WO2007110249A1 - Verwendung des 4-1bb rezeptors zur identifizierung und/oder separation aktivierter regulatorischer th-zellen (treg) - Google Patents

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Andreas Thiel
Anne Schönbrunn
Marco Frentsch
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to the use of a 4-1BB receptor for the identification and / or separation of activated regulatory T cells and a kit comprising an antibody for detecting the 4-1BB receptor (CD137) for the identification and / or separation of activated regulatory cells Th cells, wherein the antibody is coupled to a fluorescent substance or magnetic microparticles.
  • the regulatory T cells can be activated both polyclonal and with specific antigens. Activation may be in vitro or already in vivo.
  • T-cells which actively suppress unwanted immune reactions, such as endogenous structures (autoantigens). They are referred to as regulatory T cells (Treg). Regulatory T cells are essential in the lifelong maintenance of peripheral tolerance to autoantigens. They are formed in the thymus, but their activity is greatly reduced with age.
  • Tregs Regulatory T cells can lead to the suppression of anti-tumor responses (Onizuka et al., Cancer Res. 59: 3128-3133 (1999); Shimizu et al., J. Immunol. 163: 5211-5218 (1999)). Because many tumor antigens represent classical autoantigens. In contrast, decreased numbers of Tregs or functional changes in Treg can lead to autoimmune diseases, during which the body's own structures such as foreign substances or pathogens are attacked uncontrollably.
  • Tregs are involved in maintaining immunological self-tolerance by blocking the activation of autoreactive T cells. They are capable of suppressing both cytokine production and the proliferation of such potentially pathogenic T cells.
  • An important step in the identification of T helper regulatory cells was the characterization of CD4 + T helper cells constitutively displaying the interleukin-2 (IL-2) receptor (CD25) alpha chain as a surface membrane protein. The functional relevance and the exact molecular mechanisms of suppression of these CD25 + CD4 + regulatory T cells and how they arise have not yet been clarified. Since the CD25 receptor is also expressed by subpopulations of non-regulatory T cells, this marker is of limited use for analysis In particular, however, CD25 can not be used to identify and separate activated, antigen-specific regulatory T cells
  • Treg Isolation of Treg and in particular of Treg specific for certain antigens is still one of the major therapeutic targets.
  • the analysis of antigen-specific Treg 1 (auto) -antigenic Tregs are a specific means of suppressing unwanted immune reactions such as autoimmune reactions in rheumatoid arthritis (RA), multiple sclerosis (MS), atherosclerosis (AS), diabetes, psoriasis
  • Other unwanted immune reactions in which Treg are a specific agent are GvHD (graft vesus host disease) in allogeneic stem cell transplants or transplant rejection in organ transplants (Hara et al, J Immunol 166 3789-3796 (2001), Taylor et al, J Exp Med 193 1311-1318 (2001) Allergies also represent unwanted immune responses for which there have been few therapeutic options to date.
  • Therapeutic treatment with Treg which is based on the natural principle of peripheral tolerance and in many experimental ones Proven models were found to have no side effects compared to classical immunosuppressive drugs and would be
  • Tregs the molecules and mechanisms involved in the suppression, as well as reliable Treg markers are of great importance.
  • a molecular biology Treg marker, the forkhead family-owned transcription suppressor FoxP3 has been recognized (Hon et al ) Science 99 (5609) 1057-61)
  • regulatory T cells can be identified by the expression of the CD25 molecule (Thomton and Shevach (1998) J Exp Med 188 287-296, Sakaguchi et al (1995) J Immunol 155 1151 -1164)
  • Tregs that recognize a specific antigen. This would be possible if specifically activated Treg could be isolated and would be a prerequisite for specific therapies with Treg, for example, in autoimmune diseases in which The autoimmune reactions underlying the disease should not be suppressed, however, by immunoreactivities against tumor cells
  • various other cell subpopulations may have the same cell surface markers (such as CD4 for ThI Th2, or other Th cells or CD25 for activated T cells or B cells.)
  • identification of activated Treg after stimulation with defined antigens by specific activation markers is not Although the activation of regulatory Th cells leads to the increased expression of CD25 and CD38, which, like all other T-cell activation markers described, are also expressed in other T cells, so far no antigen-specific Treg has been separated by means of specific activation markers can be.
  • the majority of methods that identify and / or isolate regulatory Th cells based on the expression of a particular cell surface marker depend on the recognition of a marker and the binding of an antibody. If a single marker can not be used to identify and / or isolate a particular cell type, a combination of markers and the appropriate antibodies must be found (Levings et al., J Exp. Med. 193 (11): 1295 -1302 (2001)). Such experiments can be very complex and difficult to carry out in practice. Furthermore, the binding of the antibodies can influence the activity of the target cell or the expression of the other markers, so that the identification and / or separation process is negatively influenced by the other antibodies.
  • binding of antibodies can lead to cross-linking, capping and internalization of the markers in question.
  • the cell function can be restricted. Even if Fab fragments are used, the markers in question are masked and may possibly be impaired in their function. Binding to specific markers may also lead to deactivation of the cell (CD28, go3), induce apoptosis (cross-linking of CD4 in activated cells) or induce secretion of cytokines (CD3, CD2, CD28).
  • BD Pharmingen TM Technical Data Sheet: PE conjugated mouse anti-human CD137 (4-1BB) ", May 7, 2005, http://www.bdbiosdences.cxjm.com/externelefiles/prTVdcK ds / hurnan / live / web_enablea736005X_555956.
  • pdf 4 that the 4-1 BB marker is an activation marker for all T cells, also WO 2005/124346 merely describes that 4-1BB markers are on CD4 + CD25 * , but the document does not disclose that CD4 + CD25 + at a certain time of activation express 4-1 BB markers compared to CD4 + CD25 " T cells specifically.
  • the specific time can be determined, for example, by checks, preferably regular checks. For example, it is possible to sample or directly observe, essentially at 30 minute intervals, whether the activated regulatory Th cells have expressed the marker as a discriminative marker.
  • the multiple, preferably regular controls are accordingly regular observations of the system, directly by a skilled person or by means of analyzers or mechanisms at intervals of 5, 10, 15, 30, 45 minutes, preferably 1 hour intervals.
  • it is to be determined by the controls of the time at which only the activated regulatory cells activate the receptor / marker it was surprising that this within a short period of time, preferably from about 0-12 hours, more preferably in a period of about 0.5-10 hours and most preferably in a period of about 3-8 hours, especially of substantially or about 4 hours.
  • the invention thus relates to the surprising teaching that, in particular, antigen-specifically activated CD4 + CD25 + Treg can be isolated from, in particular, activated CD4 + CD25 " T cells by means of the 4-1BB receptor in that 4-1BB is an activation marker for CD4 + CD25 * and for CD4 + CD25 " T cells.
  • 4-1BB is an activation marker for CD4 + CD25 * and for CD4 + CD25 " T cells.
  • the regulatory cells can be identified and / or separated by the expression of one and / or more markers.
  • markers for this purpose, all known to the expert markers for identification and / or separation can be used.
  • Preferred are the markers 4-1BB, CD25, CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen-4), GITR (glucocorticoid-induced TNFR receptor), FoxP3, IL-10, CD69, CD40L, ICOS, OX40 and TGFbeta, which are individually and / or or used in combination. All markers known to those skilled in the art for the exclusion or the depletion of non-regulatory cells can also be used in combination for this purpose. However, particularly preferred is the use of the 4-1 BB receptor as a marker of living, activated regulatory cells. Either directly activated regulatory T cells are identified or separated or activation is induced by the addition of cells, proteins, peptides, pathogens or other substances.
  • the invention relates to the surprising doctrine that especially within a time dependence 4-1 BB is a specific marker for activated Treg cells, especially in a period of 0.5 to 18 hours, preferably 0.5 to 12 hours , more preferably 0.5 to 10 hours, most preferably between 0.5 and 8 hours, especially in a period of 3 to 8 hours; especially at a temperature of 37 ° C.
  • the time-dependent observation of the cells within time units makes it possible to use 4-1BB as a specific marker for the separation and isolation of the abovementioned activated cells (activated Treg) - ie
  • the invention relates, in a preferred embodiment, to the surprising teaching that identifies activated Th regulatory cells and / or can be separated, especially if a time-dependent observation is performed within which the 4-1BB receptor can be used to isolate CD4 + CD25 + Treg from cell mixtures.
  • the time-dependent observation of the cells allows the use of 4-1BB as a discriminative marker for CD25 + Treg compared to CD25 ' T cells.
  • the Treg must be activated, for example, in vitro, the skilled person would not interpret this doctrine so that this is also the case with selected cells, when the Treg are isolated directly from an inflamed sample material. In such a situation, it is conceivable to isolate the cells directly without activation by their 4-1 BB expression. Assuming that the Tregs have been activated in vivo directly at the site of inflammation, it is preferred to isolate such cells, expand them in vitro and use them e.g. For example, in cases of inflammation with concomitant chronic autoimmunity, it should be reintegrated into therapy.
  • the recognition of the temporal expression of a discriminative marker, especially in one Period of approximately or substantially 0.5 to 8 hours of activation in, for example, in vitro cultures, or an equivalent period of time in in vivo cultures, taking into account that there are regularly some activated cells present, allows one skilled in the art to isolate antigen-specific CD25 + regulatory Th cells.
  • the period may be from about 0 to 18 hours, preferably from about 0.5 to 12 hours, more preferably from about 0.5 to 10 hours, most preferably from about 0.5 to 8 hours, especially in a period of about 3 to 8 hours, preferably about 4 hours. [For example, less than about 0.5 hours, or significantly more than about 12 or about 18 hours.
  • the separated cells can be collected and / or collected in any appropriate container, eg a collection tube, which allows for the survival and / or proliferation of the cells.
  • Various media are commercially available and may be needed depending on the type of cells identified and / or separated. These media may be, for example, dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, Iscove 's medium, etc., which are often supplemented with fetal calf serum, human serum, or serum substitutes.
  • the identified and / or separated cell populations can be used immediately or cultured after isolation in vitro. After that, the cells can be frozen or frozen before the separation process. If the cells are stored for a longer period of time, it it is preferably at temperatures of about -80 0 C or frozen in liquid nitrogen, in order to guarantee that they can be used again after thawing. In this case, the cells are normally stored in DMSO and / or FCS / HS in conjunction with a medium, glucose, etc. Once thawed, the cells can either be used directly for therapeutic purposes or in vitro experiments or augmented and / or differentiated by the use of growth factors, antigens, cells, etc.
  • the regulatory Th cells are identified and / or separated from mammalian (Mamalia) cell samples, but especially from humans, and preferably from healthy subjects and / or patients.
  • the cell samples may be from blood samples containing immune cells (peritoneal, cerebral-spinal, pleural, and / or synovial body fluid), laryngeal irrigation fluids (respiratory tract, lungs), homozygotes, and aspirates from lymph nodes, spleen, tonsils, and / or other lymphoid Tissue stem.
  • the cells can be obtained from animal tissues (eg from the spleen or lymph nodes of an animal).
  • the cells may also be part of a blood sample, eg from a subject or human patient, more preferably from a peripheral blood sample.
  • activated regulatory Th cells are identified and / or separated.
  • Activated regulatory Th cells are directly able to suppress the activity of T cells. In animal models, it has been demonstrated that activated regulatory T cells can prevent the development of autoimmune diseases, graft rejection reactions and allergic reactions. By analogy, it has been suggested that activated regulatory T cells can also prevent the development of chronic immune reactions in humans.
  • activated Th regulatory cells are specifically identified and / or separated.
  • activated regulatory Th cells with the phenotype CD4 + CD25 + FoxP3 + are identified and / or separated.
  • the activation is preferably carried out by means of antigens, antibodies, peptides, proteins, chemical compounds (or mixtures of such substances) or pathogens or cells.
  • Another particular embodiment of the invention is to directly identify and / or isolate living regulatory Th cells ex vivo.
  • activated Th regulatory cells By using the 4-1BB marker and the corresponding 4-1BB antigen, preferably activated Th regulatory cells can be identified and / or separated, thus spoiling a preferred use of the invention for identifying and isolating antigen-specific regulatory Th cells.
  • a cell mixture from a patient and / or probant After obtaining a cell mixture from a patient and / or probant, it can be stimulated with certain antigens.
  • antigens For this purpose, antibodies, peptides, proteins, chemical compounds (or mixtures of such substances) or pathogens or cells may be used.
  • the use of the 4-1BB marker identifies and / or separates the regulatory Th cells.
  • antigen-specific regulatory Th cells are preferably identified and / or separated.
  • the cells separated according to the invention are generally derived from an in vivo source and therefore reflect the immunological status of the donor with respect to the number, location and T cell antigen receptor specificity of the Treg cells. This information can be used in diagnostic tests relating to immunological disorders, e.g. Cancer-related immunosuppression, autoimmune disorders; atopic states, etc.
  • Th cells of the target patient may be exposed in vitro to cells, cell extracts, separated antigens or organ donor proteins before or after transplantation. After that, the active regulatory T cells are identified and / or separated after an appropriate activation time using the 4-1BB marker.
  • the cells may be identified and / or separated by any techniques known to those skilled in the art.
  • identification of the cells the methods of magnetic cell sorting (MACS), fluorescence-activated cell sorting (FACS), ELISA, PCR and / or all fluorescence microscopes known to those skilled in the art are preferred.
  • Particularly preferred is the flow cytometry (FACS).
  • FACS flow cytometry
  • separation of the cells are preferably the cell separation systems by which cells are sorted by means of a magnetic field (MACS) or by flow cytometry (FACS). It is preferred that the expression of the 4-1 BB receptor is measured after a stimulation.
  • the regulatory Th cells are stimulated by substances known to the person skilled in the art. After 1h to 18h stimulation, the expression of the 4-1BB receptor is measured. Preferably, the expression is measured after 3h to 8h of stimulation.
  • the preferred optimal stimulation time is the time at which as many of the activated regulatory T cells as possible are expressed, but as few as possible of the non-regulatory cells 4-1 B. This point in time can be determined by the person skilled in the art by an analysis of the 4-1BB expression at various time points after stimulation.
  • the regulatory Th cells are identified and / or separated after a stimulation of the cells in the cell mixture.
  • the cells are stimulated by antigens, proteins, peptides, chemicals, cells, growth factors, antibodies and / or ligands.
  • the culture may also contain suitable growth factors.
  • Growth factors are defined as molecules that promote the survival, growth, and / or differentiation of a cell, either in culture or in intact tissue, through certain effects on a transmembrane receptor. Growth factors include polypeptides and non-polypeptide factors.
  • Certain growth factors that can be used to culture the separated and / or used cell include the interleukins, eg, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 , IL-8, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, etc.; Antigens, eg peptide antigens, protein antigens such as alloantigens preferably in connection with antigen-presenting cells, lectins, eg ConA, [alpha] -CD3, LPs, etc.
  • the culture may also contain antibodies or specific ligands (purified ligands, FC fusion proteins or other recombinant forms of the leucine zipper) for cell surface receptors that can stimulate or inhibit Treg activity.
  • antibodies or specific ligands purified ligands, FC fusion proteins or other recombinant forms of the leucine zipper
  • Also included in the medium may be mAbs or ligands which bind TNFR or other co-stimulatory molecules to Treg and stimulate and / or enhance Treg activity, override (and cause proliferation) Treg activity, or stimulate apoptosis of Treg.
  • the specific culture conditions serve a particular purpose, eg, the maintenance of Treg cell activity, etc.
  • antibodies be used for the detection of the 4-1 BB receptor.
  • the 4-1BB antibodies are added to a cell suspension and incubated for a sufficient period of time to bind the available cell surface antigens.
  • the incubation is normally at least about 5 minutes to 18 hours. Expression is measured after 3h to 8h of stimulation.
  • the optimal incubation period is that within which as many as possible of the activated regulatory T cells but as few as possible of the non-regulatory cells 4-1 B are labeled. This time frame can be determined by a person skilled in the art by analyzing different incubation times during or after the stimulation.
  • the means in which the cells are separated may be any agent which maintains the activity of the cells.
  • a preferred agent is a phosphate buffered saline solution containing 0.1 to 0.5% BSA or in equal proportions autologous pooled serum or serum replacement.
  • Various media are commercially available and may be used depending on the cell type and the experiment. Available media are Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (dMEM), Hanks Basic Salt Solution (HBSS), a Dulbecoco 's Phosphate Buffered Saline (dPBS), RPMI, Iscove 's Medium, PBS with 5mM EDTA, etc Frequently supplemented by fetal calf serum BSA, HSA etc.
  • dMEM Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium
  • HBSS Hanks Basic Salt Solution
  • dPBS Dulbecoco 's Phosphate Buffered Saline
  • RPMI Iscove '
  • the labeled cells are then separated depending on the expression of 4-1BB.
  • the separated cells can be collected in any appropriate agent that preserves the viability of the cells. Usually they are collected in a collection tube with some serum.
  • Various media are commercially available and may be used depending on the type of cells identified and / or separated, eg dMEM, including HBSS, dPBS, RPMI, Iscove 's medium, etc., often supplemented with fetal calf serum, autologous or pooled serum or serum replacement ,
  • the antigens for detecting the 4-1BB receptor are coupled with a fluorescent substance or directly with magnetic microparticles.
  • antibodies are used which may be coupled to fluorescent markers or magnetic microparticles known to those skilled in the art, such as FITC.
  • FITC Fluorescence actvated cell sorting
  • PE Phycoerythin
  • APC allophycocyanin
  • PerCP Pe ⁇ dmin Chlorophyll Protein
  • a combination of antibodies can be used to differentiate different cells Properties to Defect, Analyze and / or Isolate Based on Markers, Such as Secretory Proteins or Characteristic Surface Molecules
  • fluorescently labeled antibodies can be used for FoxP3, CD25 and / or CD4 markers.
  • Particularly preferred may be fluorescently labeled or with magnetic microparticles Paired Magnetic microparticles can be used directly or indirectly (hapten, for example, biotin and anti-hapten microparticles or fluorochromes, for example, PE or APC and anti-fluororochrome microparticles).
  • the regulatory Th cells from blood, peripheral blood mononuclear cells (PBMC), body tissue or cells of the tissue fluidity are directly identified and / or secreted or isolated
  • the regulatory Th cells are identified and / or segregated from mammalian (Mamalia) cell samples, but especially from humans and preferably from subject and / or patents.
  • the regulatory Th cells may be derived from blood samples containing immune cells (peritoneal cells) , cerebral-spinal, pleural and / or synovial fluidity), flushing of hollow organs (respiratory tract, lungs), homogenates and aspirates of lymph nodes, spleen, tonsils and / or other lymphoid tissue derived Regulaton Th cells can also be obtained from animal tissues ( z B from the spleen or lymph nodes of an animal).
  • Th cells may also be part of a blood sample, such as a subject or human patent, more preferably peripheral blood mononuclear cells (PBMC), body tissue or cells of tissue fluidity
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the invention provides a kit comprising an antibody for detecting the 4-1BB receptor for the identification and / or separation of a regulatory Th-cell It is preferred that in the kit the 4-1BB receptor antibody is coupled to a fluorescent, hapten or magnetic microparticle.
  • a 4-1BB receptor antibody coupled to a fluorescent label, hapten or magnetic microparticle is provided.
  • Fluorescent markers are known in the art, such as FITC, phycoerythrin (PE), allophycocyanin (APC), Cascade yellow and peridinin chlorophyll protein (PerCP).
  • kits activated Th regulatory cells are identified and / or separated.
  • Th regulatory cells can be identified and / or separated.
  • 4-1 BB receptor antibody By using the 4-1 BB receptor antibody, it is possible to identify and / or separate activated regulatory Th cells. Particularly preferably, living, activated regulatory Th cells are identified and / or separated.
  • the method of the invention may e.g. can be used to identify and / or separate regulatory Th cells from a blood sample (or from a blood derivative) or from cell mixture derivatives of lymphoid organs or tumors of mammals.
  • the separated regulatory Th cells can be used before and / or after cloning and / or propagation and / or in cell mixtures enriched in and / or as a pharmaceutical agent in the therapy or prevention of diseases.
  • the coding gene sequences of the TCR can be isolated from the separated regulatory T cells and used for further therapeutic purposes
  • the pharmaceutical agent may be used for the treatment and / or prevention of diseases in mammals, which may include administration of a pharmaceutically effective amount of the pharmaceutical agent into the mammal.
  • the disease may be any disease caused by the presence of a separated cell and / or by the increase in concentration of the cells concerned in / at the site in question, or in the whole
  • Mammalian subjects and / or patients can be treated and / or prevented.
  • the cell may be a Th regulatory cell and may be the treated and / or preventively treated disease an autoimmune disease, an infectious disease, an allergy, graft versus host disease (or allograft rejection) and / or any other hypersensitivity-induced disease.
  • Diseases for which the use set forth in the invention is particularly suitable are those which arise through and / or during a lack of regulation of the immune response. These diseases may be transplant rejection, allergic conditions, certain infectious diseases and / or autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases In the context of autoimmune diseases, it is known that the immune system attacks the body's own structures, e.g. in rheumatoid arthritis, insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM), multiple sclerosis (MS), atherosclerosis, psoriasis, allogeneic stem cell transplantation, organ transplantation. Therapy with specific regulatory T cells is advantageous here.
  • regulatory T cells are to be specifically eliminated for tumor antigens so that the immune system can initiate efficient anti-tumor immune responses.
  • the invention also relates to the use of the composition according to the invention and / or of the pharmaceutical agent according to the invention for the treatment of diseases which are associated with a deficiency of cellular immunity, for example in the defect according to ICDIO code: D.84.4.
  • diseases which are associated with a deficiency of cellular immunity, for example in the defect according to ICDIO code: D.84.4.
  • These may be sepsis, inflammatory reactions and fever, autoimmune diseases and cell division disorders such as cancer.
  • Inflammations in the context of the invention are the reaction of the organism carried by the connective tissue and the blood vessels to an externally or internally induced inflammatory stimulus with the purpose of eliminating or inactivating it and repairing the irritant-induced tissue damage.
  • the process will complemented by disturbance of the electrolyte balance (transmineralization), immigration of neutrophilic granulocytes and monocytes through the vascular walls (see also leukotaxis), the latter with the purpose of eliminating the inflammatory stimulus and damaged to necrotic cells (phagocytosis); Furthermore, lymphocyte effector cells, which lead to the formation of specific antibodies against the inflammatory stimulus (immune reaction), as well as eosinophils (in the healing phase or - very early - in allergic-hyperergic events).
  • the activation of the complement system releases fragments (C3a and C5a) of this system which, like histamine and bradykinin, act as mediators of inflammation, in the sense of stimulating the chemotaxis of the cited blood cells; Furthermore, blood clotting is activated. As a result, damage (dystrophy and coagulation necrosis) of the associated organ parenchyma occurs. Depending on the intensity and type of inflammation, the entire organism reacts with fever, stress (see adaptation syndrome), leucocytosis and changes in the composition of the plasma proteins (acute phase reaction), which lead to an accelerated erythrocyte sedimentation reaction.
  • Preferred inflammations in the sense of the invention are purulent, exudative, fibrinous, gangrenous, granulomatous, hemorrhagic, catarrhal, necrotizing, proliferative or productive, pseudomembranous, serous, specific and / or ulcerated inflammations ,
  • Autoimmune diseases in the sense of the invention are diseases that are due in part to the formation of autoantibodies and their damaging effect on the whole organism or organ systems, that is to say on autoaggression.
  • autoimmune diseases may also be diseases in which T cells play a prominent role in pathogenesis or initiation. Classification is possible as an organ-specific, intermediate and / or systemic autoimmune disease.
  • Preferred organ-specific autoimmune diseases are HASHIMOTO thyroiditis, primary myxedema, thyrotoxicosis (BASEDOW disease), pernicious anemia, ADDISON disease, myasthenia gravis and / or juvenile diabetes mellitus.
  • Preferred intermediate autoimmune diseases are GOODPASTURE syndrome, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune leukopenia, idiopathic thrombocytopenia, pemphigus vulgaris, sympathetic ophthalmia, primary biliary cirrhosis, autoimmune hepatitis, ulcerative colitis and / or SJ ⁇ GREN syndrome.
  • Preferred systemic autoimmune diseases are rheumatoid arthritis, rheumatic fever, systemic lupus erythematosus, dermatomyositis / polymyositis, progressive systemic sclerosis, WEGENER granulomatosis, panarteritis nodosa and / or hypersensitivity angiitis.
  • the basis for this is an aggressive immune reaction as a result of the collapse of immune tolerance towards self-determinants and an overweight of inflammatory T-helper cells.
  • autoantigens for example, by linking host proteins with haptens (for example drugs), ontogenetic tissue developing only after development of self-tolerance and protein components unmasked by changes in the conformation of the proteins in connection with, for example, infection by viruses or bacteria; furthermore for new proteins arising in connection with neoplasms.
  • Sepsis diseases are for the purposes of the invention diseases due to continuous or periodic penetration of pathogenic bacteria and / or their toxins from a disease focus and their spread on the lymph-blood route to the general or local infection.
  • Sepsis within the meaning of the invention are preferably wound sepsis (phlegmon, thrombophlebitis, lymphangitis), puerperal sepsis (in puerperal fever), otogenic sepsis (in otitis media), tonsillogenic sepsis (in angina, peritoneillitis), cholan-gitic sepsis (in case of purulent cholecystitis, cholangitis) , pyiephlebitic sepsis (in pylephlebitis) umbilical sepsis (in case of omphalitis etc.), urosepsis and tooth granuloma.
  • Sepsis within the meaning of the invention can be acute to very high (foudroyant), subacute (for example as endocarditis lenta) or chronic, but of course also as neonatal sepsis.
  • Sepsis within the meaning of the invention are therefore all pathogenic changes of a patient, which may be associated with intermittent fever and chills and with splenic tumor, with toxic reactions or damage of the bone marrow or the blood (polynuclear leukocytosis, anemia, hemolysis, thrombocytopenia) or with pathogenic reactions in the heart and the vascular nerves (tachycardia, central circulation, edema, oliguria, possibly shock) or the digestive tract (dry, covered tongue, diarrhea) or with septicopyemia (pyemia with formation of septic infarction and metastatic abscess).
  • Preferred diseases which are associated with a deficiency of the cellular immune system, are for the purposes of the invention furthermore:
  • AIDS acne, albuminuria (proteinuria), alcohol withdrawal syndrome, allergies, alopecia (hair loss), ALS (amyotrophic lateral sclerosis), Alzheimer's disease, AMD (age-related macular degeneration), anemia, anxiety disorders, anthrax (anthrax), aortic sclerosis, arterial occlusive disease, arteriosclerosis , Arterial Occlusion, Temporal Arteritis, Arteriosclerosis, Arteriovenous Fistulas, Arthritis, Osteoarthritis, Asthma, Respiratory insufficiency, autoimmune disease, AV block, acidosis, herniated disc, peritonitis, pancreatic cancer, Becker muscular dystrophy, benign prostatic hyperplasia (BPH), bladder carcinoma, hemophilia
  • the cancer or tumor being treated or prevented is selected from the group of cancers or tumors of the shark
  • Nasopharyngeal region lungs, mediastinum, gastrointestinal tract, urogenetal system, gynecological system, breast, endocrine system, skin, bone and soft tissues, mesotheliomas, melanomas, neoplasms of the central nervous system, Cancer or
  • tumors may be adenocarcinoma of the breast, prostate and colon, all forms of lung cancer originating in the bronchi, bone marrow cancer, melanoma, hepatoma, neuroblastoma, papilloma, apudoma Chomstoma, Branchioma, Malignant Carcinoid Syndrome, Carcinoid Heart Disease, Carcinoma (for Walker carcinoma, basal cell carcinoma, basosquamous carcinoma, Brown Pearce carcinoma, ductal carcinoma, Ehrlich tumor, in situ carcinoma, cancer 2 carcinoma, Merkel cell carcinoma, mucous carcinoma, non-small cell lung carcinoma, oat cells Carcinoma, papillary carcinoma, cirrhotic carcinoma, bronchiolo-alveolar carcinoma, bronchial carcinoma, squamous cell carcinoma and transitional cell carcinoma); histiocytic dysfunction; Leukemia (for example in connection with B-cell leukemia, mixed cell leukemia, null-cell leukemia, T-cell leukemia,
  • the anticancer or tumor being treated or prevented is selected from the group comprising neoplasms of the ear, nose and throat
  • Mediastinal tumors of the gastrointestinal tract comprising tumors of the esophagus, stomach, pancreas, liver, gall bladder and biliary tract, small intestine, colon and rectum carcinomas and anal carcinomas, genitourinary tumors comprising kidney, ureter, bladder, prostate, urethra, penis and testis tumors, gynecological tumors including cervical, vaginal, vulvar, carcino-cumcinoma, malignant trophoblast disease, ovarian carcinoma, Fallopian tube tumors, peritoneal tumors, breast cancers, tumors of endocrine organs including thyroid, parathyroid, adrenal, endocrine pancreatic tumors, carcinoid tumors and carcinoid syndrome, multiple endocrine neoplasias, bone and soft tissue sarcomas, mesotheliomas, skin tumors, melanomas cutaneous and intraocular melanomas, tumors of the central nervous system,
  • AIDS-associated lymphomas AIDS-associated central nervous system lymphomas
  • AIDS-associated Hodgkin's disease AIDS-associated anogenital tumors
  • transplantation-related malignancies metastatic tumors including metastases, lung metastases, liver metastases, bone metastases, pleural and pericardial Metastases and malignant ascites.
  • the cancerous disease or tumor, the / being treated or prevented is selected from the group comprising cancerous diseases or tumor diseases of the breast, the Gastrointes-t 'naltumore, including colon carcinomas, stomach carcinomas, Pankreaskarziome, colon cancer, Dünndamnkrebs, the Ovarian cancer, cervical carcinoma, lung cancer, prostate cancer, renal cell carcinoma and / or liver metastases.
  • cancerous diseases or tumor diseases of the breast the Gastrointes-t 'naltumore, including colon carcinomas, stomach carcinomas, Pankreaskarziome, colon cancer, Dünndamnkrebs, the Ovarian cancer, cervical carcinoma, lung cancer, prostate cancer, renal cell carcinoma and / or liver metastases.
  • Immunopathological reactions cause the loss of function of a particular tissue and can destroy tissues.
  • the use of the invention allows active regulatory Th cells of patients with these diseases to be isolated to treat the tissue-damaging immune response.
  • the use according to the invention is intended to enable a specific elimination of tumor-specific Treg in vitro or ex vivo. If the regulatory Th cells are present in too small numbers, they can be separated and enriched and / or propagated in cell cultures. In both cases, the patient could be treated with the enriched and / or increased and thus increased number of regulatory Th cells, which would be expected to suppress the immunopathological response and thus improve and / or cure the disease.
  • Autoimmune diseases for which the 4-1 BB receptor could be used as a marker for the identification and / or isolation and subsequent enrichment of active regulatory Th cells and a successful therapy is expected includes, but is not limited to, diabetes mellitus (IDDM), multiple sclerosis (MS), atherosclerosis (AS), psoriasis, intestinal inflammation, autoimmune haemolytic anemia, Sjogrens syndrome, autoimmune thyroiditis and systemic lupus erythematosis.
  • IDDM diabetes mellitus
  • MS multiple sclerosis
  • AS atherosclerosis
  • psoriasis psoriasis
  • intestinal inflammation autoimmune haemolytic anemia
  • Sjogrens syndrome autoimmune thyroiditis
  • systemic lupus erythematosis systemic lupus erythematosis.
  • regulatory Th cells in the context of transplantation are capable of suppressing immune responses that could lead to graft rejection.
  • Treatment of a patient and / or subject with initially isolated and then enriched specifically activated regulatory Th cells could prevent and / or prevent graft rejection.
  • Transplant rejections are triggered by an immune response from the graft acceptor.
  • the immune cells of the acceptor fight the foreign body tissue.
  • Th cells from the target patient would be exposed in vitro to cells, cell extracts, isolated antigens or organ donor proteins before or after transplantation. Accordingly, the active regulatory Th cells would be identified and / or separated after an appropriate propagation time using the 4-1BB marker. The identified and / or separated active regulatory Th cells would then be returned to the graft acceptor.
  • the cells treated by this method suppress the immune response to the graft and delay or prevent graft rejection.
  • the use of the 4-1BB marker could, inter alia, be used with allele grafts and / or xenografts, such as, for example, used in heart, lung, intestinal, corneal, renal and bone marrow transplants.
  • regulatory Th cells In case of allergy, regulatory Th cells would be identified and / or separated either prior to polyclonal activation of T cells or after culturing with specific allergens. The identified and / or separated cells would then be returned to the patient after eventual multiplication. It is now expected that the thus treated regulatory Th cells suppress the immune response and improve the symptoms associated with the antigens used.
  • Treatment of allergies by identification and / or isolation of active regulatory Th cells with marker 4-1BB and the method described would be useful, inter alia, in dermal rashes, atopic dermatitis, asthma, allergic rhinitis, insect venoms and food allergy, e.g. against gluten, dairy products, nuts and / or fish antigens.
  • Another alternative would be treatment with patient isolated regulatory Th cells exposed to certain antigens to obtain regulatory Th cells that could switch the immune response in a defined, particular direction.
  • Genes can be introduced into the cells before culture or transplantation for a variety of purposes, e.g. to prevent or reduce the susceptibility of infection, to replace genes that are subject to vertigo of a functional mutation, to increase the ability of Treg to inhibit Th cells, etc.
  • vectors can be introduced which express antisense mRNA or ribozymes whereby the expression of an undesired gene is blocked.
  • Other methods of gene therapy are the introduction of drug resistance genes, for example drug resistance gene (MDR) or anti-apoptosis genes, as in -2.
  • MDR drug resistance gene
  • transfecting target cells e.g. by electroporation, calcium precipitated DNA, fusion, transfection or lipofection. The particular manner in which the DNA is introduced is not critical to the use of the invention.
  • vectors are known to those skilled in the art that can be used to deliver exogenous genes to mammalian cells.
  • the vectors may be episomal, e.g. Plasmids, virus vectors such as e.g. Cytomegalovirus, adenovirus, etc.
  • the moieties can be integrated into the target cell genome by homologous recombination or by random integration, such as, e.g. Retrovirus-derived vectors such as MMLV, HIV-1, ALV, etc.
  • Treg cells By means of in vitro assays or screenings, active factors of the Treg cells can be analyzed. Co-culture assays may also be performed to study changes in Tregs that supress the proliferation of normal T cells including CD4 T as well as CD8 T. Interactions with dendritic cells and other antigen-determined cells can also be investigated.
  • the regulatory cells separated according to the invention may be the starting material of a wide variety of different analyzes, e.g. immunoassays for protein binding studies, cell growth determinations, differentiation and functional activity, production of hormones, etc.
  • FIGS. 1a and 1b 4-1BB is expressed early after activation specifically by negulatory T cells
  • MV peripheral Th cells
  • A peripheral Th cells
  • C regulatory T cells specific transcription factor Foxp3
  • the isolated subpopulations were then stimulated with PMA / lonomy ⁇ 'n in vitro for various lengths of time (0, 4 and 8 hours), the E ⁇ xpression of 4-1BB by FACS analysis (D).
  • the transcriptional factor Foxp3 specific for regulatory T cells is expressed specifically in 4- 1BB + Th cells after activation (RNA analysis)
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the regulatory T cell-specific transcription factor Foxp3 is expressed specifically in 4-1BB + Th cells after activation (protein analysis)
  • CD4 + Th cells were isolated from PBMC and stimulated for 4h with PMA / ionomycin in vitro. Successor were washed with FACS + 4-1BB and 4-1BB "Th cells isolated quietly. The isolated cells were then intracellularly with Foxp3-specific labeled antibodies.
  • CD4 + Th cells were isolated from PBMC and stimulated for 4h with PMA / ionomycin in vitro. Subsequently, the cells were labeled extracellularly with antibodies to CD69 (activation marker) and 4-1BB. Subsequently, it was labeled intracellularly with Foxp3-specific antibodies. In the left analysis plot this is electronic analysis windows for CD69 + activated Th cells are displayed. The right analysis plot shows the co-expression of 4-1BB and Foxp3 in CD69 + activated Th cells.
  • Figures 5 to 7 Specificity and in vitro suppression of TSST-1-specific 0025 ⁇ Treg after isolation via TSST-1-induced 4-1BB E ⁇ xpression
  • FIG. 5 is a diagrammatic representation of FIG. 5
  • CD25 * 4 CD4 + T cells were isolated by FACS from PBMC of a healthy donor and cultured with autologous CD4 ' CD25 " PBMC in a ratio of 1: 2 with 1 ⁇ g / ml TSST-1 for 4h at 37 ° C. subsequently, by FACS 4-1BB and 4-1BB + "CD4 + CD69 + T cells isolated.
  • FIG. 6 is a diagrammatic representation of FIG. 6
  • CD4 + CD69 + T cells were directly labeled and analyzed by FACS sorting with antibodies to Foxp3, Vbeta2 and Vbeta17.
  • FIG. 7 is a diagrammatic representation of FIG. 7
  • 4-1BB + CD4 + CD69 + T cells were cultured by FACS sorting for 6 days in medium and 10% FCS. Subsequently, they were cultured with CFSE-labeled naive CD45RA + CD4 + T cells and CD4 " PBMC at a ratio of 1: 1: 1 for 4 days in the presence of TSST1 0.5 ⁇ g / ml, as control were CFSE-labeled naive CD45RA + CHH + T cells and CD4 " PBMC cultured in the ratio 2: 1 for 4 days in the presence of TSST1 0.5 ⁇ g / ml.

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Abstract

Es wird die Verwendung des 4-1BB Rezeptors zur Identifizierung und/oder Separation von spezifischen regulatorischen Th-Zellen nach Aktivierung mit Antigen, polyklonalen regulatorischen Th-Zellen nach polyklonaler Aktivierung und ein Verfahren zur Identifizierung und/oder Separation von regulatorischen Th-Zellen vorgeschlagen, wobei die regulatorischen T-Zellen anhand der Ausprägung des 4-1BB Rezeptors durch einen Antikörper, Antigen oder Liganden gekoppelt mit einem fluoreszierenden Stoff, Haptenen oder magnetischen Mikropartikeln detektiert werden und ein Kit, umfassend einen Antikörper, Antigen oder Liganden zur Detektion des 4-1BB Rezeptors zur Identifikation und/oder Separation einer regulatorischen Th-Zelle, wobei der Antikörper mit einem fluoreszierenden Stoff, Haptenen oder magnetischen Mikropartikeln gekoppelt ist, vorgeschlagen.

Description

Verwendung des 4-1BB Rezeptors zur Identifizierung und/oder Separation aktivierter regulatorischer Th-Zellen (Treg)
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines 4-1 BB Rezeptors zur Identifizierung und/oder Separation von aktivierten regulatorischen T-Zellen und einen Kit, umfassend einen Antikörper zur Detektion des 4-1 BB Rezeptors (CD137) zur Identifikation und/oder Separation aktivierter regulatorischer Th-Zellen, wobei der Antikörper an einen fluoreszierenden Stoff oder magnetische Mikropartikel gekoppelt ist. Die regulatorischen T Zellen können hierbei sowohl polyklonal als auch mit spezifischen Antigenen aktiviert sein. Die Aktivierung kann in vitro oder bereits in vivo erfolgt sein.
Im Organismus existieren spezifische T-Zellen, die nicht erwünschte Immunreaktionen wie zum Beispiel gegenüber körpereigenen Strukturen (Autoantigenen) aktiv unterdrücken. Sie werden als regulatorische T- Zellen (Treg) bezeichnet. Regulatorische T-Zellen sind essentiell and der lebenslangen Erhaltung der peripheren Toleranz gegenüber Autoantigenen beteiligt. Sie werden im Thymus gebildet, dessen Aktivität jedoch mit zunehmendem Alter stark reduziert ist.
Regulatorische T-Zellen können zur Unterdrückung von Anti-Tumor-Antworten führen (Onizuka et al., Cancer Res. 59: 3128-3133 (1999); Shimizu et al., J. Immunol. 163:5211-5218 (1999)), da viele Tumorantigene klassische Autoaπtigene repräsentieren. Dagegen können verminderte Anzahlen von Treg oder funktionale Veränderungen von Treg zu Autoimmunkrankheiten führen, in deren Verlauf dann körpereigene Strukturen wie Fremdstoffe oder Pathogene unkontrolliert attackiert werden.
Tregs sind an der Aufrechterhaltung der immunologischen Selbsttoleranz beteiligt, indem sie die Aktivierung autoreaktive T-Zellen unterbinden. Sie sind in der Lage, sowohl die Cytokinproduktion als auch die Proliferation solcher potentiell pathogener T-Zellen zu supprimieren. Ein wesentlicher Schritt zur Identifizierung von regulatorischen T-Helferzellen war die Charakterisierung von CD4+ T-Helferzellen, die die alpha-Kette des lnterleukin-2 (IL-2) Rezeptors (CD25) konstitutiv als Oberflächenmembranprotein aufwiesen. Die funktionelle Bedeutung und die genauen molekularen Mechanismen der Suppression dieser CD25+ CD4+ regulatorischen T-Zellen und auch wie sie entstehen, sind bisher nicht geklärt. Da der CD25 Rezeptor auch von Sub- populationen nicht-regulatorischer T-Zellen ausgeprägt wird, kann dieser Marker nur bedingt zur Analyse und Anreicherung von Treg verwendet werden Insbesondere aber kann CD25 nicht zur Identifizierung und Separation von aktivierten, Antgen-spezrfischen regulatonschen T Zellen verwendet werden
Eine Isolierung von Treg und im besonderen von Treg spezifisch für bestimmte Antigene ist dennoch eines der grossen therapeutischen Ziele Ebenso die Analyse von Antgen-spezrfischen Treg1 (Auto)-Antιgen- spezrfische Tregs sind ein spezifisches Mittel zur Unterdrückung von ungewollten Immunreaktionen wie z B Autoimmunreaktionen bei Rheumatoider-Arthπtis (RA), Multipler Sklerose (MS), Atherosklerose (AS), Diabetes, Psoriasis Andere ungewollte Immunreaktionen bei denen Treg ein spezifsches Mittel darstellen wurden sind die GvHD (graft vesus host disease) bei allogene Stamzelltransplantationen oder die Transplantatab- stoßung bei Organtransplantationen (Hara et al , J Immunol 166 3789-3796(2001), Taylor et al , J Exp Med 193 1311-1318 (2001) Auch Allergien stellen ungewollte Immunreaktionen dar, für die es bisher nur wenige therapeutische Optionen gab Eine therapeutische Behandlung mit Treg, die auf dem naturlichen Prinzip von peripherer Toleranz beruht und in vielen experimentellen Modellen bewiesen ist, wurde keine Nebenwirkungen im Vergleich zu klassischen immunosuppressiven Medikamenten beinhalten und wäre kurativ
Hinsichtlich der aufgeführten Bedeutung der Tregs sind die an der Supression beteiligten Moleküle und Mechanismen sowie zuverlässige Treg-Marker von großer Bedeutung Im Stand der Technik ist ein molekularbiologischer Treg-Marker, der zur Forkhead-Familie gehörende Transkπptionsrepressor FoxP3, anerkannt (Hon et al (2003) Science 99(5609) 1057-61) Des werteren können regulatonsche T-Zellen anhand der Expression des CD25 Moleküls identifiziert werden (Thomton and Shevach (1998) J Exp Med 188 287- 296, Sakaguchi et al (1995) J Immunol 155 1151-1164)
Choi et al 2004, JLB, offenbaren, dass bisher keine Anhaltspunkte existieren, dass 4-1BB als diskπmmativer Marker für Treg gegenüber CD25 negativen Zellen einsetzbar ist
Allerdings ist es bisher vor allem nicht möglich, die Treg zu identifizieren und zu isolieren, die ein spezifisches Antigen erkennen Dies wäre möglich, wenn spezifisch aktivierte Treg sepaπert werden konnten und wäre eine Grundvoraussetzung für spezifische Therapien mit Treg zum Beispiel bei Autoimmunerkrankungen, in denen die der Krankheit zu Grunde liegenden Autoimmunreaktivitaten unterdruckt werden sollten nicht aber Immunreaktivitaten gegen Tumorzellen
Es ist somit schwierig nach dem bisheπgen Stand der Technik regulatonsche T-Zellen zu identifizieren und/oder zu isolieren Bishenge oben beschπebene Marker lassen nicht zu, dass die Gesamtheit der regula- tonschen T-Zellen identifiziert werden kann, da nicht alle regulatonschen T-Zellen definiert spezifische Mar- ker exprimieren. Demzufolge können bisher nur Subpopulationen identifiziert und/oder separiert werden wie zum Beispiel nur die Treg, die den CD25 Rezeptor stark ausprägen. Des Weiteren können verschiedene andere Zeilsubpopulationen die gleichen Zelloberflächenmarker besitzen (wie CD4 für ThI Th2, oder anderen Th-Zellen oder CD25 für aktivierte T-Zellen oder B-Zellen. Insbesondere ist jedoch die Identifizierung aktivierter Treg nach Stimulation mit definierten Antigenen anhand spezifischer Aktivierungsmarker nicht möglich. Die Aktivierung von regulatorischen Th-Zellen führt zur zwar zur verstärkten Expression von CD25 und CD38, die aber wie alle anderen beschriebenen T- Zellaktivierungsmarker auch in anderen T-Zellen exprimiert werden, so dass bisher keine Antigen- spezifischen Treg anhand spezifischer Aktivierungsmarker separiert werden können.
Die Mehrzahl der Methoden, die anhand der Expression eines bestimmten Zelloberfiächenmarkers regulatorische Th-Zellen identifizieren und/oder isolieren hängen von der Erkennung eines Markers und der Bindung eines Antikörpers ab. Wenn nicht ein einziger Marker verwendet werden kann, um einen bestimmten Zelltyp zu identifizieren und/oder zu isolieren, muss eine Kombination von Markern und den zu ihnen passenden Antikörpern gefunden werden (Levingset al., J Exp. Med. 193 (11 ): 1295-1302 (2001 )). Solche Experimente können in der Praxis sehr komplex und schwierig in der Durchführung sein. Des Weiteren kann die Bindung der Antikörper die Aktivität der Zielzelle oder die Expression der anderen Marker beeinflussen, so dass der Identifikation und/oder Separationsprozess mit den weiteren Antikörpern negativ beeinflusst wird.
Abschließend soll noch angemerkt werden, dass es durch die Bindung von Antikörpern zu einer Querverbindung (cross-linking), Kappung und Internalisation der betreffenden Marker kommen kann. Hierdurch kann die Zellfunktion eingeschränkt werden. Auch wenn Fab-Fragmente verwendet werden, sind die betreffenden Marker maskiert und können unter Umständen in ihrer Funktion beeinträchtigt sein. Die Bindung an bestimmte Marker kann auch zur Deaktivierung der Zelle führen (CD28, go3), Apoptose induzieren (Quer- vemetzung von CD4 in aktivierten Zellen) oder die Sekretion von Zytokinen induzieren (CD3, CD2, CD28). Anhand des Standes der Technik konnte bisher keine spezifische Identifizierung und/oder Separation von ausschließlich lebenden regulatorischen T-Zellen durchgeführt werden. Der einzig bisher beschriebene spezifische Marker FoxP3 kann zudem neueren Untersuchungen folgend auch in nicht-regulatorischen T- Zellen induziert werden (Fontenot J.D. 2003, Hori S. et al.2003). Da FoxP3 als intrazelluläres Protein vorliegt, ist es darüberhinaus nach dem bisherigen Stand der Technik nicht möglich, lebende regulatorische Zellen zum Beispiel anhand eines FoxP3-Antikörpers zu identifizieren und/oder zu isolieren. Wiederum stellt sich zusätzlich das Problem, dass nur die Gesamheit der Treg identifiziert werden kann, nicht aber Treg spezifisch für zuvor definierte Antigene. Daher ist eine zuverlässige Identifikation und/oder Separation von Treg und inbesondere Antigen-spezifischer Treg bisher nicht möglich. So offenbart auch BD Pharmingen TM: Technical Data Sheet: PE conjugated mouse anti-human CD137 (4-1BB)", 7. Mai 2005, httpV/www.bdbiosdences.cxjm/extemaLfiles/prTVdcκ^ds/hurnan/live/ web_enablea736005X_555956.pdf, dass der 4-1 BB Marker ein Aktivierungsmarker für alle T-Zellen darstellt. Auch die WO 2005/124346 beschreibt lediglich, dass 4-1BB Marker auf CD4+ CD25* sind; die Druckschrift offenbart allerdings nicht, dass CD4+ CD25+ zu einem bestimmten Zeitpunkt der Aktivierung 4-1 BB Marker im Vergleich zu CD4+ CD25" T-Zellen spezifisch ausprägen. Der bestimmte Zeitpunkt kann beispielsweise durch Kontrollen, bevorzugt regelmäßige Kontrollen, ermittelt werden. Es ist beispielsweise möglich, dass im wesentlichen in 30 Minuten Abständen eine Probenentnahme oder eine direkte Beobachtung dahingehend erfolgt, ob die aktivierten regulatorischen Th-Zellen den Marker als diskriminativen Marker ausgeprägt haben. Die mehrfachen, bevorzugt regelmäßigen Kontrollen sind demgemäß regelmäßige Beobachtungen des Systems, direkt durch einen Fachmann oder mithilfe von Analysegeräten oder-mechanismen in Abständen von 5, 10, 15, 30, 45 Minuten, bevorzugt einstündigen Abständen. Es ist also durch die Kontrollen der Zeitpunkt zu bestimmen, an welchem nur die aktivierten regulatorischen Zellen den Rezeptor/Marker aktivieren, wobei es überraschend war, dass dies innerhalb eines kurzen Zeitraums, bevorzugt von ungefähr 0-12 Stunden, besonders bevorzugt in einem Zeitraum von ungefähr 0,5-10 Stunden und ganz besonders bevorzugt in einem Zeitraum von ungefähr 3-8 Stunden, vor allem von im wesentlichen bzw. ungefähr 4 Stunden erfolgt. Diese Zeitangaben beziehen sich auf die dem Fachmann üblichen Laborbedingungen für die Aktivierung von T-Zellen. Werden deutlich höhere oder niedrigere oder auch nur geringfügig höhere oder niedrigere Temperaturen gewählt, oder aber Zusätze ins System gegeben, die eine Aktivierung hemmen oder sti- mulieren, kann sich der Zeitraum verlängern oder aber verkürzen. Dadurch, dass beispielsweise ein Fachmann die Ausbildung des Markers/Rezeptors kontrolliert, ist eine einfache Bestimmung der spezifischen zeitlichen Ausprägung möglich. Selbstverständlich weiß der Fachmann, dass er bei Entnahme der T-Zellen aus in vivo Systemen in einem Zellgemisch immer einige Zellen vorfindet, die bereits aktiviert sind und demgemäß 4-1BB (Rezeptor) ausbilden. Die Autoren der WO 2005/124346 offenbaren vielmehr, dass beide Zellpopulationen CD4+ CD25+ wie auch CD4+ CD25" T-Zellen nach ihrer Aktivierung 4-1BB Marker in gleicher Stärke ausprägen. Die genannten Druckschriften geben damit die Auffassung des Standes der Technik wieder, nach welchem 4-1 BB Marker nicht als diskriminativer Marker für CD25+ Treg-Zellen im Vergleich zu CD25" T-Zellen verwendet werden kann. Insbesondere beschreibt BD Pharmingen TM einen PE konjugierten Maus anti-human CD137 Antikörper. In der WO 2005/124346 wird vor allem die Co-Stimulation von frisch isolierten CD4+ CD25+ Maus-Treg-Zellen über den 4-1 BB Rezeptor offenbart. Die Treg-Zellen werden nicht über den 4-1 BB Rezeptor stimuliert, sondern über die Anwesenheit von starken Aktivierungsstimuli wie CD3. Gemäß der genannten Offenbarungen geht ein Fachmann davon aus, dass ein Großteil der so genannten frischen Treg-Zellen 4-1BB nicht ausprägt. So ist beispielsweise in Figur 5 der WO 2005/124346 gezeigt, dass ein Co-Stimulation mit 4-1 BBL vor allem auch auf CD25- Zellen aktivierende Eigenschaften ausübt. Eindeutig wird in Abbildung 1D offenbart, dass CD4+ CD25+ und CD4+ CD25" T-Zellen beide wäh- rend der Aktivierung den 4-1BB Rezeptor ausprägen, so dass die genannten Druckschriften den Fachmann nicht motivieren, 4-1BB Rezeptoren zur spezifischen Darstellung oder Isolierung von CD4+ CD25* Treg- Zellen aus Zellgemischen zu benutzen.
Es wurde erfindungsgemäß überraschend ein Verfahren gefunden, wodurch man lebende, aktivierte regulatorische Th-Zellen (Treg) identifizieren und/oder isolieren kann, wobei man den 4-1BB-Rezeptor als Marker und 4-1BB-spezffische Antikörper zur Identifikation und/oder Isolierung der aktivierten, regulatorische T- Zellen verwendet.
Die Erfindung betrifft also die überraschende Lehre, dass insbesondere Antigen-spezifisch aktivierte CD4+ CD25+ Treg von gleichsam, insbesondere aktivierten CD4+ CD25" T-Zellen mittels des 4-1 BB Rezeptors isoliert werden können. Demgegenüber wird im Stand der Technik regelmäßig herausgestellt, dass 4-1BB ein Aktivierungsmarker für CD4+ CD25* und für CD4+ CD25" T-Zellen ist. Vor allem weil in keiner der o. g. Schriften des Standes der Technik eine spezifische Ausprägung von 4-1BB auf CD4+ CD25+ Treg offen- oder nahegelegt wird.
Die regulatorischen Zellen können durch die Expression eines und/oder mehrerer Marker identifiziert und/oder separiert werden. Hierfür können alle dem Fachmann bekannten Marker zur Identifizierung und/oder Separation eingesetzt werden. Bevorzugt werden die Marker 4-1BB, CD25, CTLA-4 (cytotoxic T lymphocyte antigen-4), GITR (Glucocorticoid-induced TNFRezeptor), FoxP3, IL-10, CD69, CD40L, ICOS, OX40 und TGFbeta, die einzeln und/oder in Kombination eingesetzt werden. Hierfür können auch alle dem Fachmann bekannten Marker zum Ausschluß oder der Depletion von nicht-regulatorischen Zellen in Kombination eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist aber die Verwendung des 4-1 BB Rezeptors als Marker von lebenden, aktivierten regulatorischen Zellen. Entweder werden direkt aktivierte regulatorische T-Zellen identifiziert oder separiert oder die Aktivierung wird durch Zugabe von Zellen, Proteinen, Peptiden, Pathoge- nen oder anderen Stoffen induziert.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die überraschende Lehre, dass insbesondere innerhalb einer Zeitabhängigkeit 4-1 BB ein spezifischer Marker für aktivierte Treg-Zellen ist, vor allem in einem Zeitraum von 0,5 bis 18 Stunden, bevorzugt 0,5 bis 12 Stunden, besonders bevorzugt 0,5 bis 10 Stunden, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 8 Stunden, insbesondere in einem Zeitraum von 3 bis 8 Stunden; vor allem bei einer Temperatur von 37°C. Durch die zeitabhängige Beobachtung der Zellen innerhalb von Zeiteinheiten kann in einer bevorzugten Ausführungsform 4-1BB als spezifischer Marker für die Separation und Isolierung von den o. g. aktivierten Zellen (aktivierte Treg) dienen - d. h., die Erfindung betrifft in einer bevor- zugten Ausfuhrungsform die überraschende Lehre, dass aktivierte regulatorische Th-Zellen identifiziert und/oder separiert werden können, insbesondere wenn eine zeitabhängige Beobachtung durchgeführt wird, innerhalb derer der 4-1BB Rezeptor zur Isolierung von CD4+ CD25+ Treg aus Zellengemischen verwendet werden kann. Insbesondere die zeitabhängige Beobachtung der Zellen ermöglicht die Verwendung von 4- 1BB als diskriminativen Marker für CD25+ Treg im Vergleich zu CD25' T-Zellen. Auch wenn zahlreiche Pa- rameterbestjmmungen im Stand der Technik zeitabhängig erfolgen, ist es im Vergleich zum Stand der Technik überraschend, dass in den o. g. bevorzugten Zeiträumen die Ausprägung des Markers so asymmetrisch innerhalb einer Zellkultur auftritt, dass dieser zur Identifizierung oder Separation von aktivierten regulatorischen Th-Zellen (Treg) verwendet werden kann. Es schien bisher ausgeschlossen, 4-1BB als spezifischen Marker für CD25 Treg zu nutzen. So offenbart beispielsweise die WO 2005/124346 nicht, dass es sich bei 4-1BB Rezeptoren um eine ganz spezifische Signatur handelt, die sogar eine direkte Isolierung ermöglicht. Die Dauer der Inkubation, insbesondere über eine Dauer von 3 bis 8 Stunden, bevorzugt 4 Stunden, ertaubt die Verwendung von 4-1BB als diskriminath/er Marker für Treg. Diese Lehre führt in eine andere Richtung als der gesamte Stand der Technik. Durch die Offenbarung der erfindungsgemäßen Lehre kann der durchschnittliche Fachmann diese modifizieren und auf äquivalente Verwendungen erstrecken. Beispielsweise wird er erkennen, dass die Aktivierung auch über einen Zeitraum von 18 Stunden, wenn dem System bestimmte Inhibitoren zugesetzt werden. Wenn dem System beispielsweise ein Zusatz hinzugefügt wird, der verhindert, dass regulatorische T-Zellen aktiviert werden, dann wäre der Zeitraum der Aktivierung länger als 18 Stunden. Innerhalb dieses Systems würde der Fachmann eine Zeitdauer von über 18 Stunden als äquivalent zu 18 Stunden ohne einen Zusatz, der verhindert, dass regulatorische T-Zellen aktiviert wer- den, erkennen. Der Fachmann versteht die anmeldungsgemäfie Lehre so, dass die Zellen aktiviert werden. Dies gilt beispielsweise für die in vitro Versuche. Dem Fachmann ist aber bekannt, dass in in vivo Systemen einige Zellen immer aktiviert sein können. Beispielsweise würden immer einige Zellen, die beispielsweise an einem rheumatischen Entzündungsherd entnommen würden, aktiviert sein, so dass in einer entsprechenden Probe regulatorisch aktivierte Zellen vorliegen. Dem Fachmann ist auch bekannt, dass beispielsweise direkt aus lymphatischem Gewebe isolierte Treg (z. B. bei Experimenten mit Mauszellen, bei denen die Zellen grundsätzlich aus der Milz präpariert werden) ein geringer Teil der isolierten Treg eine schwache Expression von 4-1 BB aufweist, wohingegen bei aus peripherem Blut stammenden Treg keine 4-1 BB Expression detektierbar ist. Der Fachmann erkennt aber die Äquivalenz der in vitro und der in vivo Systeme. Bevorzugt müssen die Treg beispielsweise in vitro aktiviert werden, wobei der Fachmann diese Lehre nicht so auslegen würde, dass dies bei ausgewählten Zellen auch der Fall ist, wenn die Treg direkt aus einem entzündeten Probenmaterial isoliert werden. In einer solchen Situation ist es denkbar, die Zellen ohne Aktivierung direkt anhand ihrer 4-1 BB Expression zu isolieren. Unter der Annahme, dass die Treg direkt am Ort der Entzündung in vivo aktiviert worden sind, ist es bevorzugt, solche Zellen zu isolieren, in vitro zu expandieren und sie z. B. bei Entzündungen mit einhergehender chronischer Autoimmunität zur Therapie zu reinfun- dieren. Die Erkenntnis der zeitlichen Ausprägung eines diskriminativen Markers insbesondere in einem Zeitraum von ungefähr oder im wesentlichen 0,5 bis 8 Stunden einer Aktivierung beispielsweise in in vitro Kulturen bzw. eines äquivalenten Zeitraums in in vivo Kulturen, unter der Berücksichtigung, dass hier regelmäßig einige aktivierte Zellen vorliegen, ermöglicht dem Fachmann die Isolierung von Antigen-spezifischen CD25+ regulatorischen Th-Zellen. Je nach Temperatur des Systems kann sich der Zeitraum von ungefähr 0 bis 18 Stunden, bevorzugt ungefähr 0,5 bis 12 Stunden, besonders bevorzugt von ungefähr 0,5 bis 10 Stunden, ganz besonders bevorzugt von ungefähr 0,5 bis 8 Stunden, insbesondere in einem Zeitraum von ungefähr 3 bis 8 Stunden, bevorzugt ungefähr 4 Stunden verschieben. [Beispielsweise auf weniger als ungefähr 0,5 Stunden oder deutlich mehr als ungefähr 12 oder ungefähr 18 Stunden.
Die getrennten Zellen können in jedem entsprechenden Behältnis - z.B. einer Sammelröhre - aufgefangen und/oder gesammelt werden, welches das Überleben und/oder die Vermehrung der Zellen ermöglicht. Verschiedene Medien sind im Handel verfügbar und können je nach der Art der identifizierten und/oder separierten Zellen gebraucht werden. Diese Medien können z.B. dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, Iscove's Medium usw. sein, welche häufig mit fötalem Kalbsserum, humanem Serum oder Serumersatzstoffen ergänzt wer- den.
Die identifizierten und/oder separierten Zellpopulationen können sofort benutzt werden oder nach Isolierung in vitro kultiviert werden. Hiemach können die Zellen eingefroren werden, oder man friert sie vor dem Trennungsverfahren ein. Falls die Zellen für einen längeren Zeitraum gelagert werden, ist es bevorzugt sie bei Temperaturen um -800C oder in flüssigen Stickstoff einzufrieren, um zu garantieren, dass sie nach dem Auftauen wieder verwenden werden können. Hierbei werden die Zellen normalerweise in DMSO und/oder FCS/HS in Verbindung mit einem Medium, Glucose usw. gelagert. Sobald aufgetaut, können die Zellen entweder direkt für therapeutische Zwecke oder in vitro Versuche verwendet werden oder durch die Verwendung von Wachstumsfaktoren, Antigenen, Zellen usw. vermehrt und/oder differenziert werden.
Bevorzugt ist es, die regulatorischen Th-Zellen aus einem Zellgemisch zu identifizieren und zu isolieren. Die regulatorischen Th-Zellen werden aus Zellproben von Säugetieren (Mamalia), aber besonders von Menschen und bevorzugt aus gesunden Probanden und/oder Patienten identifiziert und/oder separiert. Die Zellproben können z.B. aus Blutproben, die Immunzellen enthalten (peritoneale, cerebrale-spinale, pleurale und/oder synoviale Körperflüssigkeit), Spülungsflüssigkeiten von Hohlorganen (Atemwege, Lungen), Homo- genaten und Aspirata von Lymphknoten, Milz, Mandeln und/oder anderem lymphatischem Gewebe stammen. Die Zellen können aus Tiergeweben gewonnen werden (z.B. von der Milz oder den Lymphknoten eines Tieres). Die Zellen können auch Teil einer Blutprobe sein, z.B. von einer Versuchperson oder menschlichem Patienten, besonders bevorzugt aus einer peripheren Blutprobe. In einer weiteren bevorzugten Ausführung, ist vorgesehen, dass aktivierte regulatorische Th-Zellen identifiziert und/oder separiert werden.
Aktivierte regulatorische Th-Zellen sind direkt in der Lage, die Aktivität von T-Zellen zu unterdrücken. In Tiermodellen ist gezeigt worden, dass aktivierte regulatorischen T-Zellen die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen, von Transplantatabstoßungsreaktionen und allergischen Reaktionen verhindern können. In Analogie dazu vermutet man, dass aktivierte regulatorische T-Zellen auch beim Menschen die Entstehung von chronischen Immunreaktionen verhindern können. Durch die Verwendung des 4-1 BB Markers werden aktivierte regulatorische Th-Zellen spezifisch identifiziert und/oder separiert. Bevorzugt werden zuvor in vitro aktivierte regulatorische Th-Zellen mit dem Phänotyp CD4+ CD25+ FoxP3+ identifiziert und/oder separiert werden. Die Aktivierung erfolgt hierbei bevorzugt mittels Antigenen, Antikörpern, Peptiden, Proteinen, chemischen Verbindungen (oder Gemischen solcher Stoffe) oder Pathogenen oder Zellen. Eine weitere besondere Ausführungsform der Erfindung ist es, lebende regulatorische Th-Zellen direkt ex vivo zu identifizieren und/oder zu isolieren.
Durch die Verwendung des 4-1BB Markers und dem entsprechenden 4-1BB Antigen können bevorzugt aktivierte regulatorischen Th-Zellen identifiziert und/oder separiert werden, was eine eine bevorzugte Verwendung der Erfindung, zur Indentifizierung und Isolierung Antigen-spezifischer regulatorische Th-Zellen ertaubt.
Nach der Gewinnung eines Zellgemisches aus einem Patienten und/oder Probanten, kann diese mit bestimmten Antigenen stimuliert werden. Hierzu können Antikörper, Peptide, Proteine, chemische Verbindungen (oder Gemische solcher Stoffe) oder Pathogene oder Zellen verwendet werden. Nach einer bestimmten Zeit der Aktivierung werden durch die Verwendung des 4-1BB Markers die regulatorischen Th-Zellen identifiziert und/oder separiert, Hierbei werden bevorzugt Antigen-spezifische regulatorische Th-Zellen identifiziert und/oder separiert werden.
Die Zellen die nach der Erfindung separiert werden stammen im Allgemeinen von einer in vivo Quelle ab und reflektieren daher den immunologischen Status des Spenders in Bezug auf die Anzahl, den Standort und die T Zellantigenrezeptorspezifität der Treg Zellen wieder. Diese Informationen können bei der diagnostischen Prüfungen verwendet werden, die sich auf immunologische Störungen beziehen, z.B. Krebs bezogene Immunosuppression, autoimmune Störungen; atopische Zustände, usw.
Des Weiteren können Th-Zellen des Zielpatienten in vitro Zellen, Zellextrakten, separierten Antigenen oder Proteinen des Organspenders vor oder nach der Transplantation ausgesetzt werden. Hiemach würden die aktiven regulatorischen Th-zellen nach einer angebrachten Aktivierungszeit anhand des 4-1BB Markers identifiziert und/oder separiert werden.
Die Zellen können durch alle dem Fachmann bekannten Techniken identifiziert und/oder separiert werden. Zur Identifikation der Zellen eignen sich bevorzugt die Methoden magnetische Zellsortierung (MACS), fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS), ELISA, PCR und/oder alle dem Fachmann bekannte Fluoreszenz- mikroskope. Besonders bevorzugt eignet sich die Durchflußzytometrie (FACS). Für die Separation der Zellen eignen sich bevorzugt die Zeiltrennungssysteme, durch die Zellen mit Hilfe eines Magnetfeldes (MACS) oder durch Durchflußzytrometrie (FACS) sortiert werden. Bevorzugt ist es, dass die Expression des 4-1 BB Rezeptors nach einer Stimulation gemessen wird.
Die regulatorischen Th-Zellen werden durch dem Fachmann bekannte Stoffe stimuliert. Nach 1h bis 18h Stimulation wird die Expression des 4-1BB Rezeptors gemessen. Bevorzugt wird die Expression nach 3h bis 8h einer Stimulation gemessen.
Der bevorzugte optimale Stimulationszeitpunkt ist der Zeitpunkt an dem möglichst viele der aktivierten, regulatorischen T-Zellen, aber möglichst wenige der nicht-regulatorischen Zellen 4-1 B exprimieren. Dieser Zeitpunkt kann vom Fachmann durch eine Analyse der 4-1 BB Expression zu verschiedenen Zeitpunkten nach Stimulation ermittelt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform, ist vorgesehen, dass die regulatorischen Th-Zellen nach einer Stimulation der Zellen im Zellgemisch identifiziert und/oder separiert werden.
Des Weiteren ist eine bevorzugte Verwendung der Erfindung, dass die Zellen durch Antigene, Proteine, Peptide, chemische Stoffe, Zellen, Wachstumsfaktoren, Antikörper und/oder Liganden stimuliert werden.
Die Kultur kann zudem geeignete Wachstumsfaktoren enthalten. Wachstumsfaktoren sind definiert als Moleküle, die das Überleben, Wachstum und/oder die Differenzierung einer Zelle entweder in Kultur oder im intakten Gewebe durch bestimmte Wirkungen auf einen transmembrane Rezeptor fördern. Wachstumsfak- toren schließen Polypeptide und nicht-polypeptide Faktoren ein. Bestimmte Wachstumsfaktoren, die verwendet werden können, die separierte und/oder verwendete Zelle zu kultivieren, schließen die Interleukine, z.B. IL -1, IL -2, IL -3, IL -4, IL -5, IL -6, IL -7, IL -8, IL -8, IL -10, IL -11 , IL -12, IL -13, IL -14, IL -15, IL -16, IL - 17, IL -18 usw. ein; Antigene, z.B. Peptidantigene, Proteinantigene wie z.B. Alloantigene vorzugsweise in Verbindung mit Antigenen zeigenden Zellen, Lectine, z.B. ConA, [Alpha]-CD3, LPs, usw. Die Kultur kann auch Antikörper oder spezifische Liganden (gereinigte Liganden, FC Verschmelzungsproteinen oder andere, rekombinante Formen des Leuάnzipper) für Zelloberflächenrezeptoren enthalten, die die Treg Aktivität stimulieren oder hemmen können. Im Medium können auch mAb oder Liganden, die TNFR oder andere Ko-stimulierende Moleküle auf Treg binden und die Treg Aktivität stimulieren und/oder steigern, Treg Aktivität außer Kraft setzen (und eine Vermehrung herbeiführen), oder die Apoptosis der Treg stimulieren enthalten sein. Normalerweise ist es gewollt, dass die spezifischen Kulturbedingungen einen besonderen Zweck dienen, z.B. die Erhaltung der Treg Zellaktivität usw.
Bevorzugt ist es, dass Antikörper zur Detektion des 4-1 BB Rezeptors verwendet werden.
Die 4-1BB Antikörper werden einer Zellsuspension hinzugefügt und für einen ausreichenden Zeitraum inkubiert, um die verfügbaren Zelloberfiächenantigene zu binden. Die Inkubation beträgt normalerweise mindestens etwa 5 Minuten bis zu 18h. Die Expression wird nach 3h bis 8h einer Stimulation gemessen. Der optimale Inkubationszeitraum ist der, innerhalb dessen möglichst viele der aktivierten, regulatorischen T-Zellen, aber möglichst wenige der nicht-regulatorischen Zellen 4-1 B markiert werden. Dieser Zeitrahmen kann vom Fachmann durch eine Analyse verschieden langer Inkubationszeiten während oder nach der Stimulation ermittelt werden.
Es ist wünschenswert, eine ausreichende Konzentration von Antikörpern in der Reaktionsmischung zu haben, so dass die Effizienz der Trennung nicht vom Mangel an Antikörper eingegrenzt wird. Die entsprechen- de Konzentration kann auch durch Titration bestimmt werden.
Das Mittel, worin die Zellen getrennt werden, kann jedes Mittel sein, das die Aktivität der Zellen erhält. Ein bevorzugtes Mittel ist eine mit Phosphat gepuffertes Salzlösung, die 0,1 bis 0,5% BSA oder in gleichen Anteilen autologes, gepooltes Serum oder Serumersatzstoffe enthält. Verschiedene Medien sind im Handel verfügbar und können abhängig vom Zellentyp und des Experimentes verwendet werden. Verfügbare Me- dien sind Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (dMEM), Hank's Basic Salt Solution (HBSS) ein Dulbec- co 's Phosphat gepufferte Salzlösung (dPBS), RPMI, Iscove's Medium, PBS mit 5 mM EDTA usw. häufig ergänzte durch fötalem Kalbsserum BSA, HSA usw.
Die gekennzeichneten Zellen werden dann abhängig von der Expression von 4-1BB getrennt. Die getrenn- ten Zellen können in jedem entsprechenden Mittel gesammelt werden, das die Lebensfähigkeit der Zellen erhält. Normalerweise werden sie in einer Sammelröhre mit etwas Serum gesammelt. Verschiedene Medien sind im Handel verfügbar und können je nach Art der identifizierten und/oder separierten Zellen verwendet werden, z.B. dMEM, HBSS einschließend, dPBS, RPMI, Iscove's Medium usw., häufig ergänzt mit fötalem Kalbsserum, autologen oder gepoolten Serum oder Serumersatzstoffen. Des Weiteren ist bevorzugt, dass die Antigene zur Detektion des 4-1BB Rezeptors mit einem fluoreszierenden Stoff oder direkt mit magnetischen Mikropartikeln gekoppelt sind.
Für die Durchflußzytometne oder FACS (Fluorescence actvated cell sorting) und die magnetische Zellsorte- rung oder MACS (Magnete aetvated cell sorting) werden Antikörper eingesetzt, die mit Fluoreszenzmarkem oder magnetischen Mikropartikeln gekoppelt sein können, die dem Fachmann bekannt sind, wie z B FITC, Phycoerythπn (PE), Allophycocyanin (APC), Cascade yellow and Peπdmin Chlorophyll Protein (PerCP) Die Antikörper können auch an Haptene gekoppelt sein und dann mit Hapten-spezifischen Sekundarantkorpem detektiert zu werden Eine Kombination von Antikörpern kann benutzt werden, um verschiedene Zellen mit unterschiedlichen Eigenschaften zu defekteren, analysieren und/oder zu isolieren, auf der Basis von Mar- kem, wie z B sekretorische Proteine oder charakteristische Oberflachenmolekule Besonders können fluoreszenzmarkierte Antkorper für FoxP3, CD25 und/oder CD4 Marker eingesetzt werden Besonders bevorzugt können fluoreszenzmarkierte oder mit magnetschen Mikropartikeln gekoppelte 4-1 BB-Antikorper eingesetzt werden Magnetische Mikropartikel können hierbei direkt oder indirekt verwendet werden (Hapten z B Biotin und Ant-Hapten Mikropartkel oder Fluorochrome, z B PE oder APC und Ant-Fluororchrom Mikropartkel)
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform, ist vorgesehen, dass die regulatonschen Th-Zellen aus Blut, periphere mononuklearen Blutzellen (PBMC), Korpergewebe oder Zellen der Gewebeflussigkeit direkt iden- tfiziert und/oder sepaπert bzw isoliert werden
Normalerweise werden die regulatonschen Th-Zellen aus Zellproben von Saugetieren (Mamalia), aber besonders von Menschen und bevorzugt aus Versuchperson und/oder Patenten identfiziert und/oder sepa- πert Die regulatonschen Th-Zellen können z B aus Blutproben, die Immunzellen enthalten (peritoneale, cerebrale-spinale, pleurale und/oder synoviale Korperflussigkeit), Spulungstlussigkeiten von Hohlorganen (Atemwege, Lungen), Homogenaten und Aspirata von Lymphknoten, Milz, Mandeln und/oder anderem lymphatischem Gewebe stammen Die regulatonschen Th-Zellen können auch aus Tiergeweben gewonnen werden (z B von der Milz oder den Lymphknoten eines Tieres) Die Th-Zellen können auch Teil einer Blutprobe sein, z B von einer Versuchperson oder menschlichem Patenten, besonders bevorzugt aus peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC), Korpergewebe oder Zellen der Gewebeflussigkeit
Die Erfindung sieht einen Kit vor, umfassend einen Antikörper zur Detektion des 4-1 BB Rezeptors zur Identifikation und/oder Separation einer regulatonschen Th-ZeIIe Bevorzugt ist es, dass im Kit der 4-1BB Rezeptor Antikörper mit einem fluoreszierenden Stoff, mit einem Hapten oder mit magnetischen Mikropartikeln gekoppelt ist.
Für die Identifikation und/oder Separation der aktivierten, lebenden regulatorischen Th-Zellen wird ein 4-1 BB Rezeptor Antikörper bereitgestellt, der an einem Fluoreszenzmarker, einem Hapten oder magnetischen Mikropartiklen gekoppelt ist. Fluoreszenzmarker sind dem Fachmann bekannt, wie z.B FITC, Phycoerythrin (PE), Allophycocyanin (APC), Cascade yellow and Peridinin Chlorophyll Protein (PerCP).
Des Weiteren ist eine bevorzugte Eigenschaft des Kits, dass aktivierte regulatorische Th-Zellen identifiziert und/oder separiert werden.
Durch die Verwendung des Kits, umfassend einen 4-1BB Rezeptor Antikörper gekoppelt mit einem Fluoreszenzmarker, Haptenen oder magnetischen Mikropartikeln können regulatorische Th-Zellen identifiziert und/oder separiert werden. Durch die Anwendung des 4-1 BB Rezeptor Antikörpers können bevorzugt akti- vierte regulatorische Th-Zellen identifiziert und/oder separiert werden. Besonders bevorzugt werden lebende, aktivierte regulatorische Th-Zellen identifiziert und/oder separiert.
In dieser Ausführung kann die Methode der Erfindung z.B. genutzt werden, um regulatorische Th-Zellen aus einer Blutprobe (oder aus einem Blutderivat) oder aus Zellgemischderivaten von lymphatischen Organen oder Tumoren von Säugetieren identifiziert und/oder separiert werden.
Die separierten regulatorischen Th-Zellen können vor und/oder nach dem Klonieren und/oder Vermehrung und/oder in Zellgemischen angereichert in und/oder als pharmazeutisches Mittel in der Therapie oder Vorbeugung von Krankheiten genutzt werden. Aus den separierten regulatorischen T-Zellen können ausser- dem die kodierenden Gensequenzen des TCR (T-Zellrezptor) isoliert werden und für weitere therapeutische
Zwecke wie zB für Krebstherapien genutzt werden. Außerdem können die in der genannten Form vorliegenden regulatorischen Th-Zellen in weiteren Untersuchungen und/oder Analysen eingesetzt werden. Das pharmazeutische Mittel kann für die Behandlung und/oder Vorbeugung von Krankheiten in Säugetieren verwendet werden, was eine Verabreichung einer pharmazeutisch wirksamen Menge des pharmazeuti- sehen Mittels in das Säugetier einschließen kann.
Die Krankheit kann irgendeine Krankheit sein, die durch die Gegenwart von einer separierten Zelle und/oder durch die Konzentrationserhöhung der betreffenden Zellen in/an der betreffenden Stelle, oder im gesamten
Säugetierprobanden und/oder Patienten behandelt und/oder vorgebeugt werden kann. Zum Beispiel kann die Zelle eine regulatorische Th-ZeIIe sein und die behandelte und/oder präventiv behandelte Krankheit kann eine Autoimmunkrankheit, eine infektiöse Krankheit, eine Allergie, Transplantat versus Wirtskrankheit (oder allogene Transplantatabstoßung) und/oder irgendeine andere durch Hypersensitivität eingeleitete Krankheit sein.
Krankheiten, wofür die in der Erfindung dargelegte Verwendung besonders geeignet ist, sind solche, die durch und/oder während einer fehlenden Regulation der Immunantwort entstehen. Diese Krankheiten können Transplantatabstoßungen sein, allergische Zustände, bestimmte infektiöse Krankheiten und/oder Autoimmunkrankheiten sein.
Im Zusammenhang mit Autoimmunkrankheiten ist es bekannt, dass das Immunsystem körpereigene Strukturen attackiert, wie z.B. bei rheumatischer Arthritis, Insulin abhängiger Diabetes mellitus (IDDM), Multiple Sklerose (MS), Atherosklerose, Psoriasis, allogener Stammzellentransplantation, Organtransplantation. Eine Therapie mit spezifischen regulatorischen T-Zellen ist hier vorteilhaft. Bei Tumorerkrankungen sollen regulatorische T-Zellen spezifisch für Tumorantigene eliminiert werden, so dass das Immunsystem effiziente anti- Tumor Immunantworten inrrjeren kann.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und/oder des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mittels zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer Defizienz der zellulären Immunität verbunden sind, zum Beispiel bei dem Defekt nach ICDIO-Code: D.84.4. Hierbei kann es sich um Sepsiserkrankungen handeln, um Entzündungs-reaktionen und Fieber, um Autoimmun- Erkrankungen und Erkrankungen der Störung der Zellteilung wie zum Beispiel Krebs. Entzündungen im Sinne der Erfindung sind die vom Bindegewebe und den Blutgefäßen getragene Reaktion des Organismus auf einen äußeren oder innerlich ausgelösten Entzündungsreiz mit dem Zweck, diesen zu beseitigen oder zu inaktivieren und die reizbedingte Gewebsschädigung zu reparieren. Auslösend wirken mechanische Reize (Fremdkörper, Druck, Verletzung) und andere physikalische Faktoren (ionisierende Strahlen, UV-Licht, Wärme, Kälte), chemische Stoffe (Laugen, Säuren, Schwermetalle, bakterielle Toxine, Allergene und Immunkomplexe) sowie Erreger(Mikroorganismen, Würmer, Insekten) bzw. krankhafte Stoffwechselprodukte, entgleiste Enzyme, bösartige Tumoren. Das Geschehen beginnt mit einer kurzen Arterio- lenverengung (durch Adrenalinwirkung) mit Mangeldurchblutung und Gewebsalteration, gefolgt von der Ent- Wicklung der klassischen örtlichen Entzündungszeichen (Kardinalsymptome; nach GALEN und CELSUS), das heißt von Rötung (= Ruboη Gefäßerweiterung durch Histamin), Wärme (= Caloπ durch örtliche Stoffwechselsteigerung), Schwellung (= Tumor; durch Austritt eiweißreicher Flüssigkeit aus den - unter anderem durch Histamin - veränderten Gefäßwänden, unterstützt durch die verlangsamte Blutzirkulation im Sinne der Prästase bis Stase), Schmerz (= Dolor; als Folge der erhöhten GewebsSpannung und schmerzauslösender Entzündungs-produkte, zum Beispiel Bradykinin) und Funktionsstörung (= Functio laesa). Der Vorgang wird ergänzt durch Störung des Elektrolythaushaltes (Transmineralisation), Einwanderung neutrophiler Granulozyten und Monozyten durch die Gefaßwände (s.a. Leukotaxis), letzteres mit dem Zweck, den Entzündungsreiz und geschädigte bis neuknotische Zellen zu beseitigen (Phagozytose); femer wandern Lymphozyten- Effektorzellen ein, die zur Bildung spezifischer Antikörper gegen den Entzündungsreiz führen (Immunreakti- on), sowie Eosinophile (in der Heilungsphase bzw. - sehr frühzeitig - bei allergisch-hyperergischem Geschehen). Durch die bei der Reaktion erfolgende Aktivierung des Komplementsystems werden Bruchstücke (C3a und C5a) dieses Systems frei, die - wie das Histamin und Bradykinin - als Mediatoren der Entzündung wirken, und zwar im Sinne der Anregung der Chemotaxis der zitierten Blutzellen; femer wird die Blutgerinnung aktiviert. In der Folge tritt eine Schädigung (Dystrophie und Koagulations-nekrose) des zugeordneten Organparenchyms ein. Der Gesamt-Organismus reagiert je nach Intensität und Art der Entzündung mit Fieber, Stress (s.a. Adaptationssyndrom), Leuko-zytose und Veränderungen in der Zusammensetzung der Plasmaproteine (Akute-Phase-Reaktion), die zu einer beschleunigten Blutkörperchensenkungsreaktion führen. Bevorzugte Entzündungen im Sinne der Erfindung sind die eitrige, die exudative, die fibrinöse, die gangräneszierende, die granulomatöse, die hämorrhagische, die katarrhalische, die nekrotisierende, die proliferative oder produktive, die pseudomembranöse, die seröse, die spezifische und/oder die ulzeröse Entzündungen.
Autoimmunerkrankungen im Sinne der Erfindung sind Krankheiten, die zum Teil auf die Bildung von Auto- antiköφem und deren schädigende Einwirkung auf den Gesamtorganismus bzw. Organsysteme, das heißt auf Autoaggression zurückzuführen sind. Andererseits kann es sich bei Autoimmunerkrankungen auch um Krankheiten halten, bei denen T-Zellen eine herausragende Rolle bei der Pathogenese bzw. Initiation innehaben. Eine Klassifikation ist als organspezifische, intermediäre und/oder systemische Autoimmunerkrankung möglich. Bevorzugte organspezifische Autoimmunerkrankungen sind HASHIMOTO Thyreoiditis, primäres Myxödem, Thyreotoxikose (BASEDOW Krankheit), perniziöse Anämie, ADDISON Krankheit, Myas- thenia gravis und/oder juveniler Diabetes mellitus. Bevorzugte intermediäre Autoimmunkrankheiten sind GOODPASTURE Syndrom, autoimmune hämolytische Anämie, autoimmune Leukopenie, idiopathische Thrombo-zytopenie, Pemphigus vulgaris, sympathische Ophthalmie, primäre biliäre Zirrhose, Autoimmunhepatitis, Colitis ulcerosa und/oder SJÖGREN Syndrom. Bevorzugte systemische Autoimmunkrankheiten sind rheumatoide Arthritis, rheumatisches Fieber, systemischer Lupus erythematodes, Dermato- myositis/Polymyositis, progressive systemische Sklerose, WEGENER Granulomatose, Panarteriitis nodosa und/oder Hyper-sensitivitätsangiitis. Typische Autoimmunkrankheiten sind Thyreotoxikose, Schilddrüsenbedingtes Myxödem, HASHIMOTO Thyreoiditis, generalisierte Endokrinopathie, perniziöse Anämie, chronische Gastritis Typ A, Krankheiten einzelner oder aller korpuskularen Elemente des Blutes (zum Beispiel autoimmunhämolytische Anämie, idiopath. Thrombozytopenie bzw. -pathie; idiopath. Leukopenie bzw. Agranulozytose), Pemphigus vulgaris und Pemphigoid, sympathische Ophthalmie und manche Uveitis- Formen, primär biliäre Leberzirrhose und chronisch aggressive Autoimmunhepatitis, Diabetes mellitus Typ I, CROHN Krankheit und Colitis ulcerosa, SJÖGREN Syndrom, ADDISON Krankheit, Lupus erythematodes disseminatus und als diskoide Form dieser Krankheit, als Dermatomyositis und Sklerodermie, rheumatoide Arthritis (= primär-chronische Polyarthritis), Antiglomerulusbasalmembran-Nephritis. Grundlage sind eine aggressive Immunreaktion infolge Zusammenbruchs der Immuntoleranz gegenüber Selbst-Derterminanten und ein Übergewicht von inflammatorischen T-Helfer-zellen. Femer ist die Bildung von Autoantigenen möglich, zum Beispiel durch Verbindung von Wirtsproteinen mit Haptenen (zum Beispiel Arzneimittel), durch ontogenetisches Gewebe, das sich erst nach Entwicklung der Selbsttoleranz entwickelt und für durch Änderungen der Konformation der Proteine demaskierte Proteinkomponenten im Zusammenhang zum Beispiel mit Infektion durch Viren oder Bakterien; femer für im Zusammenhang mit Neoplasien entstandene neue Proteine.
Sepsiserkrankungen sind im Sinne der Erfindung Erkrankungen infolge dauernden oder periodischen Eindringens von pathogenen Bakterien und/oder deren Giften aus einem Krankheitsherd und deren Ausbrei- tung auf dem Lymph-Blut-Weg zur allgemein beziehungsweise lokalen Infektion.
Sepsis im Sinne der Erfindung sind bevorzugt Wundsepsis (Phlegmone, Thrombophlebitis, Lymphangitis), Puerperalsepsis (bei Puerperalfieber), otogene Sepsis (bei Otitis media), tonsillogene Sepsis (bei Angina, Peritonsillitis), cholan-gitische Sepsis (bei eitriger Cholezystzitis, Cholangitis), pyiephlebitische Sepsis (bei Pylephlebitis) Nabelsepsis (bei Omphalitis etc.), Urosepsis sowie bei Zahngranulom. Die Sepsis im Sinne der Erfindung kann akut bis hochakut (foudroyant), subakut (z. Beispiel als Endocarditits lenta) oder chronisch erfolgen, aber selbstverständlich auch als Neugeborenensepsis.
Sepsis im Sinne der Erfindung sind also alle pathogenen Veränderungen eines Patienten, die mit intermitte- rierendem Fieber und Schüttelfrost verbunden sein können sowie mit Milztumor, mit toxischen Reaktionen beziehungsweise Schäden des Knochenmarks beziehungsweise des Blutes (polynukleäre Leukozytose, Anämie, Hämolyse, Thrombozytopenie) oder aber mit pathogenen Reaktionen am Herzen und der Gefäßnerven (Tachykardie, Zentralisation des Kreislaufs, Ödeme, Oligurie; evtl. Schock) beziehungsweise des Verdauungstraktes (trockene, belegte Zunge, Durchfälle) oder aber mit Septikopyämie (Pyämie mit Bildung septischer Infarkte und metastatischer Abszess) .
Bevorzugte Erkrankungen, die mit einer Defizien des zellulären Immunsystems verbunden sind, sind im Sinne der Erfindung weiterhin:
AIDS, Akne, Albuminurie (Proteinurie), Alkoholentzugs-syndrom, Allergien, Alopezie (Haarausfall), ALS (Amyotrophe Lateralsklerose), Alzheimer Erkrankung, AMD (Altersbedingte Makuladegeneration), Anämie, Angststörungen, Anthrax (Milzbrand), Aortensklerose, arterielle Verschlusskrankheit, Arterienverkalkung, Arterienverschluss, Arteriitis temporalis, Arteriosklerose, Arteriovenöse Fisteln, Arthritis, Arthrose, Asthma, Ateminsuffizienz, Autoimmunerkrankung, AV-Block, Azidose, Bandscheibenvorfall, Bauchfellentzündung, Bauchspeicheldrusenkrebs, Becker Muskeldystrophie, Benigne Prostata Hyperplasie (BPH), Blasenkarzi- nom, Bluterkrankheit
(Hämophilie), Bronchialkarzinom, Brustkrebs, BSE, Budd-Chiaπ-Syndrom, Bulimia nervosa, Bursitis (Schleimbeutelentzundung), Byler-Syndrom, Bypass, Chlamydien-Infektion, Chronische Schmerzen, Cirrhose, Commotio cerebπ (Gehirnerschütterung), CreutzfekWakob-Erkrankung, Darmkarzinom, Darmkrebs, Darmtuberkulose, Depression, Diabetes msipidus, Diabetes mellitus, Diabetes mellitus juvenilis, Diabetische Retinopathie, Duchenne-Muskeldystrophie, Duodenalkarzinom, Dystrophia musculorum progressiva, Dystrophie, Ebola, Ekzem, Erektile Dysfunktion, Fettsucht, Fibrose, Gebarmutterhalskrebs, Gebarmut- terkrebs, Gehirnblutung, Gehirnentzündung, Haarausfall, Halbsertenlahmung, Hämolytische Anämie, Hämophilie, Haustierallergie (Tieitiaarallergie), Hautkrebs, Herpes zoster, Herzinfarkt, Herzinsuffizienz, Herz- klappenentzundung, Hirnmetastase, Hirnschlag, Hirntumor, Hodenkrebs, Ischämie, Kahler-Krankheit (Plasmozytom), Kinderlahmung (Poliomyelitis), Knochenschwund, Kontaktekzem, Lahmung, Leberzirrhose, Leukämie, Lungenfibrose, Lungenkrebs, Lungenodem, Lymphdrusenkrebs (Morbus Hodgkin), Lymphogra- nulomatose, Lymphom, Lyssa, Magenkarzinom, Mammakarzinom, Meningitis, Milzbrand, Mukoviszidose (zystnsche Fibrose), Multiple Sklerose (MS), Myokardinfarkt, Neurodermitis, Neurofibromatose, Neuronale Tumoren, Nierenkrebs (Nierenzellkarzinom), Osteoporose, Pankreaskaranom, Pneumonie, Polyneuropathien, Potenz-Störungen, Progressive Systemische Sklerose (PSS), Prostatakrebs, Quaddelauschlag (Urtikaria), Querschnittssyndrom, traumatisches, Rektumkarzinom, Rippenfellentzündung, Schadel-Him-Trauma, Scheidenkrebs (Vaginalkarzinom), Sinusitis, Speiserohrenkrebs, Tremor, Tuberkulose, Tumorschmerz, Vaginalkarzinom, Verbrennung -Verbrühung, Vergiftungen, Virale Meningitis, Wechseljahre, Weichteilsar- kom, Weichteiltumor, Zerebrale Durchblutungsstörungen und/oder ZNS-Tumore
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die Krebserkrankung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert wird, ausgewählt aus der Gruppe von Krebserkrankungen oder Tumorerkrankungen des HaIs-
Nasen-Ohren-Bereichs, der Lunge, des Mediastinums, des Gastrointestinaltraktes, des Urogenrtal-Systems, des gynäkologischen Systems, der Brust, des endokrinen Systems, der Haut, Knochen- und Weichteilsar- komen, Mesotheliomen, Melanomen, Neoplasmen des zentralen Nervensystems, Krebserkrankungen oder
Tumorerkrankungen im Kmdes-alter, Lymphomen, Leukämien, paraneoplastischen Syndromen, Metasta- sen ohne bekannten Pπmartumor (CUP-Syndrom), peritonealen Karzinomastosen, Immunsuppression- bezogenen Malignitaten und/oder Tumor-Metastasen
Insbesondere kann es sich bei den Tumoren um folgende Krebsarten handeln Adenokarzinom der Brust, der Prostata und des Dickdarms, alle Formen von Lungenkrebs, der von den Bronchien ausgeht, Knochenmarkkrebs, das Melanom, das Hepatom, das Neuroblastom, das Papillom, das Apudom, das Cho- nstom, das Branchiom, das maligne Karzinoid-Syndrom, die Karzinoid-Herzerkrankung, das Karzinom (zum Beispiel Walker-Karzinom, Basalzellen-Karzinom, basosquamöses Karzinom, Brown-Pearce-Karzinom, duktales Karzinom, Ehrlich-Tumor, in situ-Karzinom, Krebs-2-Karzinom, Merkel-Zellen-Karzinom, Schleimkrebs, nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom, Haferzellen-Karzinom, papilläres Karzinom, szirrhöses Karzinom, bronchiolo-alveoläres Karzinom, Bronchial-Karzinom, Plattenepithelkarzinom und Transitionalzell- Karzinom); histiocytische Funktionsstörung; Leukämie (zum Beispiel in Zusammenhang mit B-Zellen- Leukämie, Gemischt-Zellen-Leukämie, Nullzeilen-Leukämie, T-Zellen-Leukämie, chronische T-Zellen- Leukämie, HTLV-I l-assoziierte Leukämie, akut lymphozytische Leukämie, chronisch-lymphozythische Leukämie, Mastzell-Leukämie und myeloische Leukämie); maligne Histiocytose, Hodgkin-Krankheit, non- Hodgkin-Lymphom, solitärer Plasmazelltumor; Reti-culoendotheliose, Chondroblastom; Chondrom, Chondrosarkom; Fibrom; Fibrosarkom; Riesenzell-Tumore; Histiocytom; Lipom; Liposarkom; Leukosarkom; Mesotheliom; Myxom; Myxosarkom; Osteom; Osteosarkom; Ewing-Sarkom; Synoviom; Adenofribrom; Adenolymphom; Karzinosarkom, Chordom, Craniopharyngiom, Dysgerminom, Hamartom; Mesenchymom; Mesonephrom, Myosarkom, Ameloblastom, Cementom; Odontom; Teratom; Thymom, Chorio-blastom; Adenokarzinom, Adenom; Cholangiom; Cholesteatom; Cylindrom; Cystadenocarcinom, Cystadenom; Gra- nulosa-Zelltumor; Gynadroblastom; Hidradenom; Inselzelltumor; Leydig-Zelltumor; Papillom; Sertoli-Zeil- Tumor, Thekazelltumor, Leiomyom; Leiomyosarkom; Myoblastom; Myom; Myosarkom; Rhabdomyom; Rhabdomyosarkom; Ependynom; Ganglioneurom, Gliom; Medulloblastom, Meningiom; Neurilemmom; Neuroblastom; Neuroepitheliom, Neurofibrom, Neurom, Paragangliom, nicht-chromaffines Paragangliom, Angiokeratom, angiolymphoide Hyperplasie mit Eosinophilie; sclerosierendes Angiom; Angiomatose; GIo- mangiom; Hemangioendotheliom; Hemangiom; Hemangiopericytom, Hemangiosarkom; Lymphangiom, Lymphangiomyom, Lymphangiosarkom; Pinealom; Cystosarkom phyllodes; Hemangiosarkom; Lymphan- giosarkom; Myxosarkom, Ovarialkarzinom; Sarkom (zum Beispiel Ewing-Sarkom, experimentell, Kaposi- Sarkom und Mastzell-Sarkom); Neoplasmen (zum Beispiel Knochen-Neoplasmen, Brust-Neoplasmen, Neoplasmen des Verdauungssystems, colorektale Neoplasmen, Leber-Neoplasmen, Pankreas- Neoplasmen, Himanhang-Neoplasmen, Hoden-Neoplasmen, Orbita-Neoplasmen, Neoplasmen des Kopfes und Halses, des Zentralnervensystems, Neoplasmen des Hörorgans, des Beckens, des Atmungstrakts und des Urogenitaltrakts); Neurofibromatose und zervikale Plattenepitheldysplasie.
In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Krebserkränkung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert wird, ausgewählt aus der Gruppe: Tumoren des Hals-Nasen-Ohren-Bereichs umfassend
Tumoren der inneren Nase, der Nasennebenhöhlen, des Nasopharynx, der Lippen, der Mundhöhle, des
Oropharynx, des Larynx, des Hypopharynx, des Ohres, der Speicheldrüsen und Paragangliome, Tumoren der Lunge umfassend nicht-kleinzellige Bronchialkarzinome, kleinzellige Bronchialkarzinome, Tumoren des
Mediastinums, Tumoren des Gastnointestinaltraktes umfassend Tumoren des Ösophagus, des Magens, des Pankreas, der Leber, der Gallenblase und der Gallenwege, des Dünndarms, Kolon- und Rektum- karzinome und Analkarzinome, Urogenitaltumoren umfassend Tumoren der Nieren, der Harnleiter, der Blase, der Prostata, der Harnröhre, des Penis und der Hoden, gynäkologische Tumoren umfassend Tumoren des Zervix, der Vagina, der Vulva, Korpuskarzinom, maligne Trophoblastenerkrankung, Ovarialkar- zinom, Tumoren des Eileiters (Tuba Faloppii), Tumoren der Bauchhöhle, Mammakarzinome, Tumoren endokriner Organe umfassend Tumoren der Schilddrüse, der Nebenschilddrüse, der Nebennierenrinde, endokrine Pankreastumoren, Karzinoidtumoren und Karzinoidsyndrom, multiple endokrine Neoplasien, Knochen- und Weichteilsarkome, Mesotheliome, Hauttumoren, Melanome umfassend kutane und intraokulare Melanome, Tumoren des zentralen Nervensystems, Tumoren im Kindesalter umfassend Retinoblastom, Wilms Tumor, Neurofibromatose, Neuroblastom, Ewing-Sarkom Tumorfamilie, Rhabdomyosarkom, Lymphome umfassend Non-Hodgkin-Lymphome, kutane T-Zell-Lymphome, primäre Lymphome des zentralen Nervensystems, Morbus Hodgkin, Leukämien umfassend akute Leukämien, chronische myeloische und lymphatische Leukämien, Plasmazell-Neoplasmen, myelodysplastische Syndrome, paraneoplastische Syndrome, Metastasen ohne bekannten Primärtumor (CUP-Syn-drom), peritoneale Karzinomastose, Im- munsuppression-bezogene Malignität umfassend AIDS-bezogene Malignitäten wie Kaposi-Sarkom, AIDS- assoziierte Lymphome, AIDS-assoziierte Lymphome des zentralen Nervensystems, AIDS-assoziierter Morbus Hodgkin und AIDS-assoziierter anogenitale Tumoren, Trans-plantations-bezogene Malignitäten, me- tastasierte Tumoren umfassend Gehimmetastasen, Lungenmetastasen, Lebermetastasen, Knochenmetastasen, pleurale und perikardiale Metastasen und maligne Aszites. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist die Krebserkrankung oder der Tumor, die/der behandelt oder verhindert wird, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Krebserkrankungen oder Tumorerkrankungen der Mammakarzinome, der Gastrointes-t'naltumore, einschließlich Kolonkarzinome, Magenkarzinome, Pankreaskarziome, Dickdarmkrebs, Dünndamnkrebs, der Ovarialkarzinome, der Zervikalkarzinome, Lungenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinome und/oder Lebermetastasen.
Immunopathologische Reaktionen verursachen den Funktionsverlust eines bestimmten Gewebes und können Gewebe zerstören. Die erfindungsgemäße Verwendung erlaubt es aktive regulatorische Th- Zellen von Patienten mit diesen Krankheiten zu isolieren, um die gewebeschädigende Immunantwort zu zu behandeln. Bei Tumorerkrankungen soll die erfindungsgemäße Verwendung eine spezifische Elimierung von Tumorspezifischen Treg in vitro oder ex vivo ermöglichen. Falls die regulatorischen Th-Zellen in einer zu geringen Anzahl vorliegen, können sie separiert und angereichert werden und/oder in Zellkulturen vermehrt werden. In beiden Fällen könnte der Patient mit der angereicherten und/oder vermehrten und somit erhöhten Anzahl von regulatorischen Th-Zellen behandelt werden, wodurch eine Unterdrückung der immunopathologischen Antwort und somit eine Verbesserung und/oder Heilung der Krankheit erwartet würde. Autoimmunkrankhei- ten, wofür der 4-1 BB Rezeptors als Marker zur Identifikation und/oder Isolierung und folgender Anreicherung von aktiven regulatorischen Th-Zellen verwendet werden könnte und ein erfolgreiche Therapie erwartet würde, beinhalten, aber nicht nur auf diese beschränkt, Diabetes mellitus (IDDM), Multiple Sklerose (MS), Atherosklerose (AS), Psoriasis, Darmentzündungen, autoimmunbedingte haemolytische Anämie, Sjogrens- syndrom, autoimmunbedingte Thyroiditis und systemtische Lupus Erythematosis.
Dem Fachmann ist bekannt, dass regulatorische Th-Zellen im Zusammenhang mit Transplantationen fähig sind eine Immunantworten zu unterdrücken, die zu einer Transplantatabstoßung führen könnte. Die Behandlung eines Patienten und/oder Probanden mit zunächst isolierten und dann angereicherten spezifisch aktivierten regulatorischen Th-Zellen könnte eine Transplantatabstoßung vorbeugen und/oder verhindern. Transplantatabstoßungen werden durch eine Immunantwort des Transplantatakzeptors ausgelöst. Hierbei bekämpfen die Immunzellen des Akzeptors das körperfremde Gewebe. In dieser Anwendungsform würden Th-Zellen des Zielpatienten in vitro Zellen, Zellextrakten, isolierten Antigenen oder Proteinen des Organspenders vor oder nach der Transplantation ausgesetzt werden. Hiemach würden die aktiven regulatorischen Th-zellen nach einer angebrachten Vermehrungszeit anhand des 4-1BB Markers identifiziert und/oder separiert werden. Die identifizierten und/oder separierten aktiven regulatorischen Th-Zellen würden dann dem Transplantatakzeptor wieder zugeführt werden. Es wird so erreicht, dass die nach dieser Methode behandelten Zellen die Immunantwort gegen das Transplantat unterbinden und die Transplantatabstoßung verzögert oder verhindert wird. Die Verwendung des 4-1 BB Markers könnte unter anderen bei AIIo- gentransplantaten und/oder Heterotransplantaten, wie z.B. bei Herz-, Lungen-, Darm-, Kornea-, Nieren- und Knochenmarktransplantationen eingesetzt werden.
Im Falle einer Allergie, würden regulatorische Th-Zellen entweder vor der polyklonalen Aktivierung der T- Zellen oder nach der Kultivierung mit spezifischen Allergenen identifiziert und/oder separiert werden. Die identifizierten und/oder separierten Zellen würden dann nach einer eventuellen Vermehrung dem Patienten zurückgegeben. Es wird nun erwartet, dass die so behandelten regulatorischen Th-Zellen die Immunantwort unterdrücken und sich die zu den verwendeten Antigenen korrelierende Symptomatik verbessert.
Die Behandlung von Allergien anhand der Identifizierung und/oder Isolierung von aktiven regulatorische Th- Zellen mit dem Marker 4-1 BB und der beschriebenen Methode würde sich unter anderen bei Hautauschlägen, atopischer Dermatitis, Asthma, allergischer Rhinitis, Insektengiften und Lebensmittelallergie wie z.B. gegen Gluten, Milchprodukten, Nüssen und/oder Fischantigenen eignen.
Bei infektiösen Erkrankungen ist es von Bedeutung die Immunantwort zu stärken als sie zu schwächen. In bestimmten Krankheiten ist es von belang die Immunaniwort zu modulieren um den Krankheitsverlauf zu verändern. Solche Fälle der Modulation treten bei Krankheiten auf, wo durch die Infektion immunopathologi- sehe Reaktionen auftreten, die Gewebe zerstören und bei denen wo die Immunantwort den Körper nicht schützt. Durch die Identifizierung und/oder Isolierung von aktiven regulatorischen Th-Zellen könnte die Immunantwort unterdrückt werden und immunopathologische Schäden gelindert und/oder verhindert werden.
Eine weitere Alternative, wäre die Behandlung mit aus einem Patienten isolierten regulatorischen Th-Zellen, die bestimmten Antigenen ausgesetzt wurden, um regulatorische Th-Zellen zu erhalten, die die Immunantwort in eine definierte, bestimmte Richtung umschalten könnten.
Gene können in die Zellen vor Kultur oder Transplantation für eine Vielfalt von Zwecken eingeführt werden, z.B. um die Empfänglichkeit einer Infektion zu verhindern oder zu reduzieren, Gene zu ersetzen, die einen Vertust einer Funktionsmutation unterliegen, die Fähigkeit der Treg zu steigern, um Th-Zellen zu hemmen usw. Des Werteren können Vektoren eingeführt werden die, antisense mRNA oder Ribozyme eprimieren, wodurch die Expression eines unerwünschten Gens blockiert wird. Andere Methoden einer Gentherapie sind die Einführung von Medikamentenwiderstandsgenen, zum Beispiel das Medikamentenwiderstandsgen (MDR) oder Antiapoptosis Genen, wie bei -2. Weiterhin können Techniken angewendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, um Zielzellen zu transfizieren, z.B. durch Elektroporation, Kalzium gefällte DNA, Verschmelzung, Transfektion oder Lipofektion. Die besondere Art, in der die DNA eingeführt wird, ist für die Verwendung der Erfindung nicht entscheidend.
Dem Fachmann sind viele Vektoren bekannt, die verwendet werden können, um exogene Gene in Säuge- tierzellen zu übertragen. Die Vektoren können episomal sein, z.B. Plasmide, Virus Vektoren wie z.B. Zyto- megalovirus, Adenovirus usw. Außerdem können die Gebe durch homologe Rekombination oder durch zufällige Integration ins Zielzellgenom integriert werden, wie z.B. von Retrovieren abgeleitete Vektoren wie MMLV, HIV -1 , ALV, usw.
Anhand von in vitro Assays oder Screenings können aktive Faktoren der Treg-Zellen analysiert werden. Es können auch Co-culture Assays durchgeführt werden, um die Veränderungen von Tregs zu studieren, die die Vermehrung von normalen T Zellen einschließlich CD4 T als auch CD8 T zu suprimieren. Interaktionen mit dendritischen Zellen und anderen Antigen determinierten Zellen können ebenfalls untersucht werden. Die nach der Erfindung separierten regulatorischen Zellen können das Ausgangsmaterial einer großen Viel- falt von unterschiedlichen Analysen sein, z.B. von immunoassays für Proteinbindungsstudien, Bestimmungen des Zellwachstums, Differenzierung und funktionelle Aktivität, Produktion von Hormonen usw.
Die Figuren stellen folgendes dar:
Figuren 1a und 1b 4-1BB wird wird früh nach Aktivierung spezifisch von negulatorischen T-Zellen ausgeprägt
Verschiedene Subpopulationen (MV) peripherer Th-Zellen (A) wurden mittels FACS isoliert aus PBMC (B) und an Aliquots intrazelluläre Analysen des für regulatorische T-Zellen spezifischen Transkriptionsfaktors Foxp3 durchgeführt (C). Die isolierten Subpopulationen wurden dann mit PMA / lonomyα'n in vitro für unterschiedlich lange Zeitspannen (0, 4 und 8 Stunden) stimuliert und die EΞxpression von 4-1BB mittels FACS analysiert (D).
Figur 2
Der für regulatorische T-Zellen spezifische Transkriptionsfaktor Foxp3 wird nach Aktivierung spezifisch in 4- 1BB+ Th-Zellen ausgeprägt (RNA-Analyse)
PBMC wurden für 4h mit dem Superantigen SEB in vitro stimuliert und nachfolgend mit FACS 4-1BB+ und 4-1 BB" Th-Zellen isoliert. Aus den isolierten Zellen wurde RNA isoliert und mittels RT-PCR die Expression von Foxp3 analysiert.
Figur 3
Der für regulatorische T-Zellen spezifische Transkriptionsfaktor Foxp3 wird nach Aktivierung spezifisch in 4- 1BB+ Th-Zellen ausgeprägt (Protein-Analyse)
CD4+ Th-Zellen wurden aus PBMC isoliert und für 4h mit dem PMA / lonomycin in vitro stimuliert. Nachfol- gend wurden mit FACS 4-1BB+ und 4-1BB" Th-Zellen isoliert. Die isolierten Zellen wurden dann intrazellulär mit Foxp3-spezifischen Antikörpern markiert.
Figur 4
Koexpression von 4-1BB und Foxp3 früh nach Aktivierung
CD4+ Th-Zellen wurden aus PBMC isoliert und für 4h mit dem PMA / lonomycin in vitro stimuliert. Nachfolgend wurden die Zellen extrazellulär mit Antikörpern gegen CD69 (Aktivierungsmarker) und 4-1BB markiert. Nachfolgend wurde intrazellulär mit Foxp3-spezifischen Antikörpern markiert. Im linken Analyseplot ist das elektronische Analysefenster für CD69+ aktivierte Th-Zellen angezeigt. Im rechten Analyseplot ist die Koexpression von 4-1BB und Foxp3 in CD69+ aktvierten Th-Zellen dargestellt.
Figuren 5 bis 7: Spezifität und in vitro Suppression TSST-1 -spezifischer 0025^ Treg nach Isolierung über TSST-1- induzierte 4-1BB EΞxpression
Figur 5:
Ruhende regulatorische CD25*4 CD4+ T-Zellen wurden mittels FACS aus PBMC eines gesunden Spenders isoliert und mit autologen CD4' CD25" PBMC in einem Verhältnis von 1 :2 mit 1 μg/ml TSST-1 für 4h bei 37°C kultiviert. Nachfolgend wurden mittels FACS 4-1BB+ und 4-1BB" CD4+ CD69+ T-Zellen isoliert.
Figur 6:
4-1BB+ und 4-1BB" CD4+ CD69+ T-Zellen wurden nach FACS-Sortierung direkt mit Antikörpern gegen Foxp3, Vbeta2 und Vbeta17 markiert und analysiert.
Figur 7:
4-1BB+ CD4+ CD69+ T-Zellen wurden nach FACS-Sortierung für 6 Tage in Medium und 10%FCS kultiviert. Nachfolgend wurden sie mit CFSE-markierten naiven CD45RA+ CD4+ T-Zelien und CD4" PBMC im Verhältnis 1 :1:1 für 4 Tage in der Gegenwart von TSST1 0,5μg/ml kultiviert. Zur Kontrolle wurden CFSE- markierte naive CD45RA+ CHH+ T-Zellen und CD4" PBMC im Verhältnis 2:1 für 4 Tage in der Gegenwart von TSST1 0,5μg/ml kultiviert.
Die ergänzten Daten demonstrieren zum einen die Spezifität der durch eine Stimulation mit Antigen (hier TSST-1) induzierten 4-1BB Expression. In dem hier gewählten Zeitfenster von 4 Stunden, wird 4-1BB fast ausschließlich von Vbeta2+ Foxp3+ Zellen ausgeprägt, während ein weiterer in Literatur beschriebener T- Zell-Aktivierungsmarker (CD69) auch von Foxp3" Zellen ausgeprägt wird (Fig. 6). Zudem sind unter den isolierten 4-1BB+ Zellen fast keine Vbeta17+ Zellen detektierbar (Fig. 6). Figur 7 demonstriert dann das Sup- pressionspotential von TSST-1 -spezifischen Treg nach Isolierung und in vitro Kultivierung. Die Proliferation von TSST-1 -spezifischen naiven T-Zellen wird von TSST-1 -spezifischen Tregs von über 55% auf weniger als 10% unterdrückt (Fig. 7).

Claims

Patentansprüche
Verwendung von einem 4-1 BB Rezeptor zur Identifizierung und/oder Separation aktivierter regulatoπ- scher Th-Zellen (Treg)
Verwendung nach Anspruch 1 gekennzeichnet dadurch, dass die regulatoπschen Th-Zellen aus einem Zellgemisch identifiziert und/oder sepanert werden
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der 4-1 BB Rezeptor spezifisch zeitlich ausgeprägt ist
Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitlicheAuspragung des Rezeptors als ein diskπminativer Marker durch mehrfache, bevorzugt regelmäßige Kontrollen, insbesondere in im wesentlichen 10 bis 40-mιnutιgen Abstanden, besonders bevorzugt in im wesentlichen 30-mιnutιgen Abstanden bestimmbar ist
Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor ein spezifischer Marker für aktivierte regulatoπsche Th-Zellen in einem Zeitraum von im wesentlichen 0 bis 18 Stunden nach einer Aktivierung ist, bevorzugt in einem Zeitraum von im we- senöichen 0 bis 12 Stunden, besonders bevorzugt in einem Zeitraum von im wesentlichen 0 bis 10
Stunden, ganz besonders bevorzugt in einem Zeitraum von im wesentlichen 1 bis 8 Stunden, insbesondere im wesentlichen 3 bis 8 Stunden, vor allem im wesentlichen 4 Stunden
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass
CD4+, CD25+ und/oder FoxP3+ regulatoπsche Th-Zellen identifiziert und/oder sepanert werden
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche dadurch gekennzeichnet, dass lebende regulatoπsche Th-Zellen identifiziert und/oder sepanert werden
8. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
Antigen-spezifische regulatorische Th-Zellen identifiziert und/oder separiert werden.
9. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorischen Th-Zellen durch Durchflußzytometrie oder magnetische Zellsortierung identifiziert und/oder separiert werden.
10. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Expression des 4-1 BB Rezeptors nach und/oder während einer Stimulation gemessen wird.
11. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorischen Th-Zellen nach und/oder während einer Stimulation der Zellen im Zellgemisch identifiziert und/oder separiert werden.
12. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüchen dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen durch Wachstumsfaktoren, Antikörpern und/oder Liganden stimuliert werden.
13. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass
Antigene, Liganden und/oder Antikörper zur Detektion des 4-1 BB Rezeptors verwendet werden.
14. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die Antigene, Liganden und/oder Antikörper zur Detektion des 4-1 BB Rezeptors mit einem fluoreszierenden Stoff, Haptenen und/oder magnetischen Partikeln gekoppelt sind.
15. Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatoπschen Th-Zellen aus Blut, peπpheren mononuklearen Blutzellen (PBMC), Korpergewebe oder Zellen der Gewebeflussigkert identifiziert und/oder sepaπert werden
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der 4-1BB Rezeptor Antikörper mit einem fluoreszierenden Stoff, Haptenen und/oder mit magnetischen Mikropartikeln gekoppelt ist
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass aktivierte regulatoπsche Th-Zellen identifiziert und/oder sepaπert werden
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass lebende regulatoπsche Th-Zellen identifiziert und/oder sepaπert werden
Separations-Kit umfassend einen Antikörper zur Detektion des 4-1BB Rezeptors zur Identifikation und/oder Separation einer regulatoπschen Th-ZeIIe
Verwendung eines Antikörpers zur Detektion des 4-1 BB Rezeptors zur Bereitstellung eines Identifika- tions- und/oder Separations-Kits für die Identifikation und/oder Separation einer aktivierten regulaton- schen Th-ZeIIe
Verwendung eines Kits umfassend einen Antikörper zur Detektion des 4-1 BB Rezeptors zu Identifika- tion und/oder Separation einer aktivierten regulatoπschen Th-ZeIIe
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