WO2007086583A1 - エノイル－アシルキャリアプロテインレダクターゼ（ＦａｂＫ）の結晶 - Google Patents

エノイル－アシルキャリアプロテインレダクターゼ（ＦａｂＫ）の結晶 Download PDF

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Jun Saito
Mototsugu Yamada
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Meiji Seika Kaisha Ltd
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Meiji Seika Kaisha Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a crystal of enoyl carrier protein (FabK) that can be used for X-ray crystal structure analysis and inhibitor design.
  • FabK enoyl carrier protein
  • Fatty acid biosynthesis in bacteria is performed by a series of enzymes called type II fatty acid synthase (FAS) systems.
  • type II fatty acid synthase FOS
  • fatty acid biosynthesis is catalyzed by a single multifunctional enzyme called type I FAS system, which is very different from bacterial fatty acid biosynthesis system. This suggests that compounds that inhibit type II FAS enzymes may be selective and novel antibacterial agents (Prog. Lipid Res. (2001), 40,467-497).
  • a fatty acid biosynthetic system of bacteria four enzyme reactions proceed sequentially to form a cycle, and a long-chain saturated fatty acid is biosynthesized through multiple cycles.
  • the first step in the cycle is a condensation reaction with
  • j8-keto-acyl-ACP synthase III (FabH) condenses malo-roux ACP with acetyl-CoA.
  • j8-ketosyl-ACP synthase I or II condenses malol-ACP with isyl-ACP.
  • 8-ketosyl-ACP reductase occurs.
  • dehydration with j8-hydroxyacyl-ACP dehydrase yields trans-1-enoyl-ACP.
  • Fabl, FabK, or FabL enol-I ACP reductase
  • Enolulu ACP reductase is the rate-limiting enzyme in the bacterial fatty acid synthesis pathway and is an important regulatory point of fatty acid biosynthesis in bacteria.
  • Enolulu ACP reductase Fabl present in Escherichia coli and Staphylococcus aureus is an essential enzyme for growth. (J. Biol. Chem. (1995), 270, 26538-26542). Since antibacterial activity is thought to be expressed by inhibiting enoyl ACP reductase, Fabl is an important protein as a target for antibacterial agents.
  • Fabl is a target for the broad-spectrum antibiotic triclosan.
  • Complex crystal structures of NAD and triclosan and E. coli-derived Fabl have also been studied, and it has been shown that triclosan acts as a highly specific inhibitor of Fabl by mimicking its natural substrate.
  • Conformational data for the Fabl-NAD and triclosan complex provide important information in the design of specific inhibitors. Inhibitors designed based on this information have been found to be useful in the treatment of bacterial infections (Nature (1998) 394,531-532, J. Biol. Chem. (1998), 273, 30316). -30320, Nature (1999) 398,383-384, and J. Med. Chem. (2003), 46, 1627-1635).
  • FabK is essential for growth in Streptococcus pneumoniae and has been clarified to be a flavin protein having FMN as a coenzyme at a molar concentration ratio of 1: 1 (Bioche m. J. (2003). ), 370, 1055-1062) o
  • compounds and Fa that strongly inhibit FabK have been reported so far. There is no report about the three-dimensional structure of bK.
  • the three-dimensional structure information of FabK is useful. If an inhibitor specific to FabK can be designed by clarifying the crystal structure of FabK, it would be very useful for the creation of a specific drug against Streptococcus pneumoniae, including penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae (PRSP), which is a typical drug-resistant bacterium. Useful for. In addition, if inhibitors specific to both Fabl and Fa bK can be designed, it will be very useful for the creation of a broader range of antibacterial agents, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa. . Therefore, the creation of high-quality FabK crystals that enable the design of efficient inhibitors by determining the three-dimensional structure of FabK by X-ray crystal structure analysis is desired.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • an object of the present invention is to provide FabK crystals.
  • the FabK crystal according to the present invention specifically has a space group of P2, P2 2 2, 122.
  • FabK crystals according to the present invention have a resolution of 2.2 A by the multi-wavelength anomalous dispersion method (MAD method). This is a high-quality crystal capable of obtaining X-ray diffraction intensity data of FabK and enables analysis of the three-dimensional structure of FabK. Therefore, by utilizing the FabK crystal of the present invention, three-dimensional structure information useful for efficient design of a compound that inhibits FabK can be obtained. The provision of the crystals according to the present invention is extremely significant in drug discovery.
  • FIG. 1 shows a photomicrograph of Se—His-FabK crystal of the present invention.
  • FIG. 2 shows a ribbon diagram of the structure in the determined asymmetric unit of FabK.
  • FIG. 3 shows an electron density map and a model of the point mutation (A141S).
  • the crystal of FabK according to the present invention is defined by any one of the above (a) to (e).
  • FabK is derived from Streptococcus or Streptococcus pneumoniae.
  • any one of SEQ ID NOs: 1 to 4 in the sequence listing is used.
  • a protein having one amino acid sequence is preferred.
  • it is preferable that at least one methionine residue in the protein constituting the crystal is substituted with selenomethionine.
  • preferred specific examples of FabK crystals according to the present invention are as follows:
  • FabK has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • FabK preferably has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • FabK has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • FabK has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • FabK more preferably has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • FabK has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • FabK has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the X-ray generator for acquiring diffraction intensity data by irradiating X-rays is not particularly limited. V, preferably a large synchrotron radiation facility SPring-8, etc. Use three generations of synchrotron radiation facilities.
  • V preferably a large synchrotron radiation facility SPring-8, etc.
  • SPring-8 a large synchrotron radiation facility
  • By processing the obtained X-ray diffraction intensity data it is possible to identify crystallographic parameters.
  • the crystal is immersed in an antifreezing solution containing a polyhydric alcohol and then frozen. Collect X-ray diffraction data in the frozen state and obtain an X-ray diffraction image.
  • the polyhydric alcohol include sucrose, trehalose, and glycerol. In particular, glycerol is preferred.
  • the concentration of the polyhydric alcohol in the antifreeze solution is preferably 10% to 20%.
  • molecular substitution method For phase determination, molecular substitution method, heavy atom isomorphous substitution method, or multiwavelength anomalous dispersion method (MA D method) is used.
  • heavy atom isomorphous substitution method or MAD method is used. That is, the three-dimensional structure is obtained by calculating the difference in diffraction intensity between the diffraction data of the native crystal and the heavy atom derivative crystal, or the initial phase for calculating the electron density of the diffraction data measured at different wavelengths. Can be determined.
  • the large synchrotron radiation facility SPring-8 capable of changing the wavelength could be used.
  • the method for obtaining FabK crystals according to the present invention includes vapor diffusion methods (eg, nosing drop method, sitting drop method, sandwich drop method, etc.), Balta batch method, microbatch method, microdialysis method, Alternatively, any method such as a free interface diffusion method may be used, preferably a vapor diffusion method, and more preferably a hanging drop method.
  • FabK crystals tend to be clustered. Therefore, it is preferable to obtain a good single crystal by a seeding method.
  • the protein used for crystallization is His-FabK having the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 1 to 4 and FabK. FabK with U is most preferred.
  • the concentration of the purified protein used for crystallization is preferably about 10 mgZmL.
  • the protein solution is then crystallized by adding an appropriate amount of a precipitant, salt, buffer solution, or additive.
  • Preferred precipitants used for crystallization of FabK of the present invention include water-soluble polymers such as polyethylene glycol, isopropanol, and organic solvents such as 2-methyl-2,4-pentanediol (MPD). Is mentioned.
  • a more preferred precipitating agent is polyethylene glycol.
  • an ammonium salt as a component of the precipitant. Ammonium salts include ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium acetate, and preferably ammonium chloride and ammonium acetate. One or more of these may be used.
  • a force MES pH 5.5-7.0
  • the combination of precipitants is
  • the condition (1) is not included in a commercially available crystallization condition screening kit.
  • the composition of the precipitating agent is a unique condition in which polyethylene glycol and MPD are combined, and salt / ammonium, salt / calcium, or dithiothreitol is used alone or in combination. It should be noted that it is important to suppress clustering by the microseeding method for crystals obtained under the condition (1) in order to use them for X-ray crystal structure analysis at high resolution. .
  • a DNA fragment that encodes FabK is in the form of a DNA molecule, particularly a DNA expression vector, that can be replicated in a host cell and can be expressed. Thereafter, host cells are transformed with the DNA molecule, particularly the DNA expression vector. Then, FabK is obtained by culturing the transformant.
  • the DNA molecule can be obtained by incorporating a DNA fragment encoding FabK into a vector molecule.
  • this vector is a plasmid.
  • the vector used in the present invention can be appropriately selected from forces such as a virus, a plasmid, or a cosmid vector. Host If the cells are Escherichia coli, a pUC or pBR plasmid, a Bacillus subtilis pUB plasmid, and a yeast YEp, YRp, or YCp plasmid vector may be mentioned.
  • Any host cell can be used as long as a host vector system is established, and Escherichia coli is preferable.
  • a transformant obtained by transformation of a host cell can be cultured under appropriate conditions, and a cell extract of the obtained transformant can be recovered according to a conventional method.
  • it is possible by conventional techniques to express a polypeptide attached to FabK for example, a dartathione S transferase (GST) or a polypeptide rich in histidine residues (His-tag) as a fusion protein. .
  • His-FabK expressed in E. coli by fusing His-tag can be easily purified by conventional techniques using a metal column coordinated with metal ions.
  • the metal ions are preferably nickel ions.
  • the purified His— FabK was permeated with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM ammonium chloride, 5 mM dithiothreitol, ImM fluorinated methylsulfuryl chloride, and ImM benzamidine solution, and then an anion exchange column. It is possible to purify using a combination of general chromatographic techniques using hydrophobic interaction columns and gel filtration columns.
  • His-FabK having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3 can be fractionated.
  • FabK expressed in E. coli without fusion of His-tag is purified by a combination of common chromatographic techniques using anion exchange columns, hydrophobic interaction columns, and gel filtration columns. It is possible.
  • FabK having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 can be fractionated.
  • Streptococcus pneumoniae strain R6 (ATCC49619) was cultured on blood agar basal medium (Betaton's Dickinson) at a carbon dioxide concentration of 5% at 37 ° C for 18 hours and collected by low-speed centrifugation. .
  • Genomic DNA was prepared from the obtained cells using DNeasy Tissue Kit (manufactured by QIAGEN) according to the method described in the attached instructions.
  • the following primers were designed to isolate DNA encoding FabK.
  • FabK— FP 5, 1 GGAATTCCATATGAAAACGCGTATTACAGAA-3
  • This fragment was subcloned using the vector pET-21b (+) (Novagen) previously cleaved with Ndel and Xhol using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takarabio) according to the method described in the attached manual. .
  • the obtained recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli COMPETENT high DH5 ⁇ (manufactured by TOYOBO) according to the method described in the attached instructions to obtain a transformant. Transformants were cultured on LB agar plates containing 50 gZmL of ampicillin at 37 ° C to obtain ampicillin resistant colonies.
  • Recombinant plasmids (His- FabKZpET-21b (+) and FabK / pET-21b (+)) are prepared from the obtained colonies, their DNA sequences are confirmed, and they are registered in SWISSPROT Accession No. Q8DR17 described in SEQ ID Nos. 1 and 2. Streptococcus pneumonia It was confirmed to encode FabK derived from fungus R6 strain.
  • the recombinant plasmids His-FabKZpET-21b (+) and FabKZpET-2 lb (+) obtained in Example 1 (2) were transformed into E. coli BL21 (DE3) (Novagen). The obtained transformant was added to SB medium (1.2% (w / v) Bacto Tryptone, 2.4% (w / v) Yeast Extract, 0.5% (vZv) glyceronole containing 100 g / mL ampicillin. , 0.072 M dipotassium hydrogen phosphate, and 0.028 M potassium dihydrogen phosphate)) The cells were grown in 5 L until the OD (absorbance) at 600 nm reached 0.6—1.0.
  • IPTG isopropyl ⁇ D thiogalatatopyranoside
  • the cell disruption buffer A 50 mM sodium phosphate buffer ( ⁇ 8.0), 300 mM sodium chloride, 5 mM imidazole, ImM fluoride
  • Cellulose disruption buffer B 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7) in the case of recombinant Escherichia coli containing ferrmethylsulfol, ImM benzamidine, ImM ⁇ -mercaptoethanol, and 0.1 mgZmL lysozyme) 5), 50 mM ammonium chloride, ImM fluoromethylsulfurol, ImM benzamidine, ImM dithiothreitol, and 0.1 mgZmL lysozyme) and suspended on ice for 30 minutes. Next, sonication for 1 minute was performed 5-7 times to disrupt the cells. The sonication residue was removed by centrifugation (30 minutes, 15000 rpm
  • the following purification operations were all performed at 4 ° C.
  • the cell extract obtained by recombination of His—FabKZpET-21b (+) from Escherichia coli by the method of Example 2 was purified by affinity chromatography.
  • affinity chromatography column Ni-NTA (manufactured by QIAGEN) was used as a carrier, and a column with a column volume of 30 mL was prepared by the method described in the instruction manual.
  • Equilibration buffer 50 mM sodium phosphate buffer (pH 8.0), 300 mM sodium chloride , 5 mM imidazole, ImM fluoromethylsulfurol, ImM benzamidine, and ImM
  • the His-FabK solution obtained in (1) above was dialyzed with a dialysis buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM ammonium chloride, ImM fluorinated methyl chloride, ImM benzamidine, and ImM). After dialysis against dithiothreitol for 2 hours, purification was performed using POROS HQ / 20 (PerSeptive Biosystems), an anion exchange column.
  • a dialysis buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 50 mM ammonium chloride, ImM fluorinated methyl chloride, ImM benzamidine, and ImM.
  • the His-FabK solution obtained in (2) above was mixed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 3.5 M ammonium sulfate, ImM fluorinated methyl chloride, ImM benzamidine, and ImM dithiothre. After mixing with the itol solution, the final concentration of ammonium sulfate was adjusted to 2M.
  • the His-FabK solution obtained in (3) above was concentrated to 1 mL using Amicon Ultra-4-30 kDa NMWL (Millipore), which is an ultrafiltration membrane with a retention molecular weight of 30000 or more, and gel filtration buffer (50 mM Tris).
  • Gel loading column equilibrated with hydrochloric acid buffer (pH 7.5), 150 mM ammonium chloride, ImM phenylmethylsulfonyl fluoride, ImM benzamidine, and ImM dithiothreitol) Hiloadl6 / 60 Superdex75 pre p grade (Amersham) Applied to Bioscience) with a flow rate of lmLZmin.
  • the main fractions were collected by SD S PAGE and concentrated using the ultrafiltration membrane described above. Then, for the solution exchange, after diluting with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), lOO mM salt-an-mom, ImM dithiothreitol solution, and concentrating again three times, 10 mg / Concentrate to mL, and add nicotinamide adendinucleotide disodium (reduced form) to a final concentration of 5 mM to prepare a crystallized sample. Samples were frozen in liquid nitrogen and stored at 80 ° C.
  • the following purification operations were all performed at 4 ° C.
  • the cell extract obtained by the method of Example 2 from FabKZpET-21b (+) recombinant Escherichia coli was purified by anion exchange column chromatography.
  • anion exchange column Q-Sepharose High Performance (Amersham Bioscience) was used as a carrier, and a column with a column capacity of 114 mL was prepared by the method described in the instruction manual.
  • Equilibration buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7 5)
  • FabK solution was applied to a column equilibrated with 50 mM ammonium chloride, ImM fluoride methylsulfol, ImM benzamidine, and ImM dithiothreitol at a flow rate of 5 mL Zmin.
  • 50 mM Tris-HCl buffer pH 7.5
  • 50 mM ammonium chloride, ImM fluorinated methyl chloride, ImM benzamidine, ImM dithiothreitol was eluted with a linear gradient (5 column volumes) of 0–1 M sodium chloride.
  • the eluted fractions were confirmed by SDS-PAGE, the main fractions of FabK were collected, and the subsequent purification was performed.
  • the FabK solution obtained in (1) above was mixed with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 3.5 M ammonium sulfate, ImM fluorinated methyl chloride, ImM benzamidine, and 1 mM dithiothrease. After mixing with tall solution, the final concentration of ammonium sulfate was 2M.
  • the FabK solution obtained in (2) above was concentrated to 1 mL using Ami con Ultra-4-30 kDa NMWL (Millipore), which is an ultrafiltration membrane with a retention molecular weight of 30000 or more, and a gel filtration buffer (50 mM Tris-HCl).
  • Gel filtration column Hiload 16/60 Superdex75 prep gr ade equilibrated with buffer solution (pH 7.5), 150 mM ammonium chloride, ImM fluorinated methyl chloride, ImM benzamidine, and ImM dithiothreitol (Amersham Bioscience) was applied at a flow rate of lmLZmin. The main fractions were collected by SDS-P AGE and purified thereafter.
  • the FabK solution obtained in (3) above was mixed with a dialysis buffer (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 50 mM ammonium chloride, ImM fluorinated methyl chloride, ImM benzamidine, and ImM dithiothrease). The mixture was dialyzed for 2 hours and then purified with MonoQ HR10 / 10 (manufactured by Amersham Bioscience).
  • a dialysis buffer 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 50 mM ammonium chloride, ImM fluorinated methyl chloride, ImM benzamidine, and ImM dithiothrease.
  • equilibration buffer containing 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 50 mM ammonium chloride, ImM fluorinated methyl chloride, ImM benzamidine, and 1 mM dithiothreitol
  • FabK solution was applied at a flow rate of 3 mL / min.
  • 50 mM Tris-HCl buffer ⁇ 7.5
  • 50 mM ammonium chloride, ImM fluorinated methyl chloride, lm M benzamidine, and ImM dithiothreitol solution Elute with a linear gradient of 20-1M potassium chloride (20 column volumes).
  • the eluted fractions were confirmed by SDS-PAGE, and the main fractions of Fab K were collected and concentrated using the ultrafiltration membrane described above. Then, dilute with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), lOOmM ammonium chloride, ImM dithiothreitol solution, and concentrate again three times for concentration, then concentrate to lOmg / mL. Then,
  • Example 5 Expression of selenomethionine-installed FabK (Se-His-FabK and Se-FabK)
  • His-FabK (Se-His- FabK) and FabK (Se—FabK) were prepared. 36—13 ⁇ 45—? & 1) 1 ⁇ 36-? & 1) 1 ⁇ was transformed into each recombinant plasmid described in (2) of Example 1 into Escherichia coli B834 (DE3) (Novagen), which is a methionine-requiring strain, and LB containing 100 g / mL ampicillin.
  • An apicillin-resistant colony was obtained by culturing at 37 ° C on an agar plate.
  • the obtained transformant was cultured in 37 ⁇ C LB medium lOOmL containing 100 g / mL ampicillin at 37 ° C, collected in a centrifuge, and then lOOmL LeMaster containing 100 ⁇ g ZmL ampicillin.
  • medium composition is shown in Table 1 Suspend and collect again by centrifuge 100
  • Se-Met core medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) 23.6g
  • Point mutation by substituting serine for the 141st amino acid residue alanine using the recombinant plasmids His— FabK / pET-21b (+) and FabKZpET-21b (+) prepared in Example 1, (2) Recombinant plasmids encoding the body (A141S His— FabK and A141S FabK) were prepared. Point mutations were introduced using the Stratagene QuickChange Site—Directed Mutagenesis Kit. First, a primer with 10 to 15 bases added at the center of the target mutation and the following primers complementary to it were prepared.
  • FabK-Mutant— FP 5, GGGATAATCGTTATTCCTGTCGTTCCTA GTG-3 (SEQ ID NO: 8)
  • Crystals used for X-ray crystal structure analysis by the MAD method were prepared using Se-His-FabK purified in Example 5. 10 mg / mL Se-His-FabK solution 2. O / z L and crystallizing agent (10% polyethylene glycol 1000, 10% MPD, 0.1 M ammonium chloride, 0.2 M calcium chloride, 5 mM dithio 2.0 L of thritol and 0.1 M MES (pH 6.5) were mixed on a cover glass to obtain a crystallization drop.
  • cluster crystals were obtained in a few days. Crystals that can be analyzed for X-ray crystal structure could be produced by recrystallization from the obtained cluster crystals by microseeding. Of the obtained Se-His-FabK crystals. A photomicrograph is shown in Fig. 1.
  • Example 8 Se-His-FabK X-ray diffraction intensity data convergence and determination of crystal structure
  • the Se-His-FabK crystals obtained under the crystallization condition (1) of Example 7 were mixed with a stable mother liquor containing 12.5% glycerol (12.5% polyethylene glycol 1000, 12.5% MPD, 0.1M ammonium chloride. -Um, containing 0.2M calcium chloride, 5mM dithiothreitol, and 0.1M MES (pH 6.5) and rapidly frozen in a nitrogen gas stream at 170 ° C.
  • the large synchrotron radiation facility SPring-8 at the Research Center for High-intensity Optical Science The drug discovery industry at Beamring BL32B2 was used to measure X-ray diffraction data using a CCD camera as a detector.
  • the wavelengths are 0.997932, 0.997888, and 0.90000A, that is, the edge of the absorption edge, the peak, and the remote three forces MAD data was collected at the site.
  • the vibration angle was 1 ° Z frame.
  • Each data was processed at a resolution of 2.OA using a diffraction intensity data processing program CrystalClear (manufactured by Rigaku Corporation), the diffraction intensity was quantified, and the crystal structure factor was obtained.
  • the space group is P2
  • the R factor which is an indicator of the accuracy of the determined crystal structure, was 0.220.
  • the R factor calculated from the structural factor corresponding to 5% of the total reflection that was used in the calculation at the refinement stage was 0.282.
  • the determined asymmetric unit of FabK was 0.220.
  • the A141S His- FabK crystal obtained under the crystallization condition (1) in Example 7 was treated with 15% glyce mouth.
  • Stable aqueous mother liquor containing 12.5% polyethylene glycol 1000, 12.5% MPD, 0.1M ammonium chloride, 0.2M calcium chloride, 5mM dithiothreitol, and 0.1M MES ( pH 6.0 (containing) and rapidly frozen in a nitrogen gas stream at 170 ° C.
  • the X-ray diffraction data was measured by the vibration method using the BL32B2 drug discovery industry beam line at the SPring-8 large synchrotron radiation facility at the Research Institute for High-Intensity Optical Science.
  • the X-ray wavelength was ⁇ and the vibration angle was 1 ° Z frame.
  • the A141S His-FabK crystal was processed at a resolution of 1.8 A, the diffraction intensity was quantified, and the crystal structure factor was obtained.
  • the phase was determined by the molecular replacement method using CCP4) and the structure was refined using the program Refmac5 (CCP4).
  • the R factor was 0.244.
  • the R factor for which the structure factor force equivalent to 5% of the total reflection that was included in the calculation at the refinement stage is calculated is 0.28.
  • Fig. 3 shows the electron density map and model of the point mutation.

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Abstract

　高品質で再現性良く得られるエノイル―アシルキャリアプロテインレダクターゼ(ＦａｂＫ)の結晶、特に肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）由来ＦａｂＫの結晶が開示されている。本発明によりＦａｂＫの特異的阻害剤の効率的な設計等が可能となり、新規作用機序の新薬創出に活用できる。

Description

明 細 書
エノィル一ァシルキャリアプロテインレダクターゼ（FabK)の結晶 発明の背景
[0001] 発明の分野
本発明は X線結晶構造解析および阻害剤の設計等に利用可能なエノィルーァシ ルキャリアプロテイン (FabK)の結晶に関する。
[0002] 背景枝術
細菌における脂肪酸の生合成はタイプ IIの脂肪酸シンターゼ (FAS)系と呼ばれる 一連の酵素群により行われる。一方、哺乳動物などの真核生物においては、脂肪酸 の生合成はタイプ Iの FAS系と呼ばれる単一の多機能酵素により触媒されており、細 菌の脂肪酸生合成系とは大きく異なる。そのため、タイプ IIの FAS系酵素を阻害する 化合物は、選択的かつ新規な抗菌剤としての可能性が示唆される（Prog. Lipid Res. (2001),40,467-497) o
[0003] 細菌の脂肪酸生合成系では四つの酵素反応が順次進行してサイクルを形成し、複 数回のサイクルを経て、長鎖の飽和脂肪酸が生合成される。サイクルの第 1工程は |8 ーケトァシルー ACPシンターゼによる縮合反応であり、はじめのサイクルでは j8—ケ トァシルー ACPシンターゼ III (FabH)がマロ-ルー ACPとァセチルー CoAとを縮合 する。二回目以降のサイクルでは j8—ケトァシル— ACPシンターゼ Iまたは II (FabB または FabF)がマロ-ル— ACPとァシル— ACPとを縮合する。第 2工程では NADP H—依存性 |8—ケトァシル— ACPレダクターゼ (FabG)による還元反応が起こる。第 3工程では j8—ヒドロキシァシルー ACPデヒドラーゼ（FabAまたは FabZ)により脱水 され、トランス一 2—エノィル一 ACPが得られる。第 4工程では、エノィル一 ACPレダ クターゼ（Fabl、 FabK,または FabL)により還元されてァシル—ACPを生ずる。一 サイクル当たり二個の炭素原子が付加され、最終的にパルミトイル— ACP (16C)が 得られる力 このサイクルは主にパルミトイルー ACPによるエノィルー ACPレダクタ一 ゼのフィードバック阻害を介して停止する（Escherichia coli and Salmonella： Cellular a nd Molecular Biology(1996), 612-636, American Society for Microbiology, Washingto n D.C.および J. Biol. Chem.(1996),271, 1833- 1836)。すなわち、エノィルー ACPレダ クターゼが細菌の脂肪酸合成経路の律速酵素であり、細菌における脂肪酸生合成 の重要な調節ポイントである。
[0004] また、大腸菌（Escherichia coli)や黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus)などに 存在するエノィルー ACPレダクターゼである Fablが生育に必須な酵素であることは、 大腸菌の Fabl温度感受性変異株の解析から明らかにされた (J. Biol. Chem. (1995), 270,26538-26542)。抗菌作用はエノィルー ACPレダクターゼを阻害することにより発 現されると考えられるから、 Fablは抗菌剤の標的として重要なタンパク質であるといえ る。
[0005] また、 Fablが広域スペクトル抗生物質トリクロサンの標的であることも明らかにされて いる。 NADおよびトリクロサンと、大腸菌由来 Fablとの複合体結晶構造についても研 究されており、その天然基質を模倣することによってトリクロサンが特異性の高い Fabl の阻害剤として作用することが示されている。 Fablと NADおよびトリクロサンの複合 体に関する立体構造データは特異的な阻害剤設計において重要な情報を提供する 。この情報に基づいて設計した阻害剤が、細菌感染症の治療に有用である可能性が 見出されている (Nature(1998)394,531- 532、 J. Biol. Chem.(1998),273,30316- 30320、 Nature(1999)398,383- 384、および J. Med. Chem.(2003),46, 1627- 1635)。
[0006] また、ゲノム解析研究により大腸菌や黄色ブドウ球菌などのほとんどの細菌は、エノ ィルー ACPレダクターゼとして Fablを有していることが知られている。し力し、いくつ かの菌種では Fablの代わりに FabKが存在していることが明らかになつている。とりわ け、臨床上重要な病原菌である肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae)は、エノ ィルー ACPレダクターゼとして FabKのみを有しており、緑膿菌（Pseudomonas aerugi nosa)および腸球菌（Enterococcus faecalis)では Fablと FabKの両方を有して 、るこ とが明らかにされている（Nature(2000),406,145-146)。そのため、より広範な抗菌活 性を有する抗菌剤を創出するには、 Fablだけでなく FabKも阻害する必要がある。
[0007] さらに、 FabKは肺炎連鎖球菌において生育に必須であり、補酵素として FMNを 1 ： 1のモル濃度比で有するフラビンタンパク質であることが明らかにされている（Bioche m. J.(2003),370, 1055-1062) oその他、 FabKを弱いながらも阻害する化合物の報告 はあるが、本発明者らの知る限りでは、これまでに FabKを強く阻害する化合物や Fa bKの立体構造に関する報告はない。
[0008] FabKを阻害する化合物を効率的に設計するためには FabKの立体構造情報が有 用である。 FabKの結晶構造を明らかにすることにより、 FabK特異的な阻害剤が設 計できれば、代表的な薬剤耐性菌であるペニシリン耐性肺炎連鎖球菌 (PRSP)を含 む肺炎連鎖球菌に対する特効薬の創出に非常に有用である。また、 Fablおよび Fa bK両方に特異的な阻害剤を設計できれば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA )や多剤耐性緑膿菌を対象に含む、より広範な抗菌剤の創出に非常に有用である。 そのため、 X線結晶構造解析により FabKの立体構造を決定し、効率的な阻害剤の 設計を可能とする高品質の FabK結晶の創出が望まれている。
発明の概要
[0009] 本発明者らは、今般、種々の結晶化条件を検討した結果、 X線結晶構造解析によ り FabKの立体構造を決定し、効率的な阻害剤の設計を可能とする高品質の FabK の結晶化に成功した。
[0010] 従って、本発明は、 FabKの結晶の提供をその目的としている。
[0011] そして、本発明による FabKの結晶は、具体的には、空間群が P2、 P2 2 2、 122
2、または C222のものであり、より具体的には下記の（a)〜（e)のいずれかで定義さ れるものである：
(a) 空間群が P2であり、単位格子定数が a = 50 ±5 A、 b = 126±13A、 c = 53± 5A, α = γ =90° 、および j8 = 113± 11° であり、
(b) 空間群が P2 2 2であり、単位格子定数が a=59±6A、 b = 74±7A、 c=12 6±13A、および α = j8 = γ =90° であり、
(c) 空間群が P2 2 2であり、単位格子定数が a = 87 ±9 A、 b = 160±16A、 c =l 83±18A、および α = j8 = γ =90° であり、
(d) 空間群が 1222であり、単位格子定数が a=117±12A、 b=187±19A、 c = 2 15±22A、および α = j8 = γ =90° であり、
(e) 空 f¾群力C222iであり、単位格子定数カ& = 59±6 、 b = 85±9A、 c = 126 ±13 、ぉょび0； = |8 = =90° である。
[0012] 本発明による FabKの結晶は、多波長異常分散法 (MAD法）により分解能 2. 2 A の X線回折強度データを得ることが可能な良質な結晶であって、 FabKの立体構造 の解析を可能とするものである。従って、本発明の FabKの結晶を利用することにより 、 FabKを阻害する化合物の効率的な設計等に役立つ立体構造情報を取得できる。 本発明による結晶が提供されることは、創薬において極めて意義がある。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]図 1は、本発明の Se— His— FabK結晶の顕微鏡写真を示す。
[図 2]図 2は、決定した FabKの非対称単位中の構造のリボン図を示す。
[図 3]図 3は、点変異部分 (A141S)の電子密度図とモデルを示す。
発明の具体的説明
[0014] FabKの結晶
本発明による FabKの結晶は上述の（a)〜（e)のいずれかで定義されるものである 。本発明の好ましい態様によれば、 FabKは、ストレプトコッカス属（Streptococcus)ま たは肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae)由来のものであり、より好ましい態様 によれば、配列表の配列番号 1〜4のいずれかひとつのアミノ酸配列を有するタンパ ク質であることが好ましい。本発明の別の好ましい態様によれば、結晶を構成するタ ンパク質中の少なくとも一つのメチォニン残基がセレノメチォニンに置換されたもので あることが好ましい。さらに、本発明による FabKの結晶の好ましい具体例は以下の通 りである：
[0015] まず、本発明の一つの好ましい態様によれば、 FabKの結晶は空間群が P2であり 、単位格子定数力 = 50. 26A、 b = 126. 69A、 c = 53. 63A、 a = y = 90° 、 および j8 = 112. 46° の結晶である。この態様において、 FabKは配列番号 1に示さ れるアミノ酸配列を有するものであることがより好ましい。
[0016] また、本発明の別の好ましい態様によれば、 FabKの結晶は空間群が P2であり、 単位格子定数力 = 50. 6lA、 b = 125. 95A、 c = 53. Ol A、 a = y = 90° 、お よび j8 = 112. 78° の結晶である。この態様において、 FabKは配列番号 1に示され るアミノ酸配列を有するものであることがより好ましい。
[0017] また、本発明の別の好ましい態様によれば、 FabKの結晶は空間群が P2 2 2であ り、単位格子定数力 = 58. 92A、 b = 73. 89A、 c = 126. 5θΑ、および α = β = y = 90° の結晶である。この態様において、 FabKは配列番号 1に示されるアミノ酸 配列を有するものであることがより好ましい。
[0018] また、本発明の別の好ましい態様によれば、 FabKの結晶は空間群が C222であり 、単位格子定数力 = 58. 99A、 b = 84. 6θΑ、 c= 126. 17A、および α = β = y = 90° の結晶である。この態様において、 FabKは配列番号 3に示されるアミノ酸 配列を有するものであることがより好ましい。
[0019] また、本発明の別の好ましい態様によれば、 FabKの結晶は空間群が P2 2 2であ り、単位格子定数力 = 86. 99A、 b = 160. 41 A、 c= 183. 25A、および α = β = γ = 90° の結晶である。この態様において、 FabKは配列番号 2に示されるァミノ 酸配列を有するものであることがより好まし 、。
[0020] また、本発明の別の好ましい態様によれば、 FabKの結晶は空間群が 1222であり、 単位格子定数力 117. 20A、 b = 186. 58A、 c = 214. 79A、および α = β = y = 90° の結晶である。この態様において、 FabKは配列番号 1に示されるアミノ酸 配列を有するものであることがより好ましい。
[0021] また、本発明の別の好ましい態様によれば、 FabKの結晶は空間群が 1222であり、 単位格子定数力 118. 38A、 b = 190. 3θΑ、 c = 213. 04A、および α = β = y = 90° の結晶である。この態様において、 FabKは配列番号 1に示されるアミノ酸 配列を有するものであることがより好ましい。
[0022] X線を照射して回折強度データを取得するための X線発生装置は特に限定されな V、、好ましくは財団法人高輝度光科学研究センターの大型放射光施設 SPring— 8 などの第三世代の放射光施設を利用する。得られた X線回折強度データを処理する ことにより、結晶学的パラメータを特定することが可能である。 X線回折強度を測定す るため、結晶を多価アルコール含有の抗凍結溶液中に浸した後、凍結させる。凍結 状態で X線回折データを収集し、 X線回折像を得る。ここで、多価アルコールとしては スクロース、トレハロース、またはグリセロールなどが挙げられる。とりわけ、グリセロー ルが好ましい。抗凍結溶液中の多価アルコールの濃度は好ましくは 10%〜20%で ある。
[0023] 位相決定には、分子置換法、重原子同型置換法、または多波長異常分散法 (MA D法)などが用いられる。好ましくは、重原子同型置換法または MAD法などが挙げら れる。すなわち、ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶の回折データ間の回折強 度差、あるいは異なる波長間で測定した回折データの回折強度差力 電子密度を計 算するための初期位相を求めることにより、立体構造を決定することが可能である。 本発明にあっては、波長を変えることのできる前記大型放射光施設 SPring— 8を利 用可能であった。その結果、セレノメチォニンを導入した結晶を用いた MAD法によ る X線結晶構造解析を実施し、その後、得られた FabKの立体構造をサーチモデルと した分子置換法による構造決定を行うことができた。
[0024] FabKの結晶化
本発明による FabKの結晶を得る方法は、蒸気拡散法 (例えば、ノ、ンギングドロップ 法、シッティングドロップ法、またはサンドイッチドロップ法などが挙げられる）、バルタ バッチ法、マイクロバッチ法、マイクロ透析法、または自由界面拡散法などのいかなる 方法を用いてもよぐ好ましくは蒸気拡散法が挙げられ、さらに好ましくはハンギング ドロップ法が挙げられる。本発明者らの得た知見によれば、 FabKの結晶はクラスター 化する傾向にあるため、シーデイング法により良質な単結晶を得ることが好ましい。本 発明の好ましい態様によれば、結晶化に用いるタンパク質としては配列番号 1〜4に 示されるアミノ酸配列を有する His— FabKおよび FabKが好ましぐ精製の簡便さか ら配列番号 1に示されるアミノ酸配列を有する FabKが最も好ま U、。結晶化に用いる 精製タンパク質の濃度は lOmgZmL程度であることが好ましい。そして、タンパク質 溶液に沈殿剤、塩類、緩衝液、または添加剤などを適当量加えて結晶化を行う。
[0025] 本発明の FabKの結晶化に用いられる好ましい沈殿剤としては、ポリエチレングリコ ールなどの水溶性高分子、イソプロパノール、および 2—メチルー 2, 4—ペンタンジ オール (MPD)などの有機溶媒などが挙げられる。さらに好ましい沈殿剤としては、ポ リエチレングリコールである。さらに沈殿剤の成分としては、アンモ-ゥム塩を用いるこ とが好ましい。アンモ-ゥム塩としては、硫酸アンモ-ゥム、塩化アンモ-ゥム、または 酢酸アンモ-ゥムなどが挙げられ、好ましくは、塩化アンモ-ゥムまたは酢酸アンモ- ゥムなどである。これらを一種または二種以上用いてもよい。また、緩衝剤としては公 知の緩衝剤を用いることができる力 MES (pH5. 5- 7. 0)を用いることが好ましい 。沈殿剤の組み合わせは、
(1) 8— 15%ポリエチレングリコール 1000、 8— 15%MPD、 0. 1M塩化アンモ- ゥム、 0. 2M塩化カルシウム、 5mMジチオスレィトール、および 0. 1M MES(pH5. 5- 7. 0)、
(2) 20— 25%ポジエチレングジ 一ノレ 1000、 0. 1M塩ィ匕アンモニクム、 0. 2M醉 酸アンモ-ゥム、 5mMジチオスレィトール、および 0. 1M MES(pH5. 5— 7. 0)、な らびに
(3) 2. 5— 10%ポリエチレングリコール 8000、 2. 5— 10%ポリエチレングリコール 1000、 0. 1M塩化アンモ-ゥム、 0. 2M酢酸アンモ-ゥム、 5mMジチオスレイト一 ル、および 0. 1M MES(pH5. 0— 6. 5)
の三通りが挙げられるが、とりわけ (1)の組み合わせが好ましぐ最も再現性良ぐ高 品質の結晶を得ることができる。
[0026] (1)の条件は、通常市販されている結晶化条件スクリーニングキットには含まれてい ない。上記沈殿剤の組成は、ポリエチレングリコールと MPDを組み合わせた上で、 塩ィ匕アンモ-ゥム、塩ィ匕カルシウム、またはジチオスレィトール等を単独、または組み 合せる独自の条件である。なお、高分解能での X線結晶構造解析に利用するために は（1)の条件で得られる結晶は、ミクロシーデイング法によりクラスター化を抑制する ことが重要である点に留意が必要である。
[0027] FabKの取得
(l) FabKの発現
FabKをコードする DNA断片を、宿主細胞内で複製可能でかつ同遺伝子が発現 可能な状態で含む DNA分子、特に DNA発現ベクターの形態とする。その後、前記 DNA分子、特に前記 DNA発現ベクターにより宿主細胞の形質転換を行う。そして、 その形質転換体を培養することにより FabKを得る。
[0028] 前記 DNA分子はベクター分子に FabKをコードする DNA断片を組み込むことによ つて得ることができる。本発明の好ましい態様によれば、このベクターはプラスミドであ る。本発明において利用されるベクターは使用する宿主細胞の種類を考慮し、ウィル ス、プラスミド、またはコスミドベクターなど力も適宜選択することができる。例えば宿主 細胞が大腸菌の場合は pUC系または pBR系のプラスミド、枯草菌の場合は pUB系 のプラスミド、酵母の場合は YEp系、 YRp系、または YCp系のプラスミドベクターが挙 げられる。宿主細胞としては宿主 ベクター系が確立されているものであれば利用可 能であり、好ましくは大腸菌が挙げられる。宿主細胞の形質転換により得られた形質 転換体を適当な条件で培養し、得られた形質転換体の細胞抽出液を慣用の方法に 従い回収することができる。ここで、 FabKに付カ卩的ポリペプチド、例えばダルタチォ ン一 S トランスフェラーゼ (GST)またはヒスチジン残基に富むポリペプチド (His— t ag)を融合タンパク質として発現することも慣用の技術により可能である。
[0029] (2) FabKの精製
His— tagを融合して大腸菌で発現させた FabK (His— FabK)は、金属イオンを配 位させたァフィユティーカラムを用いた慣用の技術により容易に精製が可能である。 前記金属イオンの好まし 、ものとしてはニッケルイオンが挙げられる。精製した His— FabKを 50mMトリス塩酸 (pH8. 0)、 50mM塩化アンモ-ゥム、 5mMジチオスレイト ール、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、および ImMベンズアミジン溶液で透 祈した後、陰イオン交換カラム、疎水性相互作用カラム、およびゲルろ過カラムを用 Vヽた一般的なクロマトグラフィーの手法を組み合わせて精製することが可能である。ま た、配列番号 1または 3に示されるアミノ酸配列を有する His— FabKを各々分取する ことができる。さら〖こ、 His— tagを融合せずに大腸菌で発現させた FabKは陰イオン 交換カラム、疎水性相互作用カラム、およびゲルろ過カラムを用いた一般的なクロマ トグラフィ一の手法を組み合わせて精製することが可能である。また、配列番号 2また は 4に示されるアミノ酸配列を有する FabKを各々分取することができる。
[0030] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例によって限 定されない。また、各種ベクターの作製またはタンパク質の発現等は、特に記載のな ヽ限り、 Molecularし loning, A Laboratory Manual, 3rd edition(Sambrook and Russell 著， Cold Spring Harbor laboratory Press刊（2001) )などに記載の公知の手法により 実施可能である。
実施例
[0031] ¾施{列 i : flrtf ;車 HBfe fe FabKの の ( 1)肺炎連鎖球菌 R6株由来のゲノム DNAの単離
肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae) R6株（ATCC49619)を血液寒天基礎 培地 (ベタトン'ディッキンソン社製)で二酸化炭素濃度 5%、 37°Cの条件下で 18時 間培養し、低速遠心によって集菌した。得られた菌体から DNeasy Tissue Kit (Q IAGEN社製)を用い、添付の説明書に記載の方法に従って、ゲノム DNAを調製し た。
[0032] (2)肺炎連鎖球菌 R6株由来 FabK発現ベクターの構築
FabKをコードする DNAを単離するため以下のプライマーを設計した。
[0033] FabK— F . P . ： 5，一 GGAATTCCATATGAAAACGCGTATTACAGAA - 3
' (配列番号 5)
His— FabK— R. P. : 5' - CCGCTCG AGGTCATTTCTTACAACTCCTGT 3' (配列番号 6)
FabK-R. P. ： 5 ' - CCGCTCGAGTTAGTCATTTCTTACAACTCC - 3 ' ( 配列番号 7)
[0034] 前記（1)で単離したゲノム DNAを铸型に前記プライマーを用いて、 Pyrobest D NA Polymerase (タカラバイオ社製)でポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)を添付の説明 書の記載に従い実施した。 His— tag付の FabK (His— FabK)を作製する場合には 配列番号 5および 6のプライマーを使用した。一方、タグなしの FabKを作製する場合 には配列番号 5および 7のプライマーを使用した。増幅した DNA断片は Ndelおよび Xholで消化した。この断片を予め Ndelおよび Xholで切断したベクター pET— 21b ( + ) (Novagen社製）に DNA Ligation Kit ver. 2 (タカラバィォ社製）を添付の 説明書に記載の方法に従って用い、サブクローユングした。得られた組換えプラスミ ドを大腸菌 COMPETENT high DH5 α (TOYOBO社製）に添付の説明書に記 載の方法に従い導入し、形質転換体を得た。形質転換体を 50 gZmLのアンピシ リンを含む LB agarプレート上にて、 37°Cでー晚培養し、アンピシリン耐性コロニー を取得した。取得したコロニーから組換えプラスミド（His— FabKZpET—21b ( + ) および FabK/pET— 21b ( + ) )を調製し DNA配列を確認し、配列番号 1および 2 に記載の SWISSPROT Accession番号 Q8DR17に登録されている肺炎連鎖球 菌 R6株由来の FabKをコードすることを確認した。
[0035] 実施例 2： FabK (His—FabKおよび FabK)の発現
実施例 1の（2)で得られた His— FabKZpET— 21b ( + )および FabKZpET— 2 lb ( + )の組み換えプラスミドを大腸菌 BL21 (DE3) (Novagen社製）に形質転換し た。得られた形質転換体を 100 g/mLのアンピシリンを含む SB培地（1. 2% (w/v ) Bacto Tryptone, 2. 4% (w/v)Yeast Extract, 0. 5% (vZv)グリセローノレ、 0. 072Mリン酸水素二カリウム、および 0. 028Mリン酸二水素カリウム含有） 5L中で 600nmにおける O. D. (吸光度）が 0. 6— 1. 0に達するまで増殖させた。最終濃度 ImMのイソプロピル β D チォガラタトピラノシド (IPTG)で三時間誘導後、遠 心分離機によって集菌し、菌体をリン酸緩衝食塩水（PBS) 200mLに懸濁した後、 再度遠心分離機によって集菌し、 20°Cで凍結保存した。菌体を His— FabKZpE T— 21b ( + )の組み換え大腸菌の場合には菌体破砕バッファー A(50mMリン酸ナ トリウム緩衝液 (ρΗ8. 0)、 300mM塩ィ匕ナトリウム、 5mMイミダゾール、 ImMフッ化フ ェ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、 ImM β メルカプトエタノール、お よび 0. lmgZmLリゾチーム含有）、 FabKZpET— 21b ( + )の組み換え大腸菌の 場合には菌体破砕バッファー B (50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 50mM塩化ァ ンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、 ImMジ チォスレイトール、および 0. lmgZmLリゾチーム含有）に懸濁し、氷上で 30分培養 した。次に一分間の超音波処理を 5— 7回行い、細胞を破砕した。遠心分離 (30分間 、 15000rpm)とそれに続く 0. 22 mのフィルターによって超音波処理の残渣を除 去し、細胞抽出液を得た。
[0036] 実施例 3： His—FabKの精製
( 1)ァフィ二ティーカラムによる精製
以下の精製操作はすべて 4°Cで行った。 His— FabKZpET—21b ( + )の組み換 え大腸菌から実施例 2の方法で得られた細胞抽出液をァフィユティークロマトグラフィ 一で精製した。ァフィユティークロマトグラフィーカラムは Ni— NTA(QIAGEN社製） を担体として用い、取扱説明書に記載の方法でカラム容量 30mLのカラムを作製し た。平衡化バッファー（50mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH8. 0)、 300mM塩化ナトリ ゥム、 5mMイミダゾール、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジ ン、および ImM |8—メルカプトエタノール含有)で平衡ィ匕した後、細胞抽出液を流速 lmLZminでアプライし、 3カラム容量の洗浄バッファー（50mMリン酸ナトリウム緩 衝液（ρΗ8. 0)、 300mM塩ィ匕ナトリウム、 20mMイミダゾール、 ImMフッ化フエ-ル メチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、および ImM j8—メルカプトエタノール含有 )で洗浄した後、溶出バッファー（50mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH8. 0)、 300mM 塩ィ匕ナトリウム、 200mMイミダゾール、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 lm Mベンズアミジン、および ImM j8—メルカプトエタノール含有）で溶出した。 SDS— PAGEにより溶出画分を確認し、 His— FabKの主要なフラクションをまとめて回収し た。
[0037] (2)陰イオン ¾カラムによる精製
前記（1)で得られた His— FabK溶液を透析バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液 (p H8. 0)、 50mM塩化アンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベ ンズアミジン、および ImMジチオスレィトール含有)で二時間透析した後に、陰ィォ ン交換カラムである POROS HQ/20 (PerSeptive Biosystems社製）を用いて 精製した。平衡化バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 50mM塩ィ匕アンモ -ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、および ImM ジチオスレィトール含有）で平衡化したカラムに流速 lOmL/minで His— FabK溶 液をアプライした。 3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、 50mMトリス塩酸 緩衝液 (ρΗ7. 5)、 50mM塩化アンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル 、 ImMベンズアミジン、および ImMジチオスレィトール溶液中の 0— 500mM塩化 カリウムの直線勾配（25カラム容量)で溶出した。 SDS— PAGEにより溶出画分を確 認し、 His— FabKの主要な画分をまとめ、以後の精製を実施した。
[0038] ( 3)疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製
前記（2)で得られた His—FabK溶液を 50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 3. 5M 硫酸アンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、お よび ImMジチオスレィトール溶液と混合した後、硫酸アンモ-ゥムの終濃度が 2Mに なるように調製した。調製した His— FabK溶液を平衡化バッファー（50mMトリス塩 酸緩衝液 (ρΗ7. 5)、 2M硫酸アンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、および ImMジチオスレィトール含有）で平衡化した疎水性相 互作用カラムである RESOURCE PHE 6mL (アマシャムバイオサイエンス社製）に 、流速 5mLZminでアプライした。 3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、 5 OmMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベン ズアミジン、および ImMジチオスレィトール溶液中の 2— 0M硫酸アンモ-ゥムの直 線勾配（15カラム容量)で溶出した。 SDS— PAGEにより溶出画分を確認し、 His— FabKの主要な画分をまとめ、以後の精製を実施した。
[0039] (4)ゲルろ渦カラムによる精製
前記（3)で得られた His— FabK溶液を保持分子量 30000以上の限外ろ過膜であ る Amicon Ultra— 4 30kDa NMWL (ミリポア社製）を用いて lmLまで濃縮し、 ゲルろ過バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 150mM塩化アンモ-ゥム 、 ImMフッ化フエ二ルメチルスルホニル、 ImMベンズアミジン、および ImMジチォ スレイトール含有）で平衡化したゲルろ過カラム Hiloadl6/60 Superdex75 pre p grade (アマシャムバイオサイエンス社製）に流速 lmLZminでアプライした。 SD S PAGEにより主要な画分を各々まとめ、前記記載の限外ろ過膜を用 V、て濃縮し た。その後溶液交換のため、 10mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 lOOmM塩ィ匕アン モ-ゥム、 ImMジチオスレィトール溶液で希釈し、再度濃縮する操作を三度繰り返し た後、 10mg/mLになるまで濃縮し、最終濃度 5mMになるように —ニコチンアミド アデ-ンジヌクレオチドニナトリウム (還元型）を添加して、結晶化試料とした。試料は 液体窒素中で凍結し、 80°Cで保存した。
[0040] 実施例 4： FabK (タグなし)の精製
(1)陰イオン交 カラムによる精製
以下の精製操作はすべて 4°Cで行った。 FabKZpET— 21b ( + )の組み換え大腸 菌から実施例 2の方法で得られた細胞抽出液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィ 一で精製した。陰イオン交換カラムは Q— Sepharose High Performance (アマ シャムバイオサイエンス社製)を担体として用い、取扱説明書に記載の方法でカラム 容量 114mLのカラムを作製した。平衡化バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7 . 5)、 50mM塩化アンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベン ズアミジン、および ImMジチオスレィトール含有）で平衡化したカラムに、流速 5mL Zminで FabK溶液をアプライした。 3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、 50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 50mM塩化アンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ル メチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、 ImMジチオスレィトール溶液中の 0—1M 塩ィ匕カリウムの直線勾配（5カラム容量)で溶出した。 SDS— PAGEにより溶出画分を 確認し、 FabKの主要な画分をまとめ、以後の精製を実施した。
[0041] ( 2)疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製
前記（1)で得られた FabK溶液を 50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 3. 5M硫酸ァ ンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、および 1 mMジチオスレィトール溶液と混合した後、硫酸アンモ-ゥムの最終濃度が 2Mにな るように調製した。調製した FabK溶液を平衡化バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液 ( pH7. 5)、 2M硫酸アンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベン ズアミジン、および ImMジチオスレィトール含有)で平衡ィ匕した疎水性相互作用カラ ムである RESOURCE PHE 6mL (アマシャムバイオサイエンス社製）に、流速 5m L/minでアプライした。 3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、 50mMトリス 塩酸緩衝液 (ρΗ7. 5)、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン 、 ImMジチオスレィトール溶液中の 2— 0M硫酸アンモ-ゥムの直線勾配（ 15カラム 容量)で溶出した。 SDS— PAGEにより溶出画分を確認し、 FabKの主要な画分をま とめ、以後の精製を実施した。
[0042] (3)ゲルろ渦カラムによる精製
前記（2)で得られた FabK溶液を保持分子量 30000以上の限外ろ過膜である Ami con Ultra— 4 30kDa NMWL (ミリポア社製）を用いて lmLまで濃縮し、ゲルろ 過バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 150mM塩化アンモ-ゥム、 ImM フッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、および ImMジチオスレイト ール含有）で平衡化したゲルろ過カラム Hiload 16/60 Superdex75 prep gr ade (アマシャムバイオサイエンス社製）に流速 lmLZminでアプライした。 SDS— P AGEにより主要な画分を各々まとめ、以後の精製を実施した。 [0043] (4)陰イオン交 カラムによる精製
前記（3)で得られた FabK溶液を透析バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5 ), 50mM塩化アンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズァ ミジン、および ImMジチオスレィトール含有)で二時間透析した後に陰イオン交換力 ラムクロマトグラフィーである MonoQ HR10/10 (アマシャムバイオサイエンス社製 )で精製した。平衡化バッファー（50mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 50mM塩化ァ ンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 ImMベンズアミジン、および 1 mMジチオスレィトール含有）で平衡化したカラムに流速 3mL/minで FabK溶液を アプライした。 3カラム容量の平衡化バッファーで洗浄した後、 50mMトリス塩酸緩衝 液 (ρΗ7. 5)、 50mM塩化アンモ-ゥム、 ImMフッ化フエ-ルメチルスルホ -ル、 lm Mベンズアミジン、および ImMジチオスレィトール溶液中の 0— 1M塩化カリウムの 直線勾配（20カラム容量)で溶出した。 SDS— PAGEにより溶出画分を確認し、 Fab Kの主要な画分をまとめ、前記記載の限外ろ過膜を用いて濃縮した。その後溶液交 換のため 10mMトリス塩酸緩衝液 (pH7. 5)、 lOOmM塩化アンモ-ゥム、 ImMジチ オスレィトール溶液で希釈し、再度濃縮する操作を三度繰り返した後、 lOmg/mL になるまで濃縮し、最終濃度 5mMになるように |8—ニコチンアミドアデニンジヌタレ ォチドニナトリウム (還元型)を添加して、結晶化試料とした。試料は液体窒素中で凍 結し、—80°Cで保存した。
[0044] 実施例 5 :セレノメチォニン置椽 FabK(Se—His—FabKおよび Se—FabK)の発現
MAD法による X線結晶構造解析に使用する重原子誘導体結晶を作製するために 、メチォニンの硫黄原子が重原子であるセレンに置換されたセレノメチォニン (Se— Met)置換 His - FabK (Se - His - FabK)および FabK (Se— FabK)を作製した。 36—1¾5—？&1)1^ぉょび36—？&1)1^は実施例1の（2)に記載した各々の組み換えプ ラスミドをメチォニン要求株である大腸菌 B834 (DE3) (Novagen社製）に形質転換 し、 100 g/mLのアンピシリンを含む LB agarプレート上にて、 37°Cでー晚培養し 、アンピシリン耐性コロニーを取得した。得られた形質転換体は 100 g/mLのアン ピシリンを含む LB培地 lOOmLにて、 37°Cでー晚培養し、遠心分離機で集菌後、 10 0 μ gZmLのアンピシリンを含む lOOmLの LeMaster培地（組成は表 1に示す。）で 懸濁し、再度遠心分離機によって集菌し、 100
Figure imgf000017_0001
ster培地 lOOmLに再懸濁した。この懸濁液を 100 μ gZmLのアンピシリンを含む 5 Lの LeMaster培地に接種し、 600nmにおける O. D. (吸光度）が 0. 6— 1. 0に達 するまで増殖させた。最終濃度 ImMのイソプロピル β D チォガラタトビラノシ ド (IPTG)で三時間誘導後、遠心分離機によって集菌した。その後、その集菌した菌 体をリン酸緩衝食塩水（PBS) 200mLに懸濁した後、再度遠心分離機によって集菌 し、—20°Cで凍結保存した。以下、 36—1¾5—？&1^ぉょび36—？&1) ま天然型と 同様の方法で精製した。
[0045] [表 1]
L e M a s t e r培地の組成 （1000m l当たり）
成分 3有
Se-Met core培地 （日本製薬社製） 23.6g
25mg/ml L一セレノメチォニン （和光純薬社製） 1ml
10% グルコース 100ml
1 M 硫酸マグネシウム 1ml
15mM 硫化鉄 ( II ) 1ml 硫酸 8.3 /1
KAO and MICHAYLUK VITAMIN SOLUTION (シグマ社製） 10ml
[0046] 実施例 6 :A141S変異 FabK(A141S His— FabKおよび A141S FabK)の作製
実施例 1の（2)で作製した組み換えプラスミド His— FabK/pET— 21b ( + )およ び FabKZpET— 21b ( + )を利用して、 141番目のアミノ酸残基ァラニンをセリンに 置換した点変異体 (A141S His— FabKおよび A141S FabK)をコードする組み 換えプラスミドを作製した。点変異導入には Stratagene社の QuickChange Site— Directed Mutagenesis Kitを利用して 1塩基の点変異を導入した。まず、 目的と する変異を中央にしてその前後に 10— 15塩基ずつ付加したプライマー、およびそ れに相補的な下記プライマーを用意した。
[0047] FabK - Mutant— F . P . ： 5，— GGGATAATCGTTATTCCTGTCGTTCCTA GTG— 3，（配列番号 8)
FabK— Mutant— R. P. : 5' - CACTAGGAACGACAGGAATAACGATTA TCCC 3，（配列番号 9) [0048] 前記プライマーを用い、添付の説明書に記載の方法に従って A141S His -Fab Kおよび A141S FabK点変異体発現プラスミドを作製した。得られたプラスミドにつ いては目的とした塩基以外に変異が入っていないことを DNA配列解析により確認し 、発現ベクターに挿入されている DNAが配列番号 3および 4をコードすることを確認 した。作製した発現ベクターを大腸菌 BL21 (DE3)に形質転換し、天然型と同様の 方法で発現および精製した。
[0049] 実施例 7 : FabKの結晶ィ
沈殿剤の組み合わせとしては、
(1) 8— 15%ポリエチレングリコール 1000、 8— 15%2—メチル— 2, 4—ペンタンジ オール（MPD)、 0. 1M塩化アンモ-ゥム、 0. 2M塩化カルシウム、 5mMジチオスレ ィトール、および 0. 1M MES(pH5. 5— 7. 0)、
(2) 20— 25%ポジエチレングジ 一ノレ 1000、 0. 1M塩ィ匕アンモニクム、 0. 2M醉酸 アンモ-ゥム、 5mMジチオスレィトール、および 0. 1M MES(pH5. 5— 7. 0)、なら びに
(3) 2. 5— 10%ポリエチレングリコール 8000、 2. 5— 10%ポリエチレングリコール 1 000、 0. 1M塩化アンモ-ゥム、 0. 2M酢酸アンモ-ゥム、 5mMジチオスレィトール 、および 0. 1M MES(pH5. 0— 6. 5)
の三通りを用いた。
[0050] MAD法による X線結晶構造解析に利用した結晶は実施例 5で精製した Se— His — FabKを用いて作製した。 10mg/mLの Se— His— FabK溶液 2. O /z Lと結晶ィ匕 剤（10%ポリエチレングリコール 1000、 10%MPD、0. 1M塩化アンモ-ゥム、 0. 2 M塩化カルシウム、 5mMジチオスレィトール、および 0. 1M MES(pH6. 5)含有） 2 . 0 Lをカバーガラス上で混合し結晶化ドロップとした。リザーバー溶液として前記 結晶化剤 500 μ Lを VDXプレート（ノヽンプトンリサーチ社製）のゥエルに分注し、ゥェ ルの淵に高真空グリースを塗り、カバーガラスをドロップが内側になるように被せ密閉 した。プレートを 4°Cの恒温槽内に静置すると数日でクラスター結晶が得られた。得ら れたクラスター結晶を用いてミクロシーデイング法により、再度結晶化することで X線 結晶構造解析可能な結晶が作製可能であった。得られた Se— His— FabK結晶の 顕微鏡写真を図 1に示す。この結晶は空間群が 1^であり、単位格子定数力 = 50. 26A、 b = 126. 69A、 c = 53. 63Α、 α = γ = 90° 、および j8 = 112. 46° の結 晶である。
[0051] また、結晶化条件（1)において実施例 3で精製した His— FabKを使用した場合に も同様の結晶が得られ、空間群が P2であり、単位格子定数力 = 50. 61 A、 b = 12
5. 95A, c = 53. Ol A, α = γ = 90° 、および j8 = 112. 78° であった。
[0052] さらに、結晶化条件（1)では His— FabKを利用した場合、空間群が P2 2 2であり
、単位格子定数力 = 58. 92A、 b = 73. 89A、 c= 126. 5θΑ、および α = β =
7 = 90° の結晶も作製可能であった。
[0053] また、 A141S His— FabKを使用した場合、結晶化条件（1)においては空間群が
C222であり、単位格子定数力 = 58. 99A、 b = 84. 6θΑ、 c = 126. 17A、およ び α = j8 = γ = 90° の結晶が得られた。
[0054] さらに、結晶化条件（2)において Se— FabKを使用した場合、空間群が P2 2 2で あり、単位格子定数力 = 86. 99 A、 b = 160. 41 A、 c = 183. 25 A、および a = ι8 = γ = 90° の結晶が得られた。
[0055] また、結晶化条件（3)においては His— FabKを使用した場合、空間群が 1222であ り、単位格子定数力 117. 20A、 b = 186. 58A、 c = 214. 79A、および a = ι8 = γ = 90° の結晶が得られた。
[0056] さらに、 Se— His— FabKを使用した場合には、空間群が 1222であり、単位格子定 数力 = 1 18. 38A、 b = 190. 3θΑ、 c = 213. 04A、および α = β = γ = 90° の 結晶が得られた。
[0057] 前記記載のすべての結晶は蒸気拡散法であるハンギングドロップまたはシッティン グドロップの 、ずれの方法で結晶化した場合でも、同様の結晶が得られた。
[0058] 実施例 8： Se— His— FabKの X線回析強度データの収暴および結晶構诰の決定
実施例 7の結晶化条件（1)で得られた Se— His— FabK結晶を 15%グリセロール 含有の安定ィ匕母液（12. 5%ポリエチレングリコール 1000、 12. 5%MPD、0. 1M 塩化アンモ-ゥム、 0. 2M塩化カルシウム、 5mMジチオスレィトール、および 0. 1M MES(pH6. 5)含有）に移し、 170°Cの窒素ガス気流にて急速凍結した。これを前 記財団法人高輝度光科学研究センターの大型放射光施設 SPring— 8の創薬産業 ビームライン BL32B2を利用し CCDカメラを検出装置として X線回折データを振動 法にて測定した。この際、セレンの異常散乱効果を用いて構造解析を行うために波 長は 0. 97932、 0. 97888、および 0. 90000Aの三波長、すなわち吸収端のエツ ジ、ピーク、およびリモートの三力所で MADデータを収集した。振動角は 1° Zフレ ームであった。各データは回折強度データ処理プログラム CrystalClear (リガク社製 )を使用して、分解能 2. OAで処理し、回折強度を数値化し、結晶構造因子を求め た。
[0059] その結果、空間群が P2であり、単位格子定数が a= 50. 26A、 b = 126. 69A、 c
= 53. 63 A、 α = γ = 90° 、および j8 = 112. 46° の結晶であることがわかった。 得られたデータの完全性はエッジ、ピーク、およびリモートの測定波長でそれぞれ 97 . 2%、 96. 1%、および 95. 4%であった。さらに、 R はそれぞれ 6. 2%、 6. 4%
merge
、および 8. 6%であった。結晶の空間群、単位格子定数、および Se— His— FabK の分子量力 結晶の非対称単位に Se— His— FabK分子が二分子存在していること が明らかになった。これらのデータ収集の結果は下記の表 2に示される通りであった
[0060] [表 2]
結晶学的分析の統計量 データ収集
空間群
単位 定数 ( A ) a=50.26, =126.69, c=53.63
(deg. ) =90.0, ?=112.46, 7=90.00
波長 (A) 0.90000 0.97888 0.97932
(リモート） (ビーク） (エッジ）
分解能範囲 (A) 39-2.00 40 - 2.00 32-2.00
(2.07-2.00) (2.07-2.00) (2.07-2.00)
全反 Ιί¾ 140565 139889 148999
ユニークな 78798 79294 79789
平均冗長度 1.78 1.76 1.87
¾ ^性 (%) 95.4(94.0) 96.1(94.9) 97.2(96.2)
R lerge 0.086 0.064 0.062
(0.199) (0.139) (0.142)
平均 I/sigial 3.9(1.8) 6.6(3.1) 7.6(3.5) 注記:括弧内の値は最終分解能シヱルに対するものである。
[0061] 次に、プログラム SOLVE (Terwillinger, T. C. & Berendzen, J. ActaCryst allogr. D 55, 849— 861 (1999) )を用いてセレン原子の位置を決定し初期位相 を計算した。位相の改良及び初期モデルの構築はプログラム RESOLVE (Terwilli ger, T. C. Acta Crystallogr. D56, 965— 972 (2000) )を用!ヽた。 ヽで、 プログラム Turbo Frodo (AFMB - CNRS製）、プログラム Ref mac 5 (Collaborati ve Computational Project Number 4 (ccp4) )によるモデルの構築および修 正を繰り返し実施し、 Se— His— FabKの結晶構造を決定した。構造精密化は分解 能 2. 2Aで実施した。決定した結晶構造の正確さの指標である R因子は 0. 220であ つた。さらに、精密化の段階で計算に入れな力つた全反射の 5%に相当する構造因 子から計算される R 因子は 0. 282であった。また、決定した FabKの非対称単位
free
中の構造を図 2に示した。
[0062] ¾施例 9： A141S His— FabKの X線冋析強度データの収奪および結晶構浩の決 定
実施例 7の結晶化条件（1)で得られた A141S His— FabK結晶を 15%グリセ口 ール含有の安定ィ匕母液（12. 5%ポリエチレングリコール 1000、 12. 5%MPD、0. 1M塩化アンモ-ゥム、 0. 2M塩化カルシウム、 5mMジチオスレィトール、および 0. 1M MES(pH6. 0)含有）に移し、 170°Cの窒素ガス気流にて急速凍結した。これ を前記財団法人高輝度光科学研究センターの大型放射光施設 SPring— 8の創薬 産業ビームライン BL32B2を利用し CCDカメラを検出装置として X線回折データを 振動法にて測定した。 X線の波長は ιΑ、振動角は 1° Zフレームであった。次に、 回折強度データ処理プログラム CrystalClear (リガク社製）を使用して、 A141S Hi s— FabK結晶を分解能 1. 8Aで処理し、回折強度を数値化し、結晶構造因子を求 めた。
その結果、 A141S 1¾5— &1^結晶は空間群がじ222でぁり、単位格子定数が& = 58. 99A、 b = 84. 6θΑ、 c = 126. 17A、および α = β = γ = 90° であった。 得られたデータの完全性は 99. 8%、 R は 6. 6%であった。プログラム Molrep (
merge
CCP4)を用いた分子置換法により位相を決定し、プログラム Refmac5 (CCP4)を用 いて構造を精密化した結果、 R因子は 0. 244となった。さらに、精密化の段階で計算 に入れな力つた全反射の 5%に相当する構造因子力も計算される R 因子は 0. 28
free
2となり、構造決定に成功した。また、点変異部分の電子密度図とモデルを図 3に示 した。

Claims

請求の範囲
エノィルーァシルキャリアプロテインレダクターゼ（FabK)の結晶。
FabKが、ストレプトコッカス属 (Streptococcus)または肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae)由来のものである、請求項 1に記載の結晶。
空間群力 、 P2 2 2 、 1222、または C222のものである、請求項 1に記載の結 曰曰 o
下記の 、ずれかで定義される、エノィルーァシルキャリアプロテインレダクターゼ (F abK)の結晶：
(a) 空間群が P2であり、単位格子定数が a = 50 ±5 A、 b = 126±13A、 c = 53± 5A, α = γ =90° 、および j8 = 113± 11° であり、
(b) 空間群が 2であり、単位格子定数が a=59±6A、 b = 74±7A、 c=12 6±13A、および α = j8 = γ =90° であり、
(c) 空間群が P2 2 2であり、単位格子定数が a = 87 ±9 A、 b = 160±16A、 c =l 83±18A、および α = j8 = γ =90° であり、
(d) 空間群が 1222であり、単位格子定数が a=117±12A、 b=187±19A、 c = 2 15±22A、および α = j8 = γ =90° であり、
(e) 空 f¾群力 SC222であり、単位格子定数カ& = 59±6 、 b = 85±9A、 c = 126 ±13 、ぉょび0； = |8 = =90° である。
(a) 空間群が P2であり、単位格子定数が a = 50 ±5 A、 b = 126±13A、 c = 53± 5A、 a = y =90° 、および j8 =113±11° である、請求項 4に記載の結晶。
(b) 空間群が P2 2 2であり、単位格子定数が a=59±6A、 b = 74±7A、 c=12 6±13A、および α = β = γ =90° である、請求項 4に記載の結晶。
(c) 空間群が Ρ2 2 2であり、単位格子定数が a = 87 ±9 A、 b = 160±16A、 c =l 83±18A、および α = β = γ =90° である、請求項 4に記載の結晶。
(d) 空間群が 1222であり、単位格子定数が a=117±12A、 b=187±19A、 c = 2 15±22A、および α = β = γ =90° である、請求項 4に記載の結晶。
(e) 空 f¾群力C222iであり、単位格子定数カ& = 59±6 、 b = 85±9A、 c = 126 ±13A、および a = β = γ =90° である、請求項 4に記載の結晶。 [10] FabKが、ストレプトコッカス属 (Streptococcus)または肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae)由来のものである、請求項 4〜9のいずれか一項に記載の結晶。
[11] FabKが配列番号 1〜4のいずれかひとつのアミノ酸配列を有するタンパク質である
、請求項 4〜9に記載の結晶。
[12] 結晶を構成するタンパク質中の少なくとも一つのメチォニン残基がセレノメチォニン に置換されたものである、請求項 1に記載の結晶。
[13] 少なくとも 2. 2 Aの分解能まで X線回折する、請求項 1に記載の結晶。
[14] エノィルーァシルキャリアプロテインレダクターゼ (FabK)溶液に沈殿剤を添カロし、 蒸気拡散法により結晶化することを特徴とする、エノィルーァシルキャリアプロテイン レダクターゼ（FabK)の結晶の製造方法。
[15] 前記沈殿剤がアンモニゥム塩を含有するものである、請求項 14に記載の製造方法
[16] 前記アンモ-ゥム塩として、塩化アンモ-ゥムまたは酢酸アンモ-ゥムのいずれか 一つまたは両方を含有する、請求項 15に記載の製造方法。
[17] 前記沈殿剤がポリエチレングリコールを含有するものである、請求項 14に記載の製 造方法。
[18] 請求項 14〜 17のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、エノィルーァ シルキャリアプロテインレダクターゼ（FabK)の結晶。
[19] 結晶構造情報を取得するための、請求項 1に記載の結晶の使用。
[20] 前記結晶構造情報の取得が、分子置換法、重原子同型置換法、または多波長異 常分散法により行われる、請求項 19に記載の結晶の使用。
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