WO2006132341A1 - sc(Fv)2部位特異的変異体 - Google Patents

sc(Fv)2部位特異的変異体 Download PDF

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WO2006132341A1
WO2006132341A1 PCT/JP2006/311575 JP2006311575W WO2006132341A1 WO 2006132341 A1 WO2006132341 A1 WO 2006132341A1 JP 2006311575 W JP2006311575 W JP 2006311575W WO 2006132341 A1 WO2006132341 A1 WO 2006132341A1
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amino acid
light chain
heavy chain
chain
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PCT/JP2006/311575
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Tomoyuki Igawa
Hiroyuki Tsunoda
Takamitsu Kobayashi
Shoujiro Kadono
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the present invention relates to a site-specific mutant of sc (Fv) 2, which is a low molecular weight antibody, and use thereof.
  • Proteins are different in chemical properties from DNA, which handles genetic information, and their structure is flexible. Proteins are always in equilibrium with their natural and collapsed structures (denatured structures) even under physiological conditions.
  • protein degradation pathways include degradation pathways associated with physical association of protein molecules such as the formation of soluble multimers and the formation of precipitates (insoluble matter) (Non-patent Document 1).
  • Degradation pathways by chemical modification such as hydrolysis, deamidation reaction, methionic acid reaction, etc. (Non-patent Document 2) are known.
  • the solution pH is optimized, the buffer solution salt type and concentration are optimized, or the stabilizer type and concentration are optimized.
  • Non-Patent Document 3 antibody molecules including low molecular weight antibodies are known to be associated with each other and have very low stability.
  • Non-Patent Documents 5, 6, and 7 disclose a method for enhancing the intrinsic stability of proteins by introducing amino acid mutations.
  • Various methods have been reported so far for improving the stability of a protein by amino acid mutation with respect to a protein with a known sequence.
  • Non-Patent Documents 8, 9, 10, 11 disclose a method for improving the stability of scFv molecules by amino acid modification according to such a method.
  • Fab, Fv, scFv, sc (Fv) 2 and the like are known as low molecular weight antibody molecules.
  • Fv and Fab which are antibody molecules obtained by fragmenting the same full-length IgG, Fab has been found to have different stability from Fv due to the presence of CH1 and CL. The same is true for scFv, and there is no CH1 and CL for V in scFv, which means that Fab is not exposed to the surface !, and hydrophobic amino acid is exposed to the surface. It has been reported that the thermal stability is lowered and the stability during the thermal acceleration test is improved by substituting the residue with a hydrophilic amino acid (Non-patent Document 7).
  • Non-Patent Document 1 Int. J. Pharm. 2005, 289, 1-30
  • Non-Patent Document 2 Int. J. Pharm. 1999, 185, 129-188
  • Non-Patent Document 3 Biochemistry, 1999, 38, 13960-13967
  • Non-Patent Document 4 FEBS Letters Volume 360, Issue 3, 1995, 247-250
  • Non-Patent Document 5 Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13, 333-337
  • Non-Patent Document 6 J. Biotechnology, 2004, 113, 105-120
  • Non-Patent Document 7 Microbiol Mol Biol Rev. 2001, 65 (1), 1-43
  • Non-Patent Document 8 J. Mol. Biol. 2003, 325, 531-553
  • Non-Patent Document 9 J. Mol. Biol. 2001, 305, 989-1010
  • Non-Patent Document 10 Methods, 2004, 184-199
  • Non-Patent Document 11 Protein Eng. 1997, 10 (4), 435-44
  • Non-Patent Document 13 Int. J. Cancer, 2003, 107, 822-829
  • Non-Patent Document 14 Protein Engineering, 1997, 10 (12), 1453-1459
  • the present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to provide a method for stabilizing sc (Fv) 2, including a step of introducing a site-specific mutation into sc (Fv) 2. Another object is to provide a method for suppressing the association between sc (Fv) 2 molecules. It is another object of the present invention to provide sc (Fv) 2 stabilized by introducing site-specific mutations. Another object of the present invention is to stabilize sc (Fv) 2 by placing a specific amino acid at a site that affects the stability of sc (Fv) 2. Another object of the present invention is to provide sc (Fv) 2 having an increased Tm value. Furthermore, another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing stabilized sc (Fv) 2, a method for producing the pharmaceutical composition, and a kit containing the pharmaceutical composition.
  • the present inventors performed Tm measurement of the humanized VB22 B sc (Fv) 2 site-specific mutant using Differential Scanning Calorimetry (DSC).
  • DSC Differential Scanning Calorimetry
  • hVB22B ge sc (Fv) 2 has improved Tm by 13.3 ° C by modifying the amino acid to improve stability hVB22B u 2-wz4 sc (Fv) 2
  • hVB22B has improved Tm by 15.5 ° C q_wz5 was obtained (Fig. 4). So far, there is no report on the Tm value of sc (Fv) 2, and there is no report that the Tm value is improved by amino acid modification of sc (Fv) 2.
  • the present inventors succeeded in greatly improving the Tm value of sc (Fv) 2 by amino acid modification for the first time according to the present invention. Furthermore, by introducing a site-specific mutation into sc (Fv) 2, it was found that sc (Fv) 2 is stable, and thus the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following [1] to [13].
  • a method of stabilizing sc (Fv) 2 comprising the step of introducing a site-specific mutation into sc (Fv) 2, and (2) comprising the step of introducing a site-specific mutation into sc (Fv) 2. How to suppress the association between sc (Fv) 2
  • At least one amino acid selected from the following (a) to (k) The method according to any one of [1] to [4], which introduces an acid mutation
  • Heavy chain 48 (amino acid) is isoleucine sc (Fv) 2
  • Light chain 45 (amino acid) is arginine sc (Fv) 2
  • Heavy chain 81st amino acid is glutamine sc (Fv) 2
  • a pharmaceutical composition comprising sc (Fv) 2 according to any one of [7] to [11]
  • FIG. L A graph showing the results of hVB22B g-e sc (Fv) 2 antigen activity evaluation using BaF-human Mpl.
  • FIG. 2 shows the results of evaluation of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 agonist activity using BaF-human Mpl.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of the evaluation of hVB22B q-wz5 sc (Fv) 2 agonist activity using BaF-human Mpl.
  • FIG. 4 is a graph showing Tm values of hVB22B g-e sc (Fv) 2 and site-specific mutants of sc (Fv) 2.
  • FIG. 5 is a graph showing changes in the residual ratio of monomers when the lie at position 37 of the heavy chain in sc (Fv) 2 is replaced with Val.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in the residual ratio of monomers when the 9th Pro in the heavy chain in sc (Fv) 2 is replaced with Ala.
  • FIG. 7 is a graph showing changes in the residual monomer ratio when the 9th Pro in the heavy chain in sc (Fv) 2 is replaced with Ser.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in the residual ratio of monomers when the 37th Leu of light chain in sc (Fv) 2 is replaced with Gin.
  • FIG. 9 is a graph showing a change in the residual ratio of monomers when the 8th Ala of the light chain in sc (Fv) 2 is replaced with Pro.
  • FIG. 10 is a graph showing a change in the residual ratio of monomer when the 65th heavy chain Val in sc (Fv) 2 is replaced with Gly.
  • FIG. 11 shows changes in the residual ratio of monomers when the 43rd Ser of the light chain in sc (Fv) 2 is replaced with Ala and the Gin of the 45th light chain is replaced with Arg.
  • FIG. 12 is a graph showing changes in the residual ratio of monomers when the 36th Tyr of the light chain in sc (Fv) 2 is replaced with Phe.
  • FIG. 13 is a graph showing changes in the residual ratio of monomers when the 70th Ala of light chain in sc (Fv) 2 is replaced with Asp.
  • FIG. 14 is a graph showing changes in the residual ratio of monomers when the 7th Ala of the light chain in sc (Fv) 2 is replaced with Ser.
  • FIG. 15 is a graph showing changes in the residual monomer ratio when the 81st Gin in the heavy chain in sc (Fv) 2 is replaced with Glu.
  • FIG. 16 is a graph showing a change in the residual ratio of monomers when the Arg at the 81st heavy chain in sc (Fv) 2 is substituted with Glu.
  • FIG. 17 is a graph showing changes in the residual ratio of monomers when the 48th Met in sc (Fv) 2 is replaced with lie.
  • FIG. 18 is a diagram showing a process of producing sc (Fv) 2 gene.
  • FIG. 19-A shows the VH amino acid sequence of sc (Fv) 2 used in the examples. One in the figure indicates the same amino acid sequence as g-e.
  • FIG. 19-B is a diagram showing a sequence subsequent to 19—A.
  • FIG. 20-A shows the VL amino acid sequence of sc (Fv) 2 used in the examples. One in the figure indicates the same amino acid sequence as g-e.
  • FIG. 20-B is a diagram showing a sequence subsequent to 2O-A.
  • FIG. 21 shows the results of gel filtration chromatography of u2-wz4, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 22 shows the results of DSC analysis of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, variant vl, and variant v3.
  • FIG. 23 shows the results of gel filtration chromatography analysis in a thermal acceleration test of u2-wz4 purified peakl, u2-wz4 purified peak2, modified vl, and modified v3.
  • the present inventors have found that the stability of sc (Fv) 2 is improved by introducing a site-specific mutation.
  • the present inventors have further found that the stability of sc (Fv) 2 is improved by placing a specific amino acid at a specific site.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention relates to a method for stabilizing sc (Fv) 2, which comprises the step of introducing a site-specific mutation into sc (Fv) 2.
  • “modification” or “introduction of mutation” of an amino acid residue in the method of the present invention specifically refers to substitution of the original amino acid residue (before modification) with another amino acid residue, or the original amino acid residue. Deletion of a group, addition of a new amino acid residue, and the like, and preferably replacement of an original amino acid residue with another amino acid residue.
  • the original amino acid sequence (before modification) may be a naturally occurring sequence as the original amino acid sequence, or a sequence that has already undergone amino acid substitution or humanization as the original amino acid sequence. Good.
  • “modification” of amino acid residues and “introduction of mutation” are used in the same meaning.
  • “mutation introduction” of an amino acid residue can be carried out by modifying DNA encoding sc (Fv) 2.
  • a mutation when introduced into the heavy chain (or light chain) of sc (Fv) 2, it is mutated into both of the two heavy chains (or both of the two light chains) contained in sc (Fv) 2. Or a mutation in only one heavy chain (or light chain).
  • modifying DNA refers to modifying DNA so as to correspond to the amino acid residue introduced by “introduction of mutation” in the present invention. More specifically, it refers to modifying the DNA encoding the original amino acid residue into DNA encoding the amino acid residue introduced by the modification. Usually, at least one base is inserted, deleted or substituted into the original DNA so as to be a codon encoding the desired amino acid residue. Means performing gene manipulation or mutation. That is, the codon encoding the original amino acid residue is replaced by the codon encoding the amino acid residue introduced by modification.
  • DNA modification can be appropriately performed by those skilled in the art using known techniques such as site-directed mutagenesis and PCR mutagenesis.
  • the site into which site-specific mutation is introduced is not particularly limited, and any site of sc (Fv) 2 may be used, but preferably any one of the following (a) to (k) It is a part.
  • amino acid after substitution is not particularly limited, and any amino acid may be substituted, but preferred examples of the amino acid after substitution are the following amino acids.
  • the present invention relates to a method for stabilizing sc (Fv) 2 by placing a specific amino acid at a specific site in sc (Fv) 2. More specifically, the present invention relates to a method for stabilizing sc (F v) 2 by any of the following methods.
  • sc (Fv) 2 is a single chain formed by linking two heavy chain variable regions ([VH]) and two light chain variable regions ([VL]) with a linker or the like. Polypeptide antibodies (Hudson et al, J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189). sc (Fv) 2 is, for example, two scFv (single chain Fv) (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • a linker Any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker, such as the linker disclosed in Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996, etc.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the purpose, but is usually 1 to 100 amino acids, preferably 5 to 30. Amino acids, particularly preferably 12 to 18 amino acids (eg 15 amino acids).
  • the order of the two heavy chain variable regions and the two light chain variable regions to be bound is not particularly limited, and may be arranged in any order. Can
  • sc (Fv) 2 having an arrangement of [VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL] is preferable.
  • amino acid sequence of the peptide linker examples include the following sequences.
  • Synthetic chemical linkers are commonly used for cross-linking peptides such as N-hydroxysuccinimide (NHS), disuccinimidyl suberate (DSS), bis (Sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), dithiopis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), ethylene glycol bis (Succinimidyl succinate) (EGS), ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo EGS), disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (Sulfo-DST), bis [2- (succinimidoxycarboxyl) ethyl] sulfone (BSOCOES), bis [2- (succinimidoxycarboxyl) ethyl] sulfone (B
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region or the light chain variable region may be substituted, deleted, added, and Z or inserted. Further, when the heavy chain variable region and the light chain variable region are associated with each other, as long as they have antigen-binding activity, a part thereof may be deleted or another polypeptide may be added.
  • the variable region may be humanized.
  • an antibody equivalent to can be prepared. Amino acid mutations can also occur in nature. As described above, an antibody having an amino acid sequence in which one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of the antibody of the present invention and functionally equivalent to the antibody is also included in the antibody of the present invention.
  • the number of amino acids to be mutated is not particularly limited, but is usually within 30 amino acids, preferably Is within 15 amino acids, more preferably within 5 amino acids (eg, within 3 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids with aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids with hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atom-containing side Amino acids with chains (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with side-containing side chains (R, K, H), aromatic-containing side Amino acids with chains (H, F, Y, W) can be listed (in parentheses are!
  • a chimeric antibody is an antibody produced by combining sequences derived from different animals. For example, it consists of a mouse antibody heavy chain and light chain variable region and a human antibody heavy chain and light chain constant region. Such as an antibody.
  • a chimeric antibody can be prepared by a known method. For example, DNA encoding an antibody V region and DNA encoding a human antibody C region are ligated, incorporated into an expression vector, and introduced into a host. It is obtained by making it produce.
  • a humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, which is a complementarity determining region (CDR) of a non-human mammal such as a mouse antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • the gene is transplanted into a region, and a general gene recombination technique is also known (see European Patent Application Publication No. EP 125023, WO 96/02576).
  • mouse antibody CDR and a human antibody framework region (framework region;
  • the DNA sequence designed to link to (FR) is over the terminal regions of both CDR and FR. It is synthesized by PCR using several oligonucleotides prepared so as to have one wrapping part as primers (see the method described in W098 / 13388).
  • the framework region of the human antibody to be linked via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site. If necessary, the amino acid of the framework region in the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. etal., CancerRes (1993) 53, 851 -856).
  • the constant region of the chimeric antibody and humanized antibody is usually that of a human antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, and L chain are used.
  • a chimeric antibody consists of a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a constant region derived from a human antibody.
  • a humanized antibody consists of a complementarity determining region of a non-human mammal-derived antibody, a framework region derived from a human antibody, and a constant region.
  • variable region e.g, FR
  • constant region amino acids in the variable region or constant region may be substituted with other amino acids.
  • the origin of the variable region in the chimeric antibody or the CDR in the humanized antibody is not particularly limited and may be derived from any animal. For example, it is possible to use sequences such as mouse antibody, rat antibody, rabbit antibody, and rata antibody.
  • the sc (Fv) 2 used in the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substances, and toxins. Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field. These conjugate antibodies are also included in sc (Fv) 2 in the present invention.
  • the sc (Fv) 2 used in the present invention may be a bispecific antibody! / (For example, Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374, etc.).
  • the bispecific antibody may recognize two different antigens, or may recognize different epitopes on the same antigen.
  • sc (Fv) 2 of the present invention has another protein such as Fc part of IgG at its N-terminal or C-terminal. Quartz may be fused (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281). A protein to be fused can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the sc (Fv) 2 described above can be produced by methods known to those skilled in the art. Specifically, the target sc (Fv) 2 DNA is incorporated into an expression vector. In that case, it is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region such as an enhancer or a promoter.
  • an expression control region such as an enhancer or a promoter.
  • host cells can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
  • vectors include M13 vectors, pUC vectors, pBR322, pBluescript, and pCR-Script.
  • pGEM-T, pDIRECT, pT7 and the like can be mentioned.
  • an expression vector is particularly useful.
  • an expression vector for example, for the purpose of expression in Escherichia coli, in addition to the above-mentioned characteristics that the vector is amplified in Escherichia coli, the host is used with Escherichia coli such as JM109, DH5 «, HB101, XLl-Blue.
  • Escherichia coli such as JM109, DH5 «, HB101, XLl-Blue.
  • a promoter that can be efficiently expressed in E. coli such as the lacZ promoter (Ward et al., Nature (1989) 341, 54 4-546; FASEB J.
  • the vector also includes a signal sequence for polypeptide secretion!
  • a signal sequence for polypeptide secretion the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli.
  • Introduction of the vector into the host cell can be carried out using, for example, the salt calcium method or the electopore method.
  • vectors for producing the polypeptide of the present invention include mammalian-derived expression vectors (for example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF-BO S (Nucleic Acids.
  • insect cells Kuta for example, “Bac-to- BAC baculovairus expression system” (GIBCO BRL), p BacPAK8), plant-derived expression vectors (for example, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (for example, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (eg, “Pichia Expression Kit” (manufactured by Invitrogen), pNVll, SP-Q01), Bacillus subtilis-derived expression vectors (eg, PPL608, pK ⁇ 50).
  • insect cells Kuta for example, “Bac-to- BAC baculovairus expression system” (GIBCO BRL), p BacPAK8)
  • plant-derived expression vectors for example, ⁇ 1, pMH2
  • animal virus-derived expression vectors for example, pHSV, pMV, pAdexLc
  • a promoter required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277 , 108), MMTV-LTR promoter, EF1 alpha promoter (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CAG promoter (Gene. (1991) 108, 193), CMV promoter, etc.
  • a gene for selecting for transformation into cells for example, a drug resistance gene that can be distinguished by a drug (neomycin, G418, etc.)
  • examples of such a vector include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • the gene is stably expressed and the purpose is to amplify the copy number of the gene in the cell
  • the DHFR gene that complements the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway is used.
  • a method of amplifying with methotrexate (MTX) and when transient expression of the gene is intended, a gene that expresses SV40 T antigen
  • MTX methotrexate
  • a method of transforming with a vector (such as pcD) having an SV40 replication origin using COS cells having a chromosome on the chromosome can be mentioned.
  • the replication origin those derived from poliovirus, adenovirus, ushipapilloma virus (BPV) and the like can also be used.
  • the expression vector is used as a selection marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, Escherichia coli xanthine guanine phosphoribosyl transferase (Ecogpt) gene, dihydro A folate reductase (dhfr) gene and the like can be included.
  • APH aminoglycoside transferase
  • TK thymidine kinase
  • dhfr dihydro A folate reductase
  • “stabilize” refers to suppressing aggregation caused by mutation. Suppression of association is the degree and rate of association that does not need to be completely suppressed. It is also possible to only reduce the match.
  • the meeting may be a reversible meeting or an irreversible meeting.
  • association may be the association of sc (Fv) 2 that occurs over time, and the process of producing sc (Fv) 2 in a host cell or
  • the host cell force may also be an association in the process of being secreted.
  • suppression of sc (Fv) 2 activity reduction or suppression of transition to a non-natural state also has the same meaning as “stabilization” of the present invention.
  • Whether or not the force is stable can be measured by a method known to those skilled in the art.
  • whether or not the association is suppressed can be measured by the method described in the examples. It is possible.
  • methods known to those skilled in the art such as sedimentation equilibrium (ultracentrifugation), osmotic pressure, light scattering, low angle laser light scattering, X-ray small angle scattering, neutron small angle scattering, or gel filtration. This can be done by measuring the degree of association (association rate) of antibody molecules by a method or the like.
  • the method for measuring the degree of association (association rate) of antibody molecules includes a method using SEC (Size Exclusion Chromatography), but is not limited to these methods.
  • the Tm value is known as an index indicating the stability of a protein in a solution.
  • proteins are more unstable at higher temperatures, and when heat is applied to proteins, denaturation and association begins at a certain temperature, and at a certain temperature, the protein is completely denatured or associated.
  • the Tm value is an intermediate temperature of such a change, and can generally be measured by optical analysis such as differential scanning calorimetry (DSC) and temperature-dependent CD spectrum change.
  • DSC differential scanning calorimetry
  • preparations can be made with high stability by selecting formulation conditions with high Tm values (Pharm Res. 1998 Feb; 15 (2): 200-8 ) o Therefore, it is considered that development as a pharmaceutical preparation will be facilitated by creating a variant that increases the Tm value by amino acid modification.
  • the present invention relates to a method for increasing the Tm value of sc (Fv) 2 by 10 ° C. or more, which comprises the step of introducing a site-specific mutation into sc (Fv) 2.
  • Tm value has increased or not can be examined by comparing the Tm value before amino acid modification with the Tm value after amino acid modification.
  • the increase in the Tm value indicates that the Tm value after amino acid modification is Although it is not particularly limited as long as it is higher than the Tm value before modification with no acid, it is preferably an increase of 10 ° C or more, more preferably an increase of 13 ° C or more, and particularly preferably 15 ° C or more. Is the rise.
  • the upper limit of the Tm value is not particularly limited, but is generally about 150 ° C.
  • the Tm value can be measured by a method known to those skilled in the art.
  • the Tm value can be measured by a method described in Examples.
  • the number of amino acids to be modified to increase the Tm value is not particularly limited, and a single amino acid may be modified, or a plurality of amino acids may be modified.
  • the stabilization of sc (Fv) 2 may be that the sc (Fv) 2 molecule is temporarily stabilized, and finally sc (Fv) 2 ) Two molecules may be stabilized. That is, the activity of the sc (Fv) 2 composition may be temporarily maintained, or the activity of the sc (Fv) 2 molecule may be finally maintained after a certain period.
  • the activity is not particularly limited and may be any activity such as binding activity, neutralizing activity, cytotoxic activity, agonist activity, antagonist activity, enzyme activity, etc. Ghost activity is preferred.
  • the antigenic activity is an activity that induces a change in physiological activity by binding a signal to an antigen such as a receptor, whereby a signal is transmitted into a cell.
  • physiological activities include proliferation activity, survival activity, differentiation activity, transcription activity, membrane transport activity, binding activity, proteolytic activity, phosphate ⁇ Z dephosphate ⁇ activity, redox activity, transfer activity, Forces that can include nucleolytic activity, dehydration activity, cell death-inducing activity, apoptosis-inducing activity, and the like, but are not limited thereto.
  • the antigen is not particularly limited, and any antigen can be used!
  • antigens include receptors, cancer antigens, MHC antigens, differentiation antigens, and the like.
  • receptors include, for example, hematopoietic factor receptor family, cytoforce-in receptor family, tyrosine kinase type receptor family, serine Z threonine kinase type receptor family, TNF receptor family, G protein coupled receptor Examples include receptors belonging to the receptor family such as family, GPI-anchored receptor family, tyrosine phosphatase-type receptor family, adhesion factor family, and hormone receptor family.
  • Specific receptors belonging to the above receptor family include, for example, human or mouse erythropoietin (EPO) receptor, human or mouse granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) receptor, human or mouse thrombopoi Etine (TPO) receptor, human or mouse insulin receptor, human or mouse Flt-3 ligand receptor, human or mouse platelet derived growth factor (PDGF) receptor, human or mouse interferon (IFN)-a, j8 receptor , Human or mouse leptin receptor, human or mouse growth hormone (GH) receptor, human or mouse interleukin (IL) -10 receptor, human or mouse insulin-like growth factor (IGF) -I receptor, human or mouse Leukemia inhibitory factor (LIF) receptor, human or mouse ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor, etc.
  • EPO erythropoietin
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • TPO human or mouse thrombopoi Etine
  • Cancer antigens are antigens that are expressed as cells become malignant, and are also called tumor-specific antigens.
  • abnormal sugar chains appearing on the cell surface and protein molecules when cells become cancerous also become cancer antigens, and are particularly called cancer sugar chain antigens.
  • cancer antigens include CA19-9, CA 15-3, serial SSEA-1 (SLX), and the like.
  • MHC antigens are roughly classified into MHC class I antigens and MHC class II antigens, and MHC class I antigens are HLA- ⁇ , - ⁇ , -C, - ⁇ , -F, -G,- H is included, and MHC class II antigens include HLA-DR, -DQ, -DP.
  • Differentiation antigens include
  • CDl CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CDlla, CDllb, CDllc, CD13, CD14
  • any index can be used as long as a quantitative and Z or qualitative change can be measured.
  • a cell-free (cell free assay) index a cell-based (ceU-based assay) index, a thread and woven index, and a biological index can be used.
  • Cell-free indicators include enzymatic reactions, protein, DNA, RNA quantitative and Z or Qualitative changes can be used.
  • enzyme reaction for example, amino acid transfer reaction, glycosyl transfer reaction, dehydration reaction, dehydrogenation reaction, substrate cleavage reaction and the like can be used.
  • protein phosphorylation, dephosphorylation, dimerization, multimerization, degradation, dissociation, etc., and DNA, RNA amplification, cleavage, and extension can be used.
  • a phosphate of a protein existing downstream in the signal transduction pathway can be used as a detection index.
  • Cell line indicators include changes in cell phenotype, such as quantitative and Z or qualitative changes in the product, changes in proliferative activity, changes in cell number, changes in morphology, changes in properties, etc. Can be used. As production substances, secreted proteins, surface antigens, intracellular proteins, mRNA, and the like can be used. Changes in morphology include protrusion formation and change in the number of Z or protrusions, change in flatness, change in elongation, change in Z aspect ratio, change in cell size, change in internal structure, and deformity as a cell population Z uniformity, changes in cell density, etc. can be used. These morphological changes can be confirmed by microscopic observation.
  • Cell motility includes cell invasion activity and cell migration activity.
  • changes in intracellular substances include enzyme activity, mRNA levels, intracellular signaling substances such as Ca 2+ and cAMP, and intracellular protein levels.
  • changes in cell proliferation activity induced by receptor stimulation can be used as an index.
  • tissue index a change in function according to the tissue used can be used as a detection index.
  • Biological indicators include tissue weight changes, blood system changes such as changes in blood cell count, protein content, enzyme activity, changes in electrolysis mass, and changes in the circulatory system such as blood pressure and heart rate. Or the like can be used.
  • Methods for measuring these detection indexes include, but are not limited to, absorption, luminescence, color development, fluorescence, radioactivity, fluorescence polarization, surface plasmon resonance signal, time-resolved fluorescence, mass, absorption spectrum, light scattering, fluorescence Resonant energy transfer, etc. can be used. These measurement methods are well known to those skilled in the art, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the absorption spectrum is emitted from commonly used photometers, plate readers, etc.
  • Light can be measured with a luminometer or the like, and fluorescence can be measured with a fluorometer or the like.
  • Mass can be measured using a mass analyzer. Radioactivity is measured using a gamma counter or other measuring device according to the type of radiation, fluorescence polarization is measured by BEACON (Takara Shuzo), surface plasmon resonance signal is measured by BIACORE, time-resolved fluorescence, fluorescence resonance energy transfer is measured by ARVO, etc. it can.
  • a flow cytometer or the like can also be used for measurement.
  • more measurement methods can be used by measuring two or more types simultaneously and Z or continuously. It is also possible to measure the detection index. For example, fluorescence and fluorescence resonance energy transfer can be measured simultaneously with a fluorometer.
  • the agonist activity can be measured by methods known to those skilled in the art. For example, as described in the examples, determination can be made by a method of measuring the agonist activity using cell proliferation as an index. More specifically, an antibody whose agonist activity is to be measured is added to cells that exhibit agonist-dependent growth and cultured. Then, it is possible to measure the absorbance by adding a reagent that exhibits a color reaction at a specific wavelength according to the number of living cells such as WST-8, and measure the agonist activity using the obtained absorbance as an index. .
  • Cells exhibiting antigen-dependent proliferation can also be prepared by methods known to those skilled in the art.
  • the receptor is used.
  • An expressing cell may be used.
  • the antigen is a receptor that does not emit a cell proliferation signal
  • a chimeric receptor consisting of an intracellular region of a receptor that emits a cell proliferation signal and an extracellular region of a ⁇ receptor that does not emit a cell proliferation signal. Create and express the chimeric receptor in cells!
  • Examples of receptors that emit cell proliferation signals include G-CSF receptor, mpl, neu, GM-CSF receptor, EPO receptor, c-kit, FLT-3 and the like.
  • Examples of cells that express the receptor include BaF3, NFS60, FDCP-1, FDCP-2, CTLL-2, DA-1, and KT-3.
  • the present invention relates to sc (Fv) 2 into which a site-specific mutation has been introduced.
  • the site into which site-specific mutation is introduced is not particularly limited and may be any site of sc (Fv) 2, but is preferably any of the following sites (a) to (k) .
  • amino acid after substitution is not particularly limited and may be substituted with any amino acid.
  • Preferred examples of the amino acid after substitution are the following amino acids.
  • any of the following sc (Fv) 2 can be mentioned.
  • any of the following sc (Fv) 2 may be mentioned.
  • the present invention relates to sc (Fv) 2 in which a specific amino acid is arranged at a site that affects the stability of sc (Fv) 2. Specifically, it relates to any of the following sc (Fv) 2.
  • Heavy chain 48 (amino acid) is isoleucine sc (Fv) 2
  • Light chain 45 (amino acid) is arginine sc (Fv) 2
  • Heavy chain 81st amino acid is glutamine sc (Fv) 2
  • the invention relates to sc (Fv) 2 having higher Tm values.
  • a high Tm value means that the Tm value is 55 ° C or higher, preferably 60 ° C or higher, more preferably 65 ° C or higher.
  • the present invention provides a sc (Fv) whose Tm value is increased by 10 ° C or more, preferably 13 ° C or more, more preferably 15 ° C or more by introduction of a site-specific amino acid mutation. 2 is provided.
  • the Tm value used in the present invention is a Tm value when measured under the same conditions as described in the examples.
  • sc (Fv) 2 of the present invention has excellent properties such as stabilization and inhibition of association, it is suitable for use as a pharmaceutical composition.
  • the sc (Fv) 2 of the present invention may be any sc (Fv) 2, but is not particularly limited, but when used as a pharmaceutical composition, it may be humanized from the viewpoint of antigenicity to humans. I like it.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 of the present invention. Furthermore, the present invention relates to a kit comprising the pharmaceutical composition and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition and kit of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants (ascorbic acid, etc.), buffering agents (phosphoric acid, citrate, other organic acids, etc.). And preservatives, surfactants (PEG, Tween, etc.), chelating agents (EDTA, etc.), binders and the like.
  • proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulin, amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, arginine and lysine, saccharides such as polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and mantle And sugar alcohols such as sorbitol.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, Isotonic solutions containing glucose and other adjuvants, such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride salt, suitable solubilizers such as alcohol (ethanol etc.), poly You may use together with alcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50), etc.
  • suitable solubilizers such as alcohol (ethanol etc.), poly You may use together with alcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50), etc.
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, and poly (methacrylic acid)
  • colloid drug delivery systems ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, nano- Particle and nano force psenore etc.
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; U.S. Pat. No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556? 133,988).
  • the form (dosage form) of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, such as an injection form, a nasal administration form, a pulmonary administration form, a transdermal administration form, a lyophilized dosage form, a solution dosage form, etc. Of these, a lyophilized dosage form is preferred.
  • Freeze-drying can be performed by methods well known to those skilled in the art (Pharm Biotechnol, 2002, 1 3, 109-33, Int J Pharm. 2000, 203 (1-2), 1-60, Pharm Res. 1997 , 14 (8), 969-75).
  • a container such as a vial used for freeze-drying, and it is carried out in a freezer, a freeze-dryer, or immersed in a refrigerant such as acetone Z dry ice or liquid nitrogen.
  • the antibody preparation when made into a high-concentration solution preparation, it can be carried out by methods well known to those skilled in the art.
  • a membrane concentration method using a TFF membrane is usually used.
  • Examples of the injection dosage form can be systemically or locally administered by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight. Or an analogy For example, the dose can be selected within the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient.
  • the present invention is not limited to these doses and administration methods.
  • the present invention comprises sc (Fv) 2 comprising (1) introducing a site-specific mutation into sc (Fv) 2, and (2) mixing a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention relates to a method for producing a contained pharmaceutical composition.
  • Pharmaceutically acceptable carriers can include those described above.
  • a humanized VB22B variable region gene in which the complementary antigen-determining region (hereinafter CDR) of mouse anti-human Mpl antibody VB22B has been transplanted to the human antibody framework region (FR) has been prepared.
  • CDR complementary antigen-determining region
  • FR human antibody framework region
  • humanized VB22B sc (Fv) 2 linked by an H chain variable region and an L chain variable region handler was prepared by the following method. The construction process of the humanized VB22B sc (Fv) 2 gene is shown in FIG.
  • a humanized VB22B variable region gene was synthesized by an assembled PCR method. Specifically, about 50 bases of synthetic oligo DNA were designed to hybridize about 20 bases, and these synthetic oligo DNAs were ligated by PCR to prepare genes encoding each variable region. Next, a 15-amino acid linker (Gly) is inserted between the 3 terminus of the gene encoding the H chain variable region of humanized VB22B and the 5 'end of the gene encoding the L chain variable region of humanized V B22B. Use the assembled PCR method so that the base sequence encoding (Ser) is located.
  • the 5 'end of the H chain has an EcoRI site, and the base sequence encoding the amino acids of the 22nd and 23rd amino acids of the H chain is converted to the PvuII site. did.
  • a single-chain humanized antibody gene was prepared so as to have a Notl site at the 3 ′ end of the L chain and, if necessary, a nucleotide sequence encoding a FLAG sequence. Subsequently, a fragment to be inserted into the PvuII site of this single chain humanized antibody gene was prepared.
  • the H chain variable region lacking the N-terminus and the L chain variable region are linked by a linker that also has (Gly Ser) force, and the N terminal of the H chain variable region
  • the expression vector was introduced into CHO-DG44 cells by the electoporation method and selected in addition to CHO-S-SFMII medium (Invitrogen) containing 500 ⁇ g / mL Geneticin (Invitrogen). An expression CHO cell line was established.
  • the culture supernatant of this stable expression cell line was prepared and equilibrated with 50 mM Tris-HCKpH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, Anti-Flag M2 Affinity Gel (SIGMA-ALDRICH) column or FLAG For sc (Fv) 2 with no tag attached, MG10 (a fusion protein of GST from human Mpl Gln213 to 19 mer peptide consisting of Ala231) and GST is adsorbed to the immobilized column. Elute with mM Glycine-HCl (pH 3.5). The eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris-HCl (pH 8.0) and subjected to gel filtration chromatography using a HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham-Bioscience) column.
  • WB22B ge sc (Fv) 2 which is a humanized sc (Fv) 2 of anti-Mpl antibody, using BaF-human Mpl cells showing TPO-dependent proliferation
  • the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 2
  • hVB22B g2-e sc (Fv) 2 with site-directed mutations hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 SEQ ID NO: 3 for the nucleotide sequence and SEQ ID NO: 4 for the amino acid sequence
  • the TPO-like antigen activity of wz5 sc (Fv) 2 was evaluated.
  • the cells were washed twice with RPMI1640 (Invitrogen) containing 1% Fetal Bovine Serum (Invitrogen), and then suspended in RPMI 1640 containing 10% Fetal Bovine Serum to give 4xl0 5 cells / mL. Dispense into 96-well plates at ⁇ L / well. The concentration of rhTPO (manufactured by R & D) and purified product was shaken, and 40 L was added to each well and cultured under conditions of 37 ° C and 5% CO for 24 hours.
  • WST-8 reagent Cell Count Reagent SF, manufactured by Nacalai Tester Co., Ltd.
  • WST-8 reagent Cell Count Reagent SF, manufactured by Nacalai Tester Co., Ltd.
  • the absorbance at 450 nm was measured again. Since WST-8 reagent exhibits a 450 nm color reaction depending on the number of living cells, TPO-like agonist activity was evaluated using changes in absorbance over 2 hours as an index.
  • the humanized VB22B sc (Fv) 2 site-specific mutant has the same activity as hVB22B ge sc (Fv) 2 and murine VB22B sc (Fv) 2 before mutagenesis. showed that.
  • HVB22B u2 in which site-specific mutations were introduced into hVB22Bge sc (Fv) 2 and hVB22Bge sc (Fv) 2 using Dilferential Scanning Calonmetry (DS) (N-DS II, Applied Thermodynamics) Tm values (denaturation intermediate temperature) of -wz4 sc (Fv) 2 and hVB22B q-wz5 sc (Fv) 2 were measured.
  • DS Dilferential Scanning Calonmetry
  • N-DS II Applied Thermodynamics
  • Each sc (Fv) 2 is sufficiently dialyzed against 20 mM sodium quenate and 300 mM sodium chloride (pH 7.0), adjusted to a concentration of 44.4 ug / mL, and scanned at a scanning speed of 1 ° C / min using DSC. The denaturation curve was measured, and the Tm value was calculated using the attached analysis software.
  • hVB22B ge sc (Fv) 2 has improved Tm value by 13.3 ° C by modifying amino acid to improve stability hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2, and hVB22B has improved Tm value by 15.5 ° C q-wz5 sc (Fv) 2 was obtained.
  • Tm value of sc (Fv) 2 there is no report on the Tm value of sc (Fv) 2
  • the present inventors performed sc (Fv) 2 Tm value by amino acid modification without inhibiting the function of the antibody. We have succeeded in significantly improving
  • Example 4 Change in stability of sc (Fv) 2 by introduction of site-specific mutation
  • sc (Fv) 2 was dialyzed sufficiently against 20 mM sodium quenate and 300 mM sodium chloride (pH 7.5), and adjusted to a concentration of 0.1 mg / mL, and a thermal acceleration test was performed. The thermal acceleration conditions are as shown on the horizontal axis in the figure below.
  • the area of the monomer was measured by gel filtration chromatography (SEC), and the stability of sc (Fv) 2 was evaluated by the change over time in the residual monomer ratio under each thermal acceleration condition.
  • the monomer residual ratio was calculated by “SEC monomer area of thermally accelerated sample / SEC monomer area of initial state sample ⁇ 100”. In the thermal acceleration test, the improvement in the residual monomer ratio means that the stability has been improved.
  • sc (Fv) 2 does not show the stability effect in the same amino acid modification in spite of the amino acid modification reported for scFv. Listed are amino acid modifications.
  • H37 Ile ⁇ Val (hVB22B ve sc (Fv) 2 base sequence is SEQ ID NO: 7
  • amino acid sequence is SEQ ID NO: 8
  • ⁇ hVB22B pe sc (Fv) 2 base sequence is SEQ ID NO: 9
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 10), Fig. 5
  • VH of humanized VB22B is classified into the VH1 subclass, and H37 is located at the VH / VL interface that plays an important role in stability (J. Mol. Biol. 2001, 305, 989-1010). Since H37 is a cano-carlo residue of VH1 subclass, VH / VL interface was stabilized by changing H37 from lie to Val, and stability was considered to improve. In fact, in non-patent literature (J. Immunol. Methods, 2003, 275, 31-40), the stability is improved by changing H37 from Met to the cano-carl residue Val. However, the sc (Fv) 2 was also unstable in the reverse direction (Fig. 5).
  • VH of humanized VB22B is classified into the VH1 subclass and classified as typelll according to the structural classification in non-patent literature (J. Mol. Biol. 2001, March 09, 687-699).
  • the canonical residue of H9 in VH1 is Ala, and according to non-patent literature (J. Mol. Biol. 2001, 309, 701-716), in all combinations, H9 is more Ala or Gly than Pro. Stable to be stable I'm crazy. Therefore, it was considered that the stability of HVB22B q-wz sc (Fv) 2 was changed by changing H9 from Pro to Ala, which is a typelll cano-caryl residue. However, in the sc (Fv) 2, it became a component that it was unstable instead (Fig. 6).
  • L8 is a sequence site where the cisproline structure is highly conserved, and the presence of the cisproline structure is known to greatly contribute to stability (J. Mol. Biol. 2001, 305, 989-1010).
  • scFv L8 is Pro It has been reported that the case is stabilized. Since hVB22B pz sc (Fv) 2 was modified by amino acid to Pro because L8 was Ala, a stable effect was seen (Fig. 9).
  • L45 is located in a charge core that is stabilized by charge interactions existing inside the antibody, and it has been reported that this charge core affects stability in scFv (J. Mol. Biol. 2003, 325, 531-553). However, there is no report that directly shows the effect on the stability of L43 and L45. Thus, when L43 and L45 of hVB22B q-wz sc (Fv) 2 were altered to Ala and Arg, respectively, a stable effect was observed (FIG. 11).
  • L36 is a force located at the VH / VL interface. So far, the effect on the stability of scFv has not been studied. L36 is all subclasses and the cano-carl residue is Tyr. However, since there is no hydrogen bonding partner for the hydroxyl group of Tyr in L36 and the inner hydroxyl group that cannot form hydrogen bonds contributes to instability, amino acid modification was performed from Tyr to Phe. The stability effect was seen by changing to Phe (Fig. 12).
  • L70 is a force located on the surface of the molecule. So far, the effect on the stability of scFv has not been investigated. The stability was improved by changing Ala of L70 to Asp.
  • H81 Gln ⁇ Glu [hVB22B ia sc (Fv) 2 base sequence is SEQ ID NO: 25, amino acid sequence is SEQ ID NO: 26) ⁇ hVB22B ga sc (Fv) 2 (base sequence is SEQ ID NO: 15, amino acid sequence is SEQ ID NO: 16), Fig. 15] or H81 Arg ⁇ Glu [hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 (base sequence is SEQ ID NO: 3, amino acid sequence is SEQ ID NO: 4) ⁇ hVB22B q-wz4 sc (Fv) 2 (base sequence is SEQ ID NO: 33, amino acid sequence is SEQ ID NO: 34), FIG. 16)
  • H81 is an amino acid exposed on the surface, and no effect on stability has been reported for scFv.
  • non-patent literature J. Mol. Biol. 2003, 325, 531-553
  • non-patent literature Biochemistry, 2003, 42, 1517-1528
  • the stability is improved by modifying the amino acid so that it becomes a VH3 subclass cano-carol residue. It is.
  • the stability of sc (Fv) 2 was improved by changing Hin to Glu, which is a VH3 subclass cano-carol residue.
  • Amino acids forming the VH / VL interface of hVB22B u2-wz4 sc (Fv) 2 (hereinafter referred to as u2-wz4, the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 4) used in Example 4 Gin 39 of VH (position 39 in the amino acid sequence described in WO2005 / 56604: position 39 in amino acid sequence described in 289) and 38th position of VL (position 43 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 291 in WO2005 / 56604)
  • the Gin was modified as follows.
  • u2-wz4 is linked by the amino acid linker sequence (GlyGlyGlyGlySer) x3 (SEQ ID NO: 37) in the order of [VH1] linker [VL2] linker [VH3] linker [VL4].
  • GlyGlyGlyGlySer amino acid linker sequence
  • SEQ ID NO: 37 amino acid linker sequence in the order of [VH1] linker [VL2] linker [VH3] linker [VL4].
  • the 39th Gin (gene codon CAG) of VH1 is Glu (gene codon GAG)
  • the 38th Gin (gene codon CAG) of VL2 is Glu (gene codon GAG)
  • G1 n (gene codon CAG) is changed to Lys (gene codon AAG)
  • 38th Gin of VL4 (gene codon CAG) is changed to Lys (gene codon AAG) hVB22B u2- wz4 (vl) sc (Fv) 2
  • vl the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 38
  • the amino acid sequence is SEQ ID NO: 39.
  • the 39th Gin of VH1 (gene codon CAG) is Glu (gene codon GAG)
  • the 38th Gin of VL2 (gene codon CAG) is Lys (gene codon AAG)
  • the 39th Gin of VH3 (gene codon).
  • v3 and G3 The gene hVB22B u2- wz4 (v3) sc (Fv) 2 (hereinafter referred to as v3 and G3) is modified by changing the codon CAG) to Lys (gene codon AAG) and the 38th Gin of VL4 (gene codon CAG) to Glu (gene codon GAG).
  • SEQ ID NO: 40 for nucleotide sequence SEQ ID NO: 40 for amino acid sequence : 41) was produced.
  • a point mutation was introduced using QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (manufactured by STRA TAGENE) according to the manufacturer's protocol.
  • the DNA fragment was cloned into the expression vector pCXND3 to construct an expression vector, and the gene was introduced into CHO-DG44 cells to produce a stable expression cell line. Specifically, 0.75 mL of CHO-DG44 cells (1 X 107 cells / mL) suspended in PBS mixed with an expression vector (20 / zg) was cooled on ice for 10 minutes and transferred to a cuvette. Later, a pulse was applied using a Gene Pulser Xcell (BioRad) at a capacity of 1.5 kV and 25 ⁇ FD.
  • BioRad Gene Pulser Xcell
  • CHO-S-SFMII medium Invitrogen
  • Geneticin Invitrogen
  • VH / VL interface modified sc (Fv) 2 is attached with a Flag tag! /, N! /, And so on, purification from the culture supernatant is an epitope recognized by VB22B sc (Fv) 2.
  • a certain MG10 (Gin 213 to Ala231 of human Mpl amino acid sequence) and GST fusion protein were used.
  • the MG10 and GST fusion protein was purified using Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol.
  • purified MG10 and GST fusion protein was immobilized on HiTrap NHS-activated HP (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's protocol to produce an affinity column.
  • the culture supernatant of vl-expressing CHO cell line or v3-expressing CHO cell line is applied to MG10-GST fusion protein fixed column, adsorbed vl or v3, and eluted with 100 mM Glycine-HCl (pH 3.5), 0.01% Tween80 I let you.
  • the eluted fraction was immediately neutralized with 1 M Tris-HCl (pH 7.4), and subjected to gel filtration chromatography using HiLoad 16/60 Superdex200pg (manufactured by Amersham Biosciences) to purify the monomer molecule.
  • Tm value intermediate denaturation temperature
  • Solution conditions 20 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, pH 7.0
  • Solution conditions 20 mM sodium citrate, pH 6.0
  • VH / VL interface control for obtaining a single-chain antibody of a target structure
  • a method of controlling the structure of a bispecific diabody using knobs-into-hole technology (Protein Sci. 1997 Apr; 6 (4 ): 781-8, Remodeling domain intenaces to enhance heterodimer rormation., Zhu Z, Presta LG, Zapata G, Carter P.).
  • the rate of formation of the target heterodimer structure increased to 72% by 92% by modifying a total of 4 amino acids per VH / VL interface.
  • the present invention succeeded in obtaining a target structure at a ratio of 100% without altering the thermal stability and the stability of structural isomers by modifying four amino acids.
  • sc (Fv) 2 By introducing a site-specific mutation into sc (Fv) 2, or by placing a specific amino acid at a specific site, the association reaction of sc (Fv) 2 is suppressed, and sc (F Fv) 2 can be present in the monomer state.
  • sc (F Fv) 2 In order to develop antibodies as pharmaceuticals, it is necessary to stably present each antibody molecule and to minimize the association reaction during drug storage.
  • the introduction of the site-specific mutation of the present invention can stabilize the sc (Fv) 2 and suppress the association reaction at the production stage and storage stage of the sc (Fv) 2, and therefore, the low molecular weight antibody preparation It is considered that it will be very useful when manufacturing the stencil.
  • the pharmaceutical composition containing sc (Fv) 2 stabilized by the method of the present invention suppresses the modification and association of antibody molecules, it is compared with conventional sc (Fv) 2 preparations. Therefore, the decrease in activity due to the association is suppressed, and it is expected to maintain the high activity.

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Abstract

　本発明者らは、上記の課題を解決するために、sc(Fv)2に部位特異的変異を導入し、sc(Fv)2の安定化効果について検討を行った。その結果、本発明により初めてアミノ酸置換によりsc(Fv)2のTm値を大幅に向上させることに成功した。また、sc(Fv)2に部位特異的変異を導入することにより、sc(Fv)2が安定化することを見出した。

Description

sc(Fv)2部位特異的変異体
技術分野
[0001] 本発明は、低分子化抗体である sc(Fv)2の部位特異的変異体、およびその利用に 関する。
背景技術
[0002] バイオ医薬品の製剤化においては、機能を保持した安定なタンパク質の開発、製 造、および保存条件の設定が重要視されている。
タンパク質は遺伝情報を扱う DNAとは化学的性質が異なり、その構造は柔軟である 力 逆の意味では不安定とも言える。タンパク質は生理的条件下においても常に天 然の構造と崩れた構造 (変性構造)との平衡状態にある。
[0003] 一般にタンパク質の劣化していく経路としては、可溶性の多量体の形成や沈殿'不 溶物の生成等のタンパク質分子の物理的会合ィ匕に伴う劣化経路 (非特許文献 1)と、 加水分解 ·脱アミド化反応 ·メチォニン酸ィヒ反応等による化学的修飾による劣化経路 (非特許文献 2)が知られている。医薬品としてタンパク質を開発するにあたっては、こ れら両方の劣化経路を最小限に抑え、保存中にそのタンパク質の生物学的活性の 低下が起こらな ヽ製剤を提供する必要がある。このような劣化経路を最小限に抑制 する方法として、溶液 pHの最適化、緩衝液'塩の種類と濃度の最適化、または、安定 ィ匕剤の種類と濃度の最適化が行われる。
[0004] 医薬品として使用可能な抗体には、全長抗体、断片化抗体、低分子化抗体等が知 られて 、る。抗体分子 2分子間でモノマー Zダイマーの平衡反応が起こって 、ること は既に報告されており、抗体の IgG分子では、モノマーとダイマーが可逆的な平衡状 態として存在して 、ることが報告されて 、る (非特許文献 3)。一般に低分子化抗体を 含む抗体分子は会合化しやすぐ安定性が非常に低いことが知られている (非特許 文献 4)。抗体製剤を製造する場合には、非常に高濃度下で抗体の活性を示すモノ マーの状態に保つ必要があり、そのため、抗体を医薬品として開発するに当たって は、安定性を確保した抗体の製剤化が大きな課題であると考えられてきた。 [0005] 医薬品としての安定性を確保したタンパク質医薬の開発に当たっては、上述のよう な製剤条件を最適化することによってタンパク質の安定性を高める方法と、目的のタ ンパク質の一次配列に人為的にアミノ酸変異を導入することでタンパク質本来の安 定性を増強させる方法がある。ある配列既知のタンパク質に対してアミノ酸変異により タンパク質の安定性を向上させる方法に関してはこれまで様々な方法が報告されて いる（非特許文献 5, 6, 7)。抗体分子においては、 VH-VLの一本鎖抗体である scFv を用いた研究により、 scFvにおいて安定性に大きく影響する残基の位置 (箇所)、及 び、その箇所における安定なアミノ酸残基が報告されている（非特許文献 8, 9, 10, 11)。実際にこのような方法に従って、 scFv分子に関してはアミノ酸改変により安定性 を向上させた報告は複数存在する (非特許文献 12, 13, 14)。
[0006] 低分子化した抗体分子としては Fab、 Fv、 scFv、 sc(Fv)2等が知られている。同じ全 長 IgGを断片化した抗体分子である Fvと Fabにおいても、 Fabは CH1と CLの存在により Fvとは異なる安定性を有することが分かっている。 scFvにおいても同様で、 scFvにお Vヽては CH1と CLが存在しな!、ことにより Fabにお!/、ては表面に露出しな!、疎水性アミ ノ酸が表面に露出することで熱安定性が低下し、その残基を親水性アミノ酸に置換 することで熱加速試験時の安定性が向上することが報告されて ヽる (非特許文献 7)。 すなわち、同じ低分子化した抗体分子である scFvと Fabにお 、て安定性に影響する 残基の位置 (箇所)および安定な残基は異なって 、る。そのため sc(Fv)2の安定性に 影響を与えるアミノ酸部位やアミノ酸は、現在までに報告されて 、る scFvの安定性に 影響を与えるアミノ酸部位やアミノ酸とは必ずしも一致しな 、と考えられる。これまで s c(Fv)2分子において安定性に影響する残基の位置 (箇所)および安定な残基に関す る報告はなぐまた sc(Fv)2においては、アミノ酸の部位特異的な変異の導入により、 s c(Fv)2の安定性を高める検討はこれまで行われていな力つた。
[0007] 非特許文献 1 : Int. J. Pharm. 2005, 289, 1-30
非特許文献 2 : Int. J. Pharm. 1999, 185, 129-188
非特許文献 3 : Biochemistry, 1999, 38, 13960-13967
非特許文献 4 : FEBS Letters Volume 360, Issue 3 , 1995, 247-250
非特許文献 5 : Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13, 333-337 非特許文献 6 : J. Biotechnology, 2004, 113, 105-120
非特許文献 7 : Microbiol Mol Biol Rev. 2001, 65(1), 1-43
非特許文献 8 : J. Mol. Biol. 2003, 325, 531-553
非特許文献 9 : J. Mol. Biol. 2001, 305, 989-1010
非特許文献 10 : Methods, 2004, 184-199
非特許文献 11 : Protein Eng. 1997, 10(4), 435-44
非特許文献 12 biochemistry, 2003, 42, 1517-1528
非特許文献 13 : Int. J. Cancer, 2003, 107, 822-829
非特許文献 14 : Protein Engineering, 1997, 10(12), 1453-1459
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、 sc(Fv)2に部位 特異的変異を導入する工程を含む、 sc(Fv)2を安定化させる方法、または sc(Fv)2分 子間の会合を抑制する方法を提供することにある。また、部位特異的変異を導入す ることにより安定ィ匕された sc(Fv)2を提供することを課題とする。また、 sc(Fv)2の安定性 に影響する部位に特定のアミノ酸を配置することにより、 sc(Fv)2を安定ィ匕することを 課題とする。また、本発明は Tm値が上昇した sc(Fv)2を提供することを課題とする。さ らに、安定化された sc(Fv)2を含有する医薬組成物、該医薬組成物の製造方法、およ び該医薬組成物を含むキットを提供することも課題とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、 sc(Fv)2に部位特異的変異を導入し 、 sc(Fv)2の安定ィ匕効果について検討を行った。
まず、本発明者らは、 Differential Scanning Calorimetry(DSC)を用いて、ヒト化 VB22 B sc(Fv)2部位特異的変異体の Tm値測定を行った。その結果、 hVB22B g-e sc(Fv)2 に安定性を向上させるアミノ酸改変を行うことによって Tmが 13.3°C上昇した hVB22B u 2-wz4 sc(Fv)2、及び、 Tmが 15.5°C向上した hVB22B q_wz5が得られた（図 4)。これま でに sc(Fv)2の Tm値に関する報告はなぐまた sc(Fv)2のアミノ酸改変により Tm値を向 上させた報告はない。 [0010] 次に、 sc(Fv)2部位特異的変異体の熱加速試験を行い、ゲルろ過クロマトグラフィー (SEC)分析によりモノマーの面積を測定することで算出される熱加速後のモノマー残 存率の経時的な変化により、各 sc(Fv)2部位特異的変異体の安定性を評価した。 その結果、 sc(Fv)2にお 、て安定ィ匕効果が認められるアミノ酸改変を見出した（図 9 〜17、 21〜23)。
即ち、本発明者らは、本発明により初めてアミノ酸改変により sc(Fv)2の Tm値を大幅 に向上させることに成功した。また、 sc(Fv)2に部位特異的変異を導入することにより、 sc(Fv)2が安定ィ匕することを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
[0011] 本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔13〕を提供するものである。
〔1〕 sc(Fv)2に部位特異的変異を導入する工程を含む、 sc(Fv)2を安定化させる方法 〔2〕 sc(Fv)2に部位特異的変異を導入する工程を含む、 sc(Fv)2間の会合を抑制する 方法
〔3〕 sc(Fv)2に部位特異的変異を導入する工程を含む、 sc(Fv)2の Tm値を 10°C以上 上昇させる方法
〔4〕部位特異的変異の導入が、以下の (a)〜(k)力 選択される少なくとも一つのァミノ 酸に変異を導入するものである、〔1〕〜〔3〕の 、ずれかに記載の方法
(a)重鎖 48番目のアミノ酸
(b)重鎖 65番目のアミノ酸
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸
(D軽鎖 43番目のアミノ酸
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸
(0重鎖 81番目のアミノ酸
(j)重鎖 39番目のアミノ酸
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸
〔5〕部位特異的変異の導入が、以下の (a)〜(k)力 選択される少なくとも一つのァミノ 酸変異を導入するものである、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の方法
(a)重鎖 48番目のアミノ酸をイソロイシンへ置換
(b)重鎖 65番目のアミノ酸をグリシンへ置換
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸をセリンへ置換
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸をプロリンへ置換
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸をフ -ルァラニンへ置換
(D軽鎖 43番目のアミノ酸をァラニンへ置換
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸をアルギニンへ置換
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸をァスパラギン酸へ置換
(0重鎖 81番目のアミノ酸をグルタミンへ置換
(j)重鎖 39番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンへ置換
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンへ置換
〔6〕以下の 、ずれかの方法により sc(Fv)2を安定ィ匕する方法
(a)重鎖 48番目のアミノ酸をイソロイシンにする方法
(b)重鎖 65番目のアミノ酸をグリシンにする方法
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸をセリンにする方法
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸をプロリンにする方法
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸をフ -ルァラニンにする方法
(D軽鎖 43番目のアミノ酸をァラニンにする方法
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸をアルギニンにする方法
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸をァスパラギン酸にする方法
(0重鎖 81番目のアミノ酸をグルタミンにする方法
(j)重鎖 39番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンにする方法
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンにする方法
〔7〕以下の (a)〜(k)力 選択される少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入された sc(Fv
)2
(a)重鎖 48番目のアミノ酸
(b)重鎖 65番目のアミノ酸 (c)軽鎖 7番目のアミノ酸
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸
(D軽鎖 43番目のアミノ酸
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸
(0重鎖 81番目のアミノ酸
(j)重鎖 39番目のアミノ酸
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸
〔8〕以下の (a)〜(k)力 選択される少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入された sc(Fv )2
(a)重鎖 48番目のアミノ酸をイソロイシンへ置換
(b)重鎖 65番目のアミノ酸をグリシンへ置換
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸をセリンへ置換
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸をプロリンへ置換
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸をフ -ルァラニンへ置換
(D軽鎖 43番目のアミノ酸をァラニンへ置換
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸をアルギニンへ置換
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸をァスパラギン酸へ置換
(0重鎖 81番目のアミノ酸をグルタミンへ置換
(j)重鎖 39番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンへ置換
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンへ置換
〔9〕以下の (a)〜(k)力 選択される sc(Fv)2
(a)重鎖 48番目のアミノ酸がイソロイシンである sc(Fv)2
(b)重鎖 65番目のアミノ酸がグリシンである sc(Fv)2
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸がセリンである sc(Fv)2
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸がプロリンである sc(Fv)2
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸がフ -ルァラニンである sc(Fv)2 (D軽鎖 43番目のアミノ酸がァラニンである sc(Fv)2
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸がアルギニンである sc(Fv)2
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸がァスパラギン酸である sc(Fv)2
(i)重鎖 81番目のアミノ酸がグルタミンである sc(Fv)2
(j)重鎖 39番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンにする方法
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンにする方法
〔10〕 Tm値が 55°C以上である sc(Fv)2
〔11〕部位特異的なアミノ酸変異の導入により、導入前と比較して Tm値が 10°C以上 上昇した sc(Fv)2
〔12〕〔7〕〜〔11〕のいずれか〖こ記載の sc(Fv)2を含有する医薬組成物
〔13〕以下の（1)および (2)の工程を含む、〔12〕に記載の医薬組成物の製造方法
(1)〔1〕〜〔5〕のいずれかに記載の部位特異的変異を sc(Fv)2に導入する工程
(2)医薬的に許容される担体を混合する工程
図面の簡単な説明
[図 l]BaF- human Mplを用いた hVB22B g-e sc(Fv)2のァゴ-スト活性評価の結果を示 す図である。
[図 2]BaF- human Mplを用いた hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2のァゴ-スト活性評価の結果 を示す図である。
[図 3]BaF- human Mplを用いた hVB22B q-wz5 sc(Fv)2のァゴ-スト活性評価の結果 を示す図である。
[図 4]hVB22B g-e sc(Fv)2及び該 sc(Fv)2の部位特異的変異体の Tm値を示す図であ る。
[図 5]sc(Fv)2中の重鎖 37番目の lieを Valに置換した際の、モノマー残存率の変化を 示す図である。
[図 6]sc(Fv)2中の重鎖 9番目の Proを Alaに置換した際の、モノマー残存率の変化を 示す図である。
[図 7]sc(Fv)2中の重鎖 9番目の Proを Serに置換した際の、モノマー残存率の変化を 示す図である。 [図 8]sc(Fv)2中の軽鎖 37番目の Leuを Ginに置換した際の、モノマー残存率の変化を 示す図である。
[図 9]sc(Fv)2中の軽鎖 8番目の Alaを Proに置換した際の、モノマー残存率の変化を 示す図である。
[図 10]sc(Fv)2中の重鎖 65番目の Valを Glyに置換した際の、モノマー残存率の変化 を示す図である。
[図 l l]sc(Fv)2中の軽鎖 43番目の Serを Alaに、軽鎖 45番目の Ginを Argに置換した際 の、モノマー残存率の変化を示す図である。
[図 12]sc(Fv)2中の軽鎖 36番目の Tyrを Pheに置換した際の、モノマー残存率の変化 を示す図である。
[図 13]sc(Fv)2中の軽鎖 70番目の Alaを Aspに置換した際の、モノマー残存率の変化 を示す図である。
[図 14]sc(Fv)2中の軽鎖 7番目の Alaを Serに置換した際の、モノマー残存率の変化を 示す図である。
[図 15]sc(Fv)2中の重鎖 81番目の Ginを Gluに置換した際の、モノマー残存率の変化 を示す図である。
[図 16]sc(Fv)2中の重鎖 81番目の Argを Gluに置換した際の、モノマー残存率の変化 を示す図である。
[図 17]sc(Fv)2中の 48番目の Metを lieに置換した際の、モノマー残存率の変化を示 す図である。
圆 18]sc(Fv)2遺伝子の作製過程を示す図である。
[図 19-A]実施例で使用した sc(Fv)2の VHアミノ酸配列を示す図である。図中の一は、 g-eと同じアミノ酸配列であることを示して 、る。
[図 19-B] 19— Aの続きの配列を示す図である。
[図 20-A]実施例で使用した sc(Fv)2の VLアミノ酸配列を示す図である。図中の一は、 g-eと同じアミノ酸配列であることを示して 、る。
[図 20-B]2O— Aの続きの配列を示す図である。
[図 21]u2-wz4、改変体 vl、改変体 v3のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示す。 [図 22]u2- wz4精製 peakl、 u2- wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の DSC分析の結 果を示す。
[図 23]u2-wz4精製 peakl、 u2-wz4精製 peak2、改変体 vl、改変体 v3の熱加速試験に おけるゲルろ過クロマトグラフィー分析の結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明者らは、部位特異的変異を導入することによって sc(Fv)2の安定性が向上す ることを見出した。本発明者らはさらに、特定の部位に特定のアミノ酸を配置すること によって sc(Fv)2の安定性が向上することを見出した。本発明は、これら知見に基づく ものである。
[0014] 本発明は、 sc(Fv)2に部位特異的変異を導入する工程を含む、 sc(Fv)2を安定化さ せる方法に関する。
本発明の方法におけるアミノ酸残基の「改変」または「変異の導入」とは、具体的に は、元（改変前）のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基 を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること等を指すが、好ましくは、元のァ ミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することを指す。本発明で 、う元 (改変前)のァ ミノ酸配列は、天然由来の配列を元のアミノ酸配列としてもよいし、既にアミノ酸置換 、ヒト化などが行われた配列を元のアミノ酸配列としてもよい。なお、本明細書におい ては、アミノ酸残基の「改変」と「変異の導入」は同一の意味で用いられる。
[0015] 本発明において、アミノ酸残基の「変異の導入」は、 sc(Fv)2をコードする DNAを改変 することによって行うことが出来る。
本発明において、 sc(Fv)2の重鎖 (または軽鎖）に変異を導入する場合、 sc(Fv)2〖こ 含まれる 2つの重鎖の両方 (または 2つの軽鎖の両方）に変異を導入してもよいし、片 方の重鎖 (または軽鎖）のみに変異を導入してもよ 、。
[0016] 本発明にお 、て「DNAを改変する」とは、本発明における「変異の導入」によって導 入されるアミノ酸残基に対応するように DNAを改変することを言う。より具体的には、 元のアミノ酸残基をコードする DNAについて、改変によって導入されるアミノ酸残基を コードする DNAへ改変することを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコードするコドンと なるように、元の DNAに対して、少なくとも 1塩基を挿入、欠失または置換するような遺 伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコードす るコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換され る。このような DNAの改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的 変異誘発法、 PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能である。
[0017] 本発明において、部位特異的変異が導入される部位は特に限定されず、 sc(Fv)2の 如何なる部位でもよいが、好ましくは、以下の (a)〜(k)のいずれかの部位である。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸
(b)重鎖 65番目のアミノ酸
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸
(D軽鎖 43番目のアミノ酸
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸
(0重鎖 81番目のアミノ酸
(j)重鎖 39番目のアミノ酸
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸
[0018] 置換後のアミノ酸は特に限定されず、如何なるアミノ酸に置換されてもよいが、好ま L ヽ置換後のアミノ酸の例としては、以下のアミノ酸を挙げることができる。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸:イソロイシン
(b)重鎖 65番目のアミノ酸：グリシン
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸：セリン
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸:プロリン
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸：フ -ルァラニン
(D軽鎖 43番目のアミノ酸：ァラニン
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸：アルギニン
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸:ァスパラギン酸
(0重鎖 81番目のアミノ酸：グルタミン (j)重鎖 39番目のアミノ酸:グルタミン酸またはリジン
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸:グルタミン酸またはリジン
[0019] さらに、本発明は sc(Fv)2中の特定の部位に特定のアミノ酸を配置することにより sc( Fv)2を安定ィ匕する方法に関する。より具体的には、以下のいずれかの方法により sc(F v)2を安定ィ匕する方法に関する。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸をイソロイシンにする方法
(b)重鎖 65番目のアミノ酸をグリシンにする方法
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸をセリンにする方法
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸をプロリンにする方法
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸をフ -ルァラニンにする方法
(D軽鎖 43番目のアミノ酸をァラニンにする方法
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸をアルギニンにする方法
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸をァスパラギン酸にする方法
(0重鎖 81番目のアミノ酸をグルタミンにする方法
(j)重鎖 39番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンにする方法
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンにする方法
[0020] 本発明において、 sc(Fv)2とは、 2つの重鎖可変領域（[VH] )及び 2つの軽鎖可変領 域（[VL] )をリンカ一等で結合して一本鎖ポリペプチドにした抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Methods 1999 ; 231 : 177- 189)。 sc(Fv)2は、例えば、 2つの scFv (シング ノレチェイン Fv) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879—5 883、 Pluckthun「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies J Vol.113, Resenburg 及び Moore編， Springer Verlag, New York, pp.269- 315, (1994))をリンカ一等で結合 すること〖こより作製することが可能である。リンカ一としては、遺伝子工学により導入し 得る任意のペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一、例えば、 Protein Engineerin g, 9(3), 299-305, 1996に開示されるリンカ一等を用いることができる力 本発明にお いてはペプチドリンカ一が好ましい。ペプチドリンカ一の長さは特に限定されず、 目的 に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、 1〜100アミノ酸、好ましく は 5〜30アミノ酸、特に好ましくは 12〜18アミノ酸 (例えば、 15アミノ酸)である。 [0021] 結合される 2つの重鎖可変領域と 2つの軽鎖可変領域の順序は特に限定されず、ど のような順序で並べられていてもよぐ例えば、以下のような配置を挙げることができる
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [ VH]リンカ一 [ VL]
[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
[VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]
[VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VH]
[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]
本発明においては、好ましくは、 [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL]の 配置を有する sc(Fv)2である。
[0022] ペプチドリンカ一のアミノ酸配列としては、例えば、以下のような配列を挙げることが できる。
ber
uiySer
uiyuiyber
ber'GiyGly
Gly · GlyGly · Ser (配列番号： 42)
Ser · Gly · Gly · Gly (配列番号： 43)
Gly · Gly Gly · Gly Ser (配列番号： 44)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 45)
Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号： 46)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 47)
Gly -GlyGly Gly -GlyGly Ser (配列番号： 48)
Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 49)
(Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号： 44))n
(Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号： 45))n
[nは 1以上の整数である] [0023] 合成化学物リンカ一 (ィ匕学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋 剤、例えば、 N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)、ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、 ビス（スルホスクシンィミジル)スべレート（BS3)、ジチォビス（スクシンィミジルプロピオ ネート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、ェチレ ングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スル ホスクシンィミジルスクシネート）（スルホー EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST) 、ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩 (スルホー DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカ ルポ-ルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシ カルボ-ルォキシ）ェチル]スルホン（スルホー BSOCOES)などであり、これらの架橋 剤は市販されている。
4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、 3つのリンカ一が必要となる力 全 て同じリンカ一を用いてもょ 、し、異なるリンカ一を用いてもょ 、。
[0024] 重鎖可変領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び Z又は 挿入されていてもよい。さらに、重鎖可変領域と軽鎖可変領域を会合させた場合に、 抗原結合活性を有する限り、一部を欠損させてもよいし、他のポリペプチドを付加し てもよい。又、可変領域はヒト化されていてもよい。
[0025] あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知 られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、 当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、 Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500、 K ramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456、 Kramer W, and Fritz HJ( 1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、 Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)などを用いて、本発 明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製す ることができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発 明の抗体のアミノ酸配列にぉ 、て 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を 有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
[0026] 変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、 30アミノ酸以内であり、好ましく は 15アミノ酸以内であり、さらに好ましくは 5アミノ酸以内（例えば、 3アミノ酸以内）であ ると考えられる。変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されて いる別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、 疎水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有 するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及 びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R 、 K、 H)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧 内は!、ずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個 のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミ ノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られて いる（Mark, D. F. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662—5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487—6500、 Wang, A. et al, Science 224, 1431-1433、 Dalbadie - McFarland, G. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. US A (1982) 79, 6409-6413) oまた、抗体の定常領域などのアミノ酸配列は当業者に公 知である。
[0027] キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例え ば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる 抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗 体 V領域をコードする DNAとヒト抗体 C領域をコードする DNAとを連結し、これを発現 ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
[0028] ヒト化抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region)を ヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法 も知られている（欧州特許出願公開番号 EP 125023号公報、 WO 96/02576号公報 参照)。
[0029] 具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region;
FR)とを連結するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域にオーバ 一ラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして 用いて PCR法により合成する (W098/13388号公報に記載の方法を参照)。
[0030] CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好 な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補 性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレ ームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.etal., CancerRes. (1993) 53, 851 -856)。
[0031] キメラ抗体及びヒト化抗体の定常領域には、通常、ヒト抗体のものが使用され、例え ば H鎖では、 C γ 1、 C γ 2、 C γ 3、 C γ 4を、 L鎖では C κ、 C λを使用することができる
一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来 の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性 決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域および定常領域とからなる。
[0032] なお、キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域 (例えば、 FR)や定常領域 中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもょ 、。
キメラ抗体における可変領域、又はヒト化抗体における CDRの由来は特に限定され ず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ラタ ダ抗体などの配列を用いることが可能である。
[0033] 本発明に使用する sc(Fv)2は、ポリエチレングリコール (PEG)、放射性物質、トキシン 等の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよ 、。このようなコンジュゲート抗体 は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の 修飾方法はこの分野にぉ 、てすでに確立されて 、る。本発明における sc(Fv)2にはこ れらのコンジュゲート抗体も包含される。
[0034] 又、本発明に使用する sc(Fv)2は二種特異性抗体 (bispecific antibody)でもよ!/、（例 えば、 Journal of Immunology, 1994, 152, 5368-5374、など）。 bispecific antibodyは異 なる二種の抗原を認識してもよ ヽし、同一抗原上の異なるェピトープを認識してもよ い。
また本発明の sc(Fv)2は、その N末端あるいは C末端に IgGの Fc部分等の別のタンパ ク質を融合してもよい（Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281)。融合するタ ンパク質は当業者が適宜選択することができる。
[0035] 上述の sc(Fv)2は当業者に公知の方法により製造することができる。具体的には、 目 的とする sc(Fv)2の DNAを発現ベクターへ組み込む。その際、発現制御領域、例えば 、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む
。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができ る。その際には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。 ベクターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript、 pC R-Scriptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクローユング、切り出しを目的とした場 合、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM- T、 pDIRECT、 pT7などが挙げられる。
[0036] 抗体を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクター が有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は 、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主を JM109、 DH5 «、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現 できるようなプロモーター、例えば、 lacZプロモーター（Wardら， Nature (1989) 341, 54 4-546 ;FASEB J. (1992) 6, 2422- 2427)、 araBプロモーター（Betterら， Science (1988) 240, 1041-1043 )、または T7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。こ のようなベクターとしては、上記ベクターの他に PGEX-5X-1 (Pharmacia社製）、「QIAe xpress system] (QIAGEN社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリ メラーゼを発現して 、る BL21が好まし 、；)などが挙げられる。
[0037] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれて!/、てもよ!/ヽ 。ポリペプチド分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生さ せる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379 )を使用 すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩ィ匕カルシウム法、エレクト口 ポレーシヨン法を用いて行うことができる。
[0038] 大腸菌以外にも、例えば、本発明のポリペプチドを製造するためのベクターとして は、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (Invitrogen社製）や、 pEGF- BO S (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、 pEF、 pCDM8)、昆虫細胞由来の発現べ クタ一（例えば「Bac— to— BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL社製）、 p BacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の 発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、レトロウイルス由来の発現ベクター (例えば、 pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Inv itrogen社製）、 pNVll、 SP- Q01)、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、 pPL608、 pK ΤΗ50)が挙げられる。
[0039] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には 、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（Mulliga nら， Nature (1979) 277, 108)、 MMTV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモーター（Mizu shimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CAGプロモーター（Gene. (1991) 108, 193)、 CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換 を選抜するための遺伝子 (例えば、薬剤 (ネオマイシン、 G418など）により判別できる ような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクター としては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK- RSV、 pBK- CMV、 pOPRSV、 pOP13などが挙 げられる。
[0040] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を 目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺 伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート (MTX)により 増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、 S V40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点 を持つベクター (pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、 また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由来の ものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現べ クタ一は選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、チミジ ンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラー ゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。
[0041] 本発明において「安定ィ匕する」とは、変異による会合化 (aggregation)を抑制するこ とをいう。会合化の抑制は、会合を完全に抑制する必要はなぐ会合化の程度や割 合を減少させるだけでもよい。本発明において会合は、可逆的会合でも不可逆的会 合でもよい。
本発明にお 、て「会合化」とは、時間の経過により起こる sc(Fv)2の会合ィ匕であって もよ 、し、宿主細胞中で sc(Fv)2が生産される過程または宿主細胞力も分泌される過 程における会合ィ匕であってもよい。また、 sc(Fv)2の活性低下の抑制、または非天然 状態への移行の抑制も、本発明の「安定化」と同等の意味を示すものとする。
[0042] 安定ィ匕した力否かは当業者に公知の方法によって測定することが可能であり、例え ば、会合ィ匕が抑制されたか否かは実施例に記載の方法により測定することが可能で ある。又、当業者に公知の方法、例えば、沈降平衡法 (超遠心法)、浸透圧法、光散 乱法、低角レーザー光散乱法、 X線小角散乱法、中性子小角散乱法、またはゲルろ 過法等により抗体分子の会合度 (会合率)を測定することで行うことが出来る。
抗体分子の会合度（会合率）の測定する方法としては、 SEC (Size Exclusion Chrom atography:サイズ排除クロマトグラフィー）を用いて行う方法が挙げられる力 これらの 方法に限定されるものではない。
[0043] タンパク質の溶液中における安定性を示す指標として、 Tm値が知られて ヽる。一般 にタンパク質は高温ほど不安定であり、タンパク質に熱をかけていくと、ある温度から 変性および会合ィ匕が始まり、ある温度においてタンパク質は完全に変性あるいは会 合化する。 Tm値はこのような変化の中間温度のことであり、一般に Differential Scanni ng Calorimetry(DSC)や温度依存的な CDスペクトルの変化等の光学分析によって測 定可能である。タンパク質を医薬品として開発するに当たっては Tm値の高い製剤条 件を選択することで安定性の高 、製剤を作製できることが知られて 、る (Pharm Res. 1998 Feb;15(2):200-8) oそのため、アミノ酸改変により Tm値が高くなるような変異体 を作製することによって、より医薬品製剤としての開発が容易になると考えられる。
[0044] このようなことから、本発明において sc(Fv)2分子の Tm値が上昇した場合にも、 sc(Fv )2が安定ィ匕したものとみなすことが出来る。従って、本発明は、 sc(Fv)2に部位特異的 変異を導入する工程を含む、 sc(Fv)2の Tm値を 10°C以上上昇させる方法に関する。
Tm値が上昇したカゝ否かはアミノ酸改変前の Tm値とアミノ酸改変後の Tm値を比較 することにより調べることが可能である。 Tm値の上昇は、アミノ酸改変後の Tm値がアミ ノ酸改変前の Tm値よりも高くなつている限り特に限定されないが、好ましくは 10°C以 上の上昇であり、さらに好ましくは 13°C以上の上昇であり、特に好ましくは 15°C以上 の上昇である。なお、 Tm値の上限は特に限定されないが、一般的には 150°C程度で ある。
[0045] Tm値は当業者に公知の方法により測定することが可能であり、例えば実施例に記 載の方法により測定することが可能である。
Tm値を上昇させる為に改変するアミノ酸の数は特に限定されず、単一のアミノ酸を 改変してもよいし、複数のアミノ酸を改変してもよい。
[0046] 本発明において sc(Fv)2の安定化は、一時的に sc(Fv)2分子が安定化されるもので あってもよぐまたある一定期間の後、最終的に sc(Fv)2分子が安定ィ匕されるものであ つてもよい。すなわち、一時的に sc(Fv)2組成物としての活性を維持させるものでもよく 、また一定期間の後、最終的に sc(Fv)2分子の活性を維持させるものであってもよい。
[0047] 本発明にお ヽて活性は、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、ァゴニスト活性、ァ ンタゴ-スト活性、酵素活性など、いかなる活性でもよぐ特に限定されないが、結合 活性またはァゴ-スト活性が好まし 、。
ァゴ-スト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグ ナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理 的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、 結合活性、タンパク質分解活性、リン酸ィ匕 Z脱リン酸ィ匕活性、酸化還元活性、転移 活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性、などを 挙げることができる力 これらに限定されるわけではない。
[0048] 本発明にお ヽて抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよ!/ヽ。抗原の例として は、例えば、受容体、癌抗原、 MHC抗原、分化抗原、などを挙げることができる。受 容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイト力イン受容体ファミリー 、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン Zスレオニンキナーゼ型受容体ファミリ 一、 TNF受容体ファミリー、 Gタンパク質共役型受容体ファミリー、 GPIアンカー型受容 体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモ ン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。 [0049] 上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスェ リスロポェチン (EPO)受容体、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)受容 体、ヒト又はマウストロンボポイエチン (TPO)受容体、ヒト又はマウスインスリン受容体、 ヒト又はマウス Flt-3リガンド受容体、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子 (PDGF)受 容体、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN) - a、 j8受容体、ヒト又はマウスレプチン受 容体、ヒト又はマウス成長ホルモン (GH)受容体、ヒト又はマウスインターロイキン (IL) -10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子 (IGF) -I受容体、ヒト又はマウス白血 病抑制因子 (LIF)受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子 (CNTF)受容体等を ί列示することができる。
[0050] 癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれ る。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌 抗原となり、特に癌糖鎖抗原と呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、 CA19-9、 CA 15-3、シリアル SSEA-l(SLX)などを挙げることができる。
[0051] MHC抗原には、 MHC class I抗原と MHC class II抗原に大別され、 MHC class I抗 原には、 HLA- Α,- Β,- C，- Ε,- F，- G，- Hが含まれ、 MHC class II抗原には、 HLA- DR,- DQ，- DPが含まれる。
[0052] 分化抗原には、
CDl,CD2,CD3,CD4,CD5,CD6,CD7,CD8,CD10,CDlla,CDllb,CDllc,CD13,CD14
,CD15s,CD16,CD18,CD19,CD20,CD21,CD23,CD25,CD28,CD29,CD30,CD32,CD3
3,CD34,CD35,CD38,CD40,CD41a,CD41b,CD42a,CD42b,CD43,CD44,CD45,CD45
RO,CD48,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD49e,CD49f,CD51,CD54,CD55,CD56,C
D57,CD58,CD61,CD62E,CD62L,CD62P,CD64,CD69,CD71,CD73,CD95,CD102,C
D106,CDl22,CDl26,CDwl30などが含まれる。
[0053] 活性の変化を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び Z又は質的な変化 が測定可能である限り使用することができる。例えば、無細胞系 (cell free assay)の指 標、細胞系 (ceU-based assay)の指標、糸且織系の指標、生体系の指標を用いることが できる。
[0054] 無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、 DNA、 RNAの量的及び Z又は 質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖 転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タ ンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、 DNA、 RNAの 増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在する タンパク質のリン酸ィ匕を検出指標とすることができる。
[0055] 細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び Z又 は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用い ることができる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、 m RNA等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び Z又は突起の数の 変化、偏平度の変化、伸長度 Z縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変 ィ匕、細胞集団としての異形性 Z均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。こ れらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、 足場依存性、サイト力イン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細 胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性として は、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、 酵素活性、 mRNA量、 Ca2+や cAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質 量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって 誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。
[0056] 組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることがで きる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変 ィ匕、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、 血圧、心拍数の変化等を用いることができる。
これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなぐ吸光、発光、発色、蛍 光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量 、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動、等を用いることができる。これ らの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて、適宜選択することがで きる。
[0057] 例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発 光はルミノメータ等、蛍光はフルォロメータ等で測定することができる。質量は質量分 析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウ ンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度は BEACON (宝酒造）、表面プラズモン 共鳴シグナルは BIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などは ARVO などにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。こ れらの測定方法は、一つの測定方法で 2種以上の検出指標を測定しても良ぐ簡便 であれば、 2種以上の測定を同時及び Z又は連続して測定することによりさらに多数 の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を 同時にフルォロメータで測定することができる。
[0058] 本発明において、ァゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可 能である。例えば、実施例に記載のように細胞増殖を指標にァゴ-スト活性を測定す る方法により判定することが可能である。より具体的には、ァゴニスト依存性増殖を示 す細胞に、ァゴニスト活性を測定したい抗体を添加し、培養する。その後、 WST-8の ような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光 度を測定し、得られた吸光度を指標にァゴニスト活性を測定することが可能である。
[0059] ァゴ-スト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能 であり、例えば、抗原が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容 体を発現している細胞を用いればよい。又、抗原が細胞増殖シグナルを出さない受 容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖 シグナルを出さな ヽ受容体の細胞外領域からなるキメラ受容体を作製し、該キメラ受 容体を細胞で発現させればよ!ヽ。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、 例えば、 G- CSF受容体、 mpl、 neu、 GM- CSF受容体、 EPO受容体、 c-kit、 FLT-3等を 挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、 BaF3、 NFS60、 FDC P-l、 FDCP-2、 CTLL-2、 DA-1、 KT-3等を挙げることができる。
[0060] 本発明は部位特異的変異の導入された sc(Fv)2に関する。
本発明において、部位特異的変異が導入される部位は特に限定されず、 sc(Fv)2の 如何なる部位でもよいが、好ましくは、以下の (a)〜(k)のいずれかの部位である。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸 (b)重鎖 65番目のアミノ酸
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸
(D軽鎖 43番目のアミノ酸
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸
(0重鎖 81番目のアミノ酸
(j)重鎖 39番目のアミノ酸
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸
[0061] 置換後のアミノ酸は特に限定されず、如何なるアミノ酸に置換されてもよいが、好ま L ヽ置換後のアミノ酸の例としては、以下のアミノ酸を挙げることができる。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸:イソロイシン
(b)重鎖 65番目のアミノ酸：グリシン
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸：セリン
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸:プロリン
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸：フ -ルァラニン
(D軽鎖 43番目のアミノ酸：ァラニン
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸：アルギニン
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸:ァスパラギン酸
(0重鎖 81番目のアミノ酸：グルタミン
(j)重鎖 39番目のアミノ酸:グルタミン酸またはリジン
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸:グルタミン酸またはリジン
[0062] 従って、本発明の sc(Fv)2の好ましい態様としては、以下のいずれかの sc(Fv)2を挙 げることができる。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
(b)重鎖 65番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2 (d)軽鎖 8番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
(D軽鎖 43番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
(i)重鎖 81番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
(j)重鎖 39番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸が置換された sc(Fv)2
[0063] さらに、本発明のさらに好ましい態様としては、以下のいずれかの sc(Fv)2を挙げる ことができる。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸がイソロイシンに置換された sc(Fv)2
(b)重鎖 65番目のアミノ酸がグリシンに置換された sc(Fv)2
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸がセリンに置換された sc(Fv)2
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸がプロリンに置換された sc(Fv)2
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸がフ -ルァラニンに置換された sc(Fv)2
(D軽鎖 43番目のアミノ酸がァラニンに置換された sc(Fv)2
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸がアルギニンに置換された sc(Fv)2
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸がァスパラギン酸に置換された sc(Fv)2
(i)重鎖 81番目のアミノ酸がグルタミンに置換された sc(Fv)2
(j)重鎖 39番目のアミノ酸がグルタミン酸またはリジンに置換された sc(Fv)2
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸がグルタミン酸またはリジンに置換された sc(Fv)2
[0064] さらに本発明は、 sc(Fv)2の安定性に影響を与える部位に特定のアミノ酸を配置した sc(Fv)2に関する。具体的には以下のいずれかの sc(Fv)2に関する。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸がイソロイシンである sc(Fv)2
(b)重鎖 65番目のアミノ酸がグリシンである sc(Fv)2
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸がセリンである sc(Fv)2
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸がプロリンである sc(Fv)2
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸がフ -ルァラニンである sc(Fv)2 (D軽鎖 43番目のアミノ酸がァラニンである sc(Fv)2
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸がアルギニンである sc(Fv)2
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸がァスパラギン酸である sc(Fv)2
(i)重鎖 81番目のアミノ酸がグルタミンである sc(Fv)2
(j)重鎖 39番目のアミノ酸がグルタミン酸またはリジンである sc(Fv)2
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸がグルタミン酸またはリジンである sc(Fv)2
[0065] 発明ははさらに高い Tm値を有する sc(Fv)2に関する。
本発明において高い Tm値とは、 Tm値が 55°C以上であり、好ましくは 60°C以上であ り、さらに好ましくは 65°C以上のことをいう。
又、本発明は、部位特異的なアミノ酸変異の導入によって、変異の導入前よりも Tm 値が 10°C以上、好ましくは 13°C以上、さらに好ましくは 15°C以上上昇した sc(Fv)2を提 供する。
なお、本発明で使用される Tm値は、実施例記載の条件と同一の条件で測定された 場合の Tm値である。
[0066] 本発明の sc(Fv)2は、安定化や会合抑制などの優れた性質を有するので、医薬組 成物として用いるのに適している。又、本発明の sc(Fv)2は如何なる sc(Fv)2でもよぐ 特に限定されないが、医薬組成物として用いる場合には、人に対する抗原性などの 点からヒトイ匕されて 、ることが好まし 、。
[0067] 本発明は、本発明の sc(Fv)2を含有する医薬組成物に関する。さらに、該医薬組成 物、および薬学的に許容される担体を含むキットに関する。
本発明の医薬組成物およびキットには、薬学的に許容される担体が含まれてもよい 。薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形 剤、酸化防止剤 (ァスコルビン酸等)、緩衝剤 (リン酸、クェン酸、他の有機酸等)、防腐 剤、界面活性剤 (PEG、 Tween等)、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げることがで きる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロ ブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニン及びリシン等のァ ミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マン-トールやソルビトール等の糖アル コールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、 D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マン-トール、塩ィ匕ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール ( エタノール等)、ポリアルコール (プロピレングリコール、 PEG等)、非イオン性界面活性 剤 (ポリソルベート 80、 HCO- 50)等と併用してもよい。
[0068] また、必要に応じ、マイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ^ チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシス テム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及びナノ力 プセノレ等)とすることもできる ( Remington s Pharmaceutical Science 1り edition , Osl o Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明 に適用し得る (Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 1981, 15: 167—277; Langer, Chem . Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481 号； Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547—556 ？第133,988号)。
[0069] 患者への投与は経口、非経口投与の!/、ずれでも可能である力 好ましくは非経口 投与である。本発明の医薬組成物の形態 (剤型)としては、特に制限はなぐ注射剤 型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与剤型、凍結乾燥剤型、溶液剤型など が挙げられるが、好ましくは凍結乾燥剤型を挙げることができる。
[0070] 凍結乾燥は、当業者に周知の方法によって実施できる（Pharm Biotechnol, 2002, 1 3, 109-33、 Int J Pharm. 2000, 203(1-2), 1-60、 Pharm Res. 1997, 14(8), 969-75)。 例えば、溶液を凍結乾燥に用いるバイアル等の容器に適当量分注し、凍結庫または 凍結乾燥庫中にて行なうか、またはアセトン Zドライアイス、液体窒素などの冷媒中 に浸漬して行なう。
また、抗体製剤を高濃度溶液製剤にする場合は、当業者に周知の方法によって実 施できる。例えば、非特許文献 (J. Pharm.Sc, 2004, 93(6), 1390-1402)に記載されて V、るように、通常 TFF膜を利用した膜濃縮法が用いられる。
[0071] 注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注 射などにより全身または局部的に投与することができる。また、患者の年齢、症状によ つて適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回につき体 重 lkgあたり 0.0001 mgから 1000 mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例え ば、患者あたり 0.001〜100000 mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができる。しかし ながら、本発明はこれらの投与量および投与方法等に制限されるものではない。
[0072] 本発明は、（1)部位特異的変異を sc(Fv)2に導入する工程、および (2)医薬的に許 容される担体を混合する工程を含む、 sc(Fv)2を含有する医薬組成物の製造方法に 関する。
医薬的に許容される担体は上記に記載のものを挙げることができる。
なお、本発明において使用されるアミノ酸部位のナンバーリングは、 Kabatらの方法 ( Kabat EA et ai. 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH) 用 、る なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に 組み入れられる。
実施例
[0073] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
〔実施例 1〕ヒト化抗ヒト Mpl抗体 sc(Fv)2の作製
マウス抗ヒト Mpl抗体 VB22Bの相補性抗原決定領域（以下、 CDR)を相同性の高 、ヒ ト抗体フレームワーク領域 (以下、 FR)に移植したヒト化 VB22Bの可変領域遺伝子を作 製し、続いて H鎖可変領域と L鎖可変領域カ^ンカ一にて連結されたヒト化 VB22B sc( Fv)2を以下の方法で作製した。ヒト化 VB22B sc(Fv)2遺伝子の構築過程について図 1 8に示した。
[0074] はじめに、ヒト化 VB22B可変領域遺伝子をアッセンブル PCR法により合成した。具体 的には、 50base程度の合成オリゴ DNAを約 20base程度ハイブリダィズするように設計 し、これらの合成オリゴ DNAを PCR法により連結し、各可変領域をコードする遺伝子を 作製した。次に、ヒト化 VB22Bの H鎖可変領域をコードする遺伝子の 3，末端とヒト化 V B22Bの L鎖可変領域をコードする遺伝子の 5'末端との間に、 15アミノ酸力も成るリン カー（Gly Ser)をコードする塩基配列が位置するように、アッセンブル PCR法を用い
4 3
て作製した。この構築過程において、 H鎖の 5'末端に EcoRI部位を有し、 H鎖 22番目 および H鎖 23番目のアミノ酸をコードする塩基配列が PvuII部位に変換するように設計 した。また、 L鎖の 3'末端に Notl部位と必要に応じて FLAG配列をコードする塩基配 列を有するように一本鎖ヒト化抗体遺伝子を作製した。続いて、この一本鎖ヒト化抗体 遺伝子の PvuII部位に挿入する断片を作製した。すなわち N末端が欠けた H鎖可変領 域と L鎖可変領域を (Gly Ser)力も成るリンカ一で連結し、さらに H鎖可変領域の N末
4 3
端をコードする遺伝子と (Gly Ser)から成るリンカ一をコードする塩基配列で連結する
4 3
断片で、両末端が PvuII認識配列となる断片をコードする遺伝子である。この遺伝子 断片を PvuIIで消化した後に、上述した一本鎖ヒト化抗体遺伝子の PvuII部位に挿入し てヒト化抗体 sc(Fv)2遺伝子を作製した。部位特異的なアミノ酸変異の導入につ！、て は、 QuikChange Site-Direct Mutagenesis Kit(Stratagene社製)を使用し、メーカーの プロトコールに従って実施した。完成した各 sc(Fv)2遺伝子を発現ベクター pCXND3に クロー-ングした。本明細書で使用した sc(Fv)2の VHアミノ酸配列、 VLアミノ酸配列を 図 19— A、 B、図 20— A、 Bに示した。
[0075] 発現ベクターをエレクト口ポレーシヨン法により CHO- DG44細胞に遺伝子導入し、 50 0 μ g/mL Geneticin (Invitrogen社製）を含む CHO- S- SFMII培地（Invitrogen社製）に 加えて選抜し、発現 CHO細胞株を榭立した。この安定発現細胞株の培養上清を調 製し、 50 mM Tris- HCKpH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05 % Tween20で平衡化した Anti- F lag M2 Affinity Gel (SIGMA-ALDRICH社製)カラムまたは FLAGタグが付カ卩していな い sc(Fv)2についてはェピトープである MG10 (ヒト Mplの Gln213から Ala231力 成る 19 merのペプチドと GSTとの融合蛋白質）を固定化したカラムに吸着させ、 100 mM Glyci ne-HCl(pH 3.5)で溶出させた。溶出画分は、直ちに 1M Tris-HCl (pH 8.0)で中和を 行い、 HiLoad 26/60 Superdex200pg (Amersham- Bioscience社製)カラムを用いてゲ ルろ過クロマトグラフィーを行った。
[0076] 〔実施例 2〕ヒト化 VB22B sc(Fv)2部位特異的変異体の TPO様ァゴ-スト活性評価
TPO依存性増殖を示す BaF- human Mpl細胞を用いて、抗 Mpl抗体のヒト化 sc(Fv)2 である WB22B g-e sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 1、アミノ酸配列は配列番号: 2)及 び hVB22Bg-e sc(Fv)2に部位特異的変異を導入した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 (塩基 配列は配列番号: 3、アミノ酸配列は配列番号: 4)、 hVB22B q-wz5 sc(Fv)2 (塩基配 列は配列番号： 5、アミノ酸配列は配列番号： 6)の TPO様ァゴ-スト活性を評価した。 細胞を 1 % Fetal Bovine Serum(Invitrogen社製)を含む RPMI1640 (Invitrogen社製)で 2 回洗浄した後、 4xl05cells/mLとなるように 10 % Fetal Bovine Serumを含む RPMI 1640 に懸濁し、 60 μ L/wellで 96well plateに分注した。 rhTPO (R&D社製)、精製品サンプ ルの濃度を振り、各 wellに 40 Lカ卩え、 37°C、 5 %CO条件下で、 24時間培養した。 10
2
μ L/wellで WST- 8試薬（Cell Count Reagent SF、ナカライテスタ社製）をカ卩え、直後 に Benchmark Plusを用いて 450 nmの吸光度 (対照 655 nm)を測定し、 2時間培養後に 、再度 450 nmの吸光度 (対照 655 nm)を測定した。 WST-8試薬は生細胞数に応じて 4 50 nmの発色反応を呈することから、 2時間の吸光度変化を指標に TPO様ァゴニスト 活性を評価した。
その結果、図 1、 2、 3に示すとおり、ヒト化 VB22B sc(Fv)2部位特異的変異体は変異 導入前の hVB22B g-e sc(Fv)2およびマウス VB22B sc(Fv)2と同等の活性を示した。
[0077] 〔実施例 3〕ヒト化 VB22B sc(Fv)2部位特異的変異体の Tm値測定
Dilferential Scanning Calonmetry(DSし) (N— DSし II, Applied Thermodynamics社製) を用いて、 hVB22B g-e sc(Fv)2及び hVB22Bg- e sc(Fv)2に部位特異的変異を導入し た hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2、 hVB22B q- wz5 sc(Fv)2の Tm値（変性中間温度）の測定 を行った。各 sc(Fv)2を 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM塩化ナトリウム（pH 7.0)に 対して十分に透析後、 44.4 ug/mLの濃度に揃え、 DSCを用い scanning speed l°C/mi nで変性曲線を測定し、付属の解析ソフトにより Tm値を算出した。
[0078] その結果、図 4に示すような DSCカーブが得られ、 hVB22B g-e sc(Fv)2の Tm値が 53 •4。C、 hVB22B u2- wz4 sc(Fv)2の Tm値が 66.7。C、 hVB22B q- wz5 sc(Fv)2の Tm値が 6 8.9°Cであった。 hVB22B g-e sc(Fv)2に安定性を向上させるアミノ酸改変を行うことに よって Tm値が 13.3°C上昇した hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2、及び、 Tm値が 15.5°C向上し た hVB22B q-wz5 sc(Fv)2が得られた。これまでに sc(Fv)2の Tm値に関する報告はな ぐまた sc(Fv)2のアミノ酸改変により Tm値を向上させた報告はない。実施例 2に示し たとおり、アミノ酸改変前後のァゴ-スト活性は同等であることから、本発明者らは、抗 体の機能を阻害することなぐアミノ酸改変により sc(Fv)2の Tm値を大幅に向上させる ことに成功した。
[0079] 〔実施例 4〕部位特異的変異の導入による sc(Fv)2の安定性の変化 各 sc(Fv)2を 20 mMクェン酸ナトリウム、 300 mM塩化ナトリウム（pH 7.5)に対して十 分に透析後、 0.1 mg/mLの濃度に揃え、熱加速試験を実施した。熱加速条件は以下 の図の横軸に示すとおりである。ゲルろ過クロマトグラフィー（SEC)によりモノマーの 面積を測定し、各熱加速条件におけるモノマー残存率の経時的な変化により sc(Fv)2 の安定性を評価した。
モノマー残存率は、「熱加速サンプルの SECモノマー面積 /初期状態サンプルの S ECモノマー面積 X 100」によって計算した。熱加速試験により、モノマー残存率が向 上したことはすなわち安定性が向上したことを意味する。
[0080] 以下に、 scFvにて安定ィ匕効果が報告されているアミノ酸改変にも関わらず、同様の アミノ酸改変において sc(Fv)2では安定ィ匕効果が認められず、逆に不安定ィ匕したアミ ノ酸改変を挙げる。
(1) H37 Ile→Val [hVB22B v-e sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 7、アミノ酸配列は配 列番号: 8)→ hVB22B p-e sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号: 9、アミノ酸配列は配列番 号： 10)、図 5〕
ヒト化 VB22Bの VHは VH1サブクラスに分類され、 H37は安定性に重要な役割を果た す VH/VL界面に位置する（J. Mol. Biol. 2001, 305, 989-1010)。 H37は Valが VH1サ ブクラスのカノ-カル残基であることから、 H37を lieから Valに改変することで VH/VL界 面が安定化され、安定性が向上すると考えられた。実際、非特許文献 (J. Immunol. Methods, 2003, 275, 31-40)において、 H37を Metからカノ-カル残基の Valに改変す ることで安定性を向上させている。し力しながら、 sc(Fv)2においては逆に不安定する ことが分力つた（図 5)。
[0081] (2) H9 Pro→Ala[hVB22B q-wz sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 11、アミノ酸配列は 配列番号： 12)→ hVB22B q2-wz sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 13、アミノ酸配列 は配列番号： 14)、図 6〕
ヒト化 VB22Bの VHは VH1サブクラスに分類され、非特許文献 (J. Mol. Biol. 2001, 3 09, 687-699)における構造分類によると typelllに分類される。 VH1における H9のカノ 二カル残基は Alaであり、非特許文献 (J. Mol. Biol. 2001, 309, 701-716)によると、全 ての組み合わせにおいて H9は Proよりも Ala若しくは Glyのほうが安定であることが分 かっている。そこで、 hVB22B q-wz sc(Fv)2の H9を Proから typelllのカノ-カル残基で ある Alaに改変することで安定ィ匕すると考えられた。し力しながら、 sc(Fv)2においては 逆に不安定することが分力つた（図 6)。
[0082] (3) H9 Pro→Ser [hVB22B g-a sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号：15、アミノ酸配列は配 列番号： 16) → hVB22B h-a sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 17、アミノ酸配列は配列 番号： 18)、図 7〕
非特許文献（Protein Eng. 1997, 10(4),435-444)によると、 scFvにおいて V/C界面 に疎水性アミノ酸を親水性に改変することによって熱安定性が上昇することが報告さ れている。 H9は V/C界面に位置していることから、疎水性アミノ酸の Proから親水性ァ ミノ酸の Serに置換することでを安定ィ匕すると考えられた。し力しながら、 sc(Fv)2にお V、ては逆に不安定することが分力つた（図 7)。
[0083] (4) L37 Leu→Gln [hVB22B q-wz3 sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 19、アミノ酸配列 は配列番号： 20) → hVB22B q-wz sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 11、アミノ酸配列 は配列番号： 12)、図 8〕
非特許文献（J. Mol. Biol. 2003, 325, 531-553)において、 VLドメイン内の salt- brid geが安定性に重要であり、 L45が Leuの場合、側鎖 側鎖間の水素結合が作られず 不安定化することが示されている。 hVB22B q-wz3 sc(Fv)2の L37は水素結合が形成 されな 、Leuであることから、 L37を Ginに改変することで水素結合ネットワークが形成 され安定化すると考えられた。し力しながら、 sc(Fv)2においては逆に不安定すること が分力つた（図 8)。
[0084] 次に、 scFvにて安定ィ匕効果が報告されているアミノ酸改変で、 sc(Fv)2においても安 定ィ匕効果があることを見出したアミノ酸改変を挙げる。
(5) L8 Ala→Pro [hVB22B p-z sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 21、アミノ酸配列は配 列番号： 22) → hVB22B p-wz sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 23、アミノ酸配列は配 列番号: 24)、図 9〕
L8はシスプロリン構造が高度に保存された配列箇所であり、シスプロリン構造の存 在は安定性に大きく寄与することが知られている（J. Mol. Biol. 2001, 305, 989-1010 )。実際、非特許文献 (J. Mol. Biol. 1998, 283, 395-407)において、 scFvの L8が Pro の場合に安定化されることが報告されている。 hVB22B p-z sc(Fv)2は L8が Alaであつ たため Proにアミノ酸改変したところ、安定ィ匕効果が見られた（図 9)。
[0085] (6) H65 Val→Gly [hVB22B g-a sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 15、アミノ酸配列は 配列番号： 16) → hVB22B j-a sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号: 27、アミノ酸配列は配 列番号: 28)、図 10〕
抗体の構造上、 H65は positive φ angleで保存されていることが知られており、 H65は positive φ angleを取ることができる Glyが安定であることが報告されている（J. Mol. Biol . 2001, 305, 989-1010)。実際に、非特許文献（Biochemistry, 2003, 42(6), 1517-152 8)において、 scFvの H65を Serから Glyにすることで安定化することが報告されている。 hVB22B g-a sc(Fv)2は H65が Valであったため Glyに改変したところ、安定化効果が見 られた（図 10)。
[0086] (7) L43 Ser→Ala, L45 Gln→Arg [hVB22B q- wz sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 11、 アミノ酸配列は配列番号： 12) → hVB22B q-wz5 sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 5、 アミノ酸配列は配列番号： 6)、図 11〕
L45は抗体の内部に存在する電荷的相互作用により安定ィ匕されたコア (charge core )に位置し、 scFvにおいてこの charge coreは安定性に影響を及ぼすことが報告されて いる（J. Mol. Biol. 2003, 325, 531-553)。ただし L43と L45の 2箇所の安定性に及ぼす 影響を直接示した報告はない。そこで、 hVB22B q-wz sc(Fv)2の L43, L45をそれぞれ Ala, Argに改変したところ、安定ィ匕効果が見られた（図 11)。
[0087] さらに、 scFvにおいては安定ィ匕効果が報告されておらず、 sc(Fv)2において安定ィ匕 効果があることを見出したアミノ酸改変を挙げる。
(8) L36 Tyr→Phe [hVB22B p-w sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 29、アミノ酸配列は 配列番号： 30) → hVB22B p-wz sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 23、アミノ酸配列は 配列番号: 24)、図 12〕
L36は VH/VL界面に位置する力 これまで scFvにお 、ても安定性に及ぼす影響は 検討されていない箇所である。 L36は全サブクラスでカノ-カル残基は Tyrである。し 力しながら L36の Tyrの水酸基の水素結合相手が存在せず、水素結合が出来ない内 部の水酸基は不安定ィ匕に寄与することから、 Tyrから Pheにアミノ酸改変を実施した。 Pheに改変することで安定ィ匕効果が見られた（図 12)。
[0088] (9) L70 Ala→Asp [hVB22B q-wz sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 11、アミノ酸配列は 配列番号： 12)→ hVB22B q-wz2 sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 35、アミノ酸配列 は配列番号: 36)、図 13〕
L70は分子表面に位置する力 これまで scFvにおいても安定性に及ぼす影響は検 討されていない箇所である。 L70の Alaを Aspに改変することで安定性が向上した。
[0089] (10) L7 Ala→Ser [hVB22B i-a sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 25、アミノ酸配列は 配列番号： 26)→ hVB22B i-e sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 31、アミノ酸配列は配 列番号: 32)、図 14〕
L7は分子表面に位置するがこれまで scFvにおいても安定性に及ぼす影響は検討 されていない箇所である。 L7の Alaを Serに改変することで安定性が向上した。
[0090] (11) H81 Gln→Glu [hVB22B i-a sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 25、アミノ酸配列は 配列番号: 26)→ hVB22B g-a sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 15、アミノ酸配列は配 列番号： 16)、図 15〕or H81 Arg→Glu [hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 (塩基配列は配列番 号： 3、アミノ酸配列は配列番号: 4)→ hVB22B q-wz4 sc(Fv)2 (塩基配列は配列番 号: 33、アミノ酸配列は配列番号: 34)、図 16〕
H81は表面に露出しているアミノ酸で、 scFvにおいてもこれまで安定性への影響の 報告がない。非特許文献 (J. Mol. Biol. 2003, 325, 531-553)において、 VH1サブクラ スに比べて、 VH3サブクラスのほうが安定性が高ぐ非特許文献（Biochemistry, 2003, 42, 1517-1528)において scFvを用いた検討では、 VH3サブクラスのカノ-カル残基 になるようにアミノ酸を改変することによって安定性が向上することが報告されており、 H81の VH3サブクラスのカノ-カル残基は Ginである。しかしながら、 sc(Fv)2では、 H81 を VH3サブクラスのカノ-カル残基である Ginを Gluに改変することで安定性が向上し た。
[0091] (12) H48 Met→Ile [hVB22B p-wz sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 23、アミノ酸配列 は配列番号： 24)→ hVB22B q-wz sc(Fv)2 (塩基配列は配列番号： 11、アミノ酸配列 は配列番号： 12)、図 17〕
H48は、 scFvにおいてもこれまで安定性への影響の報告がない。 VH1サブクラスの カノ-カル残基は Metである力 H48を Metから lieに改変することで安定性が向上した (図 17)。
[0092] 以上の結果より、 scFvでは安定性が向上することが報告されているアミノ酸改変は、 必ずしも sc(Fv)2においても安定ィ匕効果があるとは限らないことを見出した ((1)〜(4)の 変異体)。これは scFvと sc(Fv)2では全体の立体構造が大きく異なり、安定化に寄与 することができる配列箇所が scFvと sc(Fv)2で異なるためと考えられた。本発明者らは その中から、 sc(Fv)2においても安定性を向上させることができる配列箇所および安 定な配列を見出した ((5)〜 )の変異体)。さらに、 scFvにおいてもこれまで安定性へ の影響が報告されて 、な 、箇所にっ 、て sc(Fv)2のアミノ酸改変による効果を検討し た結果、新たに安定性を向上させる配列箇所を見出した ((8)〜(12)の変異体)。
[0093] 〔実施例 5〕 VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の作製
実施例 4において用いた hVB22B u2-wz4 sc(Fv)2 (以下、 u2-wz4と標記する、塩基 配列は配列番号： 3、アミノ酸配列は配列番号： 4)の VH/VL界面を形成するアミノ酸 である VHの 39番目（WO2005/56604の配列番号： 289に記載のアミノ酸配列における 39位）の Ginと VLの 38番目（WO2005/56604の配列番号： 291に記載のアミノ酸配列に おける 43位）の Ginを以下のようにして改変した。 u2-wz4は [VH1]リンカ一 [VL2]リン カー [VH3]リンカ一 [VL4]の順にアミノ酸リンカ一配列 (GlyGlyGlyGlySer)x3 (配列番 号: 37)で連結されており、配列番号： 3で記載した塩基配列で転写、翻訳される。は じめに、 VH1の 39番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に、 VL2 の 38番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に、 VH3の 39番目の G1 n (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VL4の 38番目の Gin (遺伝子コド ン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に改変した遺伝子 hVB22B u2- wz4(vl) sc(Fv)2 ( 以下 vlと標記する、塩基配列は配列番号: 38、アミノ酸配列は配列番号: 39)を作製 した。さらに、 VH1の 39番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に、 VL2の 38番目の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VH3の 39番目 の Gin (遺伝子コドン CAG)を Lys (遺伝子コドン AAG)に、 VL4の 38番目の Gin (遺伝子 コドン CAG)を Glu (遺伝子コドン GAG)に改変した遺伝子 hVB22B u2- wz4(v3) sc(Fv) 2 (以下 v3と標記する、配列番号:塩基配列は配列番号: 40、アミノ酸配列は配列番号 : 41)を作製した。遺伝子の改変は QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(STRA TAGENE社製)を用いてメーカーのプロトコールに従い、点突然変異を導入した。各 遺伝子の塩基配列を確認した後、 DNA断片を発現ベクター pCXND3にクローユング して発現ベクターを構築し、 CHO-DG44細胞に遺伝子導入することで、安定発現細 胞株を作製した。具体的には、発現ベクター（20 /z g)と PBSに懸濁した CHO-DG44細 胞（1 X 107細胞/ mL)の 0.75 mLを混合したものを氷上で 10分間冷却し、キュベットに 移した後に Gene Pulser Xcell (BioRad)を用いて 1.5kV、 25 μ FDの容量にてパルスを 与えた。室温にて 10分間の回復期間の後、エレクト口ポレーシヨン処理された細胞を 、 500 μ g/mL Geneticin (Invitrogen)を含む CHO- S- SFMII培地（Invitrogen)に加えて 選抜し、 vl産生 CHO細胞株および v3産生 CHO細胞株を榭立した。
VH/VL界面改変型 sc(Fv)2は Flagタグを付カ卩して!/、な!/、こと力ら、培養上清からの 精製は、 VB22B sc(Fv)2が認識するェピトープである MG10 (ヒト Mplアミノ酸配列の Gin 213から Ala231)と GST融合蛋白質を利用して行った。 MG10と GST融合蛋白質の精製 は、 Glutathione Sepharose 4B (Amersham Biosciences社製)を用いて、メーカーのプ ロトコールに従って精製した。さらに、精製した MG10と GST融合蛋白質をメーカーの プロトコールに従って、 HiTrap NHS- activated HP (Amersham Biosciences社製）に固 定化し、ァフィ二ティカラムを作製した。 vl発現 CHO細胞株または v3発現 CHO細胞 株の培養上清を MG10-GST融合蛋白質固定ィ匕カラムに流し、 vlまたは v3を吸着させ 、 100 mM Glycine-HCl(pH 3.5),0.01 % Tween80で溶出させた。溶出画分は直ちに 1 M Tris-HCl(pH 7.4)で中和を行い、 HiLoad 16/60 Superdex200pg (Amersham Biosci ences社製)を用いてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、モノマー分子を精製した。ゲ ルろ過クロマトグラフィーの緩衝液は、 20 mMクェン酸緩衝液（pH 7.5) , 300 mM NaC 1, 0.01 % Tween 80を使用した。図 21に示したゲルろ過クロマトグラフィーの結果から 、改変体 vl, v3は培養上清中でダイマー以上の凝集体が低下し、モノマー比率は改 変前の u2-wz4の 59 %と比較して、 vlが 89 %、 v3が 77 %と上昇していることが明らかに なった。改変体 vl, v3は VH/VL界面のアミノ酸を改変することにより、電荷的な反発 により好ましくない会合を阻害し、好ましい会合を促進したことが推測される。以上の ことからこの会合制御により、効率的なモノマー分子の発現に成功した。 [0095] 〔実施例 6〕 VH/VL界面改変型 sc(Fv)2の安定性評価
u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2、および、改変体 vlと改変体 v3の安定性評 価として、示走査型熱量測定（Differential Scanning Calorimetry)を用いて変性中間 温度 (Tm値)の測定を以下の条件下で行った。
DSC： N-DSCII (Applied Thermodynamics社製）
溶液条件： 20 mM sodium citrate, 300 mM NaCl, pH 7.0
タンパク質濃度: 0.1 mg/mL
スキャニング速度：1°C/分
各 DSC測定の結果を図 22に示した。 u2-wz4精製 peak2と改変体 vlの Tm値は未改 変体とほぼ同等であり、安定性は同等であることが分力つた。 u2-wz4精製 peaklと改 変体 v3とでは、若干改変体 v3のほうが低い安定性を示した。 knobs-into-hole技術を 用いた方法による界面制御においては、例えば IgGの CH3ドメインのヘテロ会合にお いて、未改変 CH3ドメインの Tm値が 80.4°Cであったのに対して、改変 CH3ドメインの T m値は 69.4°Cであり、大幅に Tm値が低下し安定性が低下してしまうことが報告されて いる。それに対して、本発明においては安定性を低下させること無く会合を制御でき ることが確認された。
[0096] 続いて、 u2-wz4精製 peaklと u2-wz4精製 peak2および VH/VL界面改変体である改 変体 vlと改変体 v3の安定性評価として、以下の条件における熱加速試験による安定 性評価を実施した。
<熱加速条件 >
溶液条件： 20 mM sodium citrate, pH 6.0
タンパク質濃度: 0.25 mg/mL
加速条件： 40°C-6day, 12day
熱加速サンプルは、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィ 一により以下の条件で分析した。
[0097] 図 23に示すとおり、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分析の結果、 u2-wz4精製 peak 2と改変体 vlのモノマー残存率はほぼ同等であり、会合ィヒに対する安定性はほぼ同 等であることが確認された。また、 u2-wz4精製 peaklと改変体 v3のモノマー残存率も モノマー残存率はほぼ同等であり、両構造異性体において会合ィヒに対する安定性 はほぼ同等であることが分かった。
[0098] 目的の構造の一本鎖抗体を得るための VH/VL界面制御としては、 knobs-into-hole 技術を用いて Bispecific diabodyの構造を制御する方法（Protein Sci. 1997 Apr;6(4): 781—8, Remodeling domain intenaces to enhance heterodimer rormation., Zhu Z, Pre sta LG, Zapata G, Carter P.)が知られている。この方法では、 VH/VL界面あたり合 計 4箇所のアミノ酸を改変することにより目的のへテロダイマー構造の形成率が 72 % 力も 92 %まで上昇したことを報告している。それに対して、本発明は 4箇所のアミノ酸 を改変することにより、熱安定性および構造異性体の安定性を低下させることなぐ目 的の構造を 100 %の比率で取得することに成功した。
産業上の利用可能性
[0099] sc(Fv)2に部位特異的変異を導入することにより、または特定の部位に特定のァミノ 酸を配置することにより、 sc(Fv)2の会合ィ匕反応を抑制し、 sc(Fv)2をモノマーの状態で 存在させることが可能となった。抗体を医薬品として開発するためには、それぞれの 抗体分子を安定に存在させ、製剤保存中の会合化反応を最小限に抑制することが 必要である。本発明の部位特異的変異の導入は、 sc(Fv)2の製造段階および保存段 階において sc(Fv)2を安定化させ会合ィ匕反応を抑制することができるため、低分子化 抗体製剤を製造する際には非常に有用なものとなると考えられる。
[0100] 本発明の方法により安定化された sc(Fv)2を含有する医薬組成物は、抗体分子の変 性、会合が抑制されているため、従来の sc(Fv)2製剤と比較して会合ィ匕による活性の 低下が抑制され、高 ヽ活性を維持して ヽることが期待される。

Claims

請求の範囲
[1] sc(Fv)2に部位特異的変異を導入する工程を含む、 sc(Fv)2を安定ィ匕させる方法。
[2] sc(Fv)2に部位特異的変異を導入する工程を含む、 sc(Fv)2間の会合を抑制する方法
[3] sc(Fv)2に部位特異的変異を導入する工程を含む、 sc(Fv)2の Tm値を 10°C以上上昇 させる方法。
[4] 部位特異的変異の導入が、以下の (a)〜(k)力 選択される少なくとも一つのアミノ酸 に変異を導入するものである、請求項 1〜3のいずれかに記載の方法。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸
(b)重鎖 65番目のアミノ酸
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸
(D軽鎖 43番目のアミノ酸
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸
(0重鎖 81番目のアミノ酸
(j)重鎖 39番目のアミノ酸
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸
[5] 部位特異的変異の導入が、以下の (a)〜(k)力 選択される少なくとも一つのアミノ酸 変異を導入するものである、請求項 1〜4のいずれかに記載の方法。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸をイソロイシンへ置換
(b)重鎖 65番目のアミノ酸をグリシンへ置換
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸をセリンへ置換
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸をプロリンへ置換
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸をフ 二ルァラニンへ置換
(D軽鎖 43番目のアミノ酸をァラニンへ置換
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸をアルギニンへ置換 (h)軽鎖 70番目のアミノ酸をァスパラギン酸へ置換
(0重鎖 81番目のアミノ酸をグルタミンへ置換
(j)重鎖 39番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンへ置換
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンへ置換
[6] 以下の 、ずれかの方法により sc(Fv)2を安定化する方法。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸をイソロイシンにする方法
(b)重鎖 65番目のアミノ酸をグリシンにする方法
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸をセリンにする方法
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸をプロリンにする方法
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸をフ -ルァラニンにする方法
(D軽鎖 43番目のアミノ酸をァラニンにする方法
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸をアルギニンにする方法
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸をァスパラギン酸にする方法
(0重鎖 81番目のアミノ酸をグルタミンにする方法
(j)重鎖 39番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンにする方法
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンにする方法
[7] 以下の (a)〜(k)力 選択される少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入された sc(Fv)2。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸
(b)重鎖 65番目のアミノ酸
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸
(D軽鎖 43番目のアミノ酸
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸
(0重鎖 81番目のアミノ酸
(j)重鎖 39番目のアミノ酸
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸
[8] 以下の (a)〜(k)力 選択される少なくとも一つのアミノ酸に変異が導入された sc(Fv)2。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸をイソロイシンへ置換
(b)重鎖 65番目のアミノ酸をグリシンへ置換
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸をセリンへ置換
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸をプロリンへ置換
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸をフ 二ルァラニンへ置換
(D軽鎖 43番目のアミノ酸をァラニンへ置換
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸をアルギニンへ置換
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸をァスパラギン酸へ置換
(0重鎖 81番目のアミノ酸をグルタミンへ置換
(j)重鎖 39番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンへ置換
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸をグルタミン酸またはリジンへ置換
[9] 以下の (a)〜(k)力 選択される sc(Fv)2。
(a)重鎖 48番目のアミノ酸がイソロイシンである sc(Fv)2
(b)重鎖 65番目のアミノ酸がグリシンである sc(Fv)2
(c)軽鎖 7番目のアミノ酸がセリンである sc(Fv)2
(d)軽鎖 8番目のアミノ酸がプロリンである sc(Fv)2
(e)軽鎖 36番目のアミノ酸がフ -ルァラニンである sc(Fv)2
(D軽鎖 43番目のアミノ酸がァラニンである sc(Fv)2
(g)軽鎖 45番目のアミノ酸がアルギニンである sc(Fv)2
(h)軽鎖 70番目のアミノ酸がァスパラギン酸である sc(Fv)2
(i)重鎖 81番目のアミノ酸がグルタミンである sc(Fv)2
(j)重鎖 39番目のアミノ酸がグルタミン酸またはリジンである sc(Fv)2
(k)軽鎖 38番目のアミノ酸がグルタミン酸またはリジンである sc(Fv)2
[10] Tm値が 55°C以上である sc(Fv)2。
[11] 部位特異的なアミノ酸変異の導入により、導入前と比較して Tm値が 10°C以上上昇し た sc(Fv)2。
[12] 請求項 7〜： L 1のいずれかに記載の sc(Fv)2を含有する医薬組成物。 以下の（1)および (2)の工程を含む、請求項 12に記載の医薬組成物の製造方法。
(1)請求項 1〜5のいずれかに記載の部位特異的変異を sc(Fv)2に導入する工程
(2)医薬的に許容される担体を混合する工程
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