WO2007139232A1

WO2007139232A1 - インスリン感受性増強剤

Info

Publication number: WO2007139232A1
Application number: PCT/JP2007/061493
Authority: WO
Inventors: Makoto Suematsu; Takeshi Adachi
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2006-05-31
Filing date: 2007-05-31
Publication date: 2007-12-06
Anticipated expiration: 2008-11-30

Abstract

本発明は、メタボリック・シンドローム、インスリン耐性またはアテローム性動脈硬化症のための治療剤、およびCOまたはCO放出分子を含有するインスリン感受性増強剤に関する。

Description

明細書インスリン感受性増強剤技術分野

本発明は、一酸化炭素（CO) によるインスリン感受性増強剤に関する。より詳細には、本発明は、 COまたは CO放出分子を含有する、種々のインスリン抵抗性関連疾患（例えば、メタボリック ' シンドローム、高血圧、ァテローム性動脈硬化症など）の治療剤、および上記治療剤を用いた疾患の処置方法に関する。背景技術

メタボリック . シンドロームは、肥満、高脂血症、高血圧および高血糖症の組み合わせによって特徴付けられる疾患の総称であり、ァテローム性動脈硬化症および心臓血管事象を引き起こす。

インスリン抵抗性は、メタボリック · シンドロームにおける最も重要な特徴の 1つである。しかし、インスリン抵抗性を引き起こす明確なメカニズムは知られていない。インスリンシグナル伝達研究の最近の進歩から、インスリンの代謝を制御するためのインスリンによる Akt活性化の重要性が明らかになってきている。 Akt/プロテイン 'キナーゼ Bは、セリン/スレオニンタンパク質キナーゼであり、ホスホイノシトール 3リン酸キナーゼ（PI3-K) によって生成されるホスホイノシトール 3リン酸によって活性化される。 Aktは、ダルコ —ストランスポータ一一 4 (Glut-4) を、骨格筋、心臓および脂肪組織の形質膜に移動させ、これによつてグルコースの細胞への取り込みが増加し、血中グルコースレベルが低下する。 Aktは、グリコゲン合成キナーゼ— 3 (GSK-3) を阻害する。この事は、グリコゲンシンターゼ活性のアップレギュレーションをもたらす。従って、 Akt の下流分子は、血中グルコースレベル、グリコゲン合成、およびインスリンの他の代簡 ί効果の調節因子の中心となり得る。インスリンによる Aktのリン酸化および活性化は、イン · ビトロおよびイン · ビボでのインスリン抵抗性状態を改善する。これに対し、 Akt リン酸化の低下は、メタボリック · シンドロームにおけるインスリン抵抗性の主要な原因である。内皮の機能障害は、メタボリック · シンドロームの別の主要な特徴であるため、血管系でのインスリン抵抗性は、ァテローム性動脈硬化症の発症に対する別の重要な因子となり得る。インスリンはまた、内皮細胞において（この細胞において Glu-4はわずかしか発現していない） PIK-3 Akt経路を活性化する。

GSK-3と同様に、インスリン/ PIK-3ZAktも、 Badおよび内皮一酸化窒素合成酵素（_eNOS) を標的にする。従って、 Akt に媒介されるこのプロセスは、 NO の抗アポトーシス効果および血管拡張につながり、血管ホメォスタシスの維持に寄与する。従って、インスリンによる Aktリン酸化に障害があると、メタボリック ' シンドロームにおいて、インスリンのァテローム性動脈硬化保護効果が障害される。メタボリック ' シンドロームおよびインスリン抵抗性改善薬剤は、医療の市場において大きな影響力を有し、実際にインスリン感受性増強薬物（例えば、メトホルミン、ペルォキシソーム増殖剤活性化レセプター γ (PPAR-γ) ァゴニスト、および HMG-CoAインヒビター）の使用が増加している。これらの薬剤は、少なくも部分的に、種々の細胞型においてインスリンによる Aktのリン酸化を回復する（M.F. White (2003) Insulin signaling in health and disease. Science 302， 1710- 1711)。従って、インスリンによる Akt リン酸化の活性剤は、インスリン感受性増強薬物として利用できる可能性がある。

一酸化炭素（CO) は、気体メディエーターであって、特異的な酵素へムォキシゲナーゼー 1およびへムォキシゲナーゼー 2 (ΗΟ- 1、 HO-2) から内因的に発生する。 COは、もともとは、神経伝達物質（A. Verma, D.J. Hirsh, C.E. Gratt, G.V. Ronnett, S.H. Snyder (1994) Carbon monoxide: A putative neural messenger. Science 263 (5093), 381-384)または血管拡張薬（M. Suematsu, Ν· Goda, Τ· Sato, S. Kashiwagi, T. Egawa, Y. Shinoda, Y. Ishimaru (1995) Carbon monoxide: An exogenous modulator of sinusoidal tone in the perfused rat liver. J Clin Invest, 96(5): 2131-2139) として知られているが、最近では、抗アポトーシス、細胞周期調節因子、またはフリーラジカル発生の抑制因子などの CO の多面発現的効果も報告されている。 COは、細胞内代謝も調節する。し力し、インスリンシグナル伝達に対する COの効果は、まだ報告されていない。発明の開示

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決する課題は、 CO によるインスリン感受性増強のメカニズムを利用した種々のインスリン抵抗性関連疾患（例えば、メタボリック ' シンドローム、高血圧、インスリン抵抗性およびァテローム性動脈硬化症など）に対する治療剤を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、 CO 放出分子であるトリカルボニルジクロ口ルテニウム（I I ) ダイマー（Rt-CO)力インスリン誘導型の Aktリン酸を増大させ、培養ブタ大動脈内皮細胞において、 Aktの下流のシグナル伝達を生じさせることを見出し、本発明を完成するに至つた。すなわち、本発明は、以下に関する。

( 1 ) COまたは CO放出分子を含有する、インスリン感受性増強剤。

( 2 ) インスリン抵抗性関連疾患を処置するためのものである、（1 ) に記載の増強剤。

( 3 ) 前記インスリン抵抗性関連疾患が、メタボリック ' シンドローム、インスリン抵抗性およびァテローム性動脈硬化症からなる群より選択される少なくとも 1つの疾患である、（2 ) に記載の増強剤。

( 4 ) COまたは CO放出分子を含有する、インスリン抵抗性関連疾患を処置するための医薬組成物。

( 5 ) 前記インスリン抵抗性関連疾患が、メタボリック ' シンドローム、インスリン抵抗性およびァテローム性動脈硬化症からなる群より選択される少なくとも 1つの疾患である、（4 ) に記載の医薬組成物。

( 6 ) 被験体においてインスリン抵抗性関連疾患を処置するための医薬の製造における、 COまたは CO放出分子の使用。

( 7 ) 前記インスリン抵抗性関連疾患が、メタボリック ' シンドローム、インスリン抵抗性およびァテローム性動脈硬化症からなる群より選択される少なくとも 1つの疾患である、（6 ) に記載の使用。

CO は、新規のインスリン感受性増強気体分子として役立ち、そしてインスリン抵抗性およびァテローム性硬化症の発症から保護し、これによつてメタボリック · シンドロームを制御する重要な可能性のある戦略として役立つことが示される。

上記のとおり、 Akt リン酸化の低下は、メタボリック · シンドロームにおけるインスリン抵抗性の主要な原因である。一方、本発明者は COまたは CO放出分子がインスリン誘導型の Aktリン酸を増大させることを見出した。したがつて、 COまたは CO放出分子により Aktリン酸化を活性化することによって、メタボリック · シンドロームなどのインスリン抵抗性関連疾患を治療することが可能である。図面の簡単な説明

図 1は、 PAEC中のインスリンリン酸化された Aktおよび GSK-3を示す。左：インスリン (ΙΟΟηΜ)による Aktおよび GSK-3のリン酸化の時間経過。右：インスリンは、用量依存的な様式で Aktをリン酸化する。

図 2は、インスリンが誘導する Akt リン酸化に対する Rt-CO (50μΜ、 6時間）の効果を示す。上： Rt-CO の投与（50μΜ、 6時間）は、インスリン誘導型の Aktリン酸化を増強した。

図 3は、 Rt-CO力 Akt, GSK-3および eNOSのリン酸化を用量依存的な様式で増大することを示す。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための単なる例示であって、本発明をこの実施形態にのみ限定することは意図されない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施することが可能である。

なお、本明細書において引用した全ての刊行物、例えば、先行技術文献および公開公報、特許公報その他の特許文献は、その全体が本明細書において参照として組み込まれる。本明細書は、本願優先権主張の基礎をなる米国仮特許出願 60/803,531号明細書の内容を包含する。

1 . インスリン感受性増強

本明細書で使用される場合、用語「インスリン感受性増強」とは、筋肉や細胞が、内因性および外因性のインスリンに対して正常に反応できない状態にある対象（被験体、組織および細胞など）において、インスリンに対する感受性が高まる現象をさす。また、用語「インスリン感受性増強剤」は、被験体に投与された場合に、上記のインスリン感受性増強を達成し得る薬剤を意味し、その形態は、固体でも液体でも気体でもよい。

本発明のィンスリン感受性増強剤は、 COまたは CO放出分子を含有する。「CO 放出分子」とは、被験体に投与された場合に、被験体内で種々の代謝プロセス（酵素的プロセス、生化学的プロセスまたは物理的プロセスが挙げられる）に供されて、 COを発生することができる分子をさす。この CO放出分子としては、例えば、一酸化炭素含有錯体、ドーパミン、アルファ一 ·リポ酸（HO-1 inducer) が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のィンスリン感受性増強剤を投与することにより、一酸化炭素の濃度を生理的濃度の範囲で人為的かつ有効に上昇させ、インスリン感受性増強を誘導することができる。

本明細書で使用される場合、用語「インスリン抵抗性関連疾患」とは、筋肉および細胞のインスリンに対する感受性の低下（すなわち、インスリンに対する反応の低下）によって特徴付けられる疾患をさす。この疾患としては、例えば、糖尿病、肥満、高脂血症、高血圧および高血糖症を含むメタボリック 'シンドローム、インスリン抵抗性およびァテローム性動脈硬化症が挙げられる力 S、これらに限定されない。

1つの実施形態において、上記ィンスリン抵抗性関連疾患は、本発明のィンスリン感受性増強剤によってインスリン感受性増強を誘導することによって処置することができる。また別の実施形態において、本発明は、インスリン抵抗性関連疾患を処置するための医薬を製造する際の、 COまたは CO放出分子の使用を提供する。

本発明のインスリン感受性増強剤を被験体に投与するためには、例えば、以下のように実施することができる。

(i) lOppm以上 250ppm以下の濃度の一酸化炭素を含む雰囲気の吸入により行う。

(ϋ) 一酸化炭素含有錯体、または cytochrome Ρ450で代謝されて COを体内で生成する arylhydrocarbonなどの化合物（CO放出分子）を生体内に投与する。

(iii)赤血球、修飾へモグ口ビン及びリポソ一ム内包へモグロビンからなる群から選ばれる少なくとも 1つに一酸化炭素を結合させて投与する。一酸化炭素の投与を、一酸化炭素を含む雰囲気の吸入により行う場合、その濃度は一酸化炭素中毒を引き起こさない濃度、例えば 250ppm以下、好ましくは lOOppm以下と低濃度にすることが好ましい。

「一酸化炭素含有錯体」としては、 CORM-l、CORM-2 ([Ru(CO)₃Cl₂]₂) (Ozawa N， Goda N, Makino N， Yamaguchi T, Yoshimura Y, Suematsu M (2002) Leydig cell- derived heme oxygenase- 1 regulates ap op to sis of premeiotic germ cells in response to stress. J Clin Invest 109: 457-467·))、 CORM_3、 C0RM-A1、 CORM-F3などの CO releasing moleculeを挙げることができる。それぞれ中心金属は、マンガン（CORM-l)、ルテニウム（CORM-2、 -3)、ホゥ素（CORM-A1) 及び鉄（CORM-F3) である。

錯体の形態では、使用し得る一酸化炭素濃度（又は錯体の量）は、 ΙμΜ- lmM 、好ましくは 10μΜ- 100μΜである。

また、一酸化炭素を、赤血球、修飾ヘモグロビン、及びリボソーム内包へモグロビンからなる群から選ばれる少なくとも 1つに結合させて投与する場合、生体内への投与は、例えば、一酸化炭素を結合させた赤血球等の「修飾型一酸化炭素」を血管内に投与すればよい。赤血球は、自己血、輸血用血液、非ヒト動物の血液を問わず、あらゆる赤血球源からのものを使用することができる。リボソーム内包ヘモグロビンの作製方法は公知である（H.Sakai et al., J. Biochem., 131， 611 617 (2002)； J.G.Riess, Chem.Rev., 101, 2797-2919 (2001) ) ₀

2 . 医薬組成物

本発明の 1つの実施形態において、 COまたは CO放出分子を含有する、ィンスリン抵抗性関連疾患を処置するための医薬組成物が提供される。被験体にこの組成物を投与することによって、インスリン感受性増強を誘導してィンスリン抵抗性関連疾患を治療することができる。従って、本発明は、本発明の医薬組成物の有効量をィンスリン抵抗性関連疾患に罹患する被験体に投与するェ程を包含するィンスリン抵抗性関連疾患の治療方法も提供する。

本発明の医薬組成物が投与される被験体としては、ヒトおよび非ヒト哺乳動物が挙げられる。この非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ゥシ、ネコ、ゥサギ、ゥマ、ヒッジ、サル、ィヌが挙げられる。上記医薬組成物中に含まれる COまたは CO放出成分は、単独で使用してもよいし、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせた形態として使用することもできる。

薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、通常医薬において使用される、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、潤滑剤、乳化剤、着色剤、矯味矯臭剤、界面活性剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤などを挙げることができる。

製剤としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤などの経口剤、坐剤、軟膏剤、点眼剤、パップ剤などの外用剤、又は注射剤を挙げることがでさる。

上記注射剤は、点滴、筋注、皮下注、静注などの方法で使用することができる。注射剤は、上記の薬学的に受容可能なキャリアを適宜組み合わせて、リポソーム製剤として製剤化してもよレ、。

賦形剤としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素などが、結合剤としては、例えば、ポリビニノレアノレコーノレ、ェチノレセノレロース、メチノレセノレロース、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロースなどが、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タノレク、シリカなどが、着色剤としては、医薬品に添加することが許可されているものが、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハツ力脳、芳香酸、ハツ力油、龍脳、桂皮末などが使用される。これらの錠剤、顆粒剤は、必要により、糖、ゼラチンなどでコーティングされ得る。

注射剤を調製する場合は、 p H調整剤、緩衝剤、験濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張剤、保存剤などを必要により添加し、常法によって静脈、皮下、筋肉内への注射剤とすることができる。その場合、必要により、常法によって凍結乾燥物とすることもできる。

懸濁化剤としては、例えば、メチルセルロース、ポリソルベート 8 0、ヒドロキシェチルセルロース、アラビアゴム、チラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどを挙げることができる。

溶解補助剤としては、例えば、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソリペート 8 0、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マクロゴール、ヒマシ油脂肪酸ェチルエステルなどを挙げることができる。また、安定化剤としては、例えば、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウムなどを、保存剤としては、例えば、パラォキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチノレ、ソノレビン酸、フエノ一ノレ、クレゾーノレ、クロロクレゾ一ノレなどを挙げることができる。

本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤形によって異なる。

気体の一酸化炭素の場合は、成人（60kg) では、好ましくは 10〜250ppm、より好ましくは lOOppmの濃度で 30分〜 3時間、好ましくは 1〜2時間、吸入投与する。吸入は、一酸化炭素源（例えば、一酸化炭素ボンべ又は濃縮装置）に接続したマスク、鼻カテーテル、鼻力ニューレを用いて行うことができる。一酸化炭素の飽和溶液（生理食塩水など）を血管内に投与することもできる。また、一酸化炭素含有錯体、又は赤血球、修飾ヘモグロビン及びリボソーム内包ヘモグロビン等に結合した一酸化炭素（修飾型一酸化炭素）の場合は、成人 1日当たりの投与量は、臨床医によって適宜選択される。実施例

以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明がこれらに限定されることは意図されない。

[実施例 1 免疫プロッティング]

ぐ方法〉

薬物および抗体：ポリクローナル抗ホスホ一 Akt (Ser473)、抗ホスホ一 eNOS (Serll79)、抗ホスホ— GSK— 3、および抗トータル Akt抗体は Cell Signaling (Beverly, MA) から入手した。モノクロ一ナル抗 eNOS抗体は Transduction Laboratories (Lexington, KY) から入手した。 Bradfordタンパク質アツセィキットは Bio-Rad (Hercules, CA) から入手し、ポリビニリデンジフルオラィド（PVDF) メンブレン、および免疫ブロッテイングのための他の試薬は GE Healthcare (Piscataway, NJ) から入手した。塩化ルテニウム (III)(Rt-Cl)およびトリカルボ二ルジクロロルテニウム (II)ダイマー (Rt-CO)は Siema-Aldrich (St. Louis, MO) から得た。

細胞培養および免疫ブロッテイング： PAEC (Porcine aortic endothelial cell: ブタ大動脈内皮細胞）は、公知例に従って培養した（M. Ishikawa, M. Kajimura, T. Adachi, K. Maruyama, N. Makino, N. Goda, T. Yamaguchi, E. Sekizuka, M. Suematsu (2005) Carbon monoxide from heme oxygenase- 2 is a tonic regulator against nitric oxide- dependent vasodilatation in the adult rat cerebral microcirculation. Circ Res, 97 (12): el04- ell4)。 4〜： 10代継代した PAECを 1%ぺニシリン /ストレプトマイシンを含む M199+10% FBSで培養した。血清を含まない M199培地で 24時間細胞を静止状態にした後、 M199 中で 6時間、 Rt-Clまたは Rt-COと共に PAECをインキュベートした。インスリン (ΙΟΟηΜ)投与の 30分後に、溶解緩衝液（トリス HC1 20mM _PH7.5,NaCl 150mM,Na₂EDTA lmM,EGTA lmM, l% Triton,ピロリン酸ナトリウム 2.5mM,6-グリセリンリン酸 lmM,NaV0₄ lmM,PMSF ImM,ロイぺプチン ΙμΜ) で細胞を剥がし、そして 15,000rpm、 4°Cで 10分間遠心分離をして、上清を収集した。 Bradford法によってタンパク質濃度を決定した。免疫ブロッテイングについての標準的方法は、以前に報告したように（M. Ishikawa, et al.、前出）使用した。

<結果〉

インスリン (100nM)は、 15分で Aktをリン酸化し、そのリン酸化は 60分間維持された。グリコゲン合成、血管新生、アポトーシスの調節について Aktの重要な下流である GSK-3 もまた、同様の時間経過でインスリンによってリン酸化された。インスリン (10~1000nM)は、用量依存的に Aktをリン酸化した（図 D o

COがインスリンによって Aktリン酸化を増大させるかどうかを試験するために、 PAECを M199中で 6時間、 Rt-Clまたは Rt-COと共にインキュベートした。その後、インスリン（100nM、 30 分）を添加して、免疫ブロッテイングにより Akt リン酸ィ匕を検出した。 Rt-CO 自体は Akt リン酸化を殆ど変えないが、 Rt-COはインスリン誘導型の Akt リン酸化を著しく増大させた。 Rt-CO は、用量依存性にインスリン誘導型の Aktリン酸化を増大し、その効果の最小濃度は ΙΟμΜ未満であった（図 2 )。

インスリンシグナル伝達における代謝効果の大部分は、 Aktの種々の下流分子によって媒介される。そこで、本発明者らは、次に、インスリン誘導型の GSK-3および eNOSのリン酸化に対する Rt_COの効果を試験した。 GSK-3および eNOSは、 PAEC中の Aktの典型的な下流標的である。その結果、 Rt_CO (25~50μΜ)はィンスリンによる GSK-3および eNOSのリン酸化を高めた（図 3 )。この結果から、 COがインスリン誘導型の Aktリン酸化を増大し、このことが PAECで細胞内代謝を制御する下流分子の調節につながることが示された。 <考察 >

本発明により、 Rt-COがインスリンによる Akt リン酸化を増大することが示された。本発明者らは Rt-Clをコントロールとして使用したので、 Rt-COの効果は COガスの放出に依存する。 Rt-COの効果は用量依存的であり、その最小用量は、 ΙΟμΜ未満である。本発明者らは、インスリンによる Aktリン酸化の増大についての Rt-COインキュベーションの持続期間を評価した。最大の増大には 3時間以上が必要とされる。 Rt-CO はまた、インスリン誘導型の GSK-3 および eNOSのリン酸化も増大させ、このことから、 COガスもインスリンが関連するグルコース取り込み、グリコゲン合成、または細胞生存の下流効果を増強することが示唆される。これらのデータは、明らかに、大動脈内皮細胞におけるィンスリン感受性増強のための COの新規な効果を示した。産業上の利用可能性

本発明のィンスリン感受性増強剤は、種々のィンスリン抵抗性関連疾患の治療剤として有用である。

Claims

請求の範囲

1 . COまたは CO放出分子を含有する、インスリン感受性増強剤。

2 . インスリン抵抗性関連疾患を処置するためのものである、請求項 1に記載の増強剤。

3 . 前記ィンスリン抵抗性関連疾患が、メタボリック ' シンドローム、インスリン抵抗性およびァテローム性動脈硬化症からなる群より選択される少なくとも 1つの疾患である、請求項 2に記載の増強剤。

4 . COまたは CO放出分子を含有する、インスリン抵抗性関連疾患を処置するための医薬組成物。

5 . 前記ィンスリン抵抗性関連疾患が、メタボリック ' シンドローム、ィンスリン抵抗性およびァテローム性動脈硬化症からなる群より選択される少なくとも 1つの疾患である、請求項 4に記載の医薬組成物。

6 . 被験体においてインスリン抵抗性関連疾患を処置するための医薬の製造における、 COまたは CO放出分子の使用。

7 . 前記インスリン抵抗性関連疾患が、メタボリック ' シンドローム、インスリン抵抗性およびァテローム性動脈硬化症からなる群より選択される少なくとも 1つの疾患である、請求項 6に記載の使用。