WO2007148488A1 - 不活化遺伝子再活性化ペプチド - Google Patents

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Kazuo Harada
Nobuo Suzuki
Kazuko Kita
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    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to inactivated gene reactivation peptides and uses thereof.
  • Gene inactivation refers to the recombination of specific genes into the mammalian chromosome genome.
  • Chromatin disaggregation by trichostatin A has the effect of reactivating inactivated genes
  • TSA is cytotoxic, it has been difficult to control and to use safely when ES cells are established by anticancer therapy, animal cloning, or somatic cell nuclear transfer.
  • the present inventor has found that the peptide having an arginine motif has a reactivation action of inactivated gene expression as a result of intensive studies, and has completed the present invention. It came.
  • the present invention is as follows.
  • a peptide having an action of reactivating inactivated gene expression (1) A peptide having an action of reactivating inactivated gene expression.
  • a peptide comprising 65% or more of the amino acid sequence constituting the peptide or derivative thereof described in (2) above, a derivative thereof, or a salt thereof.
  • a transformant comprising the recombinant vector according to (7) above.
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide according to any one of (1) to (4) above, a derivative thereof, or a salt thereof.
  • an inactivated gene reactivating peptide is provided.
  • the peptide of the present invention has the effect of reactivating an inactivated gene, and can further suppress the proliferation of tumor cells with lower cytotoxicity in combination with other anticancer agents and radiotherapy.
  • the peptide of the present invention since the peptide of the present invention has no cytotoxicity, it is useful as a pharmaceutical composition for B serious ulcer and cancer.
  • the advantage of using the peptide of the present invention rather than TSA is that it is naturally degraded in cells and loses its activity because it is made from natural amino acids.
  • the action of the peptides of the invention is observed in 4 hours, reaches a maximum in 6-9 hours and disappears after 24 hours. This action is transient and therefore has no or very low cytotoxicity as TSA has. Therefore, peptides that exhibit TSA-like effects transiently are easier to control than TSA, especially in anti-cancer treatment or regenerative medicine in combination with radiation, for example, when establishing ES cells by animal cloning or somatic cell nuclear transfer. And safe processing.
  • FIG. 1 shows the sequence of peptides used (A) and the changes in R-luc activity (B) caused by various peptide treatments.
  • FIG. 2 is a diagram showing an increase in R-luc mRNA level (A) and an increase in activity (B) by peptide 2 (SEQ ID NOs: 1 and 3).
  • Fig. 3 shows changes in R-luc activity over time with peptide 2 and TSA
  • the present invention is a peptide having an arginine-rich 31 amino acid sequence as a skeleton and having an inactivated gene reactivation effect, and intends to suppress tumor cell growth with the peptide. .
  • the peptide of the present invention contains 31 amino acid sequences, and the 3rd to 27th of them form a domain rich in arginine or lysine (referred to as “arginine-rich domain”).
  • the peptide of the present invention is shown as SEQ ID NO: 1 below.
  • YGRKKRRQRR RMA RRIRRRLRQR AR RRAAAA SEQ ID NO: 1
  • the present invention also provides one or several amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1, preferably 1 to 11, more preferably, as long as the peptide has a reactivation effect on inactivated gene expression.
  • 1 to 5 amino acids may be deleted, and one or several, preferably 1 to 11, more preferably:! To 5 amino acids are added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • one or several, preferably 1 to 11, more preferably 1 to 5 amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be substituted with other amino acids. .
  • reactivation of inactivated gene expression refers to the effect of increasing the expression of genes that have undergone epigenetic suppression due to the influence of the surrounding inactivated chromatin structure. And increasing the expression level of a gene whose expression level is extremely low in the cell.
  • the peptide of the present invention is considered to reactivate the gene by loosening the structure of aggregated chromatin containing the inactivated gene vicinity region.
  • Reactivation of the peptide of the present invention in an inactivated cell can be achieved by reducing the expression level of mRNA in a strain whose expression is significantly lower than that of other cells when mRNA of a specific gene is recombined into the mammalian cell genome. It can be evaluated by measuring. Examples of methods for measuring the mRNA expression level used in this case include RT-PCR and Northern plot analysis.
  • the peptide of the present invention includes those in which a part of the amino acid sequence is chemically modified.
  • “Chemical modification” refers to the reaction of a chemical reagent with a protein, mainly changing the chemical structure of the side chain of an amino acid residue.
  • a method of reacting with a reagent for example, polyethylene glycol
  • Affinity label may be performed.
  • Chemical modification methods are well known in the art (Sonoku Ohno ⁇ Kim Yu Oka ⁇ Fumio Sakiyama ⁇ Hiroshi Maeda, Biochemical Experimental Method 12, Chemical Modification of Proteins (above), Academic Publishing Center).
  • the present invention includes derivatives thereof in addition to the above peptides.
  • “Derivatives” include those derived from the peptides of the present invention, wherein the number of amino acids is reduced to 3 or more, or some amino acids are replaced with other amino acids including unnatural products. .
  • substitutions and deletions are based on molecular evolutionary engineering and structural analysis using X-rays and R.
  • the present invention relates to 65% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% of the amino acid sequence constituting the peptide (SEQ ID NO: 1), a variant thereof, or a derivative thereof
  • peptides containing 95% or more, derivatives thereof or salts thereof are provided.
  • the 65% region include an arginine-rich domain region in the sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence of the peptide of the present invention is determined as described above, a DNA encoding the amino acid sequence is constructed and expressed, whereby a certain is chemically synthesized. Can be obtained.
  • the peptide salt of the present invention is preferably a physiologically acceptable acid addition salt or basic salt.
  • acid addition salts include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, and sulfuric acid, or acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, kenic acid, and apples.
  • examples of such salts include, but are not limited to, salts with organic acids such as acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • Basic salts include, for example, salts with inorganic bases such as sodium hydroxide, hydroxyammonium hydroxide, ammonium hydroxide, magnesium hydroxide, and organics such as caffeine, piperidine, trimethylamine, and pyridine. Examples include salts with bases, but are not limited thereto.
  • Salts can be prepared using a suitable acid such as hydrochloric acid or a suitable base such as sodium hydroxide.
  • a suitable acid such as hydrochloric acid or a suitable base such as sodium hydroxide.
  • ethanol or young can be prepared by treatment with a standard protocol in a liquid containing an inert water-miscible organic solvent such as dioxane.
  • the peptide of the present invention when chemically synthesized, it can be synthesized by a well-known peptide synthesis method. Examples include, but are not limited to, the azide method, the acid chloride method, the acid anhydride method, the mixed acid anhydride method, the DCC method, the active ester method, the carboimidazole method, and the oxidation-reduction method.
  • a well-known peptide synthesis method examples include, but are not limited to, the azide method, the acid chloride method, the acid anhydride method, the mixed acid anhydride method, the DCC method, the active ester method, the carboimidazole method, and the oxidation-reduction method.
  • solid phase synthesis method either solid phase synthesis method or liquid phase synthesis method can be applied. You can use a commercially available peptide synthesizer (such as PSSM-8 manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the peptide of the present invention can be purified by combining ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization. 3. Polynucleotides that code for peptides
  • the polynucleotide encoding the peptide of the present invention includes a polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 having 1 to 11 amino acids deleted, substituted or substituted It comprises a polynucleotide that encodes a peptide (mutant peptide) that consists of an added amino acid sequence and that has the effect of reactivating inactivated gene expression.
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained by genetically designing the peptide of the present invention.
  • a base sequence may be designed and synthesized based on the amino acid sequence of the peptide of the present invention.
  • examples of the polynucleotide include DNA and RNA, and DNA is preferred.
  • a polypeptide encoding SEQ ID NO: 1 amino acid sequence can be prepared by site-directed mutagenesis well known in the art. it can. Using a commercially available site-specific mutagenesis kit (row; ⁇ J TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-
  • a thread expression vector for protein expression can be obtained by ligating the above-mentioned polynucleotide to an appropriate vector, and a transformant can be used to transform the recombinant vector of the present invention into a host so that the target gene can be expressed. It can be obtained by introduction (Sambrook J and Russel D. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001).
  • a phage or plasmid capable of autonomously growing in a host microorganism.
  • the plasmid DNA include plasmids derived from Escherichia coli, Bacillus subtilis or yeast, and examples of phage DNA include fly phage.
  • animal virus and insect virus vectors can be used.
  • the recombinant vector can be prepared by cleaving the purified DNA with an appropriate restriction enzyme, inserting it into an appropriate vector DNA restriction enzyme site, etc., and ligating it to a vector.
  • the host used for transformation is not particularly limited as long as it can express the target gene.
  • Examples include bacteria (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), yeast, animal cells (COS cells, CH0 cells, etc.) and insect cells.
  • Methods for introducing a recombinant vector into a host include any method (for example, a method using calcium ions, an electroboration method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, a ribofusion method, etc.) .
  • the peptide of the present invention can also be obtained by culturing the transformant and collecting it from the culture. “Culture” means any of (a) culture supernatant, (b) cultured cells, cultured cells, or their debris. Culture methods are well known in the art (see Sambrook et al., Molecular Cloning, supra).
  • the target peptide When the target peptide is produced in cells or cells after culturing, proteins are extracted by disrupting the cells or cells. When the target protein is produced outside the cells or cells, the cells or cells are removed by the force of using the culture solution as it is, centrifugation or the like. Later, common biochemical methods used to isolate and purify proteins, such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chroma The target peptide can be isolated and purified by using topography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combination.
  • RNA into a cage a method of making DNA into a cage
  • DNA DNA into a cage
  • vertical DNA the polynucleotide described in the above 3
  • vertical DNA the above polynucleotide having a promoter and ribosome binding site upstream of the translation initiation point, or upstream of the translation initiation point. Examples thereof include a polynucleotide in which a promoter necessary for transcription is incorporated.
  • a pharmaceutical composition comprising a peptide, a derivative thereof or a salt thereof
  • the target tumor in the present invention is not particularly limited, but examples include at least one selected from the following group: brain tumor (glioma, meningiomas, medulloblastoma, etc.), tongue Cancer, gingival cancer, nasal cancer, pharyngeal cancer, esophageal cancer, duodenal cancer, stomach cancer, spleen cancer, bile duct cancer, gallbladder cancer, small intestine cancer, colon cancer (colon cancer, direct bowel cancer), anal cancer, liver cancer, prostate Cancer, kidney cancer, bladder cancer, lung cancer, breast cancer, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer, vulvar cancer, vaginal cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, various leukemias
  • the peptide of the present invention when used as an antibiotic, it can target diseases such as infectious diseases. These diseases may be single, concomitant, or concomitant with other diseases other than those mentioned above, and any of them may be targeted for use of the peptide of the present invention. it can.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be systemically or locally administered orally or parenterally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is orally administered, it is any of tablets, capsules, granules, powders, pills, troches, liquids for internal use, suspensions, emulsions, syrups, etc. Alternatively, it may be a dry product that is redissolved when used.
  • a pharmaceutical form such as intravenous injection (including infusion), intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, etc. can be selected.
  • intravenous injection including infusion
  • intramuscular injection intraperitoneal injection
  • subcutaneous injection subcutaneous injection
  • suppository etc.
  • they are provided in the form of unit dosage ampoules or multi-dose containers.
  • compositions include excipients, bulking agents, binders, wetting agents, disintegrating agents, lubricants, surfactants, dispersants, mild agents, preservatives, solubilizers, antiseptics, etc.
  • Agents, flavoring agents, soothing agents, stabilizers, tonicity agents, and the like can be appropriately selected and produced by conventional methods.
  • the above-mentioned various preparations may contain pharmaceutically acceptable carriers or additives together.
  • pharmaceutically acceptable carriers and additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, pectin, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, Examples include agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, and lactose.
  • the additive used is selected appropriately or in combination from the above according to the dosage form of the present invention.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the age of the administration subject, the administration route, and the number of administrations, and can vary over a wide range.
  • the effective amount administered as a combination of an effective amount of the peptide of the present invention with an appropriate diluent and a pharmacologically usable carrier is 10 to 1000 mg / body, preferably 50 to 500 mg per kg body weight at a time.
  • the dose in the range of / body can be selected, and it is administered once or more in 1 to several times a day. 6.
  • the peptide of the present invention Since the peptide of the present invention, a derivative thereof or a salt thereof (hereinafter referred to as the peptide of the present invention) has an action similar to the above-described trichostatin A (TSA), it is used as an experimental reagent, particularly for cell engineering. It can be used as a reagent. In particular, the peptide of the present invention can be used as a differentiation-inducing reagent in the field of regenerative medicine.
  • TSA trichostatin A
  • stem cells and the peptides of the present invention can be reacted to induce white blood cells.
  • it can be used as a reagent that reacts with embryonic cells to restore the totipotency of the cells.
  • the production rate of cloned mice can be improved, and the success rate of NT-ES cell establishment can be improved.
  • the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
  • HeLa / R-luc— A is a cell that expresses moderate to high levels of R-luc
  • HeLa / R-luc—B was a cell expressing very low levels of R-luc (see Fig. 1B, control). 2) Peptide treatment of cells
  • the medium was changed to 0PTI-MEM medium without serum, peptides were added, and the cells were incubated for 30 minutes.
  • the peptides used were Peptidel (SEQ ID NO: 2), Peptide2 (SEQ ID NO: 3), Peptidel-TAT
  • Peptidel is a negative control peptide
  • Peptide2 is a peptide of the present invention
  • Peptide 1 and 2 also have a TAT sequence that penetrates into the cell.
  • Peptidel-TAT and Peptide2-TAT are peptides obtained by removing the TAT sequence from the above peptides. After 30 minutes, the medium containing the peptide was removed and replaced with a normal medium containing serum (MEM medium, 10% calf serum). After culturing for a certain period of time, the cells were collected and subjected to noreluciferase assay and RNA isolation.
  • MEM medium normal medium containing serum
  • the luminescence amount of the reaction substrate due to the action of luciferase was quantified with Atoichi's luminometer, AB-2200.
  • the activity was indicated by an arbitrary value per unit cell number (RLU, relative luminescent unit).
  • RNA separation kit Qiagen RNAeasy MiniKit. Single-stranded cDNA was synthesized by reverse transcription reaction using oligo dT primer with the whole RNA as a saddle type. Semi-quantification of the expressed amount of R-luc gene was performed by PCR using this cDNA as a saddle type. In Fig. 2, the R-luc gene was amplified 30 times, and the GAPDH gene used as a control was amplified 18 times.
  • the amplified gene product was visualized by agarose electrophoresis and ethidiumpromide staining, and the intensity of the stained DNA band was semi-quantified with a computer.
  • Peptide 1 and 2 have a TAT sequence that penetrates into the cell. Intracellular movement of these two peptides has been confirmed using fluorescently labeled peptides.
  • the activity of R-luc was examined 6 hours after the cells were treated with each of the four peptides having the TAT sequence and the above-mentioned peptide from which the TAT sequence was removed.
  • increased activity of R-luc was observed.
  • HeLa / Rluc_B which has a low expression level, showed an increase in activity of more than 10-fold (Fig. 1B).
  • This increase in activity can be considered in two ways: increased expression and enzyme activation by peptides.
  • enzyme activation since it acts on the expressed protein, the rate of increase in activity must be the same regardless of the clone, and this case is not true.
  • Sequence number 4 Synthetic peptide Sequence number 5: Synthetic peptide

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Abstract

本発明は、以下の(a)若しくは(b)のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を提供する。　(a) 配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド　(b)配列番号１で表されるアミノ酸配列において１～11個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、不活化された遺伝子発現の再活性化作用を有するペプチド。　これにより、不活化された遺伝子発現の再活性化作用を有するペプチドが提供される。

Description

不活化遺伝子再活性化ぺプチド 技術分野
本発明は、 不活化遺伝子再活性化べプチドとその用途に関する。 背景技術
遺伝子の不活化とは、 哺乳細胞染色体ゲノムへ特定の遺伝子の組み替えを行つ 明
た際に起こる現象である。 組み込まれた染色体上の位置により、 遺伝子が周囲の 凝集 （不活性化） クロマチンの影響を受け、 遺伝子発現が抑えられる場合のある 書
ことが知られている。 これは、 位置効果と呼ばれている。 この不活化の原因は、 哺乳細胞における染色体ゲノムの遺伝子発現が、 DNAのメチル化、 ヒストン蛋白 のメチル化、 ァセチル化などの修飾を含んだ複雑な生命現象により制御されてい る事に起因するというものである。 その結果、 組み込まれた周囲の凝集 （不活性 ィ匕） クロマチンにより、 遺伝子発現が著しく抑制されてしまう。 この現象は、 ト リコスタチン A (TSA) などのヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤により、 活性ィ匕 した凝集クロマチンの構造が緩むことにより、 遺伝子発現の活性が再び増大する、 すなわち再活性化が起きることが知られている。
トリコスタチン A (TSA)によるクロマチン脱凝集は、 不活性化された遺伝子を 再活性化する作用の他にも、
1 ) 白血球細胞の分化を誘導し、 様々の癌細胞の増殖を抑える、
2 ) 癌細胞の放射線感受性化を誘導する （文献 1 ) 、
3 ) クローンマウス作製率向上や NT- ES細胞の樹立成功率の向上作用もある (文献 2 )、
などの作用/効能をもたらす。
し力 し、 TSAには細胞毒性があるため、 抗癌治療、 あるいは動物クローン作製 又は体細胞核移植による ES細胞樹立の際に、 制御が難しく、 また安全に使用す ることは困難であった。 参照文献
( 1 ) Cancer Biol Ther. 2005 Jul ; 4 (7) : 787-93. Epub 2005 Jul 16
( 2 ) Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 340 Issue 1， 3 February 2006， Pages 183 - 189 発明の開示
本発明は、 不活化された遺伝子発現の再活性化作用を持つぺプチドとその利用 方法を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため、 鋭意研究を行った結果、 アルギニンモ チーフを有するぺプチドが不活化された遺伝子発現の再活性化作用を持つことを 見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
( 1 ) 不活化された遺伝子発現の再活性化作用を有するぺプチド。
( 2 ) 以下の（a)若しくは (b)のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
(a) 配列番号 1で表されるァミノ酸配列を含むぺプチド
(b) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1〜11個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 不活化された遺伝子発現の再活性 化作用を有するペプチド
( 3 ) 上記 （2 ) 記載のペプチド又はその誘導体を構成するアミノ酸配列の 65%以上を含むぺプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
( 4 ) アミノ酸配列の一部に化学修飾が施された、 （2 ) 記載のペプチド、 その 誘導体又はこれらの塩。
( 5 ) 以下の（a)若しくは (b)のぺプチド又はその誘導体をコードするポリヌクレ ォチド。
(a) 配列番号 1で表されるァミノ酸配列を含むぺプチド
(b) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1〜11個のァミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 不活化された遺伝子発現の 再活性化作用を有するぺプチド (6) DNAである （5) 記載のポリヌクレオチド。
(7) 上記 (5) 又は (6) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
(8) 上記 （7) 記載の組換えベクターを含む形質転換体。
(9) 上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこ れらの塩を含有してなる医薬組成物。
(10) 腫瘍細胞増殖抑制剤である （9) 記載の医薬組成物。
(1 1) 抗生物質である （9) 記載の医薬糸且成物。
(12) 上記 （1) 〜 （4) のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又は これらの塩を含有してなる実験用試薬。
(13) 細胞工学用試薬である （12) 記載の実験用試薬。
本発明により、 不活化遺伝子再活性化ペプチドが提供される。 本発明のぺプチ ドは、 不活化された遺伝子の再活性化作用を有し、 さらに他の抗癌剤、 放射線治 療と組み合わせ、 腫瘍細胞の増殖をより低細胞毒性で抑制することができる。 ま た、 本発明のペプチドは細胞毒性がないため、 B重瘍および癌に対する医薬組成物 として有用である。
TSAではなく、 本発明のペプチドを用いる利点は、 天然のアミノ酸を素材にし ているので細胞内で自然に分解し、 活性を失う点である。 本発明のペプチドの作 用は 4時間で認められ、 6〜9時間で最大に達し、 24時間後に消失する。 この作 用は、 一過的であるため TSAの持つような細胞毒性が無い、 またはきわめて低い。 したがって、 一過的に TSA様効果を示すペプチドとして、 特に放射線との併用に よる抗癌治療又は再生医療分野、 例えば動物クローン作製や体細胞核移植による ES細胞樹立の際に、 TSAよりコントロールしやすくかつ安全に処理することが可 能になる。 図面の簡単な説明
図 1は、 用いたぺプチドの配列 （A)と各種ぺプチド処理による R - luc活性の変 ィ匕 (B)を示す図である。
図 2は、 ぺプチド 2 (配列番号 1および 3 ) による R - luc mRNA量の増加（A)と 活性の増加 (B)を示す図である。 図 3は、 ぺプチド 2と TSAによる R- luc活性の経時変化を示す図である
HeLa/R-luc B細胞を使用した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 しかしながら、 本発明の範囲は以下の説明に 限定されるものではなく、 また、 本明細書に開示した実施形態は、 本発明の趣旨 を逸脱しない限りにおいて適宜変更されうる。 なお、 本明細書は、 本願優先権主 張の基礎となる日本特許出願 2 0 0 6 - 1 6 9 6 8 1号明細書の全体を包含する。 また、 本明細書に記載した全ての文献および刊行物は、 その目的にかかわらず参 照によりその全体を本明細書に組み込むものとする。 本発明は、 アルギニンに富む 31個のアミノ酸配列を骨格としつつ、 かつ不活 化遺伝子再活性化作用を有するペプチドであり、 当該ぺプチドによつて腫瘍細胞 増殖を抑制させようとするものである。
哺乳細胞の遺伝子の発現活性を制御する因子の一つであるヒストン蛋白には、 アルギニンリツチドメインが観察されている。 しかし、 ヒストン蛋白を化学合成 可能なサイズにした上で、 不活化遺伝子再活性化を図ったような事例は見られて いない。 これに対し、 本発明において、 発明者の鋭意努力の結果、 合成されたぺ プチドが不活化遺伝子再活性化作用を有する事を見出した。
以下に、 本発明の実施の形態について、 本発明のペプチドの合成、 そして、 合 成されたぺプチドについて行った不活化遺伝子の再活性化試験、 次に腫瘍細胞増 殖抑制試験等について詳細に説明する。
1 . 不活化遺伝子再活性化ペプチド又はその塩
本発明のペプチドは、 31個のアミノ酸配列を含むものであり、 その中の 3番 目から 27番目はアルギニン又はリジンに富むドメイン （ 「アルギニンリッチド メイン」 という） を形成するものである。 本発明のペプチドを以下に配列番号 1 として示す。 Y G R K K R R Q R R RMA R R I R R R L R Q R AR R R A A A A (配列番 号 1 )
本発明はまた、 不活化された遺伝子発現の再活性化作用を有するぺプチドであ れば、 配列番号 1で表わされるアミノ酸配列の 1個又は数個、 好ましくは 1〜11 個、 さらに好ましくは 1〜5個のアミノ酸が欠失してもよく、 配列番号 1で表わ されるアミノ酸配列に 1個又は数個、 好ましくは 1〜11個、 さらに好ましくは ：!〜 5個のアミノ酸が付加してもよく、 あるいは、 配列番号 1で表わされるアミ ノ酸配列の 1個又は数個、 好ましくは 1〜11個、 さらに好ましくは 1〜5個の アミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
ここで、 「不活化された遺伝子発現の再活性化作用」 とは、 周囲の不活性化ク ロマチン構造の影響により、 ェピジヱネティックな発現抑制を受けた遺伝子の発 現を上昇させる作用を意味し、 細胞中での発現量が著しく低い遺伝子の発現量を 増加させることを含む。 本発明のペプチドは、 不活性化された遺伝子近傍領域を 含んだ凝集クロマチンの構造を緩めることで遺伝子を再活性ィ匕させるものと考え られる。
本発明のぺプチドの不活ィヒ細胞における再活性化は、 特定の遺伝子の mRNAを 哺乳細胞ゲノムに組換えた際に、 発現が他の細胞と比べて著しく低い株における mRNAの発現量を測定する事で評価できる。 この場合に用いられる mRNA発現量 の測定手法としては、 例えば RT-PCR、 ノーザンプロット解析などが挙げられる。 このときに、 活性化比は、 本発明のペプチドで処理後 8時間の場合を、 未処理 の場合と比較して、 その発現量が少なくとも 3倍 （発現量比 =3以上） 、 好まし くは 5倍 （発現量比 =5以上） 、 さらに好ましくは 10倍以上 （発現量比 =10以 上） 増大している場合に、 再活性化が起こったと判断することができる。
また、 本発明のぺプチドは、 ァミノ酸配列の一部に化学修飾が施されたものも 含む。 「化学修飾」 とは、 化学試薬をタンパク質に反応させ、 主にアミノ酸残基 側鎖の化学構造を変えることをいう。 例えば、 本発明のペプチドの活性部位又は 活性部位近傍に存在すると予想されるアミノ酸を特異的に修飾する試薬 （例えば ポリエチレングリコール） を反応させる方法などが採用される。 ァフィニテイラ ベルを行ってもよい。 化学修飾法は、 当分野において周知である （大野素徳 ·金 岡祐ー ·崎山文夫 ·前田浩著、 生物化学実験法 12、 蛋白質の化学修飾 （上） 、 学会出版センター） 。
本発明は、 上記ペプチドのほかにその誘導体も含まれる。 「誘導体」 とは、 本 発明のペプチドを起源とし、 3 以上のアミノ酸にまでアミノ酸の数を減らしたり 一部のアミノ酸を非天然物を含んだ他のアミノ酸に置換したりしたものが含まれ る。
置換、 欠失の根拠として、 分子進化的工学や X線ゃ丽 Rなどによる構造解析を 行った結果を用いて行う場合などが含まれる。
さらに、 本発明は、 上記ペプチド （配列番号 1 ) 、 その変異体、 又はその誘導 体を構成するアミノ酸配列の 65%以上、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 最も好ましくは 95%以上を含むぺプチ ド、 その誘導体又はこれらの塩を提供する。 上記 65%の領域としては、 例えば 配列番号 1に示す配列のうち、 アルギニンリッチドメインの領域などが挙げられ る。
上記のとおり本発明のペプチドのアミノ酸配列が決定されると、 その後は、 当 該アミノ酸配列をコードする DNAを構築し、 これを発現させることにより、 ある レ、は上記べプチドを化学合成することにより、 得ることができる。
本発明のぺプチドの塩としては、 生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩 が好ましい。 酸付加塩としては、 例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など の無機酸との塩、 あるいは酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられるがこれらに限定されるもの ではない。 塩基性塩としては、 例えば、 水酸化ナトリゥム、 水酸化力リゥム、 水 酸化アンモニゥム、 水酸ィ匕マグネシウムなどの無機塩基との塩、 あるいはカフヱ イン、 ピぺリジン、 トリメチルァミン、 ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げら れるがこれらに限定されるものではない。
塩は、 塩酸などの適切な酸、 あるいは水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用 いて調製することができる。 例えば、 水中、 又はメタノール、 エタノール若しく はジォキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、 標準的なプロト コルを用いて処理することにより調製し得る。
2 . ペプチドの化学合成
本発明のぺプチドの化学合成を行う場合は、 周知のぺプチドの合成方法によつ て合成できる。 例えば、 アジド法、 酸クロライド法、 酸無水物法、 混合酸無水物 法、 DCC 法、 活性エステル法、'カルボイミダゾール法、 酸化還元法等が挙げられ るがこれらに限定されない。 また、 その合成は、 固相合成法及び液相合成法のい ずれをも適用することができる。 市販のペプチド合成装置 （島津製作所製 PSSM- 8など） を使用してもよレ、。
反応後は、 溶媒抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラフィー、 液体クロマトグラフ ィ一、 再結晶などの通常の精製法を組み合わせて本発明のぺプチドを精製するこ とができる。 3 . ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチド
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、 配列番号 1に示されるァ ミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド及び、 配列番号 1で表されるアミノ酸 配列において 1〜11個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配 列からなり、 かつ、 不活化された遺伝子発現の再活性化作用を有するぺプチド (変異体ペプチド） をコードするポリヌクレオチドを含む。
本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のぺプチドを遺伝子工学的に設計し、 得 ることができる。 例えば、 本発明のペプチドのァミノ酸配列をもとに塩基配列を 設計し、 合成すればよい。 ポリヌクレオチドとしては DNA、 RNAなどが挙げられ るが、 DNAであることが好ましい。
本発明の変異体べプチドを遺伝子工学的に得るには、 配列番号 1ァミノ酸配列 をコードするポリぺプチドを、 当分野において周知の部位特異的突然変異誘発法 によって変異体を作製することができる。 市販の部位特異的突然変異誘発用キッ 卜を用 ヽて レヽ （列; ^J TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-
K、 Mutan-Super Express Km等：タカラバィォ社製） ) 。 4 . 組換えベクター、 形質転換体及びペプチド
タンパク質発現用糸且換えベクターは、 上記ポリヌクレオチドを適当なベクター に連結することにより得ることができ、 形質転換体は、 本発明の組換えベクター を、 目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができ る (Sambrook J and Russel D. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001)。
ベクターには、 宿主微生物で自律的に増殖し得るファージ又はプラスミ ドが使 用される。 プラスミ ド DNAとしては、 大腸菌、 枯草菌又は酵母由来のプラスミ ド などが挙げられ、 ファージ DNAとしてはえ ファージが挙げられる。 さらに、 動 物ウィルス、 昆虫ウィルスベクターを用いることもできる。
組換えベクターの作製は、 精製された DNAを適当な制限酵素で切断し、 適当な ベクター DNAの制限酵素部位等に挿入してべクターに連結すればよい。
形質転換に使用する宿主としては、 目的の遺伝子を発現できるものであれば特 に限定されるものではない。 例えば、 細菌 （大腸菌、 枯草菌等） 、 酵母、 動物細 胞 （COS細胞、 CH0細胞等） 、 昆虫細胞が挙げられる。
宿主への組換えベクターの導入方法は公知であり、 任意の方法 (例えばカルシ ゥムイオンを用いる方法、 エレクトロボレーション法、 スフエロプラスト法、 酢 酸リチウム法、 リン酸カルシウム法、 リボフヱクシヨン法等） が挙げられる。 本発明において、 本発明のペプチドは、 前記形質転換体を培養し、 その培養物 から採取することにより得ることもできる。 「培養物」 とは、 （a)培養上清、 （b) 培養細胞若しくは培養菌体又はその破碎物のいずれをも意味するものである。 培養法は、 当分野において周知である （前記 Sambrookら、 Molecular Cloning を参照） 。
培養後、 目的ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、 菌体又は細 胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。 また、 目的タンパク質が菌体外 又は細胞外に生産される場合には、 培養液をそのまま使用する力、 遠心分離等に より菌体又は細胞を除去する。 その後、 タンパク質の単離精製に用いられる一般 的な生化学的方法、 例えば硫酸アンモニゥム沈殿、 ゲル濾過、 イオン交換クロマ トグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わ せて用いることにより、 目的のぺプチドを単離精製することができる。
本発明においては、 in vitro翻訳によるペプチド合成を採用することができ る。 この場合は、 RNAを錡型にする方法と DNAを踌型にする方法 （転写/翻訳） の 2通りの方法を用いることができる。 鎵型 RNAとしては、 前記 3に記載のポリ ヌクレオチドが挙げられ、 鎵型 DNAとしては、 翻訳開始点の上流にプロモーター とリボゾーム結合部位を有している上記ポリヌクレオチド、 あるいは翻訳開始点 の上流に転写に必要なプロモーター等が組み込まれたポリヌクレオチドが挙げら れる。 in vitro翻訳システムは、 市販のシステム、 例えば Expressway™システ ム （Invitrogen社） 、 PURESYSTEM (登録商標；ポストゲノム研究所） 、 TNTシス テム（登録商標； Promega社）などを用いることができる。 in vi tro翻訳システム によるぺプチド合成後は、 上記の一般的な生化学的方法を単独又は組み合わせる ことにより、 目的のぺプチドを単離精製することができる。 5 . ペプチド、 その誘導体又はこれらの塩を含む医薬組成物
本発明のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩 （以下、 本発明のペプチドと称 する。 ) を腫瘍細胞の増殖抑制剤として使用する場合は、 がん治療を特異目的と して用いることができる。 本発明において対象となる腫瘍は、 特に限定されるも のではないが、 例えば以下の群から選ばれる少なくとも 1種が挙げられる ： 脳腫瘍 （神経膠腫、 髄膜種、 髄芽腫等） 、 舌癌、 歯肉癌、 鼻癌、 咽頭癌、 食道 癌、 十二指腸癌、 胃癌、 脖臓癌、 胆管癌、 胆嚢癌、 小腸癌、 大腸癌 （結腸癌、 直 腸癌） 、 肛門癌、 肝臓癌、 前立腺癌、 腎臓癌、 膀胱癌、 肺癌、 乳癌、 子宮頸癌、 子宮体癌、 卵巣癌、 外陰癌、 膣癌、 横紋筋肉腫、 線維肉腫、 骨肉腫、 各種白血病 (急性骨髄性白血病、 急性リンパ性白血病、 慢性骨髄性白血病、 慢性リンパ性白 血病等） 、 悪性リンパ腫（リンパ肉腫、 細網肉腫、 ホジキン病）、 多発性骨髄腫、 皮膚癌、 悪性黒色腫。
また、 本発明のペプチドを抗生物質として使用する場合は、 感染症などの疾患 を対象とすることができる。 これらの疾患は、 単独であっても、 併発したものであっても、 上記以外の他の 疾病を併発したものであってもよく、 いずれも本発明のぺプチドを使用する対象 とすることができる。
さらに、 健常者に対して、 感染予防の目的で使用することも可能である。
本発明の医薬組成物は、 経口又は非経口的に全身又は局所投与することができ る。 本発明の医薬組成物を経口投与する場合は、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散 剤、 丸剤、 トローチ剤、 内用水剤、 懸濁剤、 乳剤、 シロップ剤等のいずれのもの であってもよく、 使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。 また、 本 発明の医薬組成物を非経口投与する場合は、 静脈内注射 （点滴を含む） 、 筋肉内 注射、 腹腔内注射、 皮下注射、 坐剤などの製剤形態を選択することができ、 注射 用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。
これらの各種製剤は、 製剤上通常用いられる賦形剤、 増量剤、 結合剤、 湿潤剤、 崩壊剤、 潤滑剤、 界面活性剤、 分散剤、 緩褸 ί剤、 保存剤、 溶解補助剤、 防腐剤、 矯味矯臭剤、 無痛化剤、 安定化剤、 等張化剤等などを適宜選択し、 常法により製 造することができる。
上記各種製剤は、 医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであって もよレ、。 このような担体及び添加物の例として、 水、 医薬的に許容される有機溶 剤、 コラーゲン、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルボキシメチ ルスターチナトリウム、 ぺクチン、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 カゼイン、 ゼラチン、 寒天、 グリセリン、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 ワセリン、 パラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリン酸、 ヒト血清アルブ ミン、 マンニトール、 ソルビトール、 ラクトースなどが挙げられる。 使用される 添加物は、 本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。 本発明の医薬組成物の投与量は、 投与対象の年齢、 投与経路、 投与回数により 異なり、 広範囲に変えることができる。 本発明のペプチドの有効量と適切な希釈 剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、 一回に つき体重 1kgあたり 10〜1000mg/body、 好ましくは 50〜500mg/bodyの範囲の投 与量を選ぶことができ、 1日 1回から数回に分けて 1日以上投与される。 6 . 細胞工学用試薬
本発明のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩 (以下、 本発明のペプチドと称 する。 ） は、 前記トリコスタチン A (TSA)様の作用を持っため、 実験用試薬、 特 には、 細胞工学用試薬として利用することができる。 特に、 本発明のペプチドは、 再生医療などの現場における分化誘導試薬として使用することができる。
例えば、 幹細胞と本発明のぺプチドとを反応させ、 白血球細胞への誘導を行う 事ができる。 また、 同様に胚細胞と反応させて、 当該細胞の全能性を回復させる 試薬としても利用する事ができる。 これにより、 クローンマウス作製率を向上さ せることができ、 NT - ES細胞の樹立成功率を向上させることができる。 以下、 実施例により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例に限定されるものではない。
[実施例]
〔実験方法〕
1) 細胞
HeLa細胞へ、 CMVプロモーターの下流にゥミシィタケ由来ルシフェラーゼ遺伝 子（R- luc)を含むベクター、 pRL- CMVをピューロマイシン而す性遺伝子をコードす るプラスミ ドベクター、 pPGKpuroと共導入し、 ピューロマイシンを用いた選択 により、 安定形質導入細胞クローンとして HeLa/R - luc— A及び HeLa/R- luc_Bを得 た。 HeLa/R- luc— Aは中程度〜高いレベルの R- lucを発現する細胞であり、
HeLa/R-luc— Bは非常に低いレベルの R- lucを発現する細胞であった （図 1B、 コ ントロール参照） 。 2) 細胞のペプチド処理
細胞をディッシュに播種して 24時間経過後、 血清を含まない 0PTI- MEM培地に 培地交換し、 ぺプチドを添加して細胞を 30分間ィンキュベートした。 用いたぺ プチドは、 Peptidel (配列番号 2 ) 、 Peptide2 (配列番号 3 ) 、 Peptidel- TAT
(配列番号 4 ) および Peptide2- TAT (配列番号 5 ) の 4種類である （図 1 A)。 このうち、 Peptidelは、 陰性対照べプチドであり、 Peptide2は、 本発明のぺプ チドである。 また、 Peptide 1および 2ば、 細胞内へ浸透する TAT配列を付加し てある。 Peptidel-TATおよび Peptide2- TATは、 上記ペプチドより TAT配列を除 いたペプチドである。 30分後にペプチドを含む培地を除去し、 血清を含む通常 の培地 （MEM培地、 10%仔牛血清） に交換した。 一定時間培養後に細胞を回収し、 ノレシフェラーゼアツセィ、 RNA分離を行った。
3) ノレシフェラーゼアツセィ
ルシフェラーゼ活性の測定には、 試薬として東洋インキ社のピツカジーンデュ アル'シーパンジーキットを用い、 ルシフェラーゼの作用による反応基質の発光 量をアト一社のルミノメーター、 AB - 2200で定量した。 活性は、 単位細胞数あた りの任意の値 (RLU, relative luminescent unit)で示した。
4) RT-PCR
細胞を PBSで洗浄後、 キアゲン社の RNA分離キット、 RNAeasy MiniKitを用い て全 RNAを抽出した。 全 RNAを錶型として、 オリゴ dTプライマーを用いて逆転 写反応により一本鎖 cDNAを合成した。 この cDNAを鍚型として R-luc遺伝子の発 現量の半定量を PCRにより行った。 図 2では、 R- luc遺伝子は 30回の増幅、 コ ントロールとして用いた GAPDH遺伝子は 18回の増幅反応を行った。
増幅遺伝子産物をァガロース電気泳動、 ェチジゥムプロミド染色により可視化 し、 染色した DNAバンドの濃さをコンピューターで半定量した。
〔結果 ·考察〕
Peptide 1および 2は、 細胞内へ浸透する TAT配列を付加してある。 これら 2 種類のペプチドの細胞内移行は、 蛍光標識ペプチドを用いて確認済みである。
TAT配列を持つぺプチドおよび上記ぺプチドより TAT配列を除いたぺプチドの 4 種類それぞれで細胞を処理した 6時間後に R-lucの活性を調べた。 Peptide 2で 処理したときに、 R- lucの活†生増大が認められた。 特に、 発現量の低い HeLa/R- luc_Bで 10倍以上の活性増大が見られた （図 1 B) 。 この活性増大は、 発現量の増加とぺプチドによる酵素活性化の 2通りが考えら れる。 しかし、 酵素活性化の場合、 発現している蛋白質に作用するので、 クロー ンが異なっても活性増大の割合は同じにならなければならず、 今回のケースは該 当しない。 したがって、 Peptide2 (本発明のペプチド） による活性増大は、 発現 量変化が関与しているといえる。 そこで、 R-luc mRNA量が Peptide処理により 変化するか調べた。 期待通り、 Peptide2処理 6時間後には、 R- lucmRNA量が增大 した （図 2 A)。
しかもその増大は、 R- luc活性の増大と相関していた （図 2 B)。 なお、 図 2B 中においては、 2つの独立した実験結果 (Experiment 1および 2) をしめした。 以上の結果より、 Peptide2は、 導入された R-lucの発現量を、 特に活性の低 レヽ HeLa/R-luc— B細胞で激しく活性化することが示された。
さらに、 HeLa/R - luc— Bで peptide2の遺伝子再活性化能の経時変化を調べたと ころ、 4時間で活性化が見られ、 8時間でピークを迎えた。 さらに、 peptide2の 遺伝子再活性化能は、 24時間後にほぼ消失した。 一方、 ヒストン脱ァセチル化 酵素阻害剤であるトリコスタチン A (TSA)を 1 Mの濃度で処理すると、 12時間以 降に活性が増大した（図 3 )。 このことから、 HeLa/R - luc— B細胞では染色体に組 み込まれた R-luc遺伝子が周囲の凝集クロマチンにより不活性化を受けている (位置効果） 可能性が示唆された。 この Peptide2は TSAと同様に不活性化され た遺伝子を再活性化する作用を有することを示す。 また、 この PePtide2は TSA と同様に、 不活性化した凝集クロマチンの構造を緩め、 様々な TSA様効果を示す と考えられる。 さらに、 Peptide2の遺伝子再活 1"生化能は、 24時間後にほぼ消失 し、 一過的であるため、 細胞毒性のある TSAと異なり、 Peptide2の細胞毒性は きわめて低いと考えられる。
[配列表フリーテキスト]
配列番号 1 ：合成べプチド
配列番号 2 ：合成ペプチド
配列番号 3 ：合成ペプチド
配列番号 4 ：合成ペプチド 配列番号 5 ：合成ペプチド

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 不活化された遺伝子発現の再活性化作用を有するぺプチド。
2 . 以下の（a)若しくは (b)のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
(a) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1〜11 個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたァミノ酸配列を含み、 不活化された遺伝子発現の再活性 化作用を有するペプチド
3 . 請求項 2記載のぺプチド又はその誘導体を構成するァミノ酸配列の 65%以 上を含むペプチド、 その誘導体又はこれらの塩。
4 . アミノ酸配列の一部に化学修飾が施された、 請求項 2記載のペプチド、 その 誘導体又はこれらの塩。
5 . 以下の（a)若しくは（b)のぺプチド又はその誘導体をコードするポリヌクレオ チド。
(a) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド
(b) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列において 1〜11 個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつ、 不活化された遺伝子発現の 再活性化作用を有するぺプチド
6 . DNAである請求項 5記載のポリヌクレオチド。
7 . 請求項 5又は 6記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
8 . 請求項 Ί記載の組換えべクタ一を含む形質転換体。
9 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれらの塩 を含有してなる医薬組成物。
1 0 . 腫瘍細胞増殖抑制剤である請求項 9記載の医薬組成物。
1 1 . 抗生物質である請求項 9記載の医薬組成物。
1 2 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のペプチド、 その誘導体又はこれらの 塩を含有してなる実験用試薬。
1 3 . 細胞工学用試薬である請求項 1 2記載の実験用試薬。
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IKEHARA T. ET AL.: "Chromatin Sai Kosei to Histone no Acetylation", CELL TECHNOLOGY, vol. 20, no. 3, 2001, XP003019684 *

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