WO2009043991A2 - Utlisation d'un principe actif issu du lin dans une composition destinee a activer le cytochrome c - Google Patents

Utlisation d'un principe actif issu du lin dans une composition destinee a activer le cytochrome c Download PDF

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WO2009043991A2
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Societe D'extraction Des Principes Actifs S.A. (Vincience)
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Definitions

  • the present invention is in the cosmetic and pharmaceutical field, and more particularly in the field of dermatology.
  • the present invention relates to the use, in a cosmetic composition of an effective amount of active ingredient derived from flax (genus Linum); to activate cytochrome c.
  • the active ingredient is derived from the hydrolysis of flax proteins and contains mainly polypeptides or peptides. It can be used alone or in combination with at least one other active ingredient.
  • the invention also relates to the use of a cosmetic composition for stimulating the functions of mitochondria and increasing the cellular energy level.
  • the invention also relates to a cosmetic treatment method intended to protect the skin and the integuments from external aggressions and to fight against skin aging.
  • the active ingredient, activator of cytochrome c can also be used to prepare pharmaceutical compositions intended to prevent or fight against pathologies related to mitochondrial dysfunctions; for example, certain neuromuscular or cardiac degenerations, type II diabetes or certain pathologies of aging.
  • “superficial body growths” encompasses all the keratinous appendages present on the surface of the body, in particular the hairs, the eyelashes, the eyebrows, the nails and the hair.
  • the skin is a vital organ that covers the entire surface of the body and provides protective, sensitive, immune, metabolic or thermoregulatory functions.
  • the skin like other organs, is subject to aging. But one of the major mechanisms involved in the aging process is the accumulation of oxidative damage to essential molecules such as membrane lipids, proteins, DNA, and especially I 1 mitochondrial DNA (mtDNA).
  • mtDNA I 1 mitochondrial DNA
  • Oxidative damage is caused by free radicals, chemically unstable and highly reactive species generated by intracellular metabolism or external aggression. These external aggressions include: UV radiation, toxins, air pollutants, food oxidants.
  • external aggressions include: UV radiation, toxins, air pollutants, food oxidants.
  • In the skin there is premature aging occurring in the areas exposed to radiation, characterized by phenomena of alterations of macromolecules (lipid peroxidation, carbonylation of proteins) affecting in particular elastin, collagen or fibronectin. It has also been possible to show a gradual decline in mitochondrial function with age, probably related to the accumulation of mutations on mtDNA (Singh, K. Ann Acad Sci 1019, 2004).
  • the phenomenon of cellular aging is related to the oxidative damage that the cell undergoes but also to the process of energy production necessary for the cell to survive.
  • the body has defense mechanisms capable of trapping or transforming free radicals (enzymes, glutathione, vitamins A and E, coenzyme Q10, etc.).
  • enzymes capable of trapping or transforming free radicals (enzymes, glutathione, vitamins A and E, coenzyme Q10, etc.).
  • these systems of antioxidant defenses often prove insufficient in the face of the many stresses and external aggressions to which organisms and the skin in particular are subjected.
  • cytochrome c the particular properties of cytochrome c appear to be particularly interesting:
  • Cytochrome c is a small, 15 kDa soluble protein that plays a critical role in mitochondrial function and cell survival. Cytochrome c is a highly conserved molecule in most eukaryotes; it is found in the mitochondria of plants, animals and many unicellular organisms. Cytochrome c has a protein structure organized around a porphyrin, consisting of four pyrrol nuclei, themselves linked to an iron atom. The main role of cytochrome c is to ensure the transfer of electrons, thanks to the change of valence of the iron atom.
  • Cytochrome c which is soluble, transports electrons from the m complex (coenzyme QH2-cytochrome c reductase) to complex IV (cytochrome oxidase).
  • the electrons which are the substrate for cytochrome oxidase, are then transferred by the enzyme to oxygen.
  • the present invention has for main objective the use of an effective amount of an active principle of peptide nature, resulting from the hydrolysis of linseed proteins (Linum genus), in a cosmetic composition for activating cytochrome c and stimulating the mitochondria, in order to protect the skin from external aggressions and fight against skin aging.
  • Said active ingredient may be used alone or in combination with at least one other active ingredient.
  • the inventors have in fact demonstrated a therapeutic activity, and more particularly a dermatological and cosmetic activity, of an active ingredient of a peptide nature derived from the hydrolysis of flax, capable of activating cytochrome c. In particular, it has been demonstrated that these polypeptides or peptides, which constitute the active principle, when applied to the skin, significantly stimulate mitochondrial functions.
  • active ingredient capable of protecting the skin from external aggression means a peptide hydrolyzate derived from the hydrolysis of linseed proteins (genus Linum), capable of exhibiting protective properties or of decreasing apoptosis in cells. or tissues subjected to stress of physicochemical or environmental origin.
  • active principle capable of activating cytochrome c is understood to mean a hydrolyzate of peptidic nature resulting from the hydrolysis of linseed proteins (genus Linum), capable of increasing expression of cytochrome c, either by activation of protein synthesis (by direct or indirect modulation of cytochrome c gene expression), or by increasing the biological activity of cytochrome c, or by other biological processes such as the stabilization of the cytochrome c protein or the stabilization of the messenger RNA transcripts.
  • active principle capable of stimulating the functions of mitochondria a whole hydrolyzate of peptidic nature resulting from the hydrolysis of linseed proteins (genus Linum), capable of increasing the expression or the activity of the main active molecules present in the mitochondria, and more generally capable of increasing the main energy functions of the mitochondria; that is, the oxidative phosphorylation chain and ATP synthesis.
  • Peptide is understood to mean a mixture of compounds predominantly represented by peptides or polypeptides.
  • peptide refers to a sequence of two or more amino acids linked together by peptide bonds or modified peptide bonds; the term “polypeptide” denotes a peptide of larger size.
  • biologically active is meant "which has an activity in vivo or in vitro characteristic of the activity of the active ingredient according to the invention".
  • hydrolyzate or derived from hydrolysis refers to any substance or mixture of substances, or isolated preparation, obtained after hydrolysis of plant material.
  • the active ingredient according to the invention can be obtained by extraction of proteins of plant origin, followed by controlled hydrolysis which releases biologically active peptide fragments. Many proteins found in plants are likely to contain biologically active peptide fragments within their structure.
  • the controlled hydrolysis makes it possible to release these peptide fragments. It is possible, but not necessary to carry out the invention, to extract either the proteins concerned first and then hydrolyze them, or to carry out the hydrolysis first on a crude extract and then to purify the peptide fragments. . It is also possible to use certain hydrolysed extracts without purifying the peptide fragments corresponding to the biologically active peptides according to the invention, but nevertheless ensuring the presence of said fragments by appropriate analytical means. To carry out the extraction, one can use the whole plant, or a specific part of the plant (leaf, seed, etc.).
  • the plant material used will be the seed and preferably the seed freed from its shell by a dehulling step.
  • the plant is ground using a plant grinder.
  • the powder thus obtained may subsequently be "delipidated” with the aid of a conventional organic solvent (for example an alcohol, hexane or acetone).
  • the proteins of the plant are then extracted according to the conventional method (Osborne, 1924) modified; the plant meal is suspended in an alkaline solution containing an insoluble polyvinylpolypyrrolidone adsorbent material (PVPP) (0.01-20%); in fact, it has been observed that the hydrolysis and subsequent purification operations are facilitated by this means. The concentration of phenolic-type substances interacting with the proteins is thus reduced.
  • PVPP polyvinylpolypyrrolidone adsorbent material
  • the soluble fraction is collected after centrifugation and filtration steps, this crude solution then constituting a first form of the extract containing the proteins, carbohydrates and optionally lipids.
  • the proteins are then precipitated by varying the ionic strength by acidifying the medium, which eliminates soluble components and nucleic acids.
  • the precipitate is then washed with an organic solvent such as, for example, ethanol or methanol and the solvent is evaporated by drying in vacuo.
  • the protein-rich precipitate is dissolved in water or other solvent and is then a more purified form of the hydrolyzate.
  • the extraction can also be carried out in neutral or acidic medium always in the presence of polyvinylpolypyrrolidone.
  • the precipitation step is then carried out using a conventional precipitation agent such as salts (sodium chloride, ammonium sulfate) or an organic solvent (alcohol, acetone).
  • a conventional precipitation agent such as salts (sodium chloride, ammonium sulfate) or an organic solvent (alcohol, acetone).
  • the precipitate obtained can be separated from the precipitating agents by dialysis after redissolving in water or another solvent.
  • the isolated protein fraction according to the invention is then hydrolyzed under mild conditions to generate polypeptides and soluble peptides. Hydrolysis is defined as a chemical reaction involving the cleavage of a molecule by water, this reaction being possible in a neutral, acidic or basic medium.
  • the hydrolysis is carried out chemically and / or advantageously by proteolytic enzymes.
  • endoproteases of plant origin papain, bromelain, ficin
  • microorganisms Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.
  • the reaction medium After filtration, the solution obtained constitutes the active hydrolyzate.
  • the active hydrolyzate can be further purified in order to select the molecular weights and the nature of the peptides generated.
  • the fractionation can advantageously be carried out by ultrafiltration and / or by a chromatographic type method.
  • Any of the more or less purified forms of the hydrolyzate is then solubilized in water or in any mixture containing water, and then sterilized by ultrafiltration.
  • the vegetable hydrolyzate obtained according to the invention is analyzed qualitatively and quantitatively for its physico-chemical characteristics and its content of protein and peptide compounds.
  • Peptide-like compounds are understood to mean protein fragments, peptides and free amino acids present in the mixture.
  • the peptides, amino acids and protein fragments are determined according to conventional techniques, which are well known to those skilled in the art.
  • the active plant hydrolyzate has a pH of between 4 and 7, and preferably between 5 and 6, a solids content of between 1 and 8 g / l, and preferred between 2 and 5 g / 1, its content of peptide compounds is between 0.1 and 5 g / 1, and preferably between 0.5 and 2 g / 1 and its sugar content is 0.5 to 2.5 g / l.
  • the active principle according to the invention is solubilized beforehand in one or more cosmetically or pharmaceutically acceptable solvents, conventionally used by those skilled in the art, such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, cyclic polyols, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • one or more cosmetically or pharmaceutically acceptable solvents conventionally used by those skilled in the art, such as water, glycerol, ethanol, propylene glycol, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, cyclic polyols, petroleum jelly, a vegetable oil or any mixture of these solvents.
  • the active principle according to the invention is previously solubilized in a cosmetic or pharmaceutical vector such as liposomes or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites, and more generally solubilized in, or attached to, any cosmetically or pharmaceutically acceptable carrier.
  • a cosmetic or pharmaceutical vector such as liposomes or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites, and more generally solubilized in, or attached to, any cosmetically or pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition that may be used according to the invention may in particular consist of a composition for hair care, and in particular a shampoo, a conditioner, a setting lotion, a treatment lotion, a cream or a styling gel, a restructuring lotion for hair, a mask, etc.
  • the cosmetic composition according to the invention can be used in particular in treatments using an application that is followed or not followed by rinsing, or in the form of shampoo.
  • It can also be in the form of dye or mascara to be applied with a brush or a comb, in particular on eyelashes, eyebrows or hair.
  • the active ingredient according to the invention can be used alone or in combination with at least one other active ingredient, in a cosmetic composition or for the preparation of a pharmaceutical and / or dermatological composition.
  • compositions according to the invention may be applied by any appropriate route, in particular oral, parenteral or external topical, and their formulation will be adapted by those skilled in the art, in particular for cosmetic or dermatological compositions.
  • compositions according to the invention are intended for topical administration to the skin.
  • These compositions must therefore contain a cosmetically and / or dermatologically acceptable medium, that is to say compatible with the skin and superficial body growths, and cover all cosmetic or dermatological forms.
  • These compositions may especially be in the form of creams, oil-in-water or water-in-oil emulsions or multiple emulsions, solutions, suspensions, gels, milks, lotions, sticks or even powders, suitable for application on the skin. , lips and / or integuments.
  • compositions comprise the excipients necessary for their formulation, such as solvents, thickeners, diluents, surfactants, antioxidants, dyes, preservatives, perfumes.
  • compositions that can be used according to the invention also contain other active ingredients intended to promote its action.
  • active ingredients intended to promote its action.
  • active ingredients having an anti-radical or antioxidant action chosen from vitamin C, vitamin E, coenzyme Q10 and polyphenolic extracts of plants.
  • anti-radical active ingredients any compound capable of trapping free radicals. These active principles are capable of blocking free radical chain reactions before the ultimate stages of degradation of the biological constituents of the skin and thus have an antioxidant activity.
  • active ingredients stimulating the synthesis of dermal macromolecules laminin, fibronectin, collagen
  • Collaxyl® collagen peptide sold under the name "Collaxyl®” by the company Vincience.
  • active ingredients stimulating energy metabolism such as the active ingredient marketed under the name "GP4G®” by Vincience.
  • the composition according to the invention may be a solar composition, that is to say a composition helping to protect against solar radiation.
  • assets assisting the sun protection such as, for example, sunscreens.
  • the effective amount of active ingredient corresponds to the amount necessary to obtain the desired result, namely: activate the cytochrome c, stimulate the rnitochondria and increase the cellular energy level, and more generally, protect the skin and integuments of external aggressions and fight against skin aging
  • the active principle is present in the compositions of the invention at a concentration of between about 0.0001% and about 20%, and preferably at a concentration of between 0.05% and 5%. about% relative to the total weight of the final composition.
  • compositions may especially be in the form of an aqueous solution, hydroalcoholic or oily; an oil-in-water, water-in-oil emulsion or multiple emulsions; they may also be in the form of creams, suspensions or powders, suitable for application to the skin, mucous membranes, lips and / or integuments.
  • These compositions may be more or less fluid and have the appearance of a cream, lotion, milk, serum, ointment, gel, paste or paste. a foam. They can also be in solid form, as a stick or be applied to the skin in aerosol form. They can be used as a care product and / or as a make-up product for the skin.
  • compositions additionally comprise any additive commonly used in the field of application envisaged as well as the adjuvants necessary for their formulation, such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, dyes, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, cosmetic or pharmaceutical active ingredients, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, etc. .
  • additives such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, dyes, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, cosmetic or pharmaceutical active ingredients, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, etc.
  • these adjuvants and their proportions are chosen so as not to adversely affect the desirable properties of the composition according to the invention.
  • These adjuvants may, for example, correspond to 0.01 to 20% of the total weight of the composition.
  • the fatty phase may represent from 5 to 80% by weight and preferably from 5 to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition will be chosen from those conventionally used in the field under consideration. For example, they can be used in a proportion ranging from 0.3 to 30% by weight, relative to the total weight of the composition.
  • the active ingredient according to the invention can be used advantageously in a cosmetic composition or for the preparation of a pharmaceutical composition.
  • the active ingredient according to the invention may advantageously be used in a cosmetic composition intended to fight in a preventive and / or curative manner against the manifestations of skin aging and, more specifically, in order to fight against and / or prevent aging. photo-induced (photo-aging).
  • Skin manifestations of aging means any changes in the external appearance of the skin and skin growth due to aging such as, for example, wrinkles and fine lines, wilted skin, soft skin, thinned skin, lack of elasticity and / or tone of the skin, dull and lackluster skin or skin pigmentation spots, discoloration of the hair or spots on the nails, but also any internal changes in the skin that does not systematically result by a modified exterior appearance as, for example, any internal degradation of the skin following exposure to ultraviolet (UV) radiation.
  • the active ingredient according to the invention, or the composition containing it will make it possible, in particular, to combat the loss of elasticity and firmness of the skin.
  • the active ingredient according to the invention makes it possible to protect the skin and integuments against all types of external aggressions.
  • the use of the active ingredient, or a composition containing it will allow the skin and integuments to be protected and to better withstand environmental stresses.
  • external aggression means the aggressions that the environment can produce.
  • aggressions such as pollution, UV, or irritating products such as surfactants, preservatives or perfumes.
  • Pollution is understood to mean both “external” pollution, due for example to diesel particles, ozone or heavy metals, and “internal” pollution, which may be due in particular to the solvent emissions of paints, glues , or wallpaper (such as toluene, styrene, xylene or benzaldehyde), or even cigarette smoke.
  • the active ingredient according to the invention can be advantageously used in a cosmetic composition or for the preparation of a pharmaceutical composition, as a photo-protective agent and, more particularly, as a so-called "secondary" photoprotective agent.
  • the primary photoprotective agents are distinguished from the secondary photoprotective agents.
  • Primary photoprotective agents are substances that exert physical power: they are able to absorb UV radiation and release it as heat to protect the skin.
  • Secondary photoprotective agents are substances that usually have a biological effect; these are, for example, the agents capable of limiting damage to DNA and membranes by the penetration of UV radiation into the skin.
  • the invention also relates to the use in a cosmetic composition, or for the preparation of a pharmaceutical composition, of an effective amount of active ingredient according to the invention, the active ingredient or the composition containing it, being intended for increase the synthesis of intracellular ATP of skin cells.
  • the invention also relates to the use in a cosmetic composition, or for the preparation of a pharmaceutical composition, of an effective amount of principle active ingredient according to the invention, the active principle, or the composition containing it, being intended to prevent damage to the skin caused by exposure to the sun or exposure to ionizing radiation during radiotherapy.
  • the subject of the invention is also the use in a cosmetic composition, or for the preparation of a pharmaceutical composition, of an effective quantity of active principle according to the invention, the active principle, or the composition containing it, being intended to to stimulate the mitochondria, in particular on the areas of the body exposed to radiation
  • the invention also relates to the use in a cosmetic composition, or for the preparation of a pharmaceutical composition, of an effective amount of active ingredient as described above, the active ingredient, or the composition containing it, being intended to to protect the skin from damage caused by free radicals.
  • the invention also consists in the use of an effective amount of active principle for preparing a pharmaceutical composition intended to prevent or to fight against certain pathologies related to mitochondrial dysfunctions, for example certain neuromuscular or cardiac degenerations, type diabetes. ⁇ , certain pathologies of aging.
  • the invention also consists of a cosmetic treatment method intended to stimulate the defenses and to protect the skin and integuments from external aggressions and to fight against skin aging, characterized by the application on the skin or integuments to be treated of a composition containing an effective amount of active ingredient according to the invention.
  • the invention also consists of a cosmetic treatment method intended to give a healthier appearance to the skin and to improve the radiance and radiance of the complexion, characterized by the application on the skin to be treated of a composition containing a quantity effective principle of active ingredient according to the invention.
  • the active principle is obtained from plants of the species Linum usitatissimum L.
  • the extract can be prepared from plants of at least one of the many varieties and species belonging to the genus Linum.
  • 1 kg of peeled linseed is crushed in a cereal mill.
  • the flour obtained is delipidated by the action of an organic solvent, hexane.
  • the powder obtained is suspended in an aqueous alkaline solution (1/10 dilution) pH 10 containing 1% polyvinylpolypyrrolidone (Polyclar V ISP). This mixture is stirred for a time long enough to allow the solubilization of the soluble fractions.
  • the extraction temperature is variable (between 4 and 80 0 C); preferably the operation will be performed cold.
  • the medium is clarified by centrifugation and then filtered through a plate filter.
  • This filtrate which contains the soluble fractions of flax is then subjected to protein precipitation by varying the ionic strength in neutral or acidic medium, which eliminates soluble carbohydrate components, lipids and nucleic acids. at pH 3.5.
  • the supernatant is removed and the precipitate is then washed with a solvent such as, for example, ethanol or methanol and the solvent is evaporated by drying in vacuo.
  • the protein-rich precipitate is dissolved in water or another solvent.
  • the crude protein extract is then subjected to a series of gentle and selective hydrolyses consisting of chemical and enzymatic hydrolyses in the presence of 0.5% PVPP (Polyclar V) and cysteine endopeptidases (papain, ficin).
  • the hydrolyzate is filtered on a plate and then on a sterilizing cartridge (0.2 ⁇ m).
  • a light-colored hydrolyzate, titrating with 15 to 30 g / l of dry extract, is then obtained, which is then diluted so that the concentration of peptide-like compounds determined by the Lowry method is between 0.1 and 5 g / l and preferably between 0.5 and 2 g / l.
  • a variant of the protocol of Example 1 consists in carrying out the same sequence of controlled and selective enzymatic hydrolyses but in the presence of 0.5% of PVPP.
  • a light-colored hydrolyzate of 15 to 30 g / l of dry extract is then obtained after sterile filtration.
  • the solution is then ultrafiltered on a filtration cartridge.
  • Millipore Helicon cut-off point, 1 kDa. The high molecular weights contained in the retentate are removed, the filtrate is preserved.
  • the concentration of peptide-like compounds is determined by the method of
  • Another variant consists in carrying out a purification of the active principle, obtained according to Example 1 or 2, by ion exchange chromatography, on a TSK gel column.
  • EXAMPLE 3 Demonstration of the Stimulating Effect of the Active Principle According to Example 1 on the Synthesis of Intracellular ATP
  • the aim of this study is to determine the influence of the active principle according to Example 1 on the synthesis of ATP, produced by mitochondria.
  • the wells are rinsed with 2 ml of cold PBS before adding 250 ⁇ l of lysis buffer provided by the kit.
  • the cells of each well are then scraped and harvested in 14 ml tubes.
  • Each well is rinsed with 2 x 500 ⁇ l cold PBS and all is harvested again in the respective tubes.
  • dilution is performed at l / 12,000 th in cold PBS before each reading.
  • the ATP assay is performed on these samples: 50 ⁇ L of this dilution are deposited in a lumen and 50 ⁇ L of luminol are added. After 10 seconds, the reading of the luminescence is triggered.
  • the values are standardized with respect to the amount of protein for each sample.
  • the measurements are made using a device: the Biocounter M2010A LUMAC ⁇ / 3M.
  • Results The ATP assays show that there is a significant increase in the amount of intracellular ATP after 1 hour and 3 hours, in cells treated with the active ingredient according to Example 1, in comparison with the untreated cells. .
  • the active ingredient according to Example 1 substantially increases the energy level of cutaneous cells such as fibroblasts, and more generally stimulates mitochondrial functions.
  • the purpose of this study is to determine the influence of the active ingredient according to Example 1 on the expression of cytochrome c.
  • the amount of cytochrome c was evaluated by the immuno-transfer technique (or western blot).
  • Protocol Human dermal fibroblasts are treated with a 1% solution of active ingredient according to Example 1 for 72 hours. The cells are then lysed and homogenized by sonication, and then centrifuged for 10 minutes at 1000 g. The samples, standardized for their protein concentration (BCA kit assay, Pierce), are subjected to 4-12% Bis-TRIS gel electrophoresis (InvitroGen).
  • the membranes are incubated overnight with an anti-cytochrome c antibody, diluted 1/500 (anti-cytochrome c monoclonal mouse, TEBU).
  • a secondary antibody, coupled to peroxidase and diluted 1/5000 is then used (conjugated peroxidase F (ab ') 2 , Goat antimouse, Immunotech).
  • the chemiluminescent signal is then quantified using the Supersignal Kit West Femto Trial kit and read in a reading chamber (Multilage Light Cabinet, Alpha Immunotech Corporation). Results: A marked increase in the expression of cytochrome c in the fibroblasts treated with the active principle according to Example 1 was observed.
  • Example 1 The active ingredient according to Example 1 strongly stimulates the expression of cytochrome c in cutaneous cells, and more generally the mitochondrial functions.
  • the purpose of this study is to determine the influence of the active ingredient according to Example 1 on the mitochondrial activity. For this, the total enzymatic activity (mitochondrial) of cytochrome oxidase was measured.
  • Protocol Normal human fibroblasts are treated with a 1% solution of active ingredient according to Example 1 for 3 hours and 24 hours. The cells are harvested, rinsed and then lysed by sonication. A first centrifugation is carried out to remove the main cellular debris and the supernatant is then centrifuged again at 10,000 g for 10 min.
  • Enzymatic activity is assayed in the supernatant and / or in the 2nd base, by a biochemical method using Cytocox 1 kit (Sigma) and then standardized to the protein content (assayed by the BCA kit, Pierce) .
  • Results The assays show that there is a very significant increase in the enzymatic activity of cytochrome oxidase after 3 hours and 24 hours of application of the active ingredient according to Example 1, in comparison with the untreated cells.
  • the active ingredient according to Example 1 very strongly stimulates the enzymatic activity of cytochrome oxidase, and more generally the mitochondrial activity, in cutaneous cells.
  • EXAMPLE 6 Demonstration of the Protective Effect of the Active Principle According to Example 1 on the Mitochondrial Membrane Potential
  • the aim of this study is to determine the protective effect of the active ingredient according to Example 1, with respect to dermal fibroblasts mitochondria subjected to oxidative stress, caused by hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) or UVB irradiation.
  • a mitochondria membrane potential marker (JC-I) is used.
  • JC-I is a marker that emits a different fluorescence depending on the level of polarization of the mitochondrial membrane. Protocol: The human dermal fibroblasts are treated with a 1% solution of active principle according to Example 1, for 96 hours, then subjected to oxidative stress, caused by I ⁇ 2 O?
  • results In the fibroblasts treated with the active principle according to Example 1, the mitochondria have a red fluorescence (JC-I aggregated), a sign of a high membrane potential, greater than in the control cells.
  • the irradiated or oxidatively stressed fibroblasts have mitochondria that fluoresce little in the red, and mainly in the green (monomeric JC-I), a sign of an alteration of the mitochondrial membrane potential.
  • the application of the active ingredient according to Example 1 makes it possible to observe a more pronounced red fluorescence.
  • the application of the active ingredient according to Example 1 causes an increase in the membrane potential of the mitochondria.
  • the active ingredient according to Example 1 effectively protects the mitochondria of cutaneous cells subjected to oxidative stress or irradiation with UVB.
  • phase A and phase B are separately heated between 70 ° C. and 75 ° C.
  • Phase B is emulsified in phase A with stirring.
  • Phase C is added at 45 ° C, increasing stirring.
  • Phase D is then added when the temperature is below 40 ° C. Cooling is continued up to 25 ° C. with vigorous stirring.
  • phase A Prepares phase A with stirring. Incorporate the xanthan gum gradually, with deflocculating stirring. Phases C and D will be incorporated once the gel is complete. Phase E, prepared before perfect dissolution of the DHA, will be added later. Adjust the pH if necessary to 4 - 4.5. Color and perfume.
  • phase A Prepare and melt phase A at 65-70 ° C. Heat phase C at 65-70 ° C. Phase B is added to phase A just before emulsifying A in B. At about 45 ° C, the carbomer is neutralized by addition of phase D. Phase E is then added with gentle stirring and cooling is continued to 25 ° C. Phase F is then added if desired.
  • phase A Prepare phase A and heat to 75 ° C with stirring.
  • phase B by dispersing the carbopol, then the xanthan gum with stirring. Let rest. Heat to 75 ° C.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation, dans une composition cosmétique, d'une quantité efficace de principe actif issu du lin (genre Linum) pour activer le cytochrome c et à stimuler les fonctions des mitochondries. Le principe actif provient de l'hydrolyse de protéines de lin et contient principalement des polypeptides ou des peptides. Il peut être utilisé seul ou en association avec au moins un autre principe actif. L'invention porte encore sur un procédé de traitement cosmétique destiné à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures et à lutter contre le vieillissement cutané.

Description

UTLISATION D'UN PRINCIPE ACTIF ISSU DU LIN DANS UNE COMPOSITION DESTINEE A ACTIVER LE CYTOCHROME C
La présente invention se situe dans le domaine cosmétique et pharmaceutique, et plus particulièrement dans le domaine de la dermatologie. La présente invention concerne l'utilisation, dans une composition cosmétique d'une quantité efficace de principe actif issu du lin (genre Linum) ; pour activer le cytochrome c. De préférence, le principe actif provient de l'hydrolyse de protéines de lin et contient principalement des polypeptides ou des peptides. Il peut être utilisé seul ou en association avec au moins un autre principe actif. L'invention est également relative à l'utilisation d'une composition cosmétique pour stimuler les fonctions des mitochondries et à augmenter le niveau énergétique cellulaire. L'invention porte encore sur un procédé de traitement cosmétique destiné à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures et à lutter contre le vieillissement cutané.
Le principe actif, activateur du cytochrome c, peut également être utilisé pour préparer des compositions pharmaceutiques destinées à prévenir ou lutter contre les pathologies liées à des dysfonctionnements mitochondriaux ; par exemple, certaines dégénérescences neuromusculaires ou cardiaques, le diabète de type II ou encore certaines pathologies du vieillissement.
Le terme « phanères » selon l'invention englobe l'ensemble des annexes kératiniques présentes à la surface du corps, en particulier les poils, les cils, les sourcils, les ongles et les cheveux.
La peau est un organe vital qui recouvre toute la surface du corps et assure des fonctions protectrices, sensitives, immunitaires, métaboliques ou encore thermorégulatrices. La peau, comme les autres organes, est soumise au vieillissement. Or, un des mécanismes majeurs impliqués dans les processus du vieillissement est l'accumulation de dommages oxydatifs dans des molécules essentielles telles que les lipides membranaires, les protéines, l'ADN et tout particulièrement I1ADN mitochondrial (ADNmt).
Les dommages oxydatifs sont provoqués par les radicaux libres, des espèces chimiquement instables et très réactionnelles générées par le métabolisme intracellulaire ou les agressions extérieures. Parmi ces agressions extérieures, on peut citer : les rayonnements UV, les toxines, les polluants atmosphériques, les oxydants alimentaires. Dans la peau, on observe un vieillissement prématuré survenant dans les zones exposées aux rayonnements, caractérisé par des phénomènes d'altérations des macromolécules (péroxydation lipidique, carbonylation des protéines) touchant en particulier l'élastine, le collagène ou la fibronectine. On a également pu montrer un déclin progressif des fonctions mitochondriales avec l'âge, probablement lié à l'accumulation de mutations sur l'ADNmt (K. Singh, Ann. N. Y. Acad. Sci. 1019, 2004).
Une des conséquences importantes de l'accumulation des dommages oxydatifs est une réduction de la capacité de la cellule à produire de l'ATP (Porteous et al., Eur J Biochem
1998, 257(1): 192-201). Ainsi, le phénomène du vieillissement cellulaire est en relation avec les dommages oxydatifs que subit la cellule mais aussi avec le processus de production d'énergie nécessaire à la cellule pour survivre.
L'organisme possède des mécanismes de défense capables de piéger ou de transformer les radicaux libres (enzymes, glutathion, vitamines A et E, coenzyme QlO, etc.). Cependant, ces systèmes de défenses antioxydants s'avèrent souvent insuffisants devant les nombreux stress et agressions extérieures auxquels sont soumis les organismes et la peau en particulier.
Dans ce contexte, les propriétés particulières du cytochrome c apparaissent comme particulièrement intéressantes :
Le cytochrome c est une petite protéine soluble de 15 kDa qui joue un rôle essentiel dans la fonction mitochondriale et dans la survie cellulaire. Le cytochrome c est une molécule hautement conservée chez la plupart des eucaryotes ; on la trouve dans les mitochondries des plantes, des animaux et de nombreux organismes unicellulaires. Le cytochrome c présente une structure protéique organisée autour d'une porphyrine, constituée de quatre noyaux pyrrol, eux-mêmes liés à un atome de fer. Le rôle principal du cytochrome c est d'assurer le transfert d'électrons, grâce au changement de valence de l'atome de fer. Le cytochrome c qui est soluble, transporte ainsi les électrons depuis le complexe m (coenzyme QH2-cytochrome c réductase) jusqu'au complexe IV (cytochrome oxydase). Les électrons, qui sont le substrat de la cytochrome oxydase, sont alors transférés par l'enzyme vers l'oxygène.
La recherche de composés pouvant stimuler les mitochondries et augmenter le niveau énergétique cellulaire afin de prévenir ou de lutter contre les signes du vieillissement cutané, ou les dommages causés par les agressions extérieures, telles que les rayonnements UV, les radiations, ou les expositions à des toxines ou à des polluants, est une préoccupation importante de la recherche médicale et de la cosmétique. A cet égard, il a été proposé des solutions telles que l'apport de substances impliquées dans le métabolisme énergétique, et plus particulièrement d'intermédiaires ou de cofacteurs du cycle de Krebs tels que le fumarate, le L-malate, l'acétyl CoA (WO 02064129) ou encore le traitement de la peau par des substances capables de diminuer les radicaux libres, telles que la vitamine C (US 2004/0086526) ou la L-ergothionéine (WO 9836748). D'autre part des extraits de lignanes extraits du lin ont été décrit comme bénéfiques pour la peau (WO 2004/010965). Mais à la connaissance de la demanderesse, aucune composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant des composés de nature peptidiques, issus du lin, capables d'activer le cytochrome c n'a encore été décrite.
La présente invention a pour principal objectif l'utilisation d'une quantité efficace d'un principe actif de nature peptidique, issu de l'hydrolyse des protéines du lin (genre Linum), dans une composition cosmétique pour activer le cytochrome c et stimuler les mitochondries, dans le but de protéger la peau des agressions extérieures et de lutter contre le vieillissement cutané. Ledit principe actif pourra être utilisé seul ou en association avec au moins un autre principe actif. Les inventeurs ont en effet mis en évidence une activité thérapeutique, et plus particulièrement dermatologique et cosmétique, d'un principe actif de nature peptidique issu de l'hydrolyse du lin, capable d'activer le cytochrome c. Il a notamment été mis en évidence que ces polypeptides ou ces peptides, qui constituent le principe actif, lorsqu'ils sont appliqués sur la peau, stimulent de façon importante les fonctions mitochondriales. Cela a, entre autre, été démontré par une augmentation de l'expression du cytochrome c, une augmentation de l'activité de la cytochrome oxydase et une augmentation de la synthèse d'ATP. Ce nouveau principe actif stimulateur des mitochondries, et plus généralement capable de protéger la peau des agressions extérieures permet ainsi d'ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques et cosmétiques.
On entend par « principe actif capable de protéger la peau des agressions extérieures », un hydrolysat de nature peptidique issu de l'hydrolyse des protéines du lin (genre Linum), capable de présenter des propriétés protectrices ou de diminuer l'apoptose dans des cellules ou des tissus soumis à un stress d'origine physico-chimique ou environnementale. On entend par « principe actif capable d'activer le cytochrome c », un hydrolysat de nature peptidique issu de l'hydrolyse des protéines du lin (genre Linum), capable d'augmenter l'expression du cytochrome c, soit par l'activation de la synthèse protéique (par modulation directe ou indirecte de l'expression génique du cytochrome c), soit par l'augmentation de l'activité biologique du cytochrome c, soit par d'autres processus biologiques tels que la stabilisation de la protéine cytochrome c ou encore la stabilisation des transcrits d'ARN messager.
On entend par « principe actif capable de stimuler les fonctions des mitochondries », toute un hydrolysat de nature peptidique issu de l'hydrolyse des protéines du lin (genre Linum), capable d'augmenter l'expression ou l'activité des principales molécules actives présentes dans les mitochondries, et plus généralement capables de d'augmenter les principales fonctions énergétiques de la mitochondries ; à savoir, la chaîne de phosphorylation oxydative et la synthèse d'ATP.
On entend par « de nature peptidique », un mélange de composés majoritairement représentés par des peptides ou des polypeptides. Le terme « peptide » désigne un enchaînement de deux ou plusieurs acides aminés liés entre eux par des liaisons peptidiques ou par des liaisons peptidiques modifiées ; le terme « polypeptide » désignant un peptide de taille plus importante.
Par l'expression « biologiquement actif », on entend « qui possède une activité in vivo ou in vitro caractéristique de l'activité du principe actif selon l'invention ».
Le terme "hydrolysat ou issu de l'hydrolyse" désigne toute substance ou mélange de substances, ou préparation isolée, obtenue après hydrolyse de matière végétale.
Le principe actif selon l'invention peut être obtenu par extraction de protéines d'origine végétale, suivie d'une hydrolyse contrôlée qui libère des fragments peptidiques biologiquement actifs. De très nombreuses protéines trouvées dans les plantes sont susceptibles de contenir des fragments peptidiques biologiquement actifs au sein de leur structure. L'hydrolyse ménagée permet de dégager ces fragments peptidiques. Il est possible, mais non nécessaire pour réaliser l'invention, d'extraire soit les protéines concernées d'abord et de les hydrolyser ensuite, soit d'effectuer l'hydrolyse d'abord sur un extrait brut et de purifier les fragments peptidiques ensuite. Il est également possible d'utiliser certains extraits hydrolyses sans en purifier les fragments peptidiques correspondant aux peptides biologiquement actifs selon l'invention, mais en s'assurant toutefois de la présence desdits fragments par des moyens analytiques appropriés. Pour réaliser l'extraction, on peut utiliser la plante entière, ou une partie spécifique de la plante (feuille, graine, etc.).
Plus particulièrement selon l'invention, on utilise une des nombreuses plantes de la famille des linacées, du genre Linum (lin). Le genre Linum compte près de 200 espèces poussant surtout l'hémisphère nord. Ce sont des plantes herbacées à tiges fibreuses, à feuilles simples, aux fleurs à 5 pétales. Préférentiellement selon l'invention, on utilise l'espèce cultivée Linum usitatissimum L. Selon l'invention, le matériel végétal utilisé sera la graine et préférentiellement la graine débarrassée de son enveloppe par une étape de décorticage. Dans une première étape, la plante est broyée à l'aide d'un broyeur à plantes. La poudre ainsi obtenue peut ultérieurement être "délipidée" à l'aide d'un solvant organique classique (comme par exemple un alcool, l'hexane ou de l'acétone).
On réalise ensuite l'extraction des protéines de la plante suivant le procédé classique (Osborne, 1924) modifié ; le broyât de plante est mis en suspension dans une solution alcaline contenant un produit adsorbant de type polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) insoluble (0,01 - 20 %) ; en effet il a été observé que les opérations d'hydrolyses et de purifications ultérieures étaient facilitées par ce moyen. La concentration des substances de type phénoliques interagissant avec les protéines se trouve ainsi réduite.
La fraction soluble est recueillie après des étapes de centrifugation et de filtration, cette solution brute constituant alors une première forme de l'extrait contenant les protéines, les glucides et éventuellement des lipides.
Les protéines sont ensuite précipitées en faisant varier la force ionique en acidifiant le milieu, ce qui permet d'éliminer les composants solubles et les acides nucléiques.
Le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant organique tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol puis le solvant est évaporé par séchage sous vide. Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant et constitue alors une forme plus purifiée de l'hydrolysat.
L'extraction peut également être réalisée en milieu neutre ou acide toujours en présence de polyvinylpolypyrrolidone. Après une étape de filtration, l'étape de précipitation s'effectue alors à l'aide d'un agent classique de précipitation tel que les sels (chlorure de sodium, sulfate d'ammonium) ou un solvant organique (alcool, acétone). Le précipité obtenu peut être séparé des agents de précipitation par dialyse après remise en solution dans de l'eau ou un autre solvant. La fraction protéique isolée selon l'invention est ensuite hydrolysée dans des conditions ménagées pour générer des polypeptides et des peptides solubles. L'hydrolyse se définit comme étant une réaction chimique impliquant le clivage d'une molécule par de l'eau, cette réaction pouvant se faire en milieu neutre, acide ou basique. Selon l'invention, l'hydrolyse est réalisée par voie chimique et/ou de façon avantageuse par des enzymes protéolytiques. On peut alors citer l'utilisation des endoprotéases d'origine végétale (papaïne, bromelaïne, ficine) et de micro-organismes (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.).
Pour les mêmes raisons que précédemment, lors de cette étape d'hydrolyse ménagée, une quantité de polyvinylpolypyrrolidone est additionnée au milieu réactionnel. Après filtration la solution obtenue constitue l'hydrolysat actif. L'hydrolysat actif peut être encore purifié afin de sélectionner les poids moléculaires et la nature des peptides générés. Le fractionnement peut s'effectuer avantageusement par ultrafiltration et/ ou par une méthode de type chromatographique.
L'une quelconque des formes plus ou moins purifiées de l'hydrolysat est alors solubilisée dans de l'eau ou dans tout mélange contenant de l'eau, puis stérilisée par ultrafiltration.
L'hydrolysat végétal obtenu selon l'invention est analysé qualitativement et quantitativement pour ses caractéristiques physico-chimiques et sa teneur en composés de nature protéique et peptidique. On entend par composés de nature peptidique, les fragments de protéines, les peptides et les acides aminés libres présents dans le mélange. Les peptides, acides aminés et fragments de protéines sont dosés selon les techniques classiques, bien connues de l'homme du métier.
Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'hydrolysat végétal actif a un pH compris entre 4 et 7, et préférentiellement, entre 5 et 6, un extrait sec titrant entre 1 et 8 g/1, et de manière préférée entre 2 et 5 g/1, sa teneur en composés de nature peptidique est comprise entre 0,1 et 5 g/1, et préférentiellement entre 0,5 et 2 g/1 et sa teneur en sucres est de 0,5 à 2,5 g/1.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le principe actif selon l'invention est préalablement solubilisé dans un ou plusieurs solvants cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, classiquement utilisés par l'homme de métier, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le principe actif selon l'invention est préalablement solubilisé dans un vecteur cosmétique ou pharmaceutique comme les liposomes ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites, et plus généralement solubilisé dans, ou fixé sur, tout vecteur cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable.
La composition utilisable selon l'invention peut en particulier consister en une composition pour soins capillaires, et notamment un shampooing, un après-shampooing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une lotion restructurante pour les cheveux, un masque, etc. La composition cosmétique selon l'invention peut être utilisée notamment dans les traitements mettant en œuvre une application qui est suivie ou non suivie d'un rinçage, ou encore sous forme de shampooing.
Elle peut également se présenter sous forme de teinture ou de mascara à appliquer au pinceau ou au peigne, en particulier sur les cils, les sourcils ou les cheveux.
Il est bien entendu que le principe actif selon l'invention peut être utilisé seul ou bien en association avec au moins un autre principe actif, dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou dermatologique.
Les compositions selon l'invention pourront être appliquées par toute voie appropriée, notamment orale, parentérale ou topique externe, et leur formulation sera adaptée par l'homme du métier, en particulier pour des compositions cosmétiques ou dermatologiques.
Avantageusement, les compositions selon l'invention sont destinées à une administration par voie topique cutanée. Ces compositions doivent donc contenir un milieu cosmétiquement et/ou dermatologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, et couvrent toutes les formes cosmétiques ou dermatologiques. Ces compositions pourront notamment être sous forme de crèmes, émulsions huile-dans-eau, ou eau-dans-huile ou émulsions multiples, solutions, suspensions, gels, laits, lotions, sticks ou encore de poudres, adaptés à une application sur la peau, les lèvres et/ou les phanères.
Ces compositions comprennent les excipients nécessaires à leur formulation, tels que solvants, épaississants, diluants, tensioactifs, anti-oxydants, colorants, conservateurs, parfums.
Avantageusement, les compositions utilisables selon l'invention contiennent en outre d'autres principes actifs destinés à favoriser son action. Parmi ces autres principes actifs, on o
peut citer les principes actifs ayant une action anti-radicalaire ou antioxydante, choisis parmi la vitamine C, la vitamine E, le coenzyme QlO et les extraits polyphénoliques de plantes.
Par « principes actifs anti-radicalaires », on entend tout composé capable de piéger les radicaux libres. Ces principes actifs sont capables de bloquer les réactions en chaînes des radicaux libres avant les étapes ultimes de dégradation des constituants biologiques de la peau et ont de ce fait une activité antioxydante. Parmi ces autres principes actifs, on peut également citer les principes actifs stimulant les synthèses des macromolécules dermiques (laminine, fibronectine, collagène), par exemple le peptide de collagène commercialisé sous le nom « Collaxyl® » par la société Vincience. Parmi ces autres principes actifs, on peut enfin citer les principes actifs stimulant le métabolisme énergétique, comme le principe actif commercialisé sous la dénomination « GP4G® » par la société Vincience.
Selon un autre aspect, la composition selon l'invention peut être une composition solaire, c'est-à-dire une composition aidant à la protection contre le rayonnement solaire. Ainsi, il peut être avantageusement ajouté, à la composition selon l'invention, des actifs aidant à la protection solaire tels que, par exemple, des filtres solaires.
Il est bien évident que l'invention s'adresse aux mammifères en général et plus particulièrement aux êtres humains. La quantité efficace de principe actif correspond à la quantité nécessaire afin d'obtenir le résultat recherché, à savoir : activer le cytochrome c, stimuler les rnitochondries et augmenter le niveau énergétique cellulaire, et plus généralement, protéger la peau et les phanères des agressions extérieures et lutter contre le vieillissement cutané
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le principe actif est présent dans les compositions de l'invention à une concentration comprise entre 0,0001 % à 20 % environ, et préférentiellement à une concentration comprise entre 0,05 % et 5 % environ par rapport au poids total de la composition finale.
Ces compositions pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydroalcoolique ou huileuse ; d'une émulsion huile-dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de crèmes, de suspensions, ou encore de poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les phanères. Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol. Elles peuvent être utilisées comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage de la peau.
Ces compositions comprennent, en outre, tout additif communément utilisé dans le domaine d'application envisagé ainsi que les adjuvants nécessaires à leur formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des anti-oxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des actifs cosmétiques ou pharmaceutiques, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs, des polymères filmogènes, etc.
Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80 % en poids et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition seront choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
Par ses activités particulières, le principe actif selon l'invention pourra être utilisé avantageusement dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique.
En particulier, le principe actif selon l'invention pourra être utilisé avantageusement dans une composition cosmétique destinée à lutter de manière préventive et/ou curative contre les manifestations du vieillissement cutané et, plus spécifiquement, afin de lutter contre et/ou de prévenir le vieillissement photo-induit (photo- vieillissement). Par manifestations cutanées du vieillissement, on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau et des phanères dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, la peau flétrie, la peau molle, la peau amincie, le manque d'élasticité et/ou de tonus de la peau, la peau terne et sans éclat ou les taches de pigmentation de la peau, la décoloration des cheveux ou les taches sur les ongles, mais également toute modification interne de la peau qui ne se traduit pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, toute dégradation interne de la peau consécutive à une exposition aux rayonnements ultraviolets (UV). Le principe actif selon l'invention, ou la composition le contenant, permettra de lutter, en particulier, contre la perte d'élasticité et de fermeté de la peau. Le principe actif selon l'invention permet de protéger la peau et les phanères contre tous types d'agressions extérieures. L'utilisation du principe actif, ou d'une composition le contenant, va permettre à la peau et aux phanères d'être protégés et de mieux résister aux stress environnementaux.
On entend, par l'expression « agression extérieure », les agressions que peut produire l'environnement. A titre d'exemple, on peut citer des agressions telles que la pollution, les UV, ou encore les produits à caractère irritant tels que les tensioactifs, les conservateurs ou les parfums. Par pollution, on entend aussi bien la pollution « extérieure », due par exemple aux particules de diesel, à l'ozone ou aux métaux lourds, que la pollution « intérieure » qui peut être due notamment aux émissions de solvants de peintures, de colles, ou de papier- peints (tels que toluène, styrène, xylène ou benzaldehyde), ou bien encore la fumée de cigarette.
Le principe actif selon l'invention peut être avantageusement utilisé dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, en tant qu'agent photo-protecteur et, plus particulièrement, en tant qu'agent photo-protecteur dit « secondaire ». On distingue, en effet, les agents photo-protecteurs primaires des agents photo-protecteurs secondaires. Les agents photo-protecteurs primaires sont des substances qui exercent un pouvoir physique : ils sont en mesure d'absorber les rayonnements UV et de les restituer sous forme de chaleur afin de protéger la peau. Les agents photo-protecteurs secondaires sont des substances qui ont généralement un effet biologique ; ce sont, par exemple, les agents capables de limiter les dommages causés à T ADN et aux membranes par la pénétration des rayonnements UV dans la peau.
L'invention se rapporte encore à l'utilisation dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif selon l'invention, le principe actif ou la composition le contenant, étant destiné à augmenter la synthèse d'ATP intracellulaire des cellules de la peau.
L'invention a également pour objet l'utilisation dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif selon l'invention, le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à prévenir les dommages causés à la peau par une exposition au soleil ou une exposition à des rayonnements ionisants lors de radiothérapies.
L'invention a également pour objet l'utilisation dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif selon l'invention, le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à stimuler les mitochondries, en particulier sur les zones du corps exposées aux rayonnements
UV.
L'invention se rapporte encore à l'utilisation dans une composition cosmétique, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique, d'une quantité efficace de principe actif tel que décrit précédemment, le principe actif, ou la composition le contenant, étant destiné à protéger la peau des dommages causés par les radicaux libres.
L'invention consiste encore en l'utilisation d'une quantité efficace de principe actif pour préparer une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à lutter contre certaines pathologies liées à des dysfonctionnements mitochondriaux, par exemple, certaines dégénérescences neuromusculaires ou cardiaques, le diabète de type π, certaines pathologies du vieillissement.
L'invention consiste encore en un procédé de traitement cosmétique destiné à stimuler les défenses et à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures et à lutter contre le vieillissement cutané, caractérisé par l'application sur la peau ou les phanères à traiter d'une composition contenant une quantité efficace de principe actif selon l'invention.
L'invention consiste encore en un procédé de traitement cosmétique destiné à donner un aspect plus sain à la peau et à améliorer l'éclat et la radiance du teint, caractérisé par l'application sur la peau à traiter d'une composition contenant une quantité efficace de principe actif selon l'invention.
Des modes de réalisation particuliers de ce procédé de traitement cosmétique résultent également de la description précédente. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront mieux à la lecture des exemples donnés à titre illustratif et non limitatif. Exemple 1 : Préparation de principe actif à partir de lin (Linum usitatissimum L.)
Le principe actif est obtenu à partir de plantes de l'espèce Linum usitatissimum L. Bien entendu l'extrait peut être préparé à partir de plantes d'au moins l'une quelconque des nombreuses variétés et espèces appartenant au genre Linum. Dans une première étape, 1 kg de graines de lin décortiquées sont broyées dans un broyeur à céréales. La farine obtenue est délipidée par l'action d'un solvant organique, l'hexane. Après filtration et séchage sous vide, la poudre obtenue est mise en suspension dans une solution aqueuse alcaline (dilution au 1/10) pH 10 contenant 1 % de polyvinylpolypyrrolidone (Polyclar V ISP). Ce mélange est maintenu sous agitation pendant un temps suffisamment long pour permettre la solubilisation des fractions solubles. La température d'extraction est variable (comprise entre 4 et 800C) ; préférentiellement l'opération sera réalisée à froid. Après cette phase d'extraction le milieu est clarifié par centrifugation puis filtré sur filtre à plaque. Ce filtrat qui contient les fractions solubles du lin est ensuite soumis à une précipitation des protéines en faisant varier la force ionique en milieu neutre ou acide, ce qui permet d'éliminer les composants glucidiques solubles, les lipides et les acides nucléiques le milieu est amené à pH 3,5. Le surnageant est éliminé et le précipité est ensuite lavé à l'aide d'un solvant tel que, par exemple, l'éthanol ou le méthanol puis le solvant est évaporé par séchage sous vide.
A ce stade, on obtient environ 50 grammes de poudre de couleur jaune clair d'extrait protéique brut contenant : - Protéines : 75 % - Glucides : 20 % Lipides : 5 %
Le précipité riche en protéines est remis en solution dans l'eau ou un autre solvant.
L'extrait protéique brut est alors soumis à une série d'hydrolyses ménagées et sélectives consistant en des hydrolyses chimiques et enzymatiques en présence de 0,5 % de PVPP (Polyclar V) et d'endopeptidases à cystéine (papaïne, ficine). Après réaction l'hydrolysat est filtré sur plaque puis sur cartouche stérilisante (0,2 μm). On obtient alors un hydrolysat de couleur claire, titrant de 15 à 30 g/1 d'extrait sec, qui est alors dilué de telle sorte que la concentration en composés de nature peptidique déterminée par la méthode de Lowry, soit comprise entre 0,1 et 5 g/1 et préférentiellement entre 0,5 et 2 g/1. L'analyse physico-chimique de l'hydrolysat végétal, qui constitue le principe actif, montre que son pH est compris entre 4 et 7, et préférentiellement entre 5 et 6, l'extrait sec titre de 1 à 8 g/1 et de manière préférée entre 2 et 5 g/1, sa teneur en composés de nature peptidique est comprise entre 0,1 et 5 g/1, et préférentiellement, entre 0,5 à 2 g/1 et sa teneur en sucres entre 0,5 à 2,5 g/1.
Exemple 2 : Préparation de principe actif à partir de lin (Linum usitatissimum L.)
Une variante du protocole de l'exemple 1 consiste à réaliser la même séquence d'hydrolyses enzymatiques ménagées et sélectives mais en présence de 0,5 % de PVPP. On obtient alors un hydrolysat de couleur claire titrant de 15 à 30 g/1 d'extrait sec après fïltration stérilisante On procède ensuite à une ultrafiltration de la solution sur une cartouche de fïltration
Millipore Helicon (seuil de coupure ; 1 kDa). Les hauts poids moléculaires contenus dans le retentât sont écartés, le filtrat est conservé.
La concentration en composés de nature peptidique est déterminée par la méthode de
Lowry, soit comprise entre 0,1 et 5g/l et préférentiellement entre 0,5 et 2 g/1. L'analyse physico-chimique de l'hydrolysat végétal, qui constitue le principe actif, montre que son pH est compris entre 4 et 7, et préférentiellement, entre 5 et 6, l'extrait sec titre entre 1 à 8 g/1, et de manière préférée entre 2 et 5 g/1, sa teneur en composés de nature peptidique est comprise entre 0,1 et 5g/l et préférentiellement entre 0,5 à 2 g/1 et sa teneur en sucres entre
0,5 à 2,5 g/1. Une autre variante consiste à effectuer une purification du principe actif, obtenu selon l'exemple 1 ou 2, par chromatographie d'échange d'ions, sur une colonne TSK gel
(TosoHaas) avec un tampon phosphate pH 7.
Exemple 3 : Mise en évidence de l'effet stimulant du principe actif selon l'exemple 1 sur la synthèse d'ATP intracellulaire Le but de cette étude est de déterminer l'influence du principe actif selon l'exemple 1 sur la synthèse d'ATP, produit par les mitochondries.
Protocole : Cette étude s'effectue à l'aide d'un Kit « ATP Bioluminescence Assay Kit HS
II » (Roche Applied Science). Des fibroblastes dermiques sont traités avec une solution à 1
%, de principe actif selon l'exemple 1, pendant une période allant de 1 à 3 heures. A la fin de l'incubation, les puits sont rincés avec 2 ml de PBS froid avant d'ajouter 250 μl d'un tampon de lyse fournis par le kit. Les cellules de chaque puits sont ensuite grattées puis récoltées dans des tubes de 14 ml. Chaque puits est rincé avec 2 x 500 μl PBS froid et le tout est de nouveau récolté dans les tubes respectifs. A partir de ces échantillons, une dilution est réalisée au l/12000ieme dans du PBS froid avant chaque lecture. Le dosage d'ATP est réalisé sur ces échantillons : 50 μL de cette dilution sont déposés dans une luma- cuvette et 50 μL de luminol sont ajoutés. Après 10 secondes, la lecture de la luminescence est déclenchée. Les valeurs sont standardisées par rapport à la quantité de protéines pour chaque échantillon. Les mesures sont effectuées à l'aide d'un appareil : le Biocounter M2010A LUMACΘ/3M.
Résultats : Les dosages d'ATP montrent qu'il y a une augmentation importante de la quantité d'ATP intracellulaire après 1 heure et 3 heures, dans des cellules traitées par le principe actif selon l'exemple 1 , en comparaison des cellules non traitées.
Conclusion : Le principe actif selon l'exemple 1 augmente sensiblement le niveau énergétique de cellules cutanées telles que les fibroblastes, et plus généralement stimule les fonctions mitochondriales.
Exemple 4 : Mise en évidence de l'effet activateur du principe actif selon l'exemple
1 sur l'expression de cytochrome c
Le but de cette étude est de déterminer l'influence du principe actif selon l'exemple 1 sur l'expression du cytochrome c. Pour cela la quantité de cytochrome c a été évaluée par la technique de Pimmuno-transfert (ou western blot). Protocole : Des fibroblastes dermiques humains sont traités avec une solution à 1 %, de principe actif selon l'exemple 1, pendant 72 heures. Les cellules sont ensuite lysées et homogénéisées par sonication, puis centrifugées 10 minutes à 1000 g. Les échantillons, standardisés pour leur concentration en protéine (dosage kit BCA , Pierce), sont soumis à une électrophorèse sur gel Bis-TRIS 4-12 % (InvitroGen). Après électro-transfert, les membranes sont incubées pendant une nuit avec un anticorps anti-cytochrome c, dilué au 1/500 (Mouse monoclonal anti cytochrome c, TEBU). Un anticorps secondaire, couplé à la peroxydase et dilué au 1/5000 est ensuite utilisé (peroxydase conjugated F(ab')2, Goat antimouse, Immunotech). Le signal chimio-luminescent est ensuite quantifié à l'aide du kit Supersignal West Femto Trial kit et lu dans une chambre de lecture (Multilmage light Cabinet, Alpha Immunotech Corporation). Résultats :_On obsen'e une nette augmentation de l'expression du cytochrome c dans les fibroblastes traités par le principe actif selon l'exemple 1.
Conclusions : Le principe actif selon l'exemple 1 stimule fortement l'expression du cytochrome c dans les cellules cutanées, et plus généralement les fonctions mitochondriales.
Exemple 5: Mise en évidence de l'effet activateur du principe actif selon l'exemple
1 sur l'activité enzymatique de la cytochrome oxydase
Le but de cette étude est de déterminer l'influence du principe actif selon l'exemple 1 sur l'activité mitochondriale. Pour cela l'activité enzymatique totale (mitochondriale) de la cytochrome oxydase a été mesurée. Protocole : Des fibroblastes humains normaux sont traités avec une solution à 1 %, de principe actif selon l'exemple 1, pendant 3 heures et 24 heures. Les cellules sont récoltées, rincées puis lysées par sonication. Une première centrifugation est réalisé pour éliminer les principaux débris cellulaires et le surnageant est ensuite centrifugé de nouveau à 10 000 g pendant 10 min. L'activité enzymatique est dosée dans le surnageant et/ou dans le 2eme culot, par une méthode biochimique, à l'aide de kit Cytocox 1 (Sigma) puis standardisée pour la teneur en protéines (dosée par le kit BCA, Pierce).
Résultats : Les dosages montrent qu'il y a une augmentation très importante de l'activité enzymatique de la cytochrome oxydase après 3 heures et 24 heures d'application du principe actif selon l'exemple 1, en comparaison des cellules non traitées. Conclusion : Le principe actif selon l'exemple 1 stimule très fortement l'activité enzymatique de la cytochrome oxydase, et plus généralement l'activité mitochondriale, dans les cellules cutanées.
Exemple 6 : Mise en évidence de l'effet protecteur du principe actif selon l'exemple 1 sur le potentiel de membrane mitochondriale Le but de cette étude est de déterminer l'effet protecteur du principe actif selon l'exemple 1, vis-à-vis des mitochondries de fibroblastes dermiques soumis à un stress oxydatif, provoqué par de l'eau oxygénée (H2O?) ou à une irradiation UVB. On utilise pour cela un marqueur du potentiel de membrane des mitochondries (JC-I). Le JC-I est un marqueur qui émet une fluorescence différente selon le niveau de polarisation de la membrane mitochondriale. Protocole : Les fibroblastes dermiques humains sont traités avec une solution à 1 % de principe actif selon l'exemple 1, pendant 96 heures, puis soumis à un stress oxydatif, provoqué par de IΗ2O? à 2 mM pendant 30 minutes, ou à une irradiation par des UVB à 50 mJ/cm2. Des contrôles non traités par le peptide ou par de l'H2O2 ou non irradiés sont réalisés dans les mêmes conditions. A la fin de l'expérimentation, les cellules sont lavées, fixées et soumises à un marquage par une solution de JC-I (Molecular Probes) à 0,2 μg/ml, afin de révéler le potentiel de membrane des mitochondries.
Résultats : Dans les fibroblastes traités par le principe actif selon l'exemple 1, les mitochondries présentent une fluorescence rouge (JC-I agrégé), signe d'un potentiel de membrane élevé, plus important que dans les cellules contrôle. Les fibroblastes irradiés ou soumis à un stress oxydatif ont des mitochondries qui fluorescent peu dans le rouge, et principalement dans le vert (JC-I monomérique), signe d'une altération du potentiel de membrane mitochondrial. Dans ces dernières conditions, l'application du principe actif selon l'exemple 1 permet d'observer une fluorescence rouge plus marquée. Conclusions : L'application du principe actif selon l'exemple 1 provoque une augmentation du potentiel de membrane des mitochondries. D'autre part, le principe actif selon l'exemple 1 protège efficacement les mitochondries des cellules cutanées soumises à un stress oxydatif ou à une irradiation par des UVB.
Exemple 7 : Préparation de compositions 1 - Crème protection solaire:
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000018_0001
Les constituants de la phase A et de la phase B sont chauffés séparément entre 700C et 75°C. La phase B est émulsionnée dans la phase A sous agitation. La phase C est ajoutée, à 45°C, en augmentant l'agitation. La phase D est ensuite additionnée lorsque la température se situe en dessous de 4O0C. Le refroidissement est poursuivi jusqu'à 25°C sous vive agitation.
2 -Lait après-soleil :
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000019_0001
Préparer la phase A sous agitation. Incorporer la gomme xanthane progressivement, sous agitation défloculeuse. Les phases C et D seront incorporées une fois Ie gel terminé. La phase E, préparée préalablement jusqu'à parfaite dissolution de la DHA, sera rajoutée ensuite. Ajuster le pH si nécessaire à 4 - 4,5. Colorer et parfumer.
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000021_0001
Préparer et fondre la phase A à 65-700C. Chauffer la phase C à 65-700C. La phase B est ajoutée à la phase A juste avant d'émulsionner A dans B. A environ 45°C, le carbomer est neutralisé par addition de la phase D. La phase E est ensuite additionnée sous légère agitation et le refroidissement est poursuivi jusqu'à 25°C. La phase F est alors addi-tionnée si souhaité.
4 -Crème protectrice de jour :
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
Préparer la phase A et chauffer à 75°C sous agitation. Préparer la phase B en dispersant le carbopol, puis la gomme xanthane sous agitation. Laisser reposer. Chauffer à 750C.
A température, émulsionner A dans B sous agitation rotor-stator. Neutraliser avec la phase C sous agitation rapide. Après refroidissement à 4O0C, additionner la phase D, puis la phase E. Le refroidissement est poursuivi sous agitation légère et la phase F rajoutée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation dans une composition cosmétique d'une quantité efficace d'un principe actif de nature peptidique, issu de l'hydrolyse des protéines du lin (genre Linum), pour activer
5 le cytochrome c et stimuler les mitochondries.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le principe actif provient de graines de lin de l'espèce Linum usitatissimum L.
10 3. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le principe actif, contient au moins 0,1 et 5 g/1, et préférentiellement au moins 0,5 à 2 g/1 de composés de nature peptidique.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce 15 que le principe actif est utilisé en une quantité représentant de 0,0001 % à 20 % du poids total de la composition, et préférentiellement en une quantité représentant de 0,05 % à 5 % du poids total de la composition.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce -20 que— le— priaeipe— aetif— est préalablement— setebilisé dans— un on plusieurs sr>1v_anîs_ cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptables, comme l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propylène glycol, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques, la vaseline, une huile végétale ou tout mélange de ces solvants. 25
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition se présente sous une forme adaptée à l'application par voie topique comprenant un milieu cosmétiquement ou dermatologiquement acceptable.
30 7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition contient en outre, au moins un autre principe actif favorisant l'action dudit principe actif.
8. Utilisation selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'autre principe actif est choisi parmi les principes actifs antioxydants et/ou les principes actifs stimulant la synthèse de la matrice extracellulaire, et/ou les principes actifs stimulant le métabolisme cellulaire énergétique.
9. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans une composition cosmétique destinée à protéger la peau et les phanères contre tous les types d'agressions extérieures.
10. Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que les agressions extérieures sont les rayonnements UV.
11. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans une composition cosmétique destinée à augmenter la synthèse d'ATP intracellulaire des cellules de la peau.
12. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans une composition cosmétique destinée à prévenir ou à traiter les signes cutanés du vieillissement et/ou du photo-vieillissement. -
13. Utilisation d'une quantité efficace de principe actif, tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3, pour préparer des compositions pharmaceutiques destinées à prévenir ou à lutter contre les dysfonctionnements mitochondriaux, tels que certaines dégénérescences neuromusculaires ou cardiaques, le diabète de type π ou certaines pathologies du vieillissement.
14. Procédé de traitement cosmétique destiné à stimuler les défenses et à protéger la peau et les phanères des agressions extérieures, caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau ou les phanères à traiter une composition contenant une quantité efficace de principe actif, tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
5. Procédé de traitement cosmétique destiné à donner un aspect plus sain à la peau et à améliorer l'éclat et la radiance du teint, caractérisé en ce que l'on applique topiquement sur la peau à traiter une composition contenant une quantité efficace de principe actif, tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 3.
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