WO2009013370A1 - Biosensores basados en microalgas para la detección de contaminantes medioambientales - Google Patents

Biosensores basados en microalgas para la detección de contaminantes medioambientales Download PDF

Info

Publication number
WO2009013370A1
WO2009013370A1 PCT/ES2008/000465 ES2008000465W WO2009013370A1 WO 2009013370 A1 WO2009013370 A1 WO 2009013370A1 ES 2008000465 W ES2008000465 W ES 2008000465W WO 2009013370 A1 WO2009013370 A1 WO 2009013370A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
algae
population
compound
toxic
microalgae
Prior art date
Application number
PCT/ES2008/000465
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Guillermo Orellana Moraleda
Victoria LÓPEZ RODAS
Eduardo Costas Costas
David Haig Florez
Emilia MANEIRO PAMPÍN
Original Assignee
Universidad Complutense De Madrid Rectorado
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad Complutense De Madrid Rectorado filed Critical Universidad Complutense De Madrid Rectorado
Priority to EP08805295A priority Critical patent/EP2177905A4/en
Priority to US12/667,590 priority patent/US20100248286A1/en
Publication of WO2009013370A1 publication Critical patent/WO2009013370A1/es

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C12N1/125—Unicellular algae isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/18—Water
    • G01N33/186—Water using one or more living organisms, e.g. a fish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/89—Algae ; Processes using algae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N2021/635—Photosynthetic material analysis, e.g. chrorophyll
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6432—Quenching
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N2021/6482—Sample cells, cuvettes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/405—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from algae
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2520/00—Use of whole organisms as detectors of pollution

Definitions

  • the invention relates to the field of microalgae based biosensors and, more specifically, to biosensors for the detection of environmental pollutants by means of the specific monitoring of the inhibition of the photosynthetic activity of microalgae and the consequent inhibition of molecular oxygen production by the microalgae in the presence of the toxic compound.
  • Anthropogenic pollution of ecosystems is a hot topic today, not only because of the danger of diminishing the quality and quantity of natural resources, but because such pollution can have an impact on human health.
  • Water is a limited natural resource and studies in both natural aquatic ecosystems (lakes, rivers, ...) and artificial (reservoirs) warn about the increase in the appearance of new toxic agents from industrial, agricultural and domestic activities.
  • Biosensors based on whole cells can be an attractive option as long as the microorganisms that are used as analyte recognition elements are easy to isolate and manipulate, are safe, their culture and maintenance is cheap, resist the necessary handling to integrate them into the biosensor and provide reliable and specific information on the presence and concentration of the target toxic agent.
  • the essence of a whole cell biosensor is that its cellular activity is sufficiently sensitive to the presence of the contaminant of the medium in which the device is introduced, but it is little affected or insensitive to the physicochemical characteristics of said medium, to the cycle cellular and nutrient availability. It must also be easily integrated with the appropriate transducer (optical, electrical) of the messenger or biological signal.
  • Green microalgae are the main components of the phytoplankton population. Consequently, they can be found in virtually any aquatic environment on the planet. Some species of green microalgae can grow in almost any environmental condition and survive in low concentrations of nutrients or under environmental conditions that would be lethal to many other microorganisms (temperature, pH, salts, etc.). It is therefore no surprise that microalgae have been used already for the development of biosensors capable of responding to critical changes in aquatic ecosystems. (Merz, D. et al. 1996, Fresenius J. Anal. Chem., 354, 299-305; Frense, D.
  • Said biosensors are based on the inhibitory effect of some toxins on the photosynthetic activity of algae.
  • the status of the photosynthetic activity of green algae can be monitored by the intensity of fluorescence emitted by their chlorophyll molecules or by the production of molecular oxygen (02). This is due to the fact that sunlight is absorbed by a network of "antenna” pigments bound to proteins and processed thanks to the photosynthetic reaction center ("photosystems I and II"). A small part of the energy absorbed in excess is dissipated in the form of heat, while another part of the energy absorbed is emitted as fluorescence from the chlorophyll (Maxwell and Johnson, J. Exper. Botany 2000, 51, 659-668).
  • Sunlight is mainly used to carry out water photolysis, with O 2 generation.
  • the chlorophyll function is altered, so that the fluorescence is attenuated and the production of O2 decreases.
  • the photosynthetic activity causes an alkalization of the culture medium that is inhibited in the presence of toxic agents.
  • microalgal biosensors are known in the state of the art in which the detection of the photosynthetic function is detected by measuring the attenuation of the fluorescence, by decreasing the production of O 2 or by inhibiting the alkalization of the means, medium.
  • Algae biosensors based on the detection of the chlorophyll-associated fluorescence are mostly based on the measurement of the chlorophyll a (ChI a) fluorescence emission in the photosystem Il (PSII).
  • This type of biosensors are used because they allow the detection of certain herbicides that inhibit the transport of electrons (they are 50% of the herbicides used in agriculture) during photosynthesis at the level of photosystem Il (PSII).
  • This type of biosensors have been widely described in the literature. Thus Nguyen-Ngoc and Tran-Minh (Anal. Chim.
  • TNT trinitrotoluene
  • Other examples of biosensors based on the measurement of the intrinsic fluorescence of chlorophyll include the biosensors described by Conrad et al., (J. Appl. Phycol. 1993, 5: 505-516) Rizzuto et al. (in F. Mazzei and R.
  • these biosensors have the disadvantage that only those compounds that inhibit PSII can be detected, so that the spectrum of analytes that can be identified is very small.
  • these biosensors have the added disadvantage that the fluorescent signal to be captured is subject to important variations not only with the concentration of the target analyte (pesticide, explosive, etc.), but also with fluctuations in the population of immobilized plant cells, without it being possible to correct this interference.
  • the measurements of the generated O 2 can be carried out both optically and electrochemically (Gula, RN et al., "Electrochemical an Optical Oxygen Microsensors for In Situ Measurements", in In Situ Monitoring I heard Aquatic Systems: Chemical Analysis and Speciation, Buffle and Horvai (Eds.), Wiley, New York, 2000).
  • Most of the microalgal microsensors described to date are amperometric devices, which measure the evolution of photosynthetic 02 produced in the presence of the toxic (for example atrazine or other water pollutants). Examples of such biosensors are those described by Shitanda et al. (Analytica Chimica Acta 2005, 530, 191-197), Pandard et al.
  • Biosensors in which a measurement of the intrinsic fluorescence of the chlorophyll and of the production of O 2 by amperometry are simultaneously performed have been described in DE4332163.
  • Orellana, G and Moreno-Bondi.MC et al. have described optical sensors for oxygen detection based on Ia ability of this molecule to deactivate the luminescent emission of certain coordination compounds of Ru (II).
  • these sensors have been used only for the determination of the biochemical oxygen demand (BOD), by incorporating them to bacteria that are capable of consuming O 2 in the presence of said organic matter.
  • the analytical capacity of the known biosensors is limited by the low specificity to the target analyte, since they are capable of detecting any substance that inhibits photosynthesis (Koblizek, M. et al. Biotechnol. Bioeng. 1998, 60, 664-669; Merz, D. et al. Fresenius J. Anal. Chem. 1996, 354, 299-305; Frense, D. et al. Sensors Actuators B: Chem. 1998, 51, 256-260).
  • the only attempt to obtain a specific microalgal biosensor for a given analyte is the example of Altamirano, M.
  • the biosensor contains a strain of microalgae that has been selected for its resistance to the target analyte. that it is desired to detect and a strain that is sensitive to the target analyte, so that in the presence of the target analyte only the sensitive strain shows a decrease in photosynthetic activity, while in the presence of any other toxic agent, a decrease in Ia is observed.
  • Photosynthetic activity of the two strains of microalgae was not implemented in the form of a biosensor and, in addition, was based on the detection of the intrinsic fluorescence of the PSII with the problems that this determination entails as discussed above.
  • the invention relates to a specific biosensor for detecting a toxic compound comprising
  • step (i) a first selection of viable spontaneous mutants to said compound by exposure to said toxic compound and (ii) a second selection from the mutants obtained in step (i) in the presence of progressively higher concentrations of said toxic compound by means of minus a ratchet cycle.
  • the invention relates to the use of a biosensor of the invention to detect the presence of a toxic compound in a sample.
  • the invention relates to the use of a biosensor of the invention to distinguish the presence of the toxic compound that causes a decrease in the production of oxygen in the first population of algae of other toxic compounds in a sample.
  • the invention in a fourth aspect, relates to a method for the detection of a toxic compound in a sample comprising the steps of a) contacting the sample with a biosensor according to the invention in which the second population of algae has been selected in the presence of said toxic compound and b) detecting the light production of each cell populations in the biosensor in the presence of said sample where a decrease in the light production of the first population of cells with respect to the second population of cells is indicative that the sample contains the toxic compound against which the cells of the second population have been selected and where a decrease in the production of light by the two cell populations is indicative that the sample contains a compound Toxic other than the compound against which the first population of cells have been selected.
  • the invention relates to a process for obtaining microalgae resistant to a toxic compound comprising the steps of a) a first selection of viable spontaneous mutants in the presence of said toxic compound and b) a second selection from the mutants isolated in the stage
  • the invention relates to an algae strain resistant to a toxic compound that is obtainable by the selection process of the invention.
  • Figure 1 Graphical representation of the steps to follow in Set 1 and Set 2.
  • Figure 2 Experimental scheme of the ratchet cycles in which in the first cycle the microalgae are grown in the presence of 1/10 of the DL100,
  • Figure 4 Characterization of oxygen production during the photosynthesis of the strain most sensitive to the toxic agent.
  • Figure 5 Oxygen production during the photosynthesis of the strain most sensitive to the toxic agent.
  • Figure 6 Selection of the concentration that induces a lethal dose of 100%.
  • Figure 7 Oxygen production of resistant microalgae in the absence or presence of toxic agent.
  • Figure 8 Oxygen production of sensitive and resistant microalgae in the absence or presence of toxic agent.
  • Figure 9 Oxygen production of sensitive and resistant microalgae in the presence of the target toxic agent.
  • Figure 10 Colonization of the microporous matrix by resistant microalgae.
  • Left panel ImmobaSil membrane without colonization.
  • Top 5 ImmobaSil membrane colonized by 5 * 10 cells.
  • Lower right panel Transverse section of the ImmobaSil membrane colonized by the microalgae.
  • FIG 11 Scheme of the biosensor where S and R indicate the heads containing the microalgae strains sensitive (S) and resistant (R) to the target analyte.
  • Figure 12 Biosensor scheme showing the blue LED (470 nm) powered by a current source (1), the visible photodiode or CCD sensor (2), the trifurcated optical fiber of optical glass (3), the device for the input (or output) of the sample (4), the device for the exit (or inlet) of the sample (4 ' ), the window of optical or plastic glass (5), the cellulose membrane disc (6), the porous silicone disc that contains the resistant (or sensitive) microalgae ) (7), the porous silicone disc containing the sensitive (or resistant) microalgae (7 ' ), the thin layer of light-opaque material (8), the oxygen-permeable 02 sensing membrane (9), Ia O-ring for sealing the measuring cavity (10), the bifurcated optical fiber (11), the optoelectronic measuring unit with luminescent sensors (12), the
  • the present invention is based on the unexpected finding by the authors that the sensitivity and specificity of the biosensors of toxic products based on algae can be considerably increased if the strains that integrate said biosensors have been previously selected for their resistance and / or sensitivity to the toxic agent whose presence is to be detected, wherein said selection is carried out by a first stage of fluctuation analysis (for resistant and sensitive strains) and by a second stage of selection using one or more ratchet cycles (in the case of resistant strains).
  • the first stage of selection allows to identify mutants (either already existing in the culture medium or that have appeared spontaneously during the selection) while the ratchet cycle (s) they allow to select organisms that accumulate more than one mutation that confer resistance to the toxic compound.
  • strains that show sensitivity are obtained. increased to the target toxic (which provides greater sensitivity to the target toxic) and strains that show increased resistance to the target toxic (which provides greater specificity).
  • the inventors have observed that it is possible to increase the versatility of the biosensors by means of the direct detection of the molecular oxygen instead of the measurement of the fluorescence associated with the chlorophyll, and that said direct detection of the oxygen can be carried out using the same type of sensors that are used for the detection of BOD, in which the measurement of oxygen is not performed amperometrically but through the use of a luminescent compound whose luminescence is partially deactivated in the presence of O 2 , so that a decrease in the production of O 2 by the microalgae as a result of the decrease in the photosynthetic activity results in an increase in the luminescence on the part of said compound.
  • the invention relates to a microalgae based biosensor that is specific for a certain toxic compound, wherein said biosensor comprises the following elements: a) a first population of algae whose oxygen production decreases in the presence of said compound, b) a second population of algae of the same species as the first population, whose oxygen production is not modified in the presence of said compound and which has been obtained from a strain of wild type algae by a process comprising the stages of
  • biosensor as used in the present invention, is meant a device capable of carrying out analytical determinations (typically in situ and in real time) that contains, physically bound or confined, a biological recognition element in direct contact with the sample and spatially close or in contact with said transducer element, regardless of the transducer element that provides a measurable signal (optical, electrochemical, piezoelectric, mass, ).
  • the biosensor comprises two populations of microalgae that have been selected for their resistance and / or sensitivity to a given analyte.
  • microalgae as used in the context of the present invention, any photosynthetic protist belonging to the Chlorophyta type is understood.
  • Illustrative non-limiting examples of algae that can be used in the present invention include microalgae belonging to the genera Scenedesmus sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Spirogyra sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Prymnesium sp., Porphyridium sp. ., Synechoccus sp. and Dictyosphaerium sp.
  • the species of algae that forms the first and second population of algae is Dictyosphaerium chlorelloides.
  • herbicides for example simazine, DCMU, glyphosate
  • fungicides for example 2- phenylphenol, azaconazole, azoxystrobin, carboxine, cymoxanila, ciproconazole, dodine, epoxiconazole, etridiazole, fenfuram, ferimzam, ferimzona flusilazole, flutriafol, fuberidazole, furalaxil, furametpyr, imazalil, metalaxil, metasulfocarb, metominostrobin, miclobutanyl, ofurace, oxadixyl, oxycarboxyin, phenylmercury acetate, propiconazole, protioconazole, pyrimethanil, piroquilonezole, piroquilothiaconazole, piroquiloneace
  • herbicides for example simazine, DCMU,
  • the first population of algae is characterized by being sensitive to the analyte that is to be determined, that is, that the photosynthetic activity of said population decreases or disappears completely in the presence of the analyte.
  • any strain of analyte sensitive microalgae can be used in the context of the present invention.
  • the first population has been selected from strains that appear naturally because of their greater sensitivity to the target analyte, that is, the DL100 of the strain against the analyte is lower than in the original strain. The selection is made by methods known to the person skilled in the art.
  • individual clones of algae isolated from nature are grown in the presence of increasing concentrations of the toxic agent and that clone showing a lower cell density in the culture is selected after a certain time.
  • the microalgae strains are grown in aliquots of a constant number of cells in the presence of the toxic agent for 5 days.
  • the second population of cells is characterized by being resistant to the target analyte, that is, that the photosynthetic activity of said population is not substantially modified in the presence of the analyte.
  • the second population of cells is obtained through a double selection process that comprises a first selection stage by fluctuation analysis of mutants that are present in the initial population or that appear spontaneously during the selection of the strains in the presence of the target analyte. .
  • the invention requires the use of algae of the same species as the strain that is used as the first population.
  • the microalgal strain that is used as a starting material in the first selection cycle is the strain of the first population characterized by being especially sensitive to the target analyte.
  • the first stage of selection is carried out by culturing clones isolated from the algae that is desired to be used in the presence of increasing concentrations of the target analyte and selection of those strains that have a higher cell density after a certain period of culture.
  • the selection can be carried out using as a starting material low density or high cell density cultures or using both types of cultures simultaneously.
  • cultures of high and low cell density are used simultaneously, so that the statistical analysis of the number of resistant strains makes it possible to elucidate whether the mutant originally existed in the microalgal population before exposure to the toxic agent or , on the contrary, if the mutation is the result of an adaptation Physiological induced by continued exposure to the toxic agent.
  • the second stage of selection is carried out by means of the so-called ratchet or ratchet cycles, using methods known to those skilled in the art.
  • the ratchet cycles are carried out by the method described by Reboud, X. et al. (Biological Journal of the Linnean Society, 2007, 91: 257266).
  • part of several cultures of the strain or the starting clone are added to which toxic agent concentrations equal to or greater than DL100 are added and are maintained for a certain time (first ratchet cycle). If it is observed that algal growth occurs after said period, the concentration of toxic agent is increased and the algae are kept in culture during the same time (second ratchet cycle).
  • the cycles are repeated as many times as necessary until some replicate of the resistant clone does not grow, which preferably requires the order of 10 to 15 cycles, depending on the type of chemical agent. At that time the optimization is considered finished.
  • the strains sensitive and resistant to the toxic target can be identified by standard techniques widely known to the person skilled in the art.
  • the resistant strains can be identified by determining the DL100 of the particular strain for said target toxic, so that if the DL100 is above the DL100 value for the starting strain, the strain would be a strain has been obtained by the method of the invention.
  • sensitive strains could be identified by determining the Ia
  • the strain would be a strain that could be incorporated into the biosensor of the invention.
  • the means to stimulate the photosynthetic activity of the algae populations comprise a light source of a wavelength suitable for Stimulate photosynthesis of microalgae populations.
  • a light source of a wavelength suitable for Stimulate photosynthesis of microalgae populations any light source that produces light with a peak wavelength around 470 nm can be used in the context of the present invention.
  • the invention contemplates the use of multichromatic or monochromatic light sources. In the case of panchromatic sources, the light can be used as is or decomposed in elementary beams by standard monochromators. However, the use of monochromatic light sources such as lasers and LEDs is preferred. In a preferred embodiment, the light source is a blue LED that emits a narrow band centered at 470 nm.
  • the optoelectronic element (12) that serves to detect the optical properties of the compound whose properties vary in the presence of the compound to be detected includes an element that excites the photoluminescence of the oxygen sensitive film, continuously measures the intensity and / or phase shift of the latter. , correlates these parameters with the concentration of the toxic in the water and controls the start, duration and intensity of the light pulse of the source.
  • the optoelectronic unit can also control the operation of auxiliary pumps that cause the flow of water sample through the sensitive end.
  • Transition metal complexes in particular platinum d 6 metals such as Ru (II), Os (II), Re (II), Pt (II), Rd (III) and Ir (III) with at least one diimine-type ligand (for example, 2,2'-bipyridine, 1, 10-phenanthroline and its derivatives with different degree of substitution).
  • platinum d 6 metals such as Ru (II), Os (II), Re (II), Pt (II), Rd (III) and Ir (III) with at least one diimine-type ligand (for example, 2,2'-bipyridine, 1, 10-phenanthroline and its derivatives with different degree of substitution).
  • diimine-type ligand for example, 2,2'-bipyridine, 1, 10-phenanthroline and its derivatives with different degree of substitution.
  • conjugated phenyl rings can be introduced into the structures defined above in order to increase oxygen sensitivity.
  • the compound whose optical properties vary in the presence of oxygen is permeating an O 2 permeable film (9).
  • O 2 permeable film 9
  • the sensing film has a thickness between 5 to 250 ⁇ m
  • the oxygen sensitive film is separated from the microalgae by a thin layer of an opaque oxygen permeable polymer (8 ), so that the oxygen released by more microalgae can access the sensor film but not the light coming from the diode that stimulates the photosynthesis of the algae populations (1)
  • any oxygen permeable membrane can be used in the context of the present invention to cover the sensor film (8), but for use in the present invention, silicone membranes, of polydi, are preferably used Methylsiloxanes or cellulose acetate.
  • the two populations of algae are immobilized on a support.
  • the support is a three-dimensional matrix. In an even more preferred embodiment,
  • the three-dimensional matrix is a microporous matrix.
  • any microporous support can be used in the present invention, provided that they are suitable for the culture of cells in suspension and that the pore size is small enough so that the algae inside do not escape.
  • Suitable materials for preparing microporous supports according to the present invention include include gelatin (Cultispher G, HyClone), cellulose (Cytocell, Pharmacia), polyethylene (Cytoline 1 and 2, Pharmacia), silicone (Immobasil, Ashby Scientific), collagen (Microsphere, Cellex Biosciences), crystal (Siran, Schott Glassware), acrylic copolymers, acrylamide, methylene-bisacrylamide, dimethylaminopropyl, methacrylamide, methylstyrene methacrylate, ethylene / acrylic acid, acryl-nitrile butadienestirene (ABS), ABS / polycarbonate, ABS / polysulfone, ABS / polyvinyl chloride, ethylene prop
  • the microalgae are separated from the aqueous medium in which the measurement is performed by a microalgae impermeable membrane.
  • a microalgae impermeable membrane In this way, the loss of the microalgae by washing is avoided while protecting the membrane containing the microalgae from fouling and contamination.
  • Suitable materials for the impermeable membrane include cellulose, paper and cellulose derivatives (cellulose acetate and cellulose nitrate), polyester, cellulose nitrate, polycarbonate, microporous polyethersulfone, PET, polyvinylidene fluoride (PVDF), polypropylene, silica, alumina , diatomaceous earth, gelatin, polyacrylamide and the like. These materials can be used in the membrane independently or in combinations of one or more and can be subjected to treatments in order to increase or decrease their hydrophobicity.
  • the biosensor additionally contains means for the detection of the fluorescent signal emitted by the chlorophyll in response to the light that is used to stimulate photosynthesis.
  • Fluorescent emission by each population of algae when measured in the absence of agent Toxic, it is directly proportional to the microalgae population, which allows the signal from the oxygen sensors to be corrected in real time and to increase the precision, accuracy and temporal stability of the analyte measurement.
  • the detection of the fluorescent signal is performed by a sensor (2) sensitive to red light, preferably a visible photodiode or a CCD sensor.
  • the fluorescent signal is transmitted from the microporous membrane (7 or T) to the detector (2) by means of a fiber optic beam (3).
  • the fiber optic beam that transmits the actinic light from the light source (1) and the fiber optic beam that transmits the fluorescence signal from the immobilized algae to the sensor (2) are forming part of a single trifurcated optical fiber (3).
  • the biosensor that is the subject of the present invention is, to date, the only microalgae based biosensor available in which the selection without genetic manipulation of strains highly sensitive to the toxic agent, strains resistant to the toxic agent and membrane immobilization has been unified Three-dimensional porous of both to be used together in order to achieve maximum sensitivity and specificity against a toxic agent.
  • the combination of all these characteristics included in a biosensor whose signal is the integration of both strains (sensitive and resistant) has the great advantage that it does not imply any risk when using the biosensor in situ for measurements in aquatic ecosystems, since the biological component the same aquatic environment proceeds and it is not genetically manipulated.
  • the invention relates to the use of the biosensor of the invention to detect the presence of a toxic compound in a sample.
  • the invention relates to the use of the biosensor of the invention to distinguish in a sample the presence of the toxic compound against which the second population of cells of other toxic compounds has been selected.
  • Samples that can be analyzed using the biosensor of the invention include any conventional sample in which it is suspected that a toxic compound may appear, such as, for example, river waters, a reservoir, a purification station, an industrial effluent and the like .
  • the sample suspected of containing a toxic agent is solid (for example, food), it is necessary to perform an extraction of molecules soluble in aqueous solvents, so that said extract can be applied to the biosensor of the invention.
  • the use according to the present invention is not limited to the study of samples that are potentially contaminated with the target toxins, but can be used at the industrial level in production plants of said toxic agents to monitor the performance and purity of the synthesis.
  • the biosensor works as follows.
  • the water sample is applied through the conduit (4) that allows access of the sample to the heads containing the sensitive and resistant algae ( Figure 10).
  • Each head comprises a cellulose membrane disk (6) associated with the porous membrane (7 or 7 ' ) in which the cells are located and which in turn is in contact with an opaque porous membrane (8) that allows the passage of oxygen to the oxygen sensing membrane (9).
  • the entire measurement cavity is hermetically sealed by means of O-rings (10) on both sides of the porous membrane (7 or 7 ').
  • the actinic radiation emitted by blue LEDs (1) filtered by means of pass-band optical filters in the blue (13) and fiber optic beams that directs the lighting from the LEDs (1) to a window is used of glass (5) that is in contact with the membrane disk (6) of the head.
  • the lighting excites the photosynthetic activity of the cells that are in the porous membrane (7) that produce oxygen, which diffuses through the opaque porous membrane (8) until it reaches the sensor membrane (9) where the luminescence is shielded of the compound which impregnates said sensor membrane (9).
  • the photosynthetic activity of the sensitive cells found in the first head (7) decreases, while the photosynthetic activity of the resistant cells found in the second head (7 ') remains unchanged.
  • the decrease in photosynthetic activity results in a decrease in the production of oxygen by the sensitive cells, which in turn results in a decrease in the deactivation of the luminescent signal, with which an increase in the luminescence of the Ia is produced.
  • sensing membrane The luminescent signal is transmitted from the heads by means of bifurcated fiber optic beams (11 or 11 ') to the optoelectronic unit of measure (12).
  • the fluorescent emission associated with chlorophyll is determined in the absence of a toxic agent, using a photodiode or CCD sensor (2) for that the fluorescent emission of the algal population is sent by means of a fiber optic beam that together with the optical fiber used to transmit the excitation radiation from the blue LED (1) forms a trifurcated optical fiber (3).
  • the fluorescent emission is passed through an optical cutting filter (14).
  • the simultaneous measurement of the fluorescence of the two populations of algae is a measure of the amount of immobilized biomass, which allows to correct in real time the signal from the oxygen sensors simultaneously the amount of immobilized biomass and thus normalize the luminescent emission to The amount of algae.
  • the invention relates to a method for the detection of a toxic compound in a sample comprising the steps of a) contacting the sample with a biosensor of the invention in the that the second population of algae has been selected in the presence of said toxic compound and
  • the luminescence values of each of the cell populations depend not only on the inhibition of the photosynthetic activity in each of the populations but also on the amount of immobilized cells in each population. Therefore, in a preferred embodiment, the light production values for each of the cell populations are normalized against the total number of cells in each population. Normalization requires the simultaneous determination of the total amount of algal biomass in each immobilized population and the normalization of the values of variation in the production of light by the two populations of algae according to the amount of immobilized algal biomass. In an even more preferred embodiment, the determination of the amount of immobilized algal biomass is carried out by detecting the fluorescent emission of each algal population in response to stimulating photosynthetic activity in the absence of toxic.
  • the determination of the biomass of each of the algal populations is determined simultaneously to the determination of the luminescent signal over time, which allows the correction of the values in real time.
  • the optoelectronic unit (12) is responsible for carrying out the normalization from the luminescence values emitted by the sensor membrane (9) and the intensity of the fluorescent signal detected by the sensor (2).
  • the authors of the present invention have shown that the specificity of the biosensor has only been possible thanks to the incorporation into the sensor of highly resistant cells to the target toxic. Said cells have been obtained in an inventive manner by the authors of the invention by means of the surprising observation that applying a ratchet cycle selection to cells that already had resistance to the target toxic allows to obtain cells with an even greater resistance than the starting cells . Without wishing to be bound by any theory, it is thought that the increased resistance of the cells obtained by the method of the invention is based on the ability of the ratchet cycles to select mutants that contain multiple mutations capable of conferring resistance to the toxic agent.
  • the invention provides a process for obtaining microalgae resistant to a toxic compound comprising the steps of a) a first selection of viable spontaneous mutants in the presence of said toxic compound and b) a second selection in the presence of progressively higher concentrations of said toxic compound from the cells obtained in step (a) by at least one ratchet cycle.
  • step (b) includes at least 2 ratchet cycles, more preferably at least three ratchet cycles.
  • the method of selection of the invention allows obtaining a population with a degree of resistance to the target toxic agent much greater than the use of each of the methods separately. Without wishing to be bound by any theory, it is thought that this technical effect is a consequence of the use as starting material of cells that have already been selected for their resistance to the toxic compound. If the selection were made only through stage (a) or through stage (b), the resulting cell population would contain a mixture of sensitive and resistant strains, which would make them unacceptable for incorporation into a biosensor such as that which is the object of The invention
  • the invention relates to algae resistant to a certain toxic that have been obtained by the method of selection of the present invention.
  • a sample of water was collected in a sterile bottle in the area where the biosensor will be located.
  • the cloning of microalgae to obtain strains is done by isolating them (for example, those belonging to the genus
  • Dictyosphaerium chlorelloides of the sample deposited on a slide and selecting a single cell by means of a micromanipulator, under laminar flow cabinet. Each isolated cell is transferred to one of the wells of the sterile 96-well plates with BG-11 culture medium (Sigma-Aldrich
  • Microalgal strains in cells isolated 96 - well plates with culture medium BG-11 are maintained in culture chamber at 22 0 C under light
  • the clones most sensitive to the exposure of the toxic agent are selected, that is, the clones that significantly reduce oxygen production in the shortest time and at the lowest concentration of the toxic agent. For this, exposures of the different clones are made at concentrations
  • the clone most sensitive to the toxic agent obtained in example 1 is grown in the presence of increasing concentrations (e.g., 0, 3, 10, 30, 100, 300 -1 mg L) of toxic agent in BG-11 medium for 5 days.
  • concentrations e.g., 0, 3, 10, 30, 100, 300 -1 mg L
  • the number of cells in each sample is determined using an automatic counter and that concentration of toxic agent that induces a lethal dose DL100 is selected.
  • the microalgae in SET 1 are allowed to reach a density of 2 * 10 microalgae in each of the 100 bottles.
  • the control of the microalgae proliferation is carried out by means of counts in Cell-Coulter.
  • the dose of the toxic agent that induces DL 100 is added to each of the 100 culture tubes and left in culture for 1 month.
  • the microalgae are counted in each of the 100 culture tubes.
  • As a control the number of cells in a tube that was sown a density is used
  • the statistical processing of the results of Set 1 and Set 2 will indicate if the resistance to the toxic agent is due to a natural mutation that already existed in the microalgal population before its exposure to the toxic agent (pre-selective adaptation or natural resistance) or if on the contrary it is a physiological adaptation, induced by continuous exposure to the toxic agent (post-selective adaptation or induced resistance).
  • pre-selective adaptation or natural resistance if the resistant microalgae come from a spontaneous mutation before Ia exposure to the toxic agent, then there should be a high variance in the number of microalgae per tube. If the resistant microalgae come from exposure to the toxic agent, their presence by tube should be similar and their variance very low.
  • Set 2 helps us estimate the error in the sampling of resistant cells (López Rodas et al., Eur. J. Phycol. 2001, 36, 179-190).
  • a general scheme of the method of selection of resistant strains by ratchet or ratchet is indicated in Figure 2.
  • the resistant clone obtained by fluctuation analysis is exposed to the toxic agent by ratchet or ratchet cycles (Reboud et al., 2007, Biological! Journal of the Linnean Society, 91, 257-266), which allow continued exposure of the clone to the toxic.
  • the concentration of toxic used will be 1/10, 1/3 and 1 of the DL 100.
  • 3 tubes are taken with 500,000 cells in 4 mL of medium for each concentration used and a control, constituting the first ratchet cycle.
  • Immobasil membranes 10 mm in diameter and 0.25 m thick are washed with distilled water membranes, autoclaved (121 0 C, 15 min), they are allowed to dry and store in a sterile container with distilled water and washed with BG-11 before use.
  • the membranes are then placed in sterile 4-well plates, 1 ml of BG-11 medium with 500,000 plant cells of the most sensitive clone per ml in each well is added to each well.
  • the membrane is checked weekly until the microalgae colonic the entire membrane surface (the typical time is 3-4 weeks depending on the type of clone and the type of microalgae used).
  • the strain with the best response to the toxic agent is Ia 20 (see figure 3).
  • the highest percentage of oxygen production inhibition corresponds to the strain
  • the rate of division of the sensitive microalgae is (0.98 ⁇ 0.1), approximately one division every 24 hours in the absence of the toxic agent.
  • -1 is significantly different in the presence of 5 mg L (ppm) of the toxic agent, from that which occurs in the absence of the toxic agent.
  • EXAMPLE 6 Characterization of the microalgae resistant to the toxic agent without genetic modification by means of modified fluctuation analysis for liquid cultures applied to unicellular microalgae.
  • strain 20 The exposure of the most sensitive strain (strain 20) to the toxic agent to
  • the variance / mean ratio is greater in Set 1 than in Set 2, and we can affirm that microalgae resistant to the toxic agent originate from microalgae in the aquatic environment with mutations that confer resistance to said agent. toxic.
  • the rate of division of the resistant microalgae is (0.5 ⁇ 0.2), approximately one division every 2 days in the presence and absence of the toxic agent.
  • resistant microalgae produce less oxygen during photosynthesis than sensitive ones, that is, their behavior will be similar to that of sensitive microalgae in the presence of toxic agent ( see Figure 7).
  • the oxygen production curve of sensitive and resistant microalgae in the presence of the toxic agent is different: sensitive microalgae produce less oxygen during photosynthesis than resistant ones, which allows us to determine the concentration of the target agent in the medium ( Figure 9).
  • Microalgae sensitive and resistant to the toxic agent adhere to the membrane and occupy the pores of this as can be seen in Figure 10.
  • the viability of the cells in said membrane is 98%.
  • the sensitive end of the microalgal biosensor consists of two identical heads, except that one contains microalgae sensitive to the target analyte (for example, Dictyosphaerium chlorelloides) and the other contains the corresponding resistant clone thereof, both immobilized on a porous silicone membrane (such as for example, the ImmobaSil type marketed by the company Cellon, Germany).
  • target analyte for example, Dictyosphaerium chlorelloides
  • a porous silicone membrane such as for example, the ImmobaSil type marketed by the company Cellon, Germany.
  • each head is shown in Figure 13.
  • a stainless steel or water-tight aluminum chamber the common end of a random bifurcated optical fiber is provided (such as, for example, those of optical glass or molten silica that markets the Vydas company, United Kingdom).
  • a thin glass or transparent plastic disk (5) and, on it, a thin luminescent film sensitive to molecular oxygen (9) are disposed thereon. , 73, 5150-5156).
  • the thin oxygen sensitive film is coated by a thin layer of polymer permeable to molecular oxygen but opaque to light (such as the black silicone prepolymer 732 manufactured and sold by Dow-Corning, USA) (8).
  • the water sample is flowed over the latter by means of a multichannel peristaltic pump (for example, from the Minipulse brand of Gilson, France).
  • the sample chamber is closed by a stainless steel or aluminum cover provided with a glass or optical plastic window (5).
  • the second head is Build in the same way.
  • the heads are organized in the biosensor in the manner indicated in Figure 11.
  • the biosensor also includes the elements indicated in Figure 12, that is, a light source (1), a light detector ( 2), a trifurcated optical fiber of optical glass (3), an input (4) and an output of the sample (4 ' ), an optoelectronic unit of measure with luminescent sensors (12), an optical band-pass filter in the blue one (13) and an optical filter of cut or "long-pass" (14).
  • the biosensor has an optical glass or plastic window through which the blue light that comes from a light emitting diode (1) is passed
  • the light of the diode is conducted to the optical window through one of the branches of a randomly trifurcated optical fiber of glass, molten silica or plastic (such as those sold by FiberGuide Industries, NJ, USA)
  • the common end of the trifurcated optical fiber is connected to a red sensitive photodiode (2) capable of measuring the fluorescent emission of the chlorophyll contained in the immobilized microalgae, under the excitation of the blue diode.
  • the photodiode signal is fed to the two-channel optoelectronic unit, which performs the measurement of the oxygen sensors and controls the pumping of the sample (for example, the optoelectronic unit

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

La presente invención proporciona biosensores basados en microalgas para la determinación de la presencia de compuestos tóxicos en una muestra, caracterizados por su alta sensibilidad y especificidad frente al tóxico diana. Los biosensores se basan en la medida de la actividad fotosinténtica de las algas mediante la monitorización de la producción de oxígeno molecular por parte de las microalgas usando un compuesto luminiscente cuya emisión depende de la cantidad de oxígeno en el medio.

Description

TÍTULO
BIOSENSORES BASADOS EN MICROALGAS PARA LA DETECCIÓN DE CONTAMINANTES MEDIOAMBIENTALES
CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al campo de los biosensores basados en microalgas y, más concretamente, a los biosensores para Ia detección de contaminantes medioambientales mediante Ia monitorización específica de Ia inhibición de Ia actividad fotosintética de las microalgas y Ia consiguiente inhibición de Ia producción de oxígeno molecular por parte de las microalgas en presencia del compuesto tóxico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La contaminación antropogénica de los ecosistemas es un tema candente hoy en día, no sólo por el peligro de disminuir Ia calidad y Ia cantidad de los recursos naturales, sino porque dicha contaminación puede repercutir sobre Ia salud humana. El agua es un recurso natural limitado y los estudios realizados tanto en ecosistemas acuáticos naturales (lagos, ríos,...) como artificiales (embalses) alertan sobre el incremento de Ia aparición de nuevos agentes tóxicos procedentes de actividades industriales, agrícolas y domésticas. Por Io tanto, existe una creciente demanda para mejorar los sistemas utilizados para el control de Ia contaminación acuática desarrollando dispositivos rápidos y fiables que permitan Ia detección "in situ" y en tiempo real del agente tóxico, además de su precisa identificación (herbicida, funguicida, insecticida, metales pesados,...) y cuantifícación (ver, por ejemplo, Buffle y Horvai (Eds.), "In Situ Monitoring of Aquatic, Systems: Chemical Analysis and Speciation", IUPAC Series on Analytical and Physical Chemistry of Environmental Systems VoI. 6, Wiley, Chichester, UK, 2000; Ligler y Taitt, "Optical Biosensors: Present and Future", Elsevier Science, New York, 2002; Knopf y Bassi (Eds.), "Smart Biosensor Technology", CRC Press, Boca Ratón, Florida, USA, 2006).
Entre otros sistemas de detección de agentes tóxicos, los biosensores químicos basados en células vivas no modificadas genéticamente (células de mamíferos, bacterias, microalgas,...), partes de células (membranas, orgánulos celulares), organismos enteros (artemias, Daphnia) o reacciones enzimáticas (oxidasas, luciferasa, fosfatasa alcalina,....) se han propuesto como candidatos idóneos para Ia detección de Ia contaminación acuática, aunque pocos de ellos han conseguido hasta hoy una amplia difusión comercial (Kissinger, 2005, Biosens. Bioelectron., 20, 2512-2516).
Los biosensores basados en células íntegras pueden constituir una opción atractiva siempre que los microorganismos que se utilizan como elementos de reconocimiento del analito sean fáciles de aislar y manipular, sean inocuos, su cultivo y mantenimiento sea barato, resistan el manejo necesario para integrarlos en el biosensor y proporcionen información fiable y específica de Ia presencia y concentración del agente tóxico diana. La esencia de un biosensor de células enteras es que su actividad celular sea suficientemente sensible a Ia presencia del contaminante del medio en el que se introduce el dispositivo, pero resulte poco afectado o sea insensible a las características físico-químicas de dicho medio, al ciclo celular y a Ia disponibilidad de nutrientes. Asimismo, debe ser integrable con facilidad con el transductor adecuado (óptico, eléctrico) del mensajero o señal biológica.
Las microalgas verdes son los principales componentes de Ia población de fitoplancton. Por consiguiente, se pueden encontrar prácticamente en cualquier medio acuático del planeta. Algunas especies de microalgas verdes pueden crecer casi en cualquier condición ambiental y sobrevivir en bajas concentraciones de nutrientes o bajo condiciones medioambientales que serían letales para muchos otros microorganismos (temperatura, pH, sales, etc.). No resulta por tanto una sorpresa que las microalgas se hayan utilizado ya para el desarrollo de biosensores capaces de responder a cambios críticos en los ecosistemas acuáticos. (Merz, D. et al. 1996, Fresenius J. Anal. Chem., 354, 299-305; Frense, D. et al., 1998, Sensors Actuators B: Chem., 51 , 256- 260; Naessens et al., 2000, Ecotoxicol. Environ. Safety, 46, 181-185; Védrine et al. Biosens. Bioelectron. 18, 457-463).
Dichos biosensores se basan en el efecto inhibidor de algunos tóxicos sobre Ia actividad fotosintética de las algas. El estatus de Ia actividad fotosintética de las algas verdes puede monitorizarse por Ia intensidad de fluorescencia que emiten sus moléculas de clorofila o por Ia producción de oxígeno molecular (02). Ello se debe a que Ia luz solar es absorbida por una red de pigmentos "antena" unidos a proteínas y procesada gracias al centro de reacción fotosintético ("fotosistemas I y II"). Una pequeña parte de Ia energía absorbida en exceso se disipa en forma de calor, mientras que otra parte de Ia energía absorbida se emite como fluorescencia desde Ia clorofila (Maxwell y Johnson, J. Exper. Botany 2000, 51 , 659-668). La luz del sol se usa principalmente para llevar a cabo Ia fotolisis del agua, con generación de O2. En presencia de agentes tóxicos, Ia función clorofílica se altera, de manera que Ia fluorescencia se atenúa y Ia producción de O2 disminuye. Así mismo, Ia actividad fotosintética provoca una alcalinización del medio de cultivo que se inhibe en presencia de agentes tóxicos.
Así, se conocen en el estado de Ia técnica biosensores microalgales en los que Ia detección de Ia función fotosintética se detecta mediante Ia medida de Ia atenuación de Ia fluorescencia, mediante Ia disminución de Ia producción de O2 o mediante Ia inhibición de Ia alcalinización del medio.
Los biosensores de algas basados en Ia detección de Ia fluorescencia asociada a Ia clorofila se basan en su mayor parte en Ia medida de Ia emisión de fluorescencia de Ia clorofila a (ChI a) en el fotosistema Il (PSII). Este tipo de biosensores se utilizan porque permiten Ia detección de ciertos herbicidas que inhiben el transporte de electrones (son el 50% de los herbicidas utilizados en agricultura) durante Ia fotosíntesis a nivel del fotosistema Il (PSII). Este tipo de biosensores han sido ampliamente descritos en Ia literatura. Así Nguyen-Ngoc y Tran-Minh (Anal. Chim. Acta, 2007, 583, 161) han descrito un biosensor que permite Ia detección del pesticida diurón en aguas usando células vegetales (Chlorella vulgaris) inmovilizadas en un soporte traslúcido inorgánico producido mediante tecnología sol-gel. Un biosensor similar para el análisis de pesticidas en aguas, pero inmovilizando dichas células vegetales sobre una membrana filtrante de vidrio, se ha descrito por Naessens et al. (Ecotoxicol. Environ. Saf. 2000, 46, 181-185 y Vedrine.C. et al. (Biosensors and Bioelectronics 2003, 18:457-463)). Altamirano et al. (Biosens. Bioelectron. 2004, 19, 1319-1323) han descrito un biosensor selectivo para Ia detección de trinitrotolueno (TNT) utilizando un tipo salvaje y otro resistente de Dictyosphaerium chlorelloides. La medida se basa en Ia inhibición de Ia fluorescencia del fotosistema Il tras 3 min de exposición a 0.5-31.3 mg/L de TNT en agua. Otros ejemplos de biosensores basados en Ia medida de Ia fluorescencia intrínseca de Ia clorofila incluyen los biosensores descritos por Conrad et al., (J. Appl. Phycol. 1993, 5:505-516) Rizzuto et al. (en F. Mazzei y R. Pilloton (Eds.), Proceedings of the Second Workshop on Chemical Sensors and Biosensors, E.N.E.A., Roma, Italia, 2000); López-Rodas et al., (Eur. J. Phycol. 2001 , 36, 179-190); Costas et al., {Eur. J. Phycol. 2001 , 36, 179-190), Podola,B. et al, 2004, Biosensors and Bioelectronics, 19:12531260, , Rodríguez.M. et al, (Biosensors and Bioelectronics, 2002, 17:843-849), Sanders.C.A. et al. (Biosensors and Bioelectronics, 2001 , 16:439-446) y Giardi.M.T. et al.(Environ.Sci.Technol., 2005, 39:5378-5384).
Estos biosensores sin embargo tienen Ia desventaja de que únicamente permiten detectar aquellos compuestos que inhiben el PSII, por Io que el espectro de analitos que se pueden identificar es muy reducido. Además, estos biosensores presentan el inconveniente añadido de que Ia señal fluorescente que se debe capturar esta sujeta a importantes variaciones no sólo con Ia concentración del analito diana (pesticida, explosivo, etc.), sino también con las fluctuaciones en Ia población de células vegetales inmovilizadas, sin que sea posible corregir esta interferencia.
Estos problemas se pueden solucionar mediante el uso de biosensores basados en Ia inhibición de Ia liberación de oxígeno, puesto que permiten detectar no sólo los compuestos que actúan sobre el PSII sino cualquier otro compuesto que comprometa Ia viabilidad de las microalgas y puesto que Ia detección de oxígeno está sujeta a menos interferencias que Ia detección de Ia fluorescencia intrínseca de las microalgas.
Las medidas del O2 generado pueden llevarse a cabo tanto óptica como electroquímicamente (Gula, R. N. et al., "Electrochemical an Optical Oxygen Microsensors for In Situ Measurements", en In Situ Monitoring oí Aquatic Systems: Chemical Analysis and Speciation, Buffle y Horvai (Eds.), Wiley, New York, 2000). La mayoría de los microsensores microalgales descritos hasta Ia fecha son dispositivos amperométricos, que miden Ia evolución del 02 fotosintético producido en presencia del tóxico (por ejemplo atrazina u otros contaminantes de las aguas). Ejemplos de tales biosensores son los descritos por Shitanda et al. (Analytica Chimica Acta 2005, 530, 191-197), Pandard et al. (Water Research 1993, 27, 427-431), Campanella,L et al (Water Res., 2000, 35:69-76). Este tipo de biosensores tienen las desventajas de (i) su gran tamaño, (ii) Ia necesidad de un mantenimiento frecuente, (iii) su sensibilidad a Ia contaminación por ciertas especies químicas presentes en las aguas (por ejemplo sulfuro) y (iv) su relativa baja sensibilidad.
Biosensores en los que se efectúa simultáneamente una medida de Ia fluorescencia intrínseca de Ia clorofila y de Ia producción de O2 mediante amperometría han sido descritos en DE4332163.
Orellana, G y Moreno-Bondi.M.C et al. (Proceedings of the Symposium on Photonics Technologies for 7th Framework Program, pp. 291-294) han descrito sensores ópticos para Ia detección de oxígeno basados en Ia capacidad de esta molécula de desactivar Ia emisión luminiscente de ciertos compuestos de coordinación de Ru(II). Sin embargo, estos sensores se han usado únicamente para Ia determinación de Ia demanda bioquímica de oxígeno (DBO), mediante Ia incorporación a los mismos de bacterias que son capaces de consumir O2 en presencia de dicha materia orgánica.
Independientemente de las desventajas anteriormente indicadas, Ia capacidad analítica de los biosensores conocidos está limitada por Ia baja especificidad al analito diana, dado que son capaces de detectar cualquier sustancia que inhiba Ia fotosíntesis (Koblizek, M. et al. Biotechnol. Bioeng. 1998, 60, 664-669; Merz, D. et al. Fresenius J. Anal. Chem. 1996, 354, 299- 305; Frense, D. et al. Sensors Actuators B: Chem. 1998, 51 , 256-260). Hasta Ia fecha, el único intento de obtener un biosensor microalgal específico para un analito determinado es el ejemplo de Altamirano, M. (supra.), en el que el biosensor contiene una cepa de microalgas que ha sido seleccionada por su resistencia al analito diana que se desea detectar y una cepa que es sensible al analito diana, de forma que en presencia del analito diana únicamente Ia cepa sensible muestra una disminución de Ia actividad fotosintética, mientras que en presencia de cualquier otro agente tóxico, se observa una disminución de Ia actividad fotosintética de las dos cepas de microalgas. Sin embargo, este tipo de estudio no llegó a implementarse en forma de biosensor y, además, se basaba en Ia detección de Ia fluorescencia intrínseca del PSII con los problemas que esta determinación conlleva según se ha discutido anteriormente.
Por ello, existe una necesidad en Ia técnica de biosensores que permitan Ia detección específica de tóxicos pero que no presenten todos los problemas asociados a Ia determinación de Ia actividad fotosintética de las algas mediante Ia cuantificación de Ia fluorescencia intrínseca asociada a Ia clorofila. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, Ia invención se relaciona con un biosensor específico para detectar un compuesto tóxico que comprende
a) una primera población de algas cuya producción de oxígeno disminuye en presencia de dicho compuesto, b) una segunda población de algas cuya producción de oxígeno no varía substancialmente en presencia de dicho compuesto, de Ia misma especie que Ia primera población y que se ha obtenido mediante un proceso que comprende las etapas de
(i) una primera selección de mutantes espontáneos viables a dicho compuesto mediante exposición a dicho compuesto tóxico y (ii) una segunda selección a partir de los mutantes obtenidos en Ia etapa (i) en presencia de concentraciones progresivamente mayores de dicho compuesto tóxico mediante al menos un ciclo de trinquete. c) medios para estimular Ia actividad fotosintética de las dos poblaciones de algas y d) medios para detectar el oxígeno producido por cada una de las dos poblaciones de algas caracterizado en que los medios para detectar el oxígeno producido por cada una de las poblaciones de algas comprenden al menos un compuesto cuyas propiedades ópticas varían en función de Ia concentración de oxígeno en el medio y al menos un elemento optoeléctrico adecuado para detectar las propiedades ópticas de dicho compuesto.
En un segundo aspecto, Ia invención se relaciona con el uso de un biosensor de Ia invención para detectar Ia presencia de un compuesto tóxico en una muestra.
En un tercer aspecto, Ia invención se relaciona con el uso de un biosensor de Ia invención para distinguir Ia presencia del compuesto tóxico que causa una disminución de Ia producción de oxígeno en Ia primera población de algas de otros compuestos tóxicos en una muestra.
En un cuarto aspecto, Ia invención se relaciona con un método para Ia detección de un compuesto tóxico en una muestra que comprende las etapas de a) poner en contacto Ia muestra con un biosensor según Ia invención en el que Ia segunda población de algas se ha seleccionado en presencia de dicho compuesto tóxico y b) detectar Ia producción de luz de cada una poblaciones de células en el biosensor en presencia de dicha muestra en donde una disminución en Ia producción de luz de Ia primera población de células con respecto a Ia segunda población de células es indicativa de que Ia muestra contiene el compuesto tóxico frente al que se han seleccionado las células de Ia segunda población y en donde una disminución en Ia producción de luz por parte de las dos poblaciones de células es indicativa de que Ia muestra contiene un compuesto tóxico distinto al compuesto frente al que se han seleccionado Ia primera población de células.
En un quinto aspecto, Ia invención se relaciona con un proceso para Ia obtención de microalgas resistentes a un compuesto tóxico que comprende las etapas de a) una primera selección de mutantes espontáneos viables en presencia de dicho compuesto tóxico y b) una segunda selección a partir de los mutantes aislados en Ia etapa
(a) en presencia de concentraciones progresivamente mayores de dicho compuesto tóxico mediante al menos un ciclo de trinquete.
En un sexto aspecto, Ia invención se relaciona con una cepa de algas resistente a un compuesto tóxico que es obtenible mediante el proceso de selección de Ia invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Representación gráfica de los pasos a seguir en el Set 1 y Set 2. Figura 2: Esquema experimental de los ciclos del trinquete en el que en un primer ciclo se hacen crecer Ia microalgas en presencia de 1/10 de Ia DL100,
1/3 de Ia DL100 y DL100 del agente tóxico. Si las microalgas crecen a todas las concentraciones se pasa al siguiente ciclo, en donde las microalgas se hacen crecer en presencia de 1/3 de Ia DL100. Figura 3: Esquema del resultado del proceso de selección mediante ciclos de trinquete con las distintas cepas que mostraban una mayor resistencia al agente tóxico.
Figura 4: Caracterización de Ia producción de oxígeno durante Ia fotosíntesis de Ia cepa más sensible al agente tóxico. Figura 5: Producción de oxígeno durante Ia fotosíntesis de Ia cepa más sensible al agente tóxico.
Figura 6: Selección de Ia concentración que induce una dosis letal del 100%.
Figura 7: Producción de oxígeno de microalgas resistentes en ausencia o presencia de agente tóxico. Figura 8: Producción de oxígeno de microalgas sensibles y resistentes en ausencia o presencia de agente tóxico.
Figura 9: Producción de oxígeno de microalgas sensibles y resistentes en presencia del agente tóxico diana.
Figura 10: Colonización de Ia matriz microporosa por las microalgas resistentes. Panel izquierdo: Membrana de ImmobaSil sin colonizar. Panel
5 superior derecho: Membrana de ImmobaSil colonizada por 5*10 células. Panel inferior derecho: Corte transversal de Ia membrana de ImmobaSil colonizada por las microalgas.
Figura 11: Esquema del biosensor en donde S y R indican los cabezales que contienen las cepas de microalgas sensibles (S) y resistentes (R) al analito diana. Figura 12: Esquema del biosensor en donde se indican el LED azul (470 nm) alimentado por una fuente de corriente (1), el fotodiodo de visible o sensor CCD (2), Ia fibra óptica trifurcada de vidrio óptico (3), el dispositivo para Ia entrada (o salida) de Ia muestra (4), el dispositivo para Ia salida (o entrada) de Ia muestra (4'), Ia ventana de vidrio óptico o de plástico (5), el disco de membrana de celulosa (6), el disco de silicona porosa que contiene las microalgas resistentes (o sensibles) (7), el disco de silicona porosa que contiene las microalgas sensibles (o resistentes) (7'), Ia capa fina de material opaco a Ia luz (8), Ia membrana sensora de 02 permeable a oxígeno (9), Ia junta tórica para sellado de Ia cavidad de medida (10), Ia fibra óptica bifurcada (11), Ia unidad optoelectrónica de medida con sensores luminiscentes (12), el filtro óptico de paso-banda en el azul (13) y el filtro óptico de corte o "long- pass" (14).
Figura 13: Esquema en detalle del cabezal (las referencias se corresponden con las de Ia figura 12).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se basa en el hallazgo inesperado por parte de los autores de que Ia sensibilidad y especificidad de los biosensores de productos tóxicos basados en algas pueden ser aumentadas considerablemente si las cepas que integran dichos biosensores han sido previamente seleccionadas por su resistencia y/o sensibilidad al agente tóxico cuya presencia se quiere detectar, en donde dicha selección se lleva a cabo mediante una primera etapa de análisis por fluctuación (para las cepas resistentes y sensibles) y mediante una segunda etapa de selección usando uno o más ciclos de trinquete (en el caso de las cepas resistentes). Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se piensa que Ia primera etapa de selección permite identificar mutantes (bien ya preexistentes en el medio de cultivo o bien que han aparecido espontáneamente durante Ia selección) mientras que el(los) ciclo(s) de trinquete permiten seleccionar organismos que acumulan más de una mutación que confieren resistencia al compuesto tóxico. De esta forma se obtienen cepas que muestran una sensibilidad aumentada al tóxico diana (que aporta mayor sensibilidad al tóxico diana) y cepas que muestran una resistencia aumentada al tóxico diana (que aporta una mayor especificidad).
Asimismo, los inventores han observado que es posible aumentar Ia versatilidad de los biosensores mediante Ia detección directa del oxígeno molecular en lugar de Ia medida de Ia fluorescencia asociada a Ia clorofila, y que dicha detección directa del oxígeno puede ser llevada a cabo usando el mismo tipo de sensores que son usados para Ia detección de DBO, en los que la medida del oxígeno no se realiza de manera amperométrica sino mediante el uso de un compuesto luminiscente cuya luminiscencia se encuentra desactivada parcialmente en presencia de O2, de forma que una disminución en Ia producción de O2 por parte de las microalgas a consecuencia de Ia disminución de Ia actividad fotosintética resulta en un aumento de Ia luminiscencia por parte de dicho compuesto.
Así, en un primer aspecto, Ia invención se relaciona con un biosensor basado en microalgas que es específico para un determinado compuesto tóxico, en donde dicho biosensor comprende los siguientes elementos: a) una primera población de algas cuya producción de oxígeno disminuye en presencia de dicho compuesto, b) una segunda población de algas de Ia misma especie que Ia primera población, cuya producción de oxígeno no se modifica en presencia de dicho compuesto y que se ha obtenido a partir de una cepa de algas tipo salvaje mediante un proceso que comprende las etapas de
(i) una primera selección de mutantes resistentes en presencia de dicho compuesto tóxico y
(ii) una segunda selección a partir de los mutantes obtenidos en Ia etapa (i) en presencia de concentraciones progresivamente mayores de dicho compuesto tóxico mediante al menos un ciclo de trinquete, c) medios para estimular Ia actividad fotosintética de las dos poblaciones de algas y d) medios para detectar el oxígeno producido por cada una de las dos poblaciones de algas caracterizado en que los medios para detectar el oxígeno producido por cada una de las poblaciones de algas comprenden al menos un compuesto cuyas propiedades ópticas varían en función de Ia concentración de oxígeno en el medio y al menos un elemento optoelectrónico adecuado para detectar las propiedades ópticas de dicho compuesto.
Por biosensor, según se usa en Ia presente invención, se entiende un dispositivo capaz de llevar a cabo determinaciones analíticas (típicamente in situ y en tiempo real) que contiene, físicamente ligado o confinado, un elemento biológico de reconocimiento en contacto directo con Ia muestra y espacialmente próximo o en contacto con dicho elemento transductor, independientemente de cual sea el elemento transductor que proporciona una señal medible (óptica, electroquímica, piezoeléctrica, másica,...).
En el contexto de Ia presente invención, el biosensor comprende dos poblaciones de microalgas que han sido seleccionadas por su resistencia y/o sensibilidad a un analito determinado. Por microalga, según se usa en el contexto de Ia presente invención, se entiende cualquier protista fotosintético perteneciente al tipo Chlorophyta. Ejemplos ilustrativos no limitativos de algas que pueden ser usadas en Ia presente invención incluyen microalgas pertenecientes a los géneros Scenedesmus sp., Chlamydomonas sp., Chlorella sp., Spirogyra sp., Dunaliella sp., Euglena sp., Prymnesium sp., Porphyridium sp., Synechoccus sp. y Dictyosphaerium sp. En una forma de realización preferida, Ia especia de alga que forma Ia primera y segunda población de algas es Dictyosphaerium chlorelloides.
Prácticamente no existe limitación en Io que se refiere a los analitos que pueden ser usados para Ia selección de cepas de microalgas resistentes y sensibles y que, por tanto, pueden ser detectados con el biosensor de Ia invención en tanto que dichos compuestos tengan un efecto tóxico frente a Ia microalga y que produzcan una inhibición de Ia fotosíntesis. Ejemplos ilustrativos y no limitativos de estos tipos de compuestos incluyen herbicidas (por ejemplo simazina, DCMU, glifosato), funguicidas (por ejemplo 2- fenilfenol, azaconazol, azoxistrobina, carboxina, cimoxanila, ciproconazol, dodina, epoxiconazol, etridiazol, fenfuram, ferimzona, flusilazole, flutriafol, fuberidazole, furalaxil, furametpyr, imazalil, metalaxil, metasulfocarb, metominostrobina, miclobutanilo, ofurace, oxadixilo, oxicarboxina, acetato de fenilmercurio, propiconazol, protioconazol, pirimetanilo, piroquilona, tetraconazol, tiabendazol, triciclazol), insecticidas (abamectina, acetamiprida, aldicarb, azadirachtina, azamethiphos, bendiocarb, carbarilo, carbofurano, clotianidina, criolita, dazomet, dimetilvinfos, DNOC, benzoato de emamectina, etiofencarb, dibromuro de etileno, fenamiphos, fenobucarb, fipronil, flonicamida, imidacloprida, isoprocarb, lufenuron, metidation, isotiocianato de metilo, metlocarb, pirimicarb, propoxur, pimetrozina, piridafention, clorantraniliprol (Renaxapyr™), sabadilla, spinosad, sulcofuron-sodio, tiacloprid, tiametoxam, tiofanox, triazamato, XMC y xylylcarb), raticidas (cloralosa, clorofacmona, coumatetralil y estricnina), toxinas (por ejemplo microcistina LH), antibióticos (por ejemplo fluoroquinolonas), metales pesados (por ejemplo cobre, cromo o plomo) y similares.
La primera población de algas se caracteriza por ser sensible al analito que se quiere determinar, es decir, que Ia actividad fotosintética de dicha población disminuye o desaparece por completo en presencia del analito. En principio, cualquier cepa de microalgas sensible al analito puede ser usada en el contexto de Ia presente invención. Sin embargo, en una forma de realización preferida, Ia primera población se ha seleccionado a partir de cepas que aparecen naturalmente por su mayor sensibilidad al analito diana, esto es, Ia DL100 de Ia cepa frente al analito es menor que en Ia cepa original. La selección se realiza mediante métodos conocidos por el experto en Ia materia. En una forma preferida de realización, se hacen crecer clones individuales de algas aisladas de Ia naturaleza en presencia de concentraciones crecientes del agente tóxico y se selecciona aquel clon que muestra una menor densidad celular en el cultivo tras un determinado tiempo. En una forma preferida de Ia invención, las cepas de microalgas se hacen crecer en alícuotas de un número constante de células en presencia del agente tóxico durante 5 días.
La segunda población de células se caracteriza por ser resistente al analito diana, esto es, que Ia actividad fotosintética de dicha población no se modifica sustancialmente en presencia del analito. La segunda población de células se obtiene mediante un doble proceso de selección que comprende una primera etapa de selección mediante análisis de fluctuación de mutantes que están presentes en Ia población inicial o que aparecen de forma espontánea durante Ia selección de las cepas en presencia del analito diana.
Como material de partida para Ia obtención de dicha segunda población microalgal, Ia invención requiere el uso de algas de Ia misma especie que Ia cepa que se usa como primera población. Sin embargo, en una forma de realización preferida, Ia cepa microalgal que se usa como material de partida en el primer ciclo de selección es Ia cepa de Ia primera población caracterizada por ser especialmente sensible al analito diana.
La primera etapa de selección se lleva a cabo mediante el cultivo de clones aislados del alga que se desea utilizar en presencia de concentraciones crecientes del analito diana y selección de aquellas cepas que presenten una mayor densidad celular tras un determinado periodo de cultivo. La selección se puede llevar a cabo usando como material de partida cultivos de baja densidad o de alta densidad celular o usando simultáneamente ambos tipos de cultivos. En una forma preferida de Ia invención, se usan simultáneamente cultivos de alta y de baja densidad celular, de forma que el análisis estadístico del número de cepas resistentes permite dilucidar si el mutante existía originalmente en Ia población microalgal antes de Ia exposición al agente tóxico o, por el contrario, si Ia mutación es el resultado de una adaptación fisiológica inducida por Ia exposición continuada al agente tóxico.
La segunda etapa de selección se realiza mediante los denominados ciclos de trinquete o ratchet, usando para ello métodos conocidos para el experto en Ia materia. En una forma de realización preferida, los ciclos de trinquete se llevan a cabe mediante el método descrito por Reboud, X. et al. (Biological Journal of the Linnean Society, 2007, 91 :257266). En una forma de realización aún más preferida, se parte de varios cultivos de Ia cepa o el clon de partida a los que se añaden concentraciones de agente tóxico iguales o superiores a Ia DL100 y se mantienen durante cierto tiempo (primer ciclo de trinquete). Si se observa que se produce crecimiento algal tras dicho periodo, se incrementa Ia concentración de agente tóxico y se mantienen las algas en cultivo durante el mismo tiempo (segundo ciclo de trinquete). Los ciclos se repiten tantas veces como sea necesario hasta que algún replicado del clon resistente no crezca, Io que preferiblemente requiere del orden de 10 a 15 ciclos, dependiendo del tipo de agente químico. En ese momento Ia optimización se considera finalizada.
El experto en Ia materia apreciará que las cepas sensibles y resistentes al tóxico diana pueden ser identificadas mediante técnicas estándar ampliamente conocidas para el experto en Ia materia. Así, las cepas resistentes pueden ser identificadas mediante Ia determinación de Ia DL100 de Ia cepa particular para dicho tóxico diana, de forma que si Ia DL100 está por encima del valor de DL100 para Ia cepa de partida, Ia cepa sería una cepa ha sido obtenida por el método de Ia invención. De Ia misma forma, las cepas sensibles podrían ser identificadas mediante Ia determinación de Ia
DL100, de forma que si dicha DL100 es inferior a Ia DL100 de Ia cepa de partida, Ia cepa sería una cepa que se podría incorporar en el biosensor de Ia invención.
Los medios para estimular Ia actividad fotosintética de las poblaciones de algas comprenden una fuente de luz de una longitud de onda adecuada para estimular la fotosíntesis de las poblaciones de microalgas. Para ello, cualquier fuente de luz que produzca luz con un pico de longitud de onda en torno a los 470 nm puede ser usada en el contexto de Ia presente invención. La invención contempla el uso de fuentes de luz multicromática o monocromática. En el caso de fuentes pancromáticas, Ia luz puede ser usada tal cual o descompuesta en haces de luz elementales mediante monocromadores estándar. Sin embargo, se prefiere el uso de fuentes de luz monocromáticas tales como, los lásers y los LEDs. En una forma de realización preferida, Ia fuente de luz es un LED azul que emite una banda estrecha centrada a 470 nm.
El elemento optoelectrónico (12) que sirve para detectar las propiedades ópticas del compuesto cuyas propiedades varían en presencia del compuesto a detectar incluye un elemento que excita Ia fotoluminiscencia de Ia película sensible a oxígeno, mide de forma continua Ia intensidad y/o desfase de ésta, correlaciona estos parámetros con Ia concentración del tóxico en el agua y controla el inicio, duración e intensidad del pulso de luz de Ia fuente. La luminiscencia emitida por cualquier detector de los conocidos en Ia técnica, incluyendo linear diode arrays, charge-coupled devices (CCD) o cualquier otro dispositivo sensible a Ia luz. La unidad optoelectrónica también puede controlar Ia actuación de bombas auxiliares que provoquen el flujo de muestra de agua a través del extremo sensible.
Compuestos cuyas propiedades luminiscentes varían en presencia de O2 incluyen complejos de metales de transición, en particular, metales d6 platino tales como Ru(II), Os(II), Re(II), Pt(II), Rd(III) e Ir(III) con al menos un ligando tipo diimina (por ejemplo, 2,2'- bipiridina, 1 ,10-fenantrolina y sus derivados con distinto grado de sustitución). Preferiblemente se pueden introducir anillos fenilos conjugados en las estructuras definidas anteriormente con el fin de aumentar Ia sensibilidad al oxígeno. Ejemplos ilustrativos no limitativos de complejos luminiscentes que pueden ser usados en el contexto de Ia presente invención incluyen tris(1 ,10-fenantrolina)rutenio(ll), tris(4,7-difenil-1 ,10- fenantrolina)rutenio(ll), tr¡s(2,2l-b¡piridina)rutenio(ll), tris(4-fenil-7-para- hexanolfenil-1 ,10-fenantrolina)rutenio(ll) (5-isotiocianato-1 ,10- fenantrolina)bis(2,2'-bip¡r¡dina)rutenio(ll)I así como todos los comuestos luminiscentes descritos en WO/1998/053316.
En otra forma de realización preferida, el compuesto cuyas propiedades ópticas varían en presencia de oxígeno se encuentra impregnando una película permeable a O2 (9). Este tipo de membranas son conocidas al experto en Ia materia (por ejemplo las membranas descritas por Navarro- Villoslada et al. (Anal.Chem, 2001 , 73:5150-5156) que se obtienen, preferiblemente, mediante copolimerización de unidades de metacrilato substituidas con fosforilcolina y dodecilmetacrilato. Preferiblemente, Ia película sensora tiene un espesor de entre 5 a 250 μm. En otra forma de realización, Ia película sensible a oxígeno se encuentra separada de las microalgas por una fina capa de un polímero opaco permeable al oxígeno (8), de forma que el oxígeno liberado por mas microalgas puede acceder a Ia película sensora pero no así Ia luz procedente del diodo que estimula Ia fotosíntesis de las poblaciones de algas (1). En general, cualquier membrana permeable a oxígeno puede ser usada en el contexto de Ia presente invención para recubrir Ia película sensora (8), pero para su uso en Ia presente invención, se utilizan preferiblemente membranas de silicona, de polidimetilsiloxanos o de acetato de celulosa.
En otra forma de realización, las dos poblaciones de algas se encuentran inmovilizadas en un soporte. En una forma de realización preferida, el soporte es una matriz tridimensional. En una forma de realización aún más preferida,
Ia matriz tridimensional es una matriz microporosa. Prácticamente cualquier soporte microporoso puede ser empleado en Ia presente invención, siempre que sean adecuados para el cultivo de células en suspensión y que el tamaño del poro sea Io suficientemente pequeño para que no escapen las algas de su interior. Materiales adecuados para preparar soportes microporosos de acuerdo a Ia presente invención incluyen incluyen gelatina (Cultispher G, HyClone), celulosa (Cytocell, Pharmacia), polietileno (Cytoline 1 and 2, Pharmacia), silicona (Immobasil, Ashby Scientific), colágeno (Microsphere, Cellex Biosciences), cristal (Siran, Schott Glassware), copolímeros acrílicos, de acrilamida, metilen-bisacrilamida, dimetilaminopropil, metacrilamida, metacrilato de metilestireno, etileno/ácido acrílico, acrilo-nitrilo butadienestireno (ABS), ABS/policarbonato, ABS/polisulfona, ABS/cloruro de polivinilo, etileno propileno, etilvinilacetato (EVA), nitrocelulosa, poliacrilonitrilo (PAN), poliacrilato, policarbonato, polibutilentereftalato (PBT), polietilentereftalato (PET), polímeros y copolímeros de polipropileno, poliestireno, politetrafluoroetileno (PTFE), etileno-propileno fluorado (FEP), etilentetrafluoroetileno (ETFE), perfluoroalcoxietileno (PFA), fluoruro de polivinilo (PVF), fluoruro de polivinilideno (PVDF), policlorotrifluoroetileno (PCTFE), etilenclorotrifluoroetileno (ECTFE), alcohol polivinílico (PVA), estirenacrilonitrilo (SAN), estireno-anhídrido maléico (SMA).
En otra forma de realización, las microalgas se separan del medio acuoso en que se realiza Ia medida mediante una membrana impermeable a las microalgas. De esta forma se evita Ia pérdida de las microalgas por lavado a Ia vez que se protege Ia membrana que contiene las microalgas del ensuciamiento y Ia contaminación. Materiales adecuados para Ia membrana impermeable incluyen celulosa, papel y derivados de Ia celulosa (acetato de celulosa y nitrato de celulosa), poliéster, nitrato de celulosa, policarbonato, polietersulfona microporosa, PET, fluoruro de polivinilideno (PVDF), polipropileno, sílica, alúmina, tierra de diatomeas, gelatina, poliacrilamida y similares. Estos materiales pueden ser utilizados en Ia membrana de forma independiente o en combinaciones de uno o varios y pueden ser sometidos a tratamientos con el fin de aumentar o disminuir su hidrofobicidad.
En otra forma de realización, el biosensor contiene adicionalmente medios para Ia detección de Ia señal fluorescente emitida por Ia clorofila en respuesta a Ia luz que se utiliza para estimular Ia fotosíntesis. La emisión fluorescente por parte de cada población de algas, cuando se mide en ausencia de agente tóxico, es directamente proporcional a Ia población de microalgas, Io que permite corregir en tiempo real Ia señal proveniente de los sensores de oxígeno y aumentar Ia precisión, exactitud y estabilidad temporal de Ia medida del analito. La detección de Ia señal fluorescente se realiza mediante un sensor (2) sensible a Ia luz roja, preferiblemente un fotodiodo de visible o un sensor CCD. Preferiblemente, Ia señal fluorescente es transmitida desde Ia membrana microporosa (7 ó T) hasta el detector (2) mediante un haz de fibra óptica (3). En una forma de realización preferida, el haz de fibra óptica que trasmite Ia luz actínica desde Ia fuente de luz (1) y el haz de fibra óptica que transmite Ia señal de fluorescencia desde las algas inmovilizadas hasta el sensor (2) se encuentran formando parte de una única fibra óptica trifurcada (3).
El biosensor que es objeto de Ia presente invención es hasta Ia fecha, el único biosensor basado en microalgas disponible en el que se ha unificado Ia selección sin manipulación genética de cepas altamente sensibles al agente tóxico, cepas resistentes al agente tóxico y Ia inmovilización en membrana tridimensional porosa de ambas para utilizarlas conjuntamente con el fin de alcanzar Ia máxima sensibilidad y especificidad frente a un agente tóxico. La combinación de todas estas características incluidas en un biosensor cuya señal es Ia integración de ambas cepas (sensibles y resistentes) tiene Ia gran ventaja de que no implica riesgo alguno al utilizar el biosensor in situ para medidas en ecosistemas acuáticos, ya que el componente biológico procede el mismo ambiente acuático y éste no es manipulado genéticamente.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con el uso del biosensor de Ia invención para detectar Ia presencia de un compuesto tóxico en una muestra.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con el uso del biosensor de Ia invención para distinguir en una muestra Ia presencia del compuesto tóxico frente al que ha sido seleccionada Ia segunda población de células de otros compuestos tóxicos. Las muestras que pueden ser analizadas usando el biosensor de Ia invención incluyen cualquier muestra convencional en Ia que se sospeche que puede aparecer un compuesto tóxico, como por ejemplo, aguas fluviales, de un embalse, de una estación depuradora, de un efluente industrial y similares. En el caso de que Ia muestra sospechosa de contener un agente tóxico sea sólida (por ejemplo, alimentos), es necesario efectuar una extracción de moléculas solubles en solventes acuosos, de forma que dicho extracto se pueda aplicar al biosensor de Ia invención. El experto en Ia materia apreciará que el uso según Ia presente invención no está limitado al estudio de muestras que estén potencialmente contaminadas con los tóxicos diana, sino que se puede usar a nivel industrial en plantas de producción de dichos agentes tóxicos para monitorizar el rendimiento y pureza de Ia síntesis.
En uso, el biosensor funciona de Ia siguiente manera. La muestra de agua se aplica a través del conducto (4) que permite el acceso de Ia muestra a los cabezales que contienen las algas sensibles y resistentes (Figura 10). Cada cabezal comprende un disco de membrana de celulosa (6) asociado a Ia membrana porosa (7 o 7') en Ia que se encuentran las células y que a su vez se encuentra en contacto con una membrana porosa opaca (8) que permite el paso del oxígeno hacia Ia membrana sensora de oxígeno (9). Toda Ia cavidad de medida se encuentra herméticamente sellada mediante sendas juntas tóricas (10) a ambos lados de Ia membrana porosa (7 ó 7'). Para Ia iluminación de los cabezales se usa Ia radiación actínica emitida por LED azules (1) filtrada mediante filtro ópticos de paso-banda en el azul (13) y haces de fibra óptica que dirige Ia iluminación desde los LED (1) hasta una ventana de vidrio (5) que se encuentra en contacto con el disco de membrana (6) del cabezal. La iluminación excita Ia actividad fotosintética de las células que se encuentran en Ia membrana porosa (7) que producen oxígeno, el cual difunde a través de Ia membrana porosa opaca (8) hasta llegar a Ia membrana sensora (9) en donde apantallan Ia luminiscencia del compuesto que impregna dicha membrana sensora (9). En presencia del compuesto tóxico que se ha usado para seleccionar las células resistentes, Ia actividad fotosintética de las células sensibles que se encuentran en el primer cabezal (7) disminuye, mientras que Ia actividad fotosintética de las células resistentes que se encuentran en el segundo cabezal (7') se mantiene inalterado. La disminución de Ia actividad fotosintética resulta en una disminución de Ia producción de oxígeno por parte de las células sensibles Io que a su vez resulta en una disminución de Ia desactivación de Ia señal luminiscente, con Io que se produce un aumento de Ia luminiscencia de Ia membrana sensora. La señal luminiscente se transmite desde los cabezales mediante haces de fibra óptica bifurcada (11 ó 11') hasta Ia unidad optoeléctronica de medida (12). En presencia de un compuesto tóxico inespecífico, se produce una disminución de Ia actividad fotosintética por parte de ambos cabezales, Io que resulta en un aumento de Ia señal luminiscente por parte de los dos cabezales. Con el fin de determinar simultáneamente Ia cantidad de algas en cada uno de las membranas porosas (7 ó T), se determina Ia emisión fluorescente asociada a Ia clorofila en ausencia de agente tóxico, usando para ello un fotodiodo o sensor CCD (2) al que se Ie hace llegar Ia emisión fluorescente de Ia población de algas mediante un haz de fibra óptica que junto con Ia fibra óptica usada para transmitir Ia radiación de excitación procedente del LED azul (1) forma una fibra óptica trifurcada (3). Antes de llegar al sensor (2), Ia emisión fluorescente se hace pasar a través de un filtro óptico de corte (14). La medida simultánea de Ia fluorescencia de las dos poblaciones de algas es una medida de Ia cantidad de biomasa inmovilizada, Io que permite corregir en tiempo real Ia señal proveniente de los sensores de oxígeno simultáneamente Ia cantidad de biomasa inmovilizada y así normalizar Ia emisión luminiscente a Ia cantidad de algas.
Así en otro aspecto, Ia invención se relaciona con un método para Ia detección de un compuesto tóxico en una muestra que comprende las etapas de a) poner en contacto Ia muestra con un biosensor de Ia invención en el que la segunda población de algas se ha seleccionado en presencia de dicho compuesto tóxico y
b) detectar Ia producción de luz de cada una poblaciones de células en el biosensor en presencia de dicha muestra en donde una disminución en Ia producción de luz de Ia primera población de células con respecto a Ia segunda población de células es indicativa de que Ia muestra contiene el compuesto tóxico frente al que se han seleccionado las células de Ia segunda población y en donde una disminución en Ia producción de luz por parte de las dos poblaciones de células es indicativa de que Ia muestra contiene un compuesto tóxico distinto al compuesto frente al que se han seleccionado Ia primera población de células.
En el método de Ia invención, los valores de luminiscencia de cada una de las poblaciones celulares dependen no sólo de Ia inhibición de Ia actividad fotosintética en cada una de las poblaciones sino también de Ia cantidad de células inmovilizadas en cada población. Por ello, en una forma de realización preferida, los valores de producción de luz por cada una de las poblaciones celulares se normalizan frente a Ia cantidad total de células en cada población. La normalización requiere Ia determinación simultánea de Ia cantidad total de biomasa algal en cada población inmovilizada y Ia normalización de los valores de variación en Ia producción de luz por parte de las dos poblaciones de algas en función a Ia cantidad de biomasa algal inmovilizada. En una forma de realización aún más preferida, Ia determinación de Ia cantidad de biomasa algal inmovilizada se realiza mediante Ia detección de Ia emisión fluorescente de cada población de algas en respuesta al estimular de Ia actividad fotosintética en ausencia de tóxico. Preferiblemente, Ia determinación de Ia biomasa de cada una de las poblaciones algales se determina simultáneamente a Ia determinación de Ia señal luminiscente a Io largo del tiempo, Io que permite Ia corrección de los valores en tiempo real. En una forma aún más preferida de Ia invención, Ia unidad optoelectrónica (12) se encarga de realizar Ia normalización a partir de los valores de luminiscencia emitida por Ia membrana sensora (9) y de Ia intensidad de Ia señal fluorescente detectada por el sensor (2).
Los autores de Ia presente invención han puesto de manifiesto que Ia especificidad del biosensor solamente ha sido posible gracias a Ia incorporación en el sensor de células altamente resistentes al tóxico diana. Dichas células se han obtenido de manera inventiva por los autores de Ia invención mediante Ia sorprendente observación de que el aplicar una selección por ciclos de trinquete a células que ya presentaban resistencia al tóxico diana permite obtener células con una resistencia aun mayor que las células de partida. Sin querer estar vinculados por ninguna teoría, se piensa que Ia resistencia aumentada de las células obtenidas por el método de Ia invención se basa en Ia capacidad de los ciclos de trinquete de seleccionar mutantes que contienen múltiples mutaciones capaces de conferir resistencia al agente tóxico.
Ventajas adicionales del método de selección de Ia invención incluyen
-Es posible obtener microalgas sensibles y resistentes a herbicidas, funguicidas, insecticidas, raticidas, metales,... etc. -La manipulación para Ia obtención de microalgas sensible y resistente se realiza sin Ia necesidad de alterar Ia carga genética de las microalgas, por consiguiente, no existe el peligro de contaminación accidental en el medio acuático de microalgas diferentes a las que ya existen en él.
-La integración en el biosensor de microalgas resistentes Ie confiere especificidad, es decir tipo de agente tóxico, su biodisponibilidad y su concentración en el medio acuático.
Así, en otro aspecto Ia invención proporciona un proceso para Ia obtención de microalgas resistentes a un compuesto tóxico que comprende las etapas de a) una primera selección de mutantes espontáneos viables en presencia de dicho compuesto tóxico y b) una segunda selección en presencia de concentraciones progresivamente mayores de dicho compuesto tóxico a partir de las células obtenidas en Ia etapa (a) mediante al menos un ciclo de trinquete.
No existe limitación alguna en Io que se refiere a las especies de algas adecuadas así como a los compuestos tóxicos adecuados para Ia realización del método de selección. Sin embargo, las especies preferidas y los compuestos preferidos se han expuesto anteriormente. En una forma de realización preferida, el compuesto tóxico usado en las etapas de selección (a) y (b) es simazina. En otra forma de realización preferida, el alga que se somete a selección es Dictyosphaerium chlorelloides. Preferiblemente, Ia etapa (b) incluye al menos 2 ciclos de trinquete, más preferiblemente al menos tres ciclos de trinquete.
El método de selección de Ia invención permite obtener una población con un grado de resistencia al agente tóxico diana mucho mayor que el uso de cada uno de los métodos por separado. Sin querer estar vinculado por ninguna teoría, se piensa que este efecto técnico es consecuencia del uso como material de partida de células que ya han sido seleccionadas por su resistencia al compuesto tóxico. Si Ia selección se efectuase únicamente mediante Ia etapa (a) o mediante Ia etapa (b), Ia población celular resultante contendría una mezcla de cepas sensibles y resistentes, Io que las haría inaceptables para su incorporación a un biosensor como el que es objeto de Ia invención.
En otro aspecto, Ia invención se relaciona con algas resistentes a un determinado tóxico que han sido obtenidas mediante el método de selección de Ia presente invención.
La invención se detalla a continuación de forma ilustrativa con los siguientes ejemplos que deben interpretarse de forma ilustrativa y no limitativa. EJEMPLOS
EJEMPL0 1
Obtención de microalgas sensibles y resistentes.
Se usó material comercial estéril para el cultivo de microalgas que comprendía placas estériles de de 96 pocilios, placas de cultivo estériles de 4
2 pocilios, frascos de cultivo 25 cm , pipetas estériles de plástico, medio de cultivo BG-11 estéril, cabina de flujo laminar, cámara de cultivo para microalgas, microscopio invertido, microscopio óptico, nevera a 4 0C, estereomicroscopio, oxímetro, cámara de Neubauer.
Se recogió una muestra de agua en un frasco estéril en el área donde se ubicará el biosensor. La clonación de microalgas para Ia obtención de cepas se realiza aislando éstas (por ejemplo, las pertenecientes al género
Dictyosphaerium chlorelloides) de Ia muestra depositada en un portaobjetos y seleccionando una única célula mediante una micromanipulador, bajo cabina de flujo laminar. Cada célula aislada se transfiere a uno de los pocilios de las placas de 96 pocilios estériles con medio de cultivo BG-11 (Sigma-Aldrich
Química, Tres Cantos, Madrid, España). Cada individuo presente en cada pocilio tras repetidas mitosis dará lugar a múltiples individuos, todos ellos genéticamente idénticos constituyendo un clon. Se seleccionaron aquellas cepas que mostraban las siguientes características: - Crecimiento rápido
- Resistente a Ia manipulación
- Supervivencia en amplias variaciones ambientales
- No productor de biotoxinas
Las cepas de células microalgales aisladas en placas de 96 pocilios con medio de cultivo BG-11 se mantienen en cámara de cultivo a 22 0C bajo luz
2 continua fotosintéticamente activa de 60 μmol/m /s. Después de 2 semanas, 2 el contenido de cada pocilio se transfiere a frascos de 25 cm estériles con 20 ml_ de medio BG-11 y se mantienen en cámara de cultivo bajo las mismas condiciones de temperatura y luz.
EJEMPLO 2
Selección de Ia cepa más sensible a un determinado agente tóxico sin modificación genética
De entre todas las especies y cepas aisladas de Ia muestra de agua se seleccionan los clones más sensibles a Ia exposición del agente tóxico, es decir, los clones que disminuye Ia producción de oxígeno significativamente en el menor tiempo y a Ia menor concentración del agente tóxico. Para ello, se realizan exposiciones de los diferentes clones a concentraciones
-1 crecientes (por ejemplo 0, 3, 10, 30, 100, 300 μg L ) del agente tóxico y por triplicado, manteniendo Ia exposición durante 5 días. La cepa que presente una densidad menor ante Ia concentración del tóxico, es cepa considerada más sensible. De entre los clones de menor crecimiento se seleccionaran los que presenten Ia respuesta más sensible y rápida a Ia producción de oxígeno. La medida de Ia producción de oxígeno se realiza con un oxímetro. Se utilizan
5 alícuotas de 5 * 10 células, midiendo a 1 , 2, 5, 10, 15 y 30 min.
EJEMPLO 3
Método de selección de microalgas resistentes al agente tóxico sin modificación genética mediante análisis de fluctuación (análisis de fluctuación modificado para cultivos líquidos aplicado a microalgas unicelulares) y optimización de los clones resistentes obtenidos mediante ciclos de trinquete.
3.1 Selección del clon más sensible al agente tóxico
El clon más sensible al agente tóxico obtenido en el ejemplo 1 se cultiva en presencia de concentraciones crecientes (por ejemplo. 0, 3, 10, 30, 100, 300 -1 mg L ) de agente tóxico en medio BG-11 durante 5 días. El número de células en cada muestra se determina usando un contador automático y se selecciona aquella concentración de agente tóxico que induce una dosis letal DL100.
3.2 Análisis de fluctuación
A continuación, se siembran 100 tubos de cultivo (volumen del tubo 5 ml_) con
100 células de microalgas del clon mas sensible al agente tóxico a baja densidad celular y 4 ml_ de medio BG-11 en cada uno, denominado "SET 1".
5
Se deja que las microalgas en el SET 1 alcancen una densidad de 2 * 10 microalgas en cada uno de los 100 frascos. El control de Ia proliferación microalgas se realiza mediante recuentos en Cell-Coulter. Posteriormente se añade a cada uno de los 100 tubos de cultivo Ia dosis del agente tóxico que induce DL 100 y se deja en cultivo durante 1 mes. Posteriormente se recuentan las microalgas en cada uno de los 100 tubos de cultivo. Como control se usa el número de células en un tubo que se sembró una densidad
5 celular de 2 x 10 microalgas con microalgas del clon más sensible al agente
5 tóxico con (50 tubos de cultivo con 2 x 10 microalgas cada uno), denominado "SET 2". Se añade a cada uno de los 50 tubos de cultivo Ia concentración que induce DL 100 y se deja en cultivo durante 1 mes y, posteriormente, se realiza el recuento microalgal en cada uno de los 50 tubos de cultivo (Figura D-
El procesamiento estadístico de los resultados del Set 1 y Set 2 nos indicará si Ia resistencia al agente tóxico es debida a una mutación natural que ya existía en Ia población microalgal antes de su exposición al agente tóxico (adaptación pre-selectiva o resistencia natural) o si por el contrario es una adaptación fisiológica, inducida por Ia exposición continuada al agente tóxico (adaptación post-selectiva o resistencia inducida). En el Set 1 , si las microalgas resistentes provienen de una mutación espontánea antes de Ia exposición al agente tóxico, entonces debería haber una varianza alta en el número de microalgas por tubo. Si las microalgas resistentes provienen de Ia exposición al agente tóxico su presencia por tubo debería ser semejante y su varianza muy baja. El Set 2 nos sirve para estimar el error en el muestreo de las células resistentes (López Rodas et al., Eur. J. Phycol. 2001 , 36, 179- 190).
3.3 Optimización de los clones resistentes mediante ciclos de trinquete o ratchet.
Un esquema general del método de selección de cepas resistentes mediante trinquete o ratchet se indica en Ia figura 2. Se expone el clon resistente obtenido mediante análisis de fluctuación al agente tóxico mediante ciclos de trinquete o ratchet (Reboud et al., 2007, Biológica! Journal of the Linnean Society, 91 , 257-266), que permiten Ia exposición continuada del clon al tóxico. La concentración de toxico utilizada será 1/10, 1/3 y 1 de Ia DL 100. Para ello, se toman 3 tubos con 500.000 células en 4 mL de medio por cada concentración utilizada y un control, constituyendo el primer ciclo de ratchet. Si en todos los tubos hay crecimiento microalgal al cabo de 20 días, se incrementa Ia concentración del agente tóxico (doble concentración de DL 100), para empezar el segundo ciclo de ratchet. Este proceso se repetirá con sucesivos ciclos de ratchet hasta que en algún replicado Ia clon resistente no crezca (Figura 3). En este momento, Ia optimización se considera finalizada. Cada uno de los ciclos selecciona los clones con mayor grado de resistencia al agente tóxico. Se trata de un método que maximiza Ia selección.
EJEMPLO 4
Inmovilización de microalgas sensibles y resistentes al agente tóxico en membrana porosa tridimensional ImmobaSil (Cellon, Luxemburgo).
Las membranas de Immobasil de 10 mm de diámetro y 0,25 m de grosor se lavan con agua destilada las membranas, se esterilizan en autoclave (121 0C, 15 min), se dejan secar y almacenar en un recipiente estéril con agua destilada y se lavan con BG-11 antes de utilizar. A continuación se colocan las membranas en placas de 4 pocilios estériles, se añade a cada uno de los pocilios 1 ml_ de medio BG-11 con 500.000 células vegetales del clon más sensible por ml_ en cada pocilio. La membrana se comprueba semanalmente hasta que las microalgas colonicen toda Ia superficie de membrana (el tiempo típico es de 3-4 semanas dependiendo del tipo de clon y del tipo de microalga utilizado).
EJEMPLO 5
Caracterización de Ia cepa de microalgas más sensible al agente tóxico. Curva de dosis-efecto.
De las cepas de microalgas aisladas, Ia cepa de mejor respuesta al agente tóxico es Ia 20 (ver figura 3). En el mismo tiempo de respuesta, el mayor porcentaje de inhibición de Ia producción de oxígeno corresponde a Ia cepa
20 y es estadísticamente significativa con respecto al resto de las cepas. La tasa de división de Ia microalga sensible es de (0,98 ± 0,1), aproximadamente una división cada 24 horas en ausencia del agente tóxico. Según se muestra en Ia figura 4, Ia curva de producción de oxigeno de las microalgas sensibles
-1 es significativamente diferente en presencia de 5 mg L (ppm) del agente tóxico, de Ia que se produce en ausencia del agente tóxico.
EJEMPLO 6 Caracterización de las microalgas resistentes al agente tóxico sin modificación genética mediante análisis de fluctuación modificado para cultivos líquidos aplicado a microalgas unicelulares.
La exposición de Ia cepa más sensible (cepa 20) al agente tóxico a
-1 concentraciones crecientes (0, 5, 10, 20, 40 mg L ) en medio BG-11 durante 48 h muestra que Ia concentración que induce una dosis letal 100 es de 80
-1 mg L de agente tóxico (ver Figura 5). El análisis estadístico de Ia fluctuación con baja densidad celular (Set 1) y con alta densidad celular (Set 2) se resume en Ia Tabla 1. Las columnas Set 1 y Set2 indican el número de microalgas por tubo del Set 1 y del Set 2. La fluctuación del Set 1 es muy alta mientras que en el Set 2 es menor de 2.
Tabla 1
Figure imgf000031_0001
Por Io tanto, Ia relación varianza/media es mayor en el Set 1 que en el Set 2, y podemos afirmar que las microalgas resistentes al agente tóxico se originan a partir de microalgas existentes en el medio acuático con mutaciones que confieren resistencia a dicho agente tóxico.
La tasa de división de Ia microalga resistente es de (0,5 ± 0,2), aproximadamente una división cada 2 días en presencia y en ausencia del agente tóxico.
Las curvas de producción de oxígeno de microalgas resistentes al agente tóxico son semejantes tanto en presencia de 5 ppm del agente tóxico como en ausencia del mismo (ver Figura 6). EJEMPLO 7
Caracterización de Ia respuesta conjunta de microalgas sensibles y resistentes en ausencia, en presencia del agente tóxico y en presencia de un agente tóxico inespecífico.
7.1- En ausencia de agentes tóxicos
La curva de producción de oxígeno de microalgas sensibles y resistentes en ausencia del agente tóxico son diferentes: las microalgas resistentes producen menos oxígeno durante Ia fotosíntesis que las sensibles, es decir, su comportamiento será semejante al de las microalgas sensibles en presencia de agente tóxico (ver Figura 7).
7.2-En presencia de agente tóxico inespecífico
La producción de oxígeno de microalgas sensibles y resistentes en presencia de un agente tóxico inespecífico es semejante (ver Figura 8).
7.3-En presencia del agente tóxico diana
La curva de producción de oxígeno de microalgas sensibles y resistentes en presencia del agente tóxico es diferente: las microalgas sensibles producen menos oxígeno durante Ia fotosíntesis que las resistentes, Io cual nos permite determinar Ia concentración del agente diana en el medio (Figura 9).
EJEMPLO 8
Inmovilización de microalgas sensibles y resistentes al agente tóxico en membrana tridimensional ImmobaSil (Cellon, LU)
Las microalgas sensibles y resistentes al agente tóxico (por ejemplo, Dictyosphaeríum chlorelloides) se adhieren a Ia membrana y ocupan los poros de esta como se puede observar en Ia figura 10. La viabilidad de las células en dicha membrana es del 98%.
EJEMPLO 9 Construcción del cabezal biosensor microalgal.
El extremo sensible del biosensor microalgal está constituido por dos cabezales idénticos, salvo porque uno contiene microalgas sensibles al analito diana (por ejemplo, Dictyosphaerium chlorelloides) y otro contiene el correspondiente clon resistente de las mismas, ambos inmovilizados en una membrana de silicona porosa (como por ejemplo, las de tipo ImmobaSil que comercializa Ia empresa Cellon, Luxemburgo).
Un esquema de cada cabezal se muestra en Ia Figura 13. En una cámara de acero inoxidable o aluminio hermética al agua se dispone el extremo común de una fibra óptica bifurcada al azar (como por ejemplo, las de vidrio óptico o sílice fundida que comercializa Ia empresa Vydas, Reino Unido). Sobre éste se dispone un disco delgado de vidrio o plástico transparente (5) y, sobre el mismo, una película delgada luminiscente sensible al oxígeno molecular (9) (como por ejemplo las descritas por Navarro-Villoslada et al. Anal. Chem. 2001 , 73, 5150-5156). La película delgada sensible al oxígeno se recubre por una fina capa de polímero permeable al oxígeno molecular pero opaco a Ia luz (como por ejemplo el prepolímero de silicona 732 negra que fabrica y comercializa Dow-Corning, USA) (8). Sobre Ia película sensible al oxígeno se coloca el disco de membrana de silicona porosa que contiene las microalgas inmovilizadas (7 ó T) (ImmobaSil, Cellon, LU) y, sobre ésta, una membrana de diálisis (6) (como por ejemplo las de esteres de celulosa Spectra/Por que comercializa Ia empresa Spectrum Europe BV, Holanda). Sobre esta última se hace fluir Ia muestra de agua mediante una bomba peristáltica multicanal (por ejemplo, de Ia marca Minipulse de Gilson, Francia). La cámara de muestra se cierra mediante una cubierta de acero inoxidable o aluminio provista de una ventana de vidrio o plástico óptico (5). El segundo cabezal se construye de idéntica forma. Los cabezales se organizan en el biosensor de Ia forma que se indica en Ia figura 11. El biosensor incluye, adicionalmente, los elementos que se indican en Ia figura 12, es decir, una fuente de luz (1), un detector de luz (2), una fibra óptica trifurcada de vidrio óptico (3), un entrada (4) y una salida de Ia muestra (4'), una unidad optoelectrónica de medida con sensores luminiscentes (12), un filtro óptico de paso-banda en el azul (13) y un filtro óptico de corte o "long-pass" (14).
El biosensor dispone de de una ventana de vidrio o plástico óptico a través de Ia cuál se hace pasar Ia luz azul que proviene de un diodo emisor de luz (1)
(como, por ejemplo, el que presenta un máximo a 465 nm y comercializa Ia empresa Osram, Alemania, con el código Golden Dragón LB W5SG-DYEZ-
35). La luz del diodo se conduce hasta Ia ventana óptica a través de una de las ramas de una fibra óptica trifurcada al azar de vidrio, sílice fundida o plástico (como las que vende Ia empresa FiberGuide Industries, NJ, USA)
(Figura 13). Finalmente el extremo común de Ia fibra óptica trifurcada se conecta a un fotodiodo sensible al rojo (2) capaz de medir Ia emisión fluorescente de Ia clorofila que contienen las microalgas inmovilizadas, bajo Ia excitación del diodo azul. La señal del fotodiodo se alimenta a Ia unidad optoelectrónica bicanal, que realiza Ia medida de los sensores de oxígeno y controla el bombeo de Ia muestra (por ejemplo, Ia unidad optoelectrónica
Optosen que fabrica y comercializa lnterlab IEC, Madrid).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Un biosensor específico para detectar un compuesto tóxico que comprende: a) una primera población de algas cuya producción de oxígeno disminuye en presencia de dicho compuesto, b) una segunda población de algas cuya producción de oxígeno no varía substancialmente en presencia de dicho compuesto, de Ia misma especie que Ia primera población y que se ha obtenido mediante un proceso que comprende las etapas de
(i) una primera selección de mutantes espontáneos viables a dicho compuesto mediante exposición a dicho compuesto tóxico y
(ii) una segunda selección a partir de los mutantes obtenidos en Ia etapa (i) en presencia de concentraciones progresivamente mayores de dicho compuesto tóxico mediante al menos un ciclo de trinquete c) medios para estimular Ia actividad fotosintética de las dos poblaciones de algas y d) medios para detectar el oxígeno producido por cada una de las dos poblaciones de algas caracterizado en que los medios para detectar el oxígeno producido por cada una de las poblaciones de algas comprenden al menos un compuesto cuyas propiedades ópticas varían en función de Ia concentración de oxígeno en el medio y al menos un elemento optoeléctrico adecuado para detectar las propiedades ópticas de dicho compuesto.
2. Un biosensor según Ia reivindicación 1 en el que Ia primera población de algas se ha obtenido a partir de una cepa de algas tipo salvaje mediante selección de mutantes espontáneos que muestran una sensibilidad aumentada a dicho compuesto tóxico.
3. Un biosensor según la reivindicación 1 ó 2 en el que Ia segunda población de microalgas se obtiene a partir de partir de una cepa de algas tipo salvaje que se ha obtenido mediante selección de mutantes espontáneos que muestran una sensibilidad aumentada a dicho compuesto tóxico.
4. Un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado en que cada una de las poblaciones de algas se encuentra inmovilizada en un soporte.
5. Un biosensor según Ia reivindicación 4 en el que el soporte es una matriz tridimensional.
6. Un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado en que las dos poblaciones de algas están separadas del medio acuoso en que se realiza Ia medida mediante una membrana porosa impermeable a las microalgas pero permeable al oxigeno molecular.
7. Un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el compuesto cuyas propiedades ópticas varían en función de Ia concentración de oxígeno en el medio se encuentra impregnado en una membrana.
8. Un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que al compuesto cuyas propiedades ópticas varían en presencia de oxígeno en el medio es un complejo de un metal de transición y al menos un ligando de tipo diimina.
θ. Un biosensor según Ia reivindicación 8 en el que el metal de transición se selecciona del grupo de rutenio, osmio, renio, rodio, platino e iridio.
10. Un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 en el que el ligando tipo diimina se selecciona del grupo de 2,2'-bipiridina y 1 ,10- fenantrolina y sus derivados con distinto grado de sustitución.
11. Un biosensor según la reivindicación 10 en el que el compuesto cuyas propiedades ópticas varían en función de la concentración de oxígeno se selecciona del grupo de tris( 1 , 10-fenantrolina)rutenio(II), tris(4,7-difenil- 1 , 10-fenantrolina)rutenio(II), tris (2,2'-bipiridina)rutenio(II), tris(4-fenil-7-para-hexanolfenil- 1 , 10-fenantrolina)rutenio (II), y (5-isotiocianato- 1 , 10-fenantrolina)bis(2,2'-bipiridina)rutenio(II).
12. Un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 en el que la membrana impregnada del compuesto cuyas propiedades ópticas varían en función de la concentración de oxígeno en el medio se encuentra separada de las células por una membrana opaca permeable a oxígeno.
13. Un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende adicionalmente medios para detectar Ia fluorescencia de Ia clorofila de cada una de las poblaciones de algas en respuesta al estímulo de Ia actividad fotosintética.
14. Un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que Ia especie de alga que forma Ia primera y Ia segunda población de algas es Dictyosphaeríum chlorelloides.
15. Un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el compuesto que se ha usado para seleccionar Ia segunda población de algas es simazina.
16. Uso de un biosensor según las reivindicaciones 1 a 15 para detectar Ia presencia de un compuesto tóxico en una muestra.
17. Uso de un biosensor según las reivindicaciones 1 a 15 para distinguir Ia presencia del compuesto tóxico que causa una disminución de Ia producción de oxígeno en Ia primera población de algas de otros compuestos tóxicos en una muestra.
18. Método para Ia detección de un compuesto tóxico en una muestra que comprende las etapas de a) poner en contacto Ia muestra con un biosensor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en el que Ia segunda población de algas se ha seleccionado en presencia de dicho compuesto tóxico y b) detectar Ia producción de luz de cada una poblaciones de células en el biosensor en presencia de dicha muestra en donde una disminución en Ia producción de luz de Ia primera población de células con respecto a Ia segunda población de células es indicativa de que Ia muestra contiene el compuesto tóxico frente al que se han seleccionado las células de Ia segunda población y en donde una disminución en Ia producción de luz por parte de las dos poblaciones de células es indicativa de que Ia muestra contiene un compuesto tóxico distinto al compuesto frente al que se han seleccionado Ia primera población de células.
19. Método según Ia reivindicación 18 en el que se determina simultáneamente Ia cantidad total de biomasa algal en cada población inmovilizada en ausencia de agente tóxico y se normalizan los valores de variación en Ia producción de luz por parte de las dos poblaciones de algas en función a Ia cantidad de biomasa algal inmovilizada de cada población.
20. Método según Ia reivindicación 19 en el que Ia determinación de Ia cantidad de biomasa algal inmovilizada se realiza mediante Ia detección de Ia emisión fluorescente de cada población de algas en respuesta al estímulo de Ia actividad fotosintética.
21. Un proceso para Ia obtención de microalgas resistentes a un compuesto tóxico que comprende las etapas de a) una primera selección de mutantes espontáneos viables en presencia de dicho compuesto tóxico y b) una segunda selección a partir de los mutantes aislados en Ia etapa (a) en presencia de concentraciones progresivamente mayores de dicho compuesto tóxico mediante al menos un ciclo de trinquete.
22. Un proceso según Ia reivindicación 21 en el que el compuesto tóxico obtenido en Ia primera y segunda etapa es simazina.
23. Un proceso según Ia reivindicación 21 ó 22 en el que al alga que se somete a selección es Dictyosphaeríum chlorelloides.
24. Una cepa de algas resistente a un compuesto tóxico que es obtenible mediante un proceso según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23.
PCT/ES2008/000465 2007-07-03 2008-06-30 Biosensores basados en microalgas para la detección de contaminantes medioambientales WO2009013370A1 (es)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP08805295A EP2177905A4 (en) 2007-07-03 2008-06-30 MICROALGEN BASED BIOSENSORS FOR THE DETECTION OF ENVIRONMENTAL CHARACTERISTICS
US12/667,590 US20100248286A1 (en) 2007-07-03 2008-06-30 Biosensors based on microalgae for the detection of environmental pollutants

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200701905 2007-07-03
ESP200701905 2007-07-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009013370A1 true WO2009013370A1 (es) 2009-01-29

Family

ID=40281033

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2008/000465 WO2009013370A1 (es) 2007-07-03 2008-06-30 Biosensores basados en microalgas para la detección de contaminantes medioambientales

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20100248286A1 (es)
EP (1) EP2177905A4 (es)
WO (1) WO2009013370A1 (es)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2846473A1 (es) * 2020-01-28 2021-07-28 Acciona Energia Sa Biosensor microalgal para la detección de HTF

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120115215A1 (en) * 2010-11-04 2012-05-10 Li-Cor, Inc. Light source reflector
EP2864417B1 (en) * 2012-06-21 2019-01-09 Ligar Limited Partnership Polymer and method of use
CN104197983A (zh) * 2014-03-18 2014-12-10 王雅娜 水体蓝藻爆发预警的生态修复监测系统
FR3020464B1 (fr) 2014-04-29 2018-08-17 Institut National De Recherche Pour L'agriculture, L'alimentation Et L'environnement Methode de determination de la reprotoxicite d'eaux douces
US10694752B2 (en) * 2016-06-02 2020-06-30 Reliance Industries Limited Propiconazole resistant mutants of Chlorella species
CN108132233B (zh) * 2016-12-01 2020-09-18 中国科学院大连化学物理研究所 一种基于细胞光能利用水平的微藻营养补充控制方法
KR101974891B1 (ko) * 2018-10-30 2019-05-03 강원대학교산학협력단 조류를 이용한 생태독성 측정 방법
CN114729286A (zh) * 2019-12-05 2022-07-08 宝洁公司 制备清洁组合物的方法
CN113358612B (zh) * 2021-05-24 2022-11-08 宁波大学 一种藻类检测微纳光学传感器及其制作与检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4332163A1 (de) 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Verfahren und Gerät zur Schadstoffanalyse von Gewässerproben
WO1998053316A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Boehringer Mannheim Corporation Assays employing electrochemiluminescent labels and electrochemiluminescence quenchers

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4332163A1 (de) 1993-09-22 1995-03-23 Kolibri Umweltanalytik Und On Verfahren und Gerät zur Schadstoffanalyse von Gewässerproben
WO1998053316A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Boehringer Mannheim Corporation Assays employing electrochemiluminescent labels and electrochemiluminescence quenchers

Non-Patent Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"IUPAC Series on Analytical and Physical Chemistry of Environmental Systems", vol. 6, 2000, WILEY, article "In Situ Monitoring of Aquatic Systems: Chemical Analysis and Speciation"
"Smart Biosensor Technology", 2006, CRC PRESS
ALTAMIRANO ET AL., BIOSENS. BIOELECTRON., vol. 19, 2004, pages 1319 - 1323
ALTAMIRANO M. ET AL.: "A novel approach to improve specificity of algal biosensors using wild-type and resistant mutants: an application to detect TNT", BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 19, 2004, pages 1319 - 1323, XP003024168 *
CAMPANEL THE L. ET AL.: "An algal biosensor for the monitoring of water toxicity in estuarine environments", WATER RESEARCH, vol. 35, no. 1, 2000, pages 69 - 76, XP004236286 *
CAMPANELLA, L ET AL., WATER RES., vol. 35, 2000, pages 69 - 76
CONRAD ET AL., J. APPL. PHYCOL., vol. 5, 1993, pages 505 - 516
COSTAS ET AL., EUR. J. PHYCOL., vol. 36, 2001, pages 179 - 190
ECOTOXICOL. ENVIRON. SAF, vol. 46, 2000, pages 181 - 185
FRENSE, D. ET AL., SENSORS ACTUATORS B: CHEM., vol. 51, 1998, pages 256 - 260
GIARDI.M.T., ENVIRON. SCI. TECHNOL., vol. 39, 2005, pages 5378 - 5384
GULA, R. N. ET AL.: "In Situ Monitoring of Aquatic Systems: Chemical Analysis and Speciation", 2000, WILEY, article "Electrochemical and Optical Oxygen Microsensors for In Situ Measurements"
KISSINGER, BIOSENS. BIOELECTRON., vol. 20, 2005, pages 2512 - 2516
KOBLIZEK, M. ET AL., BIOTECHNOL. BIOENG., vol. 60, 1998, pages 664 - 669
L6PEZ-RODAS ET AL., EUR. J. PHYCOL., vol. 36, 2001, pages 179 - 190
LIGLER; TAITT: "Optical Biosensors: Present and Future", 2002, ELSEVIER SCIENCE
LOPEZ RODAS ET AL., EUR. J. PHYCOL., vol. 36, 2001, pages 179 - 190
MAXWELL; JOHNSON, J. EXPER. BOTANY, vol. 51, 2000, pages 659 - 668
MERZ, D. ET AL., FRESENIUS J. ANAL. CHEM., vol. 354, 1996, pages 299 - 305
NAESSENS ET AL., ECOTOXICOL. ENVIRON. SAFETY, vol. 46, 2000, pages 181 - 185
NAVARRO-VILLOSLADA ET AL., ANAL. CHEM, vol. 73, 2001, pages 5150 - 5156
NAVARRO-VILLOSLADA ET AL., ANAL. CHEM., vol. 73, 2001, pages 5150 - 5156
NGUYEN-NGOC; TRAN-MINH, ANAL. CHIM. ACTA, vol. 583, 2007, pages 161
ORELLANA, G; MORENO-BONDI, M.C ET AL., PROCEEDINGS OF THE SYMPOSIUM ON PHOTONICS TECHNOLOGIES FOR 7TH FRAMEWORK PROGRAM, pages 291 - 294
PANDARD ET AL., WATER RESEARCH, vol. 27, 1993, pages 427 - 431
PANDARD P. ET AL.: "Comparison of two types of sensors using eukaryotic algae to monitor pollution of aquatic systems", WATER RESEARCH, vol. 27, no. 3, 1993, pages 427 - 431, XP000345141 *
PODOLA, B. ET AL., BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 19, 2004, pages 12531260
PREININGER C. ET AL.: "Optical fiber sensor for biological oxygen demand", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 66, no. 11, 1 June 1994 (1994-06-01), pages 1841 - 1846, XP000454572 *
REBOUD ET AL., BIOLOGICAL JOURNAL OF THE LINNEAN SOCIETY, vol. 91, 2007, pages 257 - 266
REBOUD, X. ET AL., BIOLOGICAL JOURNAL OF THE LINNEAN SOCIETY, vol. 91, 2007, pages 257266
RIZZUTO ET AL.: "Proceedings of the Second Workshop on Chemical Sensors and Biosensors", 2000, E.N.E.A.
RODRIGUEZ, M. ET AL., BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 17, 2002, pages 843 - 849
SANDERS, C.A. ET AL., BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 16, 2001, pages 439 - 446
See also references of EP2177905A4 *
SHITANDA ET AL., ANALYTICA CHIMICA ACTA, vol. 530, 2005, pages 191 - 197
VEDRINE ET AL., BIOSENS. BIOELECTRON., vol. 18, pages 457 - 463
VEDRINE. C. ET AL., BIOSENSORS AND BIOELECTRONICS, vol. 18, 2003, pages 457 - 463

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2846473A1 (es) * 2020-01-28 2021-07-28 Acciona Energia Sa Biosensor microalgal para la detección de HTF

Also Published As

Publication number Publication date
US20100248286A1 (en) 2010-09-30
EP2177905A4 (en) 2010-08-18
EP2177905A1 (en) 2010-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2009013370A1 (es) Biosensores basados en microalgas para la detección de contaminantes medioambientales
Van Liere et al. Interactions of cyanobacteria with light
Chen et al. Solar ultraviolet radiation and CO 2-induced ocean acidification interacts to influence the photosynthetic performance of the red tide alga Phaeocystis globosa (Prymnesiophyceae)
Pedersen et al. Underwater photosynthesis of submerged plants–recent advances and methods
MacIntyre et al. Vertical migration, nutrition and toxicity in the dinoflagellate Alexandrium tamarense
Buonasera et al. Technological applications of chlorophyll a fluorescence for the assessment of environmental pollutants
Védrine et al. Optical whole-cell biosensor using Chlorella vulgaris designed for monitoring herbicides
Guasch et al. Contrasting effects of organic and inorganic toxicants on freshwater periphyton
Pierson et al. Pigments, light penetration, and photosynthetic activity in the multi-layered microbial mats of Great Sippewissett Salt Marsh, Massachusetts
Haigh-Flórez et al. Microalgae dual-head biosensors for selective detection of herbicides with fiber-optic luminescent O2 transduction
JP2008542702A (ja) 水監視システム
Perkins et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms
Van Rijn et al. Carbohydrate fluctuations, gas vacuolation, and vertical migration of scum‐forming cyanobacteria in fishponds 1
Peña-Vázquez et al. Development of a microalgal PAM test method for Cu (II) in waters: comparison of using spectrofluorometry
Podola et al. Selective real-time herbicide monitoring by an array chip biosensor employing diverse microalgae
Belay et al. Photoinhibition of Photosynthesis in Asterionella Formosa (BACILLARIOPHYCEAE) 1, 2
Frandsen et al. Groundwater seepage stimulates the growth of aquatic macrophytes
Asztalos et al. Early detection of mercury contamination by fluorescence induction of photosynthetic bacteria
Modenutti et al. Effect of UV‐B and different PAR intensities on the primary production of the mixotrophic planktonic ciliate Stentor araucanus
Marie-Rose Vandenhecke et al. Changes in the Rubisco to photosystem ratio dominates photoacclimation across phytoplankton taxa
Goessling et al. Frustule photonics and light harvesting strategies in diatoms
NL1021258C2 (nl) Werkwijze en inrichting voor het bepalen van het aantal levende cellen in een testvloeistof en toepassing daarvan.
Perez et al. Phytoplankton absorption spectra along the water column in deep North Patagonian Andean lakes (Argentina)
Fuentes et al. Effects of changes in UV-B radiation levels on biofilm-forming organisms commonly found in cultural heritage surfaces
Sigg et al. UV radiation influences covering behaviour in the urchin Lytechinus variegatus

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08805295

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008805295

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12667590

Country of ref document: US