WO2007018143A1 - 前癌状態から癌への悪性化の過程で発現量が変化する遺伝子の利用 - Google Patents

前癌状態から癌への悪性化の過程で発現量が変化する遺伝子の利用 Download PDF

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Nobuo Kondoh
Toshio Ishikawa
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Ishihara Sangyo Kaisha Ltd
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to an expression analysis of a gene whose expression changes with the pathology of cancer, a kit for diagnosis, etc., and a utilization method thereof.
  • Leukoplakias is a precancerous symptom often observed in oral cancer and exhibits various degrees of canceration up to oral squamous cell carcinoma (OSCC) (Non-patent document 1). Histological features related to leukoplakia and OSCC have been shown (Non-patent Document 2). Dysplasias are classified as mild, moderate, or severe based on histopathological findings, and these conditions are generally considered to be a series of events that occur in the course of cancer development. . Nevertheless, discrepancies between pathological diagnosis and the course of patients with these lesions are sometimes encountered.
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • Non-patent Document 3 The present inventors have analyzed various gene events in oral cancer, and have so far expressed the keratin gene family and transdaltaminase-3 gene (TG-3). Progression process to oral cancer (Non-Patent Document 4), however, has not yet explained the discrepancy between the pathological diagnosis and the patient's course. Since cancer treatment policies vary greatly depending on the stage, more accurate and objective diagnosis methods are required.
  • Non-Patent Document 1 Lopez Mb, uene promoter hypermethylation in oral rinses of eukopla kia patients ⁇ a diagnostic and / or prognostic tool? Eur J Cancer 2003; 39: 2306-9.
  • Non-specialized document 2 Bloor BK et al. , Gene expression of differentiation-specific keratins in ora 1 epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma. Oral Oncol 2001; 37: 251—61.
  • Non-Patent Document 3 Forastiere A et al., Head and neck cancer. N Engl J Med 2001; 345: 1890 -900.
  • Non-Patent Literature 4 Ohkura S et al., Differential expression of the keratin-4, -13, -14, -17 an d transglutaminase 3 genes during the development of oral sqamous cell carcinoma fr om leukoplakia. Oral Oncol 2005; 41: 607- 13.
  • the present invention has been made in view of such a situation. More genes are analyzed, genes that show specific expression in cancer and its precancerous state are found, and a method for examining cancer is disclosed. Another object of the present invention is to provide the use of the gene for screening agents, screening methods for therapeutic agents, therapeutic vectors, therapeutic methods, and the like.
  • the present inventors conducted gene expression profile analysis for each specimen tissue of oral squamous cell carcinoma (OSCC) and white plate symptom (LP), a precancerous condition, using cDNA microarray analysis and quantitative RT-PCR analysis. Carried out. Then, unsupervised cluster analysis was performed on 33 marker genes for which there was a clear difference in the expression level between OSCC and LP based on the difference in their expression levels. As a result, we were able to classify specimen tissues into 5 groups of I to V and marker genes into 4 clusters of a to d.
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • LP white plate symptom
  • genes were identified as marker genes that identify the risk of canceration of oral cancer in the precancerous state (LP). We found that the grade of dysplasia can be identified.
  • the expression profile of the 33 marker genes is useful as an indicator for new diagnosis of oral cancer.
  • a chimeric gene in which a gene causing a lethal effect is linked downstream of the expression control region of the gene whose expression level increases during canceration is considered to be expressed in cancer cells and suppress the proliferation of the cells.
  • the present inventors completed the present invention by finding that when the cDNA of the above gene whose expression level decreases with canceration is highly expressed in cancerous cells, the proliferation of the cells is suppressed.
  • DNA comprising a base sequence selected from the group consisting of the bases described in IJ numbers: 1, 2, 5, 13, 15, 19, 21, 24, 30, 31, and 32 Gene with cDNA as
  • IJ numbers 1, 2, 5, 13, 15, 19, 21, 24, 30, 31 and 32 A gene whose DNA is hybridized under stringent conditions to DNA consisting of a base sequence selected from the group consisting of
  • a cancer screening method comprising a step of examining a change in the expression level of at least the gene according to (1) or (2) below (which may include a combination containing 2 to 5 genes)
  • a gene whose cDNA is a DNA comprising a base sequence selected from the group consisting of the base sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 2, 15, 19 and 21
  • a cancer test comprising a step of examining a change in the expression level of at least the gene described in (1) or (2) below (including a combination comprising 2 to 7 genes).
  • SEQ ID NOS: 1, 16, 18, 19, 27, 32 and 33 Genes having DNA as a cDNA comprising a base sequence selected from the group consisting of base sequences described in
  • DNA that hybridizes under stringent conditions to DNA consisting of a base sequence selected from the group consisting of base sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 16, 18, 19, 27, 32 and 33 is referred to as cDNA.
  • a method for examining cancer comprising the following steps:
  • a cancer screening method comprising the following steps:
  • a cancer screening method comprising the following steps:
  • a method for examining cancer comprising:
  • a cancer screening agent comprising a nucleotide probe that hybridizes to the DNA of [1] to [4]
  • a diagnostic agent for cancer comprising a nucleotide primer that amplifies the full length or part of the DNA according to [1] to [4]
  • a cancer screening agent comprising an antibody that binds to the polypeptide encoded by the gene described in [1] to [4].
  • a method for evaluating the presence or absence of anticancer activity in a test sample (a) contacting a test sample with a cancer cell and preparing a cRNA or cDNA sample from the cell;
  • (c) By detecting the intensity of hybridization between the cRNA or cDNA sample and the probe, cRNA or cDNA corresponding to the gene described in [1] to [4] contained in the cRNA or cDNA sample.
  • the test sample has anticancer activity when the test sample is not brought into contact with the test sample, and when compared to the measured amount of the polynucleotide in the control, How to be determined
  • a method for producing a pharmaceutical composition having anticancer activity comprising the step of mixing the sample evaluated to have anticancer activity and a pharmaceutically acceptable carrier in the step of [16] above
  • a method for treating cancer comprising the step of administering the vector according to [22].
  • [25] A method for treating cancer, comprising the step of administering the transformed cell according to [23].
  • Vector in which a polynucleotide having a functionally linked coding region is inserted is inserted
  • a method for treating cancer comprising a step of administering the vector according to [29]
  • a method for treating cancer comprising a step of administering the transformed cell according to [30].
  • the present invention is expected to make cancer screening and treatment more appropriate. For example, by using the gene expression test drug found by the present inventors, it is possible to perform early cancer screening and prognosis prediction, and to select an appropriate treatment method.
  • cancer gene therapy becomes possible by using a promoter region that regulates the expression of the gene. Cancer gene therapy becomes possible by using a vector containing the cDNA of the gene. Furthermore, the screening of a sample having anticancer activity using the expression profile of the DNA as an index is possible.
  • Other objects, features, excellence and viewpoints of the present invention are apparent to those skilled in the art from the following description. Let's go.
  • FIG. 1 Analysis of the relationship between specimens and marker genes by unsupervised hierarchical clustering based on the expression of 33 marker genes according to the present invention.
  • FIG. 2 Analysis of the relationship between specimens and marker genes by unsupervised hierarchical clustering based on the expression of 27 marker genes according to the present invention.
  • FIG. 3 Relationship between the stability of the supervised classification model based on the expression of 27 marker genes according to the present invention and the number of parameters.
  • FIG. 4 Expression of 11 marker genes and LDA score that distinguish oral cancer and leukoplakia in each specimen.
  • FIG. 5 Expression of 7 marker genes and LDA score in each specimen, which are divided into low grade (lower than mild dysplasia) and high grade (higher than moderate dysplasia).
  • the present invention provides a cancer testing method (diagnostic method) using a gene specifically expressed in cancer tissue and precancerous tissue as an index.
  • the present invention provides a cancer detection method (diagnostic method) associated with oral cancer.
  • the cancer test includes at least one selected from the group consisting of a discrimination between cancer and non-cancer, a test for the presence of cancer, a test for the malignancy of cancer, a test for the presence of cancer metastasis, and a test for the recurrence of cancer. Can be mentioned.
  • the gene that serves as an indicator for cancer testing may be a single gene or a combination of two or more.
  • ⁇ Self-directed IJ numbers: 1, 2, 5, 13, 15, 19, 21, 24, 30, 31 and 32 1 1 gene is suitable for discriminating between cancer and non-cancer 7 genes represented by SEQ ID NOs: 1, 16, 18, 19, 27, 32 and 33 are suitable as an index of cancer risk to oral cancer.
  • cancer is produced using a combination of all of the above 11 genes (shown by SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 13, 15, 19, 21, 24, 30, 31, and 32). Censorship.
  • 9 of the above 11 genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 15, 19, 21, 21, 30, 31 and 32) are used in combination for cancer. I want to have a medical examination May be used for screening for cancer using a combination of all 5 genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 15, 19, and 21).
  • screening for cancer using a combination of all of the 7 genes shown by SEQ ID NOs: 1, 16, 18, 19, 27, 32 and 33). Also mentioned.
  • the gene specifically expressed in the cancer tissue and the precancerous tissue in the present invention includes a gene functionally equivalent to the above gene.
  • “functionally equivalent” means that the polypeptide power encoded by the coding sequence in the gene of interest is encoded by the coding sequence in the DNA comprising the base sequence described in any one of SEQ ID NOs ::!-33. It has the biological function and biochemical function equivalent to the polypeptide to be prepared.
  • a gene functionally equivalent to a gene having a DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs ::! To 33 as cDNA is exemplified by human, monkey, mouse, and rat. Powers such as mutants, alleles, variants, homologues, etc. derived from potatoes, monoremots, pigs, sushi, hidges, goats, etc. are not limited to these.
  • Hybridization conditions for isolating a gene functionally equivalent to a gene having a cDNA comprising a DNA comprising any one of SEQ ID NOs ::! To 33 as cDNA are known to those skilled in the art. Can be selected as appropriate.
  • the hybridization conditions include low stringency conditions. Low stringency conditions are, for example, 42 in washing after hybridization. C, 5 X SSC, 0.1% SDS, preferably 50. C, 5 X SSC, 0.1% SDS. More preferable hybridization conditions include highly stringent conditions. High stringency conditions are, for example, 65 ° C, 0.1 X SSC, and 0.1% SDS. Under these conditions, it can be expected that DNA having high homology can be efficiently obtained as the temperature is increased.
  • the PCR method may include LA PCR method, Hot Start PCR method and the like.
  • the gene amplification method may include the LAMP method, ICAN method, LCR method, TAS method, etc. in addition to the PCR method.
  • Cancer preferably oral cancer, esophageal cancer
  • a gene comprising a DNA comprising the base sequence described in SEQ ID NO: 1 to 14 as cDNA or the Increase in the expression of a gene functionally equivalent to the gene, or decrease in the expression of a gene having a DNA comprising the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 15 to 33 as cDNA or a gene functionally equivalent to the gene It is possible to determine cancer using as an index.
  • Decreased expression of a gene having a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NOs: 30 to 33 as cDNA or a functionally equivalent gene thereof can be used as a boundary marker for transition from precancerous state to malignant state.
  • the 33 marker genes of SEQ ID NOs: 1 to 33 are classified into one of four types of clusters (Classifier), cluster a, cluster b, cluster c, and cluster d (Table 3). Most LP tissues classified as type I have high gene expression levels in cluster a and cluster b. In OSCC tissues classified as Gnolepe II with poor prognosis, cluster a gene expression is maintained at a high level, but cluster b gene expression is markedly reduced. Cluster b gene expression is further reduced in OSCC tissues classified as Group III, Group IV, and Group V. These phenomena can be used to determine cancer and predict risk. Can be measured. It is also within the technical scope of the present invention to use the decreased expression of the gene of cluster b as a marker of transition from precancerous state to malignant state.
  • cluster c and cluster d decreases as they move from group V to group II.
  • gene expression of cluster a tends to increase from group V to group II, and is classified into each gnolepe. Since the prognosis of patients who have been diagnosed is so bad as to go from Drup V to Group II, this phenomenon can be used, for example, with high expression of genes in cluster a and low expression of genes in cluster c and cluster d. In addition, it can be used as an indicator of poor prognosis in OSCC patients, or conversely, a combination of a low expression of the gene of cluster a and a high expression of the genes of cluster c and cluster d can be used as an indicator of good prognosis. can do. In addition, the expression or level of genes for each cluster, or the expression or level of each cluster, combined to determine cancer or non-cancer, predict risk, markers for transition from precancerous to malignant, prognosis It is possible to make this determination.
  • 27 genes are selected from the above 33 genes (genes containing the nucleotide sequences described in SEQ ID NOs: 1 to 33), and these are selected as cancer or non-cancer. Provide a technology to be used as a marker to be used for judgment.
  • 12 marker genes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, and 13 of the 27 genes (Table 5) are included.
  • a gene comprising a nucleotide sequence represented by a sequence selected from the group) or an expression increase of a gene functionally equivalent to the gene as an index, or 15 marker genes (sequences) (Number: 15, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 31, 32, and 33)
  • 15 marker genes sequences
  • the former 12 marker genes or an increase in the expression of a gene functionally equivalent to this gene as an indicator of cancer status or precancerous condition certain Use of increased expression of genetically equivalent genes as an indicator of non-cancerous or good status.
  • marker genes SEQ ID NOs: No .: A gene comprising a base sequence represented by a sequence selected from the group consisting of 2, 5, 13 and 19 or a gene functionally equivalent to the gene, and three marker genes (SEQ ID NOs: 2, 5 And a gene comprising a nucleotide sequence represented by a sequence selected from the group consisting of 19 or 19), a gene functionally equivalent to the gene, or two marker genes (SEQ ID NOs: 2 and 19).
  • a gene containing a nucleotide sequence represented by a specific sequence or a gene functionally equivalent to the gene, and a positive index is used to determine cancer (for example, a cancerous state or a precancerous state)
  • 7 marker genes (genes containing a base sequence represented by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 15, 21, 24, 30, 31, and 32) or the like Gene and machine Equivalent genes, 6 marker genes (genes containing a base sequence represented by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 15, 21, 30, 31, and 32) or functional with the gene
  • a marker functional gene equivalent to 3 marker genes a gene comprising a nucleotide sequence represented by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 15, and 21
  • a gene equivalent to It is possible to determine cancer using an increase in gene expression as a negative indicator (for example, to use it as an indicator of a cancer state or a precancerous state), and
  • the 27 genes in Table 5 are used in a combination comprising 2 to 27, and cancer is determined using the increased expression of the gene as an index (for example, there is a risk of canceration).
  • a marker selected from the group consisting of four marker genes SEQ ID NOs: 16, 18, 27, and 33.
  • a gene containing a nucleotide sequence) or an increase in expression of a gene functionally equivalent to the gene is used as an indicator, for example, to determine cancer (for example, as an indicator of cancer risk), or Of these, three marker genes (genes containing a base sequence represented by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1, 19, and 32) or genes that are functionally equivalent to the genes are used as indicators. Make a cancer determination (for example, , It is used as an indicator that canceration less risky) are possible.
  • the 27 genes in Table 5 are combinations comprising 2 to 27, Of the 27 genes, the former 12 marker genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, and 13) 1 to 12 genes including the nucleotide sequence shown or a gene functionally equivalent to the gene and the latter 15 marker genes (SEQ ID NOs: 15, 16, 17, 18, 19, 21, 23, 1 to 15 genes comprising a base sequence represented by a sequence selected from the group consisting of 24, 27, 28, 29, 30, 31, 32 and 33, or a gene functionally equivalent to the gene) It can be used for the determination of cancer or non-cancer by using the combination. In one embodiment, 11 base genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 5, 13, 15, 19, 21, 24, 30, 31, and 32) are selected.
  • a combination of a gene containing a sequence or a gene functionally equivalent to the gene may be a combination containing 2 to 11 marker genes), 9 marker genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 5, A combination (2-9 markers) of a gene containing a base-arranged IJ represented by a sequence selected from the group consisting of 15, 19, 21, 30, 31, and 32 or a gene functionally equivalent to the gene.
  • a combination containing genes or 5 marker genes (SEQ ID NOs: 1, 2, 15, 19 and 21) or a gene comprising a nucleotide sequence represented by a sequence selected from the group consisting of A gene that is functionally equivalent to a gene)
  • a combination containing 2 to 5 marker genes so that the expression level of each gene can be statistically evaluated and discriminated to determine whether it is cancerous or non-cancerous (including prediction) ) Can be used.
  • the former 12 marker genes SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, and 1 to 12 genes comprising a nucleotide sequence represented by a sequence selected from the group consisting of 13 or a gene functionally equivalent to the gene and the latter 15 marker genes (SEQ ID NOs: 15, 16, 17) , 18, 19, 21, 23, 24, 27, 28, 29, 30, 31, 32, and 33, or a gene functionally equivalent to the gene comprising a base sequence represented by a sequence selected from the group consisting of )
  • 7 marker genes SEQ ID NOs: 1, 16, 18, 19, 27, 32 and 33 are shown in a sequence selected from the group consisting of A combination of genes containing the nucleotide sequence or genes functionally equivalent to the gene (2-7 marker genes)
  • Using a set may be a combination saw) comprising, we can statistically evaluate determine the expression level of each gene As such, it can be used to determine cancer risk (including prediction).
  • the screening method in the present invention includes a screening method including a step of measuring the expression level of the polypeptide encoded by the gene according to the present invention, or a plurality of genes among the genes according to the present invention.
  • a detection method and power including a step of measuring the expression level of the polypeptide encoded by the gene can be mentioned.
  • Such a screening method can also be used in monitoring the effects of cancer treatment.
  • the expression level of the gene usually means the expression level of mRNA transcribed from the gene DNA.
  • the amount of cDNA or cRNA converted from the mRNA is also referred to as the “expression level of the gene”. Is included. Specific embodiments of the inspection method of the present invention are described below, but the inspection method of the present invention is not limited to these methods.
  • a polypeptide sample is prepared from a subject.
  • the polypeptide sample from the subject is, for example, a polypeptide prepared by a method known to those skilled in the art from the blood, urine, saliva, tissue or cells collected by biopsy or surgery of the subject. Peptide samples are mentioned.
  • the amount of the polypeptide encoded by the DNA according to the present invention contained in the polypeptide sample is then measured.
  • ELI SA enzyme-linked immunosorbent assay
  • US Pat. No. 4,376,110 double monoclonal antibody sandwich immunoassay
  • monoclonal Polyclonal antibody sandwich assay Edited by Wide et al., Kirkham and Hunter, “Radioimmunoassay”, E. and S.
  • the target fusion protein is adsorbed on the surface of a microtiter well. Then the remaining protein binding on the surface Potency Serum albumin (BSA), heat-inactivated normal goat serum (NGS), or BLOTTO (a non-fat dry milk buffer containing preservatives, salt and antifoam) Blocked with. The tool is then incubated with a sample suspected of containing a specific antibody. Samples can be applied undiluted or more often diluted in buffers containing small amounts (0.1-5.0% by weight) of proteins, usually BSA, NGS, or BLOTTO.
  • BSA Potency Serum albumin
  • NGS heat-inactivated normal goat serum
  • BLOTTO a non-fat dry milk buffer containing preservatives, salt and antifoam
  • the tool After incubation for sufficient time for specific binding to occur, the tool is washed to remove unbound protein and then incubated with an anti-species specific immunoglobulin antibody labeled with a reporter group.
  • the reporter group can be selected from a variety of enzymes, such as horseradish peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, and glucose oxidase.
  • the wells are then washed again to remove unbound complex and the enzyme substrate is added. The color is developed and the optical density of the contents of the well is determined with the naked eye or by the instrument.
  • the OSCC sample and / or moderate-force and severe-dysplasia sample are significantly highly expressed as compared with the LP sample.
  • Four Force Necessary Tanks 3 ⁇ 4 ImmunoLrgloDulin J polypeptide, linker protein (Section ID: SC43), Follistatin, transcript variant FST317, Sect ID: SCI 3), Parathyroid hormo ne-like hormone (Regenerative ID) : SC27), Transforming growth factor, beta-induced, 68k Da (gene ID: SC41) can be detected for early screening of oral squamous cell carcinoma.
  • RNA sample is prepared from a subject.
  • the amount of mRNA of the gene according to the present invention contained in the RNA sample is measured.
  • the measured amount of mRNA is then compared to a control.
  • a cDNA sample is first prepared from a subject.
  • the amount of cDNA corresponding to the mRNA of the gene according to the present invention contained in the cDNA sample is measured.
  • the amount of cDNA measured is then compared to a control. Examples of such methods include methods well known to those skilled in the art, such as Northern blotting, RT-PCR, and rear-time PCR. The quantitative RT-PCR method is more desirable.
  • Primers used for quantitative RT-PCR are hybridized to the target DNA.
  • the length of the oligonucleotide is usually 15 bp to 100 bp, preferably 16 bp to 45 bp, more preferably 17 bp to 30 bp, and those that function sufficiently include those with 19 bp to 28 bp.
  • Examples of primers used for quantitative RT-PCR include the primers shown in SEQ ID NOs: 34 to 99, but other functionally equivalent primers can also be used.
  • a step of preparing a cRNA sample or a cDNA sample from a subject a step of amplifying the cDNA using a nucleotide primer that amplifies the full length or a part of the cDNA according to the present invention, and detecting the amplified cDNA sample.
  • the expression level of the gene according to the present invention can be measured by the process.
  • detection oligonucleotides modified with fluorescent dyes, etc., or those that emit fluorescence by inter-acting with amplified DNA can be used.
  • SYBR Green Examples include I, TaqMan probe, Molecula r Beacon probe.
  • test method As another embodiment of the test method, first, a substrate on which a cRNA sample or cDNA sample prepared from a subject and a nucleotide probe that hybridizes with DNA according to the present invention is fixed is provided. Next, the substrate is brought into contact with the cRNA sample or cDNA sample. Next, the expression level of the DNA according to the present invention contained in the cRNA sample or cDNA sample is measured by detecting the strength of hybridization between the cRNA sample or cDNA sample and the nucleotide probe immobilized on the substrate. In addition, the measured DNA expression level is compared with the control.
  • An example of such a method is a microarray method (SNP gene polymorphism strategy, Kenichi Matsubara, Yoshiyuki Tsuji, Nakayama Shoten, P128-135).
  • Preparation of a cRNA sample or a cDNA sample from a subject can be performed by a method well known to those skilled in the art, for example, using mRNA extracted from a biopsy of the subject as a saddle.
  • mRNA is isolated from a cancer affected part of a subject. Isolation of mRNA can be performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. ⁇ et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC (Chomczynski, P. and Sacchi, ⁇ ⁇ Prepare total RNA using Anal. Biochem.
  • mRNA can be directly prepared by using QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia). CDN using reverse transcriptase from the obtained mRNA Synthesize A.
  • the synthesis of cDNA can also be performed using AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Corporation). The synthesis of cRNA can be performed, for example, according to the method of Luo, L et al. (Nat. Med. (1999) 5: 117-122).
  • the prepared cRNA sample or cDNA sample can be labeled for detection by a method well known to those skilled in the art, if necessary.
  • the “substrate” means a plate-like material capable of fixing nucleotides.
  • the nucleotide includes oligonucleotides and polynucleotides.
  • the substrate according to the present invention is not particularly limited as long as nucleotides can be immobilized, but a substrate generally used in DNA array technology can be preferably used. Examples of the material for the substrate include glass and plastic, and surface treatment is applied to fix the unmodified oligo DNA.
  • a DNA array is composed of thousands of nucleotides printed on a substrate at high density. Usually these DNAs are printed on the surface of a non-porous substrate.
  • the surface layer of the substrate is generally glass, but a porous membrane such as a nitrocellulose membrane can be used.
  • an oligonucleotide-based array developed by Affymetrix can be exemplified as a nucleotide immobilization (array) method.
  • the oligonucleotides are usually synthesized in situ.
  • an in situ synthesis method for oligonucleotides using a photolithographic technique (Affymetrix) or the like is already known, and such a technique can also be used for producing a substrate according to the present invention.
  • the nucleotide probe immobilized on the substrate is not particularly limited as long as it specifically hybridizes with the DNA of the present invention.
  • “specifically hybridize” means normal hybridization conditions, preferably stringent hybridization conditions (for example, Samfunorec et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Laboratory). In the press, New York, USA, 2nd edition, 1989), DNA other than DNA according to the present invention and cross-hybridization are not significantly generated. If specific hybridization is possible, it is not necessary to be completely complementary to the DNA base sequence to be detected.
  • the nucleotide according to the present invention includes oligonucleotides and cDNA.
  • the length of the nucleotide probe bound to the substrate is usually 100 to 400 base, preferably 200 to 4000 base, more preferably 500 to 4000 base when cDNA is immobilized.
  • the oligonucleotide is immobilized, it is usually 15 to 500 base, preferably 30 to 200 base, and more preferably 50 to 200 base.
  • a fluorescence signal is read by a scanner or the like. It can be carried out.
  • the present invention may be performed using a microarray method.
  • a method for analyzing expression profiles of a plurality of DNAs among the DNAs related to S First, a cRNA sample or cDNA sample prepared from a subject and a substrate on which nucleotide probes that hybridize with a plurality of DNAs among DNAs according to the present invention are fixed are provided. Next, the substrate is brought into contact with the cRNA sample or cDNA sample.
  • the nucleotide probe immobilized on the substrate is not particularly limited as long as it is a nucleotide capable of specifically hybridizing with a plurality of DNAs in the present invention.
  • the number of types of nucleotide probes to be immobilized on the substrate is determined according to the DNA of the present invention whose expression is to be detected in the present invention. For example, when it is desired to detect the expression of 10 DNAs according to the present invention, nucleotide probes that specifically hybridize with each of the 10 DNAs are immobilized on a substrate.
  • the nucleotide probe corresponding to each DNA is not necessarily limited to one type, and is a mixture of a plurality of types of nucleotide probes having complementarity with an arbitrary region of the DNA according to the present invention to be detected. Also good.
  • the expression level of the gene obtained by the above method is analyzed, and the discrimination between cancer and non-cancer, the presence or absence of cancer, the malignancy of cancer, and the like are determined.
  • Examples of multivariate analysis used in the analyzing step of the present invention include multiple regression. Analysis, linear discriminant analysis, Mahalanobis discriminant analysis, support vector machine, decision tree, cluster analysis, self-organizing map, principal component analysis, hierarchical neural network, etc. Cluster analysis and linear discriminant analysis are preferable.
  • the present invention also provides a screening agent for use in the screening method for cancer of the present invention.
  • screening agents include screening agents including an antibody that binds to the polypeptide encoded by the DNA according to the present invention.
  • the DNA according to the present invention is inserted into a known expression vector system, a host cell is transformed with the vector, and the present cell is transformed from inside and outside the host cell.
  • a polypeptide encoded by the DNA according to the invention or a fragment thereof may be obtained by a known method and used as a sensitizing antigen.
  • an appropriate region or a characteristic region is selected from the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the DNA of the present invention, and a peptide fragment in the selected region is chemically synthesized with a peptide synthesizer or the like.
  • the peptide fragment (or conjugate of the peptide fragment) ) May be used as a sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but it is generally preferable to select in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Rodents, Rabbits, and primates are used. A mouse can be exemplified as a suitable animal.
  • Immunization of animals with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal. Subsequently, it is confirmed by a conventional method that a desired antibody level increases in serum.
  • the blood of the mammal sensitized with the antigen is removed.
  • Serum is separated from this blood by a known method.
  • serum containing a polyclonal antibody may be used, and if necessary, a fraction containing a polyclonal antibody may be further isolated from this serum and used. For example, using an affinity column coupled with the protein of the present invention Obtaining a fraction that recognizes only the polypeptide according to the present invention,
  • Immunoglobulin G or M can be prepared by purification using A or protein G column.
  • An affinity column to which a peptide fragment selected from the amino acid sequence of the protein according to the present invention is coupled may be used.
  • immune cells are taken out of the mammal and subjected to cell fusion.
  • spleen cells are particularly preferable as immune cells used for cell fusion.
  • the other parent cell to be fused with the immune cell is preferably a myeloma cell of a mammal, more preferably a myeloma cell that has acquired the characteristics for selecting fused cells by a drug.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method such as the method of Milstein et al. (Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46). It can carry out according to etc.
  • the hyperidoma obtained by cell fusion is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is carried out for a period of time sufficient for the cells other than the target hyperpridoma (non-fused cells) to die, usually several days to several weeks. The usual limiting dilution method is then performed to screen and clone the hyperidoma that produces the desired antibody.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT culture solution is carried out for a period of time sufficient for the cells other than the target hyperpridoma (non-fused cells) to die, usually several days to several weeks. The usual limiting dilution method is then performed to screen and clone the hyperidoma that produces the desired antibody
  • human lymphocytes such as human lymphocytes infected with EB virus are sensitized with proteins, protein-expressing cells or lysates thereof in vitro.
  • sensitized lymphocytes can be fused with human-derived myeloma cells having permanent mitotic activity, such as U266, to produce desired human antibodies having protein binding activity (Japanese Patent Application Laid-Open (JP-A)). 63-17688).
  • the obtained hyperidoma was transplanted into the abdominal cavity of the mouse, and ascites was collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody was used for, for example, ammonium sulfate precipitation, protein A, protein G force ram, DEAE ion exchange chromatography.
  • Monoclonal antibodies obtained in this way can also be obtained as recombinant antibodies produced using genetic recombination techniques (for example, Borrebaeck, CAK and Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • Recombinant antibodies are produced by cloning DNA encoding them from immune cells such as hyperpridoma or sensitized lymphocytes that produce antibodies, incorporating them into appropriate vectors, and introducing them into a host.
  • the antibody may be an antibody fragment or a modified antibody as long as it binds to the polypeptide encoded by the DNA of the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′), Fv, or single chain Fv (scFv) (H
  • antibody fragments are produced by treating antibodies with enzymes such as nopain and pepsin. Or construct genes encoding these antibody fragments, introduce them into expression vectors, and express them in appropriate host cells (for example, CO, MS et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, AH, Methods Enzymol. (1989) 17 8, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, Tsuji, Methods Enzymol.
  • a modified antibody an antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” of the present invention includes these modified antibodies. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody against the polypeptide encoded by the DNA according to the present invention is a chimeric antibody or non-human antibody derived from a variable region derived from a non-human antibody and a constant region derived from a human antibody using a known technique.
  • CDRs complementarity-determining regions
  • human antibody-derived FRs framework regions
  • humanized antibodies with constant region power are known technique.
  • the antibody obtained as described above can be purified to homogeneity.
  • a normal protein separation and purification method may be applied.
  • chromatography columns such as affinity chromatography, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, SDS polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. are appropriately selected and combined to separate antibodies, It can be purified (Antibodies: A Laboratories Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) T), but not limited to these.
  • the concentration of the antibody obtained as described above can be measured by measuring absorbance, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), or the like.
  • Columns used for affinity chromatography include protein A columns and protein G columns.
  • Examples of the column using protein A include Hyper D, PO ROS, Sepharose FF (Pharmacia), and the like.
  • chromatography other than affinity chromatography examples include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography and the like (Strategies for Protein Purification and Char acterization). : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). These chromatography can be carried out using liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • the antibody thus obtained can be used not only for the above-described detection method but also for imaging using a polypeptide encoded by the DNA according to the present invention. It can also be used in cancer screening methods.
  • an antibody that binds to the polypeptide is generated.
  • the antibody is then labeled with a positron emitting isotope.
  • the labeled antibody is then administered to the subject.
  • the radioactivity is then detected by positron emission tomography.
  • the detected radioactivity is then compared to a control.
  • detection of micrometastases and determination of the degree of cancer invasion are important factors when applying surgery, and can be performed by imaging targeting specific cell surface markers.
  • imaging technology can also be used for the purpose of evaluating responsiveness to treatment including oral cancer.
  • test agent of the present invention hybridizes to the DNA of the present invention and has at least 15 nucleotides. Also included are screening agents comprising oligonucleotides having a chain length of nucleotides. The oligonucleotide specifically hybridizes to the DNA of the present invention. If specific hybridization is possible, the oligonucleotide need not be completely complementary to the DNA of the present invention.
  • a probe that can be used in the detection method of the present invention (the probe is immobilized).
  • a primer When the above oligonucleotide is used as a primer, the length is usually 15 bp to 100 bp, preferably 16 bp to 45 bp, more preferably 17 bp to 30 bp, and 19 bp to 28 bp as a fully functioning one. Is mentioned.
  • the primer is not particularly limited as long as it can amplify at least a part of the DNA of the present invention.
  • An example of a primer used for quantitative RT-PCR is a primer represented by SEQ ID NO: 34 to SEQ ID NO: 99, and a primer having a function equivalent to these is also included in the primer of the test agent of the present invention.
  • the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to the DNA of the present invention.
  • the probe may be a synthetic oligonucleotide and usually has a chain length of at least 15 bp.
  • the oligonucleotide of the present invention can be produced by, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer.
  • the probe can also be prepared as a double-stranded DNA fragment obtained by restriction enzyme treatment or the like.
  • the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferably used after being appropriately labeled.
  • a labeling method a T4 polynucleotide kinase is used to phosphorylate the 5 ′ end of the oligonucleotide with 32 P, and a DNA polymerase such as talenoenase is used.
  • Illustrate methods of incorporating substrate bases labeled with isotopes such as 32 P, fluorescent dyes, piotin, alkaline phosphatase (AP), or digoxigenin (DIG) using nucleotides as primers (random prime method, etc.) can do.
  • the screening agent of the present invention includes, for example, sterilized water, physiological saline, vegetable oils, surfactants, lipids, solubilizers, buffers, and protein stabilizers in addition to the active ingredient oligonucleotides and antibodies.
  • Agents such as BSA and gelatin, preservatives and the like may be mixed as necessary.
  • the present invention also provides DNA in which a DNA encoding a cytotoxic protein is functionally bound to the 3 'side of the promoter region of the DNA of the present invention.
  • DNA is a useful DNA that can be used as an anticancer agent.
  • “functionally linked” means that expression of DNA encoding a cytotoxic protein is induced by binding of a transcription factor to the promoter region of the DNA according to the present invention.
  • any expression that induces the expression of the fusion protein is included in the meaning of “functionally linked”.
  • cytotoxic protein in the present invention examples include, but are not limited to, diphtheria toxin, HSV-derived thymidine kinase, and the like that include bacteria-produced toxin, plant-produced toxin, animal-produced toxin, etc. Proteins that directly or indirectly damage cells and have lethal effects are included in the cytotoxic proteins of the present invention.
  • the promoter region of the DNA according to the present invention is extracted from, for example, published genomic sequence data, and the corresponding region by PCR (for example, a region about 3 kb from the 5 'end of mRNA can be mentioned. It can be obtained by amplifying a non-restricted item.
  • cytotoxicity is caused on the 3 ′ side of the promoter region of the DNA of the present invention.
  • DNA in which DNAs encoding sex proteins are functionally linked can be incorporated into an appropriate vector and amplified in a host cell such as Escherichia coli.
  • the DNA is incorporated into an appropriate vector, for example, retrovirus method, inactivated HVJ-envelope method, cationic Examples thereof include a method for introduction into a living body by a ribosome method, an adenovirus method, and the like. This makes it possible to perform gene therapy for cancer.
  • the vector to be used include, but are not limited to, an adenovirus vector (for example, pAdexlcw) and a retrovirus vector (for example, pZIPneo).
  • General genetic manipulations such as insertion of the DNA of the present invention into a vector can be performed according to conventional methods (Molecular Cloning, 5.61-5.63).
  • Administration to a living body may be an ex vivo method or an in vivo method.
  • the present invention provides a method for evaluating the presence or absence of anticancer activity in a test sample and a method for screening a sample having anticancer activity.
  • the method for evaluating the presence or absence of anticancer activity in a test sample is a method using an expression profile of a plurality of DNAs among the DNAs according to the present invention as an index. As such a method, first, a test sample is brought into contact with a cancer cell. Next, a cRNA sample or cDNA sample prepared from cancer cells brought into contact with a test sample, and a substrate on which nucleotide probes that hybridize with a plurality of DNAs of the DNA according to the present invention are fixed are provided.
  • the substrate is brought into contact with the cRNA sample or cDNA sample.
  • a plurality of DNAs of the DNA according to the present invention contained in the cRNA sample or cDNA sample are detected.
  • the expression level is measured. It is also possible to measure the expression level using the primers used for the quantitative RT-PCR.
  • the cRNA sample or cDNA sample prepared from the cancer cell contacted with the test sample is amplified using a nucleotide primer that amplifies the full length or part of the DNA according to the present invention, and then the amplified cRNA sample or cDNA By detecting the sample, the expression level of those genes can be measured.
  • the "test sample” in the method of the present invention is not particularly limited, for example, a single compound such as a natural compound, an organic compound, an inorganic compound, a protein, a peptide, a compound library, a gene library, and the like. Rally expression product, cell extract, cell culture supernatant, fermentation microbial product, marine organism extract, plant extract, prokaryotic cell extract, eukaryotic single cell extraction Or animal cell extracts.
  • the test sample can be appropriately labeled and used as necessary. Examples of the label include a radiolabel and a fluorescent label.
  • the “plurality of test samples” is not particularly limited. For example, in addition to the above test samples, a mixture of a plurality of these test samples is also included.
  • cancer cells in the method of the present invention include cells in cancer tissues and cultured cell lines in which cells collected from cancer tissues are cultured.
  • the cancer cell in the method of the present invention is not particularly limited as long as it is a cancer cell derived from an organism suitable for identifying a therapeutic agent for human cancer.
  • Such organisms are preferably mammals (for example, model mammals of human diseases such as rats and mice, model mammals transplanted with human cancer), and most preferably humans.
  • the method of "contacting a test sample with a cancer cell” involves contacting the test sample indirectly with the cancer cell only when the test sample is directly contacted with the cancer cell. (In this case, for example, using cells derived from an organism inoculated with a test sample).
  • Treatment of a cancer cell with a test sample is, for example, Scherfb (U Scherf, D
  • T Ross, ⁇ Waltham, LH Smith, JK Lee, L Tanabe, KW Kohn, WC Reinhold, TG Myers, DT Andrews, DA Scudiero, MB Eisen, EA Sausville, Y Pommier, D Bot stein, PO Brown & JN Weinstein, A Nat Genet. 2000, 24. 236-244) can be carried out according to the method described in the gene expression database for the molecular ph armacology of cancer. In the case of living organisms, this can be achieved by administering the compound orally or parenterally.
  • the expression level of a plurality of DNAs of the DNA of the present invention is restored to the expression level of the DNA in the control (cancer cell-specific expression profile).
  • the test sample is determined to have anti-cancer activity if the force has also been converted to an expression profile of normal cells that have not become cancerous or an expression profile of cells that are pre-cancerous.
  • the present invention provides a method for efficiently screening a sample having anticancer activity.
  • a plurality of test samples using the evaluation method, a plurality of test samples, The presence or absence of anticancer activity is evaluated, and a sample evaluated to have anticancer activity is selected.
  • the present invention provides a method for producing a pharmaceutical composition having anticancer activity.
  • a sample evaluated to have anticancer activity by the above screening method is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier include surfactants, excipients, coloring agents, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffering agents, suspending agents, isotonic agents, binders, disintegrating agents, lubricants, fluidity. Accelerators, flavoring agents and the like can be mentioned, but the present invention is not limited to these, and other commonly used carriers can be appropriately used.
  • light anhydrous anhydrous, lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinyl rubetal jetylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin examples thereof include medium-chain fatty acid triglycerides, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethyl cellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • the clinical specimens used for histological analysis were 27 specimens of oral squamous cell carcinoma, 19 specimens of leukoplakia (of which hyperplasia was 4, mild dysplasia 3, moderate dysplasia 7, severe dysplasia) These specimens were surgically excised from each patient at Hokkaido University Hospital Dentistry (Table 1), and after subdivision and removal of interstitial tissue, ⁇ 100 ° The one stored in C was used. Clinical specimens were collected at the time of surgical removal at Hokkaido University Dental School Dental Hospital with the patient's informed consent and approval of the Ethics Committee. The main histological characteristics of the patients are shown in Table 1.
  • OSCC oral squamous cell carcinoma
  • Mild / Mod / S dys is mild dysplasia, moderate dysplasia, severe Shows dysplasia.
  • T is tongue
  • P is palate
  • LG / UG is lower gingive / upper gingive
  • FM is floor of mouth
  • Bu beam uccal mucosa ⁇ Si is sinus free.
  • M represents male and F represents female.
  • Specimens marked with *, Mod dys 36-40 and Mod dys 42 _44 are a mixture of 3 samples from different sites of the same lesion.
  • Specimens with #, Mod dys 47,48 and Mod dys 32,33 are a mixture of two samples from different sites of the same lesion.
  • RNA is extracted using ISOGEN (manufactured by Futtsubon Gene Co., Ltd.) and the method recommended by the manufacturer is strongly recommended. Cancer Res 1999; 59: 4990-6.). Total RNA from 5 specimens of leukoplakia (of which 1 is hyperplasia, 1 is mild, 1 is moderate, 2 is severe dysplasia) Total RNA obtained from OSCC5 samples was mixed.
  • cDNA microarray analysis was performed using an IntelliGene HS Human expression chip (Takara Corporation: 16,600 probe). Briefly, 4 ⁇ g of RNA was collected from each total RNA mixture obtained in Example 2 above, and single-stranded cDNA synthesis was performed using a T7-promoter linked to an oligo-dT primer. Used for. Subsequently, the amplified (a) — RNA synthesis was performed in the presence of aminoallyl-UTP (Ambion, USA), and then 3′Cy 3-hydroxysuccinimide ester or 3′Cy5-hydroxysuccinimide ester. Fluorescently labeled.
  • Quantitative RT-PCR analysis was performed for validation of microarray analysis. Using the total RNA obtained from several samples of OSCC and LP, quantitative RT-PCR analysis was performed according to the method of Non-Patent Document 4. In brief, 1 ⁇ g of total RNA was reverse transcribed using Superscript II (Invitrogen) to obtain single-stranded cDNA. Primer Express software (manufactured by Perkin Elmer) was used to design primer pairs for PCR with respect to genes that showed a difference of 3 times or more in microarray analysis (Table 2). In the table, the gene according to the present invention (indicated by gene ID), the base sequence and the sequence number of the primer for the gene are shown. The gene ID corresponds to the gene ID shown in Table 3 below.
  • PCR is 95 using Sybr Green Mastermix (Applied Biosystems). C, 15 minutes initial density, followed by 40 cycles of 95 ° C, 30 seconds and 60 ° C, 1 minute 3 ⁇ 4rABI Prism 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems Sat.) The value of each gene was normalized to the mRNA expression level of the internal standard S5 ribosomal protein.To evaluate the statistical significance of the difference in gene expression, Student t -Test (two-sided) was used.
  • RT-PCR analysis was performed using 27 OSCC samples and 15 LP samples (in Table 1, sample numbers:! -27 and 28-42). It was revealed that 30 genes were significantly (P 0.05) highly expressed in 0 SCC and 30 genes in LP, respectively. Force to use most LP tissue excised from the tongue to minimize the effects of different anatomical sites in the oral cavity In addition, OSCC 9 tissue and LP 12 tissue (both tongues was used to confirm the level of specific expression. The expression of 32 marker genes, regardless of anatomical differences, was significantly (P 0.05) changed between OSCC and LP.
  • IGJ SC43 is also strongly suppressed in one hyperplasia specimen, all mild dysplasia specimens, and several moderate dysplasia specimens.
  • Cluster analysis was performed using DNASIS Pro software (manufactured by Hitachi Software Engineering). The relationship between samples and the relationship between genes were analyzed by unsupervised hierarchical clustering.
  • OSCC tissue and LP tissue unsupervised cluster analysis of tissue samples was performed based on the expression of 33 marker genes.
  • Cluster a is composed of 15 LP genes and 1 SC gene, but their expression is increased in both groups I and II, markedly decreased in groups III and IV, and group V was strongly suppressed.
  • the four LP genes in cluster b were highly expressed in the Group I LP tissues, while the expression levels were significantly lower in the Group II, III, IV, and V LP tissues. On the contrary Most genes in cluster c were highly expressed in the Group V OSCC tissues, and their expression decreased toward Group IV, III, IV, and I. The gene of cluster d was over-expressed in most OSCC tissues of group V and was clearly suppressed in groups IV, III, II and I. In addition, the gene CXCLIO (sci) was particularly overexpressed in group m tissues.
  • a cDNA expression vector in which the TG-3 (Transglutaminase 3) cDNA was operably linked to the expression vector was introduced into the human OSCC cell line HSC3. And on selective medium containing antibiotics. After culture, viable cells were stained with Giemsa and colony formation of these cells was observed. As a result, colony formation of HSC3 cells was significantly inhibited in the TG-3 introduction group as compared to the control group (vector only).
  • the OSCC patients classified into Group V (5) are mainly women (4/5), and the age of carcinogenesis without drinking and smoking habits is that of other patients (average 61.9). There were also patients in Group V who were older (77 to 83 years) and had no recurrence within 12 months.
  • Table 4 the histological features are displayed in the same manner as in Table 1 above, OSCC shows oral squamous cell carcinoma, Mild / Mod / S dys shows mild dysplasia, moderate dysplasia, and severe dysplasia, respectively. .
  • the gene according to the present invention (indicated by gene ID), the base sequence of the primer for the gene and the sequence number are shown.
  • the gene ID corresponds to the gene ID shown in Table 5 below.
  • PCR was performed using Sybr Green Mastermix (Applied Biosystems) at 95 ° C for 15 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 30 seconds and 60 ° C for 1 minute.
  • the reaction was performed using ABI Prism 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems).
  • the value of each gene was normalized to the expression level of 5S ribosomal protein mRNA which is an internal standard. In order to evaluate the statistical significance of the difference in gene expression, a test using Student t_test (two-sided) was performed.
  • RT-PCR analysis was performed using 27 OSCC samples and 19 LP samples (in Table 1, sample numbers 1-27 and 28-46). It was found that OSCC and 30 genes were significantly expressed in P (0.06), respectively. To minimize the effect of different anatomical sites in the oral cavity, force using most LP tissue excised from the tongue. In addition, 9 OSCC tissues and 12 LP tissues. was also obtained from the tongue alone) to confirm the level of specific expression.
  • Cluster I Most LP tissues were classified as Cluster I. Cluster I was further divided into subclusters la and lb. Those classified as subcluster la were LP tissues with a relatively well-differentiated phenotype, including hyperplasia and mild dysplasia. On the other hand, subcluster lb was composed of 0 SCC and moderate to severe dysplasia. Mod dys 33, a moderate dysplasia, was an exception. Power Cluster II was virtually composed of OSCC. It was suggested that hierarchical clustering based on the expression of the 27 marker genes provides a classification that closely matches the transition from oral dysplasia to oral cancer.
  • Example 7 it was suggested that the combination of the high expression of the gene of cluster a and the low expression of the genes of cluster c and cluster d would be a useful indicator for prognosis.
  • supervised classification was performed using Fisher's linear discriminant analysis (LDA).
  • the weight vector (w) of the linear discriminant function (Equation 1) was determined so that the ratio to the total fluctuation (Fischer's ratio, Eq. 4) was maximized.
  • a set of independent variables (a "model") was selected by the incremental method or genetic algorithm. The stability of the model was checked by leave-one-out cross validation. Each sample was masked one after another in Leave One Out. The LDA model was constructed from the remaining specimen (NH specimen), and the class power of the masked specimen was predicted from the LDA model.
  • the 27 marker gene expression was analyzed between 27 samples from 0SCC tissue and 19 samples from LP tissue including hyperplasia and dysplasia (Table 1).
  • This approach involves parameter (ie gene) selection using sequential increments and genetic algorithms.
  • the null model force was started, and the most effective variable was assigned to the previous set of variables, that is, provisional candidates, at each step.
  • the model score reached the highest value, the increase step was stopped.
  • Fisher's ratio was used as the score, the model with 11 parameters was selected as the best model.
  • the stability of the model was assessed by leave-one-out cross validation (loo) and compared to the model fit using the incremental method or genetic algorithm ( Figure 3).
  • FIG. 4 shows the expression of each marker gene and the LDA score.
  • the LDA score for each specimen is given by the linear discriminant function (g) below.
  • symbols such as (LP1) mean the logarithm of the expression level of the gene LP1 measured by RT-PCR.If the calculated g value is positive, it is assigned to OSC C and assigned to the negative value. Assigned to LP.
  • genes with A are genes that distinguish leukoplakia (LP) and oral cancer (OSCC), and 7 genes with B are dysplasias. It is a gene (predictor) that distinguishes low grade (mild dysplasia) and high grade (moderate dysplasia).
  • Example 15 [0110] To what extent is it satisfied with only a particularly excellent gene (L Pl, LP4, LP28, LP21, LP12, LP29, SC1, SC13, SC43) in Expression 8 of Example 14, that is, a gene having a small relative standard deviation was examined. The result of linear discriminant analysis using 9 genes with a relative standard deviation of 10% or less is as follows. The correct recognition rate was 94.9%.
  • Linear discriminant analysis using 5 genes (LP1, LP4, L P12, SC1, SC43) having a coefficient of variation of 5% or less than that of Example 15 is as follows. . The correct answer rate was 86.7%.
  • an accurate and objective diagnosis of cancer according to the stage and grade becomes possible, and an appropriate treatment suitable for each can be made even if the treatment policy differs greatly.
  • a number of genes are analyzed, genes that show specific expression in cancer and its precancerous state are found, cancer screening methods, screening drugs, screening methods for therapeutic drugs, therapeutic vectors, therapeutic methods, etc.
  • the gene can be used in
  • the present invention has succeeded in analyzing genes that affect the development, progression, and course of oral cancer, esophageal cancer, and squamous cell carcinoma in particular, and enables accurate diagnosis. Therefore, the analysis technique can be used to develop a test agent for gene expression, expression regulation technique, gene therapy technique, and further anti-cancer technique.

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Abstract

　異形成（Dysplasias）は組織病理学的知見に基づきmild、moderate、severeに分類され、癌発生過程において続いて起きる一連のものであると考えられているが、病理学的診断とこれらの病変をもつ患者の経過との不一致に遭遇する。癌はステージやグレードにより治療方針が大きく異なるため、より正確かつ客観的な診断方法が求められている。 　本発明は、多くの遺伝子について解析し、癌およびその前癌状態において特異的な発現を示す遺伝子を見出し、癌の検査方法、検査薬、治療薬のスクリーニング方法、治療用ベクター、治療方法などへの該遺伝子の利用を提供する。                                                                                 

Description

明 細 書
前癌状態から癌への悪性化の過程で発現量が変化する遺伝子の利用 技術分野
[0001] 本発明は、癌の病態に伴い発現が変化する遺伝子の発現解析、診断のためのキッ トなど、その利用方法に関する。
背景技術
[0002] 白板症 (Leukoplakias： LP)は口腔癌にぉレ、てしばしば観察される前癌症状であり、 口腔扁平上皮癌 (oral squamous cell carcinoma : OSCC)までの癌化の様々な程度を 呈する（非特許文献 1)。 白板症、 OSCCのそれぞれに関連する組織学的な特徴が示 されてきた（非特許文献 2)。異形成 (Dysplasias)は組織病理学的知見に基づき mild、 moderate, severeに分類され、一般的には、これらの状態は癌発生過程において続 レ、て起きる一連のものであると考えられている。にもかかわらず、病理学的診断とこれ らの病変をもつ患者の経過との不一致に時々遭遇する。そこで、病変が悪性化する 前と、その後、即ち OSCCの初期における、 heterozygosityの減少や microsatellite ins abilityのような clonal genetic changeの検出は癌患者の観察の有効な手法となる可能 性が示唆された力 依然として、 OSCCのステージングゃグレーデイングはその多くの 部分を臨床病理学的観察に依存してレ、るのが現状である (非特許文献 3)。本発明 者らは、口腔癌におけるさまざまな遺伝子イベントの解析をおこなレ、、これまでにケラ チン遺伝子ファミリーおよびトランスダルタミナーゼ - 3遺伝子 (TG-3)の発現力 口腔 癌への進行過程に対応し変化することを見出している（非特許文献 4)が、前記のよう な病理学的診断と患者の経過との不一致を説明するには至っていない。癌はステー ジゃグレードにより治療方針が大きく異なるため、より正確かつ客観的な診断方法が 求められている。
[0003] 非特許文献 1： Lopez Mb, uene promoter hypermethylation in oral rinses of eukopla kia patients― a diagnostic and/or prognostic tool? Eur J Cancer 2003; 39: 2306-9. 非特言午文献 2 : Bloor BKら, Gene expression of differentiation-specific keratins in ora 1 epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma. Oral Oncol 2001 ; 37: 251—61. 非特許文献 3 : Forastiere Aら， Head and neck cancer. N Engl J Med 2001 ; 345: 1890 -900.
非特許文献 4 : Ohkura Sら， Differential expression of the keratin-4, -13, -14, -17 an d transglutaminase 3 genes during the development of oral sqamous cell carcinoma fr om leukoplakia. Oral Oncol 2005; 41 : 607-13.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、さらに多くの遺伝子につい て解析し、癌およびその前癌状態において特異的な発現を示す遺伝子を見出し、癌 の検査方法、検査薬、治療薬のスクリーニング方法、治療用ベクター、治療方法など への該遺伝子の利用を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは口腔扁平上皮癌（OSCC)と前癌症状である白板症状 (LP)の各検体 組織について、 cDNAマイクロアレイ分析、定量的 RT-PCR分析を用いて遺伝子発現 プロファイル分析を実施した。そして、 OSCCと LPとの間で発現量に明確な差が見ら れた 33個のマーカー遺伝子について、それらの発現量の差異に基づき、教師なしク ラスター解析を行なった。その結果、検体組織を I〜Vの 5つのグループに、またマー カー遺伝子を a〜dの 4つのクラスターに分類することができた。
[0006] グループ Iに分類された殆どの LP組織ではクラスター aおよびクラスター bの遺伝子 の発現レベルが高かった。予後の悪いグループ IIに分類される OSCC組織ではクラス ター aの遺伝子の発現は高レベルで維持される力 クラスター bの遺伝子の発現は顕 著に減少した。クラスター bの遺伝子の発現は、グループ III、グループ IV及びグルー プ Vに分類される OSCC組織では更に減少した。クラスター bの遺伝子の発現減少は 前癌状態から悪性化への推移の重要な境界マーカーと考えられた。 OSCC組織では クラスター c及びクラスター dの遺伝子の発現がグループ Vからグループ IIに向うほど 減少するが、クラスター aの遺伝子の発現は、逆にグノレープ Vからグループ IIに向うほ ど増加する傾向にあった。各グノレープに分類された患者の予後は、逆にグループ V 力らグループ Πに向うほど悪かったことから、クラスター aの遺伝子の高発現レベルとク ラスター c及びクラスター dの遺伝子の低発現とをあわせて、 OSCC患者の予後の悪さ の指標とし、その逆は予後の良さを示す指標とすることができることが示唆された。 又、 OSCCと LPを判別できるマーカー遺伝子セットを見出すベぐフィッシャーの線 形判別分析 (LDA)を用いて、教師付き分類を行ない、 33個の遺伝子から 11個のマ 一力一遺伝子（表 5中 Aで示される遺伝子）を特定し、識別正解率 97.8%で OSCCと LP を明確に判別できることを見出した。更に、 11遺伝子の中で特に識別に重要な遺伝 子として、 5種の遺伝子を特定した。
更に、前癌状態（LP)における口腔癌への癌化リスクを識別するマーカー遺伝子と して 7個の遺伝子 (表 5中 Bで示された遺伝子）を特定し、識別率 97.8%で LPの異形成 のグレードを識別できることを見出した。
このように、前記 33個のマーカー遺伝子、特に癌と非癌の識別においては 11個の マーカー遺伝子、グレード識別には 7遺伝子の発現プロファイルが口腔癌の新たな 診断の指標として有用であることを見出した。また、癌化の過程で発現量が増加する 前記遺伝子の発現調節領域の下流に致死効果をもたらす遺伝子を連結したキメラ 遺伝子は、癌細胞中で発現し、該細胞の増殖を抑制すると考えられる。一方、癌化と ともに発現量が減少する前記の遺伝子の cDNAを、癌化した細胞中で高発現させた 場合、該細胞の増殖が抑制されることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
〔1〕以下の (1)または (2)に記載の少なくとも 1つの遺伝子（2〜33個の遺伝子を含む組 み合わせを包含してよい）の発現量の変化を調べる工程を含む、癌の検查方法
(1)配列番号：:!〜 33のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子
(2)配列番号：:!〜 33のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAにストリンジヱントな 条件下でハイブリダィズする DNAを cDNAとする遺伝子
〔2〕以下の (1)または (2)に記載の少なくとも 1つの遺伝子（2〜11個の遺伝子を含む組 み合わせを包含してよい）の発現量の変化を調べる工程を含む、癌の検查方法
(1)酉己歹 IJ番号： 1、 2、 5、 13、 15、 19、 21、 24、 30、 31及び 32に記載の塩基酉己歹力 らなる群から選択された塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子
(2)酉己歹 IJ番号： 1、 2、 5、 13、 15、 19、 21、 24、 30、 31及び 32に記載の塩基酉己歹 IJ力 らなる群から選択された塩基配列からなる DNAにストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする DNAを cDNAとする遺伝子
〔3〕少なくとも以下の (1)または (2)に記載の遺伝子（2〜5個の遺伝子を含む組み合わ せを包含してよい）の発現量の変化を調べる工程を含む、癌の検查方法
(1)配列番号： 1、 2、 15、 19及び 21に記載の塩基配列からなる群から選択された塩 基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子
(2)配列番号： 1、 2、 15、 19及び 21に記載の塩基配列からなる群から選択された塩 基配列からなる DNAにストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAを cDNAと する遺伝子
〔4〕少なくとも以下の (1)または (2)に記載の遺伝子（2〜7個の遺伝子を含む組み合わ せを包含してょレ、）の発現量の変化を調べる工程を含む、癌の検査方法
(1)配列番号： 1、 16、 18、 19、 27、 32及び 33に記載の塩基配列からなる群から選 択された塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子
(2)配列番号： 1、 16、 18、 19、 27、 32及び 33に記載の塩基配列からなる群から選 択された塩基配列からなる DNAにストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA を cDNAとする遺伝子
〔5〕癌の検査方法であって、以下の工程；
(a)被検者の RNA試料に含まれる前記〔1〕〜〔4〕に記載の遺伝子の mRNAの量を測 定する工程、
(b)測定された mRNA量を解析する工程、
を含む方法
〔6〕癌の検查方法であって、以下の工程；
(a)被検者の cDNA試料に含まれる前記〔1〕〜〔4〕に記載の遺伝子の cDNAの量を測 定する工程、
(b)測定された cDNA量を解析する工程、
を含む方法
〔7〕癌の検查方法であって、以下の工程；
(a)被検者のポリペプチド試料に含まれる前記〔1〕〜〔4〕に記載の遺伝子にコードさ れるポリペプチドの量を測定する工程、
(b)測定されたポリペプチドの量を解析する工程、
を含む方法
〔8〕癌の検查方法であって、以下、
(a) G)被検者から調製された cRNAまたは cDNA試料と (ii)前記〔1〕〜〔4〕に記載の DNA とハイブリダィズするヌクレオチドプローブが固定された基板とを接触させる工程、
(b)該 cRNAまたは cDNA試料と該プローブとのハイブリダィズの強度を検出することに より、前記〔1〕〜〔4〕に記載の遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)測定された遺伝子の発現量を解析する工程、
を含む方法
〔9〕癌の検査方法であって、以下、
(a) G)被検者から調製された cRNAまたは cDNA試料と (ii)前記〔1〕〜〔4〕に記載の DNA の完全長または一部を増幅するヌクレオチドプライマーを用いて、（i)の cRNAまたは c DNAの完全長または一部を増幅する工程、
(b)増幅された該 cRNAまたは cDNA試料を検出することにより、前記〔1〕〜〔4〕に記載 の遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)測定された遺伝子の発現量を解析する工程、
を含む検査方法
〔10〕解析する工程において多変量解析を用いる前記〔5〕〜〔9〕に記載の検査方法 〔11〕多変量解析が、クラスター分析又は、線形判別分析である前記〔10〕に記載の 検查方法
〔12〕前記〔1〕〜〔4〕に記載の DNAにハイブリダィズするヌクレオチドプローブを含む 、癌の検查薬
〔13〕前記〔1〕〜〔4〕に記載の DNAの完全長または一部を増幅するヌクレオチドブラ イマ一含む、癌の検査薬
〔14〕前記〔1〕〜〔4〕に記載の遺伝子にコードされるポリペプチドと結合する抗体を含 む、癌の検查薬
〔15〕被験試料における抗癌活性の有無を評価する方法であって、 (a)癌細胞に被験試料を接触させ、該細胞から cRNAまたは cDNA試料を調製するェ 程、
(b) (i)調製された cRNAまたは cDNA試料と (ii)前記〔1〕〜〔4〕に記載の DNAとハイブリ ダイズするヌクレオチドプローブが固定された基板とを接触させる工程、
(c)該 cRNAまたは cDNA試料と該プローブとのハイブリダィズの強度を検出することに より、該 cRNAまたは cDNA試料に含まれる、〔1〕〜〔4〕に記載の遺伝子に対応する cR NAまたは cDNAの量を測定する工程を含み、上記測定量が、被験試料を接触させな レ、ときに比べ、対照における該ポリヌクレオチドの測定量まで回復している場合に、 被験試料が抗癌活性を有すると判定される方法
〔16〕抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法であって、
(a)前記〔15〕に記載の評価方法により、複数の被験試料における、抗癌活性の有無 を評価する工程、
(b)複数の被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程、 を含む方法
〔17〕前記〔16〕に記載の工程に、さらに抗癌活性を有すると評価された試料と医薬 上許容される担体とを混合する工程を含む、抗癌活性を有する医薬組成物の製造 方法
〔18〕癌が口腔癌又は食道癌である、前記〔1〕〜〔： 17〕のいずれかに記載の方法
〔19〕口腔癌又は食道癌が扁平上皮癌である、前記〔18〕に記載の方法
〔20〕前記〔1〕〜〔4〕に記載のいずれかの遺伝子のプロモーター領域の 3 '側に細胞 障害性タンパク質をコードする DNAが機能的に結合した DNA
〔21〕前記〔20〕に記載の DNAが揷入されたベクター
〔22〕遺伝子治療用である、 [21]に記載のベクター
〔23〕前記〔21〕または〔22〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞
〔24〕前記〔22〕に記載のベクターを投与する工程を含む、癌の治療方法
〔25〕前記〔23〕に記載の形質転換細胞を投与する工程を含む、癌の治療方法
〔26〕癌が口腔癌又は食道癌である、〔24〕または〔25〕のいずれかに記載の治療方 法 [27]口腔癌又は食道癌が扁平上皮癌である、〔26〕に記載の治療方法
〔28〕前記〔1〕〜〔4〕に記載の DNAにコードされるポリペプチドを発現するベクターで あって、癌細胞において高発現する遺伝子のプロモーター領域の 3'側に該ポリぺプ チドのコーディング領域が機能的に結合したポリヌクレオチドが揷入されたベクター
〔29〕遺伝子治療用である、〔28〕に記載のベクター
〔30〕前記〔28〕または〔29〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞
〔31〕前記〔29〕に記載のベクターを投与する工程を含む、癌の治療方法
〔32〕前記〔30〕に記載の形質転換細胞を投与する工程を含む、癌の治療方法
〔33〕癌が口腔癌又は食道癌である、〔31〕または〔32〕のレ、ずれかに記載の治療方 法
〔34〕口腔癌又は食道癌が扁平上皮癌である、〔33〕に記載の治療方法
を提供するものである。
発明の効果
本発明によって、癌の検查ゃ治療がより適切になるものと期待される。例えば、本発 明者らが見出した遺伝子の発現の検査薬を利用することで、癌の早期検査や予後予 測が可能となり適切な治療方法が選択できる。また、該遺伝子の発現調節をおこなう プロモーター領域を利用することで、癌の遺伝子治療が可能になる。該遺伝子の cD NAを含むベクターを利用することで癌の遺伝子治療が可能となる。さらに、該 DNAの 発現プロファイルを指標として抗癌活性を有する試料のスクリーニングが可能となる 本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当 業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記 載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のた めにのみ示されているものであることを理解されたレ、。本明細書に開示した本発明の 意図及び範囲内で、種々の変化及び/又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以 下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明ら かであろう。本明細書で引用されている全ての文献は、説明の目的で引用されてい るもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきも のである。
図面の簡単な説明
[0009] [図 1]本発明に係る 33個のマーカー遺伝子の発現に基づく教師なし階層クラスタリン グによる検体間及びマーカー遺伝子間の関係の解析。
[図 2]本発明に係る 27個のマーカー遺伝子の発現に基づく教師なし階層クラスタリン グによる検体間及びマーカー遺伝子間の関係の解析。
[図 3]本発明に係る 27個のマーカー遺伝子の発現に基づく教師付き分類のモデル の安定性とパラメーター数の関係。
[図 4]各検体における、 口腔癌と白板症とを分ける 11個のマーカー遺伝子の発現及 び LDAのスコア。
[図 5]各検体における、低グレード（軽度異形成より低い）と高グレード（中度異形成よ り高レ、）を分ける 7個のマーカー遺伝子の発現及び LDAのスコア。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明は、癌組織および前癌組織において特異的に発現する遺伝子を指標とした 癌の検査方法 (診断方法)を提供する。特に、本発明は、 口腔癌に関連した癌の検 查方法 (診断方法)を提供する。
癌の検査としては、癌と非癌の判別、癌の有無の検査、癌の悪性度の検査、癌の 転移の有無の検査及び癌の再発の有無の検査からなる群から選ばれる少なくとも 1 つが挙げられる。
特異的に発現する遺伝子の cDNAの一例として配列番号：:!〜 33が挙げられる。癌 の検査の指標となる遺伝子は単独であっても、 2種以上の組合せであっても構わな レヽ。 ί列えば、酉己歹 IJ番号： 1、 2、 5、 13、 15、 19、 21、 24、 30、 31及び 32で示される 1 1遺伝子は癌と非癌を判別するのに好適であり、配列番号： 1、 16、 18、 19、 27、 32 及び 33で示される 7遺伝子は口腔癌への癌化リスクの指標として好適である。
ある一つの態様では、上記 11遺伝子（配列番号： 1、 2、 5、 13、 15、 19、 21、 24、 30、 31及び 32で示される）のすベてを組み合わせて利用して癌の検查をする。また 別の態様では、上記 11遺伝子のうち 9遺伝子（配列番号： 1、 2、 5、 15、 19、 21、 30 、 31及び 32で示される）のすベてを組み合わせて利用して癌の検查をしたり、あるい は 5遺伝子（配列番号： 1、 2、 15、 19及び 21で示される）のすベてを組み合わせて 利用して癌の検查をするものであってよい。さらに別の一つの態様では、上記 7遺伝 子（配列番号： 1、 16、 18、 19、 27、 32及び 33で示される）のすベてを組み合わせて 利用して癌の検查をすることも挙げられる。
[0011] 本発明における癌組織および前癌組織において特異的に発現する遺伝子には、 上記遺伝子と機能的に同等な遺伝子が含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象 となる遺伝子中のコーディング配列にコードされるポリペプチド力 配列番号：:!〜 33 のいずれかに記載の塩基配列を含む DNA中のコーディング配列にコードされるポリ ペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。
[0012] あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードする DNAを調製する方法と しては、ノヽイブリダィゼーシヨン技 i/|f (Sambrook， J et al. , Molecular Cloning 2nd ed.， 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)を利用する方法が挙げられる。即 ち、当業者においては、配列番号：：!〜 33のいずれかに記載の塩基配列もしくはそ の一部を利用して、これと相同性の高い DNAを単離することは、周知の技術である。
[0013] 本発明において、配列番号：:!〜 33のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAを c DNAとする遺伝子と機能的に同等な遺伝子としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラッ ト、モノレモット、ブタ、ゥシ、ヒッジ、ャギなど由来の変異体、アレル、バリアント、ホモ口 グ等が挙げられる力 これらに制限されるものではない。
[0014] 配列番号：:!〜 33のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子 と機能的に同等な遺伝子を単離するためのハイブリダィゼーシヨンの条件は、当業者 であれば適宜選択することができる。ハイブリダィゼーシヨンの条件としては、例えば 、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダィゼ ーシヨン後の洗浄において、例えば 42。C、 5 X SSC、 0.1%SDSの条件であり、好ましく は 50。C、 5 X SSC、 0.1%SDSの条件である。より好ましいハイブリダィゼーシヨンの条件 としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例え ば 65°C、 0.1 X SSC及び 0.1%SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる 程に高い相同性を有する DNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイプリ ダイゼーシヨンのストリンジエンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数 の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリン ジエンシーを実現することが可能である。当該条件選択にあたっては、 Sambrook, J e t al, Molecular Cloning 2nd ecu, 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989を 参考にすることができる。
[0015] また、配列番号：:!〜 33のいずれかに記載の塩基配列情報を基に合成したプライ マーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)法を利用して、配 列番号：:!〜 33のいずれかに記載の cDNAと機能的に同等な cDNAを単離することも 可能である。 PCR法は、 LA PCR法、 Hot Start PCR法などが含まれていてよい。また 遺伝子増幅法には、 PCR法にカロえて、 LAMP法、 ICAN法、 LCR法、 TAS法などが包 含されていてよい。
[0016] これらハイブリダィゼーシヨン技術や遺伝子増幅技術により単離される、配列番号： ：!〜 33のいずれかに記載の cDNAと機能的に同等な cDNAは、通常、アミノ酸配列レ ベルにおいて高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常 、少なくとも 50%以上の同一性、好ましくは 75%以上の同一性、さらに好ましくは 85%以 上の同一性、さらに好ましくは 95%以上の同一性を指す。
[0017] アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Altschulによるアルゴリズム BLAS T (Pro Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877， 1993)によって決定することができる。 このアルゴリズムに基づいて、 BLASTNや BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されて いる（Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410， 1990)。 BLASTに基づいて BLASTN によって塩基配列を解析する場合には、パラメータ一はたとえば score = 100、 wordl ength = 12とする。また、 BLASTに基づいて BLASTXによってアミノ酸配列を解析す る場合には、パラメータ一はたとえば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと G apped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを 用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 www.ncbi.nlm.nih.g ον·)。
[0018] 本発明に係る遺伝子または該遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現を指標とする ことで癌 (好ましくは口腔癌、食道癌）を検查することが可能である。例えば、配列番 号: 1〜14のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子もしくは該 遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現上昇、または、配列番号: 15〜33のいずれか に記載の塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子もしくは該遺伝子と機能的に同 等な遺伝子の発現低下を指標として、癌の判定を行うことが可能である。配列番号: 3 0〜33に記載の塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子もしくは該遺伝子と機能的 に同等な遺伝子の発現減少は前癌状態から悪性化への推移の境界マーカーとして 使用できる。
[0019] 配列番号: 1または 15〜29のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAを cDNAとする 遺伝子もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現および配列番号: 2〜14の いずれかに記載の塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子もしくは該遺伝子と機 能的に同等な遺伝子の発現を指標として癌の予後予測を行うことが可能である。例 えば、前者の遺伝子群の高発現および後者の遺伝子群の低発現は予後の悪さの指 標とし、またその逆は予後の良さを示す指標とすることができる。
[0020] 又、フィッシャーの線形判別分析 (LDA)を用いた教師付き分類を行ない、見出され た配列番号: 1、 2、 5、 13、 15、 19、 21、 24、 30、 31及び 32で示される 11個のマーカー遺 伝子、及び該 11遺伝子から更に特に識別に重要な遺伝子として選抜された配列番 号: 1、 2、 15、 19及び 21で示される 5遺伝子は、癌を検査する指標として有用である。 例えば、前記 11種の遺伝子の一部若しくは全部を用いることにより、 OSCCと LPを明 確に判別できる。
更に、前癌状態（LP)のグレードを識別するマーカー遺伝子として配列番号: 1、 16、 18、 19、 27、 32及び 33で示される 7個の遺伝子を用いることにより口腔癌への癌化リス クを識另リできる。
[0021] 配列番号: 1〜33の 33個のマーカー遺伝子は、クラスター a、クラスター b,クラスター c ，クラスター dの 4種のクラスター (Classifier)のいずれかに分類される (表 3)が、グルー プ Iに分類された殆どの LP組織ではクラスター a及びクラスター bの遺伝子の発現レべ ルが高い。予後の悪いグノレープ IIに分類される OSCC組織ではクラスター aの遺伝子 の発現は高レベルで維持されるが、クラスター bの遺伝子の発現は顕著に減少する。 クラスター bの遺伝子の発現は、グループ III、グループ IVおよびグループ Vに分類さ れる OSCC組織ではさらに減少する。こうした現象を利用して、癌の判定、リスクの予 測を行うことができる。クラスター bの遺伝子の発現減少を前癌状態から悪性化への 推移のマーカーとして使用することも本発明の技術範囲内のものである。
OSCC組織ではクラスター c及びクラスター dの発現がグループ Vからグループ IIに 向うほど減少する力 クラスター aの遺伝子の発現は、逆にグループ Vからグループ II に向うほど増加する傾向であり、各グノレープに分類された患者の予後は、逆にダル ープ Vからグループ IIに向うほど悪いことから、この現象を利用し、例えば、クラスター aの遺伝子の高発現とクラスター c及びクラスター dの遺伝子の低発現とをあわせて、 OSCC患者の予後の悪さの指標としたり、あるいは、その逆に、クラスター aの遺伝子 の低発現とクラスター c及びクラスター dの遺伝子の高発現の組み合わせを、予後の 良さを示す指標とすることができる。力べして、クラスター毎の遺伝子の発現又はその 程度、あるいは、各クラスターの発現又はその程度を組み合わせ、癌あるいは非癌の 判定、リスクの予測、前癌状態から悪性化への推移のマーカー、予後の判定を行うこ とが可能となる。
[0022] 本発明では、上記 33個の遺伝子（配列番号： 1〜33に記載の塩基配列を含む遺伝 子）のうちの 27個の遺伝子（表 5)を選択し、それらを癌あるいは非癌の判定に使用す るマーカーとして使用する技術を提供する。一つの態様では、当該 27個の遺伝子（ 表 5)のうち 12個のマーカー遺伝子（配列番号: 1、 2、 3、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12及び 13からなる群から選択された配列で示される塩基配列を含む遺伝子)もしくは該遺伝 子と機能的に同等な遺伝子の発現上昇を指標として、癌の判定を行うこと、または、 そのうち 15個のマーカー遺伝子（配列番号: 15、 16、 17、 18、 19、 21、 23、 24、 27、 28、 29、 30、 31、 32及び 33からなる群から選択された配列で示される塩基配列を含む遺 伝子)もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現上昇を指標として、非癌の 判定を行うことが、可能である。前者の 12個のマーカー遺伝子もしくは該遺伝子と機 能的に同等な遺伝子の発現上昇を癌状態あるいは前癌状態の指標として使う、ある レ、は、後者の 15個のマーカー遺伝子もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発 現上昇を非癌状態あるいは良好な状態である指標として使用することを包含してい てよい。
[0023] ある一つの態様では、表 5の 27個の遺伝子のうち、 4個のマーカー遺伝子（配列番 号： 2、 5、 13及び 19からなる群から選択された配列で示される塩基配列を含む遺伝 子)もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子、 3個のマーカー遺伝子（配列番号： 2 、 5及び 19からなる群から選択された配列で示される塩基配列を含む遺伝子)もしくは 該遺伝子と機能的に同等な遺伝子、あるいは 2個のマーカー遺伝子（配列番号: 2及 び 19からなる群から選択された配列で示される塩基配列を含む遺伝子)もしくは該遺 伝子と機能的に同等な遺伝子、の発現上昇をプラスの指標として、癌の判定を行うこ と (例えば、癌状態あるいは前癌状態の指標として使うこと）、または、そのうち 7個の マーカー遺伝子（配列番号： 1、 15、 21、 24、 30、 31及び 32からなる群から選択された 配列で示される塩基配列を含む遺伝子)もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子 、 6個のマーカー遺伝子（配列番号： 1、 15、 21、 30、 31及び 32からなる群から選択さ れた配列で示される塩基配列を含む遺伝子)もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺 伝子、あるいは 3個のマーカー遺伝子（配列番号： 1、 15及び 21からなる群から選択さ れた配列で示される塩基配列を含む遺伝子)もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺 伝子、の発現上昇をマイナスの指標として、癌の判定を行うこと（例えば、癌状態ある いは前癌状態の指標として使うこと）が、可能で、より好ましくは上記プラスの指標とマ ィナスの指標とを組み合わせて使用して、癌の判定を行うこと（例えば、癌状態あるい は非癌状態の指標として使うこと）ができる。
[0024] 別の態様では、表 5の 27個の遺伝子は 2〜27個を含む組み合わせで使用し該遺伝 子の発現上昇を指標として、癌の判定を行うこと（例えば、癌化リスクがあること、ある いは癌化リスクが少ないことの指標として使うこと）ができ、例えば、 4個のマーカー遺 伝子（配列番号: 16、 18、 27及び 33からなる群から選択された配列で示される塩基配 列を含む遺伝子)もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現上昇を指標とし て、癌の判定を行うこと（例えば、癌化リスクがあることの指標として使うこと）、または、 そのうち 3個のマーカー遺伝子（配列番号： 1、 19及び 32からなる群から選択された配 列で示される塩基配列を含む遺伝子)もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子の 発現上昇を指標として、癌の判定を行うこと（例えば、癌化リスクが少ないことを示す 指標として使用すること）が、可能である。
[0025] 本発明では、表 5の 27個の遺伝子は 2〜27個を含む組み合わせ、あるいは、表 5の 27個の遺伝子のうち、前者の 12個のマーカー遺伝子（配列番号: 1、 2、 3、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12及び 13からなる群から選択された配列で示される塩基配列を含む遺伝 子もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子）の 1〜12個と後者の 15個のマーカー 遺伝子（配列番号: 15、 16、 17、 18、 19、 21、 23、 24、 27、 28、 29、 30、 31、 32及び 33か らなる群から選択された配列で示される塩基配列を含む遺伝子もしくは該遺伝子と 機能的に同等な遺伝子）の 1〜 15個とを互レ、に組み合わせて含んでレ、る組み合わせ を用い、癌あるいは非癌の判定に使用することができる。一つの態様では、 11個のマ 一力一遺伝子（配列番号： 1、 2、 5、 13、 15、 19、 21、 24、 30、 31及び 32からなる群から 選択された配列で示される塩基配列を含む遺伝子もしくは該遺伝子と機能的に同等 な遺伝子）の組み合わせ（2〜11個のマーカー遺伝子を含む組み合わせであっても よい）、 9個のマーカー遺伝子（配列番号: 1、 2、 5、 15、 19、 21、 30、 31及び 32力らなる 群から選択された配列で示される塩基配歹 IJを含む遺伝子もしくは該遺伝子と機能的 に同等な遺伝子）の組み合わせ（2〜9個のマーカー遺伝子を含む組み合わせであ つてもよい）、あるいは、 5個のマーカー遺伝子（配列番号: 1、 2、 15、 19及び 21からな る群から選択された配列で示される塩基配列を含む遺伝子もしくは該遺伝子と機能 的に同等な遺伝子）の組み合わせ（2〜5個のマーカー遺伝子を含む組み合わせで あってもよい）を使用して、各遺伝子の発現量を統計的に評価判別しうるようにして、 それを癌あるいは非癌の判定 (予測を含む)に使用することができる。
別の一つの態様では、表 5の 27個の遺伝子のうち、前者の 12個のマーカー遺伝子 (配列番号: 1、 2、 3、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12及び 13からなる群から選択された配列 で示される塩基配列を含む遺伝子もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子）の 1 〜12個と後者の 15個のマーカー遺伝子（配列番号: 15、 16、 17、 18、 19、 21、 23、 24、 27、 28、 29、 30、 31、 32及び 33からなる群から選択された配列で示される塩基配列を 含む遺伝子もしくは該遺伝子と機能的に同等な遺伝子）の 1〜15個とを互いに組み 合わせたもの、例えば、 7個のマーカー遺伝子（配列番号： 1、 16、 18、 19、 27、 32及 び 33からなる群から選択された配列で示される塩基配列を含む遺伝子もしくは該遺 伝子と機能的に同等な遺伝子）の組み合わせ（2〜7個のマーカー遺伝子を含む組 み合わせであってもよい）を使用して、各遺伝子の発現量を統計的に評価判別しうる ようにして、それを癌化リスクの判定 (予測を含む)に使用することができる。
[0027] 本発明における検查方法としては、上記の本発明に係る遺伝子にコードされるポリ ペプチドの発現量を測定する工程を含む検查方法、または、本発明に係る遺伝子の うち複数の遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現量を測定するェ 程を含む検查方法、力挙げられる。このような検查方法は、癌治療効果のモニタリン グにおいてもまた使用することができる。ここで、上記遺伝子の発現量とは、通常、該 遺伝子 DNAから転写される mRNAの発現量を意味する力 該 mRNAから変換された c DNAや cRNAの量もまた上記「遺伝子の発現量」に包含される。以下に本発明の検査 方法の具体的な態様を記載するが、本発明の検査方法は、それらの方法に限定さ れるものではない。
[0028] 本発明の遺伝子または該遺伝子にコードされるポリペプチドの発現量を測定する 工程を含む検査方法の一つの態様としては、まず、被検者からポリペプチド試料を 調製する。本発明において、被検者からのポリペプチド試料としては、例えば、被検 者の血液、尿、唾液、生検や手術により採取した組織または細胞から、当業者に周 知の方法で調製したポリペプチド試料が挙げられる。
[0029] 本発明の方法においては、次いで、該ポリペプチド試料に含まれる本発明に係る D NAにコードされるポリペプチドの量を測定する。
[0030] このような方法としては、当業者に周知の方法、例えば、酵素結合免疫測定法 (ELI SA)、二重モノクローナル抗体サンドイッチィムノアツセィ法（米国特許第 4,376， 110号 )、モノクローナルポリクローナル抗体サンドイッチアツセィ法（Wideら、 Kirkham及び H unter編集、「フンオイムノアツセィ法 (Radioimmunoassay)」、 E. and S. Livingstone^ェ ジンバラ、 （1970) )、免疫蛍光法、ウェスタンブロッテイング法、ドットブロッテイング法 、免疫沈降法、プロテインチップによる解析法（蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.5 (20 02)、蛋白質 核酸 酵素 Vol.47 No.8 (2002) )、 2次元電気泳動法、 SDSポリアタリ ルアミド電気泳動法が挙げられるが、上記検查方法は、これらに限定されない。
[0031] 上記方法のうち ELISA法の具体的な態様を以下に述べるが、本発明は、この方法 に限定されるものではなレ、。 ELISA法においては、対象となる融合タンパク質が、マイ クロタイターゥエルの表面に吸着される。その後表面上の残余のタンパク質 結合部 位力 ゥシ血清アルブミン (BSA)、熱失活した正常ャギ血清 (NGS)、又は BLOTTO (保 存剤、塩及び消泡剤を含む脂肪非含有乾燥ミルクの緩衝液)などの適当な物質でブ ロッキングされる。その後ゥヱルを、特異的抗体を含むことが疑わしい試料と共にイン キュベーシヨンする。試料は、希釈せずに適用するか、もしくはより頻繁には通常 BSA 、 NGS、又は BLOTTOのようなタンパク質を少量 (0.1〜5.0質量％)含有する緩衝液中 に希釈することができる。特異的結合が生じるのに十分な時間インキュベーションし た後、ゥヱルを洗浄し、非結合のタンパク質を除去し、かつ次にレポーター基で標識 した抗一種 (anti-species)特異的免疫グロブリン抗体と共にインキュベーションする。こ のレポーター基は様々な酵素から選択することができ、例えばホースラディッシュぺ ルォキシダーゼ、 β ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びグルコースォ キシダーゼがある。特異的結合が生じるのに十分な時間経過後、次にゥエルを再度 洗浄し、非結合の複合体を除去し、かつ該酵素の基質を添加する。色を発色させ、 ゥエルの内容物の光学密度を、肉眼で又は装置により決定する。
[0032] 本発明においては、上記方法により、例えば、 LP検体に比し、 OSCC検体および/ または中度（moderate-)力ら重度異形成 (severe-dysplasia)検体で有意に高発現して レ、る 4つの力必タンノヽク ¾、 ImmunoLrgloDulin J polypeptide, linker protein (遺 子 ID ： SC43)、 Follistatin, transcript variant FST317、遺 子 ID: SCI 3)、 Parathyroid hormo ne-like hormone (退伝子 ID:SC27)、 Transforming growth Factor, beta-induced, 68k Da (遺伝子 ID:SC41)を検出することで、 口腔扁平上皮癌の早期検查を行うことができ る。
[0033] 検查方法の別の態様としては、まず、被検者から RNA試料を調製する。次レ、で、該 RNA試料に含まれる本発明に係る遺伝子の mRNAの量を測定する。次いで、測定さ れた mRNAの量を対照と比較する。その他の態様としては、まず、被検者から cDNA 試料を調製する。次いで、該 cDNA試料に含まれる本発明に係る遺伝子の mRNAに 対応する cDNAの量を測定する。次いで、測定された cDNAの量を対照と比較する。こ のような方法としては、当業者に周知の方法、例えばノーザンブロッテイング法、 RT- PCR法、 Reaト time PCR法等を挙げることができる。より望ましくは定量的 RT-PCR法 である。定量的 RT-PCRに使用するプライマーは、ターゲット DNAにハイブリダィズし 、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。該オリゴ ヌクレオチドのの長さは、通常 15bp〜100bpであり、好ましくは 16bp〜45bpで、より好 ましくは 17bp〜30bpであり、十分に機能するものとしては 19bp〜28bpのものが挙げら れる。定量的 RT-PCRに使用するプライマーの一例は、配列番号： 34から 99に示す プライマーが挙げられるが、機能的に同等な他のプライマーを用いることもできる。被 験者から cRNA試料または cDNA試料を調整する工程、本発明に係る cDNAの完全長 または一部を増幅するヌクレオチドプライマーを用いて、該 cDNAを増幅する工程、増 幅された該 cDNA試料を検出する工程により、本発明に係る遺伝子の発現量を測定 することができる。 Real-time PCR法では、蛍光色素などで修飾した検出用オリゴヌク レオチド、あるいは増幅された DNAにインター力レートして蛍光を発するものなどを使 用でき、そのようなものとしては、例えば、 SYBR Green I、 TaqManプローブ、 Molecula r Beaconプローブなどが挙げられる。
[0034] 検査方法の別の態様としては、まず、被検者から調製した cRNA試料または cDNA 試料、および、本発明に係る DNAとハイブリダィズするヌクレオチドプローブが固定さ れた基板を提供する。次いで、該 cRNA試料または cDNA試料と該基板を接触させる 。次いで、該 cRNA試料または cDNA試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブ とのハイブリダィズの強度を検出することにより、該 cRNA試料または cDNA試料に含 まれる本発明に係る DNAの発現量を測定する。さらに、測定された DNAの発現量を 対照と比較する。このような方法としては、マイクロアレイ法 (SNP遺伝子多型の戦略、 松原謙一 ·榊佳之、中山書店、 P128-135)が例示できる。
[0035] 被検者からの cRNA試料や cDNA試料の調製は、例えば、被検者の生検から抽出し た mRNAを铸型にして、当業者に周知の方法で行うことができる。例えば被検者の癌 罹患部などから、 mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァニ ジン超遠心法（Chirgwin, J. Μ· et al.， Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、 AGPC 法（Chomczynski, P. and Sacchi, Ν· , Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159)等により 総 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia社)等を使用して総 RNAから mRN Aを精製する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia社)を用いることに より mRNAを直接調製することもできる。得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDN Aを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synt hesis Kit (生化学工業社)等を用いて行うこともできる。また、 cRNAの合成は、例えば 、 Luo， Lらの方法（Nat. Med. (1999) 5: 117-122)にしたがって行うことができる。調製 した cRNA試料や cDNA試料には、必要に応じて、当業者に周知の方法によって検出 のための標識を施すことができる。
[0036] 本発明において「基板」とは、ヌクレオチドを固定することが可能な板状の材料を意 味する。本発明においてヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド が含まれる。本発明に係る基板は、ヌクレオチドを固定することが可能であれば特に 制限はないが、一般に DNAアレイ技術で使用される基板を好適に用いることができる 。基板の材料としては、例えば、ガラス、プラスチックなどが挙げられ、無修飾オリゴ D NAを固定できるように表面加工が施されてレ、てよレ、。
[0037] 一般に DNAアレイは、高密度に基板にプリントされた何千ものヌクレオチドで構成さ れてレ、る。通常これらの DNAは非透過性 (non-porous)の基板の表層にプリントされる 。基板の表層は、一般的にはガラスであるが、透過性 (porous)の膜、例えばニトロセ ルロースメンブレンを使用することができる。
[0038] 本発明において、ヌクレオチドの固定（アレイ）方法として、 Affymetrix社開発による オリゴヌクレオチドを基本としたアレイが例示できる。オリゴヌクレオチドのアレイにお いて、オリゴヌクレオチドは通常インサイチュ (in situ)で合成される。例えば、 photolith ographicの技術 (Affymetrix社）等によるオリゴヌクレオチドのインサイチュ合成法が既 に知られており、このような技術を本発明に係る基板の作製に利用することもできる。
[0039] 基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明に係る DNAと特異的にハイブリダ ィズするものであれば特に制限されなレ、。ここで「特異的にハイブリダィズする」とは、 通常のハイブリダィゼーシヨン条件下、好ましくはストリンジヱントなハイブリダィゼーシ ヨン条件下 (ί列えば、サムフノレックら， Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Labor atory Press, New York, USA,第 2版 1989に記載の条件）において、本発明に係る D NA以外の DNAとクロスハイブリダィゼーシヨンを有意に生じなレ、ことを意味する。特異 的なハイブリダィズが可能であれば、検出する DNAの塩基配列に対し、完全に相補 的である必要はない。 [0040] また、本発明に係るヌクレオチドには、オリゴヌクレオチドや cDNAなどが含まれる。 基板に結合するヌクレオチドプローブの長さは、通常 cDNAを固定する場合 100〜400 0ベースであり、好ましくは 200〜4000ベースであり、さらに好ましくは 500〜4000ベー スである。オリゴヌクレオチドを固定する場合は、通常 15〜500ベースであり、好ましく は 30〜200ベースであり、さらに好ましくは 50〜200ベースである。
[0041] 本発明において、該 cRNA試料や cDNA試料と基板に固定されたヌクレオチドプロ ーブとのハイブリダィズの有無または強度を検出する方法としては、例えば、蛍光シ グナルをスキャナ一等によって読み取ることによって行うことができる。
[0042] また、本発明に係る DNAうち複数の DNAまたは該 DNAにコードされるポリペプチド の発現量を測定する工程を含む検査方法の一つの態様としては、マイクロアレイ法を 利用して、本発明に係る DNAのうち複数の DNAの発現プロフアイノレを解析する方法 力 S挙げられる。まず、被検者から調製した cRNA試料または cDNA試料、および、本発 明に係る DNAのうち複数の DNAとそれぞれハイブリダィズするヌクレオチドプローブ が固定された基板を提供する。次いで、該 cRNA試料または cDNA試料と該基板を接 触させる。次いで、該 cRNA試料または cDNA試料と該基板に固定されたヌクレオチド プローブとのハイブリダィズの強度を検出することにより、該 cRNA試料または cDNA試 料に含まれる本発明に係る DNAのうち複数の DNAの発現量を測定する。
[0043] 基板に固定するヌクレオチドプローブは、本発明のうち複数の DNAと特異的にハイ ブリダィズすることが可能なヌクレオチドであれば特に制限はなレ、。また、基板に固定 するヌクレオチドプローブは、本発明においてその発現を検出したい本発明に係る D NAに応じて、その種類の数が決定される。例えば、本発明に係る DNAとして 10個の 発現を検出したい場合、 10個それぞれの DNAと特異的にハイブリダィズするヌクレオ チドプローブを基板に固定する。その際、それぞれの DNAに対応したヌクレオチドプ ローブは必ずしも 1種類に限定される必要はなぐ検出したい本発明に係る DNAの任 意の領域と相補性を有する複数種のヌクレオチドプローブの混合物であってもよい。
[0044] 上記の方法によって得られた遺伝子の発現量を解析し、癌と非癌の判別、癌の有 無、癌の悪性度などが判定される。
[0045] 本発明の解析する工程において用いられる多変量解析としては、例えば、重回帰 分析、線形判別分析、マハラノビス判別分析、サポートベクターマシーン、決定木、ク ラスター分析、自己組織化マップ、主成分分析、階層型ニューラルネットなどが含ま れる。好ましくは、クラスター分析、線形判別分析である。
[0046] 本発明はまた、本発明の癌の検查方法に用いるための検查薬を提供する。このよう な検查薬としては、本発明に係る DNAにコードされるポリペプチドに結合する抗体を 含む検查薬が例示できる。
[0047] 上記ポリペプチドに結合する抗体を作成するには、まず、本発明に係る DNAを公知 の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内 外から本発明に係る DNAにコードされるポリペプチド又はその断片を公知の方法で 得て、これらを感作抗原として用いればよい。別の手法としては、本発明に係る DNA にコードされるポリペプチドのアミノ酸配列より、適切な領域あるいは特徴的な領域を 選択し、選択された領域のペプチド断片をペプチド合成機などで化学合成し、必要 に応じてコンジュゲート化（キャリア一として、例えば、 BSA(bovine serum albumin), K LH(keyhole limpet hemocyanin)などが使用できる）した後、当該ペプチド断片 (あるい は当該ペプチド断片のコンジュゲート)を感作抗原として用いてもよい。
[0048] 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融 合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的には、げっ 歯目、ゥサギ目、霊長目の動物が使用される。マウスは、好適な動物として例示でき る。
[0049] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法 としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。次いで、血清中に所 望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
[0050] 本発明に係る遺伝子にコードされるポリペプチドに対するポリクローナル抗体を得る には、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺 乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクロ ーナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応 じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよ レ、。例えば、本発明に係る蛋白質をカップリングさせたァフィ二ティーカラムを用いて 、本発明に係るポリペプチドのみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテイン
Aあるいはプロテイン Gカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリン Gあるい は Mを調製することができる。本発明に係る蛋白質のアミノ酸配列より選択されたぺ プチド断片をカップリングさせたァフィ二ティーカラムを用いてもよい。
[0051] モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の 抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞 融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾 細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺 乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を 獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
[0052] 前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミ ルスティンらの方法（Galfre, G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (1981) 73， 3-46 )等に準じて行うことができる。
[0053] 細胞融合により得られたハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養 液 (ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより 選択される。当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリドーマ以外の細胞（非 融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリー二 ングおよびクローニングを行う。
[0054] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 、例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroで蛋白質、蛋白質発現細胞又は その溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞 、例えば U266と融合させ、蛋白質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生する ノ、イブリドーマを得ることもできる（特開昭 63-17688号公報)。
[0055] 次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収 し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテイン A、プロテイン G力 ラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明に係る DNAにコードされるポリぺプ チドをカップリングしたァフィ二ティーカラムなどにより精製することで調製することが 可能である。
[0056] このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生さ せた組換え型抗体として得ることができる（例えば、 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick , J. W.， THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Ki ngdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。組換え型抗体は、それを コードする DNAをハイプリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞から クローユングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。
[0057] さらに、上記抗体は、本発明に係る DNAにコードされるポリペプチドに結合する限り 、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、 Fab, F(ab') 、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチヱイン Fv(scFv)(H
2
uston, J. S. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)が挙げられる 。具体的には、抗体を酵素、例えば、ノ パイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成さ せるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに 導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、 CO, M. S. et al., J. Immunol. ( 1994) 152， 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A. H.， Methods Enzymol. (1989) 17 8, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178， 497-515; Lamoyi, Ε·， Methods Enzymol. (1986) 121， 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. and Walker, B. W.， Trends Biotechnol. ( 1991) 9， 132-137参照）。
[0058] 抗体修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体を使 用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このよう な抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ること ができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
[0059] また、本発明に係る DNAにコードされるポリペプチドに対する抗体は、公知の技術 を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体 又は非ヒト抗体由来の CDR (相補性決定領域）とヒト抗体由来の FR (フレームワーク領 域)及び定常領域力 なるヒト型化抗体として得ることができる。
[0060] 前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用さ れる抗体の分離、精製は、通常の蛋白質の分離、精製方法を適用すればよい。例え ば、ァフィ二ティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外 濾過、塩析、透析、 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜 選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Antibodies: A Laborato ry Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) T)ゝ、こ れらに限定されるものではなレ、。上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又 は酵素結合免疫吸着検定法（Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)等により 行うことができる。
[0061] ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテ イン Gカラムが挙げられる。例えば、プロテイン Aを用いたカラムとして、 Hyper D、 PO ROS、 Sepharose F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。
[0062] ァフィ二ティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン 交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー 、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Char acterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは HPLC、 FPLC等の液 相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
[0063] このようにして得られた抗体は、上記の検查方法に使用することができるだけでなく 、本発明に係る DNAにコードされるポリペプチドを標的としたイメージングを行うことを 特徴とする、癌の検查方法にも利用することができる。該方法の 1つの態様としては、 上記ポリペプチドに結合する抗体を作成する。次いで、該抗体をポジトロン放出同位 元素で標識する。次いで、標識が付された抗体を被検者に投与する。次いで、ポジト ロン放出断層撮影法で放射能を検出する。次いで、検出された放射能を対照と比較 する。特に、微小転移巣の検出、癌の浸潤度の判定は手術適用時に重要な要素で あり、特異的な細胞表面マーカーを標的としたイメージングにより実施可能である。こ のようなイメージング技術は、 口腔癌を含めた治療への応答性評価の目的にも利用 可能である。
[0064] また、本発明の検査薬には、本発明に係る DNAにハイブリダィズし、少なくとも 15ヌ クレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドを含む検查薬もまた含まれる。該オリゴ ヌクレオチドは、本発明に係る DNAに特異的にハイブリダィズするものである。特異的 なハイブリダィズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明に係る DNAに対し 、完全に相補的である必要はない。
[0065] 本発明に係る cDNAにハイブリダィズし、少なくとも 15ヌクレオチドの鎖長を有するォ リゴヌクレオチドを含む検查薬としては、上記本発明の検查方法に使用しうるプロ一 ブ (該プローブが固定された基板の形態であってもよい）やプライマーが挙げられる。 上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常 15bp〜100b Pであり、好ましくは 16bp〜45bpで、より好ましくは 17bp〜30bpであり、十分に機能する ものとしては 19bp〜28bpのものが挙げられる。プライマーは、本発明に係る DNAの少 なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されなレ、。定量的 RT-PCRに使用 するプライマーの一例は、配列番号 34から配列番号 99で示されたプライマーであり 、これらと同等の機能を有するプライマーも本発明の検査薬のプライマーに含まれる
[0066] また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発 明に係る DNAに特異的にハイブリダィズするものであれば、特に制限されなレ、。該プ ローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよぐ通常少なくとも 15bp以上の鎖長を 有する。
[0067] 本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成機により作製 することができる。プローブは、制限酵素処理等によって取得される二本鎖 DNA断片 として作製することもできる。
[0068] 本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いるこ とが好ましい。標識する方法としては、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌ クレオチドの 5'端を32 Pでリン酸化することにより標識する方法、およびタレノウ酵素等 の DNAポリメラーゼを用レ、、ランダムへキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとし て32 P等のアイソトープ、蛍光色素、ピオチン、アルカリ性フォスファターゼ (AP)、または ジゴキシゲニン (DIG)等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法 (ランダムプ ライム法等）を例示することができる。 [0069] 本発明の検查薬には、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、 滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク 質安定剤 (BSAやゼラチンなど)、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
[0070] また、本発明においては、本発明に係る DNAのプロモーター領域の 3'側に細胞障 害性タンパク質をコードする DNAが機能的に結合した DNAを提供する。このような DN Aは抗癌剤として使用できる有用な DNAである。
[0071] 本発明において、「機能的に結合した」とは、本発明に係る DNAのプロモーター領 域に転写因子が結合することにより、細胞障害性タンパク質をコードする DNAの発現 が誘導されるように、本発明に係る DNAのプロモーター領域と細胞障害性タンパク質 をコードする DNAとが結合していることをいう。従って、細胞障害性タンパク質をコード する DNAが他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成 する場合であっても、本発明に係る DNAのプロモーター領域に転写因子が結合する ことによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に 結合した」の意に含まれる。
[0072] 本発明における細胞障害性タンパク質としては、細菌産生毒素、植物産生毒素、 動物産生毒素などを包含してよぐジフテリア毒素、 HSV由来チミジンキナーゼなどが 例示できるが、これらに限定されず、直接的または間接的に細胞に障害を与え、致 死的影響を及ぼすタンパク質であれば、本発明における細胞障害性タンパク質に含 まれる。
[0073] 本発明に係る DNAのプロモーター領域は、例えば公開されているゲノム配列デー タより抽出し、 PCRにて対応する領域 (例えば mRNAの 5'末端より約 3kbの領域が挙げ られる力 これに限定されなレ、）を増幅することで得ることができる。得られたプロモー ター領域の 3'側に、当業者に周知の方法で、細胞障害性タンパク質をコードする DN Aを連結することにより、本発明に係る DNAのプロモーター領域の 3'側に細胞障害性 タンパク質をコードする DNAが機能的に結合した DNAを構築することができる。また、 構築された DNAを、適当なベクターに組み込み、大腸菌等の宿主細胞で増幅するこ とが可能である。
[0074] ヒトを含む動物の生体内において、本発明に係る DNAのプロモーター領域の 3'側 に細胞障害性タンパク質をコードする DNAが機能的に結合した DNAを発現させる方 法としては、該 DNAを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウイルス法、不活性 化 HVJ-エンベロープ法、カチォニックリボソーム法、アデノウイルス法などにより生体 内に導入する方法などが挙げられる。これにより、癌の遺伝子治療を行うことが可能 である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えば pAdexl cw)やレトロウイルスベクター（例えば pZIPneo)などが挙げられるが、これらに制限さ れない。ベクターへの本発明に係る DNAの揷入などの一般的な遺伝子操作は、常法 に従って行うことが可能である（Molecular Cloning, 5.61-5.63)。生体内への投与は、 ex vivo法であっても、 in vivo法であってもよい。
[0075] 本発明は、被験試料における抗癌活性の有無を評価する方法および抗癌活性を 有する試料のスクリーニング方法を提供する。被験試料における抗癌活性の有無を 評価する方法は、本発明に係る DNAのうち複数の DNAの発現プロファイルを指標と する方法である。このような方法としては、まず、癌細胞に被験試料を接触させる。次 いで、被験試料を接触させた癌細胞から調製した cRNA試料または cDNA試料、およ び、本発明に係る DNAのうち複数の DNAとそれぞれハイブリダィズするヌクレオチド プローブが固定された基板を提供する。次いで、該 cRNA試料または cDNA試料と該 基板を接触させる。次いで、該 cRNA試料または cDNA試料と該基板に固定されたヌ クレオチドプローブとのハイブリダィズの強度を検出することにより、該 cRNA試料また は cDNA試料に含まれる本発明に係る DNAのうち複数の DNAの発現量を測定する。 また、前記の定量的 RT-PCRに使用するプライマーを用いた、発現量の測定を行うこ とも可能である。被験試料を接触させた癌細胞から調製した cRNA試料または cDNA 試料を、本発明に係る DNAの完全長または一部を増幅するヌクレオチドプライマーを 用いて、増幅した後、増幅された該 cRNA試料または cDNA試料を検出することにより 、それらの遺伝子の発現量を測定することができる。
[0076] 本発明の方法における「被検試料」としては、特に制限はなぐ例えば、天然化合 物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合 物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵 微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出 物もしくは動物細胞抽出物等を挙げることができる。上記被験試料は必要に応じて 適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等を 挙げることができる。また、「複数の被験試料」としては、特に制限はなぐ例えば、上 記被験試料に加えて、これらの被験試料を複数種混合した混合物も含まれる。
[0077] 本発明の方法において癌細胞としては、癌組織における細胞、癌組織から採取し た細胞を培養した培養細胞株などが挙げられる。また、本発明の方法における癌細 胞としては、ヒトの癌の治療薬を同定することに適している生物由来の癌細胞であれ ば特に制限されなレ、。このような生物としては、好ましくは哺乳動物（例えば、ラットや マウスなどのヒト疾患のモデル哺乳動物、ヒト癌が移植されたモデル哺乳動物）であり 、最も好ましくはヒトである。
[0078] 本発明におレ、て「癌細胞に被験試料を接触させる」方法としては、癌細胞に被験試 料を直接的に接触させる場合だけでなぐ癌細胞に被験試料を間接的に接触させる 場合 (この場合、例えば被験試料を接種した生物由来の細胞を使用する）の双方を 含む意である。
[0079] 癌細胞の被験試料での処理は、例えば、単離細胞であれば、 Scherfb (U Scherf, D
T Ross, Μ Waltham, L H Smith, J K Lee, L Tanabe, K W Kohn, W C Reinhold, T G Myers, D T Andrews, D A Scudiero, M B Eisen, E A Sausville, Y Pommier, D Bot stein, P O Brown & J N Weinstein, A gene expression database for the molecular ph armacology of cancer. Nat Genet. 2000, 24. 236- 244)の文献に記載の方法によって 行うことができる。また、生物個体であれば、化合物を経口的または非経口的に投与 することにより行うこと力できる。
[0080] 本発明においては、被験試料を処理した場合の本発明の DNAのうち複数の DNAの 発現量が、対照における該 DNAの発現量まで回復している（癌細胞特異的な発現プ ロフアイノレ力も癌化していない正常細胞の発現プロファイルまたは前癌状態の細胞 の発現プロファイルへ転換している）場合に、被験試料が抗癌活性を有すると判定さ れる。
[0081] さらに、本発明は、抗癌活性を有する試料を効率的にスクリーニングする方法を提 供する。該方法においては、上記評価方法を利用して、複数の被験試料について、 抗癌活性の有無を評価し、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する。
[0082] さらに、本発明においては、抗癌活性を有する医薬組成物の製造方法を提供する 。該製造方法においては、上記スクリーニング方法によって抗癌活性を有すると評価 された試料と医薬上許容される担体とを混合する。該担体としては、例えば界面活性 剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合 剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず 、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケィ酸、乳 糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロース ナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビ 二ルァセタールジェチルァミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪 酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、白糖、カルボキシメチルセル ロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
[0083] 以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の 説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの 例示は本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すもので はない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは 理解されるべきである。全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的 な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者に とり周知で慣用的なものである。
実施例 1
[0084] 組織学的分析に使用した臨床検体は、 口腔扁平上皮癌の 27検体、白板症の 19検 体（うち過形成が 4、軽度異形成が 3、中度異形成が 7、重度異形成が 5検体）、これら の検体は、北海道大学病院歯科において、それぞれの患者から手術的に切除され たものであり（表 1)、細分し、間質組織を取り除かれた後、—100°Cで保存されていた ものを使用した。臨床検体は、北海道大学歯学部歯科病院において、患者の inform ed consentおよび倫理委員会の承認のもとで外科的摘除時に採取されたものである 。患者の主な組織学的特徴を表 1に示した。組織学的特徴の表示において、 OSCC は口腔扁平上皮癌、 Mild/Mod/S dysは、それぞれ軽度異形成、中度異形成、重度 異形成を示す。切除部位では、 Tは tongue、 Pは palate、 LG/UGは lower gingive/upp er gingive、 FMは floor of mouth、 Buはり uccal mucosa^ Siは sinus 不す。十生另 llでは M は男性、 Fは女性を示す。 *を付した検体、 Mod dys 36— 40及び Mod dys 42 _44は 、同一病変の異なる部位に由来する 3試料の混合物である。 #を付した検体、 Mod d ys 47,48及び Mod dys 32,33は、同一病変の異なる部位に由来する 2試料の混合物 である。
実施例 2
[0085] RNAの抽出は ISOGEN (二ツボンジーン社製）を用い、該製造者の推奨する方法に しに力つて行つ 7こ (Kondoh Nり， Identincation and characterization or genes associat ed with human hepatocellular carcinogenesis. Cancer Res 1999; 59: 4990—6.)。 白板 症 5検体（うち過形成 (hyperplasia)が 1、軽度異形成形 (mild)が 1、中度異形成 (mod erate)が 1、重度異形成（sever dysplasia)が 2検体）から得た総 RNA、 OSCC5検体か ら得た総 RNAをそれぞれ混合した。
実施例 3
[0086] cDNAマイクロアレイ分析は IntelliGene HS Human expression chip (タカラ社製: 16,6 00プローブ）を用いて行った。手短には、前記実施例 2で得られたそれぞれの総 RNA 混合物について 4 μ gずつの RNAを分取し、オリゴ— dTプライマーが連結された T7— プロモータを用いた一本鎖 cDNAの合成のために使用した。続いて、増幅された（a) — RNA合成を、アミノアリル- UTP (Ambion社製、米国）の存在下で行ったのち、 3'Cy 3-ヒドロキシスクシンイミドエステル又は 3'Cy5-ヒドロキシスクシンイミドエステルにて 蛍光標識した。精製後、標識された a— RNAを合わせて、前記 IntelliGene HS Human expression chipに対してハイブリダィズした。ー晚、 70°Cでハイブリダィズしたのち、 S canArray Express micro array reader (Penan Elmer社製) (こて' 光走查を5 Γτレヽ、付属 のソフトウェアにより定量した。データの信頼性を確かなものとするため、 Student t-te stにより Pく 0.001で、定量値の平均値の差が有意であって、 3倍以上の変化が見られ た場合に特異的な発現であると見なした。
[0087] 16,600の標的cDNAのぅち、 4，600の cDNAが検出可能な信号を見せた。そのうち 63 の cDNAは、 OSCC組織からの RNA混合物では、 LP組織からの RNA混合物に比し、 3 倍以上の発現であった。一方、 55遺伝子は LP組織からの RNA混合物では、 0SCCの それに比し、 3倍以上の発現であった。
実施例 4
[0088] 定量的 RT-PCR分析をマイクロアレイ分析のバリデーシヨンのために行った。 OSCC および LPの数検体から得られた総 RNAを使用し、前記非特許文献 4の方法にしたが つて定量的 RT-PCR分析を行った。手短には、 Superscript II (Invitrogen社製）を使用 して、それぞれ 1 μ gの総 RNAを逆転写して、一本鎖 cDNAを得た。マイクロアレイ分 析において 3倍又はそれ以上の差が見られる遺伝子に対して、 Primer Express softw are (Perkin Elmer社製）を用いて PCRのためのプライマー対をデザインした（表 2)。表 中、本発明に係る遺伝子（遺伝子 IDで示す）、該遺伝子のためのプライマーの塩基 配列及び配列番号を示した。なお遺伝子 IDは後記表 3の遺伝子 IDに対応している。
PCRは Sybr Green Mastermix (Applied Biosystems社製)を用いて、 95。C、 15分間の 初期ディネ一チヤ一、それに続いて、 95°C、 30秒間と 60°C、 1分間の 40サイクルの反 ¾rABI Prism 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems土 ) (こ飞 frつ た。それぞれの遺伝子の値は、内部標準である S5リボゾームタンパクの mRNAの発現 レベルに対して標準化した。遺伝子の発現量の差にっレ、て統計的有意性を評価す るために、 Student t-test (両側）による検定を行った。
[0089] RT-PCR分析を OSCCの 27検体及び LPの 15検体（表 1中、検体番号:!〜 27及び 28 〜42)を用いて行った結果、前記遺伝子マーカーの候補の中で、 33個の遺伝子が 0 SCCにおいて、 30個の遺伝子が LPにおいてそれぞれ有意に (Pく 0.05)高発現している ことが明らかになった。 口腔における解剖学的な部位が違うことの影響を最小限にす るために、ほとんどの LP組織を舌から切除したものを使用した力 さらに、 OSCCの 9 組織および LPの 12組織（いずれも舌のみから得た）を用いて特異的な発現のレベル を確認した。解剖学的な部位の違いにかかわりなぐ 32個のマーカー遺伝子の発現 は、 OSCCと LPの間で有意に (Pく 0.05)変化していた。また、 IGJ (SC43)は、 1つの過形 成 (hyperplasia)検体、全ての軽度異形成 (mild dysplasia)の検体、いくつかの中度異 形成 (moderate dysplasia)の検体において、発現が強く抑制されており、これを加えた 、 33個のマーカー遺伝子に注目した（表 3)。 [0090] これらのうち 14遺伝子は、 LP検体に比し、 OSCC検体および/または中度 (moderat e)から重度異形成 (severe-dysplasia)検体で有意に高発現した (表中、遺伝子 IDに SC と示される）。また、 19遺伝子は、 OSCC組織に比し、 LP組織中で有意に高発現であ つた（同様に LPと示される）。表 3には本発明における遺伝子 ID、マーカー遺伝子の 名称、 Genbank accession皿 mber、配列番号に加え、後述の実施例 5におけるクラス ター解析の結果を示した力 クラスター a〜dは後記図 1のクラスター a〜dに対応する
実施例 5
[0091] クラスター解析は DNASIS Proソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング社製）を 用いて行った。教師なし階層クラスタリング (unsupervised hierarchical clustering)によ り検体間の関係及び遺伝子間の関係を解析した。
[0092] OSCC組織と LP組織との分類をするために、 33個のマーカー遺伝子の発現に基づ き、組織検体の教師なしクラスター解析を行った。 LP組織と OSCC組織とを明確な区 別を試みた。図 1に示すように、クラスタリングアルゴリズムの組合せ、 Cosine Corr (類 似性指標）と Centroid (クラスター統合基準）によって、 27個の OSCC組織および 15個 の LP組織は 2つのグループに分けられた。その一方は、更に下位グループ I及び IIに 分けられ；他のものは下位グループ ΠΙ、 IVおよび Vに分けられた。 15個の LP組織のう ち 12個の LP組織は、グループ Iに分類された。一方、グループ III、グループ IVおよび グループ Vは OSCC組織のみ力 構成された。グループ IIには、 9個の OSCC組織及 び 3個の LP組織の両方が含まれることが注目された。
[0093] 一方、前記 14個のマーカー遺伝子と前記 19個のマーカー遺伝子の分離では、 Bra y Curtis (類似性指標）及び Median (クラスター統合基準）の組合せを用いて行った。 それらのマーカー遺伝子は 4つの下位クラスターに分けられた。クラスター aは 15個の LP遺伝子及び 1個の SC遺伝子から構成されるが、それらの発現は前記グループ I及 び IIの双方で上昇し、前記グループ III及び IVでは顕著に減少し、前記グループ Vで は強く抑制された。
[0094] クラスター bの 4個の LP遺伝子は、前記グループ Iの LP組織では高発現し、一方、前 記グループ II、 III、 IV及び Vの LP組織では発現量が有意に低くなつた。これに対して 、殆どのクラスター cの遺伝子は前記グループ Vの OSCC組織では高発現し、そして、 その発現は前記グループ IV、 III、 Π、 Iへ向うに従い減少した。クラスター dの遺伝子は 前記グループ Vの殆どの OSCC組織で過剰発現した力 前記グループ IV、 III、 IIおよ び Iでは明らかに抑制された。また、遺伝子 CXCLIO (sci)はグループ mの組織にお レ、て特に過剰に発現した。
実施例 6
[0095] OSCC組織にぉレ、て顕著に抑制されてレ、た TG-3 (Transglutaminase 3)の cDNAを 発現ベクターに機能的に連結した cDNA発現ベクターをヒト OSCC細胞株である HSC3 に導入し、抗生物質を含む選択培地上でさせた。培養後、生存細胞をギムザ染色し これらの細胞のコロニー形成を観察した。その結果、対照区 (ベクターのみ）に比し、 TG-3導入区において、 HSC3細胞のコロニー形成が著しく阻害された。
実施例 7
[0096] 前記クラスタリング.アルゴリズムにより、 OSCC検体および LP検体が 5グループに分 けられたことより、グノレープ II、 III、 IVおよび Vの OSCCの臨床病理学的所見を比較し た。グノレープ Vに分類された患者は予後が良いのに対して、グループ IIの患者は予 後が悪ぐグループ IIIおよび IVの患者はその中間であると考えられる。
[0097] 表 4に示すように、グループ Πでは、 OSCCの 8検体のうち 6検体がグレード 2に分類 され (WHO分類)、少なくとも 4検体が高度浸潤性の表現型 (4C)であり、このグループ の患者の予後は悪かった（12ヶ月の間に 62%が再発し、 60%が死亡した）。グループ III 、 IV及び V中の殆どの OSCC検体はより低いグレード、より低い浸潤性の表現型（<グ レード 3)であり、また 12ヶ月以内の再発は 16%未満（2名 /13名）であった。グループ II I (6名）およびグループ IV (7名）に分類された多くの患者は喫煙（10/13名）及び/ または飲酒（7/13名）の習慣のある男性であった。一方、グループ V (5名）に分類さ れた OSCCの患者は、主に女性であり（4/5名）、飲酒および喫煙の習慣はなぐ発 癌年齢は、その他の患者のそれ (平均 61.9歳）より高齢 (77から 83歳）であり、 12ヶ月 以内の再発が見られない患者もグループ Vには存在した。表 4中、組織学的特徴の 表示は前記表 1と同様に、 OSCCは口腔扁平上皮癌、 Mild/Mod/S dysは、それぞ れ軽度異形成、中度異形成、重度異形成を示す。また、組織学的グレード 1から 3は 、 WHO組織学的分類（WHO Histological classification: Pindborg JJら Histological ty ping of cancer and precancer of the oral mucosa. In: International Histological Classi fication of tumor series / World Health Organization -2nd ed. New York: Springer; 1 997. p. 6-13)に従った。浸潤のモードについては Yamamoto- Kohamaの分類（Yamam oto Eら Mode or invasion, bleomycin sensitivity, and clinical course in squamous cell carcinoma of the oral cavity. Cancer 1983; 51 : 2175—80.) ίこ従った。ァノレコーノレゃタ ノ コの摂取につレヽては Yokoyamaらの方法 (Yokoyama Aら Cancer screening of upper aerodigestive tract in Japanese alcoholics with reference to drinking and smoking ha bits and aldehyde dehydrogenase-2 genotype. Int J Cancer 1996; 68: 313—6) ίこ従つ た。 1年以内の再発については、 Υは治療中、 Xは OSCCによる死亡を示す。
[0098] グループ Iに分類された殆どの LP組織ではクラスター aおよびクラスター bの遺伝子 の発現レベルが高かった。グループ IIに分類される OSCC検体は他のグループ分類 される OSCCより悪性化が進行した表現型を示したにもかかわらず、その遺伝子発現 プロファイルは、クラスター bの遺伝子を除けば、グループ Iに分類された前癌状態の LP検体のそれと大変良く類似しており、一方でグループ III、 IVおよび Vの OSCCの発 現プロファイルとは大きな差異を示した。
[0099] 予後の悪いグループ IIに分類される OSCC組織ではクラスター aの遺伝子の発現は 高レベルで維持されるが、クラスター bの遺伝子の発現は顕著に減少した。クラスター bの発現は、グループ III、グループ IV及びグループ Vに分類される OSCC組織では更 に減少した。クラスター bの遺伝子の発現減少は前癌状態から悪性化への推移の重 要な境界マーカーと考えられる。
[0100] OSCC組織ではクラスター c及びクラスター dの発現がグループ Vからグループ IIに 向うほど減少する力 クラスター aの遺伝子の発現は、逆にグループ Vからグループ II に向うほど増加する傾向にあった。各グループに分類された患者の予後は、逆にグ ループ Vからグループ IIに向うほど悪かったことから、クラスター aの遺伝子の高発現と クラスター c及びクラスター dの遺伝子の低発現とをあわせて、 OSCC患者の予後の悪 さの指標として、また、その逆、クラスター aの遺伝子の低発現とクラスター c及びクラス ター dの遺伝子の高発現の組み合わせは、予後の良さを示す指標となると考えられる 実施例 8
[0101] 更に、 LPと OSCCの判別精度を上げる目的で 4症例（表 1中、検体番号: 43〜46)を 追加して、定量的 RT-PCR分析を行った。 OSCCおよび LPの数検体から得られた総 R NAを使用し、前記非特許文献 4の方法にしたがって定量的 RT-PCR分析を行った。 手短には、 Superscript II (Invitrogen社製）を使用して、それぞれ 1 μ gの総 RNAを逆 転写して、一本鎖 cDNAを得た。マイクロアレイ分析において 3倍又はそれ以上の差 が見られる遺伝子に対して、 Primer Express software (Perkin Elmer社製）を用いて P CRのためのプライマー対をデザインした (表 2)。表中、本発明に係る遺伝子（遺伝子 IDで示す）、該遺伝子のためのプライマーの塩基配列及び配列番号を示した。なお 遺伝子 IDは後記表 5の遺伝子 IDに対応している。 PCRは Sybr Green Mastermix (App lied Biosystems社製）を用いて、 95°C、 15分間の初期ディネ一チヤ一、それに続いて 、 95°C、 30秒間と 60°C、 1分間の 40サイクルの反応を ABI Prism 5700 Sequence Detec tion System (Applied Biosystems社製）にて行った。それぞれの遺伝子の値は、内部 標準である 5Sリボゾームタンパク mRNAの発現レベルに対して標準化した。遺伝子の 発現量の差について統計的有意性を評価するために、 Student t_test (両側）による 検定を行った。
[0102] RT-PCR分析を OSCCの 27検体及び LPの 19検体（表 1中、検体番号 1〜27及び 28 〜46)を用いて行った結果、前記遺伝子マーカーの候補の中で、 33遺伝子が OSCC におレ、て、 30遺伝子が LPにおレ、てそれぞれ有意に（Pく 0.06)高発現してレ、ることが明 らかになつた。 口腔における解剖学的な部位が違うことの影響を最小限にするために 、ほとんどの LP組織を舌から切除したものを使用した力 さらに、 OSCCの 9組織およ び LPの 12組織（レヽずれも舌のみから得た）を用いて特異的な発現のレベルを確認し た。
[0103] その結果、 15個のマーカー遺伝子は OSCC組織に比し LP組織で過剰に発現して おり（表 5中、遺伝子 IDに LPと表示される）、一方 12個のマーカー遺伝子は OSCC組 織及び中程度から重度の異形成のいくつかの組織において発現が上昇していた (表 5中、 SCと表示される）。解剖学的な部位の違いにかかわりなぐこれらのうち 24のマ 一力一遺伝子の発現は、 0SCCと LPの間で有意に変ィ匕してレ、た。また、 IGJ (SC43)の 発現は、 OSCCと LPの間で有意な違いが見られな力つたが (p=0.98)、全ての過形成 (h yperplasia)の検体及び全ての軽度異形成 (mild dysplasia)の検体では強く抑制されて おり、該遺伝子の発現量により、異形成 (dysplasia)はいくつかのサブグループに分け ることが可能であると考えられるため、この遺伝子は注目された。 SC1はレ、くつかの OS CCで有意に発現増加しており、 SC1及び SC44はともに Mod dys 47，48を除く LPで有 意に抑制されており、該 2遺伝子も注目された。後記図 2はこれらの 27個のマーカー 遺伝子の発現パターンを示す。
実施例 9
[0104] OSCCの 27組織と LPの 19組織（表 1中、検体番号 1〜46)との分類をするために、前 記実施例 8の 27個のマーカー遺伝子の発現に基づき、組織検体の教師なしクラスタ 一解析を行った。クラスター解析は DNASIS Proソフトウェア（日立ソフトウェアェンジ二 ァリング社製）を用いて行った。教師なし階層クラスタリング (unsupervised hierarchical clustering)により検体間の関係及び遺伝子間の関係を解析した。
LP組織と OSCC組織とを明確に区別することを試みた。図 2に示すように、クラスタリ ングアルゴリズムの組合せ、 Pearson correlation (類似性指標)と Ward (クラスター統合 基準）によって、 27の OSCC組織及び 19の LP組織は 2つのクラスターに分けられた（ 図 2中、 I及び 11)。
殆どの LP組織は、クラスター Iに分類された。クラスター Iは更にサブクラスター la及 び lbに分けられた。サブクラスター laに分類されたものは、比較的よく分化した表現形 の LP組織であり、過形成及び軽度の異形成が含まれた。一方、サブクラスター lbは 0 SCC及び中程度〜重度異形成によって構成されていた。中程度の異形成である Mo dys 33は例外であった力 クラスター IIは事実上 OSCCによって構成されていた。前記 27個のマーカー遺伝子の発現に基づく階層クラスタリングが口腔異形成から口腔癌 への移行とよく一致する分類を提供することが示唆された。
実施例 10
[0105] 実施例 7において、クラスター aの遺伝子の高発現とクラスター c及びクラスター dの 遺伝子の低発現の組み合わせは、予後診断の有用な指標となることが示唆された。 そこで、 OSCCと LPを判別できるマーカー遺伝子セットを見出すために、フィッシャー の線形判別分析 (LDA)を用いて、教師付き分類を行った。
教師付き分類はフィッシャーの線形判別分析 (LDAと略称する)によって検査された 。一組の独立変数 (p )が与えられると、クラス間 (interclass)の距離と各クラス内におけ
ij
る変動の合計との比率（フィッシャーの比、式 4)が最大になるように、線形判別関数（ 式 1)の荷重ベクトル (w)が決定された。
式 l ; g=∑ w p Is形半 Ij另 lj関数 (linear discriminant fhnctioru
i J j ij
式 2 ; m =∑≡ g /N 判別関数値クラス平均
A i A i A
式 3 ; σ 2=∑ ≡ (g -m )2/N 判別関数値クラス内分散
A i A i A A
式 4 ; F= |m - m I2 /[ σ 2+ σ 2] フィッシャーの比（Fisher's Ratio)
A B A B
A,B: classes
i=l〜Ni: an index for sample (case)
j=l〜Nj: an index for variable (gene)
逐次増加法または遺伝的アルゴリズムによって、一組の独立変数 (一つの"モデル" )が選択された。該モデルの安定性は、リーブ'ワン 'アウト'クロスバリデーシヨン (leave -one-out cross validation)によって検査された。リーブ.ワン.アウトにおいて各検体は 一つ一つ次々にマスクされた。残りの検体 (NH検体)から LDAモデルが構築され、そ のときマスクされた検体のクラス力 該 LDAモデルから予測された。
27個のマーカーの遺伝子の表現は、 0SCC組織の 27検体と、過形成と異形成を含 む LP組織の 19検体との間で分析された (表 1)。このアプローチは、逐次増加法及び 遺伝的アルゴリズムを用いるパラメータ (すなわち遺伝子)選択を含んでいる。前者の 方法では、ヌルモデル力 スタートし、最も有効な変数が、それぞれのステップにお いて一つ前の一組の変数、すなわち暫定候補、にカ卩えられた。該モデルのスコアが 最高値に達したとき、増加ステップは停止された。フィッシャーの比率をスコアとして 用いた場合、 11個のパラメーターをもつモデルが、最良のモデルとして選択された。 該モデルの安定性は leave-one- out cross validationによって評価され (loo)、逐次増 加法又は遺伝的アルゴリズムによるモデルの適合性 (fit)と比較された (図 3)。その結 果、 11個のマーカー遺伝子により最適の予測が可能であり、このときの前記 fitが 97.8 %であり前記 looが 97.8%であった。図 4はそれぞれのマーカー遺伝子の発現及び LDA のスコアを示す。 OSCC16及び Mo dys 33を除くその他の検体セットは 11個のマーカ 一の遺伝子によって OSCCと LP間を明確に区別された。各検体の LDAのスコアは下 記の線形判別関数 (g)によって与えられる。ここで (LP1)などの記号は RT-PCRで測定 された遺伝子 LP1の発現量の対数値を意味し、算出された g値が正値であれば OSC Cに予測帰属され、負値であれば LPに予測帰属される。
式 5 :
g=-0.231(LPl) +0.223(LP4) - 0.0537(LP28) -0.0734(LP21) _0.892(LP12) _0.0617(L P29) -0.282(LP8) +0.0122(SC1) +0.0669(SC13) -0.0684(SC43)-0.0366(SC5) 実施例 11
[0106] 実施例 10と同じアプローチにより、前癌症状である LPの異形成の低いグレード (軽 度異形成より低い)と高いグレード（中度異形成より高い）並びに OSCCを判別できる マーカー遺伝子セットを見出すために、フィッシャーの線形判別分析 (LDA)を用いて 、教師付き分類を行った。その結果、 7個のマーカー遺伝子により LPにおける OSCC への癌化リスクの予測が可能であり、このときの識別正解率 (fit)は 97.8%であり looは 9 5.6%であった（図 5)。各検体の LDAのスコアは下記の線形判別関数 (g)によって与え られる。
式 6 :
g=0.372(LP5) -0.495(LP4) +0.576(LP19) _0.0380(LP28) +0.246(LP17) +0.464(LP27) -0.0889(SC43)
表 5中、 Aが付された 11個の遺伝子が、白板症 (LP)と口腔癌 (OSCC)を判別する遺 伝子 (predictor)であり、 Bが付された 7個の遺伝子力 異形成の低いグレード (軽度異 形成)と高レ、グレード（中度異形成）を判別する遺伝子 (predictor)である。
実施例 12
[0107] 実施例 1と同様の方法で準備した LP 5症例及び OSCC 47症例の新たな臨床検体（ 表 6)を用いて、実施例 2に記載の方法で RNAを抽出し、実施例 7に記載の方法に従 つて RT-PCR分析を行なレ、、実施例 10の式 5に当てはめて予測判定を行なった。そ の結果、 LP 5症例中 2症例、 OSCC 47症例中 42症例の予測に成功した。その識別 正解率は 84.6%であり、カイ 2乗検定では pく 0.1であった。
実施例 13
[0108] 実施例 1及び 12の症例をあわせた全 98症例で線形判別分析を実施し、次の LDA 式を得た。識別正解率は 95.9%であった。
式 7:
g=-0.466(LPl) +0.1900(LP4) -0.0233(LP28)-0.0632(LP21) -0.8376(LP12)-0.1391(L P29) -0.113(LP8) +0.015(SC1) +0.032(SC13) -0.0797(SC43) +0.0072(SC5)+ 0.6796 Fisher's Ratio=10.547、 Nmis=4
LP-mean score =_0.597
実施例 14
[0109] 次にリーブ 'ワン'アウトによって得られる判別式の変動より、該モデルの安定性を検 討した。順次 1症例づっ除き、その都度、線形判別分析を実施し得られる各係数の平 均と標準偏差を算出して得られた線形判別関数 (g)は以下のようになった (式 8)。各 遺伝子の係数は上記式 7の係数と近似しており、該モデルが安定してレ、ることが検証 された。
式 8:
g =-0.467 (LP1) +0.190 (LP4) -0.0233 (LP28) -0.0630 (LP21) -0.8362 (LP12) -0.13 97 (LP29) -0.114 (LP8) +0.01597 (SCI) +0.0325 (SC13) -0.0798 (SC43) +0.0072 (S C5) +0.680
Fisher's Ratio=10.57±0.37、 Nmis=4.07±0.32
LP-mean score =—0.598 ±0.012
尚、各遺伝子の項の係数と標準偏差 (相対標準偏差，％)は下記の通りであった。 LP1:-0.467±0.012(2.6)、 LP4:+0.190±0.0071(3.7)、 LP28： -0.0233 ±0.0022(9.4) 、 LP21:-0.0630±0.0035(5.6)、 LP12 :-0.8362±0.0082(9.8)、 LP29:—0.1397 ±0.008 6(6.2)、 LP8:_0.114±0.015(13.2)、 SCI :+0·01597±0·00068(4.3)、 SC13:+0.0325±0 .0018(5.5)、 SC43:-0.0798±0.0021(2.6)、 SC5:+0.0072±0.0013(18.1)、定数： +0.680 ±0.018
実施例 15 [0110] 実施例 14の式 8の中で特に優れた遺伝子、即ち相対標準偏差が小さい遺伝子（L Pl、 LP4、 LP28、 LP21、 LP12、 LP29、 SC1、 SC13、 SC43)だけで、どの程度満足でき る式ができるかを検討した。相対標準偏差が 10%以下の 9遺伝子を用いて、再度線 形判別分析を行なった結果は次式である。識別正解率は 94.9%であった。
式 9 :
g =-0.448(LPl) +0.156KLP4) - 0.0204(LP28) - 0.0537(LP21) _0.8615(LP12) -0.1455 (LP29) +0.016KSC1) +0.0374(SC13) -0.0749(SC43) +0.605
Fisher's Ratio=l 0.139 Nmis=5
LP-mean score =-0.570
実施例 16
[0111] 実施例 15より更に優れた遺伝子、即ち変動係数が 5%以下の 5遺伝子 (LP1、 LP4、 L P12、 SC1、 SC43)を用いて、線形判別分析を行なった結果は次式である。識別正解 率は 86.7%であった。
式 10 :
g=-0.380(LPl) +0.0749(LP4) - 0.9197(LP12) +0.0183(SC1) - 0.0551(SC43) +0.444 Fisher's Ratio=4.332 Nmis=13
LP-mean score =-0.318
[0112] [表 1]
表 1
Figure imgf000042_0001
2] 表 1つづき
Figure imgf000043_0001
[0114] [表 3]
表 2
Figure imgf000043_0002
[0115] 4] [S挲] [9Π0]
Figure imgf000044_0001
£8^Sl£/900Zdf/X3d 1囊/ ·00Ζ ΟΛλ 表 3
Figure imgf000045_0001
]
表 3の続き
Figure imgf000046_0001
]
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000047_0002
P
£8 Sl£/900Zdr/13d CM8T0/.00Z OAV 表 5
Figure imgf000048_0001
]
表 5の続き
Figure imgf000049_0001
0]
表 6
Figure imgf000050_0001
1] 表 6の続き
Figure imgf000051_0001
産業上の利用可能性
[0123] 本発明により、癌をステージやグレードに応じての正確かつ客観的な診断が可能と なり、その治療方針が大きく異なってもそれぞれに適した的確な治療が可能となる。 本発明では、多くの遺伝子について解析し、癌およびその前癌状態において特異的 な発現を示す遺伝子を見出し、癌の検査方法、検査薬、治療薬のスクリーニング方 法、治療用ベクター、治療方法などへの該遺伝子の利用が可能とされている。
本発明は、特には、口腔癌、食道癌、さらには扁平上皮癌に関して、その発生、進 行、そして経過に影響する遺伝子を解析することに成功し、的確に診断することを可 能としているので、当該解析技術を使用して、当該遺伝子発現の検査薬、発現調節 技術、遺伝子治療技術など、さらには抗癌技術を開発できる。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らか である。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従って それらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
配列表フリーテキスト
[0124] SEQ ID NO: 34, RT-PCR Primer for IGJ
SEQ ID NO: 35， RT-PCR Primer for IGJ
SEQ ID NO: 36， RT-PCR Primer for CXCL10
SEQ ID NO: 37， RT-PCR Primer for CXCL10 SEQ ID NO: 38， RT- -PCR Pri mer for RBP1
SEQ ID NO: 39, RT- -PCR Pri mer for RBP1
SEQ ID NO: 40, RT- -PCR Pri mer for PTPRZl
SEQ ID NO: 41, RT- -PCR Pri mer for PTPRZl
SEQ ID NO: 42, RT- -PCR Pri mer for FST317
SEQ ID NO: 43, RT- -PCR Pri mer for FST317
SEQ ID NO: 44, RT- -PCR Pri mer for PTHLH
SEQ ID NO: 45, RT- -PCR Pri mer for PTHLH
SEQ ID NO: 46, RT- -PCR Pr] mer for EPSTI1
SEQ ID NO: 47, RT- -PCR Pn mer for EPSTI1
SEQ ID NO: 48, RT- -PCR Pn mer for IFI44
SEQ ID NO: 49, RT- -PCR Pr】 mer for IFI44
SEQ ID NO: 50, RT- -PCR Pn mer for IFIT3
SEQ ID NO: 51, RT- -PCR Pr mer for IFIT3
SEQ ID NO: 52， RT- -PCR Pr mer for USP18
SEQ ID NO: 53， RT- -PCR Pr mer for USP18
SEQ ID NO: 54, RT- -PCR Pr mer for TGFBI
SEQ ID NO: 55, RT- -PCR Pr mer for TGFBI
SEQ ID NO: 56, RT- -PCR Pr mer for CA2
SEQ ID NO: 57, RT- -PCR Pr mer for CA2
SEQ ID NO: 58， RT- -PCR Pr mer for LAMC2
SEQ ID NO: 59， RT- -PCR Pr mer for LAMC2
SEQ ID NO: 60, RT- -PCR Pr mer for BST2
SEQ ID NO: 61, RT- -PCR Pr imer for BST2
SEQ ID NO: 62, RT- -PCR Pr [mer for GP
SEQ ID NO: 63， RT- -PCR Pr imer for MGP
SEQ ID NO: 64, RT- -PCR Pr imer for DPT
SEQ ID NO: 65, RT- -PCR Pr imer for DPT SEQ ID NO: 66, RT-PCR Pri mer for MFAP4
SEQ ID NO: 67, RT- -PCR Pri mer for MFAP4
SEQ ID NO: 68， RT- -PCR Pri mer for PRELP
SEQ ID NO: 69， RT- -PCR Pri mer for PRELP
SEQ ID NO: 70, RT- -PCR Pri mer for FXYD6
SEQ ID NO: 71， RT- -PCR Pri mer for FXYD6
SEQ ID NO: 72, RT- -PCR Pri mer for FXYD1
SEQ ID NO: 73, RT- -PCR Pri mer for FXYD1
SEQ ID NO: 74, RT- -PCR Pri mer for SLIT3
SEQ ID NO: 75， RT- -PCR Pri mer for SLIT3
SEQ ID NO: 76, RT- -PCR Pri mer for CKMT2
SEQ ID NO: 77， RT- -PCR Pn mer for CKMT2
SEQ ID NO: 78, RT- -PCR Pn mer for DPYSL3
SEQ ID NO: 79, RT- -PCR Pr】 mer for DPYSL3
SEQ ID NO: 80， RT- -PCR Pr] mer for NR2F2
SEQ ID NO: 81, RT- -PCR Pr mer for NR2F2
SEQ ID NO: 82， RT- -PCR Pr mer for CRYAB
SEQ ID NO: 83， RT- -PCR Pr mer for CRYAB
SEQ ID NO: 84, RT- -PCR Pr mer for MYOM2
SEQ ID NO: 85， RT- -PCR Pr mer for MYO 2
SEQ ID NO: 86， RT- -PCR Pr mer for FOSB
SEQ ID NO: 87, RT- -PCR Pr mer for FOSB
SEQ ID NO: 88， RT- -PCR Pr mer for CLU
SEQ ID NO: 89， RT- -PCR Pr mer for CLU
SEQ ID NO: 90， RT- -PCR Pr imer for CRIP1
SEQ ID NO: 91， RT- -PCR Pr [mer for CRIP1
SEQ ID NO: 92, RT- -PCR Pr imer for KRT1
SEQ ID NO: 93， RT- -PCR Pr imer for KRT1 SEQ ID NO: 94, RT. PCR Primer for KRT13
SEQ ID NO: 95， RT. PCR Primer for KRT13
SEQ ID NO: 96， RT. PCR Primer for TG3
SEQ ID NO: 97, RT. PCR Primer for TG3
SEQ ID NO: 98， RT. PCR Primer for ClorflO
SEQ ID NO: 99， RT. PCR Primer for ClorflO

Claims

請求の範囲 [1] 以下の (1)または (2)に記載の少なくとも 1つの遺伝子の発現量の変化を調べる工程を 含む、癌の検査方法。 (1)配列番号：:!〜 33のいずれかに記載の塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子(2)配列番号：:!〜 33のいずれかに記載の塩基配列からなる DNAにストリンジヱントな 条件下でハイブリダィズする DNAを cDNAとする遺伝子 [2] 請求項 1に記載の方法であって、以下の (1)または (2)に記載の少なくとも 1つの遺伝 子の発現量の変化を調べる工程を含む方法。
(1)酉己歹 IJ番号： 1、 2、 5、 13、 15、 19、 21、 24、 30、 31及び 32に記載の塩基酉己歹 IJ力 らなる群から選択された塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子
(2)酉己歹 IJ番号： 1、 2、 5、 13、 15、 19、 21、 24、 30、 31及び 32に記載の塩基酉己歹力 らなる群から選択された塩基配列からなる DNAにストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズする DNAを cDNAとする遺伝子
[3] 請求項 1に記載の方法であって、少なくとも以下の (1)または (2)に記載の遺伝子の発 現量の変化を調べる工程を含む方法。
(1)配列番号： 1、 2、 15、 19及び 21に記載の塩基配列からなる群から選択された塩 基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子
(2)配列番号： 1、 2、 15、 19及び 21に記載の塩基配列からなる群から選択された塩 基配列からなる DNAにストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DNAを cDNAと する遺伝子
[4] 請求項 1に記載の方法であって、少なくとも以下の (1)または (2)に記載の遺伝子の発 現量の変化を調べる工程を含む方法。
(1)配列番号： 1、 16、 18、 19、 27、 32及び 33に記載の塩基配列からなる群から選 択された塩基配列を含む DNAを cDNAとする遺伝子
(2)配列番号： 1、 16、 18、 19、 27、 32及び 33に記載の塩基配列からなる群から選 択された塩基配列からなる DNAにストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA を cDNAとする遺伝子
[5] 請求項 1に記載の方法であって、以下の工程； (a)被検者の RNA試料に含まれる請求項 1に記載の遺伝子の mRNAの量を測定する 工程、
(b)測定された mRNA量を解析する工程、
を含む方法。
[6] 請求項 1に記載の方法であって、以下の工程；
(a)被検者の cDNA試料に含まれる請求項 1に記載の遺伝子の cDNAの量を測定する 工程、
(b)測定された cDNA量を解析する工程、
を含む方法。
[7] 請求項 1に記載の方法であって、以下の工程；
(a)被検者のポリペプチド試料に含まれる請求項 1に記載の遺伝子にコードされるポリ ペプチドの量を測定する工程、
(b)測定されたポリペプチドの量を解析する工程、
を含む方法。
[8] 請求項 1に記載の方法であって、以下、
(a) G)被検者から調製された cRNAまたは cDNA試料と (ii)請求項 1に記載の DNAとハイ ブリダィズするヌクレオチドプローブが固定された基板とを接触させる工程、
(b)該 cRNAまたは cDNA試料と該プローブとのハイブリダィズの強度を検出することに より、請求項 1に記載の遺伝子の発現量を測定する工程、
(c)測定された遺伝子の発現量を解析する工程、
を含む方法。
[9] 請求項 1に記載の方法であって、以下、
(a) G)被検者から調製された cRNAまたは cDNA試料と (ii)請求項 1に記載の DNAの完 全長または一部を増幅するヌクレオチドプライマーを用いて、（i)の cRNAまたは cDNA の完全長または一部を増幅する工程、
(b)増幅された該 cRNAまたは cDNA試料を検出することにより、請求項 1に記載の遺 伝子の発現量を測定する工程、
(c)測定された遺伝子の発現量を解析する工程、 を含む方法。
[10] 解析する工程において多変量解析を用いる請求項 5〜9に記載の方法。
[11] 多変量解析が、クラスター分析又は、線形判別分析である請求項 10に記載の方法。
[12] 請求項 1〜4に記載の DNAにハイブリダィズするヌクレオチドプローブを含む、癌の検 查薬。
[13] 請求項 1〜4に記載の DNAの完全長または一部を増幅するヌクレオチドプライマー含 む、癌の検查薬。
[14] 請求項 1〜4に記載の遺伝子にコードされるポリペプチドと結合する抗体を含む、癌 の検査薬。
[15] 被験試料における抗癌活性の有無を評価する方法であって、
(a)癌細胞に被験試料を接触させ、該細胞から cRNAまたは cDNA試料を調製するェ 程、
(b) (i)調製された cRNAまたは cDNA試料と (ii)請求項 1に記載の DNAとハイブリダィズ するヌクレオチドプローブが固定された基板とを接触させる工程、
(c)該 cRNAまたは cDNA試料と該プローブとのハイブリダィズの強度を検出することに より、該 cRNAまたは cDNA試料に含まれる、請求項 1に記載の遺伝子に対応する cRN Aまたは cDNAの量を測定する工程、
を含む方法。
[16] 抗癌活性を有する試料のスクリーニング方法であって、
(a)請求項 15に記載の評価方法により、複数の被験試料における、抗癌活性の有無 を評価する工程、
(b)複数の被験試料から、抗癌活性を有すると評価された試料を選択する工程、 を含む方法。
[17] 請求項 16に記載の工程に、さらに抗癌活性を有すると評価された試料と医薬上許容 される担体とを混合する工程を含む、抗癌活性を有する医薬組成物の製造方法。
[18] 癌が口腔癌又は食道癌である、請求項 1から 17のいずれかに記載の方法。
[19] 口腔癌又は食道癌が扁平上皮癌である、請求項 18に記載の方法。
[20] 請求項：!〜 4に記載のいずれかの遺伝子のプロモーター領域の 3 '側に細胞障害性 タンパク質をコードする DNAが機能的に結合した DNA。
[21] 請求項 20に記載の DNAが揷入されたベクター。
[22] 遺伝子治療用である、請求項 21に記載のベクター。
[23] 請求項 21または 22に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
[24] 請求項 22に記載のベクターを投与する工程を含む、癌の治療方法。
[25] 請求項 23に記載の形質転換細胞を投与する工程を含む、癌の治療方法。
[26] 癌が口腔癌又は食道癌である、請求項 24または 25のいずれかに記載の治療方法。
[27] 口腔癌又は食道癌が扁平上皮癌である、請求項 26に記載の治療方法。
[28] 請求項 1〜4に記載の遺伝子にコードされるポリペプチドを発現するベクターであつ て、癌細胞において高発現する遺伝子のプロモーター領域の 3'側に該ポリペプチド のコーディング領域が機能的に結合したポリヌクレオチドが挿入されたベクター。
[29] 遺伝子治療用である、請求項 28に記載のベクター。
[30] 請求項 28または 29に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
[31] 請求項 29に記載のベクターを投与する工程を含む、癌の治療方法。
[32] 請求項 30に記載の形質転換細胞を投与する工程を含む、癌の治療方法。
[33] 癌が口腔癌又は食道癌である、請求項 31または 32のいずれかに記載の治療方法。
[34] 口腔癌又は食道癌が扁平上皮癌である、請求項 33に記載の治療方法。
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