WO2006095077A2 - Determination in vitro de la reactivite d'une entite sur un element fonctionnel tridimensionnel - Google Patents

Determination in vitro de la reactivite d'une entite sur un element fonctionnel tridimensionnel Download PDF

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WO2006095077A2
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François Berger
Philippe Clement
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining in vitro the reactivity of an entity of interest, for example biological, on a three-dimensional functional element, of the organ type, of a biological model, of the mammalian type.
  • the document WO 03/003162 describes an information system including in particular a database which comprises information relating to micro-samples of cells or tissue of a patient suffering from a neuropsychiatric dysfunction.
  • Tissue samples may be obtained from section, section or tissue fragments, or even cell suspensions obtained from tissue, for example, brain tissue or tissue representative of the entire body of the patient.
  • this document does not describe a system for analyzing a three-dimensional functional element.
  • the present invention relates to a method and a system for determining the reactivity of an entity of interest, for example biological, on a three-dimensional functional element.
  • the present invention therefore relates to a method for determining in vitro the reactivity of an entity of interest on a three-dimensional reference functional element.
  • in vitro is meant a process which occurs outside the biological model, in the laboratory, for example in an artificial environment, on a glass slide or in appropriate laboratory equipment.
  • in vitro is meant a process which occurs outside the biological model, in the laboratory, for example in an artificial environment, on a glass slide or in appropriate laboratory equipment.
  • Step (a) of this process consists in choosing and disposing of a reference biological model, of the higher living organism type chosen in the animal kingdom, including mammals.
  • biological model is meant any kind of living organism likely to be of any study interest.
  • the biological model is of the higher living organism type and consists of at least one selected representative in the animal kingdom.
  • the biological model is chosen from vertebrates and more particularly from the class of non-human mammals.
  • these are laboratory animals commonly used in animal experiments, for example mouse, rat, monkey. It can also be a human body, post mortem, for experimental purposes.
  • the biological model can be used to obtain additional knowledge about it directly, or it can provide a better understanding of the physiology of humans or animals and their diseases. .
  • Step (a) of the method also consists in generating or having reference documentation comprising information or data specific to said reference biological model.
  • a three-dimensional reference functional element (F) for example a reference model element, consisting of a functional element taken from a representative of the biological model, is chosen and provided. reference.
  • three-dimensional functional element means any kind of anatomical structure consisting of at least one tissue and likely to be of any study interest. According to the present invention, said functional element was taken from said biological model where it exerted a specific organic or physiological function, said sampling step not being covered by the method of the present invention.
  • the functional element is in three-dimensional form, ie in three geometric dimensions. It can in particular be an organ of the reference model. AT As an indication, it may be the brain, the liver, the spleen, the thymus of the biological model.
  • Step (b) of the method also consists in generating or disposing of an anatomical 3D representation of the three-dimensional reference functional element (F).
  • morphological imaging techniques in vitro or in vivo, also called anatomical imaging.
  • in vitro imaging imaging on the functional element as when taken from the representative of the biological model.
  • in vivo imaging imaging on the model itself before sampling of said functional element.
  • CT scan or the magnetic resonance imaging (MRI) technique is used to obtain three-dimensional images of a functional element. of the biological model. It is also possible, according to the present invention, to use an anatomical atlas which details the topography of the functional element.
  • anatomical boards with topographic diagrams and / or photographic shots of the anatomical structures identified in a given sectional plane (sagittal for example).
  • Each sectional plane is indexed with respect to reference anatomical structures defining a spatial reference in the functional element studied.
  • Each diagram includes a registration grid that allows the indexing of the samples taken in the cutting plane.
  • the photography allows a visual control of the samples.
  • the atlas can be in paper format or in a digital format, the latter making it possible with a pointing tool to optimize the reading and to automate the indexing of the samples in a 3D reconstruction system. It is also possible according to the present invention to have an anatomical 3D representation of the reference functional element, without the need to generate one.
  • the anatomical 3D representation of the functional element is positioned in a 3D coordinate system.
  • reference we mean all kinds of systems for locating a location in two dimensions (“2D”), or three dimensions (“3D”), to do a precision job, for example to locate an area in a space .
  • step (c) elementary zones (Z) of biological sampling are defined in the three-dimensional reference functional element (F).
  • "elementary zones of biological samples” means locations in a space or determined volume, identified by precise parameters of positioning in the space which will be the seat of the biological samples within the functional element.
  • the number (n) of zones is determined according to the size of said functional element or that of a part of interest within it.
  • n elementary zones in other words a set (E) of (n) elementary zones (Z).
  • the definition of such areas passes through a precise mesh of the functional element or the part of interest thereof.
  • a mesh is obtained by dividing the functional element into elementary zones. The mesh is generally operated under the control of a machine controlled by software. But it may not be fully automatic.
  • the functional element (F) is three-dimensional, so that the elementary zones according to the present invention are volumes. These zones are generally hexahedrons, for example cubes.
  • the dimensions of the elementary sampling zones depend essentially on the sampling tool and the accuracy thereof.
  • Step c) of the method also consists in generating and disposing of an index (I) of said (n) elementary zones (Z) of sampling in relation with the anatomical 3D representation positioned in the 3D coordinate system according to (b), said index (I) comprising (n) elementary information each comprising at least the 3D coordinates of each elementary zone in the 3D anatomical representation positioned in the 3D coordinate system according to (b) ).
  • index any sort of list containing, for each record, keys and references in order to speed up the idenfication, the location and the access to the data.
  • a value identifying the rank or registration number of an element in a structure or table is generally used, and allows access to it. The value is often an integer, but can also take other forms. It should be noted more specifically that the programming languages have their specific writing rules to indicate the indices, for example by means of brackets or parentheses, as for BASIC in particular.
  • Step (d) consists of proceeding and disposing of (n) elementary biological samples. Said withdrawals each optionally comprise at least one entity of interest.
  • entity of interest means any entity is meant, in particular biological, that 1 is to be detected in a sample.
  • the biological term is here to be taken in its general definition relating to living organisms. We do not intend to limit our to an element that originates in the biological model itself.
  • proteins for example transcription factors
  • peptides or polypeptides antibodies, hormones, steroids, antigens derived from infectious agents or tumor cells, infectious agents such as bacteria, viruses or parasites, nucleic acids (DNA or RNA), therapeutic molecules, drugs or antibiotics.
  • infectious agents such as bacteria, viruses or parasites
  • nucleic acids DNA or RNA
  • drugs or antibiotics it can also be metabolite type entities, organic or mineral. It is nevertheless possible that said samples do not include said entity of interest, as is often the case in biology. This situation nevertheless generates information.
  • Step (d) also consists in obtaining, from (n) biological samples, at least (n) intermediate preparations each optionally comprising said entity of interest, for example by intermediate treatment of (n) elementary biological samples.
  • intermediate preparations is meant all kinds of preparations obtained by chemical, biological, physical, physicochemical treatment of the samples.
  • Such treatments should be adapted to the available quantities of biological samples available.
  • the choice of treatment is directly a function of the entity of interest itself and which is possibly present in said samples.
  • this treatment it is desired that the said entity of interest is found in the free state in the intermediate preparation, and consequently that it becomes accessible for the rest of the process, and in particular for the test reagent.
  • no processing is necessary, and that, in the natural state, said entity of interest is already easily accessible or free.
  • only a portion of the biological sample is used for an intermediate preparation and different intermediate preparations are prepared with a single biological sample, which allows any at the same time a saving of time and biological material.
  • step (e) there is at least one solid support comprising an operating surface on which are distributed (n) elementary observation sites.
  • support any type of material having a surface, commonly used in biology or chemistry. This support defines a surface, or area, operating and is defined in a two-dimensional way. In particular, it is possible to use a 2D reference, as defined above, on said surface, which makes it possible to accurately position (n) elementary observation sites (S).
  • It may especially be an inert surface but also a reactive surface.
  • the operating surface of the support may be flat but it may also comprise notches or wells intended to receive a predetermined quantity of each of the intermediate preparations, as defined below.
  • the type of support, and therefore of the operating surface is in particular chosen as a function of the entity of interest itself, but also of the type of reaction treatment implemented and the means for detecting the reaction entities.
  • a predetermined quantity of the (n) intermediate preparations is deposited in or on the (n) elementary observation sites (S) to obtain a representative collection of (n) biological samples.
  • Quantity is meant measurable quantity. It can be a mass or a volume, depending on the state in which the intermediate preparations are.
  • a same solid support may have different amounts of intermediate preparations, if this is of experimental interest.
  • the (n) elementary observation sites (S) are identified by their coordinates on the support - hereinafter 2D coordinates, by means of a two-dimensional marker.
  • said support comprises notches or wells
  • said sites (S) are located at the notches or wells.
  • the (n) predetermined quantities of the (n) intermediate preparations are deposited and stored on the same solid support.
  • step (e) the step of generating and having an index (J) of said (n) sites (S) elementary observation on the solid support, said index comprising (n) elementary information each comprising at least the 2D coordinates of each elementary observation site and the characteristics of its corresponding deposit.
  • Step (f) of the process according to the present invention consists in obtaining, by a reaction treatment of the collection according to (e) with at least one test reagent, in or on the (n) elemental sites respectively, (n) entities reaction, whose qualitative and / or quantitative characterization is representative of the reactivity of the entity of interest with the test reagent.
  • test reagent any substance used to allow the detection of the entity of interest in or on the (n) sites (S) elementary solid support.
  • Detection means the determination of the presence or absence of an entity of interest in a biological sample, but also the measurement and quantification of said entity in the intermediate preparation resulting from the corresponding biological sampling.
  • test reagent is function of the entity of interest to be detected, in particular a chemical, biological or therapeutic reagent.
  • reaction entity is obtained by contacting or reacting, between the entity of interest and the test reagent, specially chosen to reflect that presence, absence or quantity of the entity of interest.
  • the link between the entity of interest, for example in the free state within the intermediate preparation, and the test reagent may be of various nature. It may especially be a strong bond, or a weak bond, a connection limited in time or that continues.
  • covalent and non-covalent bonds and in particular: electrostatic bonds, for example ionic bonds,
  • Step (g) consists of methodically scanning the operating surface of the at least one reacted solid support, and detecting the (n) reaction entities to respectively generate (n) representative signals, qualitatively and / or quantitatively, of said reactivity in said (n) sites elementary observation, the latter being called later elemental reactivity.
  • the detection generates a signal.
  • elementary reactivity is meant the value representing the presence, absence or quantity of the entity of interest within the biological sample, and therefore within the three-dimensional element (F). This value numerically represents the reaction entity.
  • an index (K) is generated and has elementary reactivities in or on the (n) elementary sites, comprising (n) elementary information each comprising at least the qualitative and / or quantitative characteristics of its detected signal.
  • step (h) makes it possible, by correlation of the indices (I 1 J, K), to generate a 3D profile of reactivities of the biological entity of interest within the elementary zones of the functional element of the biological model. reference, having reacted with the test reagent, supplemented by the reference documentation.
  • 3D profile is meant a three-dimensional representation of the functional element (F), indicating in each of the (n) elementary zones (Z) of biological samples, the elemental reactivity (R) obtained following the reaction treatment of the solid support. wherein predetermined amounts of the intermediate preparations have been deposited and reacted with the test reagent.
  • the present invention has the advantage of implementing micro sampling techniques.
  • the possibility of depositing a large number of micro-samples on one and the same surface saves a considerable amount of time.
  • the invention is also part of an ethical context and economy of living material and leads to a reduction in the costs of experimentation.
  • steps (a) and (b) of said method may not be necessary. This will be particularly the case when the process is repeated on a functional element of a biological model that is identical or similar to that of an element already analyzed and belonging to the same species. "Species” means any taxonomic category grouping similar representatives that may reproduce between them.
  • the in vitro determination method of the present invention is as follows:
  • an index (I) of said (n) sampling elementary zones (Z) is generated and has an index in relation to the 3D anatomical representation of said reference functional element, said representation being positioned in a 3D coordinate system, and possibly information is available or data specific to said reference functional element, said index (I) comprising (n) elementary information each comprising at least the 3D coordinates of each elementary zone in the 3D anatomical representation of said reference functional element,
  • the three-dimensional functional element (F) is chosen.
  • This functional element (F) three-dimensional is preferably a brain. This is for example a brain of a mouse or a monkey.
  • said three-dimensional functional element (F) is fixed, for example frozen or waxed.
  • the (n) biological samples are taken by means of a biological sampling device.
  • All kinds of sampling devices also known in the present invention as sampling means, can be used in the present invention.
  • the thickness of these sections or blades depends on the device used and the pretreatment performed on the functional element.
  • microtome is specially designed for the production of frozen tissue sections at room temperature.
  • the fragment, placed on the plot of the microtome is frozen (CO 2 -methyl chloride) and then cut.
  • the apparatus therefore makes it possible at the same time to pretreat the functional element, in this case it freezes it, and to cut it out.
  • the cuts obtained are generally of the order of 15 microns thick. Since the cutting has been carried out in one dimension, for example in the sagittal direction for an element oriented in the anteroposterior direction within the biological model, it is then necessary to make a cut in another dimension. This second cut is then carried out systematically or more specifically selected parts, according to the definition of the set (E) developed in the previous step.
  • the cryostat meanwhile, is a microtome placed in a refrigerated chamber.
  • the tissue fragment is previously frozen with CO 2 .
  • the device allows at the same time to pretreat the functional element and cut it. Fine sections of 3 to 5 ⁇ m are achievable. It is then also necessary to make a cut in another dimension, for example in a plane transverse to the plane of first cut.
  • tools of appropriate shape and thickness capable of producing a biological sample at the surface but also at depth. It may for example be a tool consisting of an automatic pistol and a needle, a device comprising a hollow needle which protects a small rotary cylindrical knife, a suitable cutting die, a "micropunch".
  • tools can perform a systematic cutting, for example robotic, but also a cutout directed by human hand, or more or less automatic.
  • the sampling means may be directed by the hand of the person skilled in the art, but they may also be controlled by control means.
  • the (n) elementary biological samples are made by means of a sampling device chosen from a microtome, a cryostat, a suitable cutting die, a "micropunch” and a device using the laser.
  • the sampling devices used in the present invention make it possible to produce elementary biological samples in the form of cubic segments varying between 0.01 and 10 mm 3 , for example cubic segments of
  • the supports used in the present invention may be of different types. It can in particular be carriers having an inert operating surface, but it can also be supports comprising a reactive operating surface.
  • the material of the support is different from that of the operating surface.
  • the support material and / or the operating surface it is possible to use, for example, nitrocellulose, positively charged or unfilled polyamide / nylon, paper, cardboard, wood, plastic, fabric, metal, glass, organic matter in the form of beads or gel, or a mineral material.
  • the surface of the support can be flat. It may also comprise notches or wells intended to receive a predetermined quantity of each of the intermediate preparations, such as 96-well plates. Wells can be of different shapes and in particular they can be bottom V, U or flat bottom. They can also have different capacities, for example 300 ⁇ L.
  • Such surfaces may be very varied in nature, both chemically (anionic or cationic, hydrophobic or hydrophilic surfaces, etc.) and biological (antibodies or their immunoreactive fractions, aptamers, receptors or DNA ). These surfaces thus have a certain ability to retain affinity proteins of interest. For example, membranes preincubated with anti-cytokine antibodies, or anti-kinases, or anti-phosphorylated peptides may be mentioned. Such surfaces may especially be chosen from the so-called "chips" (or "chips” in English). A number of protein chips are available on the market. Such chips are sometimes in a form that is not suitable for use in the present invention.
  • said support comprising an operating surface is chosen from membranes and microtiter plates.
  • said support comprising an operating surface is a membrane (nitrocellulose, nylon, etc.) applied to another solid support, for example laminated to a glass slide or a metal material.
  • a predetermined amount of (n) preparations is deposited in or (n) sites (S) of the support.
  • This amount is a function of the available device, for example the volume of the micropipette available.
  • Step (e) can be performed manually or robotically.
  • control means are used to carry out this step.
  • the predetermined quantity of (n) intermediate preparations deposited respectively in or on the (n) elementary sites of observation of said solid support is a liquid volume varying between 1 .mu.l and 1 .mu.L. According to another variant of the present invention, it is a liquid volume ranging between 0.01 ⁇ L and 10 ⁇ L.
  • intermediate preparations means all kinds of preparations obtained by chemical, biological, physical, physicochemical treatment of the samples.
  • the intermediate preparations are obtained by protein and / or nucleic extraction on said (n) biological samples.
  • the intermediate preparations are obtained for each collection of the assembly (E) using preparation means.
  • preparation means can be directed by the hand of the skilled person, but they can also be controlled by control means.
  • test reagent of the present invention is selected according to the entity of interest to be detected.
  • a biological test reagent By way of indication of a biological test reagent according to the present invention, it is possible in particular to use monoclonal or polyclonal antibodies directed against the protein whose presence it is desired to analyze. These antibodies, or their immunoreactive fractions may, in addition, be coupled, for example to FITC, peroxidase, alkaline phosphatase, biotin or phycoerythrin, depending on the method that will be used for detection and / or quantification.
  • said test reagent is selected from the group consisting of fluorescence or luminescence markers, radioactivity markers, colorimetric markers, nucleic acid molecules, monoclonal antibodies, and polyclonal antibodies.
  • Detection can use physical techniques (surface plasmon resonance, electrical detections, ).
  • the entity of interest is a nucleic acid.
  • a test reagent is an anti-nucleic acid antibody or a nucleic acid fragment complementary to the target sequence.
  • the skilled person then has several detection possibilities.
  • the primary antibody may for example be conjugated to an enzyme whose activity, in the presence of a specific substrate, will be evidence of the presence of the protein of interest or the sequence of interest. It is also possible to use a secondary anti-primary antibody.
  • the test reagent may also be chosen so as not to denature the intermediate preparation.
  • the "reaction entity” is obtained by contacting or reacting, between the entity of interest and the test reagent, specially chosen to reflect that presence, absence or quantity of the entity of interest.
  • the reaction treatment therefore consists of a lysis (especially gentle, or more vigorous) and extraction of proteins and the use of enzyme, detergents and / or protease inhibitors .
  • the proteins are then characterized by combining affinity chromatography (separation step) and mass spectrometry.
  • MS mass map
  • MS / MS tandem mass spectrometry
  • a predetermined quantity of a (n) intermediate preparations potentially containing the desired antibody in each of the wells After washing, only the antigens attached to the antibodies at the bottom of the plate are present. They are demonstrated using another antibody specific for antigens, for example, coupled to an enzyme which transforms a colorless substrate into a colored product which is a control of the presence of the specific antibody and therefore of the presence of the antigen.
  • a variant of the ELISA test is used: the ELISpot test ("enzyme-linked immunospot"), carried out on a particular immunoadsorbent support.
  • Wells of a nitrocellulose bottom microtiter plate are coated with a monoclonal antibody specific for the entity of interest, for example a cytokine.
  • a predetermined amount of each of the (n) intermediate preparations containing cells is added to the wells in the presence of the selected stimulus and incubated at 37 ° C. During this incubation period, the cytokines secreted by the cells bind to the antibody. immobilized. After washing, a biotin-conjugated antibody specific for the cytokine to be detected is added to the wells.
  • alkaline phosphatase-coupled streptavidin is added, the binding of which is then revealed by the substrate. Blue colored precipitates form at the site of localization of the secreted cytokine and appear as spots. Each individual spot represents a cell having secreted the cytokine analyzed.
  • beads are used, together with the flow cytometry technique to quantify the presence of several proteins simultaneously (in English "Cytometry Bead Array").
  • beads are mixed with antibodies coupled and deposited in a microtiter plate, 96-well plate type.
  • a predetermined amount of one of the (n) intermediate preparations potentially containing the desired protein (s) is then deposited in each of the wells.
  • the mixture is then subjected to flow cytometry.
  • an ELISA (sandwich) type technique which allows a high-throughput analysis of the possible presence of acid-interacting proteins.
  • nucleic transcription factors, translation regulation elements, .
  • a single oligonucleotide or biotinylated double-strand probe containing the consensus sequence of the transcription factor (s) to be detected / quantified is used. This probe is incubated with a portion of each of the (n) biological samples prepared so as to retain only the protein fraction (likely to include the one or more transcription factors), and in the presence of a suitable buffer.
  • each of the (n) complexes "prepared biological sample / probe / buffer" is transferred to a suitable medium, 96-well plate type, previously treated with streptavidin.
  • the biotinylated oligonucleotide is then immobilized by binding to streptavidin and the unbound material is removed by washing.
  • the possible presence of a transcription factor, linked to the consensus sequence is demonstrated using a specific primary anti-transcription factor antibody.
  • a secondary anti-primary antibody antibody for example conjugated to 1 HRP, makes it possible to detect / quantify the possible presence of the transcription factor (s) within the (n) biological samples.
  • RNA or I 1 DNA without prior electrophoretic gel separation, by means of specific hybridization with a labeled probe (radioactive labeling or enzymatic labeling).
  • the nucleic acid-target is applied to a support of nitrocellulose or nylon, positively charged or not.
  • the choice of the support is linked to the possibility for the constituent material of the operating surface to allow a "hooking" of said nucleic acid.
  • a single-stranded nucleic acid probe of sequence complementary to that of the target nucleic acid incorporated in the object and capable of hybridizing with the object is then used as a means of detection, which makes it possible to specific detection of the target nucleic acid by molecular hybridization.
  • the nucleic acid probe can have different lengths, different sequences and be of different natures. It may be DNA or RNA of natural or synthetic origin, or synthetic derivatives containing in whole or in part rare bases or modified bases.
  • the possible hybridization can be detected by any appropriate detection means, known in the field of nucleic probes, for example by radioactive labeling of the probe.
  • the marking may also be carried out by any suitable marking system known in the art. domain of nucleic probes.
  • the detection can also be carried out by chemical means and physical means, for example electrical, electronic, radio or magnetic means.
  • the "Dot Blot” technique also makes it possible to reveal the presence of a protein on a support on which a certain volume of solution of the (n) intermediate preparations containing said protein has been deposited.
  • An antibody specific to this protein, or specific to a label grafted on said protein, is then used for the reaction treatment.
  • the same solid support may comprise intermediate preparations from different biological models. In this case, the genetic information differs according to the two or more groups of samples taken.
  • each sample contains the same genetic information, to the natural genetic mutation processes.
  • batches or “pools" of equivalent samples from identical anatomical regions are made, but several representatives of the biological model are made. This makes it possible to present larger quantities of homogeneous material for batch productions and to average the differences between individuals.
  • FIG. 1 shows, in a schematic and nonlimiting manner, a system for determining in vitro the reactivity of an entity of interest within a three-dimensional functional element F.
  • Figure 1a is a magnification of a part of the determination system of Figure 1.
  • FIG. 2 illustrates, schematically and not limiting, one of the advantages of the present invention.
  • a set E of n samples taken at n sampling elementary zones Z may, after preparation, be arranged on a multiplicity of solid supports 7i, 72, 7n , identified by a unique identifier ID.
  • FIG. 3 represents, in the form of a diagram, an embodiment of the steps for detecting and processing the elementary reactivities R at each site S of the support, starting from an image thereof.
  • Figure 4 schematically shows an exemplary embodiment of a few steps of the method of the present invention in a mouse.
  • FIG. 5 shows an analysis device according to the present invention, which comprises a solid support which comprises n elementary observation sites S distributed in two dimensions on which a determined quantity of n intermediate preparations of the n biological samples has been deposited.
  • the device positioned on the left is the one before reaction processing of the collection; the one on the right of the figure is that obtained after reaction treatment with at least one test reagent.
  • Figures 6 and 7 show a 3D profile of reactivity, as obtained according to the method of the present invention, by correlation of the 3 indexes generated during the process.
  • a functional element F in this case a brain, is selected and has a function taken from a representative of the biological model, for example a mouse or a monkey.
  • the reference biological model is a mouse and the functional element chosen is the brain of this mouse.
  • the functional element chosen is the brain of this mouse.
  • a set E of n elementary biological sampling zones is defined within this element.
  • An index of said n elementary zones is generated and has an index within the anatomical 3D representation of the mouse brain.
  • FIG. 4 also shows the operating surface of the solid support on which predetermined amounts of intermediate preparations of the samples are deposited for analysis.
  • Figure 1 shows a determination system according to the present invention.
  • An anatomical 3D representation of the three-dimensional functional element F is generated by means 4 that are positioned in the reference frame Oi. This representation is stored in the storage means 9.
  • Elementary sampling zones are defined, and in particular Z 1 and Z 2 (see FIG. 1 bis).
  • a first index I (storage means 3) is generated which comprises the elementary information of the elementary sampling zones, and in particular their 3D coordinates.
  • control means 5 for example a robot.
  • the intermediate preparations are prepared by means of the preparation means 6, also controlled by the control means 5, from the samples taken.
  • a predetermined quantity of the intermediate preparations is deposited on the elementary observation sites, S 1 and S 2 in particular, of the support 7-].
  • This support 7-i has a unique identifier ID (see in particular Figure 5).
  • the collection thus obtained undergoes a reaction treatment 10 with at least one test reagent and the reaction entities are obtained in or at the sites of the support, the qualitative and / or quantitative characterization of which is representative of the reactivity of the d interest with the test reagent.
  • the operating surface of the support is scanned and the reaction entities, and in particular R 1 and R 2 , are detected by means of detection means 12.
  • the present invention also relates to a system for determining in vitro the reactivity of an entity of interest.
  • This system is characterized in that it comprises:
  • sampling means (6) possibly controlled by control means (5), making it possible to produce an assembly (E) of (n) samples at (n) elementary zones (Z) defined on said functional element ( F) three-dimensional reference, the (n) samplings each optionally comprising at least one entity of interest,
  • preparation means (6) possibly controlled by control means (5), making it possible to carry out intermediate preparations from respectively the withdrawals from the set (E), each optionally comprising the said entity of interest; deposition means (6), optionally controlled by control means (5), for depositing a predetermined quantity of the (n) intermediate preparations corresponding to the set (E) of the (n) samples respectively, in or on (n) ) elementary sites (S) for observing at least one solid support (7), in a two-dimensional distribution, the 2D coordinates of each of the (n) sites (S) being stored in second storage means (8); ), in indexed form in a second index (J),
  • control means (5) for example robotic tools.
  • FIG. 1 shows an embodiment of the in vitro determination system of the reactivity of a biological entity of interest on a reference biological model according to the present invention.
  • Figure 1a specifies a part of the system shown in Figure 1.
  • This system comprises, under the control of a first actor A:
  • first generation means 2 or input means, of a set E of n elementary zones Z (Z 1 , Z 2 ... to Z n ), defined by at least three coordinates (x, y, z) in a three-dimensional reference mark Oi, of biological samples, intended to be produced on a three-dimensional reference functional element F of the reference biological model,
  • n intermediate preparations for example a volume varying between 1 .mu.l and 1 .mu.l, in or on n elementary observation sites S of minus a solid support 7, for example a microtiter plate, 96-well plate type, in a two-dimensional distribution (reference 02), the two-dimensional positions being defined by two coordinates ⁇ a, ⁇ ) on the support 7 in a reference frame O 2 , and stored in second storage means 8, in indexed form by a second index J (Ji for St, J 2 for S 2 ... to J n for S n ).
  • the sampling device 6, the preparation means and the depositing means are as defined above.
  • the indexes I and J are correlated so that a value of I can be uniquely associated with a value of J.
  • the system comprises under the control of the first actor A means 4 for generating, from a reference three-dimensional functional element F, an anatomical 3D representation of this element and the storage of this representation in third storage means 9.
  • each support 7 comprises at each of its observation elementary sites S, a predetermined quantity of an nth intermediate preparation from the nth biological sample, which corresponds to the nth predefined elementary zone Z.
  • each support comprises a predetermined quantity of all the n preparations, which allows an overall visualization of the reaction entities, and so as to obtain a representative collection of all samples.
  • several identical supports 7 are made.
  • One or more supports 7 are transmitted from the first actor to a second actor B.
  • the system comprises, under the control of the second actor B:
  • reaction treatment means for carrying out a reaction treatment on said solid support 7 in two dimensions, with at least one test reagent, constituting at each observation elementary site S, a reaction entity, whose qualitative characterization and / or quantitative is representative of the reactivity of the entity of interest with the test reagent,
  • the indexes J and K are correlated so that they can uniquely associate a value of J with a value of K.
  • the system includes data transfer means 15 connected to communication means 16 for communicating sets of elementary reactivities R to the first actor A.
  • the system comprises, on a computer server 17:
  • correlation means 18 between the elementary reactivities R and the elementary zones Z of biological samples, by correlation of the first, second and third indexes I, J, K, following the reception of the data from a second actor B,
  • fifth means 19 for storing the 3D coordinates of the n elementary sampling zones Z, correlated with the n elementary reactivities R.
  • the system comprises means for generating the 3D profile, from at least part of the set E of the n samples, comprising a graphical representation of the elementary reactivities R.
  • the generation means 20 include means for extracting data from: means for storing the 3D coordinates of the n elementary sampling zones Z, correlated with the elementary reactivities R, and
  • the system Under the control of the second actor B 1 the system comprises a client station 22, equipped with network communication means 24 for communicating with the first actor A, and in particular the server 17 by the communication means 16.
  • the client station comprises in particular visualization means 23 of the 3D reactivity profile, generated by the generating means 20.
  • the storage means 3, 8, 9, 14, 19 consist of entries in a database system of relational database system type, for the part under the responsibility of the first actor A and by files for the part under the control of the second actor B.
  • the system is characterized in that:
  • the first generation means 2 the first, second, third and fifth storage means
  • the 3D profile generation means 20 are arranged to be functionally under the control of at least one first actor (A), and in that: the means for producing a reaction treatment 10,
  • the fourth storage means 14 are arranged to be functionally under the control of at least one second actor B, said one or more solid supports 7 being transmitted from the first to the second actor, and the system further comprising communication means 16 between at least one first actor A and at least one second actor B, allowing the latter to communicate to the first actor A the elementary reactivity data R, and the first actor A to communicate to the second actor B the data of at least one 3D profile of reactivities.
  • indexing I, J, K in the storage means makes it possible to identify a sample to which corresponds a basic S observation site and an elementary reactivity R 1 these samples belonging to a collection set E.
  • the indexes I, J, K can however be different.
  • Each support 7 is associated with a unique identifier ID making it possible to identify, in the system, the elementary reactivities R corresponding to a particular medium.
  • the detection means 12 of the reaction entities are constituted, according to a first variant, by means for taking an image of the medium 7.
  • the image processing means 13 evaluate the elementary reactivity R at each elementary S site. observation as a function of the luminance L in the corresponding zone on the image of said support 7.
  • the communication means 16 may in particular be constituted by an Internet connection, this connection may be of the secure type. Any other type of network connection can also be used.
  • the computer server 17 comprises in particular the correlation means 18 of the index I, ie the 3D coordinates of each of the n elementary zones Z of the collection of the set E, of the index J, ie the 2D coordinates of each site S elementary observation of the support 7 and the index K, ie the elementary reactivities R with the n elementary sampling zones Z, and the means for generating 3D profiles.
  • this computer server 17 may consist of a hardware server comprising a software application server making it possible to make multiple connections with second actors B.
  • An architecture based on components in Java language, in particular on the Servlet technology can be advantageously used.
  • the result of the extraction of the data by the means for generating 3D profiles from the storage means 9 and 19 consists in producing a representation file of the three-dimensional model, in particular in a standardized format.
  • a standard VRML type format can be used.
  • the client station is equipped with network communication means 24 in the form of a network card, and a browser 25 allowing in particular the display of HTML page, and to integrate viewing means 23.
  • visualization means 23 may be constituted by a component of Applet type in Java language for viewing at least one three-dimensional model contained in a file in VRML format.
  • the system comprises means 4 for generating, from a three-dimensional reference functional element F, an anatomical 3D representation of this element.
  • the anatomical 3D representation of the functional element F is not obtained by generation means 4, but comes from a reference documentation, the dimensions of the representation and its orientation in the 3D coordinate system being adapted to that of the functional element, in particular by the application of a transformation, more particularly a controlled deformation, to the general geometry of the object.
  • the processing means 13 make it possible to determine the elementary reactivity R at each site S of the support, from an image thereof, taken by the detecting means 12, constituted by means of taking an image, and in particular a scanner. The following steps are performed, using a software program or a dedicated electronic card, following the imaging in a first step EDR1:
  • each region is segmented by thresholding, only the pixels whose luminance is greater than a given threshold, in particular equal to the sum of the luminance of the background and the standard luminance deviation on the whole. pixels in the image, are considered to be part of a cluster representative of the elementary reactivity R,
  • a quantity representative of the elementary reactivity R is calculated for each cluster corresponding to a site S, in particular as the sum over the pixel cluster of the luminance L.
  • the present invention also relates to an analysis device comprising at least one solid support (7), said support being as defined above and comprising (n) elementary observation sites (S) distributed along two dimensions of said support, said device being characterized in that a predetermined quantity of each of the (n) intermediate preparations of the (n) biological samples, taken from a three-dimensional functional element (F) of a reference biological model, is deposited respectively in each of the (n) ) elementary sites (S) of said solid support (7).
  • each of said (n) biological samples includes the same genetic information, natural genetic mutation processes, all (n) biological samples being made within the same functional element. So the device of the The present invention makes it possible to determine the reactivity in vitro of an entity of interest within the same functional element.
  • Example 1 Preparation of mouse models of neurodegenerative pathology
  • the biological model chosen is the mouse.
  • the functional element is the brain.
  • a stereotaxic atlas of the mouse brain is used.
  • Samples are taken from the brain by "micro-punching" on a freeze cut or by 3D cutting using a matrix. Between two cuts, a digital shooting makes it possible to carry out a visual identification allowing to reframe the elementary zone of sampling in the anatomical structure, this compared to the reference stereotaxic atlas.
  • the photograph is positioned relative to the atlas semi-automatically. The position of each elementary area of biological samples is thus located in the brain.
  • the 3D coordinates of each elementary zone, in indexed form, are stored in a first index.
  • MRI imaging also allows precise identification of the organ studied in relation to the model.
  • Each biological sample is processed in a suitable buffer solution.
  • Extracts of the previously prepared buffer solutions are distributed in 96-well microplates. Each numbered well contains intermediate preparations.
  • Blade Deposition A specific quantity of each intermediate preparation is deposited on a slide by the "microArraying" technique which makes it possible to carry out microsampling from the 96-well microplates. Such a micro-sampling constitutes a bank or collection which has the advantage of understanding on a reduced surface all the "spots" of a small animal brain.
  • the robot takes a sample of the contents of a well and deposits it on the blade, thus obtaining a "spot" on the blade. This operation is repeated for each well.
  • the deposits are made according to a well-defined 2D deposit grid, at each (S) elementary site.
  • the 2D coordinates of each site are stored in indexed form in a second index.
  • the deposits are usually duplicated, but each spot always corresponds to a single biological sample. The traceability of the biological samples to the position of the spots on the membranes is ensured by the numbering of the wells and the deposit grid.
  • An antibody directed against a protein is used.
  • the correlation means of the 3 indexes ie the 3D coordinates of each of the elementary sampling zones, the index of the 2D coordinates of each elementary site of observation of the slide and the index of the elementary reactivities with the basic sampling areas.
  • the means for generating 3D profiles are also used. Each elemental reactivity is expressed in the anatomical 3D representation of the mouse brain (with color codes).
  • the 3D profile thus obtained is stored on the client computer and processed in a resident software tool downloaded at the first connection on the platform or provided with the sample itself (on a CD for example).

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de détermination in vitro de la réactivité d'une entité d'intérêt, par exemple biologique, sur un élément fonctionnel tridimensionnel, du type organe, d'un modèle biologique, du type mammifère. La présente invention concerne également un système de détermination in vitro de la réactivité d'une entité d'intérêt, ainsi qu'un dispositif d'analyse.

Description

Procédé et système de détermination in vitro de la réactivité d'une entité d'intérêt sur un élément fonctionnel tridimensionnel
La présente invention concerne un procédé de détermination in vitro de la réactivité d'une entité d'intérêt, par exemple biologique, sur un élément fonctionnel tridimensionnel, du type organe, d'un modèle biologique, du type mammifère.
Le document WO 03/003162 décrit un système d'information comprenant notamment une base de données qui comprend des informations relatives à des micro-échantillons de cellules ou de tissu d'un patient atteint d'un disfonctionnement neuropsychiatrique. Les échantillons de tissus peuvent être obtenus à partir de coupe, section ou fragments de tissus, ou même de suspensions cellulaires obtenues à partir de tissus, par exemple du tissu cérébral ou de tissus représentatifs du corps entier du patient. Néanmoins ce document ne décrit pas de système permettant l'analyse d'un élément fonctionnel tridimensionnel.
De manière générale, l'art antérieur décrit des systèmes relatifs au dépôt et à l'exploitation d'échantillons de cellules ou d'un tissu biologique à deux dimensions sur des supports solides. Ces systèmes utilisent des interfaces à deux dimensions, destinés au repérage des dépôts. Mais, la composante tridimensionnelle est absente.
La présente invention concerne un procédé et un système de détermination de la réactivité d'une entité d'intérêt, par exemple biologique, sur un élément fonctionnel tridimensionnel.
La présente invention concerne donc un procédé de détermination in vitro de la réactivité d'une entité d'intérêt sur un élément fonctionnel tridimensionnel de référence.
Par "in vitro", on entend procédé qui se produit en dehors du modèle biologique, en laboratoire, par exemple en milieu artificiel, sur une lame de verre ou dans du matériel de laboratoire approprié. La description qui suit donne de plus amples détails sur la signification de ce terme selon la présente invention.
L'étape (a) de ce procédé consiste à choisir et disposer d'un modèle biologique de référence, du type organisme vivant supérieur, choisi dans le règne animal, dont mammifères. Par "modèle biologique", on entend toute sorte d'organisme vivant susceptible de présenter un quelconque intérêt d'étude. Selon la présente invention, le modèle biologique est de type organisme vivant supérieur et consiste en au moins un représentant choisi dans le règne animai. De préférence, le modèle biologique est choisi parmi les vertébrés et plus particulièrement dans la classe des mammifères non humains. A titre indicatif, il s'agit d'animaux de laboratoire couramment utilisés en expérimentation animale, par exemple de souris, de rat, de singe. Il peut également s'agir d'un corps humain, post mortem, à des fins expérimentales. Selon la présente invention, le modèle biologique peut être utilisé afin d'obtenir des connaissances supplémentaires sur celui-ci directement, ou il peut permettre d'obtenir une meilleure connaissance de la physiologie de l'homme ou de l'animal et de ses maladies.
Un grand nombre de facteurs peut influencer le choix de l'animal. Le choix s'opère selon des caractéristiques propres à l'expérimentation ou aux caractéristiques de l'animal lui-même. Parmi tous ces facteurs, il y a des considérations de nature scientifique et des aspects purement pratiques. Parmi ces facteurs, on peut notamment citer la pertinence du modèle pour l'étude envisagée, les caractéristiques génétiques du modèle, la taille et le prix de l'animal employé comme modèle, la disponibilité du modèle, la durée de vie de l'animal employé comme modèle, etc..
L'étape (a) du procédé consiste également à générer ou disposer d'une documentation de référence comprenant des informations ou données spécifiques audit modèle biologique de référence. Selon l'étape (b) de ce procédé, on choisit et dispose d'un élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence, par exemple d'un organe du modèle de référence, consistant en un élément fonctionnel prélevé sur un représentant du modèle biologique de référence.
Par "élément fonctionnel tridimensionnel", on entend toute sorte structure anatomique constituée d'au moins un tissu et susceptible de présenter un quelconque intérêt d'étude. Selon la présente invention, ledit élément fonctionnel a été prélevé sur ledit modèle biologique où il exerçait une fonction organique ou physiologique déterminée, ladite étape de prélèvement n'étant pas couverte par le procédé de la présente invention. L'élément fonctionnel se trouve sous forme tridimensionnelle, i.e. selon trois dimensions géométriques. Il peut notamment s'agir d'un organe du modèle de référence. A titre indicatif, il peut s'agir du cerveau, du foie, de la rate, du thymus du modèle biologique.
Une documentation de référence dudit modèle biologique ou dit élément fonctionnel (F), c'est-à-dire un ensemble d'informations ou de données relatives au modèle biologique ou élément fonctionnel auquel il se rapporte, est généralement disponible. Si tel n'est pas le cas, cette documentation de référence peut être générée et cette étape entre dans le procédé de la présente invention.
L'étape (b) du procédé consiste également à générer ou disposer d'une représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence.
Selon la présente invention, il est nécessaire de disposer d'une représentation tridimensionnelle anatomique de l'élément fonctionnel (F). Cette représentation peut être obtenue par les méthodes adaptées de réalisation de telles représentations.
A titre indicatif, on peut utiliser les techniques d'imagerie morphologique in vitro ou in vivo, également appelée imagerie anatomique.
Par "imagerie in vitro", on entend une imagerie sur l'élément fonctionnel tel qu'une fois prélevé sur le représentant du modèle biologique. Par "imagerie in vivo", on entend une imagerie sur le modèle lui- même, avant prélèvement dudit élément fonctionnel. On utilise, par exemple, la technique de tomodensitographie ou scanner X ("CT Scan" en anglais), ou celle de l'imagerie par résonance magnétique (IRM), qui permet d'obtenir des images en trois dimensions d'un élément fonctionnel du modèle biologique. II est également possible, selon la présente invention, d'avoir recours à un atlas anatomique qui détaille la topographie de l'élément fonctionnel.
Pour ce qui est de la conception d'un tel atlas anatomique, on dispose de planches anatomiques présentant des schémas topographiques et/ou des prises de vues photographiques des structures anatomiques repérées dans un plan de coupe donné (sagittal par exemple). Chaque plan de coupe est indexé par rapport à des structures anatomiques de référence définissant un repérage spatial dans l'élément fonctionnel étudié. Chaque schéma comporte une grille de repérage qui permet l'indexation des prélèvements réalisés dans le plan de coupe. La photographie permet un contrôle visuel des prélèvements. Ledit atlas peut être au format papier ou dans un format numérique, ce dernier permettant avec un outil de pointage d'optimiser le relevé et d'automatiser l'indexation des prélèvements dans un système de reconstruction 3D. II se peut également selon la présente invention que l'on dispose d'une représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel de référence, sans que besoin soit d'en générer une.
Selon le procédé de la présente invention, la représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel est positionnée dans un repère 3D. Par "repère", on entend toute sorte de systèmes permettant de repérer un emplacement, selon deux dimensions ("2D"), ou trois dimensions ("3D"), pour faire un travail de précision, par exemple localiser une zone dans un espace.
Selon l'étape (c), on définit des zones élémentaires (Z) de prélèvement biologique dans l'élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence.
Selon la présente invention, "zones élémentaires de prélèvements biologiques" signifie emplacements dans un espace ou volume déterminé, repéré par des paramètres précis de positionnement dans l'espace qui seront le siège des prélèvements biologiques au sein de l'élément fonctionnel. Le nombre (n) de zones est déterminé en fonction de la taille dudit élément fonctionnel ou de celle d'une partie d'intérêt au sein de celui-ci. Ainsi on définit n zones élémentaires, autrement dit un ensemble (E) de (n) zones élémentaires (Z). La définition de telles zones passe par un maillage précis de l'élément fonctionnel ou de la partie d'intérêt de celui-ci. De manière générale, un maillage est obtenu par division de l'élément fonctionnel en zones élémentaires. Le maillage est généralement opéré sous le contrôle d'une machine contrôlée par un logiciel. Mais il se peut que cela ne soit pas complètement automatique. Selon la présente invention l'élément fonctionnel (F) est tridimensionnel, de telle sorte que les zones élémentaires selon la présente invention sont des volumes. Ces zones sont généralement des hexaèdres, par exemple des cubes. Les dimensions des zones élémentaires de prélèvement dépendent essentiellement de l'outil de prélèvement et de la précision de celui-ci. L'étape c) du procédé consiste également à générer et disposer d'un index (I) desdites (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement en relation avec la représentation 3D anatomique positionnée dans le repère 3D selon (b), ledit index (I) comprenant (n) informations élémentaires comportant chacune au moins les coordonnées 3D de chaque zone élémentaire dans la représentation anatomique 3D positionné dans le repère 3D selon (b). Par "index", on entend toute sorte de liste contenant, pour chaque enregistrement, des clés et des références afin d'accélérer l'idenfication, la localisation et l'accès aux données. On utilise généralement une valeur identifiant le rang ou le numéro d'enregistrement d'un élément dans une structure ou un tableau, et qui permet d'y avoir accès. La valeur est souvent un nombre entier, mais peut également prendre d'autres formes. Il est à noter plus spécifiquement que les langages de programmation ont leurs règles d'écriture spécifiques pour indiquer les indices, au moyen par exemple de crochets ou de parenthèses, comme pour le BASIC notamment.
L'étape (d) consiste à procéder et disposer des (n) prélèvements biologiques élémentaires. Lesdits prélèvements comprennent éventuellement chacun au moins une entité d'intérêt.
Par "entité d'intérêt", on entend toute entité, notamment biologique, que1 l'on souhaite détecter dans un échantillon. Le terme biologique est ici à prendre dans sa définition générale se rapportant aux organismes vivants. On n'entend aucunement se limiter à un élément qui trouverait son origine dans le modèle biologique lui-même.
Parmi les entités d'intérêt détectées par les systèmes et les procédés selon la présente invention, on citera notamment les protéines (par exemple les facteurs de transcription), les peptides ou polypeptides, les anticorps, les hormones, les stéroïdes, les antigènes dérivés d'agents infectieux ou de cellules tumorales, les agents infectieux tels que les bactéries, les virus ou les parasites, les acides nucléiques (ADN ou ARN), les molécules thérapeutiques, les drogues ou encore les antibiotiques. Il peut également s'agir d'entités type métabolites, organiques ou minérales. II se peut néanmoins que lesdits prélèvements ne comprennent pas ladite entité d'intérêt, comme c'est souvent le cas en biologie. Cette situation génère néanmoins une information.
L'étape (d) consiste également à obtenir, à partir des (n) prélèvements biologiques, au moins (n) préparations intermédiaires comprenant chacune éventuellement ladite entité d'intérêt, par exemple par traitement intermédiaire des (n) prélèvements biologiques élémentaires. Par "préparations intermédiaires", on entend toutes sortes de préparations obtenues par traitement chimique, biologique, physique, physicochimique des prélèvements.
De tels traitements doivent être adaptés aux quantités disponibles de prélèvement biologique dont on dispose.
Le choix du traitement est directement fonction de l'entité d'intérêt elle-même et qui est éventuellement présente dans lesdits prélèvements. On souhaite, par le biais de ce traitement, que ladite entité d'intérêt se retrouve à l'état libre dans ia préparation intermédiaire, et par conséquent qu'elle devienne accessible pour le reste du procédé, et notamment pour le réactif de test. Il se peut néanmoins qu'aucun traitement ne soit nécessaire, et que, à l'état naturel, ladite entité d'intérêt soit déjà facilement accessible ou libre. il est, en outre, important de noter que, selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, on utilise une partie seulement du prélèvement biologique pour une préparation intermédiaire et on prépare différentes préparations intermédiaires avec un seul prélèvement biologique, ce qui permet tout à la fois une économie de temps et de matériel biologique.
Selon l'étape (e), on dispose d'au moins un support solide comportant une surface opératoire sur laquelle sont distribués (n) sites élémentaires d'observation.
Par "support", on entend tout type de matériaux comportant une surface, utilisé couramment en biologie ou en chimie. Ce support délimite une surface, ou aire, opératoire et est définie de façon bidimensionnelle. On peut notamment avoir recours à un repère 2D, tel que défini ci-dessus, sur ladite surface, et qui permet de positionner de façon précise (n) sites (S) élémentaires d'observation.
Il peut notamment s'agir d'une surface inerte mais également d'une surface réactive.
Il est tout à fait envisageable, selon la présente invention, d'utiliser des supports dont les surfaces opératoires ont été préalablement traitées ou préparées.
La surface opératoire du support peut être plane mais elle peut également comporter des encoches ou puits, destinés à recevoir une quantité prédéterminée de chacune des préparations intermédiaires, telles que ci- dessous définies. Le type de support, et par conséquent de surface opératoire, est notamment choisi en fonction de l'entité d'intérêt elle-même, mais également du type de traitement réactionnel mis en œuvre et du moyen de détection des entités de réaction. Selon l'étape (e), on dépose une quantité prédéterminée des (n) préparations intermédiaires dans ou sur les (n) sites (S) élémentaires d'observation pour obtenir une collection représentative des (n) prélèvements biologiques.
Par "quantité", on entend grandeur mesurable. Il peut s'agir d'une masse ou d'un volume, selon l'état sous lequel se trouvent les préparations intermédiaires.
Il est en outre important de noter que selon un mode de réalisation de la présente invention, un même support solide peut comporter des quantités de préparations intermédiaires différentes, si cela présente un intérêt expérimental.
'Les (n) sites (S) élémentaires d'observation sont repérés par leurs coordonnées sur le support - ci-après coordonnées 2D, au moyen d'un repère à deux dimensions. Lorsque le dit support comporte des encoches ou puits, lesdits sites (S) sont situés au niveau des encoches ou puits. Selon une variante de la présente invention, les (n) quantités prédéterminées des (n) préparations intermédiaires sont déposées et stockées sur ledit même support solide.
Fait également partie de l'étape (e) selon la présente invention, l'étape qui consiste à générer et disposer d'un index (J) desdits (n) sites (S) élémentaires d'observation sur le support solide, ledit index comprenant (n) informations élémentaires comportant chacune au moins les coordonnées 2D de chaque site élémentaire d'observation et les caractéristiques de son dépôt correspondant.
L'étape (f) du procédé selon la présente invention consiste à obtenir, par un traitement réactionnel de la collection selon (e) avec au moins un réactif de test, dans ou sur les (n) sites élémentaires respectivement, (n) entités de réaction, dont la caractérisation qualitative et/ou quantitative est représentative de la réactivité de l'entité d'intérêt avec le réactif de test.
Par "réactif de test", on entend toute substance employée afin de permettre la détection de l'entité d'intérêt dans ou sur les (n) sites (S) élémentaires du support solide. On entend par "détection" la détermination de la présence ou de l'absence d'une entité d'intérêt dans un prélèvement biologique, mais aussi la mesure et la quantification de ladite entité au sein de la préparation intermédiaire issue du prélèvement biologique correspondant.
Les performances des dispositifs et procédés selon l'invention autorisent, en effet, la réalisation de mesures qualitatives, quantitatives ou semi quantitatives.
Par "qualitatif, on entend ce qui se rapporte à la séparation, l'identification ou la description des caractères, sans qu'interviennent des notions de grandeur. En l'espèce, on peut considérer que "qualitatif signifie qu'il y a un signal, donc une entité d'intérêt dans le prélèvement biologique, ou qu'il n'y en a pas, c'est-à-dire qu'il n'y avait pas d'entité d'intérêt dans ledit prélèvement biologique.
L'analyse peut, en outre, être plus fine. C'est ce que l'on entend couvrir par "quantitatif, c'est-à-dire que l'on peut compter ou mesurer, en rapport avec la grandeur de certains caractères. Le réactif de test choisi est fonction de l'entité d'intérêt à détecter. Il peut notamment s'agir d'un réactif chimique, biologique ou thérapeutique.
L"'entité de réaction" est obtenue par mise en contact ou réaction, entre l'entité d'intérêt et le réactif de test, spécialement choisi pour refléter cette présence, absence ou quantité de l'entité d'intérêt. La liaison entre l'entité d'intérêt, par exemple à l'état libre au sein de la préparation intermédiaire, et le réactif de test peut être de nature diverse. Il peut notamment s'agir d'une liaison forte, ou d'une liaison faible, d'une liaison limitée dans le temps ou qui perdure. A titre indicatif, on peut citer les liaisons covalentes et les liaisons non covalentes, et notamment : - les liaisons électrostatiques, par exemple ionique,
- les liaisons de van der Waals,
- les liaisons hydrogènes,
- les interactions hydrophobes,
- les interactions covalentes réversibles, - les interactions par transfert de charge,
- les interactions biospécifiques.
L'étape (g) consiste à balayer méthodiquement la surface opératoire du au moins un support solide ayant réagi, et à détecter les (n) entités de réaction pour générer respectivement (n) signaux représentatifs, qualitativement et/ou quantitativement, de ladite réactivité dans lesdits (n) sites élémentaires d'observation, cette dernière étant appelée par la suite réactivité élémentaire.
La détection génère un signal.
Par "réactivité élémentaire", on entend la valeur représentant la présence, l'absence ou la quantité de l'entité d'intérêt au sein du prélèvement biologique, et donc au sein de l'élément (F) tridimensionnel. Cette valeur représente numériquement l'entité de réaction.
Selon l'étape (g), on génère et dispose d'un index (K) des réactivités élémentaires dans ou sur les (n) sites élémentaires, comprenant (n) informations élémentaires comportant chacune au moins les caractéristiques qualitatives et/ou quantitatives de son signal détecté.
Enfin, l'étape (h) permet, par corrélation des index (I1 J, K), de générer un profil 3D de réactivités de l'entité biologique d'intérêt au sein des zones élémentaires de l'élément fonctionnel du modèle biologique de référence, ayant réagi avec le réactif de test, complété par la documentation de référence.
Par "profil 3D", on entend une représentation tridimensionnelle de l'élément fonctionnel (F), indiquant en chacune des (n) zones élémentaires (Z) de prélèvements biologiques, la réactivité élémentaire (R) obtenue suite au traitement réactionnel du support solide sur lequel des quantités prédéterminées des préparations intermédiaires ont été déposées et ont réagi avec le réactif de test.
La présente invention présente l'avantage de mettre en œuvre des techniques de micro échantillonage. La possibilité de déposer sur une même surface un grand nombre de micro échantillons permet un gain de temps considérable. De part l'utilisation de telles techniques, l'invention s'inscrit également dans un contexte éthique et d'économie du matériel vivant et conduit à une réduction des coûts d'expérimentation.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, il se peut que les étapes (a) et (b) dudit procédé ne soient pas nécessaires. Ce sera notamment le cas lorsque l'on réitère le procédé sur un élément fonctionnel d'un modèle biologique identique ou similaire à celui d'un élément déjà analysé et appartenant à la même espèce. Par "espèce", on entend toute catégorie taxonomique regroupant des représentants semblables et qui peuvent se reproduire entre eux. Dans ce mode de réalisation, le procédé de détermination in vitro de la présente invention est le suivant :
(a) on définit un ensemble (E) de (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement biologique dans un élément fonctionnel (F) tridimensionnel ; on génère et dispose d'un index (I) desdites (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement en relation avec la représentation anatomique 3D dudit élément fonctionnel de référence, ladite représentation étant positionnée dans un repère 3D, et éventuellement on dispose des informations ou données spécifiques audit élément fonctionnel de référence, ledit index (I) comprenant (n) informations élémentaires comportant chacune au moins les coordonnées 3D de chaque zone élémentaire dans la représentation anatomique 3D dudit élément fonctionnel de référence,
(b) on procède et dispose des (n) prélèvements biologiques élémentaires, comprenant éventuellement chacun au moins une entité d'intérêt ; on obtient à partir des (n) prélèvements biologiques (n) préparations intermédiaires comprenant chacune éventuellement ladite entité d'intérêt, par exemple par traitement intermédiaire des (n) prélèvements biologiques élémentaires,
(c) on dispose d'au moins un support solide comportant une surface opératoire sur laquelle sont distribués (n) sites élémentaires d'observation ; on dépose une quantité prédéterminée des (n) préparations intermédiaires dans ou sur les (n) sites (S) élémentaires d'observation, respectivement pour obtenir une collection représentative des (n) prélèvements biologiques, par exemple stockés sur ledit même support solide ; on génère et dispose d'un index (J) desdits (n) sites (S) élémentaires d'observation sur le support solide comprenant (n) informations élémentaires comportant chacune au moins les coordonnées 2D de chaque site élémentaire d'observation et les caractéristiques de son dépôt correspondant,
(d) par un traitement réactionnel de ladite collection avec au moins un réactif de test, on obtient dans ou sur les (n) sites élémentaires respectivement (n) entités de réaction, dont la caractérisation qualitative et/ou quantitative est représentative de la réactivité de l'entité d'intérêt avec le réactif de test,
(e) on balaye méthodiquement la surface opératoire du au moins un support solide ayant réagi, et on détecte les (n) entités de réaction pour générer respectivement (n) signaux représentatifs, qualitativement et/ou quantitativement, de ladite réactivité dans lesdits (n) sites élémentaires d'observation ; on génère et dispose d'un index (K) des réactivités élémentaires dans ou sur les (n) sites élémentaires, comprenant (n) informations élémentaires comportant chacune au moins les caractéristiques qualitatives et/ou quantitatives de son signal détecté,
(f) par corrélation des index (I1 J, K), on génère un profil 3D de réactivités de l'entité biologique d'intérêt dans les zones élémentaires de l'élément fonctionnel (F), ayant réagi avec le réactif de test.
Selon la présente invention on choisit l'élément fonctionnel (F) tridimensionnel. Cet élément fonctionnel (F) tridimensionnel est préférentiellement un cerveau. Il s'agit par exemple d'un cerveau d'une souris ou d'un singe.
II est généralement d'usage, lorsque l'on souhaite effectuer un examen extemporané d'un élément fonctionnel, de réaliser un prétraitement, par exemple de congeler ou de réaliser une inclusion, de l'élément fonctionnel sur lequel on souhaite réaliser des prélèvements, de manière à figer l'eau tissulaire et augmenter la tenue de l'élément fonctionnel à découper. En effet, la résistance des tissus à la pression de l'arête de l'instrument coupant n'est pas suffisante et entraîne des détériorations qui rendent inexploitables les observations qui en résultent.
Différentes substances peuvent être employées pour l'inclusion de l'élément fonctionnel avant découpe. A titre indicatif, on peut notamment citer le Collodion, l'Esterwax, les résines époxy, les gommes, les gels de silice, la gélatine et la paraffine. Ainsi selon le procédé de la présente invention, ledit élément fonctionnel (F) tridimensionnel est fixé, par exemple congelé ou paraffiné.
De tels prétraitements, parfaitement connus par l'homme du métier, peuvent, en outre, être réalisés conjointement avec l'étape de prélèvement, comme cela apparaît à la lecture de la description qui suit.
En effet, selon la présente invention, après avoir défini l'ensemble (E) de (n) zones élémentaires (Z), on procède aux (n) prélèvements biologiques, au moyen d'un dispositif de prélèvement biologique. Toutes sortes de dispositifs de prélèvement, également appelé dans la présente invention moyens de prélèvement, peuvent être utilisées dans la présente invention.
On peut par exemple utiliser des outils réalisant des découpes systématiques de l'élément fonctionnel, sous forme de coupes ou lames. L'épaisseur de ces coupes ou lames est fonction du dispositif utilisé et du prétraitement effectué sur l'élément fonctionnel.
A titre indicatif, on peut utiliser trois types de dispositifs : la microdissection laser, le microtome et le cryostat. Le microtome est conçu spécialement pour la réalisation à l'air libre, à température ambiante de coupes de tissu congelé. Le fragment, placé sur le plot du microtome est congelé (CO2-chlόrure de méthyle) puis coupé. L'appareil permet donc dans le même temps de prétraiter l'élément fonctionnel, en l'espèce il le congèle, et de le découper. Les coupes obtenues sont généralement de l'ordre de 15 μm d'épaisseur. La découpe ayant été effectuée dans une dimension, par exemple dans le sens sagittal pour un élément orienté dans le sens antéro-postérieur au sein du modèle biologique, il est ensuite nécessaire de réaliser une découpe dans une autre dimension. Cette seconde découpe est alors réalisée de façon systématique ou on choisit plus spécifiquement certaines parties, selon la définition de l'ensemble (E) élaborée à l'étape précédente.
Le cryostat, quant à lui, est un microtome placé dans une enceinte réfrigérée. Le fragment tissulaire est préalablement congelé au CO2. Tout comme le microtome, l'appareil permet donc dans le même temps de prétraiter l'élément fonctionnel et de le découper. Des coupes fines de 3 à 5 μm sont réalisables. Il faut ensuite également réaliser une découpe dans une autre dimension, par exemple dans un plan transverse au plan de première découpe.
On peut également utiliser toutes sortes d'outils de forme et d'épaisseur appropriés susceptible de réaliser un prélèvement biologique en surface mais également en profondeur. Il peut par exemple s'agir d'un outil composé d'un pistolet automatique et d'une aiguille, d'un dispositif comprenant une aiguille creuse qui protège un petit couteau cylindrique rotatif, d'une matrice de découpe adaptée, d'un "micropunch". Dans ce cas, de tels outils peuvent réaliser une découpe systématique, par exemple robotisée, mais également une découpe dirigée par la main de l'homme, ou plus ou moins automatique. Les moyens de prélèvement peuvent être dirigés par la main de l'homme du métier, mais ils peuvent également être commandés par des moyens de commande.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, les (n) prélèvements biologiques élémentaires sont réalisés par le biais d'un dispositif de prélèvement choisi parmi un microtome, un cryostat, une matrice de découpe adaptée, un "micropunch" et un dispositif utilisant le laser .
Selon un mode de réalisation de la présente invention, les dispositifs de prélèvement utilisés dans la présente invention permettent de réaliser des prélèvements biologiques élémentaires sous forme de segments cubiques variant entre 0,01 et 10 mm3, par exemple des segments cubiques de
1 mm3.
Comme mentionné plus haut, les supports utilisés dans la présente invention peuvent être de différents types. Il peut notamment s'agir de supports comportant une surface opératoire inerte mais il peut également s'agir de supports comportant une surface opératoire réactive.
Selon une variante, la matière du support est différente de celle de la surface opératoire. Comme matière de support et/ou de la surface opératoire, on peut utiliser, par exemple, de la nitrocellulose, du polyamide/nylon chargé positivement ou non chargé, du papier, du carton, du bois, de la matière plastique, du tissu, du métal, du verre, une matière organique sous forme de billes ou de gel, ou encore une matière minérale. La surface du support peut être plane. Elle peut également comporter des encoches ou puits, destinés à recevoir une quantité prédéterminée de chacune des préparations intermédiaires, type plaques 96- puits. Les puits peuvent être de différentes formes et notamment ils peuvent être à fond en V, en U ou plat. Ils peuvent également avoir différentes contenances, par exemple 300 μL.
Il est tout à fait envisageable, selon la présente invention, d'utiliser des supports et/ou des surfaces opératoires préalablement traités ou préparés ou des surfaces permettant une interaction protéine-protéine. De telles surfaces peuvent être de nature très variées, tant sur le plan chimique (surfaces anioniques ou cationiques, hydrophobes ou hydrophiles...) que biologique (anticorps ou leurs fractions immunoréactives, aptamères, récepteurs ou ADN...). Ces surfaces possèdent ainsi une certaine capacité à retenir par affinité des protéines d'intérêt. On peut par exemple citer les membranes préincubées avec des anticorps anti-cytokines, ou anti-kinases, ou anti-peptides phosphorylés.De telles surfaces peuvent notamment être choisies parmi les matériaux appelés puces à protéines (ou "chips" en anglais). Un certain nombre de puces à protéines sont disponibles sur le marché. De telles puces se trouvent parfois sous une forme qui n'est pas adaptées à leur utilisation dans la présente invention.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, ledit support comportant une surface opératoire est choisi parmi les membranes et les plaques de microtitration. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, ledit support comportant une surface opératoire est une membrane (nitrocellulose, nylon...) appliquée sur un autre support solide, par exemple contrecollée sur une lame de verre ou un matériau en métal.
Selon la présente invention, on dépose une quantité prédéterminée des (n) préparations dans ou les (n) sites (S) du support. Cette quantité est fonction du dispositif disponible, par exemple du volume de la micropipette à disposition. L'étape (e) peut être réalisée manuellement ou de manière robotisée. Avantageusement, on utilise des moyens de commande pour réaliser cette étape.
Selon une variante de la présente invention, la quantité prédéterminée des (n) préparations intermédiaires déposée respectivement dans ou sur les (n) sites élémentaires d'observation dudit support solide est un volume liquide variant entre 1 μL et 1 pL. Selon une autre variante de la présente invention, il s'agit d'un volume liquide variant entre 0,01 μL et 10 pL.
Comme défini ci-dessus, par "préparations intermédiaires", on entend toutes sortes de préparations obtenues par traitement chimique, biologique, physique, physico-chimique des prélèvements.
Il peut s'agir notamment d'extractions, couramment utilisées en biologie et connues de l'homme du métier. On a souvent recours, pour de tels traitements à des réactifs ou substances employés en vue des réactions qu'ils sont susceptibles de produire. A titre indicatif, on peut citer la technique d'extraction au phénol chloroforme pour l'ADN et la technique d'extraction au Trizol pour l'ARN. Il est à noter que de nombreux réactifs sont disponibles, prêts à l'emploi, ce qui permet de simplifier les opérations aboutissant aux préparations intermédiaires de la présente invention.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, les préparations intermédiaires sont obtenues par une extraction protéique et/ou nucléique sur lesdits (n) prélèvements biologiques.
Selon la présente invention, les préparations intermédiaires sont obtenues pour chaque prélèvement de l'ensemble (E) en utilisant des moyens de préparation. Ces moyens de préparation peuvent être dirigés par la main de l'homme du métier, mais ils peuvent également être commandés par des moyens de commande.
Le réactif de test de la présente invention est choisi en fonction de l'entité d'intérêt à détecter.
A titre indicatif de réactif biologique de test selon la présente invention, on peut notamment utiliser des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre la protéine dont on veut analyser la présence. Ces anticorps, ou leurs fractions immunoréactives peuvent, en outre, être couplés, par exemple à la FITC, peroxydase, phosphatase alcaline, biotine ou phycoérythrine, selon la méthode que l'on utilisera pour la détection et/ou quantification.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, ledit réactif de test est choisi dans le groupe consistant en les marqueurs de fluorescence ou de luminescence, les marqueurs de radioactivité, les marqueurs colorimétriques, les molécules d'acide nucléique, les anticorps monoclonaux et les anticorps polyclonaux. La détection peut faire appel à des techniques physiques (résonance plasmonique de surface, détections électriques,...).
Selon une variante de la présente invention, l'entité d'intérêt est un acide nucléique. A titre indicatif, on utilise dans ce cas comme réactif de test un anticorps anti-acide nucléique ou un fragment d'acide nucléique complémentaire de la séquence cible. L'homme du métier dispose alors de plusieurs possibilités de détection. L'anticorps primaire peut par exemple être conjugué à une enzyme, dont l'activité, en présence d'un substrat déterminé, sera preuve de la présence de la protéine d'intérêt ou de la séquence d'intérêt. On peut également utiliser un anticorps secondaire anti-anticorps primaire. Le réactif de test peut également être choisi de manière à ne pas dénaturer la préparation intermédiaire. L'"entité de réaction" est obtenue par mise en contact ou réaction, entre l'entité d'intérêt et Ie réactif de test, spécialement choisi pour refléter cette présence, absence ou quantité de l'entité d'intérêt. Toutes les techniques réactionnelles à des fins analytiques, connues par l'homme du métier, peuvent être mises en oeuvre. En particulier, toute technique impliquant une reconnaissance spécifique (ligand-récepteur, neurotransmetteur, "binding",...etc.) peut être utilisée selon la présente invention. Différents modes de réalisation de la présente invention sont donnés ci-après, cela de façon non exhaustive et à titre purement indicatif.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, et comme décrit ci-dessus, il est envisageable d'utiliser comme surface opératoire des surfaces permettant une réactivité particulière vis-à-vis des protéines. De telles surfaces peuvent être de nature très variées, et possèdent ainsi en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques une certaine capacité à retenir par affinité des protéines d'intérêt. De telles protéines capturées et retenues sur la surface opératoire du support selon la présente invention, sont ensuite éluées sélectivement par des conditions de lavages plus ou moins stringentes. Dans un tel mode de réalisation de l'invention, le traitement réactionnel consiste donc en une lyse (douce notamment, ou plus vigoureuse) et extraction des protéines et en l'utilisation d'enzyme, de détergents et/ou d'inhibiteurs de protéases. Les protéines sont ensuite caractérisées par combinaison de la chromatographie d'affinité (étape de séparation) et de la spectrométrie de masse. Deux approches permettent d'identifier des protéines par spectrométrie de masse : la carte massique (MS) et le séquençage par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Ces techniques, et notamment le SELDI-TOF, permettent, en utilisant un seul échantillon, de générer un nombre important de spectres différents, ce en quelques heures. Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, il est envisageable d'utiliser comme surface opératoire des surfaces permettant une interaction protéine-protéine ou interaction biospécifiques. On utilise un test immuno-enzymatique de type ELISA, utilisé pour la détection d'antigène ou d'anticorps. Dans le cas de la détection d'antigènes, on fixe au fond d'une plaque de microtitration, type plaque 96-puits, l'anticorps correspondant à l'anticorps recherché. On dépose ensuite une quantité prédéterminée d'une des (n) préparations intermédiaires contenant potentiellement l'anticorps recherché, ce dans chacun des puits. Après lavage, seuls les antigènes fixés aux anticorps au fond de la plaque, sont présents. On les met en évidence en utilisant un autre anticorps spécifique des antigènes, par exemple, couplé à une enzyme qui transforme un substrat incolore en un produit coloré témoin de la présence de l'anticorps spécifique et donc de la présence de l'antigène.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, on utilise une variante du test ELISA : le test ELISpot ("enzyme-linked immunospot"), effectué sur un support particulier immuno-adsorbant. Les puits d'une plaque de microtitration à fond de nitrocellulose sont recouverts avec un anticorps monoclonal spécifique de l'entité d'intérêt, par exemple une cytokine. Une quantité prédéterminée de chacune des (n) préparations intermédiaires contenant dès cellules est ajoutée dans les puits en présence du stimulus choisi et incubées à 370C. Pendant cette période d'incubation, les cytokines sécrétées par les cellules se fixent à l'anticorps immobilisé. Après lavage, un anticorps conjugué à une biotine et spécifique de la cytokine à détecter est ajouté dans les puits. Après plusieurs lavages, on ajoute de la streptavidine couplée à la phosphatase alcaline dont la fixation est ensuite révélée par le substrat. Des précipités colorés bleus se forment au site de localisation de la cytokine sécrétée et apparaissent comme des spots. Chaque spot individuel représente une cellule ayant sécrété la cytokine analysée.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, on utilise des billes, conjointement avec la technique de cytométrie de flux pour quantifier la présence de plusieurs protéines simultanément (en anglais "Cytométrie Bead Array"). Pour cela, des billes sont mélangées avec des anticorps couplés et déposées au sein d'une plaque de microtitration, type plaque 96-puits. On dépose ensuite une quantité prédéterminée d'une des (n) préparations intermédiaires contenant potentiellement la ou les protéines recherchées, ce dans chacun des puits. Après rinçage, seules les protéines fixées aux anticorps, eux-mêmes fixés sur les billes, sont présentes. On les met en évidence en utilisant un ou plusieurs anticorps spécifiques des protéines recherchées, chacun de ces anticorps étant conjugué à un fluorochrome. Le mélange est ensuite soumis à la cytométrie de flux.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, on utilise une technique de type ELISA (sandwich) qui permet une analyse à haut débit de la présence éventuelle de protéines interagissant avec des acides nucléiques (facteurs de transcription, éléments de régulation de traduction,...). Pour cela on utilise une sonde de type oligonucléotide simple, ou double-brin biotinylé et contenant la séquence consensus du ou des facteurs de transcription à détecter/quantifier. Cette sonde est incubée avec une partie de chacun des (n) prélèvements biologiques préparés de manière à ne conserver que la fraction protéique (susceptible de comprendre le ou lesdits facteurs de transcription), et en présence d'un tampon adapté. Après incubation, chacun des (n) complexes "prélèvement biologique préparé/sonde/tampon" est transféré sur un support adapté, type plaque 96-puits, préalablement traitée à la streptavidine. L'oligonuclétotide biotinylé est alors immobilisé par liaison à la streptavidine et le matériel non lié est éliminé par lavage. La présence éventuelle d'un facteur de transcription, lié à la séquence consensus, est mise en évidence en utilisant un anticorps primaire spécifique anti-facteur de transcription. Un anticorps secondaire anti-anticorps primaire, par exemple conjugué à I1HRP, permet de détecter/quantifier la présence éventuelle du ou des facteurs de transcription au sein des (n) prélèvements biologiques.
Selon un autre mode de réalisation du procédé de la présente invention, on a recours à la technique de "Dot Blot", également appelé "Slot Blot", qui permet, sur un support de type membrane, de quantifier l'ARN ou I1ADN, sans séparation préalable sur gel d'électrophorèse, ce par le biais d'une hybridation spécifique avec une sonde marquée (marquage radioactif ou marquage enzymatique). L'acide nucléique-cible est appliqué sur un support de nitrocellulose ou de nylon, chargé positivement ou non. Dans ce cas, le choix du support est lié à la possibilité pour le matériau constitutif de la surface opératoire de permettre un "accrochage" dudit acide nucléique. On utilise alors, comme moyen de détection, une sonde d'acide nucléique, simple brin de séquence complémentaire de celle de l'acide nucléique-cible incorporé à l'objet et capable de s'hybrider à celle-ci, ce qui permet une détection spécifique de l'acide nucléique-cible par hybridation moléculaire. L'acide nucléique-sonde peut avoir différentes longueurs, différentes séquences et être de différentes natures. Il peut s'agir d'ADN ou d'ARN d'origine naturelle ou synthétique, ou encore de dérivés de synthèse contenant en tout ou partie des bases rares ou des bases modifiées. L'hybridation éventuelle peut être détectée par tout moyen de détection approprié, connu dans le domaine des sondes nucléiques, par exemple par marquage radioactif de la sonde. Le marquage peut également être réalisé par tout système de marquage approprié, connu dans le domaine des sondes nucléiques. La détection peut également être réalisée par des moyens chimiques et des moyens physiques, par exemple des moyens électriques, électroniques, radioélectriques ou magnétiques.
La technique de "Dot Blot" permet également de révéler la présence d'une protéine sur un support sur lequel on a déposé un certain volume de solution des (n) préparations intermédiaires contenant potentiellement ladite protéine. Un anticorps spécifique à cette protéine, ou spécifique à une étiquette greffée sur ladite protéine, est alors utilisé pour le traitement réactionnel. II est en outre important de noter que, selon la présente invention, un même support solide peut comporter des préparations intermédiaires provenant de modèles biologiques différents. Dans ce cas, l'information génétique diffère selon les deux groupes, ou plus, de prélèvements effectués.
Dans la mesure où l'ensemble des (n) prélèvements biologiques est réalisé au sein d'un même élément fonctionnel, chaque prélèvement comporte la même information génétique, aux processus de mutation génétique naturelle près.
Dans un mode de réalisation de la présente invention, on réalise des lots (ou "pool") d'échantillons équivalents provenant de régions anatomiques identiques, mais de plusieurs représentants du modèle biologique. Ceci permet de présenter des quantités de matériel homogène plus importantes pour des productions par lot et de moyenner les différences entre individus.
Les caractéristiques et objets de la présente invention sont mieux définis à la vue de la description qui suit et des figures.
La figure 1 montre, de façon schématique et non limitative, un système de détermination in vitro de la réactivité d'une entité d'intérêt au sein d'un élément fonctionnel F tridimensionnel.
La figure 1 bis est un grossissement d'une partie du système de détermination de la figure 1.
La figure 2 illustre, de façon schématique et non limitative, un des avantages de la présente invention. Un ensemble E de n prélèvements réalisés au niveau des n zones élémentaires Z de prélèvement peut, après préparation, être disposé sur une multiplicité de supports solides 7i, 72, 7n, identifiés par un identifiant unique ID. La figure 3 représente, sous forme de diagramme, un mode de réalisation des étapes de détection et de traitement des réactivités élémentaires R en chaque site S du support, à partir d'une image de celui-ci.
La figure 4 montre de façon schématique un exemple de réalisation de quelques étapes du procédé de la présente invention chez une souris.
La figure 5 montre un dispositif d'analyse selon la présente invention, qui comporte un support solide qui comprend n sites S élémentaires d'observation distribués selon deux dimensions sur lesquels ont été déposé une quantité déterminée des n préparations intermédiaires des n prélèvements biologiques. Le dispositif positionné sur la gauche est celui avant traitement réactionnel de la collection ; celui qui se trouve sur la droite de la figure est celui obtenu après traitement réactionnel avec au moins un réactif de test.
Les figures 6 et 7 représentent un profil 3D de réactivité, tel qu'obtenu selon le procédé de la présente invention, par corrélation des 3 index générés au cours du procédé.
Le procédé de détermination ci-dessus défini est maintenant décrit par référence aux figures.
Selon le procédé de la présente invention, on choisit et dispose d'un élément fonctionnel F, en l'espèce d'un cerveau, prélevé sur un représentant du modèle biologique, par exemple une souris ou un singe.
Tel que montré schématiquement à la figure 4, le modèle biologique de référence est une souris et l'élément fonctionnel choisi est le cerveau de cette souris. On génère ou dispose d'une représentation 3D anatomique de cet élément fonctionnel et on positionne cet élément dans un repère 3D. On définit un ensemble E de n zones élémentaires de prélèvement biologique au sein de cet élément. On génère et dispose d'un index desdites n zones élémentaires au sein de la représentation 3D anatomique du cerveau de la souris. La figure 4 montre également la surface opératoire du support solide sur laquelle des quantités prédéterminées de préparations intermédiaires des prélèvements sont déposées pour analyse.
La figure 1 , dont une partie de celle-ci est montré plus précisément sur la figure 1 bis, montre un système de détermination selon la présente invention. On génère une représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel F tridimensionnel, par le biais des moyens 4 que l'on positionne dans le repère Oi. Cette représentation est stockée dans les moyens de stockage 9. On définit des zones élémentaires de prélèvement, et notamment Z1 et Z2 (voir figure 1 bis).
On génère un premier index I (moyens de stockage 3) qui comprend les informations élémentaires des zones élémentaires de prélèvement, et notamment leurs coordonnées 3D.
11 4 Z1 (xi. y-i. z-i)
12 → Z2 (X2, y2, Z2)
On procède auxdits prélèvements par les moyens de prélèvement
6, commandés par les moyens de commande 5, par exemple un robot.
On prépare les préparations intermédiaires par le biais des moyens de préparation 6, également commandés par les moyens de commande 5, ce à partir des prélèvements réalisés. On dépose une quantité prédéterminée des préparations intermédiaires sur les sites élémentaires d'observation, S1 et S2 notamment, du support 7-]. Ce support 7-i possède un identifiant unique ID (voir notamment Figure 5).
Les coordonnées 2D des sites élémentaires- d'observation, et notamment de S1 et S2, sont stockées dans un deuxième index (moyens de stockage 8), l'index J :
J1 -> S1 (α-i, P1) J2 -> S2 (α2, β2)
La collection ainsi obtenue subit un traitement réactionnel 10, avec au moins un réactif de test et on obtient dans ou sur les sites du support les entités de réaction, dont la caractérisation qualitative et/ou quantitative est représentative de la réactivité de l'entité d'intérêt avec le réactif de test.
On balaye la surface opératoire du support et on détecte les entités de réaction, et notamment R1 et R2, par le biais des moyens de détection 12.
On stocke ces réactivités élémentaires dans un troisième index (moyens de stockage 14) :
KH RI K2 → R2 On corrèlθ les 3 index et la représentation anatomique par les moyens de corrélation 18, afin de générer un profil 3D de réactivité, tel que celui visualisé sur le poste client 22 via des moyens de visualisation 23 de la Figure 1 ou tel qu'obtenu à la Figure 6 ou 7. Ainsi, la présente invention concerne également un système de détermination in vitro de la réactivité d'une entité d'intérêt. Ce système est caractérisé en ce qu'il comporte :
- des premiers moyens de génération (2) d'un ensemble (E) de (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement biologique, destinés à être réalisés sur un élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence, lui-même prélevé sur un modèle biologique de référence,
- des premiers moyens de stockage (3) des coordonnées 3D dans un repère 3D de chacune des (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement de l'ensemble (E), une fois générées, sous forme indexée dans un premier index (I),
- des moyens de prélèvement (6), éventuellement commandés par des moyens de commande (5), permettant de réaliser un ensemble (E) de (n) prélèvements au niveau des (n) zones élémentaires (Z) définies sur ledit élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence, les (n) prélèvements comprenant chacun éventuellement au moins une entité d'intérêt,
- des moyens de préparation (6), éventuellement commandés par des moyens de commande (5), permettant de réaliser des préparations intermédiaires à partir respectivement des prélèvements de l'ensemble (E), comprenant chacune éventuellement ladite entité d'intérêt, - des moyens de dépôt (6), éventuellement commandés par des moyens de commande (5), permettant de déposer une quantité prédéterminée des (n) préparations intermédiaires correspondant à l'ensemble (E) des (n) prélèvements respectivement, dans ou sur (n) sites (S) élémentaires d'observation d'au moins un support solide (7), selon une répartition en deux dimensions, les coordonnées 2D de chacun des (n) sites (S) étant stockées dans des second moyens de stockage (8), sous forme indexée dans un second index (J),
- des troisièmes moyens de stockage (9) d'une représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence, - des moyens de réalisation d'un traitement réactionnel (10), avec au moins un réactif de test des (n) préparations intermédiaires, sur ledit support solide (7), pour obtenir respectivement (n) entités de réaction dans ou sur les (n) sites dudit support solide,
- des moyens de détection (12) des entités de réaction,
- des quatrièmes moyens de stockage (14) des (n) réactivités élémentaires (R) en chacun des (n) sites (S) dudit support (7), sous forme indexée dans un troisième index (K),
- des moyens de corrélation (18) des premier, second et troisième index (I, J, K),
- des cinquièmes moyens de stockage (19) des coordonnées 3D des (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement, corrélées avec les (n) réactivités élémentaires (R),
- des moyens de génération (20) d'un profil 3D à partir d'au moins une partie de l'ensemble (E) des (n) prélèvements, comportant le cas échéant une représentation graphique 3D des réactivités élémentaires (R), - éventuellement des moyens de visualisation (23) du profil 3D de réactivité ainsi générés.
On peut notamment avoir recours à des moyens de commande (5), par exemple à des outils robotisés. Ceux-ci présentent de nombreux avantages parmi lesquels figurent notamment un gain de temps et une précision des actes accomplis, ce qui permet notamment de déposer les échantillons à des distances relativement petites, sans pour autant risquer un chevauchement des quantités prédéterminées des préparations intermédiaires.
La figure 1 montre un mode de réalisation du système de détermination in vitro de la réactivité d'une entité biologique d'intérêt sur un modèle biologique de référence selon la présente invention. La figure 1 bis précise une partie du système représenté à la figure 1.
Ce système comporte, sous le contrôle d'un premier acteur A :
- des premiers moyens de génération 2, ou de saisie, d'un ensemble E de n zones élémentaires Z (Z-i, Z2... à Zn), définies par au moins trois coordonnées (x, y, z) dans un repère tridimensionnel O-i, de prélèvements biologiques, destinés à être réalisés sur un élément fonctionnel F tridimensionnel de référence du modèle biologique de référence,
- des premiers moyens de stockage 3 des coordonnées 3D de chacune des n zones élémentaires Z de prélèvement de l'ensemble E une fois générées, sous forme indexée dans un premier index I (U pour Z-], I2 pour Z2... à In pour Zn), - des moyens ou dispositifs de prélèvement 6 commandés par des moyens de commande 5, afin de réaliser l'ensemble E de n prélèvements au niveau des n zones élémentaires Z au sein de l'élément fonctionnel F positionné dans un repère tridimensionnel O1, - de moyens de préparation 6 commandés par des moyens de commande 5, permettant de réaliser des préparations intermédiaires pour chaque prélèvement de l'ensemble E réalisé comprenant chacune éventuellement ladite entité d'intérêt,
- des moyens de dépôt 6 commandés par des moyens de commande 5, permettant de déposer la quantité prédéterminée des n préparations intermédiaires, par exemple un volume variant entre 1 μL et 1 pL, dans ou sur n sites S élémentaires d'observation d'au moins un support solide 7, par exemple une plaque de microtitration, type plaque 96-puits, selon une répartition en deux dimensions (repère 02), les positions bidimensionnelles étant définies par deux coordonnées {a, β) sur le support 7 dans un repère O2, et stockées dans des second moyens de stockage 8, sous forme indexée par un second index J (Ji pour S-t, J2 pour S2... à Jn pour Sn).
Le dispositif de prélèvement 6, les moyens de préparation et les moyens de dépôt sont tels que ci-dessus définis. Les index I et J sont corrélés de façon à pouvoir associer de façon unique une valeur de I à une valeur de J.
Le système comporte sous le contrôle du premier acteur A des moyens 4 permettant de générer, à partir d'un élément fonctionnel F tridimensionnel de référence, une représentation 3D anatomique de cet élément et le stockage de cette représentation dans des troisièmes moyens de stockage 9.
Il est ainsi possible de réaliser un ensemble de supports 7, à partir de prélèvements effectués sur un seul et même élément fonctionnel F tridimensionnel. Selon une variante de la présente invention, chaque support 7 comporte en chacun de ses sites S élémentaires d'observation, une quantité prédéterminée d'une nième préparation intermédiaire issue du nième prélèvement biologique, qui correspond à la nième zone élémentaire Z prédéfinie. De préférence, chaque support comprend une quantité prédéterminée de l'ensemble des n préparations, ce qui permet une visualisation d'ensemble des entités de réaction, et de manière à obtenir une collection représentative de l'ensemble des prélèvements. De préférence, on réalise plusieurs supports 7 identiques.
Un ou plusieurs supports 7 sont transmis du premier acteur vers un second acteur B. Le système comporte, sous le contrôle du second acteur B :
- des moyens de réalisation d'un traitement réactionnel 10 sur ledit support solide 7 à deux dimensions, avec au moins un réactif de test, constituant en chaque site S élémentaire d'observation, une entité de réaction, dont la caractérisation qualitative et/ou quantitative est représentative de la réactivité de l'entité d'intérêt avec le réactif de test,
- des moyens de détection 12 des entités de réaction et des moyens de traitement (ou d'analyse) 13 de la réactivité élémentaire R, en chaque site S élémentaire d'observation du support 7,
- des quatrièmes moyens de stockage 14 des n réactivités élémentaires R en chacun des n sites S dudit support 7, sous forme indexée par un troisième index K (Ki pour R-i, «2 pour R2... Kn pour Rn).
Les index J et K sont corrélés de façon à pouvoir associer de façon unique une valeur de J à une valeur de K.
Le système comporte des moyens de transfert des données 15 reliés à des moyens de communication 16 permettant de communiquer des ensembles de réactivités élémentaires R au premier acteur A.
De plus, sous le contrôle du premier acteur A, le système comporte, sur un serveur informatique 17 :
- des moyens de corrélation 18 entre les réactivités élémentaires R et les zones élémentaires Z de prélèvements biologiques, par corrélation des premiers, second et troisième index I, J, K, suite à la réception des données depuis un second acteur B,
- des cinquièmes moyens de stockage 19 des coordonnées 3D des n zones élémentaires Z de prélèvement, corrélées avec les n réactivités élémentaires R.
Sous le contrôle du premier acteur A, le système comporte des moyens de génération 20 du profil 3D, à partir d'au moins une partie de l'ensemble E des n prélèvements, comportant une représentation graphique des réactivités élémentaires R. Les moyens de génération 20 comportent des moyens d'extraction de données à partir : - des moyens de stockage 19 des coordonnées 3D des n zones élémentaires Z de prélèvement, corrélées avec les n réactivités élémentaires R, et
- des moyens de stockage 9 de la représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel F tridimensionnel de référence.
Sous le contrôle du second acteur B1 le système comprend un poste client 22, équipé de moyens de communication en réseau 24 permettant de communiquer avec le premier acteur A, et en particulier le serveur 17 par les moyens de communication 16. Le poste client comporte en particulier des moyens de visualisation 23 du profil 3D de réactivité, générés par les moyens de génération 20.
Dans ce mode de réalisation, les moyens de stockages 3, 8, 9, 14, 19 sont constitués par des entrées dans un système de base de données de type système de base de donnée relationnelle, pour la partie sous la responsabilité du premier acteur A et par des fichiers pour la partie sous le contrôle du second acteur B.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le système est caractérisé en ce que :
- les premiers moyens de génération 2, - les premiers, second, troisième et cinquième moyens de stockage
3, 8, 9, 19,
- éventuellement les moyens de commande 5,
- les moyens de prélèvement 6,
- les moyens de préparation, - les moyens de dépôt,
- les moyens de corrélation 18, et
- les moyens de génération 20 de profil 3D, sont agencés pour être fonctionnellement sous le contrôle d'au moins un premier acteur (A), et en ce que : - les moyens de réalisation d'un traitement réactionnel 10,
- les moyens de détection 12 des entités de réaction et les moyens de traitement 13 des réactivités élémentaires R,
- les quatrièmes moyens de stockage 14, sont agencés pour être fonctionnellement sous le contrôle d'au moins un second acteur B, ledit ou lesdits supports solides 7 étant transmis du premier au second acteur, et le système comprenant de plus des moyens de communication 16 entre au moins un premier acteur A et au moins un second acteur B, permettant à ce dernier de communiquer au premier acteur A les données de réactivité élémentaire R, et au premier acteur A de communiquer au second acteur B les données d'au moins un profil 3D de réactivités.
Cette disposition permet le stockage d'une grande quantité de données sous le contrôle de l'acteur A et une plus grande facilité d'installation des composants logiciels sous le contrôle de l'acteur B. L'indexation I, J, K dans les moyens de stockage permet d'identifier un prélèvement auquel correspond un site S élémentaire d'observation et une réactivité élémentaire R1 ces prélèvements appartenant à un ensemble de prélèvement E. Les index I, J, K peuvent toutefois être différents.
A chaque support 7, est associé un identifiant unique ID permettant d'identifier, dans le système, les réactivités élémentaires R correspondant à un support particulier.
Les moyens de détection 12 des entités de réaction sont constitués, selon une première variante, par des moyens de prise d'une image du support 7. Les moyens de traitement de l'image 13 évaluent la réactivité élémentaire R en chaque site S élémentaire d'observation en fonction de la luminance L dans la zone correspondante sur l'image dudit support 7.
A titre indicatif, les moyens de communication 16 peuvent notamment être constitués par une connexion Internet, cette connexion pouvant être de type sécurisée. Tout autre type de connexion en réseau peut également être utilisée.
Le serveur informatique 17 comprend notamment les moyens de corrélation 18 de l'index I, i.e. des coordonnées 3D de chacune des n zones élémentaires Z de prélèvement de l'ensemble E, de l'index J, i.e. des coordonnées 2D de chaque site S élémentaire d'observation du support 7 et de l'index K, i.e. des réactivités élémentaires R avec les n zones élémentaires Z de prélèvement, et les moyens de génération 20 de profils 3D. En particulier, ce serveur informatique 17 peut être constitué d'un serveur matériel comportant un serveur d'application logiciel permettant de réaliser des connexions multiples avec des seconds acteurs B. Une architecture basée sur des composants en langage Java, en particulier sur la technologie des Servlets peut être avantageusement utilisée.
Toutefois, d'autres configurations pourront sans difficulté être mises en oeuvre par un homme du métier. Le résultat de l'extraction des données par les moyens de génération 20 de profils 3D à partir des moyens de stockage 9 et 19 consiste en la réalisation d'un fichier de représentation du modèle tridimensionnel, en particulier dans un format standardisé. A cet effet, un format standard de type VRML peut être utilisé. Un fois ce fichier constitué, il peut être communiqué par les moyens de communication 16 sur le poste client 22.
Il est ainsi possible, dans ce fichier, de représenter la réactivité élémentaire R en chaque zone élémentaire Z de prélèvement par un niveau de couleur en chaque zone. Les données de référence provenant des moyens de stockage 9 permettent également de définir les contours de l'élément fonctionnel et ses constituants dans le modèle tridimensionnel.
Le poste client est équipé de moyens de communication en réseau 24 sous forme d'une carte réseau, et d'un navigateur 25 permettant en particulier l'affichage de page HTML, et d'intégrer des moyens de visualisation 23. En particulier, ces moyens de visualisation 23 peuvent être constitués par un composant de type Applet en langage Java permettant de visualiser au moins un modèle tridimensionnel contenu dans un fichier au format VRML.
Selon une variante, le système comporte des moyens 4 permettant la génération, à partir d'un élément fonctionnel F tridimensionnel de référence, d'une représentation 3D anatomique de cet élément.
Selon une autre variante, la représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel F n'est pas obtenue par des moyens de génération 4, mais provient d'une documentation de référence, les dimensions de la représentation et son orientation dans le repère 3D étant adaptées à celle de l'élément fonctionnel, notamment par l'application d'une transformation, plus particulièrement une déformation contrôlée, à la géométrie générale de l'objet.
Comme illustré sur la figure 2, il est possible d'obtenir à partir d'un seul élément fonctionnel F un ensemble E de prélèvements réalisés au niveau des n zones élémentaires Z. Ce même ensemble E de prélèvements peut, après préparation, être disposé sur une multiplicité de supports solides 7-ι, 72, 7n, identifiés par un identifiant unique ID. Comme illustré sur la figure 3, les moyens de traitement 13 permettent de déterminer la réactivité élémentaire R en chaque site S du support, à partir d'une image de celui-ci, prise par les moyens de détections 12, constitués par des moyens de prise d'une image, et notamment un scanner. Les étapes suivantes sont réalisées, en utilisant une programmation logicielle ou une carte électronique dédiée, suite à la prise d'image dans une première étape EDR1 :
- dans une seconde étape EDR2, un maillage de l'image en régions contenant chacune un seul site S élémentaire d'observation est effectué,
- dans une troisième étape EDR3, la valeur d'un paramètre de luminance L est calculée pour chaque pixel,
- dans une quatrième étape EDR4, chaque région est segmentée par seuillage, seuls les pixels dont la luminance est supérieure à un seuil donné, en particulier égal à la somme de la luminance du fond et de l'écart type de luminance sur l'ensemble des pixels de l'image, sont considérés comme faisant partie d'un amas représentatif de le la réactivité élémentaire R,
- dans une cinquième étape EDR5, la valeur d'une grandeur représentative de la réactivité élémentaire R est calculée pour chaque amas correspondant à un site S, en particulier comme la somme sur l'amas de pixel de la luminance L.
La présente invention concerne également un dispositif d'analyse comportant au moins un support solide (7), ledit support étant tel que ci-dessus défini et comprenant (n) sites (S) élémentaires d'observation distribués selon deux dimensions dudit support, ledit dispositif étant caractérisé en ce qu'une quantité prédéterminée de chacune des (n) préparations intermédiaires des (n) prélèvements biologiques, prélevés dans un élément fonctionnel (F) tridimensionnel d'un modèle biologique de référence, est déposée respectivement en chacun des (n) sites (S) élémentaires dudit support solide (7).
Il est en outre important de noter que selon un mode de réalisation de la présente invention, chacun desdits (n) prélèvements biologiques comporte la même information génétique, aux processus de mutation génétique naturelle près, l'ensemble des (n) prélèvements biologiques étant réalisé au sein d'un même élément fonctionnel. Ainsi le dispositif de la présente invention, permet de déterminer la réactivité in vitro d'une entité d'intérêt au sein du même élément fonctionnel.
L'exemple qui suit permet de comprendre l'intérêt de la présente invention.
Exemple 1 : préparation de modèles murins de pathologie neurodéqénérative Le modèle biologique choisi est la souris. L'élément fonctionnel est le cerveau. On utilise un atlas stéréotaxique du cerveau de souris.
1. Prélèvements biologiques
Les prélèvements sont réalisés sur le cerveau par "micro-punching" sur coupe à congélation ou par découpe 3D à l'aide d'une matrice. Entre deux découpes, une prise de vue numérique permet d'effectuer un repérage visuel permettant de recadrer la zone élémentaire de prélèvement dans la structure anatomique, ce par rapport à l'atlas stéréotaxique de référence. La photographie est positionnée par rapport à l'atlas de manière semi automatique. La position de chaque zone élémentaire de prélèvements biologiques est ainsi repérée dans le cerveau. On stocke les coordonnées 3D de chaque zone élémentaire, sous forme indexées, dans un premier index.
L'utilisation d'imagerie IRM permet également un repérage précis de l'organe étudié par rapport au modèle.
2. Préparation d'une solution tampon
Chaque prélèvement biologique est traité dans une solution tampon adaptée.
Des extraits des solutions tampon préalablement préparées sont répartis dans des microplaques 96 puits. Chaque puit numéroté contient les préparations intermédiaires.
On procède ensuite comme suit :
- Extraction des protéines dans un tampon d'extraction (adapté à l'extraction des protéines solubles, membranaires ou nucléaires) ;
- Centrifugation en plaque 96 puits ; - Récupération du surnageant ;
- Dosage des protéines par MicroLowry ; - Normalisation des concentrations de protéines à la concentration de 0,5 mg/ml.
3. Dépôt sur lame On dépose sur lame une quantité déterminée de chaque préparation intermédiaire, par la technique de "microArraying" qui permet de réaliser le microéchantillonnage à partir des microplaques 96 puits. Un tel microéchantillonage constitue une banque ou collection qui présente l'avantage de comprendre sur une surface réduite l'ensemble des "spots" d'un cerveau de petit animal.
Le robot prélève un échantillon du contenu d'un puits et le dépose sur la lame, obtenant ainsi un "spot" sur la lame. Cette opération est répétée pour chaque puits. Les dépôts sont réalisés selon une grille de dépôt 2D bien définie, en chaque site (S) élémentaire. Les coordonnées 2D de chaque site sont stockées sous forme indexée dans un second index. Les dépôts sont en général dupliqués, mais chaque spot correspond toujours à un seul prélèvement biologique. La traçabilité des prélèvements biologiques jusqu'à la position des spots sur les membranes est assurée grâce la numérotation des puits et de la grille de dépôt.
4. Traitement réactionnel des lames
On utilise un anticorps dirigé contre une protéine.
Le protocole suivant est mis en place : - Contrôle de la qualité des dépôts par coloration in situ à l'aide d'un colorant fluorescent des protéines ;
- Saturation de la membrane pendant 30 minutes ;
- Incubation avec l'anticorps primaire à la concentration adaptée (2H) ;
- Lavage au PBS-tween pendant 30 minutes ; - Incubation avec un anticorps secondaire marqué (colorimétrie, luminescence ou fluorescence) (1 H) ;
- Lavage pendant 30 minutes ;
- Révélation ;
- Numérisation des lames et quantification des entités de réaction à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images ;
- Obtention d'un index des réactivités élémentaires de chaque spot. 5. Profil 3D de réactivités
On utilise pour cela des moyens de corrélation des 3 index, i.e. celui des coordonnées 3D de chacune des zones élémentaires de prélèvement, l'index des coordonnées 2D de chaque site élémentaire d'observation de la lame et de l'index des réactivités élémentaires avec les zones élémentaires de prélèvement. On utilise également les moyens de génération 20 de profils 3D. Chaque réactivité élémentaire est exprimée dans la représentation 3D anatomique du cerveau de souris (avec des codes couleur). Le profil 3D ainsi obtenu est stocké sur le poste client et traité dans un outil logiciel résident téléchargé à la première connexion sur la plateforme ou fourni avec l'échantillon lui même (sur un CD par exemple).

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination in vitro de la réactivité d'une entité biologique d'intérêt, selon lequel (a) on définit un ensemble (E) de (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement biologique dans un élément fonctionnel (F) tridimensionnel ; on génère et dispose d'un index (I) desdites (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement en relation avec la représentation anatomique 3D dudit élément fonctionnel de référence, ladite représentation étant positionnée dans un repère 3D, et on dispose éventuellement des informations ou données spécifiques audit élément fonctionnel de référence, ledit index (I) comprenant (n) informations élémentaires comportant chacune au moins les coordonnées 3D de chaque zone élémentaire dans la représentation anatomique 3D dudit élément fonctionnel de référence, (b) on procède et dispose des (n) prélèvements biologiques élémentaires, comprenant éventuellement chacun au moins une entité d'intérêt ; on obtient à partir des (n) prélèvements biologiques (n) préparations intermédiaires comprenant chacune éventuellement ladite entité d'intérêt, par exemple par traitement intermédiaire des (n) prélèvements biologiques élémentaires,
(c) on dispose d'au moins un support solide comportant une surface opératoire sur laquelle sont distribués (n) sites élémentaires d'observation ; on dépose une quantité prédéterminée des (n) préparations intermédiaires dans ou sur les (n) sites (S) élémentaires d'observation, respectivement pour obtenir une collection représentative des (n) prélèvements biologiques ; on génère et dispose d'un index (J) desdits (n) sites (S) élémentaires d'observation sur le support solide comprenant (n) informations élémentaires comportant chacune au moins les coordonnées 2D de chaque site élémentaire d'observation et les caractéristiques de son dépôt correspondant,
(d) par un traitement réactionnel de ladite collection avec au moins un réactif de test, on obtient dans ou sur les (n) sites élémentaires respectivement (n) entités de réaction, dont la caractérisation qualitative et/ou quantitative est représentative de la réactivité de l'entité d'intérêt avec le réactif de test, (Θ) on balaye méthodiquement la surface opératoire du au moins un support solide ayant réagi, et on détecte les (n) entités de réaction pour générer respectivement (n) signaux représentatifs, qualitativement et/ou quantitativement, de ladite réactivité dans lesdits (n) sites élémentaires d'observation ; on génère et dispose d'un index (K) des réactivités élémentaires dans ou sur les (n) sites élémentaires, comprenant (n) informations élémentaires comportant chacune au moins les caractéristiques qualitatives et/ou quantitatives de son signal détecté,
(f) par corrélation des index (I, J, K), on génère un profil 3D de réactivités de l'entité biologique d'intérêt dans les zones élémentaires de l'élément fonctionnel (F), ayant réagi avec le réactif de test.
2. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'entité d'intérêt est une entité biologique.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit élément fonctionnel (F) tridimensionnel est fixé, par exemple congelé ou paraffiné.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel les (n) prélèvements biologiques élémentaires sont réalisés sous forme de segments cubiques variant entre 0,01 et 10 mm3.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel les (n) prélèvements biologiques élémentaires sont réalisés par le biais d'un dispositif de prélèvement choisi parmi un microtome, un cryostat, une matrice de découpe adaptée, un "micropunch" et un dispositif utilisant le laser.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel ledit au moins un support solide comportant une surface opératoire est choisi parmi les membranes et les plaques de microtitration.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel ledit support comportant une surface opératoire est une membrane appliquée sur un autre support solide.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la quantité prédéterminée des (n) préparations intermédiaires déposée respectivement dans ou sur les (n) sites élémentaires d'observation dudit support solide est un volume variant entre 1 μl_ et 1 pL.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les préparations intermédiaires sont obtenues par une extraction protéique et/ou nucléique sur lesdits (n) prélèvements biologiques.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'élément fonctionnel tridimensionnel est un cerveau.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel ledit élément fonctionnel tridimensionnel est un cerveau de souris ou de singe.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite entité d'intérêt est un acide nucléique.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 , dans lequel ladite entité d'intérêt est un polypeptide.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit réactif de test est choisi dans le groupe consistant en les marqueurs de fluorescence, les marqueurs de luminescence, les marqueurs de radioactivité, les marqueurs colorimétriques, les acides nucléiques, les anticorps monoclonaux et les anticorps polyclonaux.
15. Système de détermination in vitro de la réactivité d'une entité d'intérêt, caractérisé en ce qu'il comporte :
- des premiers moyens de génération (2) d'un ensemble (E) de (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement biologique, destiné à être réalisé sur un élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence, lui-même prélevé sur un modèle biologique de référence, - des premiers moyens de stockage (3) des coordonnées 3D dans un repère 3D de chacune des (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement de l'ensemble (E), une fois générées, sous forme indexée dans un premier index (I),
- des moyens de prélèvement (6), éventuellement commandés par des moyens de commande (5), permettant de réaliser un ensemble (E) de (n) prélèvements au niveau des (n) zones élémentaires (Z) définies sur ledit élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence, les (n) prélèvements comprenant chacun éventuellement au moins une entité d'intérêt,
- des moyens de préparation (16), éventuellement commandés par des moyens de commande (5), permettant de réaliser des préparations intermédiaires à partir respectivement des prélèvements de l'ensemble (E), comprenant chacune éventuellement ladite entité d'intérêt,
- des moyens de dépôt (16), éventuellement commandés par des moyens de commande (5), permettant de déposer une quantité prédéterminée des (n) préparations intermédiaires correspondant à l'ensemble (E) des (n) prélèvements respectivement, dans ou sur (n) sites (S) élémentaires d'observation d'au moins un support solide (7), selon une répartition en deux dimensions, les coordonnées 2D de chacun des (n) sites (S) étant stockées dans des second moyens de stockage (8), sous forme indexée dans un second index (J), - des troisièmes moyens de stockage (9) d'une représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence,
- des moyens de réalisation d'un traitement réactionnel (10), avec au moins un réactif de test, des (n) préparations intermédiaires déposées, sur ledit support solide (7), pour obtenir respectivement (n) entités de réaction dans ou sur les (n) sites dudit support solide,
- des moyens de détection (12) des entités de réaction,
- des . quatrièmes moyens de stockage (14) des (n) réactivités élémentaires (R) en chacun des (n) sites (S) dudit support (7), sous forme indexée dans un troisième index (K), - des moyens de corrélation (18) des premier, second et troisième index (I, J1 K),
- des cinquièmes moyens de stockage (19) des coordonnées 3D des (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement, corrélées avec les (n) réactivités élémentaires (R), - des moyens de génération (20) d'un profil 3D à partir d'au moins une partie de l'ensemble (E) des (n) prélèvements, comportant le cas échéant une représentation graphique 3D des réactivités élémentaires (R),
- éventuellement des moyens de visualisation (23) du profil 3D de réactivité ainsi généré.
16. Système selon la revendication 16, caractérisé en ce les moyens de génération (20) de profil 3D comportent des moyens d'extraction de données à partir des cinquièmes moyens de stockage (19) des coordonnées 3D des (n) zones élémentaires (Z) de prélèvement, corrélées avec les (n) réactivités élémentaires (R), et des troisièmes moyens de stockage (9) d'une représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence.
17. Système selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comporte des moyens (4) permettant la génération, à partir d'un élément fonctionnel (F) tridimensionnel de référence, d'une représentation 3D anatomique de cet élément.
18. Système selon la revendication 16, caractérisé en ce que la représentation 3D anatomique de l'élément fonctionnel (F) est obtenue à partir d'une documentation de référence, les dimensions de la représentation et son orientation dans le repère 3D étant adaptées à celle de l'élément fonctionnel, notamment par l'application d'une transformation, plus particulièrement une déformation contrôlée, à la géométrie générale de l'objet.
19. Système selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce que :
- les premiers moyens de génération (2), - les premiers, second, troisième et cinquième moyens de stockage (3, 8, 9, 19),
- éventuellement les moyens de commande (5),
- les moyens de prélèvement (6),
- les moyens de préparation, - les moyens de dépôt,
- les moyens de corrélation (18), et
- les moyens de génération (20) de profil 3D, sont agencés pour être fonctionnellement sous le contrôle d'au moins un premier acteur (A), et en ce que : - les moyens de réalisation d'un traitement réactionnel (10),
- les moyens de détection (12) des entités de réaction et les moyens de traitement (13) des réactivités élémentaires (R),
- les quatrièmes moyens de stockage (14), sont agencés pour être fonctionnellement sous le contrôle d'au moins un second acteur (B), ledit ou lesdits supports solides (7) étant transmis du premier au second acteur, et le système comprenant de plus des moyens de communication (16) entre au moins un premier acteur (A) et au moins un second acteur (B), permettant à ce dernier de communiquer au premier acteur (A) les données de réactivité élémentaire (R), et au premier acteur (A) de communiquer au second acteur (B) les données d'au moins un profil 3D de réactivités.
20. Système selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisé en ce qui à chaque support (7) est associé un identifiant unique (ID).
21. Système selon l'une des revendications 15 à 19, caractérisé en ce que les moyens de détection (12) des entités de réaction en chaque site (S) élémentaire d'observation comportent des moyens de prise d'une image dudit support (7).
22. Système selon la revendication 21 , caractérisé en ce que les moyens de traitement de l'image (13) évaluent la réactivité élémentaire (R) en chaque site (S) élémentaire d'observation, en fonction de la luminance (L) dans la zone correspondante sur l'image dudit support (7).
23. Système selon la revendication 19, caractérisé en ce que les moyens de communication (16) sont constitués par une connexion Internet.
24. Système selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comporte un serveur informatique (17), comprenant des moyens de corrélation (18) des premier, second et troisième index (I, J, K), et les moyens de génération (20) de profil 3D.
25. Système selon la revendication 24, caractérisé en ce que le serveur informatique (17) comporte un serveur matériel hébergeant un serveur d'application logiciel permettant de réaliser des connexions multiples avec des second acteurs (B).
26. Système selon l'une des revendications 15 à 25, caractérisé en ce que le résultat de l'extraction des données par les moyens de génération (20) d'un profil 3D à partir des troisième (9) et cinquième (19) moyens de stockage consiste en la réalisation d'un fichier de représentation du modèle tridimensionnel, en particulier dans un format standardisé.
27. Système selon l'une des revendications 15 à 26, caractérisé en ce que la réactivité élémentaire en chaque zone élémentaire (Z) de prélèvement est représentée par un niveau de couleur en chaque dite zone, par les moyens de visualisation (23).
28. Système selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comporte, sous le contrôle d'au moins un second acteur (B), un poste client, équipé de moyens de communication en réseau (24), d'un navigateur (25) de type navigateur Internet, permettant également d'accueillir des moyens de visualisation (23).
29. Système selon la revendication 15, caractérisé en ce que les moyens de visualisation (23) comportent un composant permettant de visualiser au moins un modèle tridimensionnel contenu dans un fichier dans un format standardisé.
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