WO2007006830A2 - Método de análisis de residuos de plaguicidas en muestras vegetales - Google Patents

Método de análisis de residuos de plaguicidas en muestras vegetales Download PDF

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Definitions

  • GC Gas chromatography
  • LV Podhomiak, JF, Negron, FD Griffith Jr. J. Assoc. Off Anal. Chem. Int. 2001, 84, 873-890; E.Ueno, H. Oshima, I. Saito, H. Matsumoto, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int. 2003, 86, 1241-1251) and more recently coupled to The mass spectrometry (E. Ueno, H. Oshima, I. Saito, H. Matsumoto, Y. Yoshimura, H. Nakazawa J. Assoc. Off Anal.
  • AOAC Official Method 985.22 that involves the extraction with acetone, followed by partition with petroleum ether and dichloromethane, the subsequent concentration of the extract obtained and its analysis by chromatography of gases with different detectors (GC-ECD, GC-NPD and GC-MS) (Official Methods of Analysis, 2000 17th Ed., AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD)
  • Solvents other than acetone have been used for the extraction of pesticides from the matrix, such as " acetonitrile (SM Lee, ML Papathakis, CF. Hsiao-Ming, JE Carr, J. Anal. Chem., 1991, 339, 376- 383; W. Liao, T. Joe, WG Cusick, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 1991, 74, 554-565) or ethyl acetate (DM Holstege, DL Scharberg, ER Tor, LC Hart, FD Galey, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 1994, 77, 1263-1274; AR
  • MRLs maximum residue limits
  • European legislation European Council Directives 76/895 EEC, 86/363 / EEC and 90/642 / EEC
  • the programmed temperature injector has also been used by filling the glass tube with carbofrit (M. Gamón, C. Lleó, A. Ten, F. Mochol ⁇ , J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 2001, 84 (4), 1209-1216).
  • carbofrit M. Gamón, C. Lleó, A. Ten, F. Mochol ⁇ , J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 2001, 84 (4), 1209-1216.
  • the initial temperature of the injector must be kept at the boiling temperature of the solvent while the flow division is open. After a while, the flow division is closed and the injector is heated so that the analytes pass to the gas chromatograph column.
  • the TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption) interface (Spanish Patent No. 0 ES 2 152-153; U.S. Patent 6,402,947 B1) or the improved system (Spanish Patent No. P200501284) is based on a PTV injector, which has been widely modified, and a series of opening and closing valves as well as a six-way valve.
  • the modifications affect the pneumatic system, the introduction of the sample, the elimination of the solvent and the mode of operation (M. Pérez, J. Alario, A. Vázquez, J.
  • the TOTAD interface has proven effective for direct coupling of liquid chromatography and gas chromatography, when working both in normal phase and in reverse phase in liquid chromatography. It can also be used for the introduction of large volumes of sample in gas chromatography.
  • the TOTAD interface has been used in the analysis of pesticide residues by direct coupling of liquid chromatography and gas chromatography, in water (M. Pérez, J. Alario, A. Vázquez, J. Véen, J. Microcol. Sep. 1999, 11 (8), 582-589; M. Pérez, J. Alario, A. Vázquez, J. Véen, Anal. Chem. 2000, 72, 846-852) and in olive oil (R.
  • the method uses the interface device for the direct coupling of liquid chromatography and gas chromatography (Spanish patent n 0 ES 2 152-153; patent US 6,402.947 B1, licensed to Ia company KONIK-Tech, Sant Cugat of the Valles, Barcelona ); or the improved system (Spanish Patent No. P200501284), called the TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption) interface in the scientific literature, for the injection of large volumes in the gas chromatograph.
  • the gas chromatograph is equipped with the TOTAD interface, which is fully automatic.
  • the TOTAD interface joins the injection valve and allows the introduction of variable volumes of sample pushed by a solvent by means of a liquid chromatography pump.
  • the pesticides are extracted from the vegetable sample, previously crushed, using small amounts of organic solvent.
  • the extract obtained, once filtered, is introduced into the injection valve that is connected directly to the six-way valve of the TOTAD interface through a tube.
  • a pump attached to the injection valve automatically transfers the volume of extract from the injection valve, through the TOTAD interface, to the gas chromatography column.
  • the solvents used can be both polar and non-polar solvents.
  • the flow rate at which the transfer to the gas chromatograph occurs can vary.
  • the adsorbent placed in the inner tube of the interface retains the pesticides and the solvent is removed by the gas stream drawn through the tube or capillary connected to the opposite end of the interface.
  • the analysis method allows injecting different volumes of extract, which modifies the opening and closing times of the valves that make up the interface.
  • the method of analysis object of the invention is based on the injection of extract volumes higher than usual in gas chromatography, for which the interface device is used for direct coupling of liquid chromatography and gas chromatography (Spanish patent n 0 ES 2 152-153; patent US 6,402.947 B1, licensed to company KONIK Ia-Tech, Sant Cugat of the Valles, Barcelona) or the improved system (Spanish patent No. P200501284) called TOTAD interface (Through Oven Transfer Adsorption Desorption) in the scientific literature.
  • the method except for the extraction stage, is fully automatic.
  • the opening and closing valves and the six-way valve of the TOTAD interface are solenoid valves that are controlled from the computer software.
  • the method consists of two clearly differentiated phases: A first phase in which the pesticides are extracted from the sample and a second phase that constitutes the chromatographic analysis of the pesticides extracted.
  • Second Phase Chromatographic analysis of pesticides in the extract obtained.
  • the inner tube of the TOTAD interface is filled with an adsorbent material, of a certain length, with a system that prevents the adsorbent from moving.
  • the adsorbent material can be any material that retains the pesticides and allows the passage of the carrier gas and the liquid to be passed through.
  • the pump that pushes the solvent is connected to the injection valve and this to the six-way valve by means of a tube.
  • the six-way valve in turn, is connected by another tube inserted in the inner tube of the TOTAD interface, so that a length greater than the end of the capillary column of gas chromatography that has been introduced by this is introduced same extreme.
  • the TOTAD interface Before starting the injection, the TOTAD interface is stabilized at the temperature at which the injection is to be carried out, which must be adequate so that the pesticides are retained in the adsorbent that fills the inner tube of The interface and to achieve solvent removal.
  • the gas circulates through said tube entering the two gas inlets of the interface.
  • the valve EV1 of the interface is closed and the EV2 open (EV1 and EV2 corresponds to the nomenclature used in the Spanish patent No. ES 2 152-153).
  • the helium flow inlet is also closed by the inlet that passes through the adsorbent, and the flow or pressure is modified, if necessary, by the other inlet to the appropriate value, so that the gas that now enters only through the inlet located in the external part of the interface, it crosses the adsorbent and leaves only by the gas chromatography column.
  • the injector is rapidly heated to the temperature necessary to produce the thermal desorption of the pesticides, which are carried by the helium current to the chromatographic column, where the chromatographic analysis takes place under the previously programmed conditions.
  • the method object of the invention can be used for the multi-residue analysis of pesticides in a single analysis.
  • the method object of the invention allows the analysis of pesticide residues in vegetable samples without further treatment of the sample than the extraction.
  • the method object of the invention does not require the use of high amounts of organic solvents detrimental to the health of the analyst and to the environment.
  • the method object of the invention only needs manipulation of the sample by the analyst in the extraction stage, so that it reduces the errors and contamination caused in said manipulation.
  • the method object of the invention includes an extraction stage that is fast and an analysis stage that is fully automatic, so it is especially suitable for the analysis of pesticide residues in routine controls.
  • the method object of the invention allows the injection in the chromatographic system of volumes of extract greater than those usually injected in gas chromatography, which can be variable, which allows eliminating the stage of concentration of the extract resulting in an increase in Ia sensitivity and an improvement in detection limits.
  • the method object of the invention allows the inner tube of the TOTAD interface filled with the adsorbent material to be used numerous times, without having to be replaced.
  • the method object of the invention allows different detection systems to be used in gas chromatography.
  • the total time of the analysis of the method object of the invention is significantly less than the time required when the conventional method is used.
  • Chromatogram corresponding to the analysis of a tomato sample that was fortified at 0.05 mg / kg with each of the following pesticides: dimethoate, diazinon, fenitrotion, malathion, fenthion, chlorpyrifos, chlorfenvinfos, methidathion, tetrachlorvinfos.
  • the extraction conditions as well as the conditions in which the chromatogram has been obtained are those indicated in the embodiment of the invention.
  • the volume of extract injected was 50 ⁇ l_ and the solvent flow to which the transfer of 0.1 mL / min is performed.
  • the time indicated on the gas chromatogram corresponds only to the analysis time of the gas chromatograph.
  • the identification of the peaks is the following: 1) dimethoate 2) diazinon 3) fenitrotion 4) malathion 5) fenthion 6) chlorpyrifos 7) chlorfenvinfos 8) methidathion and 9) tetrachlorvinphs.
  • the TOTAD interface is placed horizontally on the left side of the gas chromatograph.
  • the EZchrom software Konik, Sant Cugat del Valles, Barcelona) allows to manage the interface from the computer and obtain data from the gas chromatograph.
  • the gas chromatography column used is a fused silica capillary column 30 m long and 0.32 mm internal diameter filled with 5% phenylmethylsilicone with a thickness of 0.25 ⁇ m
  • a sample of tomato bought in the market was crushed and homogenized. From this crushed sample 2.5 g were taken and fortified, adding 125 • £! _ Of a solution of pesticides in methanol at 1 mg / L thus obtaining a sample fortified with 0.05 mg / Kg of tomato from each of the following pesticides: dimethoate: , diazinon, fenitrotion, malathion, fenthion, chlorpyrifos, chlorfenvinfos, methidathion, tetrachlorvinfos, obtained from
  • the inner tube of the TOTAD interface of 2 mm internal diameter
  • Tenax TA 80-100 mesh (Chrompack, Mieddelburg, Holland) held, by both ends, with glass wool, to avoid the displacement of the Tenax.
  • a filling time was conditioned with a helium flow of 500 mL / min traversing the adsorbent and was heated from 50 0 C to 350 0 C to 50 ° C / 10 min and maintained for 60 min at the final temperature.
  • the conditions of the chromatographic analysis are the following: the column is maintained at 40 0 C for 1 min, then the temperature is increased to 170 0 C at 20 ° C / min, then at 3 ° C / min up to 210 0 C and 5 ° C / min up to 230 0 C maintaining this final temperature for 5 minutes.
  • the temperature of the Nitrogen-Phosphorus detector is maintained at 250 0 C.
  • the oven temperature of the gas chromatograph is maintained at 40 0 C.

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Abstract

El objeto de la invención es un método de análisis de residuos de plaguicidas en vegetales. El método utiliza el dispositivo de interfase para el acoplamiento directo de cromatografía de líquidos y cromatografía de gases, denominado en la literatura científica interfase TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption). El método sólo requiere una etapa de extracción previa al análisis cromatográfico. Los plaguicidas son extraídos de la muestra con un disolvente orgánico. Volúmenes de extracto muy superiores a los habituales se inyectan directamente en el cromatógrafo de gases no siendo necesaria ninguna etapa previa de limpieza ni de concentración del extracto. La interfase TOTAD permite la inyección de volúmenes de extracto muy superiores a los que normalmente se inyectan en el cromatógrafo de gases.

Description

MÉTODO DE ANÁLISIS DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS EN MUESTRAS VEGETALES
D E S C R I P C I Ó N
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Química Analítica. Tecnología de Alimentos.
ANTECEDENTES
El control de enfermedades y plagas en el cultivo de vegetales hace necesario el empleo de fitosanitarios que pueden provocar residuos en los mismos. Estos plaguicidas, sobre todo en el caso de los liposolubles, pueden concentrarse en él cuerpo humano por el consumo regular de vegetales. Es necesario por tanto disponer de métodos rápidos, sensibles y fiables que permitan controlar dichos residuos.
La cromatografía de gases (GC) ha sido Ia técnica analítica más frecuentemente usada en Ia determinación de residuos de plaguicidas en vegetales con diferentes detectores selectivos (L.V. Podhomiak, J. F., Negron, F.D. Griffith Jr., J. Assoc. Off Anal. Chem. Int. 2001, 84, 873-890; E.Ueno, H. Oshima, I. Saito, H. Matsumoto, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int. 2003, 86, 1241-1251 ) y más recientemente acoplada a Ia espectrometría de masas (E. Ueno, H. Oshima, I. Saito, H. Matsumoto, Y. Yoshimura, H. Nakazawa J. Assoc. Off Anal. Chem. Int. 2004, 87, 1003-1015; J. L. Martínez-Vidal, FJ. Arrebola, M. Mateu-Sánchez, J. Chromatogr. A, 2002, 959, 203-213). El empleo de Ia GC requiere que el analito sea suficientemente volátil. En Ia determinación de plaguicidas menos volátiles o termolábiles, como los carbamatos, se han utilizado métodos basados en Ia cromatografía de líquidos (LC) (C. Sánchez-Brunete, B. Albero, J. L. Tadeo, J. Food Proteo. 2004, 67, 2565-2569) y en el acoplamiento de cromatografía de líquidos y espectrometría de masas (LC-MS) (D. Ortelli, P. Edder, C. Corvi, Ana. Chim. Acta, 2004, 520, 33-45; C. Jansson, T. Pihlstrδm, B.G. Ósterdahl, K.E. Markides, J. Chromatogr. A, 2004, 1023, 93-104)
Habitualmente, el análisis de residuos de plaguicidas se lleva a cabo según el método oficial (AOAC Official Method 985.22) que implica Ia extracción con acetona, seguida de partición con éter de petróleo y diclorometano, Ia posterior concentración del extracto obtenido y su análisis mediante cromatografía de gases con diferentes detectores (GC-ECD, GC- NPD y GC-MS) (Official Methods of Analysis, 2000 17th Ed., AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD)
Para Ia extracción de los plaguicidas de Ia matriz se han utilizado disolventes distintos a Ia acetona, como" acetonitrilo (S. M. Lee, M. L. Papathakis, CF. Hsiao-Ming, J. E. Carr, J. Anal. Chem., 1991 , 339, 376-383; W. Liao, T. Joe, W.G. Cusick, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 1991 , 74, 554- 565) o acetato de etilo (D.M. Holstege, D.L. Scharberg, E.R. Tor, L.C. Hart, F.D. Galey, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 1994, 77, 1263-1274; A.R.
Fernández Alba, A. Valverde, A. Agüera, M. Contreras, J. Chromatogr. A, 1994, 686, 263-274). El empleo de disolventes parcialmente miscibles con el agua hace necesario llevar a cabo una etapa de partición para eliminar el contenido de agua procedente de Ia matriz vegetal del extracto. Se han empleado diferentes disolventes como éter de petróleo o diclorometano, así como mezclas de ellos como acetato de etilo-ciclohexano (A. Sannino, M. Bandini, L. Bonzoni, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int. 2003, 86(1), 101-108; L.V. Podhomiak, J. F. Negron, F.D. Griffith Jr., J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 2001 , 84(3), 873-890; W. Specht, S. PeIz, W. Gilsbach, J. Anal. Chem., 1995, 353, 183-190) o diclorometano-éter de petróleo (M. Gamón, C. Lleo,
A. Ten, F. Mocholí, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 2001, 84(4), 1209-1216). Frecuentemente es necesario realizar una limpieza del extracto previo al análisis cromatográfico. La etapa de limpieza puede llevarse a cabo por cromatografía de adsorción utilizando florisil, alúmina o gel de sílice (A. Sannino, M. Bandini, L. Bolzoni, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 2003, 86, 101-108), cromatografía de permeación de gel (GPC) (A. Sannino, M.
Bandini, L. Bolzoni, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 1999, 82, 1229-1238) y extracción en fase sólida (SPE) (L.V. Podhomiak, J. F. Negron, F.D. Griffith Jr., J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 2001 , 84(3), 873-890)
El análisis de los grupos de compuestos considerados presenta una serie de inconvenientes que afectan fundamentalmente a las etapas de extracción, partición y limpieza del extracto. En primer lugar, el tiempo requerido para la preparación de Ia muestra es alto, Io que constituye una desventaja importante en determinados casos. Además, es necesario emplear volúmenes relativamente elevados de disolventes orgánicos tóxicos, con el consiguiente riesgo para Ia salud del analista y los efectos nocivos que supone en relación con el impacto medioambiental. Por otra parte, durante todo el proceso se pueden introducir impurezas, procedentes del disolvente o de los materiales empleados, que se concentran posteriormente junto a los analitos y dan lugar a interferencias y errores analíticos y, en último término, a análisis deficientes en cuanto a su selectividad y sensibilidad.
Existen varias alternativas al uso de grandes cantidades de disolventes orgánicos, como Ia extracción con fluidos supercríticos (SFE) en
Ia que las condiciones de extracción pueden ser seleccionadas para conseguir una extracción más selectiva que no requiera realizar Ia etapa de limpieza antes del análisis cromatográfico (S. J. Lehotay, J. Chromatogr. A,
1997, 785, 289-312; A. Valverde-García, A.R. Fernández Alba, A. Agüera, M. Contreras, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 1995, 78, 867-873) o como Ia extracción por dispersión de Ia matriz en fase sólida (E. Viana, J. C Molto, G. Font J. Chromatogr. A, 1996, 754, 437-444; M. Anastassiades, SJ. Lehotay, D. Stajnbaher, FJ. Schenk, J. Assoc. OffAnal. Chem. Int., 2003, 86(2), 412- 431) o Ia extracción con "stir bar sorptive" (P. Sandra; B. Tienpont, F. David., J. Cromatogr. A, 2003, 1000, 299-309)
El establecimiento de límites máximos de residuos (LMRs) cada vez menores en Ia legislación Europea (European Council Directives 76/895 EEC, 86/363/EEC y 90/642/EEC), ha hecho necesario una mejora en los límites de detección de los métodos multirresiduo utilizados. El empleo de Ia técnica de inyección de grandes volúmenes es una alternativa para poder alcanzar estos límites de detección cada vez más exigentes. Se han desarrollado diversas técnicas que permiten Ia inyección de hasta varios cientos de microlitros en cromatografía de gases al tiempo que se mantienen unas buenas características cromatográficas (FJ. López, J. Beltran, M. Forcada and F. Hernández., J. Chromatogr. A, 1998, 823, 25- 33). Utilizando un inyector convencional con/sin división de flujo se han inyectado 10 μL de muestra en el análisis de plaguicidas en vegetales (A. Agüera, M. Contreras, J. Crespo, A.R. Fernández-Alba, Analyst, 2002, 127(3), 347-354; A. Agüera, L. Piedra, M. D. Hernando, A.R. Fernández
Alba, M. Contreras, Analyst, 2000, 125(8), 1397-1402). También se ha usado el inyector de temperatura programada (PTV) rellenando el tubo de vidrio del mismo con carbofrit (M. Gamón, C. Lleó, A. Ten, F. Mocholí, J. Assoc. Off Anal. Chem. Int., 2001, 84(4), 1209-1216). En este caso, Ia temperatura inicial del inyector debe mantenerse a Ia temperatura de ebullición del disolvente mientras Ia división de flujo se encuentre abierta. Al cabo de un tiempo, se cierra Ia división de flujo y se calienta el inyector para que los analitos pasen a Ia columna del cromatógrafo de gases. En esta técnica el disolvente se elimina en forma evaporativa por Ia vía de división de flujo, por Io que esta forma de actuar del PTV solamente es recomendada para Ia determinación de solutos de alto punto de ebullición porque los solutos más volátiles se pierden por evaporación junto con el disolvente. Se ha descrito una modificación a este modo de operar con el PTV, en Ia cual Ia columna de cromatografía de gases se desconecta del cuerpo del inyector antes de introducir Ia muestra, y el disolvente es eliminado, tanto en modo evaporativo como no evaporativo por Ia parte posterior del inyector (J. Villén, FJ. Señorans, M. Herraiz, G. Reglero, J. Tabera; J. Chromatogr. ScL, 1992, 30, 261-266)
La interfase TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption) (patente española n0 ES 2 152-153; patente en EEUU 6,402.947 B1 ) o bien el sistema mejorado (patente española n° P200501284) se basa en un inyector PTV, que ha sido ampliamente modificado, y una serie de válvulas de apertura y cierre así como una válvula de seis vías. Las modificaciones afectan al sistema neumático, Ia introducción de Ia muestra, Ia eliminación del disolvente y el modo de operación (M. Pérez, J. Alario, A. Vázquez, J.
Villén, J. Microcol Sep., 1999, 11(8), 582-589). La interfase TOTAD ha demostrado ser eficaz para el acoplamiento directo de cromatografía de líquidos y cromatografía de gases, cuando se trabaja tanto en fase normal como en fase inversa en cromatografía de líquidos. Así mismo puede ser utilizada para Ia introducción de grandes volúmenes de muestra en cromatografía de gases. La interfase TOTAD ha sido utilizada en el análisis de residuos de plaguicidas por acoplamiento directo de cromatografía de líquidos y cromatografía de gases, en agua (M. Pérez, J. Alario, A. Vázquez, J. Villén, J. Microcol. Sep. 1999, 11(8), 582-589; M. Pérez, J. Alario, A. Vázquez, J. Villén, Anal. Chem. 2000, 72, 846-852) y en aceite de oliva (R.
Sánchez, A. Vázquez, J. Viüén, J. C. Andini, J. Chromatogr. A, 2004, 1029, 167-172; R. Sánchez, A. Vázquez, D. Riquelme y J. Villén, J. Agrie. Food Chem., 2003, 51 , 6098-6102) y en el análisis de residuos de plaguicidas en agua por introducción de grandes volúmenes de muestra (J. Alario, M. Pérez, A. Vázquez, J. Villén, J. Chromatogr. ScL, 2001 , 39, 65-69). BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El método emplea el dispositivo de interfase para el acoplamiento directo de cromatografía de líquidos y cromatografía de gases (patente española n0 ES 2 152-153; patente en EEUU 6,402.947 B1 , licenciada a Ia empresa KONIK-Tech, Sant Cugat del Valles, Barcelona); o bien el sistema mejorado (patente española n° P200501284), denominada interfase TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption) en Ia literatura científica, para Ia inyección de grandes volúmenes en el cromatógrafo de gases. El cromatógrafo de gases está equipado con Ia interfase TOTAD, que es totalmente automática. La interfase TOTAD se une a Ia válvula de inyección y permite introducir volúmenes variables de muestra empujados por un disolvente mediante una bomba de cromatografía de líquidos.
Los plaguicidas son extraídos de Ia muestra vegetal, previamente triturada, empleando pequeñas cantidades de disolvente orgánico. El extracto obtenido, una vez filtrado, se introduce en Ia válvula de inyección que se conecta directamente a Ia válvula de seis vías de Ia interfase TOTAD mediante un tubo. Una bomba unida a Ia válvula de inyección transfiere automáticamente el volumen de extracto desde Ia válvula de inyección, mediante Ia interfase TOTAD, a Ia columna de cromatografía de gases. Los disolventes utilizados pueden ser tanto disolventes polares como apolares. El caudal al cual se produce Ia transferencia al cromatógrafo de gases puede variar. El adsorbente colocado en el tubo interior de Ia interfase retiene a los plaguicidas y el disolvente es eliminado arrastrado por Ia corriente de gas a través del tubo o capilar conectado al extremo opuesto de Ia interfase. Durante Ia etapa de adsorción de los analitos se introducen flujos de gas controlados por ambas entradas de gas de Ia interfase TOTAD. Una vez eliminado el disolvente, los analitos se desorben térmicamente. Durante Ia etapa de desorción de los analitos el flujo controlado de gas entra exclusivamente por Ia entrada convencional de gas en un inyector con temperatura programada (PTV) que arrastra a los analitos desorbidos conduciéndoles a Ia columna del cromatógrafo de gases donde tiene lugar el análisis cromatográfico. El control de los tiempos de apertura y cierre de las diferentes válvulas de abrir y cerrar y de Ia válvula de seis vías, que forman parte de Ia interfase TOTAD, así como de los flujos de gas por ambas entradas de gas de Ia interfase TOTAD, es fundamental para el correcto funcionamiento del método de análisis.
El método de análisis permite inyectar diferentes volúmenes de extracto Io que modifica los tiempos de apertura y cierre de las válvulas que componen Ia interfase.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El método de análisis objeto de Ia invención se basa en la inyección de volúmenes de extracto superiores a los habituales en cromatografía de gases, para Io que utiliza el dispositivo de interfase para el acoplamiento directo de cromatografía de líquidos y cromatografía de gases (patente española n0 ES 2 152-153; patente en EEUU 6,402.947 B1 , licenciada a Ia empresa KONIK-Tech, Sant Cugat del Valles, Barcelona) o bien el sistema mejorado (patente española n° P200501284) denominada interfase TOTAD (Through Oven Transfer Adsorption Desorption) en Ia literatura científica.
El método, exceptuando la etapa de extracción, es totalmente automático. Las válvulas de apertura y cierre y la válvula de seis vías de Ia interfase TOTAD son electroválvulas que se controlan desde el software del ordenador.
El método consta de dos fases claramente diferenciadas: Una primera fase en Ia cual se extraen los plaguicidas de Ia muestra y una segunda fase que constituye el análisis cromatográfico de los plaguicidas extraídos.
Primera Fase: Extracción de los plaguicidas de Ia muestra con pequeñas cantidades de disolventes orgánicos.
Una cantidad de muestra suficiente que permita Ia homogeneidad de
Ia misma es triturada. Se toma una pequeña alícuota de Ia muestra triturada y homogenizada a Ia cual se añade una pequeña cantidad de disolvente orgánico, pudiéndose añadir así mismo cantidades variables de sales que favorezcan Ia extracción de aquellos plaguicidas más polares. La mezcla se mantiene en agitación durante el tiempo necesario para Ia extracción. A continuación se permite Ia separación de las dos fases acuosa y orgánica, recogiendo ésta última y filtrándola.
Segunda Fase: Análisis cromatográfico de los plaguicidas en el extracto obtenido.
En esta fase el tubo interior de Ia interfase TOTAD se rellena de un material adsorbente, de una determinada longitud, con un sistema que impida el desplazamiento del adsorbente. El material adsorbente puede ser cualquier material que retenga los plaguicidas y que permita el paso del gas portador y del líquido que Io ha de atravesar.
La bomba que empuja al disolvente se conecta a Ia válvula de inyección y ésta a Ia válvula de seis vías mediante un tubo. La válvula de seis vías, a su vez, se conecta mediante otro tubo insertado en el tubo interior de Ia interfase TOTAD, de forma que se introduzca una longitud mayor que el extremo de Ia columna capilar de cromatografía de gases que se ha introducido por este mismo extremo.
Durante fase del análisis se distinguen cinco etapas: 1) Estabilización: Antes de iniciar Ia inyección, se estabiliza Ia interfase TOTAD a Ia temperatura a Ia que se va a llevar a cabo Ia inyección, que debe ser Ia adecuada para que los plaguicidas queden retenidos en el adsorbente que rellena el tubo interior de Ia interfase y para conseguir Ia eliminación del disolvente. El gas circula a través de dicho tubo entrando por las dos entradas de gas de Ia interfase. La válvula EV1 de Ia interfase se encuentra cerrada y Ia EV2 abierta (EV1 y EV2 corresponde a Ia nomenclatura utilizada en Ia patente española n° ES 2 152-153).
2) Invección: Se inyecta el extracto de Ia muestra a analizar en Ia válvula de inyección. Se acciona Ia válvula de inyección, con Io que el extracto inyectado es empujado por el disolvente, impulsado por al bomba hacía Ia válvula de seis vías.
r 3) Transferencia del extracto a GC: La válvula de seis vías cambia su posición automáticamente. El flujo de gas que atraviesa el adsorbente empuja al extracto a través del mismo. Los plaguicidas son retenidos mientras que el disolvente es eliminado, total o parcialmente evaporado, por el tubo de salida. Con el fin de mejorar Ia retención de los plaguicidas en el adsorbente el flujo del disolvente puede tomar diferentes valores.
4) Eliminación de los restos del disolvente: Una vez que Ia etapa de transferencia del extracto a GC ha finalizado, Ia válvula de seis vías cambia automáticamente su posición y se abren Ia válvula EV1. Al mismo tiempo se eliminan los restos de disolvente que se encuentran en el tubo interior de Ia interfase TOTAD, así como los que permanecen en el tubo capilar que une Ia válvula de seis vías con el tubo interior de Ia interfase TOTAD. Estas condiciones se mantienen el tiempo necesario para que Ia eliminación del disolvente sea tal que el remanente no interfiera en Ia cromatografía de gases. 5) Desorción térmica: Pasado el tiempo necesario para Ia eliminación del disolvente, las electroválvulas de apertura y cierre, que forman parte de Ia interfase TOTAD (EV1 y EV2) se cierran. Se cierra también Ia entrada de flujo de helio por Ia entrada que atraviesa el adsorbente, y se modifica, si es necesario, el flujo o presión por Ia otra entrada al valor adecuado, de modo que el gas que ahora entra solo por Ia entrada situada en Ia parte extema de Ia interfase, atraviesa el adsorbente y sale solo por Ia columna de cromatografía de gases. En este momento se calienta rápidamente el inyector hasta Ia temperatura necesaria para producir Ia desorción térmica de los plaguicidas, que son arrastrados por Ia corriente de helio a Ia columna cromatográfica, donde tiene lugar el análisis cromatográfico en las condiciones previamente programadas.
Las ventajas que presenta el método objeto de invención son las siguientes:
- El método objeto de Ia invención puede ser utilizado para el análisis multirresiduo de plaguicidas en un único análisis.
- El método objeto de invención permite el análisis de residuos de plaguicidas en muestras de vegetales sin más tratamiento previo de Ia muestra que Ia extracción.
- El método objeto de Ia invención no requiere el empleo de cantidades elevadas de disolventes orgánicos perjudiciales para Ia salud del analista y para el medio ambiente.
- El método objeto de Ia invención solo necesita manipulación de Ia muestra por parte del analista en Ia etapa de extracción, por Io que reduce los errores y contaminaciones causados en dicha manipulación. - El método objeto de Ia invención, incluye una etapa de extracción que es rápida y una etapa de análisis que es totalmente automática, por Io que es especialmente adecuado para el análisis de residuos de plaguicidas en controles de rutina.
- El método objeto de Ia invención permite Ia inyección en el sistema cromatográfico de volúmenes de extracto superiores a los habitualmente inyectados en cromatografía de gases, que pueden ser variables, Io que permite eliminar Ia etapa de concentración del extracto dando lugar a un aumento de Ia sensibilidad y a una mejora de los límites de detección.
- El método objeto de Ia invención permite utilizar numerosas veces el tubo interior de Ia interfase TOTAD relleno del material adsorbente, sin que tenga que ser sustituido.
- En el método objeto de Ia invención no se produce deterioro del sistema de cromatografía de gases debido a Ia introducción en el mismo de disolventes agresivos para el mismo ya que éstos son previamente eliminados.
- El método objeto de Ia invención permite utilizar diferentes sistemas de detección en cromatografía de gases.
- El tiempo total del análisis del método objeto de Ia invención es significativamente menor que el tiempo que se requiere cuando se utiliza el método convencional.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LOS DIBUJOS
Cromatograma correspondiente al análisis de una muestra de tomate que fue fortificada a 0.05 mg/kg con cada uno de los siguientes plaguicidas: dimetoato, diazinón, fenitrotión, malatión, fentión, clorpirifos, clorfenvinfos, metidatión, tetraclorvinfos. Las condiciones de extracción así como las condiciones en las cuales se ha obtenido el cromatograma son las indicadas en el ejemplo de realización de Ia invención. El volumen de extracto inyectado fue de 50 μl_ y el flujo del disolvente al cual se realiza Ia transferencia de 0.1 mL/min. El tiempo indicado en el cromatograma de gases corresponde solo al tiempo de análisis del cromatógrafo de gases. La identificación de los picos es Ia siguiente: 1) dimetoato 2) diazinón 3) fenitrotión 4) malatión 5) fentión 6) clorpirifos 7) clorfenvinfos 8) metidatión y 9) tetraclorvinfos.
EJEMPLO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Los análisis se han realizado utilizando una bomba cuaternaria (HP modelo
1100), una válvula de inyección manual (modelo J125 Rehodyne, CA) con un lazo (loop) de 50 §L y un cromatógrafo de gases (Konik modelo HRGC 4000B) equipado con un detector de Nitrógeno-Fósforo e interfase TOTAD
La interfase TOTAD se coloca horizontalmente en el lado izquierdo del cromatógrafo de gases. El software EZchrom (Konik, Sant Cugat del Valles, Barcelona) permite manejar Ia interfase desde el ordenador y obtener datos del cromatógrafo de gases.
La columna de cromatografía de gases utilizada es una columna capilar de sílice fundida de 30 m de longitud y 0.32 mm de diámetro interno rellena de 5 % de fenilmetilsilicona con un espesor de 0.25 μm
Primera fase del método
Una muestra de tomate comprada en el mercado se trituró y homogeneizó. De esta muestra triturada se cogieron 2.5 g y se fortificó, añadiendo 125 •£!_ de una disolución de plaguicidas en metanol a 1 mg/L consiguiendo así una muestra fortificada con 0.05 mg/Kg de tomate de cada uno de los siguientes plaguicidas: dimetoato, diazinón, fenitrotión, malatión, fentión, clorpirifos, clorfenvinfos, metidatión, tetraclorvinfos, obtenidos de
Chem. Service Inc. (West Chester PA1SA). Una vez fortificada Ia muestra se añadieron 2g de sulfato de sodio anhidro y 5 mL de acetato de etilo. Esta mezcla se agita durante un minuto y se deja decantar, produciéndose Ia separación entre fase orgánica y acuosa. La fase orgánica (fase superior) se extrae con una jeringa y se filtra a través de un filtro de 0.22 μm (Millex-GN
SLGN 013 NL).
Segunda fase del método
El tubo interior de Ia interfase TOTAD de 2 mm de diámetro interno y
10 cm de longitud se rellenó con 1 cm de Tenax TA 80-100 mesh (Chrompack, Mieddelburg, Holanda) sujeto, por ambos extremos, con lana de vidrio, para evitar el desplazamiento del Tenax. Una vez relleno se acondicionó con un flujo de helio de 500 mL/min atravesando el adsorbente y fue calentado desde 50 0C hasta 350 0C a 50 °C/10 min y mantenido durante 60 min a Ia temperatura final.
Durante las cinco etapas de Ia fase de análisis, las condiciones usadas fueron las siguientes
1) Estabilización: La interfase se estabiliza a 100 0C. El flujo de helio es de 500 mL/min por ambas entradas. La temperatura del horno del cromatógrafo de gases se mantiene a 40 0C.
2) Invección: Una alícuota del extracto se introdujo en Ia válvula de inyección de cromatografía de líquidos (válvula Rehodyne 7125) que tenía un lazo (loop) de 50 φ ' L. El flujo del disolvente se mantiene a 0.1 mL/min. El disolvente utilizado fue acetato de etilo.
3) Transferencia del extracto al GC: La válvula de seis vías conmuta y Ia solución es impulsada por Ia bomba de cromatografía de líquidos al interior del tubo interior de Ia interfase a un flujo de 0.1 mL/min. Los analitos son retenidos en el adsorbente y el disolvente es eliminado arrastrado por el helio
4) Eliminación restos de disolvente: Al 1 min 40 s termina Ia etapa de transferencia. En este momento se cambia Ia válvula de seis vías con Io que el disolvente impulsado por Ia bomba de cromatografía de líquidos de Ia válvula se envía al desecho. El disolvente que permanece en el tubo de transferencia es también empujado al desecho por el flujo de helio. Estas condiciones se mantienen durante 2 min para asegurar Ia eliminación de los restos de disolvente del tubo interior de Ia interfase TOTAD y del tubo de transferencia.
5) Desorción térmica: A los 3 min 40 s se cierran las válvulas de apertura y cierre de Ia interfase. Se interrumpe el flujo de helio que atraviesa el adsorbente y se cambia Ia presión por Ia otra entrada de modo que circule por la columna un caudal de 1.8 mL/min. Se calienta Ia interfase hasta 275
0C. Los plaguicidas son desorbidos y empujados por el flujo de helio a Ia columna del cromatógrafo de gases. A los 4 min 10 s comienza el análisis cromatográfico, de acuerdo con el programa que se indica más adelante.
Las condiciones del análisis cromatográfico son las siguientes: se mantiene Ia columna a 40 0C durante 1 min, a continuación se aumenta Ia temperatura hasta 170 0C a 20 °C/min, después a 3 °C/min hasta 210 0C y a 5 °C/min hasta 230 0C manteniendo esta temperatura final durante 5 minutos . La temperatura del detector de Nitrógeno-Fósforo se mantiene a 250 0C. Durante las etapas de inyección y de eliminación del disolvente Ia temperatura del horno del cromatógrafo de gases se mantiene a 40 0C.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. Método de análisis de residuos de plaguicidas en muestras vegetales que comprende las siguientes etapas:
a. extracción de los plaguicidas de Ia muestra; y b. análisis cromatográfico de los plaguicidas extraídos,
caracterizado por el empleo de Ia interfase TOTAD (Through Oven
Transfer Adsorption Desorption).
2. Método de análisis, según Ia reivindicación 1 , caracterizado porque los disolventes empleados en Ia etapa a) de extracción pueden ser polares o apolares. , -
3. Método de análisis, según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque permite inyectar volúmenes de extracto muy elevados.
4. Método de análisis, según Ia reivindicación 3, caracterizado porque el volumen de extracto inyectado es de 50 μl_.
5. Método de análisis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extracto obtenido en Ia etapa a) no requiere de ninguna etapa adicional de partición, limpieza o concentración.
6. Método de análisis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el extracto obtenido en a) es transferido automáticamente al cromatógrafo de gases.
7. Método de análisis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque Ia etapa b) de análisis es totalmente automática.
8. Método de análisis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el tubo del interior de Ia interfase está relleno de un material adsorbente.
9. Método de análisis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque los disolventes son eliminados antes de Ia introducción del extracto en Ia columna de cromatografía de gases.
10. Método de análisis, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque permite e| análisis multiresiduo de plaguicidas en un único análisis.
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