WO2009004153A1 - Procédé de production et utilisation de familles d'oligomères d'acide galacturonique - Google Patents

Procédé de production et utilisation de familles d'oligomères d'acide galacturonique Download PDF

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WO2009004153A1
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galacturonic acid
oligomers
producing
mixture
acid oligomers
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PCT/FR2008/000717
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Inventor
Patrice Pheulpin
Stéphanie ROSSARD
Maximilien Barbier
José KOVENSKY
Bernard Courtois
Josiane Courtois-Sambourg
Original Assignee
Université de Picardie Jules Verne
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H7/00—Compounds containing non-saccharide radicals linked to saccharide radicals by a carbon-to-carbon bond
    • C07H7/02—Acyclic radicals
    • C07H7/033—Uronic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
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    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0045—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Galacturonans, e.g. methyl ester of (alpha-1,4)-linked D-galacturonic acid units, i.e. pectin, or hydrolysis product of methyl ester of alpha-1,4-linked D-galacturonic acid units, i.e. pectinic acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a process for producing a family of galacturonic acid oligomers and to a use of such a family of oligomers.
  • Oligosaccharides are a broad family of compounds among which many molecules have biological activities that can be used in a variety of applications. Certain derivatives of these oligosaccharides may be developed in order to inhibit the development of infectious processes, for example in plants.
  • Plants are precisely an important source of biologically active oligosaccharides and most of them are obtained by fragmenting pectins, pectins from flax, for example, or from any other plant.
  • Pectins correspond to a major constituent of the plant cell wall.
  • the pectins consist essentially of homogalacturonans and rhamnogalacturonans type RG I and type RG II.
  • the homogalacturonans consist of 100% of partially methylated C6 and C2 and / or C3 acetylated galacturonic acid.
  • the rhamnogalacturonans type RG I consist mainly of rhamnose, galacturonic acid and galactose, arabinose and sometimes xylose.
  • RG II-type rhamnogalacturonans which are less important in pectins, consist of galacturonic acid, glucuronic acid, rhamnose, galactose, arabinose, fucose, apiose, KDO, a derivative of heptulosuric acid and xylose.
  • the methods described in these documents are relatively complex to implement, and therefore expensive.
  • the structure of the oligomers obtained depends strongly on the origin of the pectins, in particular the substitution, in particular by the acetates, which varies from one plant to another, but also as a function of the stage of growth of the plant (Bedouet et al. al, 2006, Carbohydrate Polymers 65, 165-173).
  • a problem that arises and that the present invention aims to solve is to provide a less expensive method of producing oligomers, consisting solely of galacturonic acid, unsubstituted or acetylated.
  • Another problem, which the invention solves, is to provide a process which makes it possible to obtain oligomers having the same structure (not contaminated with oligomers containing neutral oses), whatever the origin of the pectins used, these oligomers which may be unsubstituted or acetylated by a given percentage.
  • the present invention provides a rapid and inexpensive process for the production of acetylated or unsubstituted galacturonic acid oligomers, said process being of the type in which a mixture of galacturonic acid polymers is provided; and according to the invention this process further comprises the following steps: a) adjusting the pH of said mixture of galacturonic acid polymers to acidic conditions between 4 and 5; b) said mixture is brought to a temperature above 110 ° C.
  • a characteristic of the invention lies in the implementation of a polymer mixture of galacturonic acid which is thermally degraded in a controlled manner to obtain oligomers of a limited degree of polymerization of between 2 and 40, for example between 5 and 25. A description will be given in greater detail in the following description of an embodiment of the invention. wherein the degree of polymerization dp is essentially between 4 and 11.
  • the subject of the present invention has hydrolysis conditions different from the aforementioned document by L. Bedouet et al, since the degradation of the crude pectin described in this document is carried out in the presence of 0.1 M of HCI 12 M; and under these conditions, the pH of the solution is of the order of 1 and the temperature applied is 80 ° C.
  • Said mixture of galacturonic acid polymers is advantageously brought to a temperature higher than 110 ° C in an autoclave, and therefore, according to the Regnault table, said mixture of galacturonic acid polymers is brought to a pressure greater than 0, 5 bar.
  • a temperature of less than 130 ° C. for example 121 ° C.
  • the reaction lasts 24 hours, which is greatly less profitable, and moreover in this case, does not lead to the same results.
  • the mixture is placed in an autoclave for 40 minutes. Under these conditions of temperature, 121 ° C, and pressure corresponding and close to 1 bar, essentially unsubstituted galacturonic acid oligomers are obtained.
  • step d) after step c), an acetic compound is reacted on said galacturonic acid oligomers recovered in a controlled manner in order to graft acetate groups in a determined percentage onto said recovered galacturonic acid oligomers. ; in this way, acetylated galacturonic acid oligomers are obtained without modifying the degree of polymerization.
  • the galacturonic acid polymers which are naturally partially acetylated, but according to a variable rate which depends on their origin, are first completely free of their substituents and then be acetylated in a totally controlled manner. In this way we can get rid of the origin of polymers.
  • said oligomers are advantageously substituted with groups selected from the group consisting of, alkyl, aryl, acyl, phosphate and sulphate, according to a percentage determined so as to confer properties on them. special.
  • These oligomers will then be treated with an acetylation reagent, and preferably a reagent that is easy to eliminate at the end of the reaction, such as acetic anhydride, will be chosen.
  • acetylation reagent preferably a reagent that is easy to eliminate at the end of the reaction, such as acetic anhydride, will be chosen.
  • sulfated galacturonic acid oligomers they will preferably be obtained using an SO 3 -DMF complex.
  • said galacturonic acid polymers are obtained by hydrolyzing pectins derived from plants of any nature whatsoever.
  • a source of supply is almost infinite, and therefore very cost-effective.
  • the method of implementation is relatively simple and does not use expensive methods of enzymatic degradation.
  • the processes for preparing oligogalacturonans enzymatically require the elimination of the protein so that the oligogalacturonan fraction is pure. The method which is the subject of the present invention is freed from this deproteinization step.
  • the pH of the oligomer mixture is lowered after step b) to precipitate the acid oligomers.
  • galacturonique whose degree of polymerization dp is greater than 40 or preferably greater than 25, so as to recover in step c) a supernatant containing said galacturonic acid oligomers of degree of polymerization dp, between 2 and 40 or else preferably, between 2 and 25 and essentially between 5 and 25.
  • said supernatant is treated so as to recover oligomers of dp substantially between 5 and 25, either by precipitation or by ultrafiltration; it may advantageously be mixed with an alcohol to precipitate said galacturonic acid oligomers whose degree of polymerization dp is essentially between 5 and 25.
  • the oligomers of dp essentially between 5 and 25 are recovered in the retentate, this filtration method further allows to concentrate the oligomer solution which can be freeze-dried.
  • acetic anhydride is advantageously reacted with the recovered galacturonic acid oligomers to graft acetate groups. In this way, the acetylation process is relatively mild and thus does not cause a change in the degree of polymerization. There is no further degradation of the oligomers.
  • step d) the acetic compound and said oligomers of galacturonic acid form a reaction mixture, and the acetylation reaction is interrupted by adding a given amount of water to said reaction mixture. Then, said reaction mixture supplemented with said quantity of water given is dialyzed after reaction to recover said acetylated oligomers in solution in water.
  • said acetylated oligomers in solution in water are lyophilized to be isolated. Preferably, they are frozen before lyophilization.
  • the present invention relates to the oligomers obtained according to the production method described above.
  • the present invention provides the use of acetyl oligomers according to the method described above for use as an antimicrobial agent.
  • FIG. 1 is a proton nuclear magnetic resonance spectrum ( 1 H NMR) of a compound obtained according to the process according to the invention and having a first degree of substitution;
  • Neutral osse sequences are acid-sensitive in contrast to uronic acid sequences. In neutral acid medium, neutral oles and oligomers of neutral osues are soluble, while acidic oligomers form a precipitate. The neutral osse sequences will therefore be eliminated by controlled acid hydrolysis, while the acidic osse sequences will remain intact; we will then obtain polymers of galacturonic acid (PGA).
  • PGA galacturonic acid
  • the method used to degrade galacturonic acid polymers (PGA) to galacturonic acid oligomers (OGA) corresponds to an autohydrolysis, under acidic conditions at a pH of between 4 and 5 and preferentially at a pH of 4.4. of these galacturonic acid polymers (PGA) caused by heating in an autoclave at 121 ° C. (1 atm) for 40 minutes. It will be specified here that an autoclave is a thick-walled and hermetically sealed container, forming a sealed enclosure.
  • the oligomers of pectin are obtained by degradation of crude pectins, which contain acidic oses (galacturonic acid) and neutral oses.
  • the ratio of neutral to acidic acids varies according to the origin of the pectins. It is respectively 75/25 for flax, 80/20 for apple, or 82/18 for lemon.
  • the oligomers of galacturonic acid (OGA) thus obtained, whose degree of polymerization DP is essentially between 5 and 25 units are therefore nonacetylated.
  • the ratio of neutral to acidic acids varies according to the plants and their stage of growth and the exploitation of raw pectins would lead to a variability of composition which could be detrimental to the reproducibility of the properties in the case of the application of these molecules.
  • the galacturonic acid (PGA) polymers can be extracted from pectins isolated from plants of any kind. It will also be possible to use galacturonic acid polymers sold as such commercially. In both cases, it is intended to obtain oligomers of galacturonic acid (OGA).
  • PGA galacturonic acid
  • a process for preparing galacturonic acid polymers from a determined amount of pectin is described below.
  • 10 g of pectin are provided, which is dissolved in water, and advantageously in ultra-pure water.
  • a quality of water can be obtained by means of a commercial device, for example the PURELAB UHQ system.
  • 4 molar hydrochloric acid is added to the solution, then the mixture is brought to 50 ° C. and stirred for a period of 2 to 4 hours, advantageously the treatment is treated for 3 hours at 50 ° C.
  • the neutral osse sequences are hydrolysed while the bonds between the uronic acids are not degraded.
  • the mixture is neutralized with sodium hydroxide
  • the carboxylic functions of the galacturonic acid polymer are predominantly in the ionized COO - H + form, which improves self-degradation when the mixture is heated to 121 ° C. in an autoclave for 40 minutes.
  • a reduction in the duration of the treatment reduces the degradation of the polymer, whereas conversely an increase in the duration of the treatment at 121 ° C.
  • the mixture of galacturonic acid oligomers mentioned above is then rapidly cooled. Then, the pH of this cooled mixture is adjusted to 2.0 with acetic acid. This adjustment then causes the precipitation of the molecules of average mass which can result from an incomplete degradation.
  • the ion exchange chromatography elution of the supernatant in comparison with the two other elution profiles described above shows a profile that starts a little earlier and, above all, attenuates rather than the profile of the oligomers of galacturonic acid after heat treatment. This shows the elimination of high molecular weight compounds by precipitation at pH 2 in the presence of acetic acid.
  • oligosaccharides are then recovered, either by precipitation in the presence of an alcohol, sbit by ultrafiltration membrane IkDa cutoff threshold; in both cases, the oligomers can be dried by lyophilization.
  • a treatment with 7 volumes of isopropanol is preferentially chosen.
  • the mixture is again centrifuged under the same conditions and the tubes, galacturonic acid oligomer fractions, are then recovered in the pellet.
  • the precipitate recovered in the pellet is dried, for example by evaporation.
  • the dry precipitate can advantageously be solubilized in UHQ water (10 g of galacturonic acid oligomers per liter) then freeze-dried. Lyophilization improves the conditioning of galacturonic acid oligomers (OGA).
  • the oligomers galacturonic acid whose degree of polymerization is between 4 and 11 represent nearly 95% of all the compounds obtained by this process.
  • almost 78% of the compounds have a degree of polymerization of between 5 and 10. Therefore, the method used here is extremely selective.
  • oligomers of galacturonic acid may be obtained according to the method of preparation proposed in Example 2 above from commercially available galacturonic acid polymers.
  • the process according to the invention aims to obtain partially acetylated galacturonic acid oligomers just as are the galacturonic acid polymers present in the plant, but with a determined acetylation level. To do this, a method of acetylation has been developed. Thus, according to this technique, starting from unsubstituted oligomers, the acetylation of the galacturonic acid oligomer fractions can be controlled.
  • a second cycle leads to approximately 30% acetylated galacturonic acid oligomers (OGA).
  • OAA acetylated galacturonic acid oligomers
  • a third cycle in accordance with the first treatment cycle mentioned above leads to approximately 40% acetylated OGAs without modifying the degree of polymerization dp.
  • the spectrum of the molecules thus produced is not represented.
  • the galacturonic acid oligomers (OGA) thus obtained were applied to microorganisms to demonstrate their activities.
  • OGAs were introduced into culture media inoculated with Gram-positive (Staphylococcus aureus, Listha innocuita) and Gram-negative (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa) bacteria at 10 7 colony-forming units (CFUs). ) per milliliter for E. coli, L. innoccua, S. aureus and S. typhimurium, and 5 x 10 7 CFU per milliliter for P. aeruginosa.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique, ledit procédé étant du type selon lequel on fournit un mélange de polymères d'acide galacturonique; selon l'invention le procédé comprend en outre les étapes suivantes : on porte ledit mélange à une température et à une pression déterminées pour dégrader lesdits polymères d'acide galacturonique de façon à obtenir un mélange d'oligomères comprenant des oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est essentiellement compris entre 2 et 40; et, on récupère lesdits oligomères d'acide galacturonique de dp essentiellement compris entre 2 et 40; de la sorte, on obtient des oligomères selon un pourcentage déterminé et présentant un degré de polymérisation dp essentiellement compris entre 2 et 40.

Description

Procédé de production et utilisation de familles d'oliqomères d'acide qalacturonique
La présente invention se rapporte à un procédé de production d'une famille d'oligomères d'acide galacturonique et à une utilisation d'une telle famille d'oligomères.
Les oligosaccharides constituent une large famille de composés parmi laquelle de nombreuses molécules présentent des activités biologiques susceptibles d'être utilisées dans diverses applications. Certains dérivés de ces oligosaccharides peuvent être élaborés dans le but d'inhiber le développement des processus infectieux, par exemple chez les végétaux.
Les végétaux sont précisément une importante source d'oligosaccharides biologiquement actifs et la plupart d'entre eux sont obtenus en fragmentant des pectines, des pectines issues du lin par exemple ou de tout autre végétal. Les pectines correspondent à un constituant majeur de la paroi des cellules végétales.
Les pectines se composent essentiellement d'homogalacturonanes et de rhamnogalacturonanes de type RG I et de type RG II. Les homogalacturonanes sont constitués de 100% d'acide galacturonique partiellement méthylé en C6 et actétylé en C2 et/ou C3. Les rhamnogalacturonanes de type RG I sont constitués majoritairement de rhamnose, d'acide galacturonique et de galactose, d'arabinose et parfois de xylose. Quant aux rhamnogalacturonanes de type RG II, présents en moins grande proportion dans les pectines, ils sont constitués d'acide galacturonique, d'acide glucuronique, de rhamnose, de galactose, d'arabinose, de fucose, d'apiose, de KDO, d'un dérivé de l'acide heptulosurique et de xylose.
Des méthodes ont été mises en œuvre pour dégrader ces pectines dans le but d'obtenir des oligomères d'acide galacturonique. Ces méthodes procèdent de la dégradation enzymatique de pectines puis de la purification des oligomères d'acide galacturonique. On citera notamment l'article de L. Bédouet et al. (« Methods for obtaining neutral and acid oligosaccharides from flax pectines », Biotechnology Letters (2005) 27 : 40), dans lequel il est décrit une méthode enzymatique pour obtenir des oligosaccharides neutres et acides à partir de pectines de lin partiellement substitués par des groupements methyl en C6 et/ou acétyl en C2/C3. La purification des familles d'oligosaccharides 100% neutres (oligogalactanes, oligoarabinogalactanes) ou 100% acides (oligogalacturonanes), ou partiellement anioniques, nécessitant une purification par chromatographie échangeuse d'anions. On pourra se référer également au document japonais JP 10 226 701 dans lequel il est décrit également une méthode de décomposition des pectines brutes pour obtenir des oligomères d'acide galacturonique. La méthode consistant à faire une extraction à chaud (60 à 1000C) de ladite pectine puis de soumettre l'extrait à une dégradation enzymatique à l'aide de pectinase. Les enzymes utilisées permettent de couper les chaînes polymériques en oligomères. Ces chaînes polymériques présentent naturellement des substituants acétylés, la préparation en oligogalacturonane décrite dans le procédé est naturellement contaminée par des oligomères non 100% anioniques puisque l'extraction à chaud entraîne obligatoirement des fractions d'osés neutres de masse moléculaire faible, on citera l'article de L. Bedouet (Changes in esterified pectins development in the flax stems and leaves Carbohydrate Polymers 65, (2006) 165-173 ) ; les oligomères qui résultent de cette dégradation enzymatique présentent une activité antibactérienne
Bien qu'intéressantes, les méthodes décrites dans ces documents sont relativement complexes à mettre en œuvre, et par conséquent coûteuses. Par ailleurs, la structure des oligomères obtenus dépend fortement de l'origine des pectines, notamment la substitution notamment par les acétates qui varie d'une plante à une autre, mais aussi en fonction du stade de croissance de la plante (L. Bedouet et al, 2006, Carbohydrate Polymers 65, 165-173). Aussi, un problème qui se pose et que vise à résoudre la présente invention est de fournir un procédé moins coûteux de production d'oligomères, constitués uniquement d'acide galacturonique, non substitués ou acétylés. Un autre problème, que résout l'invention, est de fournir un procédé, qui permette d'obtenir des oligomères ayant la même structure (non contaminés par des oligomères contenant des oses neutres), quelle que soit l'origine des pectines utilisées, ces oligomères pouvant être non substitués ou acétylés selon un pourcentage déterminé.
Dans ce but, la présente invention propose un procédé rapide et peu onéreux de production d'oligomères d'acide galacturonique acétylés ou non, ledit procédé étant du type selon lequel on fournit un mélange de polymères d'acide galacturonique; et selon l'invention ce procédé comprend en outre les étapes suivantes : a) on ajuste le pH dudit mélange de polymères d'acide galacturonique à des conditions acides entre 4 et 5 ; b) on porte ledit mélange à une température supérieure à 11O0C et à une pression déterminée pour dégrader lesdits polymères d'acide galacturonique de façon à obtenir un mélange d'oligomères comprenant des oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est compris essentiellement entre 2 et 40 ; et, c) on récupère lesdits oligomères d'acide galacturonique de dp essentiellement compris entre 2 et 40 ; de cette façon on obtient des oligomères qui seront acétylés selon un pourcentage déterminé et présentant un degré de polymérisation dp essentiellement compris entre 2 et 40. Ainsi, une caractéristique de l'invention réside dans la mise en œuvre d'un mélange de polymères d'acide galacturonique que l'on dégrade thermiquement de manière contrôlée pour obtenir des oligomères d'un degré de polymérisation limité compris entre 2 et 40, par exemple entre 5 et 25. On décrira plus en détail dans la suite de la description un mode de réalisation dans lequel le degré de polymérisation dp est essentiellement compris entre 4 et 11.
On observera que l'objet de la présente invention présente des conditions d'hydrolyse différentes du document précité de L. Bedouet et al, car la dégradation de la pectine brute décrite dans ce document s'effectue en présence de 0,1 M d'HCI 12 M ; et dans ces conditions, le pH de la solution est de l'ordre de 1 et la température appliquée est de 80° C.
Ledit mélange de polymères d'acide galacturonique est porté avantageusement à une température supérieure à 110°C dans un autoclave, et par conséquent, selon la table de Regnault, ledit mélange de polymères d'acide galacturonique est porté à une pression supérieure à 0,5 bar.
De préférence, on applique une température inférieure à 130° C, par exemple 121 ° C et ce durant un laps de temps compris entre 30 et 60 minutes, alors que selon l'art antérieur précité la réaction dure 24 heures, ce qui est grandement moins rentable, et au surplus en l'espèce, ne conduit pas aux mêmes résultats. Par exemple, le mélange est placé en autoclave durant 40 minutes. Dans ces conditions de température, 121°C, et de pression correspondante et voisine de 1 bar, on obtient essentiellement des oligomères d'acide galacturonique non substitués.
Avantageusement, et selon une étape d), après l'étape c), on fait réagir un composé acétique sur lesdits oligomères d'acide galacturonique récupérés de façon contrôlée pour greffer des groupements acétates selon un pourcentage déterminé sur lesdits oligomères d'acide galacturonique récupérés ; de cette façon on obtient des oligomères d'acide galacturonique acétylés sans modification du degré de polymérisation. De la sorte, les polymères d'acide galacturonique qui sont naturellement partiellement acétylés, mais selon un taux variable qui dépend de leur origine, sont d'abord entièrement débarrassés de leurs substituants pour ensuite être acétylés de manière totalement contrôlée. De cette façon on peut s'affranchir de l'origine des polymères.
Par ailleurs, et selon encore un autre mode de mise en œuvre, lesdits oligomères sont avantageusement substitués avec des groupements choisis parmi l'ensemble des, Alkyl, Aryle, Acyl, Phosphate, Sulfate, selon un pourcentage déterminé de manière à leur conférer des propriétés particulières. Ces oligomères seront alors traités par un réactif d'acétylation, on choisira de préférence un réactif facile à éliminer au terme de la réaction, comme par exemple l'anhydride acétique. Dans le cas des oligomères d'acide galacturonique sulfatés, ils seront obtenus de préférence à l'aide d'un complexe SO3-DMF.
Selon un mode de mise en œuvre de l'invention particulièrement avantageux, lesdits polymères d'acide galacturonique sont obtenus en hydrolysant des pectines issues de végétaux, de quelle que nature que ce soit. Une telle source d'approvisionnement est quasiment infinie, et par conséquent d'un coût très avantageux. Aussi, non seulement la matière première est d'un faible coût, mais au surplus le procédé de mise en œuvre, est relativement simple et ne fait pas appel à des méthodes coûteuses de dégradation enzymatique. Par ailleurs les procédés de préparation des oligogalacturonanes par voie enzymatique nécessitent l'élimination de la protéine afin que la fraction oligogalacturonane soit pure. Le procédé objet de la présente invention s'affranchi de cette étape de déprotéinisation.
De manière préférentielle, on abaisse le pH du mélange d'oligomères après l'étape b), pour provoquer la précipitation des oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est supérieure à 40 ou de préférence supérieur à 25, de façon à récupérer à l'étape c) un surnageant contenant lesdits oligomères d'acide galacturonique de degré de polymérisation dp, compris entre 2 et 40 ou bien de préférence compris entre 2 et 25 et essentiellement compris entre 5 et 25. Ensuite, ledit surnageant est traité de manière à récupérer des oligomères de dp essentiellement compris entre 5 et 25, soit par précipitation, soit par ultrafiltration; il pourra avantageusement être mélangé à un alcool pour faire précipiter lesdits oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est essentiellement compris entre 5 et 25. Dans le cas de la filtration on pourra avantageusement utiliser une membrane de seuil de coupure de IkDa, les oligomères de dp essentiellement compris entre 5 et 25 sont récupérés dans le rétentat, ce procédé de filtration permet en outre de concentrer la solution d'oligomères qui peut être lyophilisée. Et à l'étape d), on fait réagir avantageusement de l'anhydride acétique sur les oligomères d'acide galacturonique récupérés pour greffer des groupements acétates. De la sorte, le procédé d'acétylation est relativement doux et il ne provoque ainsi pas de modification du degré de polymérisation. Il n'y a pas de dégradation supplémentaire des oligomères.
Selon un mode de réalisation particulier, à l'étape d), le composé acétique et lesdits oligomères d'acide galacturonique forment un mélange réactionnel, et on interrompt la réaction d'acétylation en ajoutant une quantité d'eau donnée audit mélange réactionnel. Ensuite, ledit mélange réactionnel additionné de ladite quantité d'eau donnée est dialyse après réaction pour récupérer lesdits oligomères acétylés en solution dans l'eau. Avantageusement, lesdits oligomères acétylés en solution dans l'eau sont lyophilisés pour être isolés. De préférence, ils sont congelés avant lyophilisation.
Selon un autre aspect, la présente invention concerne les oligomères obtenus conformément au procédé de production décrit ci-dessus. Selon encore un autre aspect, la présente invention propose l'utilisation d'oligomères acétylés selon le procédé décrit ci-dessus, pour une utilisation comme agent antimicrobien.
D'autres particularités et avantages de l'invention ressortiront à la lecture de la description faite ci-après de modes de réalisation particuliers de l'invention, donnés à titre indicatif mais non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels :
- la Figure 1 est un spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (1H RMN) d'un composé obtenu selon le procédé conforme à l'invention et présentant un premier degré de substitution ; et,
- la Figure 2 est un spectre de ce même composé présentant un second degré de substitution.
Les séquences d'osés neutres sont sensibles aux acides contrairement aux séquences d'acide uroniques. En milieu acide, les oses neutres et les oligomères d'osés neutres sont solubles alors que les oligomères d'osés acides forment un précipité. Les séquences d'osés neutres seront donc éliminées par hydrolyse acide contrôlée, tandis que les séquences d'osés acides resteront intactes ; on obtiendra alors des polymères d'acide galacturonique (PGA).
La méthode utilisée pour dégrader les polymères d'acide galacturonique (PGA) en oligomères d'acide galacturonique (OGA) correspond à une autohydrolyse, en condition acide à un pH compris entre 4 et 5 et de manière préférentielle à un pH de 4,4, de ces polymères d'acide galacturonique (PGA) provoquée par chauffage en autoclave à 1210C (1 atm) pendant 40 minutes. On précisera ici qu'un autoclave est un récipient à parois épaisses et à fermeture hermétique, formant une enceinte étanche. Si l'on s'en réfère à la table de Regnault, donnant la température approximative de la vapeur d'eau seule dans un autoclave en fonction de la pression, lorsque la température est de 121°C, la pression interne de l'autoclave atteint environ 1 atmosphère, plus précisément, 1 bar pour 120,420C; et lorsque la température est de 1340C, la pression atteint environ 2 atmosphères, précisément, 2 bar pour 133,69°C. Toujours selon la table de Regnault à 144°C la pression est d'environ 4 atmosphères. Aussi, dans un autoclave, les valeurs de la pression et de la température sont liées par des lois physiques. En conséquence, lorsqu'on utilise un autoclave pour dégrader les polymères, conformément à l'invention, la seule valeur de température imposée à l'intérieur, conditionne la pression de dégradation. Méthode :
Les oligomères de pectine sont obtenus par dégradation des pectines brutes, lesquelles contiennent des oses acides (acide galacturonique) et des oses neutres. Le rapport oses acides/oses neutres varie selon l'origine des pectines. Il est respectivement de 75/25 pour le lin, de 80/20 pour la pomme, ou encore de 82/18 pour le citron. La méthode appliquée pour dégrader les pectines selon laquelle elles sont soumises à un traitement acide puis sont portées à au moins 1200C, permet d'éliminer tous les substituants présents sur le polymère et en particulier les groupements acétyl. Après purification, les oligomères d'acide galacturonique (OGA) ainsi obtenus, dont le degré de polymérisation DP est essentiellement compris entre 5 et 25 unités sont donc non acétylés.
En revanche, d'autres méthodes que la dégradation thermique, notamment la dégradation enzymatique par des pectinases commerciales peut conduire à l'obtention d'oligomères d'acide galacturonique (OGA) acétylés, puisque les polymères d'acide galacturonique sont naturellement acétylés et que la dégradation enzymatique consiste simplement au découpage du polymère en oligomères. Cependant l'exploitation d'un tel procédé peut conduire à une hétérogénéité des échantillons puisque le taux de substitution des pectines varie en fonction du végétal, mais aussi en fonction de son stade de développement. Et surtout, ces méthodes sont plus coûteuses.
De même, le rapport oses acides/oses neutres varie en fonction des plantes et de leur stade de croissance et l'exploitation de pectines brutes entraînerait une variabilité de composition qui pourrait être préjudiciable à la reproductibilité des propriétés dans le cas de l'application de ces molécules.
Pour s'assurer de la parfaite reproductibilité des lots on s'intéresse plus particulièrement à la fraction ne contenant que les oses acides. On pourra extraire les polymères d'acide galacturonique (PGA) à partir de pectines isolées de plantes de quelle que nature que ce soit. On pourra aussi utiliser des polymères d'acide galacturonique vendus tels quels dans le commerce. Dans les deux cas, on vise à obtenir des oligomères d'acide galacturonique (OGA). Exemple 1
Un procédé de préparation de polymères d'acide galacturonique à partir d'une quantité déterminée de pectine est décrit ci-après. On fournit tout d'abord 10 g de pectine que l'on met en solution dans de l'eau, et de manière avantageuse dans de l'eau ultra pure. Une telle qualité d'eau est susceptible d'être obtenue au moyen d'un dispositif du commerce, par exemple le système PURELAB UHQ. Ensuite, on ajoute à la solution de l'acide chlorhydrique quatre fois molaire, puis on porte le mélange à 5O0C et on le met sous agitation pendant une durée de 2 à 4 heures avantageusement on traitera la préparation trois heures à 500C. De la sorte, les séquences d'osés neutres sont hydrolysées tandis que les liaisons entre les acides uroniques ne sont pas dégradées. Après cette phase d'agitation, le mélange est neutralisé par de la soude
12 fois molaire. Puis on additionne au mélange 2 volumes d'isopropanol. Ainsi, seules les molécules de masse moyenne élevée précipitent avec l'isopropanol, tandis que les molécules de masse faible (mono et oligosaccharides) restent en solution. On introduit ensuite le mélange dans des tubes d'une centrifugeuse. On récupère alors le précipité dans le culot desdits tubes, après centrifugation du mélange porté à 4° C et à 15.000 g pendant 30 minutes, tandis que le surnageant est éliminé. On obtient par là même, des polymères d'acide galacturonique. Exemple 2 Le précipité obtenu selon l'exemple 1 est ensuite remis en solution dans de l'eau ultra pure UHQ. Le pH de la solution est alors ajusté à 4,4 avec de l'acide chlorhydrique 0,1 fois molaire. De la sorte, les fonctions carboxyliques du polymère d'acide galacturonique (PGA), sont majoritairement sous la forme ionisée COO" H+. Cela améliore l'auto-dégradation lorsque le mélange est porté à 121 ° C en autoclave pendant 40 minutes. Une diminution de la durée du traitement réduit la dégradation du polymère, alors qu'à l'inverse une augmentation de la durée du traitement à 1210C augmente la dégradation du polymère et conduit à des oligomères d'acide galacturonique dont les dp sont en moyenne, selon les cas majoritairement plus élevés ou plus petits que ceux obtenus par traitement pendant 40 minutes. Grâce à ce traitement thermique et aux conditions d'application, d'une part tous les substituants du polymère sont éliminés, notamment les substituants acétyl, et d'autre part, on obtient notamment des oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est majoritairement compris entre 2 et 25 unités ose. D'ailleurs, lorsque l'on compare les profils d'élution en chromatographie échangeuse d'ions (DEAE-Sepharose), des polymères d'acide galacturonique obtenus selon l'exemple 1 précité et des oligomères d'acide galacturonique obtenus grâce au traitement thermique décrit ci-dessus, on observe pour les seconds, une élution qui non seulement démarre plus tôt, mais aussi qui est plus étalée que celle des premiers. Cela est révélateur de la dégradation des polymères, puisque l'élution des petites molécules est plus rapide et que l'élution des plus grosses molécules.
Le mélange d'oligomères d'acide galacturonique précité, est ensuite refroidi rapidement. Puis, on ajuste le pH de ce mélange refroidi à 2,0 avec de l'acide acétique. Cet ajustement provoque alors la précipitation des molécules de masse moyenne qui peuvent résulter d'une dégradation incomplète.
Ainsi, après centrifugation du mélange à 15 000 g pendant 30 minutes et ce à une température de 4° C, on récupère le surnageant que l'on neutralise par de l'ammoniaque et qui est constitué de petites molécules, tandis que le culot des tubes de centrifugation contenant les molécules de masse moyenne précitée est éliminé.
Là encore, l'élution en chromatographie échange d'ions du surnageant en comparaison des deux autres profils d'élution décrit ci-dessus, montre un profil qui démarre encore un peu plus tôt et surtout qui s'atténue bien plutôt que le profil des oligomères d'acide galacturonique après traitement thermique. Cela témoigne de l'élimination des composés de haut poids moléculaire et ce, grâce à la précipitation a pH 2 en présence d'acide acétique.
Les petites molécules constituées d'oligosaccharides sont ensuite récupérées, soit par précipitation ëh présence d'un alcool, sbit par ultràfiltration sur membrane de IkDa de seuil de coupure ; dans les 2 cas, les oligomères peuvent être séchés par lyophilisation. Dans le cas de la précipitation alcoolique on choisira préférentiellement un traitement par 7 volumes d'isopropanol. Le mélange est à nouveau centrifugé dans les mêmes conditions et l'on récupère alors dans le culot des tubes, les fractions d'oligomères d'acide galacturonique. Pour ce faire, le précipité récupéré dans le culot est séché par exemple par évaporation. Ensuite, le précipité sec peut avantageusement être solubilisé dans de l'eau UHQ (10g d'oligomères d'acide galacturonique par litre) puis lyophilisé. La lyophilisation améliore le conditionnement des oligomères d'acide galacturonique (OGA).
On se référera au tableau I reporté ci-dessous, dans lequel apparaît alors, le pourcentage des fractions d'oligomères d'acide galacturonique obtenu par précipitation dans l'isopropanol, en fonction du degré de polymérisation.
Tableau
Figure imgf000011_0001
Ainsi qu'on peut le constater, les oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation est compris entre 4 et 11 représentent près de 95 % de tous les composés obtenus selon ce procédé. Par ailleurs, près de 78 % des composés ont un degré de polymérisation compris entre 5 et 10. Par conséquent, le procédé ici mis en œuvre est extrêmement sélectif.
Dans le cas de la récupération des oligomères d'acide galacturonique par ultrafiltration sur membrane de 1 kDa de seuil de coupure, on récupérera le rétentat contenant les oligomères de dp majoritairement compris entre 5 et 25 ; ces oligomères concentrés dans le rétentat sont lyophilisés. Par ailleurs, ces oligomères sont non substitués, en raison de l'élimination des acétates et des méthyles durant le procédé de préparation décrit ci-dessus. En outre, les fractions sont exemptes d'osés neutres. Bien évidemment, des oligomères d'acide galacturonique sont susceptibles d'être obtenus selon le mode de préparation proposé dans l'exemple 2 ci-dessus à partir de polymères d'acide galacturonique disponibles dans le commerce.
Le procédé selon l'invention, vise à obtenir des oligomères d'acide galacturonique partiellement acétylés tout comme le sont les polymères d'acide galacturonique présents dans la plante, mais avec un taux d'acétylation déterminé. Pour ce faire, il a été mis au point un procédé d'acétylation ménagé. Ainsi, selon cette technique, en partant d'oligomères non substitués, l'acétylation des fractions d'oligomères d'acide galacturonique peut être contrôlée.
Les oligomères d'acide galacturonique sont additionnés d'anhydride acétique et l'acétylation est très douce et non dénaturante, c'est-à-dire qu'elle ne dégrade pas les oligomères. Exemple 3 : un cycle de traitement
A 1 g d'oligomères d'acide galacturonique on ajoute 10 ml d'anhydride acétique 0,1 fois molaire et ce en quatre fois. Le mélange est alors mis sous agitation douce pendant 24 heures et à température ambiante. Puis, le processus d'acétylation est stoppé par l'ajout de 50 ml d'eau ultra pure UHQ. Ensuite le mélange est dialyse afin d'éliminer les réactifs puis lyophilisé. Avant lyophilisation, le mélange est avantageusement congelé. De la sorte, on obtient un produit final contenant des oligomères d'acide galacturonique acétylés avec un rendement de 100 % par rapport aux oligomères de départ, c'est-à-dire que tous les oligomères présentent des substituant acétylés.
En revanche, on obtient en moyenne pour un premier cycle de traitement, 10 % d'acétylation, par rapport à toutes les substitutions possibles, sans diminution du degré de polymérisation dp. On pourra se référer au spectre de résonance magnétique nucléaire du proton (1H RMN) illustré sur la Figure 1 , lequel illustre le mode de calcul du taux d'acétylation. En effet, le rapport de l'intégration des signaux 10 correspondants aux protons des acétates de la région allant de 2,5 à 3 ppm, à l'intégration des signaux 12 correspondants aux protons des résidus d'acide galacturonique de la région allant de 3,8 à 6 ppm permet de déterminer le taux d'acétylation. Un deuxième cycle conduit à des oligomères d'acide galacturonique (OGA) acétylés à environ 30%. Le spectre de résonance magnétique nucléaire du proton illustré sur la Figure 2, montre la progression des signaux 10 correspondants aux protons des acétates de la région, 2,5 à 3 ppm par rapport à ceux 12 de la région correspondant aux résidus d'acide galacturonique, 3,8 à 6 ppm.
Aussi, un troisième cycle conforme au premier cycle de traitement précité, conduit à des OGA acétylés à environ 40% sans modification du degré de polymérisation dp. Le spectre des molécules ainsi produites n'est en revanche pas représenté.
Le taux d'acétylation des oligomères d'acide galacturonique auxquels ont fait subir le traitement du type précité est reproductible. Exemple 4
Les oligomères d'acide galacturonique (OGA) ainsi obtenus, ont été appliqués à des micro-organismes pour en démontrer leurs activités. Ainsi, les OGA ont été introduits dans des milieux de culture inoculés par des bactéries à Gram positif (Staphylococcus aureus, Listeha innocuita) et à Gram négatif (Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa) à raison de 107 unités formant colonies (UFC) par millilitre pour E. coli, L. innoccua, S. aureus et S. typhimurium, et 5 x 107 UFC par millilitre pour P. aeruginosa. Le développement de ces micro-organismes en présence des OGA a été mis en œuvre dans un mélange liquide pendant 6 heures à 37°C sous agitation. La mesure de l'activité des oligomères d'acide galacturonique est faite par mesure de la densité optique du mélange à 600 nm. Les résultats présentés dans le tableau I ci-dessous correspondent à la moyenne de 4 essais distincts. La croissance des micro-organismes en présence des OGA est comparée à un témoin sans OGA. Le pourcentage d'inhibition de croissance est déterminé par le rapport de la densité optique standard du témoin sans OGA à 600 nm moins la densité optique de l'essai, le tout divisé par la densité optique standard et multiplié par 100 : DO6oo Standard - DO6oo essais / DO6oo Standard x 100. Tableau II
Figure imgf000014_0001
Ainsi, il est montré que pour les micro-organismes Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus, les oligomères d'acide galacturonique acétylés à un taux de 10 %, et présentant un degré de polymérisation compris entre 5 et 25, freinent le développement de ces micro-organismes avec une efficacité supérieure aux oligomères d'acide galacturonique non acétylés du même degré de polymérisation.
Les fractions d'oligomères d'acide galacturonique (OGA) qui réduisent de manière conséquente la croissance de bactéries pathogènes tel Staphylocoque et Pseudomonas, ainsi que Salmonella et qui présentent une faible activité vis- à-vis de Escherichia coli présentent un grand intérêt pour l'alimentation humaine. En effet, si elles étaient incorporées à l'alimentation sous forme de compléments alimentaires par exemple, elles pourraient réduire la croissance des pathogènes en ayant une très faible activité sur les saprophytes et Escherichia coli en particulier. À terme, il pourrait y avoir alors extinction de la flore pathogène. Par ailleurs, les OGA pourraient être exploités dans le domaine des cosmétiques pour des applications cutanées. Dans ce cas, il y aurait comme dans le cas précédent diminution de la flore pathogène notamment des Staphylocoques et des Pseudomonas.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique, ledit procédé étant du type selon lequel on fournit un mélange de polymères d'acide galacturonique ; caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes suivantes : a. on ajuste le pH dudit mélange de polymères d'acide galacturonique à des conditions acides entre 4 et 5 ; b. on porte ledit mélange à une température supérieure à 1100C et à une pression déterminée pour dégrader lesdits polymères d'acide galacturonique de façon à obtenir un mélange d'oligomères comprenant des oligomères d'acide galacturonique dont le degré de polymérisation dp est essentiellement compris entre 2 et 40 ; et, c. on récupère lesdits oligomères d'acide galacturonique de dp essentiellement compris entre 2 et 40 ; par quoi on obtient des oligomères selon un pourcentage déterminé et présentant un degré de polymérisation dp essentiellement compris entre 2 et 40.
2. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ledit mélange de polymères d'acide galacturonique est porté à une température supérieure à 1100C dans un autoclave, par quoi ledit mélange de polymères d'acide galacturonique est porté à une pression supérieure à 0,5 bar.
3. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on porte ledit mélangé à une température supérieure à 1100C et à une pression déterminée pendant un laps de temps compris entre 30 et 60 minutes.
4. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le degré de polymérisation dp est essentiellement compris entre 4 et 11.
5. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le degré de polymérisation dp est essentiellement compris entre 5 et 25.
6. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que selon une étape d, après l'étape c, on fait réagir un composé acétique sur lesdits oligomères d'acide galacturonique récupérés de façon contrôlée pour greffer des groupements acétates selon un pourcentage déterminé sur lesdits oligomères d'acide galacturonique récupérés de manière à obtenir des oligomères acétylés.
7. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que lesdits oligomères sont substitués avec des groupements choisis parmi l'ensemble des, Alkyl, Aryle, Acyl, Phosphate et Sulfate.
8. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que lesdits polymères d'acide galacturonique sont obtenus en hydrolysant des pectines issues de végétaux.
9. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on abaisse le pH du mélange d'oligomères après l'étape b, pour provoquer la précipitation des oligomères d'acide galacturonique de façon à récupérer à l'étape c un surnageant contenant lesdits oligomères d'acide galacturonique.
10. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit surnageant est mélangé à un alcool pour faire précipiter lesdits oligomères d'acide galacturonique.
11. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'à l'étape d, on fait réagir de l'anhydride acétique sur lesdits oligomères d'acide galacturonique récupérés.
12. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce qu'à l'étape d, le composé acétique et lesdits oligomères d'acide galacturonique forment un mélange réactionnel, et en ce qu'on interrompt la réaction d'acétylation en ajoutant une quantité d'eau donnée audit mélange réactionnel.
13. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit mélange réactionnel additionné de ladite quantité d'eau donnée est dialyse après réaction pour récupérer lesdits oligomères acétylés en solution dans l'eau.
14. Procédé de production d'oligomères d'acide galacturonique selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que lesdits oligomères acétylés en solution dans l'eau sont lyophilisés pour être isolés.
15. Oligomères d'acide galacturonique obtenus conformément au procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14.
16. Utilisation d'oligomères selon la revendication 14, pour une utilisation comme agent antimicrobien.
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