des personnes atteintes par la maladie d'Alzheimer souffrent de dépression. La relation entre la dépression et la démence est très complexe et n'est pas complètement comprise. La dépression est associée à une incapacité physique et un déclin cognitif chez les personnes soufrant de la maladie d'Alzheimer. La dépression est observée le plus souvent lors de la phase précoce de la pathologie quand les patients sont encore conscients des lacunes naissantes et lors de la phase plus tardive quand les divers systèmes de neurotransmetteurs impliqués dans l'humeur sont dissociés (Urani et al, 2002, in Behavioural brain research, 134, pp239-247). Dans cet article, il est également indiqué que les atteintes neuropathologiques provoquées chez des personnes âgées déprimées atteintes par une démence vasculaire ou par la maladie d'Alzheimer apparaissent être plus d'ordre structural et moins génétique comparé à ceux observés lors d'une dépression classique chez l'adulte. Néanmoins, dans les 2 cas, les stratégies thérapeutiques employées à ce jour ne différent pas ; ce sont toujours les antidépresseurs classiques qui sont prescrits avec une efficacité controversée. En effet, la plupart des patients sont insensibles à ces thérapies. Ainsi, de nouvelles thérapies sont nécessaires pour traiter les personnes atteintes par une démence vasculaire ou par la maladie d'Alzheimer.
Les antidépresseurs classiques fonctionnent tous selon le même principe : augmenter la durée de vie d'un neurotransmetteur, et en particulier les aminés biogènes (telles que la sérotonine et la noradrénaline) dans la fente synaptique. Ces neurotransmetteurs sont libérés par l'élément présynaptique. Le principe de la neurotransmission est d'être rapide. Après leur libération, les neurotransmetteurs doivent être éliminés de la fente synaptique. Pour cela, ils sont, soit dégradés par les monoamine oxydases, soit recapturés par l'élément présynaptique. Parmi les traitements, on distingue : - Les inhibiteurs des monoamine oxydases (IMAO) qui inhibent la dégradation et augmentent la disponibilité des aminés biogènes pour la libération dans la fente synaptique.
Les antidépresseurs tricycliques qui inhibent la recapture et prolongent la durée de vie des aminés biogènes dans la fente synaptique et donc leur action sur les récepteurs post-synaptiques. Les inhibiteurs sélectifs de recapture de la sérotonine (ISRS) qui exercent le même rôle que les tricycliques mais, comme leur nom l'indique, sélectivement sur la recapture de sérotonine. Cette sélectivité permet de réduire les effets secondaires des antidépresseurs. Par ailleurs, l'efficacité des antidépresseurs est contestée dans plusieurs études dont une récente anglo-américaine réalisée sur les antidépresseurs parmi les plus prescrits (Prozac®, Deroxat®, Zoloft® et Seropram®) et dans laquelle les chercheurs concluent que ces médicaments n'auraient guère plus d'effets que des placebos (Kirsch et al, Plos Médecine, février 2008, vol.5, issue 2) ; dans une autre étude, il est indiqué que leur efficacité est surévaluée (Healthfacts, Nov, 1992) ; ces études ne font pas référence à une sous population particulière. En ce qui concerne les personnes âgées, l'efficacité réelle des antidépresseurs fait l'objet de controverses (Paille et al, Vol4, N°21 p9-34, Masson 2004). Plusieurs études, dont une réalisée au Canada, ont révélé que les ISRS ont des effets néfastes sur la santé mentale chez les personnes âgées et en particulier il a été constaté un risque accru de tentatives de suicide lors du premier mois de traitement (Juurlink et al, The American journal of psychiatry, 2006, Vol.163, n°5 pp813-821).
De plus, tous ces antidépresseurs présentent deux défauts majeurs : 1) leur délai d'action est important, 2) il faut au minimum deux à trois semaines avant d'obtenir un effet; et la proportion de personnes insensibles au traitement, notamment les sujets âgés, est très importante.
Etant donné que les antidépresseurs classiques ne sont pas pleinement satisfaisants et en particulier parmi la population âgée, il est donc utile de rechercher et mettre en œuvre d'autres traitements qui agissent sur d'autres cibles et sont susceptibles de pallier aux déficiences des premiers.
Parallèlement à ces déficiences monoaminergiques, dans la dépression et en général lors d'un stress, il y a entre autres, l'activation de l'axe HPA qui est en fait la voie neuroendocrinienne finale commune de tous les circuits centraux activés au cours du stress. L'axe HPA est constitué de l'hypothalamus, de l'hypophyse et des glandes surrénales. Une dérégulation de l'axe HPA se caractérise par une augmentation de la libération de Padrénocorticotropine (ACTH) et donc de la corticostérone (CORT) circulante, qui pourra provoquer des troubles de l'humeur. Lors d'une situation normale, la CORT exerce un feedback négatif sur l'axe HPA, alors que lors de la dépression, il a été démontré que ce feedback exercé par la CORT est altéré. D'ailleurs les antidépresseurs corrigent les perturbations de l'axe HPA (Boyle et al, PNAS, 2005, 102(2) :473-478).
Une autre structure importante, l'hippocampe, module l'activation de l'axe HPA notamment en exerce une action inhibitrice sur l'hypothalamus.
La Demanderesse s'est intéressée à l'utilisation du trilostane (4,5-epoxy-17- hydroxy-3-oxoandrostane-17β-ol-3-one) qui est un modulateur d'activité enzymatique affectant la synthèse des stéroïdes neuroactifs. Il bloque la 3beta- hydroxystéroïde deshydrogénase (3β-HSD) qui convertit notamment la prégnénolone en progestérone puis en alloprégnanolone (Potts GO et al, (1978) Steroids 32:257-
67 ; Young J et al, (1994) Endocrine 2:505-9 ; Phan VL et al, (1999) Eur J Neurosci 11:2385-96). Le blocage de cette enzyme va donc permettre de modifier les taux en neurostéroïdes, hormones synthétisées en périphérie et par le cerveau et servant de neuromodulateurs très puissants.
Le trilostane est actuellement commercialisé en Grande-Bretagne sous la spécialité Modrenal® ; celle-ci étant prescrite dans les pathologies liées à l'hypercortisolémie, et également pour le traitement du cancer du sein avancé chez des femmes ménopausées.
La demande de brevet GBl, 123,770 divulgue l'utilisation du trilostane dans le traitement de pathologies comme la maladie d'Addison (insuffisance surrénale lente), en remplacement de la désoxycorticostérone. Diverses publications ont montré que le trilostane pouvait être utilisé pour traiter le cancer du sein, mais en association avec une autre molécule (Coombes et al, Trilostane therapy for advanced breast cancer., Cancer Treat Rep 69: 4, 351-4, Apr, 1985 ; Chu et al, Trilostane with hydrocortisone in treatment of metastatic breast cancer., Breast Cancer Res Treat 13: 2, 117-21, Mar, 1989 ; Ingle et al, Evaluation of trilostane plus hydrocortisone in women with metastatic breast cancer and prior hormonal therapy exposure., Am J Clin Oncol 13: 2, 93-7, Apr, 1990 ; Williams et al., Multicentre cross-over study of aminoglutethimide and trilostane in advanced postmenopausal breast cancer., Clin Oncol (R CoIl Radiol) 7: 2, 87-92, 1995). La demande EP125553A divulgue l'utilisation du trilostane en association avec un antioestrogène (de type tamoxifène) pour le traitement de cancers.
La demande EP1455831A divulgue l'association d'un antiprogestatif qui a une activité FSH, méïotique et LRH -comme le trilostane - avec un progestatif dans le but de favoriser une stimulation ovarienne contrôlée. Dans la publication Le Roux et al, (Inhibition of progestérone sécrétion with trilostane for mid-trimester termination of pregnancy: randomized controlled trials., Hum Reprod 17: 6, 1483-9, Jun, 2002), qui fait état de résultats d'une étude clinique au terme de laquelle le trilostane a été considéré comme étant efficace lors d'une interruption de grossesse ; le trilostane ayant été administré en tant que prétraitement avant l'administration du misoprostol.
On peut également citer les demandes EP1895964A et WO06064291A qui divulguent respectivement l'utilisation du trilostane dans une indication dermatologique liée à une modification de croissance des vaisseaux sanguins notamment, et son utilisation dans le traitement de cancers de la peau par inhibition de l'angiogénèse et/ou la vasculogénèse.
Le trilostane est déjà décrit pour le traitement de l'hypercorticisme (syndrome de Cushing) chez le chien (Neiger R et al, (2002). Vet Rec 150:799-804). La demande WO02080930 décrit l'utilisation du trilostane comme inhibiteur de la production de cortisol dans le traitement de pathologies associées aux taux élevés d'hormone surrénales, et en particulier l'alopécie chez le chien, la lamitis chez le cheval, et la maladie de Cushing chez le chien et le cheval. Même si cette demande PCT spécule sur ces pathologies en les citant simplement, elle ne décrit nullement l'utilisation du trilostane dans le traitement de la dépression ou de l'anxiété chez l'animal, et encore moins le potentiel d'utiliser le trilostane ou ses dérivés pour induire une forte augmentation de l'expression des récepteurs aux oestrogènes ERβ, ni pour traiter la dépression chez des sujets âgés.
La Demanderesse a montré dans la présente invention, que le trilostane possédait des propriétés comme antidépresseur et anxiolytique, en agissant sur des cibles complètement différentes de celles des antidépresseurs classiques ; elle montre également que le trilostane a le potentiel pour traiter efficacement ces pathologies chez les personnes âgées, constituant aussi une alternative intéressante aux traitements connus.
Selon un premier aspect, la présente invention se rapporte donc à l'utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés dans la préparation d'un médicament en vue de traiter la dépression ; le trilostane étant le principe actif préféré.
On entend par « dérivé » du trilostane, tout principe actif ayant une structure chimique très proche de celle du trilostane comme l'épostane décrit dans la demande DE2855091, et les métabolites actifs du trilostane et dérivés comme le 17- kétotrilostane pour le trilostane.
Selon un second aspect, l'anxiété est une autre indication pouvant être traitée par le trilostane ou un dérivé de celui-ci.
Les Inventeurs ont en effet montré chez l'animal que le trilostane est efficace pour ces deux indications et sans altérer l'activité générale comme la locomotion, vitesse de déplacement ou lors des réponses stéréotypées.
Le trilostane est particulièrement recommandée pour traiter la dépression chez des personnes qui ont auparavant subi des effets indésirables comme par exemple, de manière descriptive mais non limitative, des céphalées, des hallucinations ou des troubles du sommeil, après utilisation des antidépresseurs classiques.
Les Inventeurs ont montré que l'effet du trilostane disparaît chez les souris surrénalectomisées et castrées, suggérant une action périphérique plutôt que centrale. Par ailleurs, les Inventeurs ont montré également que le trilostane permet de réduire l'augmentation des taux plasmatiques en corticostérone qui est un glucocorticoïde marqueur de l'activation de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien.
Selon un aspect particulier de l'invention, le trilostane ou un dérivé de celui-ci est utilisé dans la préparation d'un médicament pour le traitement de la dépression chez les patients atteints par la maladie d'Alzheimer. La Demanderesse a démontré dans la présente invention que le trilostane a un effet antidépresseur potentialisé (ou accru) dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, le trilostane ou l'un des dérivés pourrait donc être un candidat pour traiter des patients déprimés qui souffrent de la maladie d'Alzheimer chez qui il n'existe pas de traitements adaptés i.e. ne répondant pas aux traitements classiques d'antidépresseurs. De préférence, le traitement antidépresseur du trilostane chez des personnes atteintes par la maladie d'Alzheimer s'adresse tout particulièrement à celles déprimées âgées.
Un médicament selon cette invention pourra être administré : - par voie orale, comme par exemple, sous forme de comprimés enrobés ou non, de gélules, de poudres, de granulés, de suspensions ou de solutions orales. Une telle forme pour l'administration par voie orale peut être soit à libération immédiate, soit à libération prolongée ou retardée ;
- par voie parentérale, comme par exemple, sous forme de préparations injectables par voie sous-cutanée, intraveineuse ou intramusculaire;
- par voie rectale, comme par exemple, sous forme de suppositoires ;
- par voie topique, notamment transdermique, comme par exemple, sous la forme de " patch ", de pommade ou de gel.
- par voie intranasale, comme par exemple sous forme d'aérosols et " sprays ".
En fonction de la voie d'administration choisie, des diluants, excipients et/ou véhicules de la molécule active pourront être inclus.
Typiquement, la dose du trilostane ou l'un de ses dérivés à administrer est comprise entre 1 et 300 mg par patient ; cette fourchette ayant été déterminée selon les recommandations de la FDA « Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers, JuIy 2005 Pharmacology and Toxicology ». De préférence, la dose à administrer sera comprise entre 10 et 100 mg par patient. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, annexés par les figures suivantes :
La figure 1 illustre l'effet dose/réponse obtenu après administration à court terme de trilostane dans le test de la nage forcée chez des souris normales et des souris castrées et surrénalectomisées. - La figure 2 illustre l'effet antidépresseur du trilostane chez les souris stressées chroniquement.
La figure 3 représente l'effet antidépresseur du trilostane en association avec les antidépresseurs classiques.
La figure 4 montre l'effet de l'administration du trilostane sur les taux plasmatiques d'ACTH et de CORT.
La figure 5 représente l'analyse semi-quantitative par RT-PCR de l'expression du gène de la 3β-HSD en fonction du stress et de l'administration du trilostane.
La figure 6 représente l'effet d'un inhibiteur de la 3β-HSD (cyanokétone) dans le test de nage forcée
La figure 7 illustre l'effet de l'administration d'un down-régulateur des récepteurs aux estrogènes (ICI 182,780, fulvestrant) sur l'effet antidépresseur du trilostane.
La figure 8 montre l'analyse semi-quantitative par RT-PCR de l'expression du gène aux récepteurs aux estrogènes de type β en fonction du stress et de l'administration du trilostane.
La figure 9 montre les effets sur la locomotion et les effets anxiolytiques du trilostane chez la souris. La figure 10 montre l'effet du trilostane sur le contenu en BDNF de l'hippocampe et l'hypothalamus.
La figure 1 1 montre l'effet antidépresseur potentialisé du trilostane dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer.
EXEMPLE 1 ; Effet antidépresseur du trilostane chez les souris stressées de façon chronique
L'efficacité du stress chronique a été évaluée chez des souris soumises à un stress pendant 3 heures par jour pendant 3 semaines en terme de changement du poids corporel (figure 2a) ; du poids des glandes surrénales (figure 2b) et d'une réponse anhédonique -préférence au saccharose dans notre cas-(figure 2c, 2d). Ensuite, l'effet du trilostane a été évalué chez ces souris stressées chroniquement en utilisant le test de la nage forcée.
Mesure de la préférence au saccharose (anhédonie) L'anhédonie est un des symptômes des animaux déprimés. Au cours de ce test a été évaluée la préférence pour boire une solution de saccharose (4%) par rapport à l'eau du robinet. Préalablement, on disposait 4 souris dans une même cage, une semaine avant le test et on les privait d'eau 16 heures avant chaque mesure. On leur présentait 2 bouteilles de liquides préalablement pesées : une contenant de l'eau du robinet et l'autre une solution contenant 4% de saccharose. Les bouteilles étaient pesées 1 heure après afin d'estimer la consommation moyenne de liquide par heure et par souris. Ensuite, les souris avaient libre accès à l'eau du robinet pendant 6 heures. Le test était réalisé tous les jours pendant les 6 derniers jours du stress chronique.
Test de la naee forcée chez des souris Swiss témoins et surrénalectomisées et castrées (AdX/Cx)
Le test de la nage forcée a été réalisé chez des souris témoins (non surrénalectomisées et castrées) et chez des souris surrénalectomisées et castrées (AdX/Cx), de façon à déterminer si l'administration de trilostane par voie systémique (voie sous-cutanée) pouvait avoir des propriétés comme antidépresseur, et également si son action est périphérique ou centrale. Les souris AdX/Cx ne produisent donc plus de glucocorticoïdes endogènes et permettent l'étude des effets de glucocorticoïde exogène après leur administration.
Le test de la nage forcée constitue le test animal le plus couramment utilisé pour la mise en évidence d'une activité potentielle d'antidépresseur. Le principe est d'induire un désespoir comportemental évalué par la mesure du temps d'immobilité des animaux. Ce test possède plusieurs variantes. Celle que nous utilisons se déroule sur deux sessions séparées de 24 heures :
- au 1er jour : l'animal est mis dans un bêcher à moitié rempli d'eau à 22 - 23°C pendant 15 min. L'animal se débat, nage, et essaie de grimper le long des parois pendant quelques minutes avant de réaliser qu'il n'y a pas d'issue possible. Il reste alors immobile à la surface de l'eau. Une souris est considérée comme immobile quand elle ne se débat pas et flotte à la surface de l'eau, en ne faisant que les mouvements nécessaires pour garder la tête hors de l'eau. Après ce pré-test, les animaux retrouvent leur cage et retournent à l'animalerie ;
- au 2eme jour : chaque souris est remise dans le bêcher et on ne mesure l'immobilité de l'animal que sur les 5 dernières minutes d'une session de 6 min. La durée d'immobilité observée est considérée comme une mesure de l'état de désespoir comportemental de l'animal. Animaux :
Le test de la nage forcée a été réalisé sur un lot de 12 souris mâles Swiss (Depré, St Doulchard, France), âgées de 6 à 8 semaines et pesant 32 ±2g. Les groupes d'animaux sont logés dans des cages en plastique. Ils ont un libre accès à la nourriture et à l'eau, sauf lors des expériences comportementales au cours desquelles ils sont gardés dans un environnement régulé (22±1°C, 40-60% d'humidité) sous un cycle jour/nuit de 12 heures (jour à 07h00). Les expériences sont réalisées entre 09h00 et 17h00 dans un local expérimental situé dans l'animalerie et sont précédées par une période de 30 minutes de repos. Toutes les procédures animalières sont conduites selon un respect strict des directives EC du 24/11/1986. Molécule active
Le trilostane a été acheté dans le commerce ; il a été mis en suspension dans de l'huile de sésame pure et injecté par voie sous-cutanée (se) dans un volume de lOOμl par 20g de poids corporel. Enregistrement et traitement des données
La session a été enregistrée par un caméscope CDD connecté à un microordinateur et les mouvements ont été analysés en utilisant le logiciel Videotracks® (Viewpoint, Champagne-au-Mont-d'Or, France). Deux niveaux de changements de pixels ont été analysés pour discriminer d'une part entre l'immobilité et lutte, et d'autre part entre lutte et nage. Etant donné que seule l'immobilité est considérée de façon non équivoque comme paramètre d'un désespoir comportemental, les autres comportements n'ont pas été analysés.
Résultats
On constate que les souris stressées montrent un amaigrissement persistant, par rapport à celles témoins non stressées, 1, 2 ou 3 semaines après l'initiation du stress. Les souris sacrifiées 24 heures après la dernière session de contention montrent une augmentation très significative du poids des glandes surrénales. Le groupe des souris stressées consomme davantage de liquide en fonction du temps que celui des témoins. L'anhédonie (préférence au saccharose dans notre cas) est significativement supérieure chez les souris témoins non stressées (environ 80%) en comparaison aux souris stressées (environ 60%) pour chaque jour de la mesure
(résultats non montrés).
On constate que chez les souris témoins qui ont reçu 12,5mg et 25mg de trilostane, le temps d'immobilité est réduit de façon significative par rapport aux souris témoins non traitées. En revanche, chez les souris surrénalectomisées et castrées, on constate que le temps d'immobilité n'est pas modifié après administration de trilostane. Ainsi, l'administration du trilostane par voie sous- cutanée réduit le temps de l'immobilité aux doses de 12,5 et 25 mg/kg indiquant un effet antidépresseur du produit. Etant donné que l'effet du trilostane sur la réduction de l'immobilité des souris est aboli chez les souris surrénalectomisées et castrées (AdX/CX mice), cela suggère un effet périphérique plutôt que central du produit.
Test de stress chronique de contention Le stress de contention va engendrer un stress psychologique très fort, mais aussi avec une composante physique. Les souris (n=l l à 12 par groupe) ont été immobilisées dans des tubes en plastique à raison de 3 heures par jour, entre 11 h et 14 h, pendant 21 jours. Ainsi, les mouvements de leur tête et de leurs membres sont limités. Les souris contrôle restent à l'animalerie durant toute la période de stress. 24 heures après la dernière session de contention, les animaux ont été soumis à une séance de 6 min de nage forcée. Le trilostane a été administré par voie sous-cutanée 16 heures et 2 heures avant la session
Les résultats sont montrés dans la figure 2.
Les animaux stressés chroniquement montrent une tendance à une augmentation de l'immobilité dans le test de nage forcée, et un traitement à court terme de trilostane diminue significativement le temps d'immobilité chez les animaux témoins et chez les animaux stressés
EXEMPLE 2 : Effet des associations trilostane - antidépresseurs classiques dans le test de Ia nage forcée
L'effet antidépresseur du trilostane est maintenant bien établi chez les souris soumises au test de nage forcée, nous nous sommes donc demandé si le trilostane pouvait faciliter l'effet antidépresseur d'autres antidépresseurs.
Nous avons donc poursuivi l'étude de l'effet du trilostane en association avec des antidépresseurs classiques comme la sertraline, la fluoxétine, la désipramine et l'imipramine toujours en utilisant le test de la nage forcée décrit précédemment. Les résultats sont présentés dans la figure 3.
La sertraline, qui est un antidépresseur inhibant le transporteur à la sérotonine, présente également une affinité très importante pour le récepteur sigma- 1 contribuant ainsi à son activité pharmacologique. Le composé, administré seul, exerce un effet antidépresseur très significatif aux doses de 20 et de 40 mg/kg (figure 3A). La fluoxétine est un autre antidépresseur inhibant sélectivement le transporteur à la sérotonine qui réduit significativement le temps d'immobilité des souris à 30 et 60 mg/kg ip (figure 3B).
La désipramine, antidépresseur tricyclique inhibant les transporteurs à la sérotonine et à la noradrénaline, réduit le temps d'immobilité des souris à la dose de
20 et 40 mg/kg ip (figure 3C). L'imipramine, un autre antidépresseur tricyclique présente un effet antidépresseur dans le test de nage forcée aux mêmes doses que la désipramine (figure 3D).
Le traitement au trilostane montre un effet antidépresseur qui s'additionne à celui des antidépresseurs classiques testés ici. Cet effet semble plus important lorsque le traitement au trilostane est associé aux antidépresseurs ISRS (figure 3A et 3B) et est significatif avec la sertraline à forte dose. Ces observations suggèrent que le trilostane exerce son effet dans le test de nage forcée par un mécanisme pharmacologique différent de celui impliquant les systèmes monoaminergiques. Les effets des antidépresseurs classiques et du trilostane sont purement additifs.
EXEMPLE 3 : Effet du trilostane sur l'activité de Taxe HPA
Nous avons par la suite étudié l'action neuroendocrinienne du trilostane sur la réactivité de l'axe HPA. L'hormone ACTH est synthétisée par les cellules corticotropes de l'antéhypophyse. L'ACTH stimule la production du CORT par le cortex surrénal. La sécrétion d'ACTH est contrôlée par un mécanisme de régulation hypothalamo-hypophyso-surrénalienne et dépend principalement du taux de CORT plasmatique.
Dosage de l'adrénocorticotropine (ACTH)
Pour doser l' ACTH plasmatique nous avons utilisé un kit radioactif (ELSA ACTH, ORIS Group, Gif-sur- Yvette, France) qui repose sur le principe de la technique « sandwich » sur phase solide. Deux anticorps monoclonaux ont été préparés contre deux sites antigéniques éloignés l'un de l'autre sur la molécule d'ACTH, le premier est absorbé sur la phase solide ELSA et reconnaît la partie N terminale, le second marqué à l'iode 125 est utilisé comme traceur et reconnaît la partie C terminale. Les molécules d'ACTH présentes dans les standards ou les échantillons à tester sont prises en « sandwich » entre les deux anticorps. L'excès de traceur est aisément éliminé par une étape de lavage, il ne reste donc plus sur l'ELSA que le complexe anticorps adsorbé/antigène/anticorps marqué.
La radioactivité liée à l'ELSA est alors proportionnelle à la quantité d'ACTH initialement présente dans l'essai.
Mode opératoire
Après avoir sacrifié les souris par décapitation, les échantillons de sang sont collectés des cerveaux dans 1 mg/ml d'EDTA ; ils sont centrifugés à 40C, et le plasma est conservé à -20°C avec un ajout de 5μl d'aprotinine (7,6TILVmI, Sigma- Aldrich) jusqu'à son utilisation. L'ACTH plasmatique est testée en utilisant un kit RIA dans 50μl d'échantillons non-extraits, selon les instructions du fabricant. La concentration d'ACTH détectable minimale était de 2 pg/ml et les coefficients de variations de l'essai -interne et externe- étaient respectivement de 6% et de 5%. La concentration en corticostérone plasmatique était mesurée à l'aide d'un test ELISA en utilisant lOOμl d'échantillons non-extraits, selon les recommandations du fabriquant (Oxford Biomédical Research, Oxford, MI, USA).
Résultats
Les résultats sont présentés dans la figure 4. Chez la souris, le trilostane n'affecte pas les taux d'ACTH circulants chez les individus sains, mais diminue très significativement, à la dose de 12,5 mg/kg, l'augmentation d'ACTH (350%) liée au stress de nage forcée (figure 4A). Les augmentations du taux d'ACTH ont lieu par l'intermédiaire de l'hypothalamus qui sécrète le CRF (Corticotropin Releasing Factor). Le dosage de la CORT plasmatique, glucocorticoïde sécrété par les glandes surrénales notamment en réponse au stress et marqueur de l'activation de l'axe HPA, a confirmé une action physiologique du trilostane sur l'axe HPA. Chez la souris, le trilostane n'affecte pas les taux de CORT circulants chez les individus sains, mais diminue très significativement l'augmentation de CORT liée au stress de nage forcée (Figure 4B). La concordance des doses actives montre que nous avons ici la confirmation endocrinienne de l'effet antidépresseur du trilostane.
EXEMPLE 4 ; Effet du trilostane sur l'expression de la 3B-HSD Le trilostane est un modulateur d'activité enzymatique affectant la synthèse des stéroïdes neuroactifs. Il bloque la 3β-HSD qui convertit notamment la prégnénolone en progestérone puis en alloprégnanolone. L'effet de l'administration à court terme de trilostane est analysé par RT-PCR dans le cerveau, sur des préparations d'ARNm d'hippocampes, et en périphérie, sur des préparations d'ARNm de glandes surrénales en fonction du stress et de l'administration du trilostane.
Analyse semi-quantitative par RT-PCR de l'expression du gène de la 3β- HSD et du gène des récepteurs aux estrogènes de type β
Afin d'extraire les ARNs qui seront utilisés pour l'analyse des ARNm de la 3β-HSD et des ERβ et pour l'analyse semi-quantitative par RT-PCR, les animaux contrôles et stressés sont sacrifiés par décapitation après 15 minutes de nage forcée.
L'hippocampe et les glandes surrénales sont rapidement prélevés et congelés à -80°C jusqu'à l'extraction des ARN. Les ARN totaux sont ensuite extraits à partir des tissus en utilisant le kit High Pure RNA Tissue (Roche, Meylan, France) selon les recommandations du fabricant. La concentration et la pureté des ARN sont évaluées par spectrométrie à densité optique (mesures à 260 et 280 nm).
La synthèse d'ADNc est ensuite réalisée grâce à la reverse transcriptase à partir d'un mélange réactionnel de 20μl. Pour cela, on mélange lμg d'ARN total à 2 μl d'hexamères amorces aléatoires (0,5μg/μl) (Amersham, Orsay, France) et on laisse incuber à 70°C pendant 5 minutes. Après refroidissement dans la glace, la solution est mélangée à 8μl de tampon 5X, à 2μl de chacun des dATP, dTTP, dCTP, dGTP (chacun 1OmM) et 1 μl (200U, Promega) de transcriptase reverse du virus de leucémie murin Moloney (M-MLV RT) et la réaction est réalisée selon les instructions du kit. Des réactions parallèles sont réalisées en absence d'enzyme pour évaluer une éventuelle contamination.
Pour l'amplification de PCR, 1 μl d'ADNc total synthétisé en réaction de réverse transcription est utilisé pour les amorces suivantes. Les amorces utilisées pour détecter la 3β-HSD sont ceux décrits par Schulte et al. (2007) : AATCTGAAAGGTACCCAGAA (sens) et TCATCATAGCTTTGGTGAGG (antisens). Les amorces utilisées pour détecter les ERβ sont ceux décrits par Thakur et al. (2007) : ACAGTCCTGCTGTGATGAAC (sens) et
ACTAGTAACAGGGCTGGCAC (antisens). Les réactions PCR sont réalisées grâce au kit Quantum RNA Classic 18S (Ambion). Les ADNc amplifiés sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose à 2% et révélés au bromide d'éthidium. Les ratios sont exprimés en pourcentage de la valeur contrôle.
Résultats
Les résultats sont présentés en figure 5. Il s'avère que le stress de nage forcée n'affecte pas l'expression de 3β-HSD, ni dans l'hippocampe (figure 5A) ni dans les glandes surrénales (figure 5C). Le trilostane, à 25 mg/kg s.c, induit une forte augmentation significative de l'expression de la 3β-HSD dans l'hippocampe
(figure 5B) ou dans les glandes surrénales (figure 5D), mais n'est pas affecté par le stress. Ceci suggère que l'inhibition de l'enzyme par le trilostane provoque certainement une augmentation de l'expression du gène de la 3β-HSD afin de contrecarrer le blocage de l'activité de l'enzyme. EXEMPLE 5 : Effet d'un autre inhibiteur de la 3B-HSD : la cyanokétone
Nous avons testé un autre inhibiteur de la 3β-HSD : la cyanokétone. L'administration de cyanokétone aux mêmes doses (6,25-50 mg/kg; s.c.) et selon le même protocole d'injection que le trilostane (administration à court terme) n'induit pas d'effet antidépresseur chez les souris dans le test de nage forcée (figure 6). Ceci suggère que l'effet antidépresseur du trilostane ne passe pas principalement par une inhibition de l'enzyme mais certainement par un autre mécanisme.
EXEMPLE 6 : Action de l' anti-œstrogène Fulvestrant® sur l'effet antidépresseur du trilostane
Pour essayer de comprendre le mécanisme de l'effet antidépresseur du trilostane, nous avons évalué son effet sur les récepteurs aux oestrogènes en utilisant un antagoniste de ces récepteurs: le fulvestrant® (ICI 182,780). Nous avons constaté que l'effet antidépresseur du trilostane administré à court terme est bloqué lorsque les souris sont traitées avec de l'ICI 182,780; 1-4 mg/kg;s.c. (figure 7).
La diminution du taux de récepteurs aux estrogènes, par l'administration de fulvestrant, chez les souris bloque l'effet antidépresseur du trilostane traduisant une implication de ces récepteurs dans l'effet du trilostane. Il faut de plus noter que le fulvestrant est une molécule qui ne passe pas la barrière hémato-encéphalique, ceci confirme donc une fois de plus une action périphérique plutôt que centrale du trilostane.
EXEMPLE 7 : Effet du trilostane sur l'expression du gène des récepteurs aux estrogènes de type β
Suite au résultat observé avec l'antagoniste des récepteurs aux estrogènes, nous avons mesuré l'effet du trilostane sur l'expression du gène des récepteurs aux estrogènes de type β. L'effet de l'administration à court terme de trilostane est analysé par RT-PCR dans le cerveau, sur des préparations d'ARNm d'hippocampes, et en périphérie, sur des préparations d'ARNm de glandes surrénales (figure 8). Le trilostane, à 25 mg/kg s.c, induit une forte augmentation significative de l'expression des ERβ dans l'hippocampe et dans les glandes surrénales, mais l'expression n'est pas augmentée par le stress. Cette augmentation, liée au traitement, est plus importante au niveau de l'hippocampe (figure 8A) qu'au niveau des glandes surrénales (figure 8B). Chez les animaux non traités le stress de nage forcée augmente aussi l'expression des ERβ.
Ce résultat indique que l'action principale du trilostane passerait par un mécanisme d' induction de ERβ 1.
EXEMPLE 8 : Effet anxiolytique et sur la locomotion du trilostane chez la souris
Pour évaluer l'effet du trilostane sur l'anxiété, deux protocoles comportementaux ont été utilisés: le test en champ ouvert et test appelé « light/dark exploration box ».
Comportement en champ ouvert (« open-field behavior »)
La mobilité générale et des mesures observables d'exploration, ainsi que l'anxiété ont été examinées dans une arène circulaire en bois (diamètre=75cm). Deux cercles concentriques ont été dessinés sur le sol (diamètres de 15 et de 45cm) ; le cercle externe étant divisé en 8 parties et le cercle du milieu étant divisé en 4 parties. La session en champ ouvert consiste à placer la souris dans le cercle central et de mesurer ses mouvements pendant 10 minutes grâce à une caméra vidéo. Les paramètres suivants ont été évalués : (1) l'activité de locomotion, en terme de nombres de parties traversées est ensuite calculée en tant que distance parcourue en mètre ; (2) durée d'immobilité ; (3) vitesse de locomotion ; (4) activité de locomotion dans les 5 parties centrales ; (5) fréquence de reculade ; (6) fréquence de toilettage, et (7) nombre de défécations. Activité de locomotion
L'activité de locomotion a été mesurée spécifiquement dans des cages transparentes en PVC (40X40X25cm de haut), en utilisant un compteur à rayons infrarouges (Columbus Instruments). Les animaux ont été placés 2 heures dans les cages et l'activité horizontale a été enregistrée après 1 heure et durant 1 heure avec des intervalles de 10 minutes.
Test d'anxiété dit « elevated plus maze »
L'état d'anxiété des souris a été évalué en utilisant leur capacité à explorer un labyrinthe en forme de croix, où 2 branches sont ouvertes et non protégées peintes en blanc, et 2 branches fermées peintes en noir. Les branches qui se prolongent de la plateforme centrale, et le labyrinthe sont surélevés de 50 cm par rapport au sol. Chaque souris était placée au centre du labyrinthe et son comportement exploratoire a été enregistré pendant 10 minutes. Le temps passé et le nombre d'entrées dans les branches ouvertes ou fermées ont été enregistrés. Les résultats sont exprimés en temps total passé dans les branches ; nombre total d'entrées dans les branches ainsi qu'en temps passé dans chaque branche par visite.
Boite exploratoire lumière/obscurité (ou « Light/dark exploratory box »)
L'anxiété a également été évaluée en mesurant la présence d'un compartiment éclairé dans light/dark exploratory box . L'appareil en PVC a été divisé en 2 compartiments, un avec un fond et des parois en blanc (30X25X25cm de haut) ; le second avec un fond et des parois en noir (15X25X25cm de haut), séparés par une porte de 6X6cm. Une lampe à bulbe (75W) a été placée 1,5m au-dessus d'un compartiment blanc. Chaque souris a été placée dans le compartiment blanc et l'activité exploratoire a été enregistrée par vidéo et analysée grâce au logiciel Videotrack® (Viewpoint).
Résultats
Effet du trilostane sur l 'activité générale
L'effet du trilostane sur l'activité générale lors du test en champ ouvert est résumé dans le tableau 1 suivant (2 doses : 12,5 et 25mg/kg SC). Tableau 1
Paramètres comportementaux chez des souris traitées par le trilostane lors du test en champ ouvert.
Figure imgf000021_0001
Outre le tableau 1, des résultats sont présentés dans la figure 9 (a) profils d'activité et (b) activité de locomotion totale ; (c) temps passé sur les branches ouvertes du labyrinthe et (d) nombre d'entrées dans les branches ouvertes et fermées ; et (e) temps passé dans le compartiment blanc de la black-and-white exploratory box. Les animaux ont reçu du trilostane (12,5 ou 25mg/kg SC) 16 et 2 heures avant les sessions comportementales. Le nombre d'animaux est indiqué en (b, c et e). *p<0,05 vs données du groupe V-treated ; test de Dunnett
D'après les résultats du tableau 1, il s'avère que l'administration de trilostane n'affecte pas l'activité locomotrice, en terme de locomotion totale, d'immobilité ou de vitesse de locomotion pendant les sessions de 10 minutes. De même, aucun effet n'a été mesuré sur la capacité exploratoire, en terme de latence avant déplacement ou comportements de reculade ; de stéréotactisme en terme de pourcentage de locomotion au centre de l'arène ou d'activité générale, en terme de comportement de toilettage ou de défécations. Il en a été déduit que l'administration de trilostane n'affecte pas les capacités générales et physiques de la souris. L'activité de locomotion a été étudiée plus spécifiquement par actimétrie.
L'activité de locomotion enregistrée pendant 60 minutes après l'administration du trilostane ou de la solution témoin (véhicule) a diminué progressivement dans le temps mais aucune différence parmi les groupes de traitement n'a été notée (voir la figure 9a). Ainsi, aucune différence n'a été observée en terme d'activité de locomotion totale (voir figure 9b).
L'anxiété a été étudiée également de façon plus spécifique en utilisant deux protocoles comportementaux, le « elevated plus-maze test» (labyrinthe) et la light/dark exploratory box. Le trilostane a été administré au cours de 2 injections, dans la fourchette de doses allant de 6,3 à 50mg/kg SC. La figure 9c montre que lors du « elevated plus-maze test», le trilostane augmente le temps passé dans les branches ouvertes avec un effet dose/réponse en courbe de Gauss. Un effet significatif a été observé à une dose de 12,5mg/kg. Le traitement a aussi permis à réduire les entrées dans la branche fermée (voir figure 9d), selon une relation strictement dose dépendante avec un effet significatif pour la dose la plus élevée, mais pas pour les branches ouvertes (voir figure 9d). Lors du test light/dark exploratory box,le trilostane augmente le temps passé dans le compartiment blanc (voir figure 9e) avec un effet dose-réponse en courbe de Gauss, un effet significatif étant observé à une dose de 12,5mg/kg.
EXEMPLE 9 : Effet du trilostane sur Ie contenu en BDNF dans l'hippocampe et l'hypothalamus
Dans la littérature, la neurotrophine BDNF a été rapportée comme étant impliquée dans la régulation de l'axe HPA en réponse à un stress aiguë ou chronique, et en particulier il a été observé une augmentation rapide des taux d'ARNm codant pour le BDNF dans l'hippocampe, l'hypothalamus et la glande pituitaire. D'autre part, certains travaux révèlent que le BDNF serait impliqué dans la dépression. Ainsi, il a été entrepris dans le cadre de l'invention d'effectuer des dosages de cette neurotrophine dans l'hippocampe et l'hypothalamus.
Protocole opératoire Les hippocampes et hypothalamus ont été prélevés après décapitation, pesés, congelés rapidement dans de l'azote liquide à -80°C jusqu'à l'essai. Le test ELISA BDNF max a été réalisé selon les instructions du fabricant (Promega).
Résultats
La figure 10 montre les dosages du BDNF effectués pour les hippocampes (a) et hypothalamus (b) après administration de trilostane dans une fourchette de doses allant de 6,3 à 50mg/kg en sous-cutané, chez des souris témoins non stressées et chez des souris ayant subi 15 minutes de nage forcée aux jours 1 et 2. Il en résulte que dans l'hippocampe, le stress induit une augmentation significative de 29% en concentration de BDNF, qui n'était pas atténuée par l'administration de trilostane, et que dans l'hypothalamus, aucun changement significatif du contenu en BDNF n'était observé après administration de trilostane. Le stress dû à la nage forcée induit une augmentation de 27% en BDNF, et qui n'était pas atténuée de façon dose dépendante par le trilostane. Les doses de 25 et 50mg/kg induisent un blocage significatif de l'augmentation du contenu en BDNF induit par le stress.
EXEMPLE 10 : Effet antidépresseur du trilostane sur un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Test de la nage forcée.
Lors de cette expérience, on a développé artificiellement chez des souris la maladie d'Alzheimer en injectant par voie intracérébroventriculaire (i.c.v) des peptides 25-35 de la protéine β amyloïde (appelés ci-après Aβ25-35). On compare les résultats à ceux obtenus sur des souris témoins chez lesquelles on injecte un peptide témoin (appelé « scrambled » ou ScAβ). Ensuite on injecte le trilostane à toutes les souris avant de leur faire subir le test de nage forcée. Matériels et méthodes
Des souris Swiss OFl mâles (Depré, Saint Doulchard, France) âgées de 7 semaines et pesant 32 ± 2 g, ont été utilisées dans cette étude. Les animaux ont été placés dans des cages en plastiques, en groupes, dans une animalerie standard ; dans un environnement régulé (23 ± 1°C, hygrométrie 40-60%) et sous un cycle de 12h de jour/12h de nuit. Sauf pendant les expériences de comportement, l'eau et la nourriture standard étaient en libre accès,
Le peptide P25-35 amyloïde (Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met, Ap25-35) et le peptide contrôle (Ala-Lys-Ile-Gly-Asn-Ser-Ile-Gly-Leu-Met-Gly, ScAP) ont été fournis par Genepep (Prades-le-Lez, France). Ils sont solubilisés et aliquotés dans de l'eau bidistillée stérile à la concentration de 3 mg/ml et stockés à - 20°C avant leur utilisation. Le trilostane est mis en suspension dans de l'huile de sésame (Sigma/ Aldrich, Saint Quentin-Fallavier, France).
Avant d'être injectées, les solutions de peptides sont incubées pendant 4 jours à 37°C pour provoquer l'agrégation du peptide Ap25-35 (Maurice et al., 1996,
Brain Research, 706(2) ppl81-193). Elles sont injectées (9 nmol par souris) par voie intracérébroventriculaire (i.c.v.) dans un volume final de 3 μl. Le trilostane est injecté par voie sous-cutanée (s.c.) aux doses de 3,12 mg.kg ; 6,25 mg/kg ;
12,5 mg/kg ; 25 mg/kg et 50 mg/k ; en deux fois : 16 h et 2 h avant le test comportemental. Les souris témoins ont reçu de la solution véhicule (huile de sésame).
Test de nage forcée
Chaque souris est placée dans un bêcher en verre de 2 litres (diamètre
12 cm, hauteur 24 cm), rempli d'eau jusqu'à une hauteur de 12 cm. La température de l'eau est maintenue à 22-23°C. Au jour 1, les animaux sont placés dans l'eau et la session de nage forcée dure 15 mn. Au jour 2, les animaux sont replacés dans l'eau et la session de nage forcée dure 6 mn. Les sessions sont enregistrées par caméra CCD couplée à un logiciel de traitement d'image (Videotrack®, ViewPoint, Champagne- au-Mont-d'Or, France) qui analyse la quantité de mouvements minute par minute. Une souris est considérée comme immobile quand elle arrête de nager et/ou de se débattre, ne faisant plus que les mouvements lui permettant de maintenir la tête hors de l'eau.
Le planning de l'expérience est donc le suivant : o à J 0 : injection en i.c.v. des peptides Ap25-35 ou ScAβ o à J 6
• 12 h : session 1 de nage forcée de 15 mn " 20 h : injection 1 de trilostane en s.c. o à J 7
" 10 h : injection 2 de trilostane en s.c. " 12 h : session 2 de nage forcée 6 mn - Analyse de l'immobilité
Analyses statistiques
Les résultats sont analysés par une analyse de variance (ANOVA) à deux paramètres indépendants (traitement en i.c.v. et traitement en s.c), puis par un test de comparaison a posteriori de Dunnett. Résultats
Les résultats sont montrés dans la figure 11.
Les résultats montrent que le trilostane est efficace en tant qu'antidépresseur chez les animaux traités avec Ap25-35 (reproduisant la maladie d'Alzheimer) ainsi que chez ceux traités par le peptide contrôle (ne reproduisant pas la maladie d'Alzheimer). Néanmoins, il est important de remarquer que la dose efficace est nettement plus faible dans le cas des souris chez lesquelles la maladie d'Alzheimer est induite. En effet, une dose de 6,25 mg/kg de trilostane est suffisante chez les souris traitées par le peptide amyloîde Ap25-35alors qu'une dose nettement plus élevée de trilostane est nécessaire - 25 mg/kg- pour obtenir un effet antidépresseur chez les souris témoins (traitées par ScAβ). Enfin, il est à noter qu'à des doses de trilostane plus importantes, l'effet antidépresseur du trilostane est sensiblement réduit chez les souris traitées par le peptide Ap25-35 lorsqu'on compare à la dose plus faible.
Ces résultats montrent, par conséquent, que le trilostane est efficace comme antidépresseur dans un modèle animal non transgénique de la maladie d'Alzheimer. Cette facilitation d'effet antidépresseur est intéressante dans le sens où la maladie d'Alzheimer s'accompagne en effet dans plus de 30% des cas d'une dépression majeure résistante aux traitements classiques.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés pour la fabrication d'un médicament utile dans le traitement de la dépression.
2. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés pour la fabrication d'un médicament utile dans le traitement de l'anxiété.
3. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une population de sujets âgés.
4. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon la revendication 1 ayant un effet antidépresseur potentialisé chez des patients atteints par la maladie d'Alzheimer.
5. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon la revendication 1 ayant un effet antidépresseur potentialisé chez des patients âgés atteints par la maladie d'Alzheimer.
6. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que ce principe actif est administré par voie parentérale, par voie orale, par voie rectale ou toute autre voie acceptable.
7. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la dose à administrer est comprise entre 1 et 300 mg par patient.
8. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que la dose à administrer est comprise entre 10 et 100 mg par patient.
9. Utilisation du trilostane ou d'un de ses dérivés selon la revendication 1, caractérisée en ce que les sujets à traiter sont des personnes qui ont subi des effets indésirables liés à l'utilisation des antidépresseurs classiques.
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