明 細 書
DnaJ遺伝子を利用した細菌の検出及びその利用
技術分野
[0001 ] 本発明は、 DnaJ遺伝子を利用した細菌の検出及びその利用に関し、 詳しく は DnaJ遺伝子を利用して細菌を検出するための方法及びこの方法に用いる核 酸分子並びにこれらの診断や同定への利用に関する。
背景技術
[0002] 従来、 病原細菌など各種細菌の検出や同定は特殊な試薬および熟練した技 術を用い、 対象とする細菌の培養を行う必要があった。 病原細菌の増菌は危 険度を伴うものであるほか、 可能性ある病原菌が複数想定される場合には、 種々の条件で培養を行う必要もあった。 さらに菌種を同定するには、 生化学 的性状等を詳しく調べる必要があった。 このように、 細菌の検出や同定、 特 に、 病原細菌の検出や同定には、 危険性のほか多大な手間と時間を要してい た。
[0003] —方、 細菌の分類や同定の手法として 1 6S rDNAの塩基配列が用いられるよ うになつてきている。 こうした遺伝子の塩基配列を利用すれば、 比較的短時 間で細菌及び菌種を検出したり同定したりすることが期待される。
[0004] しかしながら、 1 6S rDNAの塩基配列の蓄積とともに、 1 6S rDNAの塩基配列 が独立かつ近縁の菌種間では 9 8 %以上類似して菌種を識別できないことが 多くあることがわかってきた (非特許文献 1 ) 。 したがって、 より複雑な全 染色体の遺伝子の類似度を計測する方法を実施しなければ、 菌種を決定でき ないこともわかってきた (非特許文献 2 ) 。 このため、 より多型に富んだ配 列のデータの蓄積が要請されるようになり、 GyrBや ropBなどの遺伝子の塩基 配列データの蓄積が進んでいる。 (非特許文献 3、 4、 5 ) 。
[0005] こうしたハウスキーピング遺伝子の一つとして、 ヒートショックタンパク 質である Dna Jがある。 Dna Jをコ一ドする DnaJ遺伝子は、 Mycobacter i um属菌 の菌種で分類に利用できることが報告されている (非特許文献 6 ) 。 また、 M
ycobacterium aviumの血清型において DnaJ遺伝子に多型が多いこと (非特許 文献 7) ゃ同菌種において 200塩基と短い配列ではあるが、 血清型で DnaJ 遺伝子がよく保存され、 同じ属の菌種レベルでは配列の違いが大きいことも 報告された (非特許文献 8) 。 さらに、 レジオネラ (Legionel la) 属におい ては、 DnaJ遺伝子は、 L. pneumophl iaの血清型で保存されており、 菌種レベ ルでは多型に富むことが報告されている (非特許文献 9) 。
[0006] 一方、 食品や動物から採取した検体中の病原微生物を迅速にかつ確実に検 出し特定することは、 感染症予防や治療の現場において強く求められている 。 病原微生物の特定にあたっては、 複数種類の病原微生物に特徴的なターゲ ット核酸にそれぞれ対応する複数種類のプライマ一セットを用いて PC Rを 実施するマルチプレックス P C R法が有用である。 マルチプレックス P C R では、 一つのチューブ内で多種類のプライマ一を用いてターゲット核酸を増 幅する。 こうしたマルチプレックス PC R法にあっては種々の検討がなされ ている (特許文献 1〜4) 。 マルチプレックス PC Rは、 感染症治療にあた つてウィルスやパクテリァ等病原微生物を特定することに有用性が高い。 病 原微生物を特定するには、 病原微生物のゲノムに特異的な配列をターゲット とする必要がある。
[0007] 非特許文献 1 : Fox、 G. E. et aに 1992. Int. J. Syst. Bacterid. 42:166-1 70)
非特許文献 2 : Ezaki、 丁. et aに 1989. Int. J. Syst. Bacterioし Amano、 Μ· et aに 2005. Microbiol. I國 unol. 49:255-263
非特許文 ϋ νί : Yamamoto、 S. and S. Harayama. 1995. Appl . Environ. Microb iol.61: 1104-1109.、
非特許文 14 : Yamamoto、 S. and S. Harayama.1996. Int. J. Syst. Bacter i ol. 46:506-511
非特許文献 5 : Gheunoy、 W. et a I.2005. Diagn. Microbiol. Infect. Dis.51 : 165-171
非特許文献 6 : Takewaki、 S. et aに 1994. Int. J. Syst. Bacter iol .44: 159-
166
非特許文献 7 : Victor、 TC. et aに 1996. J. Med. Microbiol. 44:332-339 非特許文献 8 : Morita、 Y . et. a I.2004. J. Med. Microbiol .53:813- 817 非特許文献 9 : Li u、 H. et a I.2003. Microbiol. I國 unol. 47:859-869 発明の開示
[0008] 通常、 ある遺伝子中の塩基配列が他の属の類縁菌に対して特異的であると ともに、 同一属内の菌種レベルで特異的であり、 しかも、 菌種内の株レベル においては当該塩基配列がある程度保存されているとき、 はじめてその遺伝 子だけで特定菌種を検出したり同定したりすることができる。 すなわち、 特 定の遺伝子が特定の菌種の検出や同定に用いることができるかどうかは、 網 羅的に特定菌種に含まれる多数の株について特定遺伝子の配列を決定しなけ ればならなかった。
[0009] しかしながら、 DnaJ遺伝子については、 特定の菌種ゃ血清型レベルで配列 が決定されているに過ぎず、 これら菌種内の株レベルでの配列情報について は報告されていない。 DnaJ遺伝子については、 上記のような網羅的な遺伝子 解析がなされていなかった。 したがって、 これまで、 DnaJ遺伝子が単独で菌 種の検出や同定に利用可能な特異的な塩基配列を有しているかどうかは不明 であった。 さらに、 菌株による多型があるため菌種で保存された配列を見出 すには多数の菌株の配列を決定する必要があった。
[0010] また、 細菌などの病原微生物を特定するのにあたっては、 複数 (2〜1 0 種類) 種類のプライマ一を、 当該プライマ一を個々に用いる場合と同じ濃度
(0. 2 M〜0. 8 M程度) で用いると、 プライマ一の競合が生じて、 増幅効率が低下して増幅産物が減少してしまい結果として増幅産物を検出で きなくなるという問題があった。 また、 プライマー濃度を下げれば増幅効率 が低下してしまい、 この場合も増幅産物を検出できなくなる。 したがって、 一度に組み合わせることのできる実用的なプライマーの種類は実質的には 6 種類程度であった。
[0011] また、 マルチプレックス P C Rを、 多種類のプライマ一によって実施する
には、 プライマーの特異性が重要である。 多種類の病原微生物に対応するマ ルチプレックス PC Rにおいては、 菌種特異的な配列をタ一ゲットとする必 要がある。 しかしながら、 多種類の病原微生物について、 同時に使用可能で 、 かつ菌種特異的なターゲットを増幅するプライマーを設計するのは極めて 困難であった。
[0012] 本発明は、 簡易に細菌の菌種を検出又は同定できる方法等及びこれに用い る核酸分子を提供することを一つの目的とする。 また、 本発明は、 高感度に 細菌の菌種を検出又は同定する方法等及びこれに用いる核酸分子を提供する ことを他の一つの目的とする。 さらに、 本発明は、 2種類以上の菌種を検出又 は同定することができる方法等及びこれに用いる核酸分子を提供することを 他の一つの目的とする。 また、 本発明は、 細菌などの微生物の迅速な検出に 適したマルチプレックス PCRによる微生物の増幅方法及びそのためのキッ ト等を提供することを一つの目的とする。
[0013] 本発明者らは、 680菌種 1250株について DnaJ遺伝子の配列決定を行い、 その 結果の比較から、 例えば、 16S rDNA遺伝子の菌種間の配列類似度が 95%以 上であるのに対し、 DnaJ遺伝子では、 ほとんどの属において菌種間の類似度 が 75〜 90%であることを見出し、 さらに、 同一種内の株レベルでの配列 情報から、 DnaJ遺伝子だけで菌種を決定できる特異的な塩基配列を抽出でき ることを見出し、 これらの知見に基づき本発明を完成した。 すなわち、 本発 明によれば、 以下の手段が提供される。
[0014] 本発明によれば、 細菌の菌種を検出する方法であって、 Staphy lococcus属 菌、 StreptococcusJh菌、 Klebsiel lafc菌、 Escher ichiaj禹菌、 Mycobacterium J禹菌、 Legionel la 菌、 Vibriof禹菌、 Baci I I usJh菌、 Neisser iajfc菌、 Camp ylobacter属菌、 Chlamydia属菌、 Chlamydophi I a属菌、 Mycoplasma属菌、 List eria 属菌、 Salmonel la属菌及び Yersinia属菌から選択される 1種又は 2種以 上の細菌の菌種を検出対象とし、
( a) 検出対象細菌菌種の核酸を含有する可能性のある被験試料と検出対
象細菌菌種の DnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダィズする核酸分子と を接触させる工程と、
( b) 前記核酸分子と前記被験試料中の核酸とのハイプリダイズの有無を 検出する工程と、
を備える方法が提供される。
[0015] この発明においては、 前記 (a) 工程は、 前記核酸試料と 2種類以上の菌 種の DnaJ遺伝子のそれぞれの少なくとも一部にハイプリダイズする 2種類以 上の前記核酸分子を同時に接触させる工程であることが好ましい。 また、 前 記核酸分子は、 同一種に属する菌株の DnaJ遺伝子の塩基配列をァラインメン トして抽出される 1種又は 2種以上の菌種特異的な塩基配列又は当該塩基配 列と実質的に同一である塩基配列を含むことができる。 さらに、 前記細菌の 菌種は Streptococcus pyogenes. Streptococcus agalactiae Streptococc us pneumoniae. Staphylococcus aureus, Klebsiel la pneumoniae, Escher i chia col i、 Mycobacterium tuberculosis. Mycoplasma pneumoniae, Mycop lasma genitar ium Vibrio cholerae、 Vibrio parahaemolyticus Vibrio v ulnificus、 Vibrio fluvial is Vibrio alginolytr icus Neisseria menin gitides、 Neisseria gonorrhoae Baci l lus cereus、 Chlamydia trachomat is、 Ch I amydoph i I a pneumoniae及び Campylobacter jejuniから選択される 1 種又は 2種以上とすることができる。 これらの特定の菌種を検出するのにあ たり、 特定の核酸分子を使用することができる。
[0016] た、 B'J'記細菌の菌禾里は、 Streptococcusj禹菌、 Staphylococcus^菌、 KI ebsiel la属鹵
、 Escher ichiaj禹菌、 Mycobacter i umjfc菌、 Legionel la属鹵、 Ghlamydiaj禹菌、 Chlamydophi I a属菌、 Neisseria属菌、 Mycoplasma 属菌から選択される 1種又 は 2種以上とすることができる。 これらの菌は肺炎及び/又は咽頭炎の原因 菌である B'J記細菌が Streptococcus pyogenes. Streptococcus agalactia e、 Streptococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus, KI ebsiel la pn eumoniae、 Escher ichi col i、 Mycobacterium tuberculosis, Legionel la p
neumophi la Chlamydia trachomatis Ch I amydoph i I a pneumoniae, Neisser ia gonorrhoae 、 Neisseria men ingi tides及び Mycoplasma pneumoniaeから選 択されるいずれかとすることができ、 その場合、 前記核酸分子は、 配列番号 1 〜42、 131〜134及び配列番号 89〜116から選択される 1種又は 2種以上に記載 の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができる。
[0017] た、 B'J'記細菌が Vibr ioj禹菌、 Gampylobacterr禹菌、 Staphylococcusj禹菌、 Baci l lus属鹵、 Escher ichiaj禹菌、 Listeria J禹菌、 Salmonel laf禹菌及び Yersi nia属菌から選択される 1種又は 2種以上とすることができる。 これらの菌は 、 下痢及び/又は食中毒の原因菌である。 前記細菌が Vibrio cholerae、 Vib r io mimicus、 Vibrio parahaemolyticus Vibrio alginolyticus、 Vibrio fluvial is、 Vibrio vulnificus Vibrio vulnificus Campylobacter jej uni、 Staphylococcus aureus, Baci I lus cereus及び Eshcer ichia col iから 選択されるいずれかであるとき、 前記核酸分子は、 配列番号 43〜70、 134、 配 列番号 87〜88、 97〜98、 101〜102及び 117〜130から選択される 1種又は 2種 以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことが できる。 た、 B'J記細菌が、 Listeria monocytogenesであるとき、 s'J記核酉 S 分子は、 配列番号 135、 136又は配列番号 137、 138に記載の塩基配列又はこれ と実質的に同一である塩基配列を含むことができ、 前記細菌が、 Salmonel la enter itidisであるとき、 前記核酸分子は、 配列番号 139、 140に記載の塩基配 列又はこれと実質的に同一の塩基配列を含むことができ、 前記細菌が Yersini a enterocol iticaのときには、 前記核酸分子は、 配列番号 143、 144に記載の 塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができる。
[0018] また、 ¾IJ記細菌が Neisser i a属菌、 Chlamydia属菌及び Mycoplasma属菌から 選択される 1種又は 2種以上とすることができる。 これらの菌は性病の原因 菌である。 B'J記細菌が Neisser i a gonorrhoae. Neisseria meningitides、 C h I amyd i a trachomatis及び Mycoplasma genitar ium のとき、 前記核酸分子は 、 配列番号 71〜86、 配列番号 105〜106及び 109〜114から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むこ
とができる。
[0019] 本発明によれば、 細菌を同定する方法であって、 Streptococcus属菌、 Stap hylococcusj禹菌、 Enterococcusj禹菌、 Peptostreptococcusj禹菌、 Klebsiel la J禹菌、 Escher ichi Γ禹菌、 Enterobacter属鹵、 Leg i one 11 aj禹菌、 Neisseriaj禹菌 、 Baci l lus属菌、 Hel icobacter属菌、 Gorynebacter i um属菌、 Pseudomonas属 菌、 Bur k holder i a属菌、 Haemophi I us属菌、 Bacteroides属菌、 Enterococcus 属菌、 Nocardia属菌、 Prevotel la属菌、 Neisseria属菌、 Moraxel la属菌、 Fla vobacter i um属菌、 Clostridium属菌、 Treponema属菌、 Sphingobacter ium属菌 、 Leptospi ra属菌、 Campylobacter属菌、 Listeria 属菌、 Salmonel la ®¾ び Yersinia属菌から選択される 1種又は 2種以上の細菌を同定対象とし、 ( a ) 同定対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試料中の DnaJ遺伝子の 少なくとも一部の塩基配列を取得する工程、 を備える、 方法が提供される。
[0020] この同定方法では、 (b) 前記被験試料から取得された DnaJ遺伝子の少な <とも一部の塩基配列と同定対象細菌の DnaJ遺伝子の塩基配列とを対比して 前記被験試料中の細菌の菌種を同定する工程を備えることが好ましい。
[0021] 本発明によれば、 細菌同定プログラムであって、 Streptococcus属菌、 Stap hylococcusj禹菌、 Enterococcusj禹菌、 Peptostreptococcusj禹菌、 Klebsiel la J禹菌、 Escher ichi Γ禹菌、 Enterobacter属鹵、 Leg i one 11 aj禹菌、 Neisseriaj禹菌 、 Baci l lus属菌、 Hel icobacter属菌、 Gorynebacter i um属菌、 Pseudomonas属 菌、 Bur k holder i a属菌、 Haemophi I us属菌、 Bacteroides属菌、 Enterococcus 属菌、 、 Nocardia属菌、 Prevotel la属菌、 Neisseria属菌、 Moraxel la属菌、 F lavobacter ium属菌、 Clostridium属菌、 Treponema属菌、 Sphingobacter ium属 菌、 Leptospira属菌及び Campylobacter属菌から選択される 1種又は 2種以上 の細菌を同定対象とし、 同定対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試 料中から取得された DnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と同定対象細菌 の DnaJ遺伝子の塩基配列とを対比して前記被験試料中の細菌の菌種を同定す るステップを 1又は 2以上のコンピュータに実行させるプログラムが提供さ れる。
[0022] 本発明によれば、 細菌を検出■同定するための核酸分子であって、 Strepto coccusfc菌、 Staphylococcus)禹菌、 EnterococcusJh菌、 Peptostreptococcus J禹菌、 Klebsiel lar禹菌、 Escher ichi Jh菌、 Enterobacterj禹菌、 Legionellas 菌、 Neisseria属菌、 Bacillus属菌、 Hel icobacter属菌、 Gorynebacter i um属 菌、 Pseudomonas属菌、 Bur k holder i a属菌、 Haemophi IUS SN Bacteroides 属菌、 Enterococcus属菌、 Nocardia属菌、 Prevotel la ®N Neisseria属菌、 Moraxella属菌、 Flavobacter ium属菌、 Clostridium属菌、 Treponema属菌、 Sp hingobacter ium属菌、 Leptospi ra属菌、 Campylobacter属菌、 Listeria 属菌 、 Salmonel la属菌及び Yersinia属菌から選択される 1種又は 2種以上の細菌 を検出■同定対象とし、 前記同定対象細菌の DnaJ遺伝子の少なくとも一部と ハイプリダイズする核酸分子が提供される。 前記核酸分子は遺伝子増幅用の プライマ一であってもよいし、 プローブであってもよい。 また、 これらの核 酸分子から選択される 1種又は 2種以上が固相に固定化された固定化体の形 態としてもよく、 これら核酸分子から選択される 1種又は 2種以上の核酸分 子を含む、 細菌の同定検出キットの形態としてもよい。
[0023] また、 本発明者らは、 プライマーの機能を 2つに分離することで微生物を 迅速かつ高感度に検出できることを見出した。 すなわち、 ターゲット核酸に 特異的にァ二一リングするとともにターゲット核酸とアニーリングしないタ グ配列を有する第 1のプライマ一セッ卜と、 第 1のプライマ一セッ卜に付し たタグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する第 2のプライマーセットとを 組み合わせることにより、 複数種類のターゲットを指向する複数のプライマ ーセットを同時に作用させた場合であっても、 十分な感度でターゲット配列 を検出できることを見出した。 また、 複数種類の微生物を検出可能なプライ マ一混合物 (以下、 カクテルプライマ一ともいう。 ) を構成するために、 各 種微生物の DnaJ遺伝子をターゲットとすることで菌種特異的なプライマーを 容易に設計することができ、 実質的に単一の P C R反応サイクルで増幅効率 よ <タ_ゲットを増幅して感度よく検出できることを見出し、 本発明を完成 した。 本発明によれば以下の手段が提供される。
[0024] また、 本発明によれば、 少なくとも 1種類のターゲット核酸を増幅する方 法であって、 タグ配列と前記ターゲット核酸に特異的な塩基配列とをそれぞ れ有する第 1のプライマ一セッ卜と、 前記タグ配列と実質的に同一のタグ配 列をそれぞれ有する少なくとも 1種類の第 2のプライマ一セッ卜とを用いて ポリメラーゼ連鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程を、 備える方法 が提供される。
[0025] 前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、 前記第 1のプライマ一セットによる前 記ターゲット核酸の増幅と前記第 1のプライマーセットによる増幅産物の前 記第 2のプライマ一セットによる増幅とを実施する工程とすることができる 。 また、 前記ポリメラ一ゼ連鎖反応工程は、 実質的に単一の PC R反応サイ クルを実施する工程とすることができる。
[0026] 前記ポリメラ一ゼ連鎖反応工程は、 前記第 1のプライマ一セッ卜のプライ マ一濃度は、 0. 005;UM以上 0. 1 M以下であり、 前記第 2のプライ マ一セッ卜のプライマ一濃度は、 前記第 1のプライマ一セッ卜のプライマ一 濃度の 1 0倍以上 50倍以下であり、 前記第 2のプライマ一セットによる増 幅産物が 250塩基以下の核酸であり、 単一の PC R反応サイクルを実施す る工程とすることができる。
[0027] 本発明によれば、 病原微生物のマルチプレックス PC Rによる診断方法で めって、 記炳照微生物は、 Staph y lococcusj禹菌、 Streptococcusfc菌、 Ser ratiajfc菌、 Klebsiel la属鹵、 Escher ichiaj禹菌、 Mycobacter i umJh菌、 Legion el la 属菌、 Vibrio属菌、 Baci l lus属菌、 Neisseria属菌、 Campylobacter属菌 、 Chlamydia属菌、 Chlamydophi I a属菌、 Mycoplasma属菌、 Listeria 属菌、 Sa Imonel la属菌及び Yersinia属菌から選択される 1種又は 2種以上であり、 前 記病原微生物由来の核酸を含有する可能性のある被験試料に対して、 タグ配 列と前記病原微生物が保持するターゲット核酸 (好ましくは D n a J遺伝子 上にある。 ) に選択的にァニールする塩基配列とを有する少なくとも 1種類 の第 1のプライマ一セッ卜と、 前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有 する少なくとも 1種類の第 2のプライマ一セッ卜とを用いてポリメラ一ゼ連
鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程と、 前記ターゲット核酸を含む 増幅産物を検出する工程と、 を備える方法が提供される。 この方法において は、 前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は単一の P C R反応サイクルを実施する 工程であることが好ましい。
[0028] 本発明によれば、 少なくとも 1種類の微生物のターゲット核酸をマルチプ レックス PC Rにより増幅するためのプライマ一セットを含むキットであつ て、 タグ配列と前記微生物が保持するターゲット核酸 (好ましくは D n a J 遺伝子上にある。 ) と選択的にァニールする塩基配列とを有する第 1のブラ イマーセッ卜と、 前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する第 2のプ ライマ一セットと、 を備える、 キットが提供される。
図面の簡単な説明
[0029] [図 1A]16SrDNA配列の比較について示す図。 両菌種では、 1 2塩基 (1. 2% ) しか違いがなかった。
[図 1B]DnaJ配列の多型を示す図。 両菌種では、 1 83塩基 (20. 6%) の 違いがあった。
[図 2]S. aureusの DnaJプライマ一配列を示す図。
[図 3]単独プライマ一 (プライマ一液 B) 及びマルチプルプライマ一 (プライ マー液 A) による増幅結果を示す図。
[図 4]Light Cycler (ロッシュ社)用の毛細管チューブで増幅した DNAを GYBR Gr eenの蛍光の増強をモニターした結果を示す図。
[図 5] P C R増幅産物をァガロース電気泳動で確認した結果を示す図。
[図 6]遺伝子増幅による検出感度を電気泳動法で比較した図。
[図 7]Light Cycler (ロッシュ社)用の毛細管チューブで増幅した DNAを GYBR Gr een の蛍光の増強をモニターした結果を示す図。
[図 8] Mycobacterium属菌の dnaJ遺伝子を 55菌種 3亜種の基準株を示す図。
[図 9] DnaJ遺伝子と RpoB遺伝子の配列を比較する図。
[図 10]各種遺伝子の塩基配列を比較する図。
[図 11]16S rDNA遺伝子及び DnaJ遺伝子の塩基配列の類似性を比較する図。
[図 12]各種菌株についての DnaJ遺伝子による同定結果と生化学的性状による 同定結果とを示す図。
[図 13]M. avium_M. intracel lulars group (MAC group)として総称されていた 臨床分離株 16株(図中の KPM株)についての DnaJ遺伝子の塩基配列に基づいて同 定した結果を示す図。
[図 14]本発明の増幅方法に用いる第 1のプライマ一セッ卜と第 2のプライマ —セットとタ一ゲット核酸との関係を示す図である。
[図 15]Legionel la pneumophiaG T C1279DNAをタ一ゲット核酸として設計し たプライマー配列を示す図である。
[図 16]実施例 8の PC Rにおける増幅モニタ一結果を示す図である。
[図 17]実施例 9の PC Rにおける増幅モニタ一結果を示す図である。
[図 18]下痢の細菌性病原微生物を検出対象とするプライマーの配列を示す図 である。
[図 19]下痢のウィルス性病原微生物を検出対象とするプライマーの配列を示 す図である。
[図 20]実施例 1 0でシリコン基板に固定化したプローブの配列を示す図であ る。
[図 21 ]実施例 1 0の P C R産物をシリコン基板上のプローブとハイプリダイ ゼーシヨンさせたときの蛍光を示す図である。
[図 22] S T D病原微生物を検出するためのプライマーの配列を示す図である
[図 23]実施例 1 1の P C R産物中の増幅産物の検出に用いたプローブの配列 を示す図である。
[図 24]実施例 1 1で得られたハイブリダィゼーシヨン産物の蛍光強度を示す 図である。
[図 25]実施例 1 2で調製した 4種類のプライマー混合物を構成するプライマ 一を示す図である。
[図 26]実施例 1 2で P C Rを行った結果の C Tmを示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0030] 本発明の検出方法によれば、 前記被験試料と、 検出しょうとする菌種の Dna J遺伝子の少なくとも一部とハイブリダイズする核酸分子とを接触させてハイ ブリダイズの有無を検出することにより、 特定菌種を検出することができる 。 DnaJ遺伝子は、 菌種間において類似度が低い一方、 同一菌種の菌株間にお いて一定以上保存されている。 このため、 菌種特異的な塩基配列を容易に抽 出でき、 当該塩基配列を用いることで容易に特定菌種を検出できる。 特に、 菌種間の類似度が低いため、 類縁種であっても感度よく特定菌種を検出する ことができる。 また、 菌種間類似度が低いために、 特異的なプライマー等を 設計できる。 この結果、 複数のプライマ一セットの混合物を用いても特定の 菌種を検出することができる。 したがって、 複数種のプライマ一セットを含 む 1種のプライマー混合物で複数の菌種を検出することができる。 なお、 Dna J遺伝子は生命維持に不可欠なハウスキーピング遺伝子であって全ての菌株が 保有している点において、 菌種の検出同定には有利である。
[0031] また、 本発明の同定方法によれば、 DnaJ遺伝子は、 菌種間において類似度 が低いため、 同定対象細菌の DnaJ遺伝子の塩基配列を決定又は所定のプロ一 ブとハイブリダィズさせること等により解析し、 既存の類縁菌種の Dna J遺伝 子の塩基配列の解析結果と比較等することに
より、 同定対象細菌の菌種を同定することができる。
[0032] 以下、 本発明の実施の形態について、 本発明の細菌の検出方法及び同定方 法並びにこれらの方法に用いる核酸分子等について詳細に説明する。
[0033] (細菌の検出方法)
(検出対象)
本発明の細菌の検出方法は、 Staphylococcusf禹菌、 Streptococcus属鹵、 KI ebsiel la属
菌、 Escher ichiaf禹菌、 Mycobacter i um属鹵、 Legionel la J禹菌、 Vibrioj禹菌、 Baci I I us属菌、 Neisseria属菌、 Campylobacter属菌、 Chlamydia属菌、 Chi a mydophi la属菌、 Mycoplasma属菌、 Listeria 属菌、 Salmonel la ®¾t Yersi
nia属菌から選択される 1種又は 2種以上の菌の菌種を検出対象としている。 これらの属に属する菌種においては、 DnaJ遺伝子の塩基配列は 16S rDNA遺伝 子の塩基配列よりも類似度が低いため、 同一菌種内の株の間で保存されてい る菌種特異的な塩基配列を見出すのが容易であり、 DnaJ遺伝子を用いて菌種 を検出するのに適している。 例えば、 DnaJ遺伝子については、 Stapylocuccu s属菌においては 16S rDNAでは菌種間で平均 97.4%であるが DnaJは菌種間で平 均 77. 6%、 Streptococcus属菌においては 16 S rDNAでは菌種間で平均 95. 8%であるが DnaJは同平均 76. 4%、 Mycobacter i um属菌においては 16 S rDN Aでは菌種間で平均 93%であるが DnaJは同平均 83. 7 %、 Legionel la属菌に ついては 16S rDNAでは菌種間で平均 96.1%であるが DnaJは同平均 82.5%であ る。 Vibrio属菌については 16S rDNAでは菌種間で平均 97.4%であるが DnaJは 同平均 82%、 Aeromonas属菌については 16S rDNAでは菌種間で平均 98.8%で ある力《DnaJは同平均 89. 8%、 Fami ly Enterobacter iaceae科につし、ては 1 6S rDNAでは菌種間で平均 97.1%であるが DnaJは同平均 87. 6 %の配列類似 度となっている。
[0034] なかでも、 検査対象菌種は、 Klebsiel la属菌、 Escher ichia属菌、 Vibrio属 菌、 Baci I I usj禹菌 Neisseriaj禹菌、 GampylobacterJh菌、 Ghlamydiafc菌、 Ch lamydophi la Mycoplasma属菌、 Listeria 属菌、 Salmonel la S¾t Yer sinia属菌の菌種とすることが好ましい。 これらの属については、 遺伝子工学 的手法による菌種の検出や同定が困難であつたが、 DnaJ遺伝子の利用により 遺伝子工学的に検出や同定が可能となったからである。
[0035] また、 16S rDNAが極めて類似している腸内細菌科 Fami lyである Enterobacte riaceaeのなかでも、 属中の菌種別に違いを見ると Klebsiel la属の 4つの菌種 では、 16S rDNAは 1.4%の
違いしかないが、 DnaJでは 7. 8%の違いがある。 さらに、 Serratia属では 1 6S rDNAで 2.3%であるのにたいして、 DnaJでは 5.5%、 Salmonel la属では 16S r DNAは 1.4%、 DnaJは 6. 3%と多型が大きくなつている。 このように、 DnaJ遺伝 子を用いればより適切に菌を検出したり菌種を同定することができる。
[0036] 本発明の検出方法においては、 複数種類の菌種をそれぞれ検出する核酸分 子の混合物を用いることで、 2種類以上の菌種を検出対象菌種することもでき る。 DnaJ遺伝子の塩基配列が属間及び菌種間で類似度が低く、 菌株間で類似 度が高い配列部位があるため、 互いに干渉しないで DnaJ遺伝子をハイプリダ ィズする核酸分子を設計できるからである。
[0037] (被験試料)
本発明の検出方法は、 (a ) 検査対象細菌の核酸を含有する可能性のある 被験試料と検出しょうとする菌種の DnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイプリ ダイズする核酸分子とを接触させる工程を備えることができる。 ここで、 被 験試料は、 菌種を検出しょうとする検査対象細菌の核酸を含有する可能性が あればよく、 特に限定されないが、 例えば、 血液、 血清、 ヒトを含む動物か ら採取された細胞又は組織、 便や尿などの排泄物、 痰、 井戸水、 食品などが 挙げられる。 被験試料は、 こうした採取物等から核酸を抽出した核酸抽出試 料であってもよいし、 さらに、 DnaJ遺伝子又はその一部 (検出しょうとする 領域を含む) の増幅産物を含む試料であってもよい。
[0038] (核酸分子)
本発明方法で用いることのできる核酸分子としては、 同一種に属する菌株 の DnaJ遺伝子の塩基配列をァライメントして抽出される 1種又は 2種以上の 菌種特異的な塩基配列を含むことができる。 こうした核酸分子によれば、 菌 種特異的であり、 かつ当該菌種に属する株を確実に検出することができる。 なお、 こうしたァライメント及び特徴的配列の抽出には、 DNAS I S pro ver. ( 日 Iiソフ卜) 、 Beacon des i gnerver. 5. 1 (Mo l ecu l ar beacon社)及び G l usta l W (Free soft)などのソフトウエアを利用することができる。
[0039] 核酸分子は、 抽出された菌種特異的な塩基配列を 1つ含んでいてもよいし 、 2以上含んでいてもよい。 また、 核酸分子は、 こうして抽出された菌種特 異的な塩基配列と実質的に同一である塩基配列を含むことができる。 ここで 、 実質的に同一である配列とは、 当該塩基配列に基づく DnaJ遺伝子とのハイ プリダイゼーシヨンの特異性を維持できる範囲で改変された塩基配列が挙げ
られる。 たとえば、 当該塩基配列と相補的な塩基配列や、 当該塩基配列にお いて、 1又は 2以上の塩基が置換、 挿入、 欠失及び付加から選択された 1種 又は 2種以上の形態で改変された塩基配列が挙げられる。 また、 こうした改 変は、 特定菌株の DnaJ遺伝子の塩基配列に対応させて行われていてもよい。
[0040] 核酸分子は具体的には、 こうした特異的な塩基配列からなる又はこうした 塩基配列を含むプライマーやプローブである。 核酸分子は、 塩基配列に基づ <ハイプリダイゼーシヨンが可能であれば特に限定されない。 核酸分子とし ては、 DNA、 RNA、 DNA-RNAキメラ、 修飾塩基等を含む人工核酸、 ペプチド核酸
(PNA) のいずれの形態を採ることができるが、 典型的には DNAである。 また 、 こうした核酸分子は、 各種の蛍光色素や蛍光色素のクェンヤー等で修飾さ れていてもよい。
[0041 ] 次に、 菌種毎に好ましい核酸分子を例示する。 細菌が Streptococcus pyoge nesのとき、 配列番号 1〜4 (プライマー) 及び配列番号 89〜90 (プローブ) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一 である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 また、 前記細菌が Streptococc us aga l act i aeのとき、 配列番号 5〜8 (プライマ一) 及び配列番号 91〜92 (プ ローブ) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質 的に同一である塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列又は当該塩 基配列と実質的に同一の塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Strep tococcus pneumon i aeのとき、 配列番号 9〜12 (プライマ一) 及び配列番号 93 〜94 (プローブ) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこ れと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Staph y l ococcus aureusのとき、 配列番号 13〜1 6 (プライマ一) 及び配列番号 97〜9 8 (プローブ) の 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一 である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が K l ebs i e l l a pneumon i ae のとき、 配列番号 1 7〜2 0 (プライマ一) 及び配列番号 109〜1 10 (プライ マー) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的 に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Escher i ch i co l
iのとき、 前記核酸分子は、 配列番号 21〜24 (プライマー) 及び配列番号 101 〜102 (プローブ) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこ れと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Mycob acterium tuberculosisのとき、 前記核酸分子は、 配列番号 25〜28 (プライマ -) 及び配列番号 103〜104 (プローブ) から選択される 1種又は 2種以上に 記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙 げられる。 細菌が Mycobacterium spp. (ただし、 Μ· tuberculosiグループを除 <) のとき、 前記核酸分子は、 配列番号 29〜30 (プライマー) 及び配列番号 1 31〜133 (プライマ一) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又 はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が L egionel la 卩116111110卩1^ 13のとき、 配列番号 35〜38 (プライマ一) 及び配列番号 115〜116 (プローブ) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又 はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が V ibrio choleraeのとき、 前記核酸分子は、 配列番号 43〜46 (プライマ一) 及 び配列番号 127〜128 (プローブ) から選択される 1種又は 2種以上に記載の 塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられ る。 細菌が Vibrio mimicusのとき、 前記核酸分子は、 配列番号 43、 配列番号 47〜49 (プライマ一) 及び配列番号 125〜126から選択される 1種又は 2種以 上に記載の塩基配列 (プローブ) 又はこれと実質的に同一である塩基配列を 含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Vibrio parahaemolyticusのとき、 前記核 酸分子は、 配列番号 43、 配列番号 50〜52 (プライマー) 及び配列番号 123〜1 24 (プローブ) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれ と実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Vibrio vulnificusのとき、 前記核酸分子は、 配列番号 43、 配列番号 53〜55 (プライ マー) 及び配列番号 119〜120 (プローブ) から選択される 1種又は 2種以上 に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が 挙げられる。 細菌が Vibrio fluvial isのとき、 前記核酸分子は、 配列番号 43 、 配列番号 134、 配列番号 56〜57 (プライマー) 及び配列番号 117〜118 (プ
ローブ) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質 的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Vibrio algino lyticusのとき、 配列番号 43、 配列番号 58〜60 (プライマー) 及び配列番号 12 1〜122 (プライマ一) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又 はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が B aci l lus cereusのとき、 配列番号 61〜66 (プライマ一) 及び配列番号 87〜88 (プローブ) から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと 実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Gampyloba cter jejuniのとき、 前記核酸分子は、 配列番号 67〜70 (プライマー) 及び配 列番号 129〜130 (プライマー) の 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこ れと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Neiss eria meningitidisのとき、 配列番号 83〜86 (プライマ一) 及び配列番号 111 〜112 (プローブ) の 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に 同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Neisseria gonorro haeのとき、 配列番号 79〜82 (プライマ一) 及び配列番号 113〜114 (プローブ ) の 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基 配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Gh I amyd i a
trachomatisのとき、 配列番号 75〜78 (プライマ一) 及び配列番号 109〜110 ( プローブ)
の 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配 列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が、 Gh I amydoph i I a pneumoniaeのとき 、 前記核酸分子は、 配列番号 39〜42 (プライマー) 及び配列番号 107〜108 ( プローブ) の 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一で ある塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Mycoplasma genitariumの とき、 配列番号 71〜74 (プライマー) 及び配列番号 105〜106 (プローブ) の 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列 を含む核酸分子が挙げられる。 細菌が Mycoplasma pneumoniaeのとき、 配列番 号 31〜34 (プライマ一) 及び配列番号 95〜96 (プローブ) の 1種又は 2種以
上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子 が挙げられる。
[0042] 肺炎、 咽頭炎の原因菌の検出にあたっては、 Streptococcus属菌、 Staphylo coccusfc菌、 Klebsiel laj禹菌、 Escher ichiaj禹菌、 Mycobacter i umjfc菌、 Legi onel la属菌、 Chlamydia属菌、 Chlamydophi I a属菌、 Neisser i a属菌及び Mycopl asma 属菌から選択される 1種又は 2種以上を検出対象とすることができる。 このとき、 細菌が Streptococcus pyogenes. Streptococcus agalactiae S treptococcus pneumoniae. Staphylococcus aureus, Klebsiel la pneumo niae、 Escher ichi col i、 Mycobacterium tuberculosis, Legi one I la pneum ophi la、 Chlamydia trachomatis Ch I amydoph i I a pneumoniae. Neisseria g onorrhoae 、 Neisseria men ingi tides及び Mycopl asma pneumoniaeから選択さ れるいずれかであるとき、 前記核酸分子としては、 配列番号 1〜42、 131〜133 及び配列番号 89〜116から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又は これと実質的に同一である塩基配列を含む核酸分子が挙げられる。 これらの うち、 2種類以上又は 3種類以上の菌種の各 DnaJ遺伝子に対応するプライマ ーセットを組み合わせることが好ましい。
[0043] また、 下痢、 食中毒の原因菌の検出にあたっては、 Vibrio属菌、 Gampyloba cterjfc菌、 Staphylococcus)禹菌、 Baci l lusj禹菌、 Escher ichiaj禹菌、 Listeria 属菌、 Salmonel la属菌及び Yersinia属菌から選択される 1種又は 2種以上を 検出対象とすることができる。 このとき、 細菌が Vibrio cholerae、 Vibrio mimicus、 Vibrio parahaemolyticus Vibrio alginolyticus、 Vibrio f luv ial is、 Vibrio vulnificus. Vibrio vulnificus, Campylobacter jejuni 、 Staphylococcus aureus, Baci I lus cereus及び Eshcer ichia col iから選 択されるいずれかであるとき、 前記核酸分子としては、 配列番号 43〜70、 134 、 配列番号 87〜88、 97〜98、 101〜102及び 117〜130から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含む核 酸分子が挙げられる。 また、 細菌が、 Listeria monocytogenesであるとき、 前記核酸分子は、 配列番号 135、 136又は配列番号 137、 138に記載の塩基配列
又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができ、 前記細菌が、 Sal monel la enter itidi sであるとき、 前記核酸分子は、 配列番号 139、 140に記載 の塩基配列又はこれと実質的に同一の塩基配列を含むことができ、 前記細菌 が Yersinia enterocol iticaのときには、 前記核酸分子は、 配列番号 143、 144 に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列を含むことができ る。 これらのうち、 2種類以上又は 3種類以上の菌種の各 DnaJ遺伝子に対応 するプライマ一セットを組み合わせることが好ましい。
[0044] また、 性病の原因菌の検出にあたっては、 Neisseria属菌、 Chlamydia属菌 、 あるいは Mycoplasma属菌から選択される 1種又は 2種以上を検出対象とす ることもできる。 このとき、 Neisseria gonorrhoae Neisseria meningitid es、 Chlamydia trachomatis及び Mycoplasma genitar iumのとさ、 B'J記核酸分 子としては、 配列番号 71〜86、 配列番号 105-106及び 109-114から選択される 1種又は 2種以上に記載の塩基配列又はこれと実質的に同一である塩基配列 を含む核酸分子が挙げられる。 これらのうち、 2種類以上又は 3種類以上の 菌種の各 DnaJ遺伝子に対応するプライマーセットを組み合わせることが好ま しい。
[0045] 以下に、 核酸分子に適用するのに好ましい塩基配列を検出対象細菌名とと もに列挙する。 なお、 プライマーとして利用するものは、 基本的にフォヮ一 ドプライマ一とリバースプライマーの順で 1セットとなるように記載した。
[0046] (プライマーとして利用するのに好ましい核酸分子の塩基配列)
(気道感染の原因菌のプライマー)
Streptococcus pyogenes
配列番号 01: 5-ATAAGGATGTTCAAGAAGCTTACG
配列番号 02: 5-CACCAAAGCCGCCTTGAG
配列番号 03: 5-TTTTGAAGAGGCTGTATTTGG
配列番号 04: 5-GAGCGGTACCAGGTTTTG
Streptococcus agalactiae
配列番号 05 : 5-GCTTATGAAACCTTGAGTGATAC 配列番号 06: 5-AAACCGCCACCATCGAAG 配列番号 07: 5-GGAGATGACCTACAATATCG 配列番号 08: 5-GGCTAGTACCTGGCTTAG
Streptococcus pneumoniae
配列番号 09 : 5-GCCTATGAGACTTTGAGTGAC 配列番号 10 :5-ACCAGCTCCACCAAAACC 配列番号 11 : 5-GCAATCCAAACGCTCCTC 配列番号 12 :5-TGTACGACAGCCAGCTTC
Staphylococcus aureus
配列番号 13 : 5-GGACAAGGATTCAATGGCTCT 配列番号 14 : 5-TTGCGGTGCATTTGGATCTCT 配列番号 15: 5- GAAGCGGTATTTGGTACAAC 配列番号 16: 5- GCCATTACAGTAACTACAAGTC
Klebsiel la pneumoniae
配列番号 17: 5-CCCTGTCGGTTAAAATTCC 配列番号 18: 5-CTCAAAGATAGCGTGCTG 配列番号 19: 5-GCGTAGAAAAGACCAAAACC 配列番号 20: 5- CAGGTTCAGGTGAAGCAG
Escher ichia col u
配列番号 21 : 5-TGTTGAGCGCAGCAAAAC 配列番号 22: 5-CAAGACGGATGCGGTCTC 配列番号 23: 5- CTCGAAGAAGCTGTACGTG 配列番号 24: 5- CTGTGTACCTGGTTTTGC
Mycobacterium tuberculosis
配列番号 25: 5- GTTCGACAGCGGCTTTGG 配列番号 26: 5- GAACAAGTCGTTGAGGTTGAAC 配列番号 27: 5-AAGACTTCTACCAGGAGCTG 配列番号 28: 5-ACTTCCGATAGGCACGTTT
Mycobacterium spp. (M. tuberculosis以外) 配列番号 29: 5-CGIGARTGGGTYGARAARG 配列番号 30: 5-GGIGAYYTITTCGGIGGIYT 配列番号 131:5- GTGARTGGGTCGARAARGACT 配列番号 132:5- CGI GTYTCGTCGTAYTCCTT 配列番号 133: 5-CAGCGRTTACCYGCCCA
Mycoplasma pneumoniae
配列番号 31 : 5- AGCTTGCTATGCAGTACC 配列番号 32: 5- CTCTTTAAACTTCTCTTCGTTTTG 配列番号 33: 5-TTGAGATGACTAATGGTTGTACTC 配列番号 34: 5- CCCTTCAGCCCCAAAACC
Leg i one I la penumophi la
配列番号 35: 5- ACTGTTTGTGAGGGATCG 配列番号 36: 5- AAAACCTTGTTGAATTCTGAC 配列番号 37: 5- TTGAAGAAGCGGCTATAGG 配列番号 38: 5- CTCACAAACAGTACAAGTACC
Ch I amydoph i I a pneumon i ae
配列番号 39: 5- TCTCAGTGATCCTCAGAA
配列番号 40: 5-CCAAAGGCTCCCATGAAAG
配列番号 41 : 5- TTTGGAATGCGCTCAGATC 配列番号 42: 5- GCTTCTTCAAAAGTCAAATTAATATG (下痢食中毒をおこす菌のプライマー)
Vibrio chol erae
配列番号 43 : 5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA 配列番号 44 : 5-AGCAGCTTATGACCAATACGCC 配列番号 45: 5- AAACACGTCACCGAAAATATC 配列番号 46: 5- TTATGACCAATACGGCCATG
Vibrio mimicus
配列番号 43 : 5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA 配列番号 47 : 5 -YCTTGAAGAAGCGGTTCGTGCA 配列番号 48: 5-ATATCGCCAAAGTCAG
配列番号 49: 5-GCATCGGTCAGAATTTCATAC
Vibrio parahaemolyticus
配列番号 43 : 5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA 配列番号 50 : 5-TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAG 配列番号 51 : 5- CCAAAGATGTCGCCGAAG
配列番号 52: 5- CGAAGTTCTAACCGACTCTC
Vibrio vulnificus
配列番号 43: 5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA 配列番号 53: 5-GTACGAAATTCTGACCGATCAA 配列番号 54: 5-CCACCGCCTTGTTCAAAAG
配列番号 55: 5-ACGAAATTCTGACCGATCC
Vibrio fluvial is
配列番号 43: 5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA 配列番号 134: 5-GTACGAAATTCTGACCGATCAA 配列番号 56: 5-CAATCTCTTTCGAGCAACCAC 配列番号 57: 5-CAACGTGGTGCGGATCTG
Vibrio alginolyticus
配列番号 43 : 5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA 配列番号 58 : 5-GATCGAAGTRCCRACACTMGGA 配列番号 59: 5- CCGAATACATCGCCAAAG 配列番号 60: 5- ATGCTGCTTTTGAACAAGG
Baci 11 us cereus
配列番号 61 : :5-GATCAATTTGGTCATGCTGGT 配列番号 62: 5-GAAGCCACCACCGAAGTC 配列番号 63: 5- AAAGCGTATCGTCGTTTGG 配列番号 64: 5- ATCATCACTTAACACTTCATATGC 配列番号 65: 5-CGCAGTACGATCAATTTGG 配列番号 66: 5-CAAAGAAAGAACTAAATATATCTTC
Campylobacter jejuni
配列番号 67 : 5-TACTTATAAATGCTCTTGTAAAAC 配列番号 68 :5-CTTTGGACAAGTTTGAAG
配列番号 69: 5- TAGACTTTACTTATAAATGCTCTTG 配列番号 70: 5- GACACTTTGGACAAGTTTG
(性病の原因菌のプライマー)
Mycoplasma genitar ium
配列番号 71 :5- GAAGGGTTAAATGCTTCTGG
配列番号 72 :5-CACCATCCATTCCAAAGG
配列番号 73: 5- AAGGGATTATTATGAAGTTCTAGGG
配列番号 74: 5- CATTTTCTGCTTTATGACGATC
Ch I amydoph i I a trachomatis
配列番号 75 :5-GGGATTTCCTTCTTGATCC
配列番号 76 : 5-CATGGGGATGATTTAGTTTTAG
配列番号 77: 5- AAAGAAACCGCCTCCATTA
配列番号 78: 5- GCATGGGGAATATGGAAGAC
Neisseria gonorrhoae
配列番号 79 : 5-GGCGGGGAGTTAGAAGTG
配列番号 80: 5-GACACCCTTACCTTTCACG
配列番号 81 : 5- CGGGCAAACATATTAAAGAACC
配列番号 82: 5- CGGGAATATTGACTTCCAC
Neisseria meningitidis
配列番号 83: 5-TTGGAAGTGCCGACCTTG
配列番号 84: 5-GATTTGACACCCTTACCCTTCG
配列番号 85: 5- GGGCAAACACATTAAAGAACC
配列番号 86: 5- GCGGGAATATTGACTTCCA
(プローブとして利用することが好ましい核酸分子の塩基配列) Baci 11 us cereus:
配列番号 87: TTACCATCCAGACGTAAGTAAAGAAGAA
配列番号 88: TTAGCCACCGCCGAAGTCTCCTCC
Streptococcus pyogenes
配列番号 89: TTCGCCGTATTGATCATAAGCAGCA
配列番号 90: TTCCTGAGCCTAAACAAGTGCCG
Streptococcus agalactiae
配列番号 91 : TTAAAACCGCCATTTGCCCCAG
配列番号 92: TCTTCCTGAACAAGTATGACATGATGAC
Streptococcus pneumoniae
配列番号 93: TTCGTGCTGCCTATGACCAGTATG 配列番号 94: TCGATGATACTTAACTTCCTTCTCAGT
Mycoplasma pneumoniae
配列番号 95: TACAGTCTCACCCTCACCCTTATG 配列番号 96: TTCACAGGCACTACAGGTCACC
Staphylococcus aureus:
配列番号 97: TTCAATCCGTAAAGATGTAACATGCG 配列番号 98: TTCAATCCGTAAAGATGTAACATGCGAA
Klebsiel la pneumoniae
配列番号 99: TTCGTACAGATCGCCTGCCG
配列番号 100: CGCGCCGGCAGGCGATCTGTACGT
Eshcer ichia col i
配列番号 101 AAGAGATCCGCATTCCGACTCTGGAAG 配列番号 102: TTAAGAGATCCGCATTCCGACT
Mycobacterium tuberculosis
配列番号 103: TCGGGGTCGGTGGAGACGGCG
配列番号 104: TTCTCCTCTGATGCCAGTCCTGAAGA
Mycoplasma genitar ium
配列番号 105: TAGCAGGGTTTAATCCTTTTGACATCT 配列番号 106: TAAACGCTAGTTCTCAAGACATAAA
Ch I amydoph i I a pneumon i ae
配列番号 107: TTCGCAAGGCATCTTCCATGTTCC 配列番号 108: TTTCTTACTGGCTCCTTGACGA
Chlamydia trachomatis
配列番号 109: TTAGCCGCATCAACAAATCCAATAGG 配列番号 110: TTACCGAAATCGCCGCCAAA
Neisseria meningitidis
配列番号 111 : TTCTTGACCGCCTTATTCCGCC 配列番号 112: TGCCGTGGCGCGGGGCGGAATA
Neisseria gonorrhoeae
配列番号 113: TTCTTGACCGCCTTATTCCGCC 配列番号 114: TGCCGTGGCGTGGGGCGGAATA
Leg i one I la pneumophi la
配列番号 115: TAAGAAGTTGAAATTACCGTTCCAAGAC 配列番号 116: AAAGAAGTTGAAATTACCGTTCC
Vibrio fluvial is
配列番号 117: TTCCAGCGTCAGTTCCATGTTG
配列番号 118: : TCGAGCAGCCGCGTACCGCTTCT
Vibrio vulnificus
配列番号 119: TCCATATTGATCGTAAGCCGCT
配列番号 120: TCGAGACACCACGAACGGCCTCT
Vibrio alginolyticus
配列番号 121 : TTAATCAGCACCGCCGCCAC
配列番号 122: TCGTTACACCACGAACCGCTTCT
Vibrio parahaemolyticus
配列番号 123: TTCAGCACCGCCTCCACCAA
配列番号 124: TAGTTACACCACGAACGGCTTCT
Vibrio mimicus
配列番号 125: TTCGAAGCCGCCGCCACCAA
配列番号 126: : TCGAACATCCACGAACCGCTTCT
Vibrio chol erae
配列番号 127: TTAATCAGCACCGCCACCGC
配列番号 128: TCGAGCAGCCGCGAACCGCTTCT
Campylobacter jejuni
配列番号 129: TGTAATGGAACAGGGGCTA
配列番号 130: TCCATCTTTAGCCCCTGTTCCAT
被験試料と核酸分子とを接触させるには、 被験試料中に含まれる可能性の ある検出対象の DnaJ遺伝子と核酸分子とをハイブリダィズ可能な状態におけ ばよい。 例えば、 液相内で両者を共存させてもよいし、 一方を固相に結合さ
せて他方を当該固相に接触する液相に含めるようにしてもよい。 後述するよ うに、 こうした接触を実現する工程は、 P C R、 R T— P C R法、 転写介在 増幅法 (T M A法) 、 分枝 DNA法 (bDNA法) 、 リアルタイム P C R法、 リガ一 ゼ連鎖反応法 (L C R法) などの遺伝子増幅法、 サザンブロッテイング法、 マイクロアレイ法、 マイクロビーズ法、 核酸 (DNA) クロマトグラフィなどの 核酸のハイブリダィゼーシヨンに基づく塩基配列の検出法の一部として実施 することができる。 使用する核酸分子がプライマーとして設計されているか あるいはプローブとして設計されているか等によっても本工程に用いる手法 を適宜選択することができる。
[0051 ] 本発明方法は、 核酸分子と被験試料中の核酸とのハイブリダィズの有無を 検出する工程を備えることができる。 こうしたハイブリダィズの有無を検出 するには、 例えば、 ( 1 ) 核酸分子と被験試料中の核酸との特異的なハイブ リダィズの有無の直接的な検出、 (2 ) 核酸分子と被験試料中の核酸との特 異的ハイブリダィズに基づく遺伝子増幅反応の有無、 (3 ) 遺伝子増幅反応 産物中の特定塩基配列の有無の検出等により行うことができる。
[0052] 上記 (1 ) の場合、 例えば、 核酸分子及び被験試料から抽出した核酸の少 なくとも一方に検出可能なシグナルを発する標識化合物あるいはハイブリダ ィズを介したインタ一カレ一シヨン等によりシグナルを生じる変化を生じる シグナル形成化合物を付加しておくことで、 ハイブリダィゼ一シヨンを検出 することができる。 ハイブリダィズ産物を効率的に検出するには、 核酸分子 又は被験試料中の核酸を固相に結合しておくことが好ましい。 こうした検出 は、 サザンブロッテイング法、 マイクロアレイ法、 マイクロビーズ法 (フロ —サイ トメータ一) 、 核酸 (DNA) クロマトグラフィなどの核酸のハイブリダ ィゼーシヨンに基づく塩基配列の検出法として実施することができ、 核酸分 子はプローブの形態を採ることができる。
[0053] 上記 (2 ) の場合、 例えば、 核酸分子をプライマーとして機能させて DnaJ 遺伝子を錶型として特異的にハイブリダィズした核酸分子を伸張させ、 所定 の増幅産物が得られたか否かを電気泳動等で検出することができる。 こうし
た遺伝子増幅及び検出は、 P CR、 RT— P CR法、 転写介在増幅法 (TM A法) 、 分枝 DNA法 (bDNA法) 、 リアルタイム P C R法、 リガ一ゼ連鎖反応 法 (L CR法) などの遺伝子増幅法あるいは増幅産物の検出法として実施で きる。 なお、 P CRを用いる方法については後段にて詳述する。
[0054] 上記 (3) の場合、 上記 (2) と上記 (1) とを組み合わせて実施すること ができる。 例えば、 一定範囲の属あるいは菌種に特異的なプライマーを核酸 分子として用いて遺伝子増幅産物を得、 さらに、 この遺伝子増幅産物に対し て特定菌種に特異的なプローブを核酸分子として用いてハイブリダィズの有 無を検出することができる。
[0055] (細菌の同定方法)
本発明の細菌の同定方法は、 同定対象細菌あるいはその核酸を含有する可 能性のある臨床サンプルなどの被験試料中の DnaJ遺伝子の少なくとも一部の 塩基配列を取得する工程、 を備えることができる。 DnaJ遺伝子の少なくとも 一部の塩基配列を取得することで、 同定対象細菌の菌種を同定することが可 能である。 また、 その系統樹を作製することもできる。 細菌の検出方法にお いて検出対象とするのに好ましい細菌の菌種は、 Streptococcus属菌、 Staphy lococcus属鹵、 Enterococcusj禹菌、 Peptostreptococcusj禹菌、 Klebsiel las 菌、 Escher ichi j禹菌、 EnterobacterJh菌、 Legionel la属鹵、 Neisser iaj禹菌、 Baci l lus属菌、 Hel icobacter属菌、 Gorynebacter i um属菌、 Pseudomonas属菌 、 Burkholder ia属菌、 Haemophi IUS SN Bacteroides属菌、 Enterococcus属 菌、 Nocardia属菌、 Prevotel la属菌、 Neisseria属菌、 Moraxel la属菌、 Flavo bacterium属菌、 Clostridium属菌、 Treponema属菌、 Sphingobacter ium属菌、 Leptospi ra属菌、 Campylobacter属菌、 Listeria 属菌、 Salmonel 18属菌及び丫 ersinia属菌である。 DnaJ遺伝子は、 これらの細菌において多様性のある遺伝 子であるため、 菌種を同定するのに有用である。 DnaJ遺伝子の塩基配列を取 得するにあたり、 上記した核酸分子をプライマーとして得られる P C R増幅 産物や上記した核酸分子をプローブとして用いて得られるハイブリダィゼー シヨン産物の塩基配列を取得してもよい。
[0056] 塩基配列の取得にあたっては、 P C R法等で取得した遺伝子の少なくとも —部について公知の手法によるシークェンサ一による塩基配列決定法や所定 の塩基配列を有するプローブとハイブリダィゼーシヨンさせることによる方 法 (マイクロアレイ等の利用) が挙げられる。
[0057] 被験試料から取得された DnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列に基づい て菌種を同定する際には、 取得した塩基配列と予め取得しておいた同定対象 細菌の DnaJ遺伝子の塩基配列とを対比することが好ましい。 すなわち、 菌種 の同定に際しては、 予め、 各種細菌の DnaJ遺伝子の全部あるいは一部につい ての塩基配列のデータベースを準備しておくことが好ましい。 こうしたデ一 タベースを予め準備しておくことで、 速やかに菌種を同定できる。 また、 菌 種内の各種菌株についての DnaJ遺伝子の塩基配列に関する情報を含むデータ ベースを準備しておくことが好ましい。 こうしたデータべ一スによれば、 菌 株に共通であって菌種特異的な塩基配列を容易に抽出することができる。 こ うして抽出された塩基配列を用いることにより、 容易にかつ正確に菌種と同 定することができる。 また、 同時に、 系統樹の作成にも都合がよい。
[0058] 特に、 DnaJ遺伝子による菌種の同定にあたっては、 被験試料について 1 6S r DNAの塩基配列を取得する工程を先立って行うことが有用である。 1 6S rDNA遺 伝子の塩基配列において類縁菌種と高い類似度であっても DnaJ遺伝子につい ては類似度が低いからである。 例えば、 予め 1 6S rDNA遺伝子について最も類 似度の高い菌種候補 (菌種は 1種類であってもよいし、 2種類以上であって もよい。 ) を決定し、 こうして決定された候補菌種の DnaJ遺伝子と分離株な どの被験試料中の DnaJ遺伝子の塩基配列を決定することにより、 簡易かつ迅 速に分離株の菌種を同定することができる。 また、 1 6S rDNA遺伝子によって 同定可能なときには、 DnaJ遺伝子による同定をする必要もない。 このような 手法を採用する場合の既存菌種の 1 6S rDNA遺伝子との類似度は特に限定しな いが、 分離株と既存の菌種との 1 6S rDNA遺伝子の塩基配列が 98%以上類似し ているときに、 DnaJ遺伝子の塩基配列について当該既存の菌株と分離株とを 対比することが好ましい。
[0059] 1 6S rDNA遺伝子の塩基配列の取得にあたっては、 DnaJ遺伝子の塩基配列の 取得と同様、 適宜公知の手法を用いることができる。 また、 被験試料中の 1 6S rDNA遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と既存の菌種の 1 6S rDNA遺伝子の塩 基配列とを対比することで、 これらの間の塩基配列類似度を取得することが 好ましい。 その際、 各種の菌種又は菌株についての 1 6S rDNA遺伝子の塩基配 列のデータベースを予め準備しておくことが好ましい。
[0060] なお、 被験試料中の Dna J遺伝子等の塩基配列を解析するのにあたっては、 同定対象細菌の採取源は特に限定されないが、 既に説明したような臨床サン プルなどを含む被験試料を用いることができる。 また、 既に説明した細菌の 検出方法と同様に、 細菌の核酸抽出物あるいは細菌遺伝子の所定領域の増幅 産物を被験試料とすることができる。
[0061 ] また、 以上のことから、 本発明によれば、 DnaJ遺伝子の少なくとも一部の 塩基配列を取得する細菌同定プログラムであって、 上記同定方法におけるの と同様の菌を同定対象細菌とし、 同定対象細菌の核酸を含有する可能性のあ る被験試料中から取得された DnaJ遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と同定 対象細菌の DnaJ遺伝子の塩基配列とを対比して前記被験試料中の細菌の菌種 を同定するステップを 1又は 2以上のコンピュータに実行させるプログラム も提供される。 このプログラムによれば、 被験試料から取得できた DnaJ遺伝 子の配列を塩基配列に一致する配列を Dna J遺伝子の配列データベースから検 索することで、 被験試料の細菌の種を同定することができる。 このプログラ ムにおいては、 上記ステップに先立って、 前記被験試料中から取得された 1 6S rDNA遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と同定対象細菌の 1 6S rDNA遺伝子の 塩基配列とを対比して前記取得した塩基配列と最も類似度の高い 1 6S rDNA遺 伝子の塩基配列を有する菌種候補を決定し、 これらの菌種候補と被験試料由 来の DnaJ遺伝子の塩基配列を対比するステップを備えるようにしてもよい。
[0062] なお、 プグラムの形態は、 特に問うものではなく、 インタ一ネットを介し てダウン口一ドされる形態であってもよいし、 適当な記憶媒体に格納された ものであってもよい。 さらに、 コンピュータ等の装置の R O M等に格納され
たものであってもよい。 さらに、 本発明によれば、 こうしたプログラムを実 行可能に格納した装置も提供される。 この装置のコントローラには、 こうし たプログラムを実行可能な C P U、 プログラムを格納する ROM又はハード ディスクなどの記憶装置及び適当な配列入力手段を備えることができる。 ま た、 DnaJ遺伝子の配列データベースを装置内のハードディスクなどの記憶手 段に備えることもできるし、 インタ一ネットに接続可能な環境であれば、 こ うした配列データベースが格納されたサーバーにアクセスして必要な処理を 行うようにしてもよい。 さらに、 配列を対比するステップ、 すなわち、 配列 間の類似度等を決定したり、 アラインメントを行ったりするステップは、 DNA SIS pro ver. (日 ソフ卜 、 Beacon designerver.5.1 (Molecular beacon千土 )及び Glustal W (Free soft)などのソフトウェアの全部又は一部を利用する ことができる。
(核酸分子及び核酸分子を含む細菌検出■同定キット)
本発明の核酸分子は、 既に説明した各種核酸分子を含むことができる。 ま た、 上記した各種核酸分子を 1種又は 2種以上を含む細菌検出又は同定する ための検出同定キッ卜としてもよい。 こうした検出同定キッ卜に含まれる核 酸分子は、 プローブ及び/又はプライマーとして機能する核酸分子とするこ とができる。 検出同定キッ卜における核酸分子の組み合わせは特に限定しな いが、 好ましくは 3種以上、 より好ましくは 4種以上、 さらに好ましくは 5 種以上の細菌の菌種を検出又は同定することができる核酸分子を組み合わせ たキットとすることが好ましい。 また、 好ましい対象菌種の組み合わせとし ては、 例えは、 Ghlamydophi la属 2種 Chlamydia属 1種、 Goxiel la属 1種、 Haemop hi lusjfcl禾里、 し egionel laj禹 4種、 StreptococcusJh2禾里、 Mycobacter i umj禹菌 3 種、 Pseudomonasr禹 1禾里、 Mycoplasma属 ι種、 Stapylococcusj禹 1禾里、 Bordet el lajfcl禾里、 Gorynebacter i umj禹 1禾里、 Bordetel lajfcl不里、 Klebsiel laj禹 1種 、 Serratia属 1種及び Escherichia属 1種を含むことができる。 こうした核酸 分子のキットは肺炎および咽頭炎の原因菌を検出■同定するのに好ましい。 また、 例えは、 Chlamydia属 1種、 Neisseria属 2種、 Mycoplasma属 2種、 Urea
plasma属 2種、 Candida l lN Treponema属 1種、 Tr ichomonasa属 1種及び Hae mophilus属 2種、 を含むことができる。 こうした核酸分子のキットは性病の 尿道炎の原因菌を検出■同定するのに好ましい。 さらに、 例えば、 Yersinia J禹 2禾里、 Escher ichia-Shigel laj禹 4禾里、 Campylobacter属 1種、 Salmonellaj禹 1種、 Vibrioj禹 4禾里、 Aeromonasf禹 3禾里、 Plesiomonas属 1種、 Giardiajs 1 l 、 Entamoeba属 1種 及び Clostridium属 4種、 を含むことができる。 こうした 核酸分子のキットは食中毒一下痢症の原因菌を検出■同定するのに好ましい
[0064] 以上の好ましい組み合わせは、 特に、 16SrDNAをターゲットとして被験試料 中の核酸に対して PGR等により増幅してその産物によって菌種を同定する手法 と組み合わせてもよい。 たとえば、 16SrDNA遺伝子を増幅できるプライマ一セ ットを含んだプライマ一カクテル (組成物) としてもよいし、 最初に 16SrDNA による菌種の同定を試みたうえ、 同定不能のときに DnaJによる同定を試みる ようにしてもよい。 こうすることで、 一挙に菌種を検出又は同定したり、 む だなく菌種を検出又は同定することができる。
[0065] こうした検出同定キットは、 核酸分子をプライマーとして含む遺伝子増幅 用の形態とするなど、 単に 1種又は 2種以上の核酸分子のキッ卜としてもよい し、 核酸分子としての 1種又は 2種以上のプローブをビーズや基板等の固相 に固定化可能にキット化したものであってもよい。
[0066] (固定化体)
本発明の固定化体は、 上記した核酸分子の 1種又は 2種以上がビーズや基 板などの固相に固体化されたものとすることができる。 固相に固定化された 核酸分子は、 基板等においてはその配列の位置情報により、 また、 ビーズに おいてはその色によって識別されるようになっている。 固相に固定化された 核酸分子は、 ハイプリダイズによりシグナルを発するような化合物が結合さ れていてもよい。 また、 固相表面上においてプライマ一伸長反応が可能に核 酸分子が固定化されていてもよい。 なお、 固相の形態は特に限定しないし、 また、 その材質も特に限定されないで、 ガラス、 プラスチック、 セラミック
ス等を使用できる。
[0067] また、 本発明の固定化体は、 プローブとしての核酸分子がフィルタ一など のクロマトグラフ基材に固定化された核酸クロマトグラフ装置であってもよ い。
[0068] 本発明は、 また、 少なくとも 1種類のターゲット核酸を増幅し又は検出す るための増幅方法及びその利用にも関する。 これらの発明は、 不特定のター ゲット核酸を増幅し、 検出するのに有用であるほか、 上記した DnaJ遺伝子又 はその一部をターゲット核酸とする、 DnaJ遺伝子の配列を利用した細菌の検 出や同定に有用である。 すなわち、 DnaJ遺伝子の塩基配列に基づく菌種特異 的なプライマ一を用いることで、 1種又は 2種以上 (好ましくは 2種以上) の菌種の検出や同定に対して、 本発明の有用性を一層高めることができる。
[0069] 本発明のターゲット核酸の増幅方法は、 少なくとも 1種類のターゲット核 酸を増幅する方法であって、 タグ配列と前記ターゲット核酸に特異的な塩基 配列とをそれぞれ有する少なくとも 1種類の第 1のプライマ一セッ卜と、 前 記タグ配列と実質的に同一のタグ配列をそれぞれ有する少なくとも 1種類の 第 2のプライマ一セットとを用いてポリメラ一ゼ連鎖反応を実施するポリメ ラーゼ連鎖反応工程を、 備えることができる。
[0070] 本発明のターゲット核酸の増幅方法によれば、 第 1のプライマ一セッ卜に よりターゲット核酸を増幅し、 ターゲット核酸配列を含む第 1のプライマー セットの増幅産物を第 2のプライマーセットにより増幅する。 すなわち、 第 1のプライマ一セットによるタ一ゲット核酸の増幅効率が小さくても、 第 2 のプライマ一セットによる増幅により、 検出に必要量のタ一ゲット核酸を含 む増幅産物として容易に得ることができる。 したがって、 複数種類の第 1の プライマ一セッ卜が低濃度であっても、 第 1のプライマ一セットによる増幅 効率の低さを補って、 第 1のプライマ一セットによって一つ以上のタ一ゲッ ト核酸を増幅することができる。 また、 主として第 2のプライマ一セットに よりターゲット配列を増幅するため、 増幅効率を容易に均一化することがで さる。
[0071 ] また、 前記ポリメラーゼ連鎖反応工程は、 前記第 1のプライマ一セッ卜に よる前記ターゲット核酸の増幅と前記第 1のプライマーセットによる増幅産 物の前記第 2のプライマ一セットによる増幅とを同時に実施する工程とする ことができる。 こうしたポリメラ一ゼ連鎖反応工程によれば簡易にターゲッ ト核酸を検出することができる。
[0072] 本発明では、 第 1のプライマ一セットを、 微生物の D n a J遺伝子上のタ ーゲット核酸に特異的な塩基配列を有するように設計することができる。 D n a J遺伝子を用いることで、 異なる属のほか同属の異なる種の微生物を含 んでいても、 微生物を菌種レベルで容易に検出することができる。 本発明者 らによれば、 D n a J遺伝子は、 菌種間の類似度は低い一方同一菌種内で保 存されている配列が判明している。 このため、 菌種によって毒性や悪性度が 異なる病原微生物の検出に有利である。 また、 D n a J遺伝子を用いること で増幅産物の長さを、 増幅産物の競合を効果的に回避できる 2 5 0塩基以下 に容易に設定することができる。
[0073] 以下、 当該実施形態について、 本発明のターゲット核酸の増幅方法及び増 幅用のキット等について、 適宜図面を参照しながら詳細に説明する。 図 1 4 には、 本発明の増幅方法に用いる第 1のプライマ一セッ卜と第 2のプライマ ーセッ卜とターゲット核酸との関係を示す。
[0074] (ポリメラーゼ連鎖反応)
本発明においてポリメラ一ゼ連鎖反応 (P C R ) とは、 試験管内で特定の D N A配列を酵素反応で増幅する反応である。 P C Rには、 R T—P C R法 、 リアルタイム P C R法のほか多様な変法やほかの分析手法との組み合わせ が存在するが、 本発明の P C Rにはそれらをすベて包含することができる。
[0075] (ターゲット核酸)
本発明においてターゲット核酸とは、 ポリメラ一ゼ連鎖反応により増幅し ようとする塩基配列の全体又はその一部である核酸である。 ターゲット核酸 は、 ポリメラーゼ連鎖反応により増幅が可能であれば特に限定しないが、 生 物の遺伝情報媒体であるゲノムとしての D N A又は R N Aのほか、 m R N A
、 c DNA、 c RN A等が挙げられる。 また、 一本鎖であっても二重鎖であ つてもよい。
[0076] ターゲット核酸は、 また、 生物又はその一部の組織から抽出等により抽出 されたもの、 発現解析によって得られた mRN A、 c DNA、 ゲノムに対す る PCRで得られた増幅産物等各種の形態を採ることができるが、 その形態 は特に限定されない。 取得源である生物及び組織も特に限定しないで。 ヒト 及び非ヒト哺乳類、 その他の動物のほか、 細菌、 真菌、 ウィルス等の微生物 とすることができる。 感染症の予防■治療や衛生の観点からは、 ターゲット 核酸が由来する生物は、 微生物であることが好ましく、 より好ましくは、 衛 生上又は治療上検出又は同定されるべき微生物であり、 より好ましくは病原 微生物である。
[0077] ターゲット核酸が由来する微生物としては、 Staphylococcus属菌、 Strepto coccusfc菌、 Serratia属鹵、 Klebsiel laj禹菌、 Escher ichiaj禹菌、 Mycobacter ium属菌、 Legionel la属菌、 Vibrio属菌、 Baci l lus属菌、 Neisseria属菌、 Cam pylobacter属菌、 Chlamydia属菌、 Chlamydophi I a属菌、 Mycoplasma属菌、 Lis teria 属菌、 Salmonel la属菌及び Yersinia属菌が挙げられる。 微生物として は、 これらから選択される 1種又は 2種以上の菌の菌種から選択される。 こ れらの属に属する菌種は、 D n a J遺伝子上において好ましいターゲット核 酸を備えている。 すなわち、 これらの属に属する菌においては、 菌種間の D n a J遺伝子の塩基配列が 1 6 S r D N A遺伝子の塩基配列よりも類似度が 低く、 同一菌種内の株の間で保存されている菌種特異的な塩基配列を見出す のが容易だからである。
[0078] なかでも、 Staphylococcus)禹菌、 StreptococcusJh菌、 Mycobacter i umjsS 、 Legionel la属菌及び Vibrio属菌の菌種とすることが好ましい。 これらの属 に属する菌は、 属間及び同一属内の菌種間で D n a J遺伝子の類似度が低く 、 D n a J遺伝子による菌種の検出に適しているからである。 例えば、 D n a J遺伝子については、 Stapylocuccus属菌においては 1 6 S r DNAでは菌 種間で平均 97. 4 %であるが D n a Jは菌種間で平均 77. 6 %、 Strepto
coccus属菌においては 1 6 S r D N Aでは菌種間で平均 95. 8%であるが D n a Jは同平均 76. 4%、 Mycobacter i um属菌においては 1 6 S r D N A では菌種間で平均 93%であるが D n a Jは同平均 83. 7 %、 Legionel la 属菌については 1 6 S r D N Aでは菌種間で平均 96. 1 %でぁるが0门 3 Jは同平均 82. 5%、 V i brio属菌については 1 6 S r D NAでは菌種間で 平均 97. 4%であるが D n a Jは同平均 82%となっている。
[0079] こうしたターゲット核酸は、 例えば、 血液、 血清、 ヒトを含む動物から採 取された細胞又は組織、 便や尿などの排泄物、 痰、 井戸水、 食品などの被験 試料として提供される。 なお、 被験試料は、 こうした採取物等から核酸を抽 出した核酸抽出試料であってもよいし、 さらに、 DnaJ遺伝子又はその一部 ( 検出しようとする領域を含む) の増幅産物を含む試料であってもよい。
[0080] (第 1のプライマ一セット)
本発明の増幅方法では、 タグ配列とターゲット核酸に選択的にァニールす る塩基配列とをそれぞれ有する第 1のプライマ一セットを用いる。 第 1のプ ライマ一セットは、 フォヮ一ドプライマ一とリバースプライマ一とから構成 されている。 図 1に示すように、 フォワードプライマ一及びリバースプライ マ一はいずれも、 その 5' 側にタグ配列を有し、 3 ' 側にターゲット核酸に 対するァニ一リング配列を有している。
[0081] 第 1のプライマ一セット (プライマ一対) は、 ターゲット核酸の種類に応 じて設定される。 通常は、 一つのターゲット核酸に対して一つのセットの第 1のプライマ一セッ卜が設定される。 なお、 二つ以上のタ一ゲット核酸に対 して一つの第 1のプライマ一セッ卜が設定される場合もありうる。
[0082] 第 1のプライマ一セット (対) のそれぞれのプライマーが有するターゲッ ト核酸に選択的にァニールする塩基配列 (以下、 ァニール配列ともいう。 ) は、 ターゲット核酸とのみハイブリダィズしてァニール可能な特異性が高い 配列を選択することが好ましい。 なお、 同一遺伝子をターゲット核酸として プライマ一を設計する場合には、 異なるプライマ一セット間でァニール配列 は部分的にまた全体が一致している場合もありえる。 ァニール配列は、 ター
ゲット核酸に対する特異性のほか、 プライマ一ダイマ一の形成回避、 P CR 工程での反応温度を考慮して決定することができる。 好ましくは、 当該塩基 配列とターゲット核酸との Tmは 50°C以上 70°C以下であり、 より好まし くは 55°C以上 65°C以下である。
[0083] 微生物の検出や同定を目的に増幅方法を実施する場合、 こうしたァニール 配列は、 検出等しようとする微生物に特異的な配列を選択することができる 力 上述のように D n a J遺伝子上の塩基配列をタ一ゲット核酸とすること が好ましい。 複数の微生物について同一遺伝子上の塩基配列をターゲット核 酸とするときには、 例えば、 複数の微生物の D n a J遺伝子の塩基配列をァ ライメントすることにより、 微生物特異的な塩基配列を選択することができ る。 こうしたァニール配列によれば、 菌種特異的であり、 かつ当該菌種に属 する株を確実に検出することができる。 なお、 こうしたァライメント及び特 徵的配列の抽出には、 D NAS I S p r o v e r . (日立ソフト) 、 B e a e o n d e s ι g n e r v e r . 5. 1 (Mo l e c u l a r b e a c o n社) 及び C l u s t a l W (F r e e s o f t ) などのソフトウェア を利用することができる。
[0084] タグ配列は、 増幅しょうとするターゲット核酸にはハイブリダィズしない 配列から選択することができる。 タグ配列は、 好ましくは、 その長さが 1 2 塩基以上 40塩基以下であり、 より好ましくは 1 8塩基以上 30塩基以下で
[0085] 第 1のプライマ一セットを構成するフォヮ一ドプライマ一とリバ一スプラ イマ一とは、 それぞれ、 タグ配列とァニール配列とをリンカ一配列等を介し て備えていてもよいが、 好ましくは、 2種類の配列のみからなる。 また、 フ ォヮ一ドプライマ一とリバースプライマ一は、 いずれも全体として 30塩基 以上 80塩基以下であることが好ましく、 より好ましくは、 35塩基以上で
[0086] また、 こうした第 1のプライマ一セットによって増幅される増幅産物は 8 0塩基以上 280塩基以下であることが好ましい。 この範囲であると、 病原微生
物等の遺伝子において共通の保存された配列が含まれる可能性が減少し検出 感度が上昇するからである。 より好ましくは増幅産物は、 2 5 0塩基以下で ある。 2 5 0塩基以下であると増幅された領域に異なった菌種に共通の保存 された配列が含まれる可能性が減少し、 増幅効率と感度を上昇させることが できるからである。 さらに好ましくは 2 0 0塩基以下である。 2 0 0塩基以 下であると種特異的なプライマー及びプロ一ブを設計し易いからである。 特 に、 微生物の D n a J遺伝子をタ一ゲット核酸とした場合、 D n a遺伝子の 構造上、 増幅産物の長さが 2 0 0塩基を超えると種特異的なプライマーゃプ ローブを設計しにくくなるが、 2 0 0塩基以下であれば種特異的プライマー を設計しやすくなる。 また、 D n a J遺伝子の場合、 遺伝子の構造から増幅 産物がこの長さであっても、 特異的プローブを設計するのが 1 6 s r D N A よりも容易である。 すなわち、 D n a J遺伝子上にターゲット核酸を配する ことで、 多数の微生物において好ましくは 2 5 0塩基以下、 より好ましくは 2 0 0塩基以下の増幅産物が得られるような第 1のプライマ一セットを設計 することができる。 本発明においては、 第 1のプライマ一セットによる増幅 産物をこうした一定範囲の塩基長で取得できるため、 第 2のプライマーセッ 卜によってこの増幅産物をさらに増幅するための P C Rサイクルと第 1のプ ライマ一セットによる P C R反応サイクルとを同一のサイクルとすることが 可能となる。
第 1のプライマ一セットは、 少なくとも 1種類用いるが、 本増幅方法がマ ルチプレックス P C Rによる増幅工程を実施する場合等、 複数種類の第 1の プライマ一セットを用いることができる。 好ましくは、 6種類以上の第 1の プライマ一セットを用い、 より好ましくは 1 0種類以上の第 1のプライマ一 セットを用いる。 さらに好ましくは、 1 5種類以上の第 1のプライマ一セッ トを用いる。 また、 5 0種類以下の第 1のプライマ一セットを用いることが 好ましい。 特に、 微生物のターゲット核酸を増幅する場合、 D n a J遺伝子 上の配列をタ一ゲット核酸とすることが好ましい。 この遺伝子を用いること で、 菌種特異的であり、 かつ増幅産物の競合も起こりにくいプライマーを設
計することができるため、 マルチプレックス P C Rによって多種類の微生物 のターゲット核酸を容易に検出することができる。
[0088] (第 2のプライマ一セット)
本増幅方法では、 第 1のプライマ一セッ卜に用いたタグ配列と実質的に同 —のタグ配列をそれぞれ有する少なくとも 1種類の第 2のプライマ一セット を用いる。 第 2のプライマ一セットは、 第 1のプライマ一セットがタ一ゲッ ト核酸にァニールして得られる増幅産物に対してタグ配列を介してァニール して、 増幅産物をさらに増幅することができる。
[0089] 第 2のプライマ一セットを構成する第 2のフォヮ一ドプライマ一及び第 2 のリバースプライマ一は、 それぞれ第 1のフォヮ一ドプライマ一のタグ配列 及び第 1のリバースプライマーのタグ配列と実質的に同一のタグ配列を有し ている。 第 2のフォワードプライマ一及び第 2のリバースプライマ一は、 好 ましくは、 それぞれ第 1のフォワードプライマ一及びリバースプライマ一の タグ配列と実質的に同一のタグ配列からなる。
[0090] ここで、 タグ配列と実質的に同一なタグ配列とは、 第 1のフォワードブラ イマ一のタグ配列と同一のタグ配列のほか、 第 1のタグ配列と相補的な塩基 配列とのハイブリダイゼーション特異性を維持できる範囲で改変された塩基 配列が挙げられる。 たとえば、 当該塩基配列と相補的な塩基配列や、 当該塩 基配列において、 1又は 2以上の塩基が置換、 挿入、 欠失及び付加から選択 された 1種又は 2種以上の形態で改変された塩基配列が挙げられる。 好まし <は第 1のプライマ一セッ卜にそれぞれ付加されているタグ配列と同一のタ グ配列を用いる。
[0091 ] 第 2のプライマ一セットは、 特定の第 1のプライマ一セットに対応して使 用するものでなく、 第 1のプライマ一セッ卜に用いられるタグ配列に対応し て使用するものである。 したがって、 増幅反応で用いる 2種類以上の第 1の プライマ一セッ卜が 1種類のタグ配列対を用いている場合には、 第 2のブラ イマ一セットは 1種類である。 また、 2種類以上の第 1のプライマ一セット が 2種類以上のタグ配列対を用いている場合には、 2種類以上の第 2のブラ
イマ一セットを用いる。
[0092] このような第 1のプライマ一セットと第 2のプライマ一セットとは、 第 1 のプライマ一セッ卜の各プライマ一濃度をより低くし、 第 2のプライマ一セ ッ卜の各プライマー濃度を個々の第 1のプライマーセッ卜のプライマー濃度 より高くして用いることが好ましい。 第 2のプライマ一セットを用いるため 、 第 1のプライマ一セットは、 第 2のプライマ一セットの錶型となりうる程 度の増幅産物を産生できればよいからである。
[0093] P C R反応液における第 2のプライマ一セッ卜の個々のプライマ一の濃度 は、 P C R反応液における個々の第 1のプライマ一セッ卜の個々のプライマ —の濃度の 1 0倍以上 5 0倍以下であることが好ましい。 この範囲内である と、 多種類の第 1のプライマ一セットを用いた場合であっても、 単独のブラ イマ一セッ卜で増幅したときと同等の検出感度を得ることができる。 なお、 第 1のプライマ一セッ卜のプライマ一濃度と第 2のプライマ一セッ卜のブラ イマ一濃度との比率は、 使用する第 1のプライマ一セッ卜の種類数に応じて 決定することが好ましい。 例えば、 使用する第 1のプライマーセットの種類 が 1 0種類のときには、 第 2のプライマ一セッ卜の個々のプライマ一濃度を 個々の第 1のプライマ一セッ卜のプライマ一濃度の 1 0倍以上とすることが 好ましい。 同様に、 第 1のプライマ一セットが 2 0種類であるときには、 第 2のプライマ一セッ卜のプライマ一濃度は 2 0倍以上とすることが好ましい
[0094] 第 1のプライマ一セットの個々のプライマ一濃度は、 0 . 0 0 5 ;U M以上 0 . 2 M以下であることが好ましい。 この範囲であると、 第 2のプライマ ーセットにより増幅可能な程度に増幅産物を生成できる。 より好ましくは、 0 . 1 M以下である。 一方、 第 2のプライマ一は、 0 . 以上であり 、 さらに好ましくは 0 . 2 5 ;U M以上であることが好ましい。
[0095] 本発明で用いる第 1のプライマ一セッ卜と第 2のプライマ一セッ卜とは、 以下の特徴: (a ) 前記第 1のプライマ一セットによる増幅産物が 2 5 0塩 基以下の核酸である
(b) 前記第 1のプライマ一セットのプライマーの使用時濃度が 0. 005 M以上 0. 2 ;UM以下 (好ましくは 0. 以下) である
(c) 前記第 2のプライマ一セットのプライマーの使用時濃度は、 前記第 1 のプライマ一セッ卜のプライマ一の使用時濃度の 1 0倍以上 50倍以下であ る
のいずれかを備えることが好ましい。 これらを備えることで、 複数種類の第 1のプライマ一セットを用いても、 特異性を維持してかつタ一ゲット配列を 必要量増幅することができる。 さらに、 後述するように簡易な P CR工程に より複数種類の第 1のプライマ一セットを用いた増幅工程を実施できる。
[0096] なお、 こうした第 1のプライマ一セットや第 2のプライマ一セット構成す る核酸分子は、 塩基配列に基づくハイプリダイゼーシヨンが可能であれば特 に限定されない。 核酸分子としては、 D NA、 RNA、 D NA— RNAキメ ラ、 修飾塩基等を含む人工核酸、 ペプチド核酸 (P NA) のいずれの形態を 採ることができるが、 典型的には D N Aである。 また、 こうした核酸分子は 、 必要に応じ各種の蛍光色素や蛍光色素のクェンチヤ一等で修飾されていて もよい。
[0097] (P CR工程)
第 1のプライマ一セッ卜と第 2のプライマ一セッ卜とを用いた P C R工程 における反応条件等は特に限定しないで第 1のプライマ一セットによるター ゲット核酸の増幅産物を第 2のプライマーセットによって増幅可能であれば よい。 第 1のプライマ一セットによるタ一ゲット核酸の増幅ステップと第 2 のプライマ一セットによる第 1のプライマ一セッ卜の増幅産物の増幅ステツ プとは、 それぞれ異なる 「変性—アニーリング—伸長」 のサイクルで実施す ることができる。 例えば、 第 1のプライマ一セットによる増幅ステップは、 90 °C以上 97 °C以下で 1 0秒〜 60秒、 55 °C以上 65 °C以下で 1 0秒〜 60秒、 70 °C以上 75 °C以下で 1秒〜 30秒で実施することができる。 ま た、 例えば、 サイクル数は、 1サイクル以上数サイクル以下であることが好 ましい。 1 0サイクルを超えても、 最終的な増幅産物の増量程度が大きくな
いからである。 好ましくは 1〜2サイクルであり、 より好ましくは 1サイク ルである。 また、 例えば、 第 2のプライマ一セットによる増幅ステップは、 9 0 °C以上 9 7 °C以下で 0 . 5秒〜 5秒、 5 5 °C以上 6 5 °C以下で 0 . 5秒 〜5秒、 7 0 °C以上 7 5 °C以下で 1秒〜 2 0秒で実施することができる。 ま た、 例えば、 サイクル数は、 2 0サイクル以上 7 0サイクル以下であること が好ましい。 より好ましくは 3 0サイクル以上であり、 より好ましくは 4 0 サイクル以上 6 0サイクル以下である。
[0098] また、 第 1のプライマ一セットによる増幅ステップと第 2のプライマ一セ ットによる増幅ステップとは、 単一の 「変性一アニーリング一伸長」 の P C Rサイクルで実施してもよい。 特に、 第 1のプライマ一セットによる増幅産 物の長さを好ましくは 2 5 0塩基以下、 より好ましくは 2 0 0塩基以下とす る場合には、 第 2のプライマ一セットによる P C R反応サイクルを第 1のプ ライマ一セットによる P C Rサイクルと同一条件とすることが好ましい。 こ のような場合には、 同一条件の P C Rサイクルで第 1のプライマ一セットも 第 2のプライマ一セットもそれぞれ有効に機能させることができ、 結果とし て、 第 2のプライマ一セットによる増幅産物を効率的に得ることができる。 したがって、 第 1のプライマ一セッ卜のための P C Rサイクルを別個実施す る必要がない。
[0099] 既に説明したように、 ターゲット核酸を D n a J遺伝子上に置くこと等に より、 複数のターゲット核酸に対する複数の第 1のプライマ一セットによる 増幅産物の長さを 2 5 0塩基以下、 好ましくは 2 0 0塩基以下とする場合、 単一の P C Rサイクルを実施することは、 マルチプレックス P C Rを実施す る場合において特に好ましい。 こうした塩基長に第 1のプライマ一セッ卜の 増幅産物を設定することで、 第 1のプライマーセットによる増幅時に競合を 抑制することができるとともに、 全てのターゲット核酸に対して均等な増幅 条件を付与することができるからであり、 どのターゲット核酸も同等の検出 感度で検出することができる。 また、 単一の P C Rサイクルで第 1のプライ マ一セッ卜と第 2のプライマ一セッ卜とを作用させることにより、 リアルタ
ィム P C R等、 定量的分析にも適しているといえる。
[0100] 第 1のプライマ一セット及び第 2のプライマ一セットを単一の P C Rサイ クルを用いて増幅ステップを実施する場合、 9 0 °C以上 9 7 °C以下で 0 . 5 秒〜 5秒、 5 5 °C以上 6 5 °C以下で 0 . 5秒〜 5秒、 7 0 °C以上 7 5 °C以下 で 1秒〜 2 0秒で実施することができる。 また、 例えば、 サイクル数は、 2 0サイクル以上 7 0サイクル以下であることが好ましい。 より好ましくは 3 0サイクル以上 6 0サイクル以下である。
[0101 ] また、 こうした P C R工程では、 第 1のプライマ一セットのプライマ一濃 度は、 0 . 0 0 5 Μ以上 0 . 2 Μ以下であり、 前記第 2のプライマ一セ ッ卜のプライマ一濃度は、 前記第 1のプライマ一セッ卜のプライマ一濃度の 1 0倍以上 5 0倍以下であることが好ましい。 こうした濃度範囲であると、 効率的にターゲット核酸を増幅することができる。 また、 第 1のプライマ一 セットによる増幅産物が 2 5 0塩基以下の核酸であると、 類似の配列を持つ た領域が含まれる可能性が減少し、 増幅時の競合がおきずに感度を増大させ ることができる。
[0102] 本発明を先に説明した細菌の菌種の検出方法に適用する場合、 前記 (a ) 工程を、 タグ配列と前記 D n a J遺伝子の一部と選択的にァニールする塩基 配列とを有する少なくとも 1種類の第 1のプライマーセッ卜と、 前記タグ配 列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも 1種類の第 2のプライマー セッ卜とを用いてポリメラ一ゼ連鎖反応を実施し、 前記第 1のプライマ一セ ットによる前記 D n a J遺伝子の少なくとも一部の増幅と前記第 1のプライ マ一セットによる増幅産物の前記第 2のプライマ一セットによる増幅とを実 施する工程とすることが好ましい。 こうすることで、 複数の菌種にわたる細 菌の存在可能性がある場合においても、 少ない実験数で網羅的に多くの菌種 についてその菌種が存在するか否かを検出することができる。 この場合にお いて、 P C R工程を単一の P C R反応サイクルを実施する工程とすることで 、 より実験を簡略化することができる。
[0103] (病原微生物のマルチプレックス P C Rによる診断方法)
本発明の病原微生物のマルチプレックス P C Rによる診断方法は、 Staph y lococcus属鹵、 Streptococcusj禹菌、 Serratiaj禹菌、 Klebsiel laJh菌、 Escher ichia属菌、 Mycobacter i um属菌、 Legionel la 属菌、 Vibrio属菌、 Baci l lus属 菌、 Neisseria属菌、 Campylobacter属菌、 Chlamydia属菌、 Gh I amydoph i I a属 菌、 Mycoplasma属菌、 Listeria 属菌、 Salmonel la属菌及び Yersinia属菌から 選択される 2種以上の病原微生物を対象とし、 前記病原微生物由来の核酸を 含有する可能性のある被験試料に対して、 タグ配列と前記病原微生物が保持 する D n a J遺伝子上のターゲット核酸に選択的にァニールする塩基配列と を有する少なくとも 1種類の第 1のプライマーセッ卜と、 前記タグ配列と実 質的に同一のタグ配列を有する少なくとも 1種類の第 2のプライマーセット とを用いてポリメラーゼ連鎖反応を実施するポリメラーゼ連鎖反応工程と、 前記ターゲット核酸を含む増幅産物を検出する工程と、 を備えることができ る。 P CR工程は、 上記と同様にして実施することができる。 特に、 P CR 工程を単一の P C R反応サイクルを実施する工程とすることが好ましい。 こ うすることで迅速に病原微生物を診断することができる。 検出工程で、 増幅 産物を検出する方法は、 特に限定されない。 増幅産物を電気泳動等によりそ の分子量により分離して検出することもできるし、 第 2のプライマ一に標識 化合物を付しておき、 サザンブロッテイング法、 マイクロアレイ法、 マイク 口ビーズ法 (フローサイ トメータ一) 、 核酸 (D NA) クロマトグラフィな どにおけるハイブリダイゼ一シヨンに基づいてターゲット配列を検出しても よい。
本発明の診断方法によれば、 前記 P C R工程を備えることにより、 少量の ターゲット核酸しか存在しない場合であっても特異的にかつ検出感度よくタ —ゲット核酸を検出することができる。 複数種類のプライマ一セットを用い てマルチプレックス P C Rによりターゲット核酸を検出するにあたっても特 異的に感度よくしかも容易にターゲット核酸を検出することができる。 また 、 ターゲット核酸が D n a J遺伝子にあるため、 異なる微生物の D n a遺伝 子上のできるだけ保存されている配列をァニ一リング配列として選択して第
1のプライマ一セットを設計すると、 第 1のプライマ一セッ卜が均一に異な る D n a J遺伝子上のターゲット核酸を増幅し、 さらに、 この増幅産物を第 2のプライマ一セッ卜が均一に増幅することで、 定量的にターゲット核酸を 増幅でき、 ターゲット核酸、 すなわち、 微生物量を定量することができる。 この種の定量的解析は、 他のターゲット核酸にも適用できる。 例えば、 発現 解析の産物である m R N Aや c D N Aなどのターゲット核酸にも適用して、 発現量を定量することもできる。
[0105] (少なくとも 1種類の病原微生物のターゲット核酸をマルチプレックス P C Rにより増幅するためのプライマ一セットを含むキット)
本発明のキットは、 タグ配列と前記病原微生物のターゲット核酸と選択的 にァニールする塩基配列とを有する第 1のプライマ一セッ卜と、 前記タグ配 列と実質的に同一のタグ配列を有する第 2のプライマ一セッ卜と、 を備える ことができる。 この検出キットにおける第 1のプライマ一セッ卜と第 2のプ ライマ一セットについてはいずれもすでに説明した本発明の増幅方法におけ る第 1のプライマ一セッ卜と第 2のプライマ一セッ卜とついにいての実施態 様を適用することができる。
[0106] さらに、 本発明のキットとしては好ましくは、 以下のいずれかの特徴:
( a ) 前記第 1のプライマ一セットによる増幅産物が 2 5 0塩基以下の核酸 である
( b ) 前記第 1のプライマ一セットのプライマーの使用時濃度が 0 . 0 0 5 M以上 0 . 2 ;U M以下 (好ましくは 0 . 以下) である
( c ) 前記第 2のプライマ一セットのプライマーの使用時濃度は、 前記第 1 のプライマ一セッ卜のプライマ一の使用時濃度の 1 0倍以上 5 0倍以下であ るを備えることが好ましい。
[0107] これらの特徴を備えることで、 少量のターゲット核酸を増幅又は検出する ことが容易であるとともに、 複数のプライマ一セットを同時に用いた場合で あっても、 ターゲット核酸を確実にかつ高感度に検出することができる。
[0108] 本発明のキットは D n a J遺伝子上にターゲット核酸を備えることが好ま
しい。 D n a J遺伝子上にターゲット核酸を有することで、 第 1のプライマ ーセットによる増幅産物が 200塩基以下の核酸であっても他の増幅産物と 競合しないような増幅産物を設計することができる。 本検出キットは、 ター ゲット核酸を微生物の D n a J遺伝子上に有することが好ましい。 これらの 微生物は既に説明したが、 以下の表に示すいずれかの微生物の D n a J遺伝 子上にターゲット核酸を有するとき、 同表に示す第 1のフォヮ一ドプライマ —とリバースプライマーとを用いることが好ましい。
ほ 1]
[0109] D n a J遺伝子については、 その配列の一部が公知ではある。 D n a J遺 伝子を本発明におけるターゲット核酸とするには、 多型の多い D n a J遺伝 子の菌種レベルでの保存配列と S N P多型箇所を取得する必要があつたが、 これらは知られていなかった。 本発明者らは、 多数の野生株の D n a J遺伝 子の配列を決定し、 菌種特異的に保存されている領域と S N Pの箇所とを特 定し、 これにより、 第 1のプライマ一セットの特異的プローブのための配列 を初めて決定することができた。 また、 増幅産物に特異的なプローブのため の配列を決定することができた。 本発明者らによれば、 D n a J遺伝子につ いては、 Mycobacterium属では属内の菌種の株の多型は 1 %以内、 腸内細菌科 の菌種ゃ Streptococcus属、 Staphylococcus属の菌種では 1 _ 3%に多型が収 まっていた一方、 独立した近縁種とは 5 以上の配列の開きがあることがわ かっている。
[0110] 本発明のキッ卜は、 Staphylococcus属鹵、 Streptococcusj禹菌、 Serratiaj禹 菌、 Klebsiel laj禹菌、 Escher ichiaJh菌、 Mycobacter i umj禹菌、 Legionel las 菌、 Vibrio属菌、 Baci l lus属菌、 Neisseria属菌、 Campylobacter属菌、 Chi am yd i a属菌、 Chlamydophi la Mycoplasma属菌、 Listeria 属菌、 Salmonel I
a属菌及び Yersinia属菌からなる群から選択される 1種又は 2種以上を検出対 象とするプライマ一セッ卜のキットとすることができる。 好ましくはこれら の検出対象の DnaJ遺伝子上の一部をターゲット核酸とするようにプライマー を設計する。 プライマーの設計には、 既に説明したこれらの菌に属する各種 菌種特異的な部分を増幅するプライマー配列を利用できる。 本発明のキット には、 これらの検出対象のうち、 2種類以上又は 3種類以上の菌種の各 D n a J遺伝子に対応するプライマ一セットを組み合わせることが好ましい。
[0111] 本発明のキットは、 既に説明した肺炎、 咽頭炎の各種原因菌から選択され る 1種又は 2種以上を検出対象とするキットとすることができる。 また、 本 発明のキットは、 既に説明した下痢、 食中毒の各種原因菌から選択される 1 種又は 2種以上を検出対象とするキットとすることができる。 さらに、 本発 明のキットは、 既に説明した性病の各種原因菌から選択される 1種又は 2種 以上を検出対象とするキットとすることができる。 本発明のキッ卜にあって は、 好ましくはこれらの検出対象の D n a J遺伝子上の一部をタ一ゲット核 酸とする。 プライマーの設計には、 既に説明したこれらの菌に属する各種原 因菌について特定されたプライマ一配列を利用できる。 本発明のキットにあ つては、 これらの検出対象のうち、 2種類以上又は 3種類以上の菌種の各 D n a J遺伝子に対応するプライマ一セットを組み合わせることが好ましい。
[0112] 本発明のキットは、 好ましくは 3種以上、 より好ましくは 4種以上、 さら に好ましくは 5種以上の微生物のターゲット核酸を同時に増幅可能に構成す ることができる。 例えば、 こうした検出キットにおける好ましい対象菌種の 組み合わせとしては、 例えば、 Ghlamydophi la属菌、 Chlamydia属菌、 Goxiel l aj禹菌、 Haemophi lusjfc菌、 し egionel la属菌、 Streptococcusj禹菌、 Mycobacter ium属菌、 Pseudomonas属菌、 Mycoplasma属菌、 Stapylococcus属菌、 Bordetel la属菌、 Gorynebacter i um属菌、 Bordetel la属菌、 Klebsiel la属菌、 Serratia 属菌及び Escherichia属菌を含むことができる。 こうしたキットは肺炎および 咽頭炎の原因菌を検出■同定するのに好ましい。 また、 例えば、 Chlamydia属 菌、 Neisser iaj禹菌、 Mycoplasmaf禹菌、 UreaplasmaJh菌、 GandidaJh菌、 Trepo
nema属菌、 Tr ichomonasa S¾t Haemophi IUS SN を含むことができる。 こ うしたキットは性病の尿道炎の原因菌を検出■同定するのに好ましい。 さら に、 例えは、 Yersinia属菌、 Escher ichia-Shigel laJhi¾ Campylobacter)禹菌 、 Salmonel I aj禹菌、 Vibrioj禹菌、 Aeromonasj禹菌、 Plesiomonasf禹菌、 Giardia 属菌、 Entamoeba属菌、 Clostridium属菌及び Lister ia 属菌を含むことができ る。 こうしたキットは食中毒一下痢症の原因菌を検出■同定するのに好まし い。
[0113] 以上のことから、 本発明によれば、 Staphylococcus属菌、 Streptococcus属 菌、 Klebsiel laj禹菌、 Escher ichiaJh菌、 Mycobacter i umj禹菌、 Legionella ι禹 菌、 Vibrio属菌、 Bacil I us属菌、 Neisseria属菌、 Campylobacter属菌、 Chi a mydia属菌、 Chlamydophi la ¾N Mycoplasma属菌、 Listeria 属菌、 Salmonel la属菌及び Yersinia属菌から選択される 2種以上の細菌の菌種を検出対象と し、
(a) 検出対象細菌の核酸を含有する可能性のある被験試料と検出しょう とする 2種類以上の菌種の DnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイプリダイズす る 2種類以上の核酸分子とを接触させる工程と、 (b) 前記核酸分子と前記 被験試料中の核酸とのハイブリダィズの有無を検出する工程と、 を備える方 法であって、 前記 (a) 工程は、 タグ配列と前記 D n a J遺伝子の一部と選 択的にァニールする塩基配列とを有する少なくとも 1種類の第 1のプライマ ーセッ卜と前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも 1種 類の第 2のプライマ一セッ卜と、 を用いてポリメラ一ゼ連鎖反応を実施し、 前記第 1のプライマ一セットによる前記 D n a J遺伝子の少なくとも一部の 増幅と前記第 2のプライマ一セットによる前記第 1のプライマ一セットの增 幅産物の増幅とを実施する工程である、 方法が提供される。 前記ポリメラー ゼ連鎖反応工程は、 単一の P C R反応サイクルを実施する工程とすることが できる。
[0114] 細菌を検出■同定するための核酸分子キッ卜であって、 Streptococcus属菌 、 Staphylococcusr禹菌、 Enterococcus属菌、 PeptostreptococcusJh菌、 Klebs
iel la属菌、 Escher ichi属菌、 Enterobacter属菌、 Leg i one 11 a属菌、 Neisser i a属菌、 Baci l lus属菌、 Hel icobacter属菌、 Gorynebacter i um属菌、 Pseudomo nas属菌、 Burkholder ia属菌、 Haemophi I us属菌、 Bacteroides属菌、 Enteroco ecus属菌、 Nocardia属菌、 Prevotel la Neisseria属菌、 Moraxel la属菌 、 Flavobacter ium属菌、 Clostridium属菌、 Treponema属菌、 Sphingobacter iu m属菌、 Leptospi ra属菌、 Campylobacter属菌、 Listeria 属菌、 Salmonel la属 菌及び Yersinia属菌から選択される 2種以上の細菌の菌種を検出■同定対象 とし、 前記同定対象細菌の DnaJ遺伝子の少なくとも一部とハイブリダィズす る核酸分子を含むキットが提供される。 また、 このキットにおいて、 前記核 酸分子は、 タグ配列と前記 D n a J遺伝子の一部と選択的にハイブリダイズ するする塩基配列とを有する少なくとも 1種類の第 1のプライマーセッ卜と 、 前記タグ配列と実質的に同一のタグ配列を有する少なくとも 1種類の第 2 のプライマ一セットとを含むことができる。 さらに、 これら核酸分子キット を構成する 2種以上の核酸キッ卜が固定化された固相体の形態を採ってもよ い。
実施例 1
[0115] Staphylococcus属の S. aureusは食中毒上重要な菌種であるが、 1 6S rDNA では類縁種である S. epidermidisと 99.5%類似度があり(図 1 A、 特異的な prim erをデザインすることは不可能であつたが、 DnaJでは両者は 81.1%の類似度 しかない(図 1 B)ことがわかった。 このため、 容易に primerをデザインでき た。 しかも、 この primer配列は、 配列を決定した 1 1株の S. aureusの間でよ く保存されていた(図 2)。 本実施例では、 食中毒を起こす 9種の病原体につ いて決定した DnaJ配列等に基づいて、 これらの病原体につきプライマ一を作 製した。 各病原体についてのプライマ一配列は以下のとおりとした。
[0116] Staphylococcus aureus用のプライマ一
配列番号 13 : 5-GGACAAGGATTCAATGGCTCT
配列番号 14 : 5-TTGCGGTGCATTTGGATCTCT
Campylobacter jejuni用のプライマ一
配列番号 67 : 5-TACTTATAAATGCTCTTGTAAAAC 配列番号 68 :5-CTTTGGACAAGTTTGAAG Vibrio chol erae用プライマ一
配列番号 43 : 5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA 配列番号 44 : 5-AGCAGCTTATGACCAATACGCC Vibrio parahaemolyticusffl^^'i' 配列番号 43 : 5-CAGGTTTGYTGCACGGCGAAGA 配列番号 50 : 5-TGCGAAGAAAGGCTCATCAGAG Escherichia col i用プフイマ一
配列番号 21 : 5-TGTTGAGCGCAGCAAAAC 配列番号 22: 5-CAAGACGGATGCGGTCTC
Listeria monocytogenes用プライマ一 配列番号 135: GTACAAGCTACATTAGGTGAC 配列番号 136: GTTCGTTTGAAAATTCCAAGT
(もしくは、
配列番号 137: GGACAACACCTGAAAAATGT 配列番号 138: AATGGGGTATTTTGTTCCACGT) Salmonella enter itidis用プライマ一 配列番号 139: AAATCAAAAAGGCGTACAAG 配列番号 140: GAGATTAAAGCAGCCTACGA Yersinia spp用プライマ一
配列番号 141: CGTTCAGGTACAAGTCAAGG 配列番号 142: GTGAGGTTCCTATTAACTTTGC
(もしくは、
Yersinia enterocol itica用プライマ一 配列番号 143: TACGCGGTGTGACTAAAGAA 配列番号 144: TATGTACCTGACCTGCACCA)
Clostridium perf r i ngens用プライマ一 (ただし、 16S rDNAをタ一ゲット核酸 とする)
配列番号 145: GGTGCTTCAGATGATGAG
配列番号 146: GGAGATAAGGAAGCGGAA
[0117] 上記各種プライマ一を以下のように混合して、 これらの 9種のプライマ一 セット全てを含むプライマ一液 Aを調製し、 さらに以下の P C R反応液を調 製した。
プライマ一液 A (各プライマ _1 ;UM) 2 u \
2 XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara) : 10 I
S. aureus DNA (GTC 250 株) : 5ng
蒸留水で 全量を 20ulとした。
[0118] なお、 コントロールとして、 S. aureusについてのプライマ一のみを用いて 、 Pプライマ一液 Bを調製し、 さらに以下の P C R反応液を調製した。
プライマ一液 B (各プライマ一 1 M) Z \
2 XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara) : I
S. aureus DNA (GTC 250 株) : 5ng
蒸留水を加えて全量を 20ulとした。
[0119] 上記の各 PGR反応液を各々 Light Cycler (ロッシュ社)用の毛細管チューブに試 薬をいれ、 Light Cyclerで遺伝子の増幅 (9 5°C: 1秒、 55°C:1秒、 7 2°C : 10秒を 50サイクル) を行なった。 結果を図 3に示す。
[0120] プライマ一液 Aで増幅した P C R産物とプライマ一液 Bで増幅した P C R 産物とは、 最終的にほぼ同じ増幅効率で増幅が確認された。 すなわち、 9種 類のプライマ一セットを含むプライマ一混合物と単独のプライマ一セッ卜と による増幅効率は同等レベルであり、 これらの各プライマ一は、 それぞれ干 渉することなく意図した菌の Dna J遺伝子の特定配列を増幅できることがわか つた。
実施例 2
[0121] 実施例 1で用いた S. aureusの DNAに替えて下記菌株の DNAを使用し、 同様の
条件で混合したプライマ一セットを使用した。 Light Cycler (ロッシュ社)用 の毛細管チューブで増幅した DNAを GYBR Greenの蛍光の増強をモニタ一した。 結果を図 4に示す。
[用いた菌株]
1. Campylobacter jejuni GTC 0259 型株
2. Vibrio chol erae GTC 0037 01 El To I型
3. Vibrio parahaemolyticus GTC 0056 ( = CDC A3308)
4. Escher ichia col i GTC 1061 0157 (VT1 and VT2 陽性)
5. Listeria monocytogenes GTC 0149 (=ATCC15313) type strain
6. Salmonel la enter ica var. Typhi murium GIFU 11566 ST-1
7. Yersinia enterocol itica GTC 0127 型株
8. Clostridium perfringens GTC 0785 (=ATCC13124)
[0122] 図 4に示すように、 各菌の DNAはプライマ一混合液 A中の特異的プライマ一 セットで増幅することが確認された。 すなわち、 これらの各プライマ一は、 それぞれ干渉することなく意図した菌の Dna J遺伝子の特定配列を増幅できる ことがわかった。
実施例 3
[0123] (Vibrio属菌の Dna J遺伝子の増幅)
Vibrio属菌の共通のフォワードプライマー (配列番号 43) と同属内の下記 のほかの菌種に特異的なリバースプライマ一を混合したプライマ一液を以下 のようにして調製した。
[0124] V brio属共通のプライマー (配列番号 43) 2 M
V brio chol erae (配列番号 44) 1 μ Μ
V brio mimicus (配列番号 47) 1 μ Μ
V brio vulnificus (配列番号 53) 1 μ Μ
V brio fluvial is (配列番号 134) 1 μ M
V brio parahaemolyticus (酉己歹 ij番号 50) 1 μ. M
V brio alginolyticus (配列番号 58) 1 μ M
[0125] さらに、 このプライマ一液を下記のようにして PCR反応液を調製した。 プライマ一混合液 (Foward2 u M Reverse各 1 M) : 2/J I
2 XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara) : ]0u I 各 vibrioの DNA (単独) : 5ng 水を加えて全量を 20 I とした。
[0126] [使用した Vibrio の菌株]
Vibrio cholerae GTC 0037 01 El Tol型
Vibrio mimicus GTC 0334 type 株
Vibrio vulnificus GTC 0116 type 株
Vibrio fluvial is GTC 0315 type 株
Vibrio parahaemolyticus GTC 0056 (=CDC A3308)
Vibrio alginolyticus GTC 0057 (=ATCC17449) 型株
[0127] 上記の PGR反応液を各々 Light Cycler (ロッシュ社)用の毛細管チューブに試 薬をいれ、 Light Cyclerを用いて遺伝子の増幅 (95°C: 1秒、 55°C 1秒、 72 °C: 10秒を 50サイクル) を行なった。 PCR増幅産物をァガロース電気 泳動で確認した結果を図 5に示す。
[0128] 図 5に示すように、 各々の菌種に予測されたサイズの増幅産物を得ること ができた。 すなわち、 これらの各プライマ一は、 それぞれ干渉することなく 意図した菌の DnaJ遺伝子の特定配列を増幅できることがわかった。
実施例 4
[0129] (Vibrio属菌における DnaJ遺伝子の増幅による検出感度と特異的増幅)
実施例 3で作成したプライマ一液を用いて Vibrio cholerae GTC 0037株の 検出感度を糞便で希釈したサンプルを使って比較した。 Vibrio cholerae GTC 0037株の菌液を生理食塩水、 および 10%の糞便懸濁液と混合し、 フヱノール —クロロフオルム法で DNAを抽出した。 抽出した核酸を連続希釈して、 実施例 3の P C R反応液における D N Aに替えて用いて P C R反応を実施し、 遺伝 子増幅の感度を電気泳動法で比較した。 結果を図 6に示す。
[0130] 図 6に示すように、 DNAを定量希釈し検出感度を測定したところ、 図中に示
した検出レベルにおいて増幅産物を検出できた。 またコレラ菌の DNAを人の正 常糞便から抽出した DNAと混合し、 検出感度を求めたところ、 蒸留水で希釈し たのと同じレベルまで検出感度が確認できた。 以上のことから、 このプライ マ一液の各プライマ一セットは、 糞便由来の夾雑物存在下においても、 それ ぞれ意図した菌種の Dna J遺伝子の特定領域を特異的に増幅することができ るとともに高感度に菌種を検出できることがわかった。
実施例 5
(性病の病原体菌種の DnaJ遺伝子増幅及び同定)
性病診断に使用する菌種の DnaJ遺伝子の特定領域に基づいて設計したブラ イマ一を混合し、 プライマ一液を調製した。
Mycoplasma genitar ium用プライマ一 (酉己歹 ij番号 71、 72)
Chlamydia trachomati s用プライマ一 (配列番号 75、 76)
Neisseria gonorrhoae用プライマ一 (配列番号 79、 80)
なお、 以下の菌種に関しては DnaJ遺伝子でない遺伝子の特定領域に基づいて プライマ一を設計した。
Ureaplasma spp.用プライマ一 (Tuf遺伝子)
配列番号 147: GGATGGTGCAATCTTAGTTATT
配列番号 148: ACTTGACGCGCTAATAGG
Treponema pal I idum用プライマ _(16S rDNA遺伝子)
配列番号 149: TGGGGATAGCCTCTAGAAATAG
配列番号 150: CCCTTTCCTCTCAAAGACCT
Herpes simplex vi rus用プライマ一 (GlycoproteinB蛋 l遺伝子)
配列番号 151 : CTGGTCAGCTTTCGGTACG
配列番号 152: CCGCAGCTCGTTGTTCTC
Papi I loma vi rus用プライマ一 (蛋白 E6遺伝子)
配列番号 153: TCAAAAGCCACTGTGTCCT
配列番号 154: CGACCCCTTATATTATGGAATCTT
Candida albicans用プライマー (26S rDNA遺伝子)
配列番号 155: TCAGTAGCGGCGAGTGAA
配列番号 156: GCCCAAAGATACCTTCTTCAAAT
Trichomonas vaginal is用プライマ一 (18S rDNA遺伝子)
配列番号 157: GAAATCATAGTTCTTGGGCTCTG
配列番号 158: CCTTCCGTCAATTCCTTCAAG
[0132] 上記の各プライマーを下記の要領で混合した P C R反応液を調製した。
プライマ一液 (各プライマ一 1uM) Z u \
2 XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara) : 10ul 各菌株の DNA : 5ng 水を加えて全量を 20 I とした。
[0133] 上記の P C R反応液を各々 Light Cycler (ロッシュ社)用の毛細管チューブ に試薬をいれ、 Light Cyclerを用いて遺伝子の増幅 (95°C: 1秒、 55°C 1 秒、 72°C: 10秒を 50サイクル) を行なった。 この実験には下記の菌株を使 用した。 Light Cycler (ロッシュ社)用の毛細管チューブで増幅した DNAを GYBR Greenの蛍光の増強をモニターした結果を図 7に示
す。
[0134] [用いた菌株]
1 Mycoplasma genitar ium GGS 2289 (clone from cl inical sample) 2 Chlamydia trachomatis GGS 922 (Clone from cl inical sample) 3 Neisseria gonorrhoae GTC 02085 (=ATCC 49226)
4Ureaplasma spp. GGS 1699 (Clone from cl inical sample) 5 Treponema pal I idum GGS 745 (Clone from cl inical sample) 6 Herpes simplex virus GGS 1943 (Clone from cl inical sample) 7 Papi I loma vi rus GGS 1944 (Clone from cl inical sample) 8 Candida albicans GTC 00654 (= I FM 5801)
9 Trichomonas vaginal is GGS 1941 (Clone from cl inical sample)
GTC: Gifu type culture col lection
GGS: Gifu Recombinant strain Col lection
ATCC: American type culture col lection, USA
NCTC: National col lection of type culture, UK
IFM: Research Center for pathogenic & microbial toxicoses, Chiba Uni versity)
[0135] 図 7に示すように、 各菌株の DNAは増幅されていた。 すなわち、 これらの各 プライマーは、 それぞれ干渉することなく意図した菌の DnaJ遺伝子の特定配 列を増幅できることがわかつた。
実施例 6
[0136] (肺炎■咽頭炎の病原体菌種の DnaJ遺伝子増幅及び同定)
肺炎や咽頭炎を起こす病原体菌種の DnaJ遺伝子の特定領域に基づいて設計 したプライマ一を混合し、 プライマ一液を調製した。
Streptococcus pneumoniae用プライマ一 (酉己歹 ij番号 9、 10)
Streptococcus pyogenes用プライマ一 (酉己歹 ij番号 1、 2)
Staphylococcus aureus用プライマ一 (酉己歹 ij番号 13、 14)
Klebsiel la pneumoniae用プライマ一 (酉己歹 ij番号 17、 18)
Escherichia col i用プライマー (配列番号 21、 22)
Mycobacterium tuberculosis用プライマ一 (配列番号 25、 26)
Chlamydia pneumoniae用プライマ一 (配列番号 39、 40)
Legionel la pneumophi la用プライマ一 (酉己歹 ij番号 35、 3り
Mycoplasma pneumoniae用プライマ一 (酉己歹 ij番号 31、 32)
Mycobacterium group用プライマ一 (配列番号 29、 30)
[0137] [用いた菌株]
Streptococcus pneumoniae GTC 01147(=NCTC 7465)
Streptococcus pyogenes GTC 01839
Staphylococcus aureus GTC 02805
Klebsiel la pneumoniae GTC 00107(=NCTC 9633)
Escherichia col i GTC 09975 (=ATCC 25868)
Mycobacterium tuberculosis GTC 12850 (=ATCC 27294)
Chlamydia pneumoniae ATCC VR 145
Legionel la pneumophi la GTC 00702 (=ATCC 33737)
Mycoplasma pneumoniae GTC 00666 (-ATCC 15531)
Mycobacterium avium GTC 00603 (=ATCC 25291)
GTC: Gifu type culture col lection
GGS: Gifu Recombinant strain Col lection
ATCC: American type culture col lection, USA
NCTC: National col lection of type culture, UK
IFM: Research Center for pathogenic & microbial toxicoses, Chiba Uni versity)
[0138] 上記の各プライマーを下記の要領で混合した P C R反応液をを調製した。
プライマ一液 (各プライマ一 1uM) Z u \
2 XCYBER premix Hotstart Ex Taq(Takara) : I 各菌株の DNA : 5ng 水を加えて全量を 20 I とした。
[0139] 上記の P C R反応液を各々 Light Gyc I er (ロッシュ社)用の毛細管チューブ に試薬をいれ、 Light Cyclerを用いて遺伝子の増幅 (95°C: 1秒、 55°C 1 秒、 72 °C: 10秒を 50サイクル) を行なった。 この実験には上記の菌株 DNAを 使用した。 P C R増幅産物をァガロ一ス電気泳動で確認したところ、 これら のプライマ一セットは、 それぞれ意図した菌種の Dna J遺伝子の特定領域を 特異的に増幅することができるとともに高感度に菌種を検出できることがわ かった。
実施例 7
[0140] (Mycobacterium属菌の菌種の DnaJ遺伝子の増幅及びシークェンスによる同 定)
Mycobacterium属菌の dnaJ遺伝子を 55菌種 3亜種の基準株 (図 8に示す) の
ほぼ全領域を Primer working法でシークェンス(Appl ied biosystem社、 )し、 配列番号 29、 30、 131、 132及び 133による 386bpの増幅配列と、 ほぼ全領域の 1 188bpの両者で配列を比較した。 その結果を、 すでに解析が行なわれている既 存の遺伝子 RpoBと比較した。 結果を図 9、 1 0に示す。
[0141] 図 9及び図 1 0に示すように、 16S rDNA配列が平均して 96.6%の類似度で あつたのに対し、 dnaJでは 80.7%であり、 比較した rpoB、 hsp65が 90.0- 90.7% に対して最も多型が大きかった。
[0142] また、 M. kansasi i_M. gastriは 16S rDNA配列が 100%—致して区別できない が (図 1 1 ) 、 DnaJ遺伝子を比較してみると、 M. kansasi i- M. gastr iは 95.5% と開きがあった。 そこで生化学的性状で M. kansasi i (20株) と M. gastr i (2株) の臨床分離株 23株 (KPM番号株)、 を上記配列番号 29、 30、 131、 132及び 133で 増幅し、 既に配列を決定した全基準株の配列を使って系統樹を作成した。 そ の結果、 図 1 2に示すように、 すべての株が生化学的性状で同定した結果と —致した。
[0143] また、 M. avium と M. intracel lulaeは生化学的性状が類似し識別が困難であ るので M. avium ― M. intracel lulare group (MAC group)として総称されてしゝ た臨床分離株 16株(図の KPM株)を同様に配列を決定し、 比較した。 その結果を 図 1 3に示す。
[0144] 図 1 3に示すように、 9株は M. avium、 3株が M. intracel lulareであり、 3株 が新しく分類された M. chimaera、 1株が M. scrof laceumと同定された。 以上の ことから、 この全塩基配列、 および部分配列で同定する方法が、 生化学性状 で識別できない菌群の正確な同定に有効であることがわかつた。
実施例 8
[0145] 本実施例では、 Legionel la pneumophiaG T C1279DNAをタ一ゲット核酸と してマルチプレックス P CRを実施した。 プライマ一としては、 1 8種類の タグ付きアニーリングプライマ一セットの混合液 (フォワードプライマ一 ( 配列番号 1〜1 8) 及びリバースプライマ一 (配列番号 1 9〜36) (いず れもタグ付き) 各最終濃度 0. 1 ;UM) とこれらのプライマーに付したそれ
ぞれのタグと同一配列のタグを有する増幅プライマ一セッ卜の混合液 (フォ ワードプライマ一 (配列番号 37) 及びリバースプライマ一 (配列番号 38 ) (いずれもタグのみ) 各最終濃度 1 ;U M) を準備した。 これらのプライマ —の配列を図 1 5に示す。
[0146] これらのプライマ一混合液及び DNA溶液 (Legionel la pneumophiaG T C127 9DNA1 u g/m I ) を用いて以下の組成で P C R反応溶液を調製し、 ライ ト サイクラ一 (ロッシュ株式会社製) を用いて以下の条件で P CRを実施した 。 比較例として、 上記 1 8種類のプライマ一セットのフォワードプライマ一 から 5' 末端から 1 8塩基のタグ配列を取り除いたアニーリングプライマ一 と、 リバースプライマーの 5' 末端から 27塩基のタグ配列を除いたァ二一 リングプライマーとタグ無しアニーリングプライマ一セッ卜の混合液 (フォ ワードプライマー及びリバースプライマー (いずれもタグ無し) 各最終濃度 0. 1 μ Μ) を準備して、 以下の組成で P C R反応溶液を調製し、 実施例と 同様にして P C Rを行った。 増幅モニタ一結果を図 1 6に示す。
[0147] (実施例 8の P C R反応液の組成)
2 X SYBR premix E x T a q T a K a R a) ^ 0 μ \ プライマ一混合液 (Fプライマ一、 Rプライマ一各 1 Μ) 2 u I 増幅プライマ一混合液 (Fプライマ一、 Rプライマ一各 1 0 Μ) 2 μ I Legionel la pneumophiaG T C1279DNA ( 1 n g/m I ) 1 μ I dH20 5 u I 全量 20 I
[0148] (比較例の P C R反応液の組成)
2 x SYBR premix E x T a q T a K a R a) Λ 0 H \ プライマ一混合液 (Fプライマ一、 Rプライマ一各 1 M) 2 u I Legionel la pneumophiaG T C1279DNA ( 1 n g/m I ) 1 μ I d H20 7 u I 全量 20 I
[0149] (反応条件)
95°C、 1秒、 60°C、 1秒、 72°C、 5秒 60サイクル
[0150] 図 1 6に示すように、 実施例 8のタグ付きプライマ一セッ卜と増幅プライ マ一セッ卜とによって Leg i one I I a pneumoph i a G T C 1279DNAを 35サイクル 付近で増幅シグナルが増加しはじめ、 40サイクル程度で良好な検出感度を 示した。 これに対し、 増幅プライマ一を用いない比較例では、 50サイクル でもまったくターゲット核酸は増幅されなかった。 以上のことから、 タ一ゲ ット核酸に対して選択的にァニールするァニール配列とタグ配列とを有する アニーリングプライマーと、 当該タグ配列と同一のタグ配列を有する増幅用 プライマーとを用いることで多種類のプライマ一セットを用いても十分に特 定のターゲット核酸を増幅できることがわかった。
実施例 9
[0151] 本実施例は、 実施例 8で作成したタグ付きアニーリングプライマーと増幅 プライマ一との配合比率を、 表 2に示すように、 1 : 1〜 1 : 50にまで変 化させた。 以下に示すようにして P C R反応液を調製す u u u uるとともに以下の条 件で P CRを実施した。 なお、 ターゲット核酸としては、 Mycoplasma pneumo niaeG T C2987DNAを用いた。 比較例として従来の単独プライマ一溶液 (4 m、 8 μ Μ) を用いて以下の組成で P CR反応液を調製して、 実施例と同様 の条件で P C Rを行った。 結果を図 1 7に示す。 なお、 単独プライマ一は、 M ycoplasma pneumoniae16S r DNAのフォワードプライマ一及びリバ一スプライ マーからタグ配列を除いた配列である。
ほ 2] プライマー混合物 混合比率
No.1 Anealing 0.5uM: 2ul 增巾 Taa 0.5uM)
No.2 Anealing 0.5uM: 2ul 增塁 Tag 2.5uM) 5
No.3 Anealing 0.5uM: 2ul 增 ijfTag (5uM) 10
No.4 Anealing 0.5uM: 2ul 增巾 Tag (10uM) 20
No.5 Anealing 0.5uM: 2ul 增巾屋 Tag (20uM) 40
No.6 Anealing 0.5uM: 2ul 增幅 Tag (25uM) 50
[0152] (実施例 9の P C R反応液の組成)
2 x SYBR premix H o t S t a r t (T a K a R a) ^ 0 Lt \
Mycoplasma pneumoniaeG T C2987DNA (1 n g m I ) 1 u I プライマ一混合液 4 μ I dH20 5 u I 全量 20
[0153] (比較例の P C R反応液の組成)
2 x SYBR premix H o t S t a r t (T a K a R a) 1 0 u
Mycoplasma pneumoniaeG T C2987DNA (1 n g/m I ) 1 μ I 単独プライマ一 * (4 M、 8 U M) 混合液 4 I dH20 5 u I 全量 20
[0154] (反応条件)
95°C、 1秒、 60°C、 1秒、 72°C、 5秒 60サイクル
[0155] 図 1 7に示すように、 アニーリングプライマ一に対する増幅プライマーの 比率の上昇に伴って増幅効率は上昇して、 当該比率が 1 0倍以上のとき、 単 独のプライマ一を 0. 4 M濃度で用いて増幅した場合と同等の増幅効率を 示した。
実施例 10
[0156] 本実施例では、 図 1 8及び図 1 9に示す下痢の細菌性病原微生物及びウイ ルス性病原の保有する遺伝子の所定の領域をターゲット核酸とするァニーリ ングプライマーと増幅プライマーとの比率を 1 : 50に設定となるよう、 以 下の組成で P C R反応液を調製するとともに以下の反応条件で P C Rを実施 した。 P C R実施後、 P C R産物を、 図 20に示すプローブを搭載したシリ コンチップ (東洋鋼鈑製) と 55°Cで 30分ハイブリダィズさせた。 ハイブ リダィゼ一シヨン後、 チップを洗浄し、 レーザ一スキャナ Scan Array 400 0 (G S I L u m o n i c s社製) で C y e 5の蛍光強度を計測した。 結果 を図 21に示す。 なお、 図 21には併せてスポッ卜したプローブの位置情報 を示す。
[0157] (実施例 1 0の P C R反応液の組成)
2 x SYBR premix H o t S t a r t ( T a K a R a ) ^ 0 μ \
Vibrio choleraeDNA (1 n g/m I ) 1 μ I
Adenovi rusDNA (1 n g/m I ) 1 μ I
アニーリングプライマ一混合液 (各 0. 2 M) u I
増幅プライマ一混合液 (各 1 0 ;UM) 2 μ I
dH20 4 u I
全量 20 I
[0158] (反応条件)
95°C、 1秒、 60°C、 1秒、 72°C、 5秒 60サイクル
[0159] 図 21に示すように、 49種類のアニーリングプライマ一セットを含んで いても、 2種類のターゲット核酸をそれぞれ特異的にかつ良好な感度で検出 することができた。
実施例 11
[0160] 本実施例では、 図 22に示す 1 6種類の S TD用アニーリングプライマ一 セットの混合 (各プライマ一最終濃度 0.02 ;UM) 及び増幅プライマ一セット 混合液 (各 1 O M) を準備、 以下に示すようにアニーリングプライマーに 対する増幅プライマーの比率を 20となるように、 以下の組成で PC R反応 液を調製し、 以下の条件で PC Rを行った。 増幅反応後、 PCR産物を図 2 3に示すプローブを結合させた I um i n a x社の蛍光ビーズお Streptav i d i n_phycoerythrinを加え、 室温で 30分間反応させ、 Lumi nax社の蛍光測定機 器(Luminaxl 00)で蛍光強度を測定した。 結果を図 24に示す。
[0161] 図 24に示すように、 PCR反応液に含まれる唯一のターゲット核酸であ る Chlamydia toracomatisのプローブと高い特異性で結合した。 以上のこと から PC R産物中には、 このタ一ゲット核酸が特異的に増幅されていたこと がわかった。
実施例 12
[0162] 本実施例では、 図 25に示す 4種類のプライマ一混合物を調製した。 図 2 5に示す各プライマ一は既に記載した配列のものを用いた。 プライマ一 P C
R反応液には、 図 25に示す各菌種の DNAをそれぞれ 200 p g/m I、 各ァ 二一リングプライマ一を 0. 075 M、 各増幅プライマ一を 0. 8 M、 共通 1 6 S r R N Aプライマ一を 0. 2 M含めるようにした。 なお、 DN Aポリメラ一ゼは SYBR premix H o t S t a r t ( T a K a R a ) を使 用した。 この PC R反応液につき、 95°C、 1分間加熱後、 95°C、 1秒、 55°C、 1秒、 72°C、 1 0秒のサイクルを 50回実施した。 結果 (C Tm 値) を図 26に示す。 なお、 CTm値は、 を 1回微分したときの増幅曲線の 半分値となる蛍光シグナル強度等のシグナルに到達するまでの PC Rサイク ル数である。 CTm値が小さし、ほど、 増幅効率が良いといえる。
[0163] 図 26に示すように、 1 6 S r RN A遺伝子をターゲット核酸とし、 ァニ —リングプライマーと増幅プライマ一とからなるプライマ一混合物 Aで P C Rを実施した場合、 C Tm値は 40〜46程度であつたのに対し、 1 6 S r R N Aの共通配列をリ /く一スプライマ一とするプライマ一混合物 Bでは C T m値が低下する傾向が観察された。 すなわち、 1 6 S r RN Aをターゲット 核酸としてアニーリングプライマ一を設計すると、 系統的に異なつた菌種 8 種類のプライマーを混合しても、 かえって対照例よりも増幅効率が低下する 傾向があった。 したがって、 1 6 S r RNAは、 本発明のような多重化した マルチプレックス PC Rのタ一ゲット核酸として不向きであることがわかつ た。
[0164] これに対して、 プライマ一混合物 C及び Dの結果から明らかなように、 D n a J遺伝子をタ一ゲット核酸としてアニーリングプライマ一と増幅プライ マーとを用いる場合には、 多数の他のプライマ一 (合計 1 8種類) が存在し ていても特異的にターゲット配列にァニールして効率的に増幅できること力《 わかった。 したがって、 D n a J遺伝子は、 こうした多重化マルチプレック ス PC Rのタ一ゲット核酸として有利であることがわかった。
配列表フリーテキス卜
[0165] 配列番号 "!〜 86、 1 31 , 1 32, 1 33、 1 35〜 1 58、 1 59〜 2 94及び 326〜357 : プライマ一
配列番号 87〜 1 30、 1 34、 295〜 325及び 358〜 367 : プロ ーブ