WO2007034021A1 - Nanopartícula biosensora, procedimiento de elaboración y sus aplicaciones - Google Patents
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- G01N2446/20—Magnetic particle immunoreagent carriers the magnetic material being present in the particle core
Definitions
- the present invention relates to the field of biosensors, in particular the use of peptide nucleic acid probes (PNAs) immobilized on nanoparticles for the detection of hybridization of natural nucleic acids (DNA or RNA) of specific sequences.
- the nanoparticles are composed of a magnetic core and an outer layer of a metallic character, on which the relevant probes are immobilized with base sequences complementary to the target object of identification and detection.
- the magnetic, electrical and optical properties of the nanoparticles are used to improve the method, focusing on the difference in the magnetic, optical or electrical signal obtained from said nanoparticles before and after the modification of a positive hybridization test.
- the type of tests to which the present invention relates can also be carried out spectroscopically on macroscopic metal surfaces.
- a certain sequence formed by a certain number of nucleotides becomes unique within the genome of one or more species, and in this way said sequence is usable to detect and characterize the presence of the organism that possesses it.
- it is even possible to detect the presence of an organism, strain or variant that differs only in a nucleotide from other variants, which allows for example to differentiate between two mutants of the same microorganism.
- microarray technology also called chips or microchips
- microarray technology also called chips or microchips
- SNPs nucleotide polymorphism studies
- mini-sequencing can be performed using DNA microarrays. and typing of microorganisms. This technique exploits the experimental methodology developed by E.
- nucleic acids both long chains and short oligonucleotides
- the stability of the hybrids is determined by the degree of complementarity of the nucleotide sequence and by external factors such as the ionic strength of the medium, the pH or the temperature.
- PNA peptide nucleic Acids
- the PNA consists of a polymer whose skeleton is of a peptide nature, unlike the sugar and phosphate skeleton characteristic of natural nucleic acids (DNA and RNA).
- the PNA skeleton is formed by units of N- (2-aminoethyl) glycine linked by peptide bonds, is aquiral, electrically neutral and lacks phosphorus atoms (Egholm et al., 1992; Egholm et al., 1993).
- Puric nucleotide bases (A and G) and pyrimidine (C and T) are linked to the PNA skeleton, in a conformation that can interact exactly with the nucleotide bases of natural nucleic acids.
- the PNA is characterized by its ability to hybridize stably and specifically with complementary DNA, in accordance with the Watson-Crick base parity rules (Egholm et al., 1993).
- single chain PNAs ssPNA
- ssPNA single chain PNAs
- This is mainly due to the electrically neutral character of the PNA, which avoids repulsion phenomena between chains present in the DNA-DNA interaction (Nielsen et al., 1991; Wittung et al., 1994).
- the difference in temperature between that at which complete mating occurs and that at which one of the bases is mismatched is greater in the PNA-DNA case than in the DNA-DNA.
- a biosensor based on immobilized PNA probes will be potentially more efficient than another based on DNA for the detection of mutations and SNPs in a target nucleic acid molecule.
- PNA is not sensitive to the action of natural biodegrading enzymes such as DNases, RNases or proteases, so that its biological stability is much greater than that of DNA or RNA.
- biodegrading enzymes such as DNases, RNases or proteases
- the insensitivity of the PNA to variations in pH or ionic strength means that it also has much greater chemical stability and offers greater experimental possibilities for hybridization to different molecules in different medium compositions (Egholm et al., 1993; Kambhampati et al. ., 2001).
- the interest of taking advantage of the physical-chemical peculiarities of the NAP for its use in detection and quantification systems of natural nucleic acids is evident.
- PNA / DNA (RNA) biosensors have been developed that use the quartz crystal microbalance as a very sensitive instrument for the detection of small mass changes that take place after hybridization between complementary sequences (Wang et al., 1997) or the Mass spectrometry in the MALDI-TOF modality (Griffin et al., 1997; Arlinghaus et al., 2003; Brandt et al., 2003).
- SNPs in such agents that can make them resistant to drugs or facilitate their escape to the immune system or vaccines
- iii characterization of mutations or SNPs in human or animal genes, related to or prone to diseases
- detection of specific tumor markers has important applications in food and environmental control, in aspects that include the following: i) detection of specific microorganisms, pathogens or pollutants; ii) detection of the presence of genetically manipulated organisms (GMOs) or transgenics, and can be quantified if their presence is above the allowed limits.
- GMOs genetically manipulated organisms
- an important sample volume can be analyzed using only micrograms of suspended nanoparticles, which are subsequently concentrated by an external magnetic field.
- ferrofluids which are stable suspensions of ferro or ferrimagnetic nanoparticles, with a narrow distribution of particle sizes.
- This type of nanoparticles were obtained, initially, by mechanical grinding of samples of iron oxides with magnetic properties.
- this method in addition to being expensive and slow, produces a high size distribution in the particles obtained.
- the upper limit of the particle size admitted at room temperature is about 3 nm for iron, and about 10 nm for Fe 3 Ü4 (magnetite) and for its oxidized form ⁇ -Fe2Ü 3 ( maghemite).
- the particle size can reach up to 20 nm. Above these limits, particles that are too large can act as aggregation nuclei and grow by destabilizing the suspension.
- ferrofluids will consist of stable phases of materials that can be displaced or controlled by magnetic gradients.
- Magnetic nanoparticles can also be synthesized by steam methods such as laser pyrolysis (Veintenillas et al., 1998), which gives rise to very dispersed particles of very small magnetic saturation, or the flame method (Urakawa et al., 1996) that originates polydisperse particles.
- a silica network has also been used to obtain magnetic nanoparticles, but the size distribution is too wide (del Monte et al., 1997).
- the main method for obtaining spherical nanoparticles is that of Massart, which consists in the aging of a mixture of ferrous and ferric hydroxide solutions in aqueous medium (Massart and Cabuil, 1987).
- the average particle size can be controlled in an order of magnitude within the range of nanometers (between 1.6 and 12.5 nm) (Jolivet et al. ., 1983), so that the size of particle decreases as the pH and ionic strength increases.
- spherical magnetite particles between 8 and 14 nm were obtained by varying the nature of the base used in the precipitation (NH 4 OH, NaOH or KOH) and the temperature.
- 50 mL of a 0.33 M aqueous solution of FeCl 2 and 0.66 M of FeCl 3 were added to 450 mL of 1 M basic solution under strong stirring.
- a flow of N 2 gas was previously passed through the basic solution to ensure that the final precipitate consisted only of magnetite.
- Smaller particles were obtained by adding to the mixture of iron salts a solution of IM KOH with 1% by weight of polyvinyl alcohol (PVA) at room temperature (Lee et al., 1996).
- Magnetic particles of adequate size synthesized by the above methods have an isoelectric point close to 7 for magnetite, and 9 in the case of cobalt ferrite, which makes them very unstable in aqueous solution at neutral pHs; at pH values ⁇ 2 units of the isoelectric point some aggregation is noticed, and at values ⁇ 1.5 pH units precipitate.
- This coating can be of diverse nature: polymers, organic substances, or different metals or oxides.
- silica great stability against aggregation is achieved, greatly reducing the magnetic attractions and interactions of Van de Waals that occur between said nanoparticles.
- high resistance to heat treatments is provided (Tartaj et al., 2001).
- a problem that involves the coating with silica is the low mechanical resistance that this layer presents within a stirring tank.
- this silica coating could be produced not on individual nanoparticles but on aggregates of about five nanoparticles (Philipse et al., 1994).
- silica layer offers several advantages in addition to its stabilization at neutral pH, such as the possibility of modifying its surface by adding existing functional groups in silane-like binding molecules.
- These molecules have a trialkoxysilane group at one of their ends, and a short chain with the relevant functional group (amino, mercapto, hydroxide, epoxide, etc.) at the end of the chain emerges from the free bond of the silicon.
- the relevant functional group amino, mercapto, hydroxide, epoxide, etc.
- silica nanoparticles have been carried out on silica nanoparticles (Oldenburg et al., 1998).
- the silica surface is silanized with ⁇ -aminopropyltriethoxysilane, so that a multitude of amino groups are incorporated into the surface.
- previously synthesized gold nanoparticles are immobilized and a subsequent stage of growth is made by reducing gold (III) ions until desired, closing the gold layer on the silica.
- This metallic outer layer preferably gold or silver adds many other properties to the silica-coated magnetic nanoparticles, among which it is worth mentioning in relation to the present invention that of providing a unique optical property: the surface plasmon phenomenon.
- nanoparticles that meet all the previously described properties and the feasibility of their use as a support for the detection of hybridization between complementary organic molecules and their application in the development of new tools or technological platforms in nano-biotechnology are not known.
- a first aspect of the invention relates to a biosensor nanoparticle comprising: a magnetic nanoparticle, a layer of silica, a layer or several external metallic layers that can be of different nature and deposited with different alternation and immobilized in its outer surface, and a layer of organic or inorganic, synthetic or naturally occurring biosensor molecules capable of binding to biomolecules.
- the biosensor nanoparticle of the invention comprises a magnetic nanoparticle with a thickness between 4-30 nm in diameter, a layer of silica with a thickness between 1-20 nm, a metal layer with a thickness between 1-200 nm and a layer of organic or inorganic, synthetic or naturally occurring biosensor molecules with the ability to bind biomolecules.
- a third aspect of the present invention relates to the various applications of the biosensor nanoparticles of the present invention.
- a fourth aspect of the invention relates to methods for determining the hybridization or binding of a biological molecule to the organic or inorganic biosensor molecule immobilized to a biosensor nanoparticle of the invention.
- said methods are but are not limited to: spectroscopic detection methods using ultraviolet, visible or infrared radiation, or Raman spectroscopy, or XPS, or electrochemical detection methods.
- Figure 1 Diagram of the biosensor nanoparticle, indicating its different layers.
- Figure 2. Image of Transmission Electron Microscopy (TEM) of cobalt / silica / gold ferrite nanoparticles.
- the image has 120,000 magnifications and the white bar represents 50 nm.
- Figure 3 Transmission spectra in the infrared zone of magnetic nanoparticles with an outer layer of gold on whose surface a layer of chemisorbed has been Thiolated PNA of known sequence ("PG", see Example 1), and the same preparation after being incubated in the presence of a complementary DNA molecule ("DNA-G”, see Example 2) and washed to eliminate possible nonspecific hybridizations.
- PG Thiolated PNA of known sequence
- Figure 4 Transmission spectra in the infrared zone of magnetic nanoparticles with gold-silver-gold outer layer on whose surface a layer of thiolated PNA of known sequence "PG" has been chemisorbed (see Example 1).
- these nanoparticles have been incubated with the complementary DNA "DNA MG”, which resists the washing cycle and remains hybridized, showing its characteristic bands in the IR.
- the nanoparticles have been incubated with a non-specific DNA "DNA L”, which does not hybridize to the PNA and is therefore completely eliminated in the wash cycle; in this way, the IR bands observed at the end of the process are only the characteristics of the PNA (see Example 2).
- Figure 5 Cyclic voltammetries of gold electrodes (3mm diameter discs) coated with a thiolated PNA monolayer, incubated in a complementary DNA solution (at the concentrations indicated in the figure), washed and subsequently incubated in thionin 10 ⁇ 6 M, 10 "3 M H2O2 and the enzyme peroxidase 0.1 mg / ml.
- the present invention faces the problem of providing new tools for the identification and characterization of biomolecules, and more specifically new biosensors capable of binding nucleic acids with high sensitivity and specificity.
- the invention is based on the fact that the inventors have observed that it is possible to identify hybridization specific produced between natural nucleic acids (DNA or RNA) and molecules analogous to them (more specifically, PNA) when these PNA probes are immobilized on the metal surface of magnetic core nanoparticles.
- DNA or RNA natural nucleic acids
- PNA molecules analogous to them
- any type of organic or inorganic molecule can be immobilized, thanks to the properties of said surfaces, provided that it includes functional groups capable of accepting electronic density, such as amino groups or thiol groups (see Example 1).
- the immobilized molecules may or may not originate dispositions in the form of self-assembled monolayers (SAMs) in which case an optimum packing density is obtained. SAM formation occurs, for example, in the case of immobilization of thiolated PNAs on gold surfaces.
- the magnetic core allows said particles to be captured by an external magnetic field and allows the concentration of the analyzed sample when it is at low concentrations.
- it is possible to analyze see Example 2 and 3) the difference in optical signal produced by said nanoparticles with a biosensor molecule immobilized on its surface, before and after hybridization of a complementary nucleic acid present in a problem biological sample.
- the metal used as an external layer provides a unique optical property: the phenomenon of superficial plasmon This phenomenon consists in the collective vibration of the electrons of the metal surface, causing an ultraviolet-visible absorption band (characteristic of the metal and the size of the nanoparticles) at the wavelength at which the resonance condition occurs in these electrons.
- the phenomenon of surface plasmon also has consequences in the region of vibrational energies of chemical bonds, being the cause of the effects of Surface Enhancement Raman Spectroscopy (SERS) (Vo-Dinh, 1998) and Surface Enhancement InfraRed Absorption (SEIRA) (Osawa et al., 1991).
- SERS Surface Enhancement Raman Spectroscopy
- SEIRA Surface Enhancement InfraRed Absorption
- metal surface is its ability to support self-assembled monolayers, especially thiolated groups on gold surfaces (Madoz et al., 1997; Madoz-G ⁇ rpide et al., 2000; Abad et al. ., 2002; Briones et al., 2004).
- a first aspect of the present invention is a biosensor nanoparticle comprising: a) a magnetic nanoparticle b) a layer of silica c) one (or several) metallic outer layer (s), which can be of different nature and deposited with different alternation, and immobilized on its outer surface d) a layer of organic or inorganic, synthetic biosensor molecules or naturally occurring with the ability to bind biomolecules.
- biosensor nanoparticle refers to particles of a size between 5 and 250 nanometers (nm), preferably between 50 and 100 nm and more preferably 60 nm which also comprises all the characteristics described previously.
- the size of the nanoparticle may vary depending on the thickness of the different layers described above which a, descriptively, may vary as follows: i) magnetic particle between 4 and 30 nm and ii) silica layer with a thickness between 1 and 20 nm and iii) metallic layer of a controlled thickness between 1 and 200 nm
- iron oxides that exist (Garcell et al., 1998; Solinas et al., 2001), maghemite ( ⁇ -Fe2Ü 3 ) and magnetite (FesCU) have permanent magnetic properties.
- cobalt ferrite nanoparticles (CoFe2 ⁇ 4), a compound with the same inverse spinel structure characteristic of magnetite, in which cobalt has replaced the oxidation-state iron II can be used.
- Another example of an alternative magnetic material to those described is iron-platinum (FePt), although it is not an oxide.
- magnetic nanoparticle refers to a magnetic material, oxidized or not, belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, respectively, to one of the following groups or to any combination thereof: i) iron oxide, such as magnetite (FesCU) and its oxidized form maghemite ( ⁇ -Fe2Ü 3 ) or an iron-cobalt oxide such as ferrite of cobalt (CoFe2Ü4) or ii) non-oxid magnetic materials such as iron-platinum (FePt);
- Fe oxide such as magnetite (FesCU) and its oxidized form maghemite ( ⁇ -Fe2Ü 3 ) or an iron-cobalt oxide such as ferrite of cobalt (CoFe2Ü4)
- FePt iron-platinum
- the term "metallic outer layer” refers to metals that induce the increase of the spectroscopic signal belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: gold (Au ), silver (Ag), copper (Cu), platinum (Pt) or an alloy formed by several or all of these metals.
- biosensor molecules refers to a biological molecule or a molecule analogous to a biological molecule, of an organic or inorganic nature, immobilized on a nanoparticle that acts as a physical support, capable of binding or specifically hybridize to other biological molecules or analogs thereof so that the binding process can be monitored.
- Said biological molecules or analogs of biological molecules also include a functional group capable of accepting electronic density that entails its chemisorption or fisisorities belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, to the following list: amino groups, groups thiol, epoxy groups, disulfide groups, di-alkyl sulfides, as well as amines and alcohols in platinum.
- the molecules that possess said functional groups, both in the structure of the molecule itself and as a result of the synthetic addition of said group, can be selected, by title illustrative and without limiting the scope of the present invention, of one of the following sets: a) natural biomolecules: single or double stranded nucleic acids (DNA or RNA), enzymes, antibodies, membrane proteins, thermal shock proteins, chaperonins, other proteins, monosaccharides, polysaccharides, glycoproteins, fatty acids, terpenes, steroids, other molecules of a lipidic nature, lipoproteins, hormones, vitamins, metabolites, hydrocarbons, natural molecules with antibiotic or antiviral activity, or macromolecular aggregates composed of proteins and / or nucleic acids or other combinations of the molecules mentioned above; b) natural biomolecules obtained by in vitro selection procedures: aptamers, ribozymes or aptazymes; c) artificial biomolecules: PNAs, other analogs of natural nucleic acids, chim
- hybridization refers to the interaction between two complementary strands of natural nucleic acids or their artificial analogs, or, generically, to the specific interaction between two proteins, an antibody and the antigen that recognizes, or a binding protein and its ligand.
- the nanoparticles of the present invention can also be used in different biosensor formats based on molecular recognition between antigen-antibody, receptor-ligand, enzyme-substrate or enzyme-inhibitor, in which the molecular recognition event leading to changes in optical and / or electrical properties of the system that can be detected thanks to the composition and structure of the nanoparticles object of this invention: ultraviolet, visible or infrared spectroscopy; Raman spectroscopy and "Surface Enhanced Raman Spectroscopy” (SERS), Raman microscopy; Infrared transmission, including FTIR and infrared microscopy; "Surface Enhanced InfraRed Absorption” (SEIRA) and "Atenuated Total Reflection Spectroscopy”(ATR); X-ray, XPS, NEXAFS, XANES based techniques.
- ultraviolet, visible or infrared spectroscopy Raman spectroscopy and "Surface Enhanced Raman Spectroscopy”
- nucleic acid refers to a sequence of deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA) or peptide nucleic acid (PNA), of length equal to or greater than 2 nucleotides (DNA or RNA) or 2 nucleotide bases attached to their corresponding skeleton (PNA) (abbreviated as nt) which can be single chain or double chain.
- DNA deoxyribonucleic acid
- RNA ribonucleic acid
- PNA peptide nucleic acid
- peptide nucleic acid refers to a molecule structurally analogous to DNA in which the structural skeleton is a polymer of a peptide nature formed by polymerization of N- (2- aminoethyl) glycine, to which the nucleic bases are linked by methylenecarbonyl bonds.
- recombinant antibodies or “mini antibodies” refers to fragments derived from antibodies constructed by recombinant DNA technology, and which, despite their smaller size, retain the antigen binding capacity since maintain at least one immunoglobulin variable domain
- Fab where the antigen binding zones reside.
- the mini-antibodies may belong, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: Fab, F (ab ') 2, scFv, and recombinant monodomain antibodies.
- recombinant monodomain antibodies and / or immunoglobulin-like domains with independent binding and recognition capability are understood, both to the heavy chain variable domains (VH), to the light chain variable domains (VL) , to recombinant camelid (VHH) antibodies, recombinant humanized camelid antibodies, recombinant antibodies of other camelized species, IgNAR monodomain antibodies of cartilaginous fish; that is, both domains that are naturally monodomain (case of VHH and IgNAR) are included, as antibodies that have been altered by genetic engineering so that by themselves they are able to interact with the antigen and improve its stability and solubility properties .
- a particular embodiment of the invention is the biosensor nanoparticle of the invention in which the magnetic nanoparticle is constituted by cobalt ferrite, the silica layer is functionalized with amino groups and thiol groups, the metal layer is gold, and the immobilized biomolecule it is a modified PNA at one of its ends, said modification consisting in the insertion of a thiol group at said end (see Example 1.1).
- biosensor nanoparticle in which the magnetic nanoparticle is cobalt ferrite, the silica layer is functionalized with amino groups and thiol groups, and the metal layer is formed by a silver layer and successively another of gold, and the immobilized biomolecule is a modified PNA at one of its ends, said modification consisting in the insertion of a thiol group at said end (see Example 1.4).
- the biosensor nanoparticle of the invention can be mass, that is, it does not have a magnetic core or a silica layer and is formed solely by a metal core.
- a preferred aspect of the present invention is the process of the invention in which the magnetic particle is constituted, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, by the following groups of magnetic materials, oxidized or not, respectively or by any combination thereof: i) iron oxide, such as magnetite (FesCU) and its oxidized form, maghemite ( ⁇ -Fe 2 ⁇ 3 ), or an iron-cobalt oxide such as cobalt ferrite (CoFe 2 OR 4 ), ii) non-oxidized magnetic materials such as iron-platinum (FePt).
- iron oxide such as magnetite (FesCU) and its oxidized form, maghemite ( ⁇ -Fe 2 ⁇ 3 )
- an iron-cobalt oxide such as cobalt ferrite (CoFe 2 OR 4 )
- non-oxidized magnetic materials such as iron-platinum (FePt).
- the iron and cobalt oxide is cobalt ferrite (see Example 1), magnetite (FesCU) or its oxidized form (P-Fe 2 Os) •
- a more preferred aspect of the invention is a process of the invention in which the conditioning of step b) of the process of the invention is carried out with tetramethylammonium hydroxide.
- An even more preferred aspect of the present invention is a process of the invention in which the silica coating of step c) of the process of the invention is carried out by treatment with a sodium silicate solution.
- the thickness of the silica layer of step c) of the process of the invention may vary depending on the size of the desired nanoparticles.
- another embodiment of the present invention is a process of the invention that additionally comprises the following stage: c2) an extension of step c) after treatment with sodium silicate, promoting further growth of the silica layer with tetraethoxy orthosilicate .
- a preferred embodiment of the present invention is the process of the invention in which the chemical functionalization of the surface of step d) of the process of the invention is carried out with a reagent of the corresponding trialkoxy silane type, by way of illustration and without limit the scope of the present invention to the following group of compounds: ⁇ -aminopropyl triethoxysilane, ⁇ -mercaptopropyl trimethoxy silane or a mixture of both.
- any molecule of the trialkoxy silane type or different molecules with this structure can be introduced simultaneously, thereby obtaining the desired functionalization.
- Another particular embodiment of the process of the invention is a process in which the metallic layer of e) of the process of the invention is made from a metal, belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: gold (Au), silver (Ag), copper (Cu) or platinum (Pt), or an alloy formed by several or all of these metals, for example Au / Ag or Au / Cu.
- a metal belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: gold (Au), silver (Ag), copper (Cu) or platinum (Pt), or an alloy formed by several or all of these metals, for example Au / Ag or Au / Cu.
- the metal nanoparticles of step e.i) are gold nanoparticles that are prepared by the reduction of HAUCI4 dissolved in basic water with tetrakis (hydroxyphenyl) phosphonium chloride.
- the nanoparticles of stage d) are mixed with those of stage e), so that the metal nanoparticles are in excess.
- the growth of a gold layer mentioned in step e.iii) of the process of the invention is carried out by reduction on the nucleation seeds in successive stages of Au 3+ with hydroxylamine hydrochloride.
- the growth of a gold layer mentioned in step e.iii) of the process of the invention is carried out by the reduction on the nucleation seeds in successive stages of Au 3+ with formaldehyde.
- the growth of a metal layer of step e.iii) of the process of the invention consists in the generation of a gold / silver alloy that is made by reduction on the seeds of nucleation in successive stages of Ag + with formaldehyde in the presence of ammonia (see example 1.2).
- Another particular object of the invention is the process of the invention in which the biosensor molecule immobilized in step f) of the process of the invention belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, of one of the following sets: a) natural biomolecules: single or double stranded nucleic acids (DNA or RNA), enzymes, antibodies, membrane proteins, heat shock proteins, chaperonins, other proteins, monosaccharides, polysaccharides, glycoproteins, fatty acids, terpenes, steroids, other molecules of a lipidic nature, lipoproteins, hormones, vitamins, metabolites, hydrocarbons, thiols, natural molecules with antibiotic or antiviral activity, or macromolecular aggregates composed of proteins and / or nucleic acids or other combinations of the aforementioned molecules; b) natural biomolecules obtained by in vitro selection procedures: aptamers, ribozymes, aptazymes; c) artificial biomolecules: PNAs, other analogs of natural nucle
- said biosensor molecule includes a functional group, both in the structure of the molecule itself and as a result of the synthetic addition of said group, with the ability to accept belonging electronic density, for illustrative purposes and without limiting the scope of the present invention, to the following list: amino groups, thiol groups, disulfide groups, di-alkyl sulfides, epoxy groups, as well as amines and alcohols in platinum.
- Another particular aspect of the invention is the process of the invention in which the biomolecule immobilized in step f) of the process of the invention is a peptide nucleic acid molecule (PNA).
- PNA peptide nucleic acid molecule
- the biosensor molecules for example PNA molecules
- This detection specificity can be so high as to discriminate between two target DNA molecules that differ in a single mutation or genetic polymorphism (SNP). Therefore, such immobilized biomolecules can detect the existence of said DNA chains in a sample using appropriate methods, which allows their application in different sectors industrial mainly in human and veterinary biomedicine, food and environmental control.
- a third aspect of the present invention is the use of the various applications of the biosensor nanoparticle of the invention by way of illustration, in at least one of the following aspects: i) detection of pathogens of viral, bacterial, fungal type or protozoan, ii) characterization of mutations or genetic polymorphisms (SNPs) in said agents that can make them resistant to drugs or facilitate the escape to vaccines, iii) characterization of mutations or SNPs in human or animal genes, related to diseases or prone to them, iv) detection of specific tumor markers. v) detection of specific microorganisms, pathogens or contaminants in food, vi) detection of the presence of genetically manipulated organisms (GMO) or transgenic in food, and vii) detection of microorganisms or toxins polluting the environment.
- GMO genetically manipulated organisms
- biosensor nanoparticles of the present invention can also be used for the elaboration of a microarray or microarray in which each point of the microarray could be constituted by a biosensor nanoparticle of the present invention directed to a certain biological element (for example, a nucleic acid with a certain sequence).
- a certain biological element for example, a nucleic acid with a certain sequence.
- Biosensor consisting of a series of biosensor nanoparticles of the present invention arranged on a microarray or microarray type surface.
- a fourth aspect of the present invention is an assay for the determination of hybridization, binding or interaction of a biological molecule to the immobilized molecule in a biosensor nanoparticle of the invention, hereinafter hybridization determination assay of the invention, which comprises the following steps: i) reaction of the biosensor nanoparticle of the invention with a sample capable of containing the candidate biological molecule, which may or may not have sequences complementary to the immobilized organic biomolecule, under conditions suitable for hybridization, ii) capture of the Biosensor nanoparticles by magnetic sedimentation, and iii) determination of hybridization, or not, occurred in i).
- a particular embodiment of the invention is a biosensor nanoparticle that has on its surface PNAs as immobilized biosensor molecule of section i) of the hybridization determination test, and where the object of hybridization is a candidate biological molecule consisting of an acid natural nucleic (DNA or RNA). Therefore, another particular aspect of the present invention is the use of the biosensor nanoparticle of the invention in which the determination of hybridization or not in step i) of the hybridization determination test consists of hybridization between a molecule of immobilized PNA in the biosensor nanoparticle and a DNA molecule present in a test sample.
- Another particular embodiment of the invention is a biosensor nanoparticle that has on its surface natural antibodies, artificial antibodies, recombinant antibodies or mini-antibodies as immobilized biosensor molecule of section i) of the hybridization determination test, and where the object of hybridization or binding it is the antigen that said antibody specifically recognizes.
- the antigen must have different functional groups in its molecular structure from those of the protein that acts as an antibody, so that its detection is possible by spectroscopic or electrochemical techniques.
- Said specific functional groups of the antigen and not present in the protein may be, by way of illustration and without limiting the scope of the invention: aliphatic hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, heterocycles, D-amino acids, functional groups containing nitrogen, sulfur, phosphorus or metals forming coordination links.
- Another particular embodiment of the invention is a biosensor nanoparticle that has on its surface, as an immobilized biosensor molecule in section i) of the hybridization determination test, aptamers, ribozymes, aptazymes or other nucleic acids to which by in vitro selection procedures they have been endowed with (or enriched in) the ability to recognize specific ligands and specifically bind to them.
- the ligand whose binding can be detected must have in its molecular structure functional groups different from those of the nucleic acid that acts as a biosensor molecule, that is to say, any group other than the following: ribose, deoxyribose, phosphate, pyric nitrogen or pyrimidine base.
- Said specific functional groups of the ligand can be, by way of illustration and without limiting the scope of the invention: aliphatic hydrocarbons, aromatic hydrocarbons, heterocycles, D-amino acids, other functional groups containing nitrogen, sulfur, phosphorus or metals forming coordination bonds .
- a preferred embodiment of the present invention is a method of detecting the hybridization of step iii) of the hybridization or binding determination test carried out by spectroscopic detection.
- the measurement of spectroscopic detection can be carried out by ultraviolet radiation. More preferably the spectroscopic measurement can be carried out by infrared radiation.
- hybridization detection is performed by Raman spectroscopy.
- Raman's technique and infrared (IR) measure the vibrational energy of the molecules in the same region of the electromagnetic radiation spectrum, although both techniques detect different phenomena that happen with chemical bonds. The difference is that the IR provides the signal of the polarity changes of the excited link according to one or another vibration, and the Raman provides the polarization change that the link undergoes.
- the spectroscopic measurement will provide a series of absorption bands
- these bands are those that correspond to the skeleton on which the nucleic bases are arranged, which as already mentioned in the case of the PNA is a peptide chain, and for natural nucleic acids (DNA and RNA) it is of the sugar-phosphate type (2-deoxyribose or ribose, respectively, linked by phosphodiester bonds).
- a particular embodiment of the invention is a method of spectroscopic detection of the hybridized nucleic acid on the nanoparticle in the infrared region that is carried out by a method, by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, belonging to the following group: a) by using infrared equipment, measuring the absorption of nanoparticles by transmission b) by using infrared equipment, measuring the absorption of nanoparticles by total attenuated reflection (ATR) c) by using infrared equipment, measuring the absorption of nanoparticles in the flush angle mode.
- a method by way of illustration and without limiting the scope of the present invention, belonging to the following group: a) by using infrared equipment, measuring the absorption of nanoparticles by transmission b) by using infrared equipment, measuring the absorption of nanoparticles by total attenuated reflection (ATR) c) by using infrared equipment, measuring the absorption of nanoparticles in the flush angle mode.
- the infrared equipment used in section a) above is a desktop set located in a laboratory, integrating the Fourier Transform (FT) technique for spectrum resolution, and using transmission windows of barium fluoride, calcium fluoride or other type of window transparent to infrared radiation, by way of example and not limited to: potassium bromide, potassium chloride, sodium chloride or sodium bromide.
- FT Fourier Transform
- infrared radiation transparent windows can adopt a flow configuration through which successive samples can be analyzed continuously.
- the infrared equipment used in section a) above is a portable device for the analysis in field samples, it can be a Fourier Transform equipment or on the contrary present a dispersive system of continuous irradiation and Detector limited to frequencies of interest.
- the flow configuration in the infrared equipment used in section b) above, in the mode of attenuated total reflection (ATR) the flow configuration can be adopted with or without application of an external magnetic field that allows maintaining positioned the magnetic nanoparticles in the cell.
- the infrared equipment used in section b) above by means of the attenuated total reflection mode (ATR) in the flow configuration can be used the cell with external and thermostatted magnetic field. In this way, a temperature ramp can be applied and the effect of this temperature on the stability of the hybridization between the immobilized PNA probe on the nanoparticle and the target nucleic acid (DNA or RNA) can be studied.
- the infrared equipment used in section b) has a zinc selenide window, which can be replaced by any other glass suitable for the ATR technique.
- the appropriate crystal for ATR technique may be coated by a thin film of gold or silver.
- the biosensor nanoparticles containing PNA probes can be arranged regularly in discrete areas of a surface and after the hybridization step be analyzed. by infrared microscopy individually or in microarray arrangement.
- the outer metallic layer that the nanoparticles present gives them another property: they are able to conduct electricity along their surface. This gives them the character of nanoelectrodes, being able to transmit an electrical signal in solution to an electrode on which the magnetic particles are confined by gravity or by the influence of an external magnetic field.
- nanoparticles containing immobilized PNA probes are allowed to react with the solution where the nucleic acid molecules are presumably found with complementary sequences to said PNA.
- step ii) of the hybridization determination test of the invention the nanoparticles with the hybridized nucleic acid are recovered and incubated in a solution containing a redox compound, that is, with different properties in their oxidized state and in their reduced state Said redox compound, in its oxidized state has a positive net charge while in its reduced state it has no charge.
- redox mediators belong, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: the thionine compound, the blue methylene compound, the osmium bipyridyl compound or the benzyl violgene compound .
- the thionine compound the blue methylene compound
- the osmium bipyridyl compound the osmium bipyridyl compound or the benzyl violgene compound.
- redox mediators are electrostatically adsorbed on the DNA strands hybridized on complementary PNA chains.
- said redox mediators lose their electrical charge and thereby their electrostatic affinity for DNA, so they diffuse to the medium and can be detected electrochemically.
- a particular embodiment of the present invention is a method for the determination of the hybridization of iii) by electro-analytical techniques known as dynamic.
- the dynamic techniques belong to the category of electrochemical techniques of controlled potential, being included, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: chronoamperometry and cyclic and / or linear voltammetry. As it is accepted by any expert in the field, the scanning or pulse modalities and the stationary or rotary electrode are variable of these techniques.
- the dynamic techniques belong to the category of electrochemical techniques of controlled current, small amplitude, or large amplitude. These include, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, chronopotentiometry and coulombimetry.
- voltammetric techniques belong to the category of "stripping" and its variants: linear scan, differential pulse, differential linear scan of square wave.
- variants of electroanalytical techniques can be performed, instead of with metal nanoparticles, with metal electrodes to support PNA probes.
- These electrodes can be shaped, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, of: discs, wires, rings, spheres or spheroids.
- Example 1.1 - Gold biosensor nanoparticles.
- the initial object of this exemplary embodiment is to prepare a magnetic suspension composed of cobalt ferrite nanoparticles (CoFe2 ⁇ 4) of uniform size, coated with a thin layer of silicon functionalized with amino groups, plus a final coating with a gold layer (such as outlined in the figure 1) on which the thiolated PNA molecules will be chemisorbated as an example of a biosensor molecule.
- the silicon coating takes place on the magnetic nanoparticles individually, and the coating of several magnetic cores can also be obtained simultaneously.
- the nanoparticles thus prepared fulfill the desired properties: that they are stable in suspension for a long period of time, but that in the presence of a sedimentary magnetic field. Furthermore, by removing said magnetic field, the nanoparticles must be redispersed by applying gentle agitation.
- These nanoparticles are synthesized by coprecipitation of Fe 3+ and Co 2+ in boiling alkaline solution by the Wagner method (Wagner et al., 2002).
- the nanoparticles thus obtained have an isoelectric point of approximately 8.5, which makes them quite unstable in aqueous solutions with a pH between 7 and 10.
- the next step is to coat this ferrofluid with a layer of silica, which can be lowered to 3 the isoelectric point of the nanoparticles making them stable in solution at neutral pHs.
- the silicon layer allows, in turn, to subsequently insert functional groups to work on the surface of the nanoparticles.
- the silicon coating of the nanoparticles is done as follows: 30 mL of the cobalt ferrite ferrofluid previously synthesized are taken and diluted to 150 mL with water. Then 500 ⁇ L of tetramethylammonium hydroxide (TMA) is added, raising the pH to 11.5-12, and taken to the reaction flask. Then 100 mL of sodium silicate in 0.50% solution is prepared, and with the Dowex W X8 resin previously activated lowers the pH to 10.5, after which it is filtered with filter paper to remove the ion exchange resin.
- TMA tetramethylammonium hydroxide
- the flask with the ferrofluid is heated to a boil with a reflux system, and the 100 mL of sodium silicate is added over 2 hours, drop by drop during the first hour and a half with the help of a peristaltic pump.
- the volume must be kept constant, so that some steam is gradually released if necessary.
- a reaction based on the Stóber method Wang et al., 1996), a condensation of siloxane groups between the silane groups of ⁇ -aminopropyltriethoxysilane (APTES) is used to introduce the amino group on the surface of magnetic nanoparticles already coated with silica ) and the silica layer deposited in the previous stage on the ferrofluid.
- APTES ⁇ -aminopropyltriethoxysilane
- the relevant amount of absolute ethanol with 1% ammonia, the 1.5% ferrofluid and the APTES in 1 millimolar concentration (mM) are placed in a reaction flask, and allowed to stir gently, at 400 revolutions per minute (rpm) ) and with a glass rod, until the next day.
- the particles are magnetically sedimented and washed with ethanol, redispersing them after two washes in a volume equal to the original amount of ferrofluid. This requires a short dive (between 15 and 20 seconds) in an ultrasonic bath.
- gold nanoparticles were synthesized following the method of reducing a gold salt (III) described by D. Duff and A. Baiker (Duff and Baiker, 1993).
- a basic solution with final concentrations rtiM of NaOH, 1 rtiM of the reducing agent [tetrakis- (hydroxyphenyl) phosphonium chloride, (THPC)] and 1 rtiM of HAUCI4 was prepared.
- these compounds are added under stirring at 600 rpm, in that order and in the volumes corresponding to the final amount to be prepared.
- After formation of the colloid which happens a few seconds after adding the gold salt, it is filtered with a Whatman filter of cellulose nitrate with a pore size of 450 nm, and stored.
- the gold nanoparticles are immobilized by self-assembly to these functional groups, taking advantage of the well-known affinity of these groups for gold, producing a chemisorption.
- the presence of gold nanoparticles together with the functionalized magnetic nanoparticles leads to the surface decoration of the latter with the first ones, each magnetic nanoparticle being covered by several gold nanoparticles.
- These gold nanoparticles are the seed to reduce metals on the surface, promoting the growth of a layer of gold or silver over the nanoparticle.
- both dispersions - functionalized cobalt ferrite ferrofite and gold nanoparticles - are at basic pH, both colloids can be mixed without subsequent flocculation problems during self assembly. Initially, equal amounts of both fluids are added and after homogenization by vortexing the mixture is allowed to react for two hours. Then, the nanoparticles are sedimented magnetically and it is checked by spectrophotometry if there are gold nanoparticles in the supernatant.
- the final size of the biosensor nanoparticles produced in the present example is between 50 and 80 nm in diameter, as can be verified by transmission electron microscopy ( Figure 2).
- the magnetic particles that constitute the nucleus of the nanoparticles are 18 + 3 nm, and the thickness of the silica layer is between 1 and 15 nm.
- Example 1.2 Synthesis of gold / silver alloy biosensor nanoparticles.
- the process of obtaining nanoparticles coated by an Au / Ag alloy is based on the reduction of the silver ion on the magnetic nanoparticles decorated with gold nanoparticles obtained as indicated in section 1.1.
- 500 ⁇ L of the ferrofluid decorated with gold particles, 400 ⁇ L of 0.5 M glycine, 600 ⁇ L of water (of milli-Q purity), 20 ⁇ L of 12 rtiM AgNO 3 and 100 ⁇ L of 10 mM ascorbic acid are placed. This solution is left at room temperature and in darkness for 6 hours, the nanoparticles are washed by magnetic sedimentation three times, resuspended in 500 ⁇ L of water each time, and the process is repeated (Huang et al., 2004).
- the immobilization of the PNA molecules is performed as will be detailed in Example 1.4.
- Example 1.3 Synthesis of biosensor nanoparticles of gold, silver and gold.
- gold nanoparticles are synthesized according to the method described in section 1.1.
- the gold nanoparticles are placed in the presence of the functionalized magnetic nanoparticles, and the suspension is acidified so that the gold is immobilized on the ferrofluid, for at least one hour. It is then washed and when resuspended in 5 mL of water, the pH is increased to 11 with NaOH IN. At that point, when attracting with a magnet there is no gold left in the solution.
- the method consists of drinking 9 mL of water with a concentration of 0.15 rtiM of AgNO 3 and adding 500 ⁇ L of the gold-decorated magnetic nanoparticles. Then 50 ⁇ L of 37% formaldehyde is added, vortexed rapidly and 50 ⁇ L of 25% NH 3 is immediately poured. It is stirred again, and after two minutes it settles magnetically. Plasma of the supernatant is measured, and after washing twice, that of the nanoparticles. These measurements are made at all stages of the coating, until it is seen that the plasmon of the silver extends along the entire visible range, at which point the silver layer is considered to be practically closed.
- the silver layer is in turn coated with gold by the method described in Example 1.1., resuspended to a higher dilution: 0.3 mg / itiL instead of 3 mg / itiL.
- the end result is that the nanoparticles acquire a much greater stability in solution, and are not added.
- Three gold plating stages are placed under the following conditions: 5 mL of nanoparticles at 0.3 mg / mL, 50 ⁇ L of 25 rtiM HAUCI4 and 80 ⁇ L of 100 mM NH 2 OH-HCl, under stirring in the vortex. It is washed twice, and the coating steps are followed with the variation of the surface plasmon resonance band. It is observed how the band grows at 520 nm, and the maximum moves towards longer wavelengths, indicating the progression of the coating. When the nanoparticles are coated 10 times more diluted, as it is in this case, their surface stability is much greater.
- Example 1.4 - Immobilization of PNA on biosensor nanoparticles with an outer layer of gold or silver.
- a biosensor molecule is immobilized.
- an organic molecule type PNA has been used, which gives the biosensor nanoparticle of the invention the functionality of being able to hybridize to natural nucleic acids (DNA or RNA) with sequences complementary to those of the PNA.
- the outer gold layer of the nanoparticles has some supporting properties, and thiolated compounds can be chemisorbed on it.
- the PNAs to be immobilized on the nanoparticles have at one end a thiol group contributed by a cysteine (Cys), so that they will form monolayers oriented PNA strands, as the inventors have previously demonstrated with crystals of gold (Briones et al., 2004; 2005).
- Cys cysteine
- two different single chain PNA molecules have been employed, both with a cysteine at its amino terminus.
- the PNA molecules have two "0" type spacer groups that correspond to 8-amino-3, 6-dioxaoctanoic acid molecules, and together form a 3 nm long spacer that allows separation the end of the molecule immobilized on the nanoparticle of the sensor region capable of hybridizing to nucleic acids.
- the first PNA molecule used is called "PG", it has 11 nucleotide bases in length and its sequence (written from the amino end to the carboxyl end) is: Cys-OO-SEQ ID No. 1.
- the second PNA sequence is called "PM” and its sequence (9 nucleotide bases in length) is: Cys-O- O-SEQ ID No. 2.
- This sequence has been chosen due to its biosanitary relevance, since it includes the sequence complementary to codon 41 of the reverse transcriptase (RT) region of the pol gene of the human immunodeficiency virus (HIV), a position in which the frequent occurrence of the M41L mutation involved in the resistance of HIV to antiviral drug called Zidovudine (AZT) (Yeni et al., 2002).
- the nanoparticles already decorated with PNA are concentrated under the action of a magnetic field and the adsorption of the PNA molecules is checked by infrared transmission spectroscopy (dashed line in Figure 3). This spectrum of PNA on the nanoparticle will be considered the "blank" in subsequent experiments of hybridization of the nanoparticles to DNA of a sample, as set forth in Example 2.
- Example 2 Hybridization of the gold and PNA coated nanoparticle biosensor to a DNA molecule with sequence complementary to that of the PNA. Determination by increasing the intensity of the infrared absorption bands due to the hybridization of the DNA with the PNA.
- PNA protein binds to RNA
- DNA deoxyribose
- RNA ribose groups
- phosphate phosphate
- the PNA lacks phosphate groups and glycidic rings, which offers a special utility in the design of biosensors for the detection of DNA or RNA hybridization.
- our biosensor system is applied in animal and human biosanity, both for the detection of DNA / RNA sequences characteristic of pathogenic viruses and to determine whether such sequences inform about the existence of a viral population capable of evade the immune system, escape vaccines or be resistant to antiviral drugs.
- the DNA sequences of the other family are used as a non-hybridization control, that is, those hybridizations that should not occur (or, if they occur, should be thoroughly washed) since the complementarity of the PNA / DNA sequence is negligible (for example, the "PG" PNA with the "DNA-M” and "DNA-L” DNAs).
- DNA-GM 5'- SEQ ID N ° 7 -3 '(parallel hybridization with "PG” and antiparallel with “PM”)
- DNA-MG 5'-SEQ ID N ° 8 -3' (antiparallel hybridization with "PG” and parallel with “PM”). Therefore, each of these two DNA molecules can hybridize with the two PNAs that cover different nanoparticles.
- the hybridization of the nanoparticles coated with PNA and the DNA is carried out for 1 hour, at temperatures between 41 and 58 ° C, with DNA concentrations of 100 ⁇ M, and followed by a two cycle wash of 15 minutes at temperatures between 37 and 50 ° C.
- the infrared spectrum obtained after hybridization and washing of the biosensor nanoparticles with gold metallic coverage and Coated by PNA type "PG" with the "DNA MG” is shown in continuous line in Figure 3. It shows that after hybridization between PNA and perfectly complementary DNA, peaks corresponding to the phosphate groups of the DNA, as a signal that clearly indicates the hybridization event produced, at a frequency of 1220 and 1060 cm "1 .
- Example 3 Hybridization of the gold and PNA coated biosensor nanoparticle to a DNA molecule with sequence complementary to that of the PNA. Cyclic vocamograms of the thionine incorporated through ionic interactions with the phosphate residues of the DNA strands.
- the process indicated in Example 2 has been carried out, but using a different hybridization detection technique. Cyclic voltamograms have been obtained using flat gold electrodes modified with the PNA molecules indicated in Example 1.4, subsequently incubated with different concentrations of complementary DNA. In this case, after hybridization and washing, the hybridized nanoparticles are incubated with a thionine solution and subjected to cyclic volametry in the presence of peroxidase and H2O2.
- Figure 5 shows the currents obtained using nanoparticles functionalized with the "PM” PNA, in a concentration range of "M-DNA” between 10 "14 and 10 " 6 M. Subsequent increases in sensitivity are obtained by decreasing the reaction volume, which results in detection sensitivities of 10 ⁇ 16 M of DNA, that is, 0.1 femtomolar.
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Abstract
La invención se refiere al campo de los biosensores, en concreto a nanoparticulas biosensoras compuestas por un núcleo magnético, una capa de sílice, una o varias capas externas metálicas que puedan ser de distinta naturaleza y depositadas con distinta alternancia e inmovilizadas en su superficie externa, así como una capa de moléculas biosensoras orgánicas o inorgánicas, sintéticas o de origen natural con capacidad de unirse a biomoléculas. La invención también describe el procedimiento de obtención de las nanoparticulas biosensoras así como las diversas aplicaciones de éstas.
Description
Titulo
NANOPARTÍCULA BIOSENSORA, PROCEDIMIENTO DE ELABORACIÓN Y SUS APLICACIONES
Sector de la técnica
La presente invención se refiere al campo de los biosensores, en concreto a la utilización de sondas de ácidos nucleicos peptidicos (PNAs) inmovilizadas sobre nanoparticulas para la detección de la hibridación de ácidos nucleicos naturales (DNA o RNA) de secuencias especificas. En particular, las nanoparticulas están compuestas de un núcleo magnético y una capa externa de carácter metálico, sobre la que se inmovilizan las sondas pertinentes con secuencias de bases complementarias a la diana objeto de identificación y detección. Se aprovechan las propiedades magnéticas, eléctricas y ópticas de las nanoparticulas para mejorar el método, centrándose en la diferencia de señal magnética, óptica o eléctrica que se obtiene de dichas nanoparticulas antes y después de la modificación que supone un ensayo de hibridación positivo. El tipo de ensayos al que se refiere la presente invención pueden ser también llevado a cabo espectroscópicamente sobre superficies metálicas macroscópicas.
Antecedentes de la invención
Desde que en 1953 Watson y Crick publicaran la estructura en doble hélice del DNA, y con ello quedara inaugurada la era de la biologia molecular (Watson y Crick, 1953) , los avances de la ciencia en materia de genética, genómica y biotecnologia han sido espectaculares. Una de las aplicaciones analiticas más extendidas del DNA consiste en la detección de otras moléculas de DNA o RNA con secuencias complementarias concretas, dada la especificidad de unión existente entre nucleótidos a través de sus bases
nucleotidicas, lo que se conoce como regla de paridad de Watson-Crick: adenina (A) con timina (T), y guanina (G) con citosina (C) . Asi, una determinada secuencia formada por un cierto número de nucleótidos llega a ser única dentro del genoma de una o más especies, y de esta forma dicha secuencia es utilizable para detectar y caracterizar la presencia del organismo que la posee. Dado el desarrollo tecnológico actual, es incluso posible detectar la presencia de un organismo, cepa o variante que difiere tan sólo en un nucleótido respecto de otras variantes, lo que permite por ejemplo diferenciar entre dos mutantes de un mismo microorganismo.
En el ámbito de la biotecnologia ha supuesto un avance importante el desarrollo de la tecnologia de microarrays, también llamados chips o microchips (Southern y col., 1994; revisiones en Nature Genetics 21, suplemento, 1999; Harris, 2005) , según la cual miles de sondas moleculares, principalmente ácidos nucleicos o proteinas, se pueden fijar covalentemente a un soporte sólido (vidrio, nitrocelulosa, nylon etc.) Mediante microarrays de DNA se pueden realizar experimentos de expresión génica, estudios de polimorfismos de nucleótidos (SNPs) , minisecuenciación y tipado de microorganismos. Esta técnica explota la metodologia experimental desarrollada por E. Southern (Southern, 1975) , según la cual los ácidos nucleicos (tanto cadenas largas como oligonucleótidos cortos) se pueden fijar a un soporte sólido y formar hibridos estables con sus complementarios marcados radiactiva o fluorescentemente. La estabilidad de los hibridos viene determinada por el grado de complementariedad de la secuencia de nucleótidos y por factores externos tales como la fuerza iónica del medio, el pH o la temperatura. (Parinov y col., 1996; Hacia, 1999; Relógio et al., 2002).
En biotecnología también ha resultado relevante el uso de moléculas análogas de los ácidos nucleicos naturales para diversas aplicaciones. Dentro de dichas moléculas, es particularmente interesante el caso de los ácidos nucleicos peptídicos ("Peptide Nucleic Acids", abreviados como PNA) descritos por vez primera por Nielsen y colaboradores en 1991 (Nielsen y col., 1991) . El PNA consiste en un polímero cuyo esqueleto es de naturaleza peptídica, a diferencia del esqueleto de azúcares y fosfatos característico de los ácidos nucleicos naturales (DNA y RNA) . El esqueleto del PNA está formado por unidades de N- (2-aminoetil) glicina unidas por enlaces peptídicos, es aquiral, eléctricamente neutro y carece de átomos de fósforo (Egholm y col., 1992; Egholm y col., 1993) . Al esqueleto del PNA están unidas, mediante enlaces metilencarbonilo, las bases nucleotídicas púricas (A y G) y pirimidínicas (C y T) , en una conformación tal que puedan interaccionar exactamente con las bases nucleotídicas de los ácidos nucleicos naturales .
El PNA se caracteriza por su capacidad para hibridarse de manera estable y especifica con DNA complementario, de acuerdo con las reglas de paridad de bases de Watson-Crick (Egholm y col., 1993) . De hecho, los PNAs de cadena sencilla (ssPNA) presentan mayor afinidad por el ssDNA complementario que el propio ssDNA de secuencia igual a la del PNA. Esto se debe principalmente al carácter eléctricamente neutro del PNA, que evita fenómenos de repulsión entre cadenas presentes en la interacción DNA-DNA (Nielsen y col., 1991; Wittung y col., 1994). La alta afinidad del PNA por el DNA permite incluso la hibridación de ssPNA a DNA de cadena doble (dsDNA) mediante un proceso denominado "invasión de hebra" (Demidov y col., 1995; Nielsen, 2001; Demidov y col., 2002) y permite usar sondas de PNA para inducir recombinación y/o bloqueo específico de genes concretos (Rogers y col., 2002) . Además, la
interacción del PNA al DNA es muy especifica, y prácticamente para todos los pares de bases que pueden formarse, la diferencia en estabilidad térmica entre el apareamiento correcto y el incorrecto es mayor en un dúplex PNA-DNA que en el dúplex DNA-DNA (Egholm y col., 1993). Por tanto, la diferencia de temperatura entre aquélla a la que se produce un apareamiento completo y aquélla en la que una de las bases está desapareada es mayor en el caso PNA-DNA que en el DNA-DNA. Con ello, un biosensor basado en sondas inmovilizadas de PNA será potencialmente más eficiente que otro basado en DNA para la detección de mutaciones y SNPs en una molécula de ácido nucleico diana.
Dada la estructura de su esqueleto peptidomimético artificial, el PNA no es sensible a la acción de enzimas biodegradadoras naturales como DNasas, RNasas o proteasas, por lo que su estabilidad biológica es mucho mayor que la del DNA o RNA. (Nielsen, 1999) . Finalmente, la insensibilidad del PNA a las variaciones de pH o de fuerza iónica hacen que posea también mucha mayor estabilidad quimica y ofrezca mayores posibilidades experimentales para su hibridación a distintas moléculas en diferentes composiciones del medio (Egholm y col., 1993; Kambhampati y col., 2001) . Por todo ello, es evidente el interés que posee aprovechar las peculiaridades fisico-quimicas del PNA para su uso en sistemas de detección y cuantificación de ácidos nucleicos naturales .
Algunos de los cambios fisico-quimicos asociados a la hibridación PNA/DNA o PNA/RNA son obvios . Uno de ellos es el aumento de masa que conlleva este apareamiento; a este respecto se han desarrollado biosensores de PNA/DNA (RNA) que utilizan la microbalanza de cristal de cuarzo como instrumento muy sensible para la detección de los pequeños cambios de masa que tienen lugar tras la hibridación entre secuencias complementarias (Wang y col., 1997) o bien la
espectrometría de masas en la modalidad MALDI-TOF (Griffin y col., 1997; Arlinghaus y col., 2003; Brandt y col, 2003).
Además, se han desarrollado otros sistemas de detección de la hibridación entre una sonda de PNA y la diana de DNA que basan la detección de la hibridación en la aparición de una señal de fósforo, puesto que este elemento no está presente en la cadena de PNA pero sí forma parte del esqueleto de las cadenas del DNA (o RNA) diana. Esta posibilidad se ha puesto de manifiesto Arlinghaus y colaboradores con la técnica SIRIMP (Sputter-Initiated Resonance Ionization Microprobe Phosphorous Image) (Arlinghaus y col., 1997). Resultados análogos han sido obtenidos por parte de los inventores de la presente invención utilizando la técnica de Espectroscopia de Fotoemisión de Rayos X (XPS) en sondas de PNA inmovilizadas sobre placas planas con una superficie de oro, antes y después de la hibridación a dianas de DNA complementarias . Mediante XPS se ha observado que con la hibridación (y tras el correspondiente lavado en condiciones controladas para evitar la unión inespecífica de la diana) se produce un incremento de entre 2 y 4 veces en la señal de nitrógeno
(pico de fotoemisión correspondiente al NIs, normalizado al pico Au4f del sustrato) , y la aparición de una señal de fósforo (pico P2p normalizado a Au4f) que no existía en el PNA (Briones y col., 2004; Briones y col., 2005).
La realización de muchos de estos ensayos en fase homogénea presenta numerosas dificultades debido a lo extremadamente diluidas que habitualmente están las moléculas diana de DNA o RNA en las muestras naturales, por lo que suele realizarse la reacción de hibridación sobre superficies en las que se ha inmovilizado previamente la molécula sonda de PNA. Esto representa una limitación del ensayo ya que la cantidad de sonda se limita a una capa de moléculas de PNA sobre la superficie en cuestión, con la
que forzosamente debe ponerse en contacto la muestra a analizar para dar una señal positiva. Con ello, la sensibilidad y el limite de detección de estas técnicas es también limitado. Llegados a este punto, el uso de nanoparticulas, y en particular nanoparticulas magnéticas, supone un salto muy significativo, ya que una pequeña cantidad de nanoparticulas magnéticas puede ser resuspendida en grandes volúmenes de muestra y ser recuperada posteriormente mediante la aplicación de un campo magnético externo. Asi, es posible purificar y/o pre-concentrar cantidades muy minoritarias y diluidas del DNA diana que especificamente se hibrida con el PNA inmovilizado sobre las nanoparticulas, con lo que se reduce el limite de detección en gran medida. Este tipo de sistemas permite determinar la presencia de secuencias de DNA concretas de interés en situaciones donde una detección precoz de la misma puede ser critica, por ejemplo para evitar los efectos perjudiciales que tuviera la existencia de las especies o cepas de organismos que poseen dichas secuencias caracteristicas . Este hecho posee gran aplicación en biomedicina humana y veterinaria, entre otros en los siguientes aspectos: i) detección de patógenos de tipo viral, bacteriano, fúngico o protozoario; ii) caracterización de mutaciones o polimorfismos genéticos
(SNPs) en dichos agentes que pueden hacerlos resistentes a fármacos o facilitar su escape al sistema inmune o a vacunas; iii) caracterización de mutaciones o SNPs en genes humanos o animales, relacionados con enfermedades o con propensión a ellas; iv) detección de marcadores tumorales concretos. Asimismo, este potencial de detección presenta importantes aplicaciones en alimentación y control medioambiental, en aspectos que incluyen los siguientes: i) detección de microorganismos concretos, patógenos o
contaminantes; ii) detección de la presencia de organismos manipulados genéticamente (OMG) o transgénicos, pudiendo cuantificarse si su presencia está por encima de los limites permitidos . En todos estos casos se puede conseguir analizar un volumen importante de muestra usando apenas unos microgramos de nanoparticulas en suspensión, que posteriormente son concentrados mediante un campo magnético externo. Con ello, es posible aumentar en varios órdenes de magnitud la sensibilidad de la detección. De particular interés para las aplicaciones analiticas que se contemplan en esta patente de invención son los ferrofluidos, que son suspensiones estables de nanoparticulas ferro ó ferrimagnéticas, con una estrecha distribución de tamaños de particula. Este tipo de nanoparticulas se obtenian, en un principio, mediante el molido mecánico de muestras de óxidos de hierro con propiedades magnéticas. Sin embargo este método, además de ser costoso y lento, produce una elevada distribución de tamaño en las particulas obtenidas . La alternativa surgió con los métodos de co-precipitación, en los que se utilizan sales disueltas con los iones apropiados (por ejemplo, Fe2+ y Fe3+ en relación 1:2) y se llevan a unas condiciones en las que dicha disolución se vuelva inestable y precipite el sólido deseado (en el mismo ejemplo, la precipitación se consigue llevando la disolución a NaOH I M a ebullición) . Estos métodos producen unas nanoparticulas suficientemente pequeñas como para presentar superparamagnetismo . Este fenómeno supone que en una particula, debido a su minúsculo tamaño, sólo hay un dominio magnético permanente, pero que tiene capacidad de rotar. Consecuentemente, en un ferrofluido cada nanoparticula tiene su momento magnético orientado al azar y se anulan unos a otros, de modo que en ausencia de un campo externo el fluido se comporta como si no se tratase de un sólido magnético. Al someterse a un
campo magnético todas estas nanoparticulas, bien por rotación en el seno de la disolución o bien por orientación de su campo magnético, se orientan según el campo externo. Ello produce una fuerte atracción particula-particula que se transmite por todo el fluido. Aunque obviamente es interesante la posibilidad de que las particulas sean concentradas a través de la aplicación de un campo magnético externo, no es deseable que las interacciones magnéticas sean tan fuertes como para promover una orientación colectiva, y una posible agregación y coagulación.
Por tanto, para obtener un ferrofluido estable bajo un campo magnético moderadamente fuerte, esto es, que la fuerza de atracción entre particulas sea menor que la energia térmica asociada a las particulas, éstas deben ser muy pequeñas. Para que aparezca el monodominio magnético propio del superparamagnetismo, el limite superior del tamaño de particula admitido a temperatura ambiente es de unos 3 nm para hierro, y unos 10 nm para Fe3Ü4 (magnetita) y para su forma oxidada μ-Fe2Ü3 (maghemita) . En el caso de CoFe2θ4 (ferrita de cobalto) , el tamaño de particula puede llegar hasta 20 nm. Por encima de estos limites, particulas demasiado grandes pueden actuar como núcleos de agregación y crecer desestabilizando la suspensión. De esta forma, queda patente que es necesario un tamaño de particula pequeño y una distribución estrecha de tamaños dentro de la población de particulas. Con estas caracteristicas, los ferrofluidos estarán constituidos por fases estables de materiales que pueden ser desplazados o controlados por gradientes magnéticos. Los tres óxidos mencionados, si son sintetizados en un tamaño adecuado y coherente, presentan una alta aplicabilidad para estos fines .
El principal método directo de obtención de nanoparticulas magnéticas de magnetita en disolución, con
una estrecha distribución de tamaño, es a partir de sales de hierro (Massart, 1981) . También se pueden sintetizar nanoparticulas magnéticas mediante métodos de vapor como la pirólisis via láser (Veintenillas y col., 1998), que da lugar a particulas muy dispersas y de muy pequeña saturación magnética, o el método de la llama (Urakawa y col., 1996) que origina particulas polidispersas . También se ha utilizado una red de silice para obtener nanoparticulas magnéticas, pero la distribución de tamaño resulta demasiado amplia (del Monte y col., 1997) .
En la actualidad se conocen varios métodos de sintesis para obtener nanoparticulas esféricas de magnetita en disolución. Según uno de dichos sistemas, una suspensión de hidróxido férrico es parcialmente oxidada con diferentes agentes oxidantes. Se han obtenido particulas esféricas de magnetita de una estrecha distribución de tamaños para rangos seleccionados entre los limites 30 a 1100 nm, mezclando FeSC>4 con KOH en presencia de ion nitrato y llevando el gel resultante a 90 °C durante varias horas (Sugimoto y Matijevic, 1980) . Sin embargo la aplicación de éste método es limitada, ya que las nanoparticulas de magnetita con diámetros superiores a 30 nm ya no son super- paramagnéticas .
No obstante, como se ha indicado el método principal para obtener nanoparticulas esféricas es el de Massart, que consiste en el envejecimiento de una mezcla de disoluciones de hidróxido ferroso y férrico en medio acuoso (Massart y Cabuil, 1987). Con una estequimetria de Fe2VFe3+ = 0.5 se forman particulas muy homogéneas en tamaño y composición quimica. Además, se ha observado que, ajustando el pH y la fuerza iónica del medio de precipitación, se puede controlar el tamaño medio de las particulas en un orden de magnitud dentro del rango de los nanómetros (entre 1.6 y 12.5 nm) (Jolivet y col., 1983), de modo que el tamaño de
partícula decrece conforme aumenta el pH y la fuerza iónica. Ambos factores determinan el cambio isostático de la superficie de las partículas y en consecuencia la composición química de la superficie. En una de las descripciones de preparación de este material, las partículas esféricas de magnetita entre 8 y 14 nm se obtuvieron variando la naturaleza de la base usada en la precipitación (NH4OH, NaOH o KOH) y la temperatura. Para la precipitación de estas partículas se añadieron 50 mL de una disolución acuosa 0.33 M de FeCl2 y 0.66 M de FeCl3 a 450 mL de solución básica 1 M bajo fuerte agitación. Un flujo de N2 gas se pasó previamente a través de la solución básica para asegurar que el precipitado final estuviera constituido solamente por magnetita. Las partículas más pequeñas se obtuvieron añadiendo a la mezcla de sales de hierro una disolución de KOH IM con un 1% en peso de poli (alcohol vinílico) (PVA) a temperatura ambiente (Lee y col. , 1996) .
Para sintetizar nanopartículas de CoFe2θ4 se sigue un método similar al método de Massart, en el que se cambia el Fe2+ por Co2+ y alguna otra de las condiciones experimentales, como la temperatura de adición de reactivos al medio básico. El proceso es análogo al de la magnetita ya mencionado previamente (Wagner y col., 2002) . Las partículas magnéticas de tamaño adecuado sintetizadas por los métodos anteriores, tienen un punto isoeléctrico cercano a 7 para la magnetita, y de 9 en el caso de la ferrita de cobalto, lo que las hace muy inestables en disolución acuosa a pHs neutros; a valores de pH ±2 unidades del punto isoeléctrico se nota ya cierta agregación, y a valores ±1.5 unidades de pH precipitan. Por este motivo es necesario recubrirlas de un compuesto que estabilice la suspensión en agua a valores de pH cercanos a la neutralidad. Este recubrimiento puede ser de diversa
índole: polímeros, substancias orgánicas, o bien diferentes metales u óxidos . En el caso de recubrir las partículas con una capa de sílice se consigue una gran estabilidad frente a la agregación, reduciéndose en gran medida las atracciones magnéticas e interacciones de Van de Waals que se producen entre dichas nanopartículas . Además, se proporciona una alta resistencia frente a los tratamientos térmicos (Tartaj y col., 2001) . Un problema que conlleva el recubrimiento con sílice es la baja resistencia mecánica que presenta dicha capa dentro de un tanque de agitación. Por otra parte, este recubrimiento de sílice podría producirse no sobre nanopartículas individuales sino sobre agregados de unas cinco nanopartículas (Philipse y col., 1994) . Por el contrario, la presencia de dicha capa de sílice ofrece varias ventajas además de su estabilización a pH neutro, como por ejemplo la posibilidad de modificar su superficie añadiendo grupos funcionales existentes en moléculas de unión tipo silano. Estas moléculas tienen un grupo trialcoxisilano en uno de sus extremos, y del enlace libre del silicio sale una cadena corta con el grupo funcional pertinente (amino, mercapto, hidróxido, epóxido, etc) en el extremo de la cadena. De esta forma, en lugar de tener las nanopartículas en capa cerrada de sílice se pueden modificar químicamente para crear la superficie funcionalizada deseada.
Así, una modificación con una capa de oro externa se ha llevado a cabo sobre nanopartículas de sílice (Oldenburg y col., 1998) . Para ello se silaniza la superficie de sílice con μ-aminopropiltrietoxisilano, de modo que en la superficie se incorporan multitud de grupos amino. Sobre estos grupos se inmovilizan nanopartículas de oro previamente sintetizadas y se hace una etapa posterior de crecimiento reduciendo iones de oro (III) hasta que se desee, cerrándose la capa de oro sobre la sílice.
Esta capa externa metálica (preferiblemente oro o plata) añade muchas otras propiedades a las nanoparticulas magnéticas recubiertas de silice entre las que merece destacar en relación con la presente invención el de proporcionar una propiedad óptica singular: el fenómeno del plasmón superficial.
Sin embargo, no se conocen nanoparticulas que reúnan todas las propiedades anteriormente descritas y la viabilidad de su uso como soporte para la detección de hibridación entre moléculas orgánicas complementarias y su aplicación en el desarrollo de nuevas herramientas o plataformas tecnológicas en nano-biotecnologia.
Breve descripción de la invención Un primer aspecto de la invención se refiere a una nanoparticula biosensora que comprende: una nanoparticula magnética, una capa de silice, una capa o varias capas externas metálicas que pueden ser de distinta naturaleza y depositadas con distinta alternancia e inmovilizada en su superficie externa, y una capa de moléculas biosensoras orgánicas o inorgánicas, sintéticas o de origen natural con capacidad de unirse a biomoléculas . Preferentemente la nanoparticula biosensora de la invención comprende una nanoparticula magnética de un espesor entre 4-30 nm de diámetro, una capa de silice de una espesor entre 1-20 nm, una capa metálica de un espesor entre 1-200 nm y una capa de moléculas biosensoras orgánicas o inorgánicas, sintéticas o de origen natural con capacidad de unirse a biomoléculas . Un segundo aspecto de la invención se refiere al procedimiento de obtención de la nanoparticula biosensora de la invención comprendiendo las etapas de preparación de un coloide de particulas magnéticas de entre 4-20 nm de tamaño; condicionamiento del coloide para que sea estable a
pHs básicos (mayores de pH=7); recubrimiento de las nanoparticulas coloidales en medio básico con una capa de silice de un espesor entre 1-20 nm; funcionalización quimica de la superficie de las nanoparticulas magnéticas recubiertas de silice de la etapa anterior con una capa metálica y la inmovilización de la molécula biosensora orgánica sobre la superficie de la nanoparticula resultante .
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a las diversas aplicaciones de las nanoparticulas biosensoras de la presente invención.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a métodos para la determinación de la hibridación o unión de una molécula biológica a la molécula biosensora orgánica o inorgánica inmovilizada a una nanoparticula biosensora de la invención. Preferentemente dichos métodos son pero no se limitan a: métodos de detección espectroscópica utilizando radiación ultravioleta, visible o infrarroja, o espectroscopia Raman, o XPS, o bien métodos de detección electroquimicos .
Otros aspectos de la presente invención resultarán evidentes para un experto en la materia a la vista de la descripción de la invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Esquema de la nanoparticula biosensora, indicando sus diferentes capas.
Figura 2.- Imagen de Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) de nanoparticulas de ferrita de cobalto/silice/oro . La imagen posee 120.000 aumentos y la barra blancarepresenta 50 nm.
Figura 3.- Espectros de transmisión en la zona del infrarrojo de nanoparticulas magnéticas con capa externa de oro sobre cuya superficie se ha quimisorbido una capa de
PNA tiolado de secuencia conocida ("P-G", ver Ejemplo 1) , y la misma preparación tras ser incubada en presencia de una molécula complementaria de DNA ("DNA-G", ver Ejemplo 2) y lavada para eliminar las posibles hibridaciones inespecificas .
Figura 4.- Espectros de transmisión en la zona del infrarrojo de nanoparticulas magnéticas con capa externa de oro-plata-oro sobre cuya superficie se ha quimisorbido una capa de PNA tiolado de secuencia conocida "P-G" (ver Ejemplo 1) . En el espectro superior, esas nanoparticulas han sido incubadas con el DNA complementario "DNA MG", que resiste el ciclo de lavado y se mantiene hibridado, mostrando sus bandas caracteristicas en el IR. En el espectro inferior, las nanoparticulas se han incubado con un DNA no especifico "DNA L", que no hibrida al PNA y por tanto es eliminado por completo en el ciclo de lavado; de esta forma, las bandas de IR observadas al final del proceso son únicamente las caracteristicas del PNA (ver Ejemplo 2 ) . Figura 5.- Voltametrias ciclicas de electrodos de oro (discos de 3mm de diámetro) recubiertos de una monocapa de PNA tiolado, incubados en una disolución de DNA complementario (a las concentraciones indicadas en la figura) , lavados y posteriormente incubados en tionina 10~6 M, H2O2 10"3M y la enzima peroxidasa 0.1 mg/ml .
Descripción detallada de la invención
La presente invención se enfrenta al problema de proporcionar nuevas herramientas para la identificación y caracterización de biomoléculas, y más concretamente nuevos biosensores con capacidad de unirse a ácidos nucleicos con elevada sensibilidad y especificidad.
La invención se basa en que los inventores han observado que es posible identificar la hibridación
específica producida entre ácidos nucleicos naturales (DNA o RNA) y moléculas análogas a ellos (más concretamente, PNA) cuando estas sondas de PNA están inmovilizadas sobre la superficie metálica de nanopartículas con núcleo magnético.
En la superficie de estas nanopartículas magnéticas recubiertas con una capa metálica se puede inmovilizar, gracias a las propiedades de dichas superficies, cualquier tipo de molécula orgánica o inorgánica, siempre que incluya grupos funcionales con capacidad de aceptar densidad electrónica, como los grupos amino o los grupos tiol (ver Ejemplo 1) . Las moléculas inmovilizadas pueden originar o no, disposiciones en forma de monocapas autoensambladas (SAMs) en cuyo caso se obtiene una densidad de empaquetamiento óptima. La formación de SAMs ocurre, por ejemplo, en el caso de la inmovilización de PNAs tiolados sobre superficies de oro.
De esta forma, pueden aprovecharse las nuevas propiedades magnéticas, eléctricas y ópticas -que se encuentran integradas y se complementan entre si- de las nanopartículas con la molécula orgánica o inorgánica inmovilizada sobre su superficie para desarrollar biosensores específicos. En primer lugar, el núcleo magnético permite que dichas partículas puedan ser capturadas por un campo magnético externo y permite la concentración de la muestra analizada cuando ésta se encuentra a bajas concentraciones. En segundo lugar, es posible analizar (ver Ejemplo 2 y 3) la diferencia de señal óptica que producen dichas nanopartículas con una molécula biosensora inmovilizada en su superficie, antes y después de la hibridación de un ácido nucleico complementario presente en una muestra biológica problema.
Además, el metal utilizado como capa externa proporciona una propiedad óptica singular: el fenómeno del
plasmón superficial. Este fenómeno consiste en la vibración colectiva de los electrones de la superficie metálica, provocando una banda de absorción situada en el ultravioleta-visible (caracteristica del metal y del tamaño de las nanoparticulas) a la longitud de onda en que se da la condición de resonancia en dichos electrones . El fenómeno del plasmón superficial también tiene consecuencias en la región de energias de vibración de enlaces quimicos, siendo el causante de los efectos de Surface Enhancement Raman Spectroscopy (SERS) (Vo-Dinh, 1998) y Surface Enhancement InfraRed Absorption (SEIRA) (Osawa y col., 1991) . Estos efectos provocan un aumento considerable en ciertos modos de vibración de las moléculas situadas sobre las superficies metálicas, que en el caso del SERS puede llegar hasta 106 veces, mientras que en el SEIRA se puede alcanzar un aumento de 102 veces. Estos efectos ópticos de aumento de señal dependen fundamentalmente del material que las provoca (Au, Ag, Cu) , del espesor de la capa y de su rugosidad externa, y también del grosor (en el caso de láminas) o del diámetro de la particula (en el caso de nanoparticulas" y pueden ser medidos por técnicas de espectroscopia.
Finalmente, otra de las propiedades que aporta la superficie metálica es su facilidad para servir de soporte de monocapas autoensambladas, especialmente de grupos tiolados sobre superficies de oro (Madoz y col., 1997; Madoz-Gúrpide y col., 2000; Abad y col., 2002; Briones y col., 2004) .
Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención lo constituye una nanoparticula biosensora que comprende : a) una nanoparticula magnética b) una capa de silice
c) una (o varias) capa(s) externa (s) metálica (s) , que pueden ser de diferente naturaleza y depositadas con distinta alternancia, e inmovilizada en su superficie externa d) una capa de moléculas biosensoras orgánicas o inorgánicas, sintéticas o de origen natural con capacidad de unirse a biomoléculas .
El término "nanoparticula biosensora" tal como se utiliza en la presente invención se refiere a particulas de un tamaño comprendido entre 5 y 250 nanómetros (nm) , preferentemente entre 50 y 100 nm y más preferentemente de 60 nm que además comprenda todas las caracteristicas descritas anteriormente.
El tamaño de la nanoparticula puede variar en función del espesor de las distintas capas descritas anteriormente que a, titulo descriptivo, pueden variar como sigue: i) particula magnética entre 4 y 30 nm y ii) capa de silice de un espesor entre 1 y 20 nm y iii) capa metálica de un espesor controlado entre 1 y 200 nm
De los numerosos óxidos de hierro que existen (Garcell y col., 1998; Solinas y col., 2001) presentan propiedades magnéticas permanentes la maghemita (μ-Fe2Ü3) y la magnetita (FesCU) . Por otro lado, se puede usar nanoparticulas de ferrita de cobalto (CoFe2θ4) , un compuesto con la misma estructura de espinela inversa caracteristica de la magnetita, en la que el cobalto ha sustituido al hierro de estado de oxidación II. Otro ejemplo de material magnético alternativo a los descritos es el hierro-platino (FePt), aunque no es un óxido.
Por lo tanto, tal y como se utiliza en la presente invención el término "nanoparticula magnética" se refiere a un material magnético, oxidado o no, perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la
presente invención, respectivamente, a uno de los siguientes grupos o a cualquier combinación de éstos: i) óxido de hierro, como la magnetita (FesCU) y su forma oxidada maghemita (μ-Fe2Ü3) o un óxido de hierro- cobalto como la ferrita de cobalto (CoFe2Ü4) o ii) materiales magnéticos no óxidos como el hierro- platino (FePt) ;
Tal como se utiliza en la presente invención el término "capa externa metálica" se refiere a metales que inducen el incremento de la señal espectroscópica pertenecientes, a titulo ilustrativo y sin que se limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: oro (Au), plata (Ag) , cobre (Cu) , platino (Pt) o una aleación formada por varios o todos estos metales . Tal como se utiliza en la presente invención el término "moléculas biosensoras" se refiere a una molécula biológica o a una molécula análoga a una molécula biológica, de naturaleza orgánica o inorgánica, inmovilizada sobre una nanoparticula que actúa como soporte fisico, con capacidad para unirse o hibridarse especificamente a otras moléculas biológicas o análogas de ellas de forma que se pueda realizar un seguimiento del proceso de unión. Dichas moléculas biológicas o análogos de moléculas biológicas además incluyen un grupo funcional con capacidad de aceptar densidad electrónica que conlleve su quimisorción o fisisorción perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, a la siguiente lista: grupos amino, grupos tiol, grupos epoxi, grupos disulfuro, di-alquil sulfuros, asi como las aminas y alcoholes en platino. Las moléculas que poseen dichos grupos funcionales, tanto en la propia estructura de la molécula como por efecto de la adición sintética de dicho grupo, pueden seleccionarse, a titulo
ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, de uno de los siguientes conjuntos: a) biomoléculas naturales: ácidos nucleicos (DNA o RNA) de cadena sencilla o doble, enzimas, anticuerpos, proteinas de membrana, proteinas de choque térmico, chaperoninas, otras proteinas, monosacáridos, polisacáridos, glucoproteinas, ácidos grasos, terpenos, esteroides, otras moléculas de naturaleza lipidica, lipoproteinas, hormonas, vitaminas, metabolitos, hidrocarburos, moléculas naturales con actividad antibiótica o antiviral, o bien agregados macromoleculares compuestos por proteinas y/o ácidos nucleicos u otras combinaciones de las moléculas citadas anteriormente; b) biomoléculas naturales obtenidas por procedimientos de selección in vitro: aptámeros, ribozimas o aptazimas; c) biomoléculas artificiales: PNAs, otros análogos de ácidos nucleicos naturales, quimeras de ácidos nucleicos naturales y artificiales, polimeros con capacidad de reconocimiento de forma ("molecular imprinted polymers" o MIPs) , anticuerpos artificiales, anticuerpos recombinantes, minianticuerpos, o moléculas sintéticas con actividad antibiótica o antiviral.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "hibridación" se refiere a la interacción entre dos hebras complementarias de ácidos nucleicos naturales o sus análogos artificiales, o bien, genéricamente, a la interacción especifica entre dos proteinas, un anticuerpo y el antigeno que reconoce, o una proteina de unión y su ligando . Las nanoparticulas de la presente invención también se pueden utilizar en diferentes formatos de biosensores basados en el reconocimiento molecular entre antigeno- anticuerpo, receptor-ligando, enzima-substrato o enzima- inhibidor, en los que el evento de reconocimiento molecular
de lugar a cambios en propiedades ópticas y/o eléctricas del sistema que puedan ser detectadas gracias a la composición y estructura de las nanoparticulas objeto de esta invención: espectroscopia ultravioleta, visible o infrarroja; espectroscopia Raman y "Surface Enhanced Raman Spectroscopy" (SERS) , microscopia Raman; Infrarrojo de transmisión, incluyendo FTIR y microscopia de infrarrojo; "Surface Enhanced InfraRed Absorption" (SEIRA) y "Atenuated Total Reflection Spectroscopy" (ATR) ; técnicas basadas en rayos X, XPS, NEXAFS, XANES.
Tal y como se utiliza en la presente invención el término "ácido nucleico" se refiere a una secuencia de ácido desoxirribonucleico (DNA) , ácido ribonucleico (RNA) o ácido nucleico peptidico (PNA) , de longitud igual o superior a 2 nucleótidos (DNA o RNA) o 2 bases nucleotidicas unidas a su correspondiente esqueleto (PNA) (abreviado como nt) que puede ser de cadena sencilla o cadena doble.
Tal como se utiliza en la presente invención el término "ácido nucleico peptidico (PNA) " se refiere a una molécula análoga estructuralmente al DNA en la que el esqueleto estructural es un polimero de naturaleza peptidica formado por polimerización de N- (2- aminoetil) glicina, al cual las bases nucleicas están unidas mediante enlaces metilencarbonilo .
Tal como se utiliza en la presente invención el término "anticuerpos recombinantes" o "minianticuerpos" se refiere a fragmentos derivados de anticuerpos construidos por tecnologia de DNA recombinante, y que, pese a su menor tamaño, conservan la capacidad de unión al antigeno ya que mantienen al menos un dominio variable de inmunoglobulina
(Fab) donde residen las zonas de unión a antigenos. Los minianticuerpos pueden pertenecer, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente
grupo: Fab, F(ab')2, scFv, y anticuerpos recombinantes monodominio . En el marco de la presente invención, se entiende por anticuerpos recombinantes monodominio y/o dominios tipo inmunoglobulina con capacidad de unión y reconocimiento independiente, tanto a los dominios variables de cadena pesada (VH) , a los dominios variables de cadena ligera (VL) , a los anticuerpos recombinantes de camélidos (VHH) , los anticuerpos recombinantes de camélidos humanizados, los anticuerpos recombinantes de otras especies camelizadas, los anticuerpos monodominio IgNAR de peces cartilaginosos; es decir, se incluyen tanto dominios que de forma natural son monodominio (caso de VHH e IgNAR) , como anticuerpos que por ingenieria genética se han alterado para que por si solos sean capaces de interaccionar con el antigeno y mejorar sus propiedades de estabilidad y solubilidad.
Una realización particular de la invención lo constituye la nanoparticula biosensora de la invención en que la nanoparticula magnética esté constituida por ferrita de cobalto, la capa de silice esté funcionalizada con grupos amino y grupos tiol, la capa metálica sea de oro, y la biomolécula inmovilizada sea un PNA modificado en uno de sus extremos, consistiendo dicha modificación en la inserción de un grupo tiol en dicho extremo (ver Ejemplo 1.1) .
Otra realización particular de la presente invención lo constituye la nanoparticula biosensora en que la nanoparticula magnética es de ferrita de cobalto, la capa de silice esté funcionalizada con grupos amino y grupos tiol, y la capa metálica esté formada por una capa de plata y sucesivamente otra de oro, y la biomolécula inmovilizada sea un PNA modificado en uno de sus extremos, consistiendo dicha modificación en la inserción de un grupo tiol en dicho extremo (ver Ejemplo 1.4) .
En otro aspecto particular de la invención la nanoparticula biosensora de la invención puede ser másica, es decir, no poseer núcleo magnético ni capa de silice y estar formada únicamente por un núcleo metálico. Un segundo aspecto de la presente invención lo constituye el procedimiento de obtención de las nanoparticulas biosensoras de la invención, en adelante procedimiento de la invención, que comprende las etapas de: a) preparación de un coloide de particulas magnéticas de entre 4 y 30 nm b) condicionamiento del coloide para que sea estable a pHs básicos (mayores de pH = 7), c) recubrimiento de las nanoparticulas coloidales en medio básico con una capa de silice de un espesor entre 1 y 20 nm, d) funcionalización quimica de la superficie de las nanoparticulas obtenidas en la etapa c) para introducir grupos funcionales, e) recubrimiento de las nanoparticulas magnéticas funcionalizadas de la etapa d) con una capa metálica que comprende las etapas de: e.i) sintesis de nanoparticulas de metal estables en agua, con un diámetro de entre 3 y 20 nm e.ii) quimisorción de las nanoparticulas de metal sobre las nanoparticulas resultantes de la etapa d) anteriormente mencionada, e.iii) crecimiento sobre el producto obtenido en e.ii) de una capa metálica, formando una capa de un espesor controlado entre 1 y 200 nm f) inmovilización de la molécula biosensora sobre la superficie de la nanoparticula resultante de la etapa e) .
Un aspecto preferido de la presente invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la particula magnética está constituida, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, por los siguientes grupos de materiales magnéticos, oxidados o no, respectivamente o por cualquier combinación de los mismos: i) óxido de hierro, como la magnetita (FesCU) y su forma oxidada, la maghemita (μ-Fe2θ3) , o un óxido de hierro-cobalto como la ferrita de cobalto (CoFe2O4), ii) materiales magnéticos no óxidos como el hierro- platino (FePt) .
Preferentemente en dicho procedimiento el óxido de hierro y cobalto es ferrita de cobalto (ver Ejemplo 1) , magnetita (FesCU) o su forma oxidada (P-Fe2Os) •
Un aspecto más preferido de la invención lo constituye un procedimiento de la invención en el que el condicionamiento de la etapa b) del procedimiento de la invención se realiza con hidróxido de tetrametilamonio . Un aspecto aún mas preferido de la presente invención lo constituye un procedimiento de la invención en el que el recubrimiento de silice de la etapa c) del procedimiento de la invención se realiza por tratamiento con una solución de silicato sódico. Por otro lado, el grosor de la capa de silice de la etapa c) del procedimiento de la invención puede variar en función del tamaño de las nanoparticulas deseadas. Asi, otra realización de la presente invención lo constituye un procedimiento de la invención que comprende adicionalmente la siguiente etapa: c2) una extensión de la etapa c) tras el tratamiento con silicato sódico, promoviendo un crecimiento adicional de la capa de silice con tetraetoxi ortosilicato .
Una realización preferida de la presente invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la funcionalización quimica de la superficie de la etapa d) del procedimiento de la invención se realiza con un reactivo del tipo trialcoxi silano perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, al siguiente grupo de compuestos: μ-aminopropil trietoxisilano, μ-mercaptopropil trimetoxi silano o una mezcla de ambos. Preferentemente se pueden introducir en general cualquier molécula del tipo trialcoxi silano o diferentes moléculas con esta estructura simultáneamente, obteniéndose de este modo la funcionalización deseada.
Otra realización particular del procedimiento de la invención lo constituye un procedimiento en el que la capa metálica de e) del procedimiento de la invención se elabora a partir de un metal, perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: oro (Au), plata (Ag), cobre (Cu) o platino (Pt), o una aleación formada por varios o todos estos metales, por ejemplo Au/Ag o Au/Cu.
En otra realización particular del procedimiento de la invención, las nanoparticulas metálicas de la etapa e.i) son nanoparticulas de oro que se preparan por la reducción de HAUCI4 disuelto en agua básica con cloruro de tetrakis (hidroxifenil) fosfonio.
En aún otra realización particular del procedimiento de la invención, para producir la quimisorción de la etapa e.ii) se mezclan las nanoparticulas de la etapa d) con las de la etapa e) , de modo que las nanoparticulas de metal estén en exceso.
En otra realización preferente del procedimiento de la invención, el crecimiento de una capa de oro mencionado en la etapa e.iii) del procedimiento de la invención se realiza por la reducción sobre las semillas de nucleación
en etapas sucesivas de Au3+ con hidrocloruro de hidroxilamina .
En otra realización particular del procedimiento de la invención, el crecimiento de una capa de oro mencionado en la etapa e.iii) del procedimiento de la invención se realiza por la reducción sobre las semillas de nucleación en etapas sucesivas de Au3+ con formaldehido .
En otra realización aún más preferente del procedimiento de la invención, el crecimiento de una capa metálica de la etapa e.iii) del procedimiento de la invención consiste en la generación de una aleación oro/plata que se realiza por la reducción sobre las semillas de nucleación en etapas sucesivas de Ag+ con formaldehido en presencia de amoniaco (ver ejemplo 1.2) . Otro objeto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la molécula biosensora inmovilizada en la etapa f) del procedimiento de la invención pertenece, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, de uno de los siguientes conjuntos: a) biomoléculas naturales: ácidos nucleicos (DNA o RNA) de cadena sencilla o doble, enzimas, anticuerpos, proteinas de membrana, proteinas de choque térmico, chaperoninas, otras proteinas, monosacáridos, polisacáridos, glucoproteinas, ácidos grasos, terpenos, esteroides, otras moléculas de naturaleza lipidica, lipoproteinas, hormonas, vitaminas, metabolitos, hidrocarburos, tioles, moléculas naturales con actividad antibiótica o antiviral, o bien agregados macromoleculares compuestos por proteinas y/o ácidos nucleicos u otras combinaciones de las moléculas citadas anteriormente; b) biomoléculas naturales obtenidas por procedimientos de selección In vitro: aptámeros, ribozimas, aptazimas;
c) biomoléculas artificiales: PNAs, otros análogos de ácidos nucleicos naturales, quimeras de ácidos nucleicos naturales y artificiales, polimeros con capacidad de reconocimiento de forma ("molecular imprinted polymers" o MIPs) , anticuerpos artificiales, anticuerpos recombinantes, minianticuerpos, o moléculas sintéticas con actividad antibiótica o antiviral.
Como se ha comentado anteriormente dicha molécula biosensora incluye un grupo funcional, tanto en la propia estructura de la molécula como por efecto de la adición sintética de dicho grupo, con capacidad de aceptar densidad electrónica perteneciente, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, a la siguiente lista: grupos amino, grupos tiol, grupos disulfuro, di- alquil sulfuros, grupos epoxi, asi como las aminas y alcoholes en platino.
Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la biomolécula inmovilizada en la etapa f) del procedimiento de la invención es una molécula de ácido nucleico peptidico (PNA) .
Dadas las caracteristicas de estas moléculas biosensoras inmovilizadas es posible conseguir que, en condiciones controladas de hibridación y lavado, las moléculas biosensoras, por ejemplo moléculas de PNA se hibriden únicamente con sus cadenas de DNA perfectamente complementarias. Esta especificidad de detección puede ser tan alta como para discriminar entre dos moléculas de DNA diana que se diferencien en una sola mutación o polimorfismo genético (SNP) . Por tanto, tales biomoléculas inmovilizadas pueden detectar la existencia de dichas cadenas de DNA en una muestra empleando métodos adecuados, lo que permite su aplicación en distintos sectores
industriales principalmente en biomedicina humana y veterinaria, alimentación y control medioambiental.
Por lo tanto un tercer aspecto de la presente invención lo constituye el uso de las diversas aplicaciones de la nanoparticula biosensora de la invención a titulo ilustrativo, en al menos uno de los siguientes aspectos: i) detección de patógenos de tipo viral, bacteriano, fúngico o protozoario, ii) caracterización de mutaciones o polimorfismos genéticos (SNPs) en dichos agentes que pueden hacerlos resistentes a fármacos o facilitar el escape a vacunas, iii) caracterización de mutaciones o SNPs en genes humanos o animales, relacionados con enfermedades o con propensión a ellas, iv) detección de marcadores tumorales concretos . v) detección de microorganismos concretos, patógenos o contaminantes en alimentos, vi) detección de la presencia de organismos manipulados genéticamente (OMG) o transgénicos en alimentos, y vii) detección de microorganismos o toxinas contaminantes del medio ambiente.
Por otro lado, las nanoparticulas biosensoras de la presente invención también pueden utilizarse para la elaboración de un microarray o micromatriz en el que cada punto del microarray pudiera estar constituido por una nanoparticula biosensora de la presente invención dirigida a un determinado elemento biológico (por ejemplo, un ácido nucleico con una secuencia determinada) . Con ello seria posible el análisis en paralelo de una bateria de distintas hibridaciones producidas sobre otros tantos tipos de nanoparticulas biosensoras. Asi, otro objeto particular de la presente invención lo constituye un dispositivo
biosensor constituido por una serie de nanoparticulas biosensoras de la presente invención dispuestas sobre una superficie tipo micromatriz o microarray .
Un cuarto aspecto de la presente invención lo constituye un ensayo de determinación de la hibridación, unión o interacción de una molécula biológica a la molécula inmovilizada en una nanoparticula biosensora de la invención, en adelante ensayo de determinación de la hibridación de la invención, que comprende las siguientes etapas : i) reacción de la nanoparticula biosensora de la invención con una muestra susceptible de contener la molécula biológica candidata, que puede poseer o no secuencias complementarias a la biomolécula orgánica inmovilizada, en condiciones adecuadas para su hibridación, ii) captura de las nanoparticulas biosensoras por sedimentación magnética, y iii) determinación de la hibridación, o no, ocurrida en la i) . iv) deducción de la existencia, o no, de la molécula biológica candidata en la muestra susceptible de contenerla y en su caso, deducción de la secuencia de tal molécula biológica candidata en función de su grado de hibridación con la nanoparticula biosensora. v) opcionalmente, cuantificación de la concentración de la molécula biológica candidata en la muestra.
Como se ha comentado anteriormente, una realización particular de la invención es una nanoparticula biosensora que posee en su superficie PNAs como molécula biosensora inmovilizada del apartado i) del ensayo de determinación de la hibridación, y donde el objeto de la hibridación es una molécula biológica candidata consistente en un ácido
nucleico natural (DNA o RNA) . Por ello, otro aspecto particular de la presente invención lo constituye el uso de la nanoparticula biosensora de la invención en el que la determinación de la hibridación o no en la etapa i) del ensayo de determinación de la hibridación consiste en la hibridación entre una molécula de PNA inmovilizada en la nanoparticula biosensora y una molécula de DNA presente en una muestra problema.
Otra realización particular de la invención es una nanoparticula biosensora que posee en su superficie anticuerpos naturales, anticuerpos artificiales, anticuerpos recombinantes o minianticuerpos como molécula biosensora inmovilizada del apartado i) del ensayo de determinación de la hibridación, y donde el objeto de la hibridación o unión es el antigeno que dicho anticuerpo reconoce especificamente . En ese caso, el antigeno ha de poseer en su estructura molecular grupos funcionales diferentes de los de la proteina que actúa como anticuerpo, de forma que sea posible su detección por técnicas espectroscópicas o electroquimicas . Dichos grupos funcionales especificos del antigeno y no presentes en la proteina pueden ser, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención: hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos aromáticos, heterociclos, D-aminoácidos, grupos funcionales que contengan nitrógeno, azufre, fósforo o metales formando enlaces de coordinación.
Otra realización particular de la invención es una nanoparticula biosensora que posee en su superficie, como molécula biosensora inmovilizada del apartado i) del ensayo de determinación de la hibridación, aptámeros, ribozimas, aptazimas u otros ácidos nucleicos a los que mediante procedimientos de selección in vitro se les ha dotado de (o enriquecido en) la capacidad para reconocer ligandos concretos y unirse especificamente a ellos. En ese caso, el
ligando cuya unión se podrá detectar ha de poseer en su estructura molecular grupos funcionales diferentes de los del ácido nucleico que actúa como molécula biosensora, es decir, cualquier grupo distinto a los siguientes: ribosa, desoxirribosa, fosfato, base nitrogenada púrica o pirimidinica . Dichos grupos funcionales especificos del ligando pueden ser, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención: hidrocarburos alifáticos, hidrocarburos aromáticos, heterociclos, D-aminoácidos, otros grupos funcionales que contengan nitrógeno, azufre, fósforo o metales formando enlaces de coordinación.
Una realización preferente de la presente invención lo constituye un método de detección de la hibridación de la etapa iii) del ensayo de determinación de la hibridación o unión llevado a cabo mediante detección espectroscópica. Preferentemente, la medida de detección espectroscópica se puede llevar a cabo mediante radiación ultravioleta. Más preferentemente la medida espectroscópica se puede llevar a cabo mediante radiación infrarroja. En otro aspecto preferido de la invención la detección de la hibridación se realiza mediante espectroscopia Raman.
La técnica de Raman y el infrarrojo (IR) miden en la misma región del espectro de radiación electromagnética, la de energia vibracional de las moléculas, si bien ambas técnicas detectan diferentes fenómenos que suceden con los enlaces quimicos . La diferencia es que el IR proporciona la señal de los cambios de polaridad del enlace excitado según una u otra vibración, y el Raman proporciona el cambio de polarizabilidad que sufre el enlace. La medida espectroscópica proveerá una serie de bandas de absorción
(en el caso del IR) o de dispersión (en el caso del Raman) en las que se buscan las frecuencias de vibración de las partes no comunes entre la molécula biosensora inmovilizada sobre las nanoparticulas y la molécula biológica candidata
cuya presencia se desea detectar. En el caso de la detección de DNA o RNA empleando PNA inmovilizado sobre nanoparticulas, estas bandas son las que corresponden al esqueleto sobre el que se disponen las bases nucleicas, que como ya se comentó en el caso del PNA es una cadena de naturaleza peptidica, y para los ácidos nucleicos naturales (DNA y RNA) es de tipo azúcar-fosfato (2-desoxirribosa o ribosa, respectivamente, unida por enlaces fosfodiéster) .
Asi, una realización particular de la invención lo constituye un método de detección espectroscópica del ácido nucleico hibridado sobre la nanoparticula en la región del infrarrojo que se lleva a cabo mediante un método, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, perteneciente al siguiente grupo: a) mediante el uso de un equipo de infrarrojo, midiendo la absorción de las nanoparticulas por transmisión b) mediante el uso de un equipo de infrarrojo, midiendo la absorción de las nanoparticulas por reflexión total atenuada (ATR) c) mediante el uso de un equipo de infrarrojo, midiendo la absorción de las nanoparticulas en la modalidad de ángulo rasante.
En una realización particular de la invención, el equipo infrarrojo utilizado en el apartado a) anterior es un equipo de sobremesa emplazado en un laboratorio, integrando la técnica de la Transformada de Fourier (FT) para la resolución de espectros, y utilizando ventanas de transmisión de fluoruro de bario, fluoruro de calcio u otro tipo de ventana transparente a la radiación infrarroja, a titulo de ejemplo y sin limitarse a ellos: el bromuro potásico, cloruro potásico, cloruro sódico o bromuro sódico. En otra realización particular de dicho método, las ventanas trasparentes a la radiación infrarroja pueden
adoptar una configuración en flujo mediante el cual sucesivas muestras pueden ser analizadas en continuo.
En una realización preferente de la invención, el equipo infrarrojo utilizado en el apartado a) anterior es un equipo portátil para el análisis en muestras de campo, pudiendo ser un equipo de Transformada de Fourier o por el contrario presentar un sistema dispersivo de irradiación continua y detector limitado a las frecuencias de interés .
En una realización aún más preferente de la invención, en el equipo infrarrojo utilizado en el apartado b) anterior, en la modalidad de reflexión total atenuada (ATR) puede adoptarse la configuración en flujo con o sin aplicación de un campo magnético externo que permita mantener posicionadas las nanoparticulas magnéticas en la celda. En una realización aún más preferente de la invención, el equipo infrarrojo utilizado en el apartado b) anterior mediante la modalidad de reflexión total atenuada (ATR) en la configuración en flujo puede utilizarse la celda con campo magnético externo y termostatizada. De esta forma se puede aplicar una rampa de temperatura y estudiar el efecto de dicha temperatura en la estabilidad de la hibridación entre la sonda de PNA inmovilizada sobre la nanoparticula y el ácido nucleico diana (DNA o RNA) .
En otra realización particular de la invención, el equipo infrarrojo utilizado en el apartado b) presenta una ventana de seleniuro de zinc, pudiendo ser sustituida por cualquier otro cristal apropiado para la técnica de ATR
(como el germanio, por ejemplo) . En otra realización particular el cristal apropiado para técnica de ATR puede estar recubierto por una pelicula delgada de oro o plata.
En otra realización particular de dicho método las nanoparticulas biosensoras conteniendo sondas de PNA se pueden disponer regularmente en áreas discretas de una superficie y tras la etapa de hibridación ser analizadas
mediante microscopía infrarroja individualmente o en disposición de microarray.
Por otro lado, la capa metálica externa que presentan las nanopartículas les da otra propiedad: son capaces de conducir la electricidad a lo largo de su superficie. Esto les confiere el carácter de nanoelectrodos, pudiendo transmitir señal eléctrica en disolución hasta un electrodo sobre el que se confinan las partículas magnéticas por gravedad o por la influencia de un campo magnético externo. Un ejemplo práctico de esta realización, llevada a cabo sobre electrodos de disco de oro, funcionalizados con una monocapa de PNA tiolado, se muestra en la figura 5. Se han obtenido resultados similares con las nanopartículas magnéticas biosensoras descritas en esta patente. En una realización particular de dicho método, en el apartado i) del ensayo de determinación de la hibridación de la invención, se dejan reaccionar las nanopartículas que contienen sondas de PNA inmovilizadas con la disolución donde presumiblemente se encuentran las moléculas de ácidos nucleicos con secuencias complementarias a dicho PNA. En el paso ii) del ensayo de determinación de la hibridación de la invención, las nanopartículas con el ácido nucleico hibridado se recuperan y se incuban en una disolución que contienen un compuesto redox, es decir, con propiedades diferentes en su estado oxidado y en su estado reducido. Dicho compuesto redox, en su estado oxidado tiene carga neta positiva mientras que en su estado reducido no presenta carga. Estos compuestos, que en lo sucesivo llamaremos mediadores redox, pertenecen, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: el compuesto tionina, el compuesto azul de metileno, el compuesto osmio-bipiridilo o el compuesto bencil viológeno.
Uno de los hechos experimentales originales que sustentan la presente invención es que dichos mediadores redox se adsorben electrostáticamente sobre las cadenas de DNA hibridadas sobre cadenas de PNA complementarias . Sin embargo, tal como se ha observado experimentalmente, tras su reducción electroquimica dichos mediadores redox pierden su carga eléctrica y con ello su afinidad electrostática por el DNA, por lo que difunden al medio y pueden ser detectados electroquimicamente . Este fenómeno tiene lugar cuando los heterodúplex PNA/DNA se han formado sobre un electrodo másico, y también cuando se han formado sobre nanoparticulas conductoras que depositadas sobre un electrodo colector o atraidas sobre él por un campo magnético externo, se comportan como un array de nanoelectrodos . Se ha determinado experimentalmente que las moléculas de los mediadores redox difundidas al medio pueden ser reducidas por la acción catalitica de un enzima apropiado (a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención, un enzima peroxidasa) , con lo que se obtiene un efecto de amplificación (ver Ejemplo 3) .
Por tanto, una realización particular de la presente invención la constituye un método para la determinación de la hibridación de iii) mediante técnicas electro-analiticas conocidas como dinámicas . En una realización particular de la invención las técnicas dinámicas pertenecen a la categoria de técnicas electroquimicas de potencial controlado, estando comprendidas, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, al siguiente grupo: cronoamperometria y voltametria ciclica y/o lineal. Tal como es aceptado por cualquier experto en el campo, son variables de estas técnicas las modalidades de barrido o de pulso y las de electrodo estacionario o rotatorio.
En una realización particular de la invención las técnicas dinámicas pertenecen a la categoria de técnicas electroquimicas de corriente controlada, de pequeña amplitud, o de gran amplitud. Entre ellas están comprendidas, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, la cronopotenciometria y la culombimetria .
En una realización particular de la invención las técnicas voltamétricas pertenecen a la categoria de "stripping" y sus variantes: de barrido lineal, de pulso diferencial, de barrido lineal diferencial de onda cuadrada.
En una realización preferente de la presente invención, las variantes de las técnicas electroanaliticas pueden realizarse, en lugar de con nanoparticulas metálicas, con electrodos metálicos como soporte de las sondas de PNA. Estos electrodos pueden tener forma, a titulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, de: discos, hilos, anillos, esferas o esferoides.
A continuación, los ejemplos describen en mayor detalle ciertas realizaciones de la presente invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1.- Síntesis de las nanoparticulas magnéticas metalizadas biosensoras de la invención.
Ejemplo 1.1.- Nanoparticulas biosensoras de oro.
El objeto inicial de este ejemplo de realización es preparar una suspensión magnética compuesta por nanoparticulas de ferrita de cobalto (CoFe2θ4) de tamaño uniforme, recubiertas con una capa delgada de silice funcionalizada con grupos amino, más un recubrimiento final con una capa de oro (tal como se esquematiza en la figura
1) sobre la cual se quimisorberán las moléculas de PNA tiolado como ejemplo de molécula biosensora. El recubrimiento de silice tiene lugar sobre las nanoparticulas magnéticas de forma individual, pudiendo también obtenerse el recubrimiento de varios núcleos magnéticos simultáneamente. Las nanoparticulas asi preparadas cumplen las propiedades buscadas: que sean estables en suspensión durante un largo periodo de tiempo, pero que en presencia de un campo magnético sedimenten. Además, retirando dicho campo magnético las nanoparticulas deben redispersarse al aplicar una agitación suave.
En un ejemplo particular se ha empleado ferrita de cobalto con una estructura de espinela inversa, sintetizada a un tamaño de 17+3 nm, con unas propiedades magnéticas adecuadas (Ms=73 emu/g) . Estas nanoparticulas se sintetizan por coprecipitación de Fe3+ y Co2+ en solución alcalina a ebullición por el método de Wagner (Wagner y col., 2002) . Las nanoparticulas asi obtenidas tienen un punto isoeléctrico aproximado a 8.5, lo que las hace bastante inestables en disoluciones acuosas con pH comprendido entre 7 y 10. El siguiente paso consiste en recubrir este ferrofluido con una capa de silice, con lo que se consigue bajar hasta 3 el punto isoeléctrico de las nanoparticulas haciéndolas estables en disolución a pHs neutros. La capa de silice permite, a su vez, insertar posteriormente grupos funcionales para trabajar sobre la superficie de las nanoparticulas .
El recubrimiento con silice de las nanoparticulas se hace del siguiente modo: se toman 30 mL del ferrofluido de ferrita de cobalto sintetizada previamente y se diluyen hasta 150 mL con agua. Luego se añade 500 μL de hidróxido de tetrametilamonio (TMA), subiendo el pH hasta 11.5-12, y se llevan al matraz de reacción. A continuación se prepara 100 mL de silicato sódico en disolución al 0.50%, y con la
resina Dowex W X8 previamente activada se disminuye el pH hasta 10.5, tras lo cual se filtra con papel de filtro para eliminar la resina de intercambio iónico.
El matraz con el ferrofluido se calienta hasta ebullición con un sistema de reflujo, y se van añadiendo los 100 mL de silicato sódico a lo largo de 2 horas, gota a gota durante la primera hora y media con la ayuda de una bomba peristáltica. El volumen se ha de mantener constante, para lo que se va liberando poco a poco algo de vapor en caso que sea necesario. Cuando la reacción termina, se deja enfriar a temperatura ambiente al aire. El producto de la reacción se dializa durante cuatro dias en tubos de cellophane frente a agua, llevada a pH = 10 por adición de dos gotas de TMA. Se cambia el agua de diálisis cada dia. Para introducir el grupo amino en la superficie de las nanoparticulas magnéticas ya recubiertas por silice se utiliza una reacción basada en el método de Stóber (Wang y col., 1996), una condensación de grupos siloxanos entre los grupos silano del μ-aminopropiltrietoxisilano (APTES) y la capa de silice depositada en la etapa previa sobre el ferrofluido. Para ello se pone en un matraz de reacción la cantidad pertinente de etanol absoluto con amoniaco al 1%, el ferrofluido al 1.5% y el APTES en concentración 1 milimolar (mM) , y se deja agitando suavemente, a 400 revoluciones por minuto (rpm) y con una varilla de vidrio, hasta el dia siguiente. Luego, las particulas se sedimentan magnéticamente y se lavan con etanol, redispersándolas tras dos lavados en un volumen igual a la cantidad original de ferrofluido. Para ello se necesita una inmersión corta (entre 15 y 20 segundos) en un baño de ultrasonidos.
Para llevar el ferrofluido funcionalizado a fase acuosa, las nanoparticulas se sedimentan magnéticamente y se decanta el etanol, siendo sustituido por un volumen igual de disolución acuosa de HEPES 20 mM a pH = 12. Luego
se introduce en el baño de ultrasonidos el tiempo necesario para una correcta dispersión. Este procedimiento se realiza tres veces para eliminar todo el etanol .
Paralelamente se sintetizaron nanoparticulas de oro siguiendo el método de reducción de una sal de oro (III) descrito por D. Duff y A. Baiker (Duff y Baiker, 1993) . En este caso se preparó una disolución básica con concentraciones finales 60 rtiM de NaOH, 1 rtiM del agente reductor [cloruro de tetrakis- (hidroxifenil) fosfonio, (THPC) ] y 1 rtiM de HAUCI4. En un medio acuoso se añaden estos compuestos bajo agitación a 600 rpm, por ese orden y en los volúmenes correspondientes a la cantidad final que se quiera preparar. Tras la formación del coloide, que sucede a los pocos segundos de añadir la sal de oro, se filtra con un filtro Whatman de nitrato de celulosa con un tamaño de poro de 450 nm, y se almacena.
Sobre el ferrofluido de ferrita de cobalto funcionalizado con grupos amino y/o tiol en su superficie se inmovilizan las nanoparticulas de oro por autoensamblaje a estos grupos funcionales, aprovechando la afinidad bien conocida de estos grupos por el oro, produciéndose una quimisorción. En concreto, la presencia de nanoparticulas de oro junto a las nanoparticulas magnéticas funcionalizadas conduce a la decoración superficial de estas últimas con las primeras, quedando recubierta cada nanoparticula magnética por varias nanoparticulas de oro. Estas nanoparticulas de oro son la semilla para reducir metales en la superficie, promoviendo el crecimiento de una capa de oro o de plata sobre la nanoparticula. Esto sucede cuando se ponen en presencia de los iones metálicos con los que se quiere recubrir la nanoparticula y un agente reductor suave capaz de hacer crecer una superficie metálica pero incapaz de producir nucleación secundaria.
Dado que ambas dispersiones -ferrofluido de ferrita de cobalto funcionalizado y las nanoparticulas de oro- están a pH básico, se pueden mezclar ambos coloides sin que haya problemas posteriores de floculación durante el autoensamblaje . En un principio se añaden cantidades iguales de ambos fluidos y tras homogeneizar por agitación en vortex la mezcla se deja reaccionar dos horas. Luego, se sedimentan las nanoparticulas magnéticamente y se comprueba mediante espectrofotometria si en el sobrenadante hay nanoparticulas de oro. Si no las hay, se redispersa el sedimento y se añaden más nanoparticulas de oro, repitiéndose el proceso hasta que se sature la superficie de las nanoparticulas magnéticas con las de oro, momento en el que se detectará un exceso de oro en el sobrenadante. Posteriormente, se lavan las particulas por sedimentación magnética y posterior redispersión en un medio HEPES 20 rtiM a pH = 11 tres veces, para eliminar el exceso de nanoparticulas de oro.
Sobre las nanoparticulas anteriores ya decoradas con nanoparticulas de oro se hace crecer una capa de oro mediante la reducción de HAUCI4 con un reductor suave que favorezca el crecimiento en lugar de la nucleación de nuevas particulas de oro, como es la hidroxilamina (NH2OH) . En cada reducción, las nanoparticulas magnéticas decoradas con nanoparticulas de oro actúan como centros de nucleación. Repitiendo este proceso de reducción varias veces se consigue que se forme una capa continua de oro sobre las nanoparticulas magnéticas. Además, en función de la cantidad de oro que se añada y del número de etapas de reducción se pueden lograr diferentes tamaños de particula. Esto se ve reflejado en la banda de absorción de resonancia de plasmón superficial, que se desplaza en función de la cantidad de oro añadida.
El tamaño final de las nanopartículas biosensoras producidas en el presente ejemplo está comprendido entre 50 y 80 nm de diámetro, como puede comprobarse por microscopia electrónica de transmisión (Figura 2) . Las particulas magnéticas que constituyen el núcleo de las nanoparticulas tienen 18+3 nm, y el espesor de la capa de silice es entre 1 y 15 nm.
Ejemplo 1.2.- Síntesis de nanoparticulas biosensoras de aleación oro/plata.
El proceso de obtención de nanoparticulas recubiertas por una aleación Au/Ag se basa en la reducción del ion plata sobre las nanoparticulas magnéticas decoradas con nanoparticulas de oro obtenidas tal como se indica en el apartado 1.1. Para ello se ponen 500 μL del ferrofluido decorado con particulas de oro, 400 μL de glicina 0.5 M, 600 μL de agua (de pureza milli-Q) , 20 μL de AgNO3 12 rtiM y 100 μL de ácido ascórbico 10 mM. Esta solución se deja a temperatura ambiente y en oscuridad durante 6 horas, se lavan las nanoparticulas por sedimentación magnética tres veces, resuspendiendo en 500 μL de agua cada vez, y se repite el proceso (Huang y col., 2004) . La inmovilización de las moléculas de PNA se realiza tal como se detallará en el Ejemplo 1.4.
Ejemplo 1.3.- Sintesis de nanoparticulas biosensoras de oro, plata y oro.
Se toman 2 mL de un ferrofluido de ferrita de cobalto cuya sintesis de ha descrito en el ejemplo 1.1. y se hace reaccionar con una mezcla de dos silanos, en proporciones diferentes entre 50 y 80% de μ-APTES y el resto de μ-MPTMS . El volumen añadido de estos reactivos suma 50 μL. Todo esto se hace en un matraz, bajo agitación suave (100 rpm) con varilla de vidrio, poniendo 288 mL de etanol absoluto y 10
rtiL de NH3 al 25%. Luego se vierte el ferrofluido y, por último, los silanos. Esto se deja reaccionar a temperatura ambiente hasta el dia siguiente. Posteriormente se lavan, se resuspenden en 20 mL de etanol 2 veces y otras 3 veces en agua, y se dejan en un volumen final de 10 mL (con ello se diluye la concentración de nanoparticulas 5 veces, de modo que queda aproximadamente 3 mg/mL) .
Por otro lado se sintetizan nanoparticulas de oro según el método descrito en el apartado 1.1. Las nanoparticulas de oro se ponen en presencia de las nanoparticulas magnéticas funcionalizadas, y se acidifica la suspensión de forma que el oro se inmovilice sobre el ferrofluido, durante al menos una hora. Luego se lava y al resuspender en 5 mL de agua, se sube el pH hasta 11 con NaOH IN. En ese punto, al atraer con un imán no ha de quedar oro en la disolución.
A continuación se recubre con plata según el método del formaldehido descrito por N. Halas (Hallas y col., 2005) , etapa que se hace el número necesario de veces para conseguir un recubrimiento total. El método consiste en tomar 9 mL de agua con una concentración 0.15 rtiM de AgNO3 y añadir 500 μL de las nanoparticulas magnéticas decoradas con oro. Acto seguido se añaden 50 μL de formaldehido al 37%, se agita con el vórtex rápidamente y se vierte de inmediato 50 μL de NH3 al 25%. Se vuelve a agitar, y al cabo de dos minutos se sedimenta magnéticamente. Se mide el plasmón del sobrenadante, y tras lavar dos veces, el de las nanoparticulas . Estas medidas se hacen en todas las etapas del recubrimiento, hasta que se vea que el plasmón de la plata se extiende a lo largo de todo el rango visible, punto en el que se considera que la capa de plata está prácticamente cerrada.
Posteriormente, la capa de plata se recubre a su vez con oro por el método descrito en el Ejemplo 1.1.,
resuspendiéndose hasta una dilución mayor: 0.3 mg/itiL en lugar de 3 mg/itiL. El resultado final es que las nanoparticulas adquieren una estabilidad en disolución mucho mayor, y no se agregan. Se ponen tres etapas de recubrimiento de oro en las siguientes condiciones : 5 mL de nanoparticulas a 0.3 mg/mL, 50 μL de HAUCI4 25 rtiM y 80 μL de NH2OH-HCl 100 mM, bajo agitación en el vortex. Se lava dos veces, y se siguen las etapas de recubrimiento con la variación de la banda de resonancia del plasmón superficial. Se observa cómo va creciendo la banda a 520 nm, y el máximo se desplaza hacia longitudes de onda más largas, lo que indica la progresión del recubrimiento. Cuando se recubren las nanoparticulas 10 veces más diluidas, como es en este caso, su estabilidad en superficie resulta mucho mayor.
Ejemplo 1.4.- Inmovilización de PNA sobre las nanoparticulas biosensoras con capa externa de oro ó plata.
Posteriormente a lo indicado en los Ejemplos 1.1 a 1.3, en las nanoparticulas magnéticas con recubrimiento de oro asi elaboradas se procede a la inmovilización de una molécula biosensora. En concreto para el presente ejemplo se ha utilizado una molécula orgánica tipo PNA, lo que confiere a la nanoparticula biosensora de la invención la funcionalidad de poder hibridarse a ácidos nucleicos naturales (DNA o RNA) con secuencias complementarias a las del PNA. La capa de oro externa de las nanoparticulas presenta unas propiedades de soporte, y sobre ella se pueden quimisorber compuestos tiolados . Por ello, los PNAs que se van a inmovilizar sobre las nanoparticulas tienen en un extremo un grupo tiol aportado por una cisteina (Cys) , de modo que van a formar monocapas orientadas de hebras de PNA, tal como los inventores han demostrado previamente con cristales de oro (Briones y col., 2004; 2005).
En realizaciones particulares de este ejemplo se han empleado dos moléculas diferentes de PNA de cadena sencilla, ambas con una cisteina en su extremo amino . A continuación de la Cys, las moléculas de PNA poseen dos grupos espaciadores de tipo "0" que corresponden a moléculas de ácido 8-amino-3, 6-dioxaoctanoico, y que en conjunto forman un espaciador de 3 nm de longitud que permite separar el extremo de la molécula inmovilizado sobre la nanoparticula de la región sensora con capacidad para hibridarse a ácidos nucleicos . La primera molécula de PNA utilizada se denomina "P-G", posee 11 bases nucleotidicas de longitud y su secuencia (escrita desde el extremo amino al extremo carboxilo) es: Cys-O-O-SEQ ID N° 1. Esta secuencia ha sido elegida por su relevancia en virologia animal, ya que corresponde a la región más antigénica (denominada "loop RGD") de la proteina VPl de la cápsida del virus de la fiebre aftosa (FMDV) (Martinez y col., 1997) .
La segunda secuencia de PNA se denomina "P-M" y su secuencia (de 9 bases nucleotidicas de longitud) es: Cys-O- O-SEQ ID N° 2. Esta secuencia ha sido elegida debido a su relevancia biosanitaria, ya que incluye la secuencia complementaria al codón 41 de la región de la transcriptasa reversa (RT) del gen pol del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) , una posición en la que se ha descrito la frecuente aparición de la mutación M41L implicada en la resistencia de HIV al fármaco antiviral denominado Zidovudina (AZT) (Yeni y col., 2002).
Para inmovilizar el PNA sobre las nanoparticulas, se toman 76 μL del ferrofluido recubierto con oro elaborado previamente, y se añaden 4 μL de una disolución de las moléculas de PNA diluida en agua (pureza milli-Q) a concentración 10 μM. La quimisorción del PNA sobre las nanoparticulas se logra mediante incubación a una
temperatura de entre 20 y 250C, durante tres horas y cuarto. Posteriormente, las nanopartículas se sedimentan magnéticamente y el sobrenadante se cambia por agua. Se resuspenden las nanoparticulas, y se repite el proceso dos veces más para eliminar todo el PNA que no haya reaccionado con el recubrimiento de oro de las nanoparticulas . Las nanoparticulas ya decoradas con PNA se concentran bajo la acción de un campo magnético y se comprueba la adsorción de las moléculas de PNA por espectroscopia infrarroja de transmisión (linea discontinua en Figura 3) . Este espectro de PNA sobre la nanoparticula se considerará el "blanco" en los experimentos posteriores de hibridación de las nanoparticulas a DNA de una muestra, tal como se expone en el Ejemplo 2.
Ejemplo 2.- Hibridación de la nanoparticula biosensora recubierta de oro y PNA a una molécula de DNA con secuencia complementaria a la del PNA. Determinación mediante el aumento de la intensidad de las bandas de absorción en el infrarrojo debidos a la hibridación del DNA con el PNA.
Como se ha indicado previamente, la diferencia estructural más importante entre el PNA y los ácidos nucleicos naturales es que aquél posee un esqueleto de naturaleza peptidica mientras que el DNA y el RNA presentan en su esqueleto una sucesión de grupos desoxirribosa (el DNA) o ribosa (el RNA) y fosfato (Nielsen y col., 1991; Egholm y col., 1992) . Por tanto, el PNA carece de grupos fosfato y de anillos glucidicos, lo que le ofrece una utilidad especial en el diseño de biosensores para la detección de hibridación de DNA o RNA. En este ejemplo se aprovecha precisamente que el cambio más notable que produce la hibridación PNA/DNA en la región del infrarrojo lo proporcionan los grupos fosfato del DNA, ya que tienen la tensión antisimétrica (una banda ancha en el intervalo
1260-1200 cπf1) y la simétrica del enlace P=O (en torno a 1100 cm"1) . Otros hechos espectrales atribuibles a los residuosde desoxirribosa o ribosa de las cadenas DNA/RNA se detectan a 1065 cm"1. Estas bandas se observan en una zona del espectro donde no absorben radiación ni las bases nucleotidicas del PNA y el DNA ni el esqueleto peptidomimético del PNA. Además, se produce un aumento en la señal en torno a 1580 cm"1 debida al apareamiento de las bases nitrogenadas (Ver figuras 3 y 4) . En el presente ejemplo se han empleado nanoparticulas magnéticas recubiertas de oro funcionalizadas con moléculas del PNA "P-G" o bien con el "P-M", cuyas secuencias se indican en el ejemplo 1.4. Se han diseñado moléculas de DNA de cadena sencilla que poseen una región central complementaria a la de dichos PNAs. Se han diseñado y sintetizado cuatro moléculas de DNA diana, de 31 nucleótidos (nt) de longitud, que corresponden con las secuencias de tipo salvaje y mutante de FMDV ("DNA-G" 5'- SEQ ID N° 3 -3', y "DNA-E" 5'- SEQ ID N° 4 -3', respectivamente, que difieren en la mutación de tipo "transición" G—>A en su posición central) y de HIV ("DNA-M" 5'-SEQ ID N° 5 -3', y "DNA-L" 5'- SEQ ID N° 6 -3', respectivamente, que difieren en la mutación de tipo "transversión" A—>T en su posición central) . De esta forma, se estudia la capacidad de cada familia de nanoparticulas funcionalizadas con un tipo de PNA no sólo para detectar la presencia del DNA o RNA complementario en una muestra sino incluso para discriminar entre secuencias de DNA o RNA con una mutación puntual. Por tanto se aplica nuestro sistema biosensor en biosanidad animal y humana, tanto para la detección de secuencias de DNA/RNA caracteristicas de virus patógenos como para determinar si tales secuencias informan sobre la existencia de una población viral con capacidad de
evadir el sistema inmune, escapar a vacunas o ser resistente a fármacos antivirales. En cada caso, las secuencias de DNA de la otra familia se utilizan como control de no hibridación, es decir, aquellas hibridaciones que no deben producirse (o, si se producen, deben lavarse completamente) puesto que la complementariedad de secuencia PNA/DNA es despreciable (por ejemplo, el PNA "P-G" con los DNAs "DNA-M" y "DNA-L") .
Por otra parte, se han diseñado y sintetizado otras dos moléculas de DNA, de cadena sencilla y 20 nt de longitud, que son complementarias a la vez a los dos PNAs utilizados en una y otra orientación: "DNA-GM": 5'-SEQ ID N° 7 -3' (hibridación paralela con "P-G" y antiparalela con "P-M") y "DNA-MG": 5'-SEQ ID N° 8 -3' (hibridación antiparalela con "P-G" y paralela con "P-M") . Por tanto, cada una de estas dos moléculas de DNA podrá hibridar con los dos PNAs que recubren sendas nanoparticulas diferentes.
En todos los casos, la hibridación de las nanoparticulas recubiertas con PNA y el DNA se realiza durante 1 hora, a temperaturas comprendidas entre los 41 y 58 °C, con concentraciones de DNA de 100 μM, y seguidas de un lavado de dos ciclos de 15 minutos a temperaturas comprendidas entre 37 y 50 °C. Las soluciones de hibridación (SH) y lavado (SL) empleadas han sido de dos tipos: i) SH compuesta de NaCl 7mM + citrato de Na 0.7 rtiM (pH = 7.2), SL compuesta de NaCl 45mM + citrato de Na 4.5 rtiM (pH = 7.0); ii) SH y SL compuesta de NaCl 6OmM + citrato de Na 6 rtiM + laurilsarcosina 0.72%. Previamente al análisis, en todos los casos se realiza un último lavado en agua (milli Q) para eliminar restos de sales .
Como ejemplo de los resultados producidos, el espectro de infrarrojo obtenido tras la hibridación y lavado de las nanoparticulas biosensoras con cobertura metálica de oro y
recubiertas por PNA de tipo "P-G" con el "DNA MG" se muestra en trazo continuo en la Figura 3. En ella se hace patente que tras la hibridación entre PNA y DNA perfectamente complementario aparecen entre otros los picos correspondientes a los grupos fosfato del DNA, como señal que claramente indica el evento de hibridación producido, a una frecuencia de 1220 y 1060 cm"1.
Como ejemplo de los resultados obtenidos con nanoparticulas biosensoras con cubierta metálica formada por capas sucesivas de oro/plata/oro, se muestra en el panel superior de la Figura 4 el espectro de infrarrojo obtenido tras la hibridación y lavado de estas nanoparticulas biosensoras recubiertas por PNA de tipo "P- G" con el "DNA MG" de secuencia complementaria. Por comparación, el espectro inferior corresponde a nanoparticulas idénticas a las anteriores (recubiertas por PNA tipo "P-G") pero hibridadas con una sonda de DNA de secuencia no complementaria al PNA ("DNA L") , que al no hibridar especificamente es eliminada durante el ciclo de lavado. En el espectro superior de la figura aparecen los picos a 1225 y 1036 cm"1 correspondientes a los grupos fosfato del DNA, ligeramente desplazados respecto a sus posiciones en la figura 3 por efecto de la capa de plata. Además, análogamente a lo que se observa en la Figura 3, otro hecho espectral caracteristico de la hibridación del PNA a un DNA complementario es la banda a 1590 cm"1, correspondiente al apareamiento especifico de las bases nitrogenadas del PNA con las del DNA.
Ejemplo 3.- Hibridación de la nanoparticula biosensora recubierta de oro y PNA a una molécula de DNA con secuencia complementaria a la del PNA. VoItamogramas ciclicos de la tionina incorporada a través de interacciones iónicas con los residuos fosfatos de las cadenas de DNA.
Empleando las nanopartículas biosensoras elaboradas como se detalla en el Ejemplo 1 se ha llevado a cabo el proceso indicado en el Ejemplo 2, pero empleando una diferente técnica de detección de la hibridación. Se han obtenido voltamogramas ciclicos empleando electrodos planos de oro modificados con las moléculas de PNA indicadas en el Ejemplo 1.4, posteriormente incubadas con diferentes concentraciones de DNA complementario. En este caso, tras la hibridación y el lavado, las nanoparticulas hibridadas se incuban con una disolución de tionina y se someten a volametria ciclica en presencia de peroxidasa y H2O2.
La Figura 5 muestra las corrientes obtenidas empleando nanoparticulas funcionalizadas con el PNA "P-M", en un rango de concentración de "DNA-M" entre 10"14 y 10"6 M. Posteriores aumentos de sensibilidad se obtienen disminuyendo el volumen de reacción, con lo que se llega a sensibilidades de detección de 10~16 M de DNA, es decir, de 0.1 femtomolar.
REFERENCIAS
1. Abad, JM. Vélez, M., Santamaría, C, Guisan, J.M., Matheus, P. R., Vázquez, L., Gazaryan, I., Gorton, L., Gibson, T. & Fernández, V.M. Immobilization of peroxidase glycoprotein on gold electrodes modified with mixed epoxy-boronic acid monolayers . J. Am. Chem. Soc. 124, 12845-12853 (2002) .
2. Arlinghaus HF, Ostrop M, Friedrichs 0, Feldner JC. Genome diagnostics with TOF-SIMS. Appl . Surf. Sci. 203: 689-692 (2003) .
3. Arlinghaus, H. F., Kwoka, M. N., Jacobson, K. B. Analysis of biosensor chips for identification of nucleic acids . Anal Chem. 69: 3747-3753 (1997) .
4. Brandt, 0., Feldner, J., Stephan, A., Schrδder, M., Schnδlzer, M., Arlinghaus, H. F., Hoheisel, J. D. &
Jacob, A. PNA microarrays for hybridisation of unlabelled DNA samples . Nucleic Acids Res. 31, ell9- el27 (2003) .
5. Briones, C, Mateo-Martí, E., Gómez-Navarro, C, Parro, V., Román, E. y Martín-Gago, J.A. Ordered self- assembled monolayers of peptide nucleic acids with DNA recognition capability. Physical Review Letters 93: 208103 (2004) .
6. Briones, C, Mateo-Martí, E., Gómez-Navarro, C, Parro, V., Román, E. y Martín-Gago, J.A. Structural and functional characterization of self-assembled monolayers of peptide nucleic acids and its interaction with complementary DNA. Journal of Molecular Catalysis 228: 131-136 (2005) . 7. del Monte, F., Morales, M. P., Levy, D., Fernández, A., Ocaña, M., Roig, A., Molins, E. & Serna, C. J. Formation of gamma-Fe2C>3 isolated nanoparticles in a silica matrix. Langmuir 13: 3627-3634 (1997) .
8. Demidov W, Protozanova E, Izvolsky KI, Price C, Nielsen PE, Frank-Kamenetskii MD. Kinetics and mechanism of the DNA double helix invasión by pseudocomplementary peptide nucleic acids . Proc Nati Acad Sci USA. 99: 5953-5958 (2002).
9. Demidov W, Yavnilovich MV, Belotserkovskii BP, Frank- Kamenetskii MD, Nielsen PE. Kinetics and mechanism of polyamide ("peptide") nucleic acid binding to dúplex DNA. Proc Nati Acad Sci USA. 92: 2637-2641 (1995). 10. Duff, D. G., Baiker, A. & Edwards, P.P. A new hydrosol of gold clusters . 1. Formation and particle-size variation. Langmuir 9: 2301-2309 (1993) .
11. Egholm, M., Buchardt, 0., Christensen, L., Behrens, C, Freier, S. M., Driver, D. A., Berg, R. H., Kim, S. K., Norden, B. & Nielsen, P. E. PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules. Nature 365, 566-568 (1993).
12. Egholm, M., Buchardt, 0., Nielsen, P. E., & Berg, R. H. Peptide nucleic acids (PNA) . Oligonucleotide analogues with an achiral backbone. J. Am. Chem. Soc. 114, 1895- 1898 (1992) .
13. Garcell L., Morales M. P., Andres-Verges M., Tartaj P. & Serna CJ. Interfacial and rheological characteristics of maghemite aqueous suspensions. J. of Colloid and Interf. Sci. 205, 470-475 (1998).
14. Griffin TJ, Tang W, Smith LM. Genetic analysis by peptide nucleic acid affinity MALDI-TOF mass spectrometry. Nat Biotechnol . 15: 1368-1372 (1997) .
15. Hacia, J. G. Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays . Nature Genetics 21: 42-47
(1999) .
16. Halas N. Playing with plasmons . Tuning the optical resonant properties of metallic nanoshells. MRS Bulletin 30: 362-367 (2005).
17. Harris, H. The DNA microarray . The Scientist 19: 27-31
(2005) .
18. Huang. CC, Yang, Z. S. & Chang, H. T. Synthesis of dumbbell-shaped Au-Ag core-shell nanorods by seed- mediated growth under alkaline conditions . Langmuir 20: 6089-6092 (2004) .
19. Jackson JB, Halas NJ. Silver nanoshells: Variations in morphologies and optical properties . JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY B 105: 2743-2746 (2001) . 20. Jolivet, J. P., Massart, R. & Fruchard, J.M. Synthesis and physicochemical study of non-surfactant magnetic colloids in an aqueous médium. Nouv. J. Chim. 7: 325- 331 (1983) .
21. Kambhampati D, Nielsen PE, Knoll W. Investigating the kinetics of DNA-DNA and PNA-DNA interactions using surface plasmon resonance-enhanced fluorescence spectroscopy . Biosens Bioelectron. 16: 1109-1118 (2001) .
22. Lee, J., Isobe, T. & Senna, M. Preparation of ultrafine Fe3Ü4 partióles by precipitation in the presence of PVA at high pH. J. Colloid Interface Sci. 177: 490-494 (1996) .
23. Madoz, J., Kuznetzov, B.A., Medrano, F. J., Garcia, J. L. & Fernández, V.M. Functionalization of gold surfaces for specific and reversible attachment of a fused beta- galactosidase and choline-receptor protein. J. Am. Chem. Soc. 119: 1043-1051 (1997).
24. Martinez, M.A., Verdaguer, N., Mateu, M. G. & Domingo, E. Evolution subverting essentiality : dispensability of the cell attachment Arg-Gly-Asp motif in multiply passaged foot-and-mouth disease virus. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94, 6798-6802 (1997).
25. Massart, R & Cabuil, V. Effect of some parameters on the formation of colloidal magnetite in alkaline-medium
- yield and particle-size control. J. Chem. Phys . 84, 967-973 (1987) .
26. Massart, R. Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media. IEEE transactions on magnetics 17: 1247-1248 (1981).
27. Nielsen PE. Applications of peptide nucleic acids . Curr Opin Biotechnol. 10: 71-75 (1999).
28. Nielsen PE. Peptide nucleic acid targeting of double stranded DNA. Methods Enzymol. 340: 329-340 (2001). 29. Nielsen, P. E., Egholm, M., Berg, R. H. & Buchardt, 0. Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide. Science 254, 1497-1500 (1991) .
30. Oldenburg, S. J., Averitt, R. D., Wescott, S. L. & Halas, N. J. Nanoengineering of optical resonances . Chemical
Physics Lett. 288: 243-247 (1998).
31. Osawa, M. & Ikeda, M. Surface-enhanced infrared- absorption of para-nitrobenzoic acid deposited on silver island films - contributions of electromagnetic and chemical mechanisms. J. Phys. Chem. 95: 9914-9919 (1991) .
32. Parinov, S., Barsky, V., Yershov, G., Kirillov, E., Timofeev, E., Belgovskiy, A. & Mirzabekov, A. DNA sequencing by hybridisation to microchip octa- and decanucleotides extended by stacked pentanucleotides . Nucleic Acids Res. 24, 2998-3004 (1996).
33. Philipse, A. P., van Bruggen, M. P. B. & Pathmamanoharan, C. Magnetic silica dispersions - preparation and stability of surface-modified silica particles with a magnetic core. Langmuir 10: 92-99 (1994).
34. Relógio, A., Schwager, C, Richter, A., Ansorge, W. & Valcárcel, J. Optimization of oligonucleotide-based DNA microarrays . Nucleic Acids Res. 30: e51 (2002).
35. Rogers FA, Vasquez KM, Egholm M, Glazer PM. Site- directed recombination via bifunctional PNA-DNA conjugates. Proc Nati Acad Sci USA 99: 16695-16700 (2002) . 36. Solinas S., Piccaluga G., Morales M. P. & Serna CJ. Sol-gel formation of gamma-Fe2θ3/Siθ2 nanocomposites; Acta Materialia 49, 2805-2811 (2001) .
37. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis . J Mol Biol . 98: 503-517 (1975) .
38. Southern E.M. Case-Green, S. C, Eider, J. K., Jonson, M., Mir, K. U., Wang, L. & Williams, J. C. Arrays of complementary oligonucleotides for analysing the hybridization behavior of nucleic acids . Nucleic Acids Res. 22: 1368-1373 (1994).
39. Sugimoto, T. & Matijevic, E. Formation of uniform spherical magnetite particles by crystallization from ferrous hydroxide ges . J. Colloid Interface Sci. 74: 227-243 (1980) . 40. Tartaj, P., González-Carreño, T. & Serna, CJ. Single- step nanoengineering of silica coated maghemite hollow spheres with tunable magnetic properties . Advanced materials 13: 1620-1624 (2001).
41. Urakawa, T., Nakzawa, T., Inoue, H., Shirat, T. & Fluk, E. J. Preparation and Mossbauer spectroscopic characterization of ultrafine iron oxide particles. J. Mater. Sci. Lett . 15: 1237-1239 (1996).
42. Veintenillas-Verdaguer, S., Morales, M. P. & Serna, CJ. Continuous production of gamma Fe2Ü3 ultrafine powders by láser pyrolysis. Materials Lett. 35, 227-231 (1998).
43. Vo-Dinh, T. Surface-enhanced Raman spectroscopy using metallic nanostructures . Trends in Anal. Chem. 17: 557- 582 (1998) .
44. Wagner, J., Autenrieth, T. & Hempelmann, R. Core shell partióles consisting of cobalt ferrite and silica as model ferrofluids [CoFe2θ4-SiC>2 core shell partióles] . J. of Magnetism and Magnetic Materials 252: 4-6 (2002). 45. Wang J, Nielsen PE, Jiang M, Cai X, Fernandes JR, Grant DH, Ozsoz M, Beglieter A, Mowat M. Mismatch-sensitive hybridization detection by peptide nucleic acids immobilized on a quartz crystal microbalance . Anal Chem. 69: 5200-5202 (1997). 46. Wang, J., Palecek, E., Nielsen, P. E., Rivas, G., Cai, X., Shiraishi, H., Dontha, N., Luo, D., Farias, P.A.M. Peptide Nucleic Acid Probes for Sequence-Specific DNA Biosensors. J. Am. Chem. Soc. 118: 7667-7670 (1996).
47. Watson, J. D. & Crick, H. D. Molecular Structure of Nucleic Acids : A Structure for Deoxyribose Nucleic
Acid. Nature 171: 737-738 (1953).
48. Wittung, P., Nielsen, P. E., Buchardt, 0., Egholm, M. & Norden, B. DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid. Nature 368: 561-563 (1994). 49. Yeni, P. G., Hammer, S.M., Carpenter, CC, Cooper, D.A., Fischl, M.A., Gatell, J.M., Gazzard, B. C, Hirsch, M. S., Jacobsen, D.M., Katzenstein, D.A., Montaner, J. S., Richman, D. D., Saag, M. S., Schechter, M., Schooley, R. T., Thompson, M.A., Vella, S. & Volberding, P.A. Antiretroviral treatment for adult HIV infection in 2002: updated recommendations of the International AIDS Society-USA Panel. JAMA 288, 222-235 (2002) .
Claims
1.- Nanopartícula biosensora que comprende: a. Una nanopartícula magnética, b. Una capa de sílice, c. Una capa o varias capas externas metálicas que pueden ser de distinta naturaleza y depositadas con distinta alternancia, e inmovilizada en su superficie externa, y d. Una capa de moléculas biosensoras orgánicas o inorgánicas, sintéticas o de origen natural con capacidad de unirse a biomoléculas .
2.- Nanopartícula biosensora de la reivindicación 1, donde: a) El espesor del núcleo magnético presenta un tamaño mínimo de 4 nm de diámetro y máximo de 30 nm de diámetro, b) El espesor de la capa de sílice oscila entre un mínimo de 1 nm de espesor y un máximo de 20 nm de espesor, y c) El espesor de la capa metálica oscila entre un mínimo de 1 nm de espesor y un máximo de 200 nm de espesor.
3. - Nanopartícula biosensora según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 donde el núcleo magnético comprende uno o cualquier combinación de los siguientes grupos : a) oxido de hierro, b) óxido de hierro cobalto, y c) materiales magnéticos no óxidos.
4. - Nanopartícula biosensora según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 donde la capa externa metálica comprende uno de los siguientes metales: oro, plata, cobre, platino o una aleación formada por varios o todos estos metales .
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
5. - Nanoparticula biosensora según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 donde las moléculas biosensoras comprenden una o varias moléculas seleccionadas de los siguientes conjuntos: a) Biomoléculas naturales, b) Biomoléculas naturales obtenidas por procedimientos de selección in vitro, y c) Biomoléculas artificiales
6.- Nanoparticula biosensora según la reivindicación 5 donde las biomoléculas naturales obtenidas por procedimientos de selección in vitro son aptámeros, ribozimas o aptazimas.
7.- Nanoparticula biosensora según la reivindicación 5 donde la biomoléculas artificiales son ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) .
8.- Nanoparticula biosensora según la reivindicación 5 donde la biomoléculas artificiales son anticuerpos artificiales, anticuerpos recombinantes o minianticuerpos .
9.- Nanoparticula biosensora según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 donde: a . La nanoparticula magnética es ferrita de cobalto, b. La capa de sílice está funcionalizada con grupos amino o grupos tiol, c. La capa metálica es oro o una capa de plata y sucesivamente otra de oro, y d. La biomolécula inmovilizada es un PNA modificado en uno de sus extremos, consistiendo dicha modificación en la inserción de un grupo tiol en dicho extremo.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
10.- Procedimiento de obtención de la nanopartícula biosensora de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9 que comprende las siguientes etapas: a. Preparación de un coloide de partículas magnéticas de entre 4 y 30 nm de tamaño, b. Condicionamiento del coloide para que sea estable a pHs básicos (mayores de pH=7) , c. Recubrimiento de las nanopartículas coloidales en medio básico con una capa de sílice de un espesor entre 1 y 20 nm, d. Funcionalización química de la superficie de las nanopartículas obtenidas en c) para introducir grupos funcionales, e. Recubrimiento de las nanopartículas magnéticas funcionalizadas de d) con una capa metálica, y f. Inmovilización de la molécula biosensora sobre la superficie de la nanopartícula resultante de e .
11.- Procedimiento de obtención de la nanopartícula biosensora según la reivindicación 10 donde el recubrimiento de la nanopartículas magnéticas funcionalizadas de d) con una capa metálica comprende las siguientes etapas: a. Síntesis de nanopartículas de metal estables en agua, con un diámetro de entre 3 y 20 nm, b. Quimisorción de las nanopartículas de metal sobre las nanopartículas resultantes de d) , y c. Crecimiento sobre el producto obtenido en b) de una capa metálica, formando una capa de un espesor controlado entre 1 y 200 nm.
12. - Procedimiento de obtención de la nanopartícula biosensora según la reivindicación 10 donde se realiza una
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) extensión de la etapa c) promoviendo un crecimiento adicional de la capa de sílice con tetraetoxi ortosilicato .
13. - Uso de la nanopartícula biosensora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9 para la elaboración de un microarray o micromatriz en el que cada punto está constituido por una nanopartícula biosensora.
14. - Uso de la nanopartícula biosensora según cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9 para al menos una de las siguientes aplicaciones: a. Detección de patógenos de tipo viral, bacteriano, fúngico o protozoario, b. Caracterización de mutaciones o polimorfismos genéticos (SNPs) en dichos agentes que pueden hacerlos resistentes a fármacos o facilitar el escape de vacunas, c. Caracterización de mutaciones o SNPs en genes humanos o animales, relacionados con enfermedades o con propensión a ellas, d. Detección de marcadores tumorales concretos, e. Detección de microorganismos concretos, patógenos o contaminantes en alimentos, f. Detección de la presencia de organismos manipulados genéticamente (OMG) o transgénicos en alimentos, y g. Detección de microorganismos o toxinas contaminantes del medio ambiente.
15.- Método para la determinación de la hibridación o unión de una molécula biológica a la biomolécula orgánica inmovilizada a una nanopartícula biosensora de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9, que comprende las siguientes etapas :
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) a. Reacción de la nanopartícula biosensora de la invención con una muestra susceptible de contener la molécula biológica candidata, b. Captura de las nanopartículas biosensoras por sedimentación magnética, c. Determinación de la hibridación ocurrida en la etapa a) , d. Deducción de la existencia de la molécula biológica candidata en la muestra susceptible de contenerla, y e. Opcionalmente, cuantificación de la concentración de la molécula biológica candidata en la muestra.
16.- Método para la determinación de la hibridación según la reivindicación 15 que se lleva a cabo mediante detección espectroscópica .
17.- Método según la reivindicación 16 donde el método de detección espectroscópica utilizado es mediante radiación ultravioleta .
18.- Método según la reivindicación 16 donde el método de detección espectroscópica utilizado es mediante radiación visible.
19.- Método según la reivindicación 16 donde el método de detección espectroscópica utilizado es mediante radiación infrarroja .
20.- Método según la reivindicación 16 donde el método de detección espectroscópica utilizado es mediante espectroscopia Raman.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
21.- Método según la reivindicación 19 donde la detección espectroscópica de la molécula biológica hibridada o unida a la nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9 se lleva a cabo mediante el uso de un equipo infrarrojo, midiendo la absorción de las nanopartículas por transmisión o reflexión atenuada o en la modalidad de ángulo rasante .
22.- Método según la reivindicación 21 donde la medida de la absorción de las nanopartículas por transmisión integra la técnica de la Transformada de Fourier para la resolución de espectros y utiliza ventanas de transmisión de fluoruro de bario o fluoruro de calcio u otro tipo de ventana transparente a la radiación infrarroja.
23. - Método según la reivindicación 22 donde las ventanas transparentes a la radiación infrarroja pueden adoptar una configuración en flujo.
24.- Método para la detección de una sonda electroquímica que se lleve a cabo mediante técnicas electroquímicas lineales, cíclicas o de pulso que es atraída electrostáticamente por las cargas negativas portadas por las cadenas de DNA o RNA hibridadas con cadenas neutras de PNA inmovilizadas sobre la nanopartícula biosensora de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9.
25.- Método según la reivindicación 24 donde la sonda electroquímica es una molécula catiónica en su estado oxidado o neutra o aniónica en su estado reducido.
26.- Método según la reivindicación 25 donde la sonda electroquímica en su estado neutro o cargado negativamente
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) puede ser reoxidada catalíticamente a su estado de carga positiva por un enzima u otro catalizador.
27.- Método según la reivindicación 26 donde el catalizador obtiene electrones de la sonda electroquímica y los transfiere a un reactivo adecuado.
28.- Método según la reivindicación 26 donde la enzima es una peroxidasa.
29.- Método según la reivindicación 27 donde el reactivo es peróxido de hidrógeno.
30.- Método según la reivindicación 26 donde la sonda es la molécula tionina.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
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---|---|---|---|
US12/067,166 US8623636B2 (en) | 2005-09-16 | 2006-09-12 | Nanoparticle biosensor, method of preparing same and uses thereof |
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010536041A (ja) * | 2007-08-10 | 2010-11-25 | ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 前方結像型光干渉断層(oct)システムおよびプローブ |
WO2010093420A3 (en) * | 2009-02-11 | 2011-03-31 | University Of Houston | Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles and uses thereof |
US20120015344A1 (en) * | 2010-05-14 | 2012-01-19 | 1. Board of Trustees of MICHIGAN STATE UNIVERSITY | Methods, compositions, and apparatus for the detection of viral strains |
US20120257199A1 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Nanyang Technological University | Method of diagnosing malaria infection in a patient by surface enhanced resonance raman spectroscopy |
Families Citing this family (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009145189A (ja) * | 2007-12-13 | 2009-07-02 | Fujifilm Corp | バイオセンサー |
KR101114507B1 (ko) * | 2010-05-24 | 2012-03-13 | 한국과학기술원 | 자성 나노입자-플래티늄 나노입자-다공성 탄소 복합체 및 그 제조방법 |
DE102010062184B3 (de) * | 2010-11-30 | 2012-04-19 | Technische Universität Dresden | Verfahren zur Metallbeschichtung von Nanopartikeln mittels stromloser Abscheidetechniken |
KR101311920B1 (ko) | 2010-12-21 | 2013-09-26 | 한국생명공학연구원 | 란타나이드 금속착체를 이용한 형광 나노입자 및 그 제조방법 |
KR101304427B1 (ko) * | 2011-04-12 | 2013-09-05 | 한국과학기술연구원 | 재사용이 용이한 기공체 - 위성 나노입자 복합체 및 그 제조방법 |
EP2722672B1 (en) | 2011-06-15 | 2019-02-20 | Sanyo Chemical Industries, Ltd. | Assay method using magnetic silica particles and reagent for said assay method |
KR20130015634A (ko) * | 2011-08-04 | 2013-02-14 | 삼성전자주식회사 | 자성 나노입자의 응집을 이용한 바이오센서 및 그의 검출 방법 |
JP6654897B2 (ja) | 2012-08-31 | 2020-02-26 | スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ | 粒子、方法およびその使用 |
WO2014100380A2 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Multimodal particles, methods and uses thereof |
WO2014104713A1 (ko) * | 2012-12-24 | 2014-07-03 | 주식회사 노마디엔 | 금 마감 자성 마이크로스피어 |
KR102310098B1 (ko) * | 2013-02-19 | 2021-10-06 | 삼성전자주식회사 | 금속 나노입자와 발광물질의 접합체 |
JP6635791B2 (ja) | 2013-02-20 | 2020-01-29 | スローン − ケタリング・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ | 広視野ラマン撮像装置および関連方法 |
DE112014001699T5 (de) * | 2013-03-27 | 2015-12-10 | Imra America, Inc. | Für Magnetsensordetektion nützliche magnetische Nanopartikel speziell bei Biosensoranwendungen |
US9638639B2 (en) | 2013-06-04 | 2017-05-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Plasmonic-magnetic bifunctional nanotubes for biological applications |
US10359366B2 (en) * | 2013-08-23 | 2019-07-23 | Ukon Craft Science Ltd. | Substrate for surface enhanced Raman scattering spectroscopy and devices using same |
DE102013224577A1 (de) | 2013-11-29 | 2015-06-03 | Technische Universität Dresden | Verfahren zur Metallbeschichtung von anorganischen Partikeln mittels stromloser Metallabscheidung |
EP3080267B1 (en) | 2013-12-12 | 2020-02-19 | Altratech Limited | A sample preparation method and apparatus |
EP3080294B1 (en) | 2013-12-12 | 2018-06-13 | Altratech Limited | A capacitive sensor and method of use |
US10912947B2 (en) | 2014-03-04 | 2021-02-09 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Systems and methods for treatment of disease via application of mechanical force by controlled rotation of nanoparticles inside cells |
CN103926286B (zh) * | 2014-04-25 | 2016-06-08 | 广西民族大学 | 一种高灵敏度的纳米氧化钴掺杂的酞氨西林分子印迹电化学传感器及其制备方法 |
CA2956210A1 (en) | 2014-07-28 | 2016-02-04 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Metal(loid) chalcogen nanoparticles as universal binders for medical isotopes |
US20160273055A1 (en) * | 2015-03-17 | 2016-09-22 | The Floria International University Board of Trustees | Nanoparticle based assay to detect fungal infection |
US10919089B2 (en) | 2015-07-01 | 2021-02-16 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Anisotropic particles, methods and uses thereof |
US9627114B2 (en) | 2015-09-14 | 2017-04-18 | Elwha Llc | Magnetic plasmonic nanoparticle positioned on a magnetic plasmonic substrate |
US9627115B2 (en) * | 2015-09-14 | 2017-04-18 | Elwha Llc | Magnetic plasmonic nanoparticle dimer |
CN109311662A (zh) * | 2016-03-24 | 2019-02-05 | 南洋理工大学 | 核壳等离子体纳米间隙的纳米结构材料 |
US10156658B1 (en) * | 2017-06-06 | 2018-12-18 | Saudi Arabian Oil Company | Detecting a tracer in a hydrocarbon reservoir |
WO2019045406A2 (ko) * | 2017-08-28 | 2019-03-07 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 표적 유전자 검출용 장치 및 이를 이용하여 표적 유전자를 검출하는 방법 |
US11459601B2 (en) | 2017-09-20 | 2022-10-04 | Altratech Limited | Diagnostic device and system |
KR102426791B1 (ko) * | 2018-08-09 | 2022-07-28 | (주) 비비비 | 자성 나노입자를 이용한 바이오센서, 이를 이용하는 검출 장치 및 검출 방법 |
CN109254048B (zh) * | 2018-11-05 | 2021-03-16 | 济南大学 | 一种基于钴镍氧化物的硝基呋喃类抗生素传感器的制备方法及应用 |
EP3877400A4 (en) | 2018-11-07 | 2022-09-07 | Seer, Inc. | COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS FOR CROWN PROTEIN ANALYSIS AND THEIR USES |
CA3133682A1 (en) | 2019-03-15 | 2020-09-24 | Saudi Arabian Oil Company | Bulk synthesis of janus nanomaterials |
EP3770927A1 (en) | 2019-07-23 | 2021-01-27 | Cartier International AG | Ferrofluid system containing gold particles |
US11422285B2 (en) | 2020-06-17 | 2022-08-23 | Saudi Arabian Oil Company | Nanofluidic chips as micromodels for carbonate reservoirs |
US11773715B2 (en) | 2020-09-03 | 2023-10-03 | Saudi Arabian Oil Company | Injecting multiple tracer tag fluids into a wellbore |
US11660595B2 (en) | 2021-01-04 | 2023-05-30 | Saudi Arabian Oil Company | Microfluidic chip with multiple porosity regions for reservoir modeling |
US12019038B2 (en) | 2021-01-21 | 2024-06-25 | Saudi Arabian Oil Company | Evaluation of source rock samples from subterranean reservoirs |
US11534759B2 (en) | 2021-01-22 | 2022-12-27 | Saudi Arabian Oil Company | Microfluidic chip with mixed porosities for reservoir modeling |
CN117999357A (zh) * | 2021-06-14 | 2024-05-07 | 波士顿大学董事会 | 用于检测细胞应激的方法 |
US11796517B2 (en) | 2021-11-09 | 2023-10-24 | Saudi Arabian Oil Company | Multifunctional magnetic tags for mud logging |
US11885790B2 (en) | 2021-12-13 | 2024-01-30 | Saudi Arabian Oil Company | Source productivity assay integrating pyrolysis data and X-ray diffraction data |
US11999855B2 (en) | 2021-12-13 | 2024-06-04 | Saudi Arabian Oil Company | Fluorescent dye molecules having hydrophilicity and hydrophobicity for tracer applications |
US11725139B2 (en) | 2021-12-13 | 2023-08-15 | Saudi Arabian Oil Company | Manipulating hydrophilicity of conventional dye molecules for water tracer applications |
US12000278B2 (en) | 2021-12-16 | 2024-06-04 | Saudi Arabian Oil Company | Determining oil and water production rates in multiple production zones from a single production well |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5445971A (en) * | 1992-03-20 | 1995-08-29 | Abbott Laboratories | Magnetically assisted binding assays using magnetically labeled binding members |
EP1138743A1 (en) * | 1998-11-27 | 2001-10-04 | Nittetsu Mining Co., Ltd. | Fluorescent or phosphorescent composition |
WO2005015213A1 (en) * | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Tsinghua University | Fluorescent magnetic nanoparticles and process of preparation |
US20050048570A1 (en) * | 2001-12-28 | 2005-03-03 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten | Structured-functional bonding matrices for biomolecules |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6219137B1 (en) * | 1998-12-03 | 2001-04-17 | Lockheed Martin Energy Research Corporation | Nanoprobe for surface-enhanced Raman spectroscopy in medical diagnostic and drug screening |
KR100512451B1 (ko) * | 2002-02-28 | 2005-09-05 | (주)에프이에이 코퍼레이션 | 자성체 나노입자에 지지된 재사용가능한 유기금속촉매 및 그 제조방법 |
GB0220063D0 (en) * | 2002-08-29 | 2002-10-09 | Isis Innovation | Magnetic particle and process for preparation |
-
2005
- 2005-09-16 ES ES200502269A patent/ES2301296B1/es active Active
-
2006
- 2006-09-12 US US12/067,166 patent/US8623636B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2006-09-12 EP EP06807954.0A patent/EP1936378B1/en active Active
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5445971A (en) * | 1992-03-20 | 1995-08-29 | Abbott Laboratories | Magnetically assisted binding assays using magnetically labeled binding members |
EP1138743A1 (en) * | 1998-11-27 | 2001-10-04 | Nittetsu Mining Co., Ltd. | Fluorescent or phosphorescent composition |
US20050048570A1 (en) * | 2001-12-28 | 2005-03-03 | Fraunhofer-Gesellschaft Zur Forderung Der Angewandten | Structured-functional bonding matrices for biomolecules |
WO2005015213A1 (en) * | 2003-08-08 | 2005-02-17 | Tsinghua University | Fluorescent magnetic nanoparticles and process of preparation |
Non-Patent Citations (53)
Title |
---|
ABAD, JM; VELEZ, M.; SANTAMARIA, C.; GUISAN, J.M.; MATHEUS, P.R.; VAZQUEZ, L.; GAZARYAN, I.; GORTON, L.; GIBSON, T.; FERNÁNDEZ, V: "Immobilization of peroxidase glycoprotein on gold electrodes modified with mixed epoxy-boronic acid monolayers", J. AM. CHEM. SOC., vol. 124, 2002, pages 12845 - 12853 |
ARLINGHAUS HF; OSTROP M; FRIEDRICHS 0; FELDNER JC: "Genome diagnostics with TOF-SIMS", APPL. SURF. SCI., vol. 203, 2003, pages 689 - 692 |
ARLINGHAUS, H.F.; KWOKA, M.N.; JACOBSON, K.B.: "Analysis of biosensor chips for identification of nucleic acids", ANAL CHEM., vol. 69, 1997, pages 3747 - 3753 |
BRANDT, 0.; FELDNER, J.; STEPHAN, A.; SCHR6DER, M.; SCHNÖLZER, M.; ARLINGHAUS, H. F.; HOHEISEL, J. D.; JACOB, A.: "PNA microarrays for hybridisation of unlabelled DNA samples", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 31, 2003, pages E119 - E127 |
BRIONES, C.; MATEO-MARTI, E.; GOMEZ-NAVARRO, C.; PARRO, V.; ROMAN, E.; MARTIN-GAGO, J.A.: "Ordered self-assembled monolayers of peptide nucleic acids with DNA recognition capability", PHYSICAL REVIEW LETTERS, vol. 93, 2004, pages 208103 |
BRIONES, C.; MATEO-MARTI, E.; GOMEZ-NAVARRO, C.; PARRO, V.; ROMAN, E.; MARTIN-GAGO, J.A.: "Structural and functional characterization of self-assembled monolayers of peptide nucleic acids and its interaction with complementary DNA", JOURNAL OF MOLECULAR CATALYSIS, vol. 228, 2005, pages 131 - 136 |
DEL MONTE, F.; MORALES, M.P.; LEVY, D.; FERNÁNDEZ, A.; OCANA, M.; ROIG, A.; MOLINS, E.; SEMA, C. J.: "Formation of gamma-Fe203 isolated nanoparticles in a silica matrix", LANGMUIR, vol. 13, 1997, pages 3627 - 3634 |
DEMIDOV W; PROTOZANOVA E; IZVOLSKY KI; PRICE C; NIELSEN PE; FRANK-KAMENETSKII MD: "Kinetics and mechanism of the DNA double helix invasion by pseudocomplementary peptide nucleic acids", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 99, 2002, pages 5953 - 5958 |
DEMIDOV W; YAVNILOVICH MV; BELOTSERKOVSKII BP; FRANK-KAMENETSKII MD; NIELSEN PE: "Kinetics and mechanism of polyamide (''peptide'') nucleic acid binding to duplex DNA", PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 92, 1995, pages 2637 - 2641 |
DUFF, D.G.; BAIKER, A.; EDWARDS, P.P.: "A new hydrosol of gold clusters. 1. Formation and particle-size variation", LANGMUIR, vol. 9, 1993, pages 2301 - 2309 |
EGHOLM, M.; BUCHARDT, O.; CHRISTENSEN, L.; BEHRENS, C.; FREIER, S. M.; DRIVER, D. A.; BERG, R.H.; KIM, S.K.; NORDEN, B.; NIELSEN,: "PNA hybridizes to complementary oligonucleotides obeying the Watson-Crick hydrogen-bonding rules", NATURE, vol. 365, 1993, pages 566 - 568 |
EGHOLM, M.; BUCHARDT, OR.; NIELSEN, P. E.; BERG, R. H.: "Peptide nucleic acids (PNA). Oligonucleotide analogues with an achiral backbone", J. AM. CHEM. SOC., vol. 114, 1992, pages 1895 - 1898 |
GARCELL L.; MORALES M.P.; ANDRES-VERGES M.; TARTAJ P.; SERNA C.J.: "Interfacial and rheological characteristics of maghemite aqueous suspensions", J. OF COLLOID AND INTERF. SCI., vol. 205, 1998, pages 470 - 475 |
GRIFFIN TJ; TANG W; SMITH LM: "Genetic analysis by peptide nucleic acid affinity MALDI-TOF mass spectrometry", NAT BIOTECHNOL., vol. 15, 1997, pages 1368 - 1372 |
HACIA, J.G.: "Resequencing and mutational analysis using oligonucleotide microarrays", NATURE GENETICS, vol. 21, 1999, pages 42 - 47 |
HALAS N: "Playing with plasmons. Tuning the optical resonant properties of metallic nanoshells", MRS BULLETIN, vol. 30, 2005, pages 362 - 367 |
HARRIS, H: "The DNA microarray", THE SCIENTIST, vol. 19, 2005, pages 27 - 31 |
HUANG. C.C.; YANG, Z.S.; CHANG, H.T.: "Synthesis of dumbbell-shaped Au-Ag core-shell nanorods by seedmediated growth under alkaline conditions", LANGMUIR, vol. 20, 2004, pages 6089 - 6092 |
JACKSON JB; HALAS NJ: "Silver nanoshells: Variations in morphologies and optical properties", JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY B, vol. 105, 2001, pages 2743 - 2746 |
JOLIVET, J.P.; MASSART, R.; FRUCHARD, J.M.: "Synthesis and physicochemical study of non-surfactant magnetic colloids in an aqueous medium", NOUV. J. CHIM., vol. 7, 1983, pages 325 - 331 |
KAMBHAMPATI D; NIELSEN PE; KNOLL W: "Investigating the kinetics of DNA-DNA and PNA-DNA interactions using surface plasmon resonance-enhanced fluorescence spectroscopy", BIOSENS BIOELECTRON., vol. 16, 2001, pages 1109 - 1118 |
LEE, J.; ISOBE, T.; SENNA, M: "Preparation of ultrafine Fe304 particles by precipitation in the presence of PVA at high pH", J. COLLOID INTERFACE SCI., vol. 177, 1996, pages 490 - 494 |
LI J. ET AL.: "Amplifying the electrical hybridization signals of DNA array by multilayer assembly of Au nanoparticle probes", THE ANALYST, vol. 128, no. 7, July 2003 (2003-07-01), pages 917 - 923, XP002407190 * |
MADOZ, J.; KUZNETZOV, B.A.; MEDRANO, F.J.; GARCIA, J.L.; FERNÁNDEZ, V.M.: "Functionalization of gold surfaces for specific and reversible attachment of a fused beta-galactosidase and choline-receptor protein", J. AM. CHEM. SOC., vol. 119, 1997, pages 1043 - 1051 |
MARTINEZ, M.A.; VERDAGUER, N.; MATEU, M.G.; DOMINGO, E.: "Evolution subverting essentiality: dispensability of the cell attachment Arg-Gly-Asp motif in multiply passaged foot-and-mouth disease virus", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 94, 1997, pages 6798 - 6802 |
MASSART, R: "Preparation of aqueous magnetic liquids in alkaline and acidic media", IEEE TRANSACTIONS ON MAGNETICS, vol. 17, 1981, pages 1247 - 1248 |
MASSART, R; CABUIL, V.: "Effect of some parameters on the formation of colloidal magnetite in alkaline-medium- yield and particle-size control", J. CHEM. PHYS., vol. 84, 1987, pages 967 - 973 |
NATURE GENETICS, vol. 21, 1999 |
NIELSEN PE: "Applications of peptide nucleic acids", CURR OPIN BIOTECHNOL., vol. 10, 1999, pages 71 - 75 |
NIELSEN PE: "Peptide nucleic acid targeting of double stranded DNA", METHODS ENZYMOL., vol. 340, 2001, pages 329 - 340 |
NIELSEN, P. E.; EGHOLM, M.; BERG, R. H.; BUCHARDT, O: "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide", SCIENCE, vol. 254, 1991, pages 1497 - 1500 |
OLDENBURG, S.J.; AVERITT, R.D.; WESCOTT, S.L.; HALAS, N.J.: "Nanoengineering of optical resonances", CHEMICAL PHYSICS LETT., vol. 288, 1998, pages 243 - 247 |
OSAWA, M.; IKEDA, M.: "Surface-enhanced infraredabsorption of para-nitrobenzoic acid deposited on silver island films - contributions of electromagnetic and chemical mechanisms", J. PHYS. CHEM., vol. 95, 1991, pages 9914 - 9919 |
PARINOV, S.; BARSKY, V.; YERSHOV, G.; KIRILLOV, E.; TIMOFEEV, E.; BELGOVSKIY, A.; MIRZABEKOV, A: "DNA sequencing by hybridisation to microchip octa- and decanucleotides extended by stacked pentanucleotides", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 24, 1996, pages 2998 - 3004 |
PHILIPSE, A.P.; VAN BRUGGEN, M.P.B.; PATHMAMANOHARAN, C.: "Magnetic silica dispersions - preparation and stability of surface-modified silica particles with a magnetic core", LANGMUIR, vol. 10, 1994, pages 92 - 99 |
REIOGIO, A.; SCHWAGER, C.; RICHTER, A.; ANSORGE, W.; VALCARCEL, J.: "Optimization of oligonucleotide-based DNA microarrays", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 30, 2002, pages E51 |
ROGERS FA; VASQUEZ KM; EGHOLM M; GLAZER PM: "Sitedirected recombination via bifunctional PNA-DNA conjugates", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 99, 2002, pages 16695 - 16700 |
See also references of EP1936378A4 |
SOLINAS S.; PICCALUGA G.; MORALES M.P.; SERNA C.J.: "Sol-gel formation of gamma-Fe203/Si02 nanocomposites", ACTA MATERIALIA, vol. 49, 2001, pages 2805 - 2811 |
SOUTHERN E.M.: "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis", J MOL BIOL., vol. 98, 1975, pages 503 - 517 |
SOUTHERN E.M.; CASE-GREEN, S.C.; ELDER, J.K.; JONSON, M.; MIR, K.U.; WANG, L.; WILLIAMS, J.C.: "Arrays of complementary oligonucleotides for analysing the hybridization behavior of nucleic acids", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 22, 1994, pages 1368 - 1373 |
SPASOVA M. ET AL.: "Magnetic and optical tunable microspheres with a magnetite/gold nanoparticle shell", JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY, vol. 15, no. 21, 2005, pages 2095 - 2098, XP003012302 * |
SUGIMOTO, T.; MATIJEVIC, E: "Formation of uniform spherical magnetite particles by crystallization from ferrous hydroxide ges", J. COLLOID INTERFACE SCI., vol. 74, 1980, pages 227 - 243 |
TARTAJ, P.; GONZALEZ-CARRENO, T.; SERNA, C.J.: "Single-step nanoengineering of silica coated maghemite hollow spheres with tunable magnetic properties", ADVANCED MATERIALS, vol. 13, 2001, pages 1620 - 1624 |
URAKAWA, T.; NAKZAWA, T.; INOUE, H.; SHIRAT, T.; FLUK, E. J.: "Preparation and Mossbauer spectroscopic characterization of ultrafine iron oxide particles", J. MATER. SCI. LETT., vol. 15, 1996, pages 1237 - 1239 |
VEINTENILLAS-VERDAGUER, S.; MORALES, M.P.; SERNA, C.J.: "Continuous production of gamma Fe 0 ultrafine powders by laser pyrolysis", MATERIALS LETT., vol. 35, 1998, pages 227 - 231 |
VO-DINH, T: "Surface-enhanced Raman spectroscopy using metallic nanostructures", TRENDS IN ANAL. CHEM., vol. 17, 1998, pages 557 - 582 |
WAGNER, J.; AUTENRIETH, T.; HEMPELMANN, R.: "Core shell particles consisting of cobalt ferrite and silica as model ferrofluids [CoFe 0 -Si0 core shell particles", J. OF MAGNETISM AND MAGNETIC MATERIALS, vol. 252, 2002, pages 4 - 6 |
WANG J; NIELSEN PE; JIANG M; CAI X; FERNANDES JR; GRANT DH; OZSOZ M; BEGLIETER A; MOWAT M: "Mismatch-sensitive hybridization detection by peptide nucleic acids immobilized on a quartz crystal microbalance", ANAL CHEM., vol. 69, 1997, pages 5200 - 5202 |
WANG, J.; PALECEK, E.; NIELSEN, P.E.; RIVAS, G.; CAI, X.; SHIRAISHI, H.; DONTHA, N.; LUO, D.; FARIAS, P.A.M.: "Peptide Nucleic Acid Probes for Sequence-Specific DNA Biosensors", J. AM. CHEM. SOC., vol. 118, 1996, pages 7667 - 7670 |
WATSON, J.D.; CRICK, H.D.: "Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid", NATURE, vol. 171, 1953, pages 737 - 738 |
WITTUNG, P.; NIELSEN, P. E.; BUCHARDT, 0.; EGHOLM, M.; NORDEN, B.: "DNA-like double helix formed by peptide nucleic acid", NATURE, vol. 368, 1994, pages 561 - 563 |
YENI, P.G.; HAMMER, S.M.; CARPENTER, C.C.; COOPER, D.A.; FISCHL, M.A.; GATELL, J.M.; GAZZARD, B.G.; HIRSCH, M.S.; JACOBSEN, D.M.;: "Antiretroviral treatment for adult HIV infection in 2002: updated recommendations of the International AIDS Society-USA Panel", JAMA, vol. 288, 2002, pages 222 - 235 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010536041A (ja) * | 2007-08-10 | 2010-11-25 | ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 前方結像型光干渉断層(oct)システムおよびプローブ |
WO2010093420A3 (en) * | 2009-02-11 | 2011-03-31 | University Of Houston | Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles and uses thereof |
US20120015344A1 (en) * | 2010-05-14 | 2012-01-19 | 1. Board of Trustees of MICHIGAN STATE UNIVERSITY | Methods, compositions, and apparatus for the detection of viral strains |
US20120257199A1 (en) * | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Nanyang Technological University | Method of diagnosing malaria infection in a patient by surface enhanced resonance raman spectroscopy |
US9671347B2 (en) * | 2011-04-08 | 2017-06-06 | Nanyang Technological University | Method of diagnosing malaria infection in a patient by surface enhanced resonance raman spectroscopy |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1936378A1 (en) | 2008-06-25 |
EP1936378B1 (en) | 2014-11-05 |
US8623636B2 (en) | 2014-01-07 |
US20130040292A1 (en) | 2013-02-14 |
JP5281403B2 (ja) | 2013-09-04 |
JP2009509132A (ja) | 2009-03-05 |
EP1936378A4 (en) | 2009-11-25 |
ES2301296B1 (es) | 2009-05-29 |
ES2301296A1 (es) | 2008-06-16 |
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