WO2006090821A1

WO2006090821A1 - 生化学分析用分離媒体

Info

Publication number: WO2006090821A1
Application number: PCT/JP2006/303385
Authority: WO
Inventors: Mitsutoshi Masuda; Kazuko Matsumoto; Rika Iwaura; Yoshinori Yamaguchi; Toshimi Shimizu
Original assignee: Japan Science And Technology Agency; National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2006-02-24
Publication date: 2006-08-31
Also published as: JP4706026B2; CA2599335C; CA2599335A1; JPWO2006090821A1; EP1870704A4; EP1870704A1

Abstract

　本発明は、キャピラリー交換が容易な新規な分離・分析用充填材組成物、その製造方法とそのキャピラリーへの充填方法、およびそれを用いたキャピラリー電気泳動法などの電気泳動法を提供する。　本発明は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物の水中での加熱溶解と冷却によって製造することができる長尺状の自己集合体を含有してなる電気泳動のための分離・分析用充填材組成物、その製造方法、それを用いた分離・分析方法などに関する。

Description

生化学分析用分離媒体

技術分野

[0001] 本発明は、生化学分析用の電気泳動装置などに利用される分離媒体、それを充填したキヤビラリ一力ラムとそれを用いた分離システムに関する。より詳細には、本発明は、疎水部と親水部をもつ両親媒性ィヒ合物の水中での加熱溶解と冷却によって製造することができる長尺状の自己集合体を含有してなる電気泳動のための分離'分析用充填材組成物、その製造方法、それを用いた分離'分析方法などに関する。背景技術

[0002] 生物の機能を細胞レベルで明らかにするために、生体内のタンパク質、ペプチド、核酸、アミノ酸、糖質、神経伝達関連物質などの解析、分析が行われている。その手段として、質量分析計を組み合わせた高速液体クロマトグラフィー等が行われてきた力その理論段数はキヤピラリー電気泳動に及ばない。具体的には、例えば「J.Chor matography」誌第 558号 1991年 pp280のオリゴヌクレオチドの分離分析に見られるように、キヤビラリ一電気泳動では 1,000,000、高速液体クロマトグラフィーでは 30,000程度である。加えて、分析に必要なサンプルの絶対量が高速液体クロマトグラフィーと比較して微量である（高速液体クロマトグラフィーでは数 ml、キヤビラリ一電気泳動法では piレベルである）ので分離分析にはキヤピラリー電気泳動法が利用される。また、キヤピラリー電気泳動はヒューマンゲノムプロジェクトで使用されているように、その高分解能には定評があり、最近ではタンパク質、アミノ酸などの分析にも多く利用される。このように簡便で、高分解能、高感度のキヤピラリー電気泳動は DNA、 RNA、タンパク質などの分離分析の重要な技術である。これまでのキヤピラリー電気泳動では、内径 20〜： LOO mのキヤビラリ一の内部に充填するポリマーの細孔（正確にはポリマーのネットワークによって作られる網目の大きさ）を利用して分離を行っている（非特許文献 1参照)。その過程は物理的な「分離媒体」の効果であり、多くの場合水溶性のポリマーをキヤビラリ一の内部に充填することにより分析が行われている。この分離媒体には、内部に固定化されて、交換が困難な固定型と、単にキヤピラリー内に溶液として充填しただけで、交換が容易な可換型に分類できる。いずれの場合にも、代表的な篩、として水溶性のポリマーが用いられて、る。

[0003] 固定型の分離媒体としては、ポリアクリルアミドがその代表例である。具体的には、ガラス表面に結合するシランカップリング剤の一種であるメタアクリル型モノマー（3-m ethacryloxypropyltrimethoxysilane: MPTS)とアクリルアミドモノマー、および架橋化用の少量のビスアクリルアミドモノマーをキヤビラリ一中で混合した後、ラジカル共重合を行う。このようにして網目状のゲル力なる固相型の分離媒体 (高分子ネットワーク）を得る。この系の短所は、試料や不純物などの吸着によって分離媒体の分離能が低下することを原因とするキヤビラリ一の寿命が短い点である。このため通常は 20〜： L0 0回の使用後はキヤビラリ一全体の交換が必要である。また、これらの分離媒体の高分子固定ィ匕作業はキヤピラリー内で重合を行うために、キヤビラリ一の調製に時間と多くの手順を要すること、得られたゲルが分離能の低下を招く不均一な網目構造を部分的に含む点、キヤビラリ一の交換にともなう定量性の低下があげられる。これらの固定型の分離媒体 (ゲル充填キヤビラリ一)も市販されて、るが、それぞれの分子量に合わせて最適化されているものを選ぶことが困難であり、本来は試料の大きさや種類に合わせてゲル濃度などを調整する必要がある。

[0004] 可換型の分離媒体ではヒドロキシェチルセルロース（HEC)、ヒドロキシプロピルセルロース (HPC)、非架橋型の鎖状ポリアクリルアミドが挙げられる (非特許文献 2参照)。これらの長所は、これらの分離媒体はポリマー溶液であり詰め替えが容易である点、キヤビラリ一の寿命が飛躍的に向上する点、さらにはこの長寿命故の分析における再現性の高さである。またこの詰め替えの容易さから分離媒体の自動充填が可能となり、分析の完全自動化、省力化、高速ィ匕に大きく貢献できる可能性が高い。短所は、分離する試料 (DNA、 RNA、タンパク)の長さ (分子量）に応じて、分離媒体の濃度や分子量等を最適化する必要性がある点である。つまり高分子量のサンプルに対しては、粘性の高い高濃度の高分子 (篩い)溶液が必要になるため、ポリマーやサンプルの充填が困難になる点である。さらに試料の移動度も低下することから、分析にも長時間を要する。つまり二本鎖 DNAを試料とした場合、可換型の分離媒体である高分子溶液を用いるとキヤピラリー電気泳動による分離分析の限界は 10,000塩基対程度である。

このような可換型の分離媒体の長所を生かし、なおかつ高濃度での分離媒体溶液の粘度上昇を抑えるため、新しいナノ構造をもつ分離媒体の試みがなされている。これらは、これまで分離媒体として用いられてきた柔軟でランダムな 1次元の鎖状高分子とは異なる構造、サイズを持つことが特徴である。例えば、分離媒体である高分子ゲルの架橋点を減らすことでミクロなゲル状網目構造を持ちながら、溶媒に分散可能なため交換が容易な分離媒体 (非特許文献 3参照)、球状の金ナノ微粒子の表面に高分子を修飾することで分離媒体の溶液粘度を抑えることに成功した例 (非特許文献 4参照）、またゲルでありながら加熱することで交換可能な可換型の有機ゲルを用いた例 (非特許文献 5参照)などが挙げられる。しかし、非特許文献 3及び 4もそれぞれ、ゲルの微細構造は柔軟でランダムな構造あるいは球状に限られること、非特許文献 5では、ゲル形成に有機溶媒を用いることから、有機溶媒に不溶な分子は分析、測定することが出来ないし、 DNA,RNA,タンパクなどの様に試料が高次構造を持つ場合、これらの有機溶媒によって変性する可能性がある。

一方、親水性と疎水性をもつ両親媒性化合物が水中で、加熱による溶解後、冷却すること、あるいは単に分散させることで自ら集合して（自己集合と、う）、安定なナノメートルサイズの分子集合体を形成することはすでに知られて、る（非特許文献 6参照)。分子の自己集合によるこのような分子集合体は、従来、アルキルベンゼンスルホン酸（SDS : Sodium Dodecyl Sulfate)などが形成する球状のミセルゃ、天然由来のリン脂質から形成される球状の分子集合体 (リボソーム、ある、はべシクルと呼ばれる二分子膜からなる細胞膜の基本構造)が知られている。これらの両親媒性ィ匕合物からなる集合体の特徴は、室温では分子が液晶状態であるために流動性を持つことである。このため、最安定な球状の集合形態を通常もち、外部からの刺激により容易に変形する。このような液晶状態での構造は、冷却により流動性の無い固体状態に変えることができるが、通常は液晶状態での球状構造を反映した状態のままで固体状になる。このように両親媒性ィ匕合物が流動状態力固体状態への変化を起こす温度をゲル液晶相転移温度とヽぅ。

このような両親媒性ィ匕合物に、分子間結合力とその空間的な方向性 (異方性という )を増すような官能基を導入することで、固体状態での構造形態が球状から、以下に記載するような特異な形態に変化する。ここで、上述の様な分子間相互作用とその異方性を増す官能基としては、水素結合を形成可能なアミド基、水酸基、尿素基、イミド基、ウレタン基、カルボキシル基、リン酸基さらには剛直なユニットである芳香環、炭化フッ素基などがあげられる。特に、これらを有する糖、アミノ酸類の導入が有効である。さらには、このような特異な形態を安定ィ匕するために、疎水部が比較的長く大きい両親媒性ィ匕合物がよく用いられる。この様な分子間結合力を増加させた両親媒性ィ匕合物の水中での自己集合形態は、加熱状態 (つまりゲル液晶相転移温度以上)では流動性が増加し、通常の両親媒性ィ匕合物と同様に球状になる。しかし、これをゲル液晶相転移温度以下に冷却して固体状態に相転移させると、集合構造が変化して、幅 3nm〜500 μ m、長さ lOOnm〜数 mmの軸比の高い極微細繊維、テープ、およびこれらがねじれた形態に変化したらせん状テープや、外径 20nm〜数十/ z m、長さ lOOnm〜数 mmのチューブなどの微細構造を持つ長尺状構造体を与える（非特許文献 7、 8参照)。これらはさらに化合物の濃度を上げたり、金属塩を添加することでこれらの構造体同士が物理的に接触 (架橋)し、絡み合うため、溶媒である水を多く含んだヒドロゲルになる。

これらの自己集合による長尺状構造体やそれらからなるヒドロゲルの特徴は、 (1) 可逆的に出発材料である両親媒性ィ匕合物に戻すことができる点と、（2)自己集合によって長尺状構造体にするときに、その条件によって微細な形態やサイズが精密に制御出来る点である。具体的には、これらの構造体は一般的に分散させた溶媒中で安定であるが、物理的振動や衝撃を加えたり、両親媒性ィ匕合物がよく溶ける溶媒 (良溶媒)の添加によりこの様な特異的な構造は崩壊し、球状の分子集合体や分子分散状態にまで戻ってしまう。しかし、これらの崩壊した構造体は再冷却、水などの貧溶媒の添加、振動を取り除いた静置によって、可逆的に自己集合させて、半永久的に元の長尺状構造体やその物理架橋物であるヒドロゲルにもどすことができる。またこのとき、分子の種類、冷却速度や両親媒性化合物の濃度ばかりでなぐ溶液の pH, 無機塩や水以外の有機溶媒の添加などで、その微細な形態 (繊維状、テープ状、らせんテープ状、チューブ状など）、ゾルーゲルなどのマクロな形態 (長尺構造が分散したゾル状分散物、それらが物理架橋しあうことによるヒドロゲル)、各微細構造のサィズなどを作り分けることもできる。

[0007] このような両親媒性ィ匕合物を電気泳動分析に使用する例としては、 SDS— PAGE (S odium Dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresisノ法や、 SDS (Sodium Dode cyl Sulfate)キヤビラリ一電気泳動法、ミセル動電クロマトグラフィー法などが従来から用いられている。しかし、 SDS-PAGE法や SDSキヤピラリー電気泳動法では、両親媒性化合物として SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)が用いられている。これらの方法での S DSの役割は、 SDSのミセルがタンパク質に吸着することで、その高次構造を破壊し、一本の高分子鎖に変性させることであり、本発明のように両親媒性ィ匕合物を分離や分析用の媒体として使用するものではない。また、ミセル動電クロマトグラフィー法ではミセルは疎水場をもつ移動相として作用するだけである（非特許文献 1)。

[0008] 非特許文献 1 :本田進、寺部茂編、「キヤピラリー電気泳動、基礎と実際」、講談社サイエンティフィック、 1995年.

非特許文献 2 : A. Lagu et al, Anal. Chem., 1991, 63, 1233.

非特許文献 3 :A.E. Barron et al. Anal. Chem., 2004, 76, 5249.

非特許文献 4 : H.- T. Chang et al., Anal. Chem., 2004, 76, 192.

非特許文献 5 : 0. Lev et al. Anal. Chem., 2004, 76, 5399.

非特許文献 6 :野島庄七，砂本順三、井上圭三編、 "リボソーム"，南江堂（1988) . 非特許文献 7 : L.A.Estroff and A.D. Hamilton, Chem. Rev. 2004, 104, 1201.

非特許文献 8 :平尾一之編， "基礎力も学ぶナノテクノロジー"東京化学同人，第 5 章（2003) .

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0009] このような自己集合によるナノ構造体を利用した例としては、前記非特許文献 5に示した自己集合性有機ゲルの例が挙げられる。しかし、これはァセトニトリル、あるいはこれにメタノールを加えた混合溶媒などの有機溶媒中でしか自己集合してゲルを与えないオルガノゲルである。つまり、電気泳動分析が有機溶媒系に限られる点である。このような有機溶媒に多くの生体高分子の試料は不溶である。また分離媒体の交換が可能力どうかの記述はない。従って本発明は、電気泳動のための新規な分離媒体としての分離'分析用充填材組成物、及びそれを用いた電気泳動法、より詳細にはキヤピラリー電気泳動におけるキヤビラリ一交換が容易な新規な分離媒体としての分離'分析用充填材組成物、並びにその製造方法とそのキヤビラリ一への充填方法、及びそれを用いたキヤビラリ一電気泳動法などの電気泳動法を提供する。

課題を解決するための手段

[0010] 本発明者らは鋭意検討した結果、（1)水中で自己集合可能な親水部と疎水部を持つ低分子の両親媒性化合物を加熱により水溶液として電気泳動分析機器の分離用カラムに充填し、 (2)これを冷却することで電気泳動の分離媒体として働く長尺状構造をもつ自己集合体、あるいはこれら力なるヒドロゲルを形成させ、（3)これを分離媒体として用いた電気泳動分析法を行うことにより、極めてシャープな分離 '分析ができることを見出した。さらに本発明者らは、（4)この長尺状構造が目詰まり、劣化などで交換を要する場合は、加熱しながら再溶解させ、排出した後に再び（1)の処理をすることで分離媒体を詰め替えることが可能な新しい分離'分析用の媒体を提供することができることを見出した。このような詰め替えは、分離媒体の劣化だけでなぐ分析試料に応じた適切な分離媒体の選択にお！ヽて重要である。特にキヤビラリ一電気泳動におけるキヤビラリ一中の分離媒体の交換を極めて容易にするものである。

[0011] 即ち、本発明は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性ィ匕合物の水中での加熱溶解と冷却によって製造することができる長尺状の自己集合体を含有してなる電気泳動のための分離 ·分析用充填材組成物に関する。

また、本発明は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性ィ匕合物と水を混合し、これを水中で加熱溶解し、次いで冷却することからなる長尺状の自己集合体を含有してなる電気泳動のための分離'分析用充填材組成物を製造する方法に関する。さらに、本発明は、前記した本発明の電気泳動のための分離 ·分析用充填材組成物が充填された電気泳動用の分離媒体の容器、好ましくはキヤビラリ一、及び当該分離媒体の容器、好ましくはキヤピラリーを有することを特徴とする電気泳動装置に関する。

また、本発明は、前記した本発明の電気泳動のための分離 ·分析用充填材組成物が充填された電気泳動用の分離媒体の容器、好ましくはキヤピラリーを用いて試料を電気泳動により分離'分析する方法に関する。

さらに、本発明は、キヤピラリー電気泳動において、キヤビラリ一中の劣化した分離- 分析用充填材組成物が充填されているキヤビラリ一力ラムを加熱して、分離'分析用充填材組成物を流動性のゾル又は分子分散状態まで再溶解し、これを吸引又はカロ圧することによりキヤビラリ一力ラム内の溶液化された劣化後の分離 ·分析用充填材組成物を除去し、次いで新しい分離 ·分析用充填材組成物を当該キヤビラリ一力ラムに充填することからなる、キヤビラリ一力ラムの分離'分析用充填材組成物を交換する方法に関する。

[0012] 本発明は、さらに次に示す 1〜5の事項を特徴とするものである。

1.電気泳動分析、たとえばキヤビラリ一電気泳動やスラブゲル電気泳動の分離媒体として用いるための、長尺状の自己集合体、及びその製造方法。特に疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物の水中での加熱溶解、その後の冷却によって得られる、長尺状の自己集合体。

2.上記 1の長尺状自己集合体の架橋構造に基づぐ電気泳動分析の分離媒体用ヒドロゲル状組織、及びその製造方法

3.上記 2の長尺状の自己集合体あるいはそれからなるヒドロゲル状分離媒体の充填材、及びその交換方法。

4.さらには、分離媒体の劣化時には、まずキヤピラリーを再度加熱して、上記ヒドロゲルを分子分散状態まで再溶解する。つぎにこれをポンプなどで吸引または加圧することでキヤピラリー内の溶液を新しい分離媒体の溶液とすみやかに入れ替える、最後にこれを冷却することで新ヽ分離媒体を充填する。このような分離媒体の交換方法

5.上記の 1〜4の分離媒体を組み込んだキヤビラリ一に対してタンパク、核酸、または脂質などを導入した後、電気泳動を行うことを特徴とする分析方法。

[0013] 本発明は、電気泳動の分離媒体として用いるための、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物の水中での加熱溶解と冷却によって得られる長尺状の自己集合体の使用、及びその製造方法を提供するものである。即ち、本発明で用いる両親媒性ィ匕合物は、その自己集合によって得られた軸比の高い極微細繊維、テープ、らせん状テープやチューブ構造などの微細構造によってネットワーク状の媒体をつくり、篩いとしての役割を果たさせるものであり、この点が従来の SDSなどとの本質的な相違点である。

本発明の電気泳動のための分離'分析用充填材組成物は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物によって得られる長尺状の自己集合体、及び分離'分析用充填材用の担体を含有してなるものである。

本発明における電気泳動としては、電気により試料の大きさ、重さ、形状、電荷の種類とその密度などの性質により泳動させることができ、そして、試料の有する性質に基づいて分離又は分析することができる方法であれば特に制限はないが、好ましくはキャピラリーを用いる電気泳動法が好まし、。本発明の好ま、電気泳動法としては、例えば、キヤビラリ一電気泳動、キヤビラリ一ゾーン電気泳動、キヤビラリ一等電点電気泳動、キヤビラリ一等速電気泳動、ミセル動電クロマトグラフィー、キヤビラリーゲル電気泳動、 SDSキヤビラリーゲル電気泳動、スラブ電気泳動法、デスクゲル電気泳動法、 SDS-PAGE法、 Native-PAGE法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）、免疫電気泳動法などが挙げられる。

また、本発明の電気泳動法としては、通常の電気泳動法にさらにブロッテイング操作などの方法を必要に応じて併用されるものも包含している。

次に、本発明に従い両親媒性ィ匕合物の水中での自己集合によって得られた分離媒体を用いたキヤピラリー電気泳動分析をするための好ましい態様について説明する。

本発明の電気泳動のための分離'分析用充填材組成物は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性ィ匕合物の水中での加熱溶解と冷却によって製造することができる長尺状の自己集合体を含有してなることを特徴とするものである。また、本発明は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性ィヒ合物の水中での加熱溶解と冷却によつて製造することができる長尺状の自己集合体の電気泳動の分離'分析用の充填材又は媒体としての使用を提供するものである。

本発明における長尺状の自己集合体とは、分子間結合力とその空間的な方向性（異方性という）を増すような官能基が導入された両親媒性ィ匕合物により、幅 3nn！〜 50 0 m、長さ lOOnm〜数 mmの軸比の高い極微細繊維、テープ、およびこれらがねじれた形態に変化したらせん状テープや、外径 20nm〜数十 μ m、長さ lOOnm〜数 mmのチューブなどの微細構造を持つ長尺状構造体 (非特許文献 7、 8参照）のことをいう。このような構造は、 SDSなどが形成する球状のミセルゃ、天然由来のリン脂質から形成される球状の分子集合体とは基本的に相違するものである。

本発明の疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性ィ匕合物としては、水中での加熱溶解と冷却により長尺状の自己集合体を形成することができる疎水部と親水部をもつ両親媒性ィ匕合物であれば特に制限はないが、好ましくは比較的長鎖の両親媒性の脂質が挙げられ、例えば、チミジル酸、糖、ペプチド、リン酸、ピリジ-ゥム基、カルボキシル基、アンモニゥム基、リン酸アンモニゥム基など力疎水部である鎖状、分岐状、環状の炭化水素、フッ化炭素鎖などに片端あるいは両端で連結された脂質が例示できる。このうち、後者の疎水部の両端が連結された両親媒性脂質を双頭型脂質と呼ぶ。

本発明の両親媒性ィ匕合物における「低分子」とは、モノマーを重合させて多数の繰り返し単位を有する高分子量の重合体以外の化合物と定義されるものであり、例えば、分子量力 0000以下、好まし <は 30000以下、 20000以下、 10000以下、又は 5 000以下のものであり、分子中にモノマーの繰り返し単位が 50以上、好ましくは 40以上の繰り返しが無、分子を、う。

このような低分子の両親媒性ィ匕合物としては、例えば、非特許文献 7又は 8に記載されて、るような物質をあげることができる。非特許文献 7及び 8の記載を参考のために本明細書に取り入れる。

本発明の低分子の両親媒性化合物として好ましい化合物を例示すれば以下に示すィ匕合物が挙げられる力これらの例示される化合物に限定されるものではない。次の一般式（1)

G-NHCO-R (1)

(式中、 Gはダルコビラノース、ガラクトピラノース、マルトース、ラタトース、セルビオースなどの糖のァノマー炭素原子に結合するへミアセタール水酸基を除いた糖残基を表し、 Rは炭素数が 10〜39の不飽和炭化水素基を表す。 )

で表される N—グリコシド型脂質 (特開 2004— 224717号参照)。

このような化合物の具体例としては、例えば、次の一般式（2)、一般式（3)、一般式 (4)、又は一般式 (5)

[0016] [化 1]

[0017] [化 2]

[0018] [化 3]

[0019] [化 4]

[0020] などの化合物、及びこれらの混合物が挙げられる。

これらの N—グリコシド型脂質の類似したィ匕合物としては、飽和の側鎖を持った次の一般式 (6)

[0021] [化 5]

[0022] で表されるグリコリピッド類（T. Shimizu et al., Langmuir., 2005, 21, 743- 750参照）などが挙げられる。

[0023] 次の一般式（7)

X'-O-Ph-R

(式中、 X¹はグリコシル基、又は 2〜29個、好ましくは 2〜5個の単糖が結合したオリゴ糖残基を表し、 Rは前記一般式（1)と同様の炭素数が 10〜39、好ましくは 14〜16 の不飽和炭化水素基を表し、 Phはベンゼン環を表し、当該ベンゼン環における基 X¹ —O—と基 R—との置換位置は任意である力好ましくはメタ位であることを表す。 ) で表される構造を有する O—グリコシド型糖脂質 (脂質の製造方法は特開 2001— 2 61693号、集合体は特開 2003— 252893号、その製造方法は特開 2003— 2598 93号参照)。

[0024] 次の一般式（8)

A-Ph-NHCO-R¹ (8)

(式中、 Aはグルコース、ガラクトース、 N—ァセチルダルコサミン、キシロースなどの糖の残基を表し、 R¹は炭素数 6〜20、好ましくは 10〜20の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を表し、 Phはベンゼン環を表し、当該ベンゼン環における基 A—と基一 NHCO - R¹との置換位置は任意であるが、好ましくはパラ位であることを表す。）

で表される糖脂質 (特開 2003— 49154号参照)。

このような一般式 (8)で表される糖脂質をさらに具体的に例示すれば、次の一般式 (9)及び一般式（10)

[0025] [化 6]

[0026] [ィ匕 7]

[0027] (式中、 R²は、炭素数 6〜20,好ましくは 10〜20の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示す。 )

で表される化合物などが挙げられる。一般式（9)における—NHCO— R²基の具体例としては、例えば次に示すような基が挙げられる（T.Shimizu, et al., J. Am. Chem. So c, 2002, 124, 10675参照）。

[0028] [化 8]

— NHOC

[0029] [化 9]

[0030] [化 10]

—NHOC

[0031] [化 11]

—NHOC

[0032] また、これらの化合物に類似した、 N—ァシル化一 O—グリコシル化一アミノフエノルの誘導体としては、次の一般式（11)又は一般式（12)、

[0033] [化 12]

[0034] [化 13]

[0035] (式中、 R³は、炭素数 4〜15,好ましくは 6〜 12の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキレン基を示す。 )

で表される糖ーァミノフエノール誘導体（T. Shimizu et al., Chem. Eur. J., 2002, 8, 1

60参照）などが挙げられる。さらに、ァゾベンゼン誘導体の例としては次の一般式（13 )、

[0036] [化 14]

[0037] で表されるァゾベンゼン誘導体（S. Shinkai et al., Org. Lett. 2002, 4, 1423- 1426参照）が挙げられる。

[0038] 次の一般式（14)

G¹—NHCO—(CH ) —COOH (14)

2 n

(式中、 G¹は還元性末端水酸基を除いたアルドース残基を表し、 nは 6〜20の整数を表す。）

で表されるカルボキシル基を有する非対称双頭型糖脂質 (特開 2002— 322190号、特開 2001— 261690号、 T. Shimizu et al. Lamgmuir 2004, 20, 5969- 5977.参照）。これらのアルドース残基における水酸基は遊離であってもよいが、一部又は全部の水酸基がァセチル基、ベンジル基、イソプロピル基、メチレン基、ベンジリデン基などの糖類合成法における慣用的な保護基で保護されて、てもよ、。

[0039] 次の一般式（15)

G²— NHCO—（CH ) -CONH-G³ (15)

2 m

(式中、 G²及び G³はそれぞれ独立して、例えばダルコビラノシル基や D—ガラクトピラノシル基などの、アルドビラノースの還元末端水酸基を除いた残基を表し、 mは 6〜1 8の整数を表す。 )

で表される両端に糖残基を有する双頭型脂質 (特開平 9— 143192号参照)。より具体的には、次の一般式（16)

[0040] [化 15]

[0041] (式中、 mは、 6〜18,好ましくは 6〜 12の整数を示す。）

で表される双頭型糖脂質（特開平 9 143192号、 T. Shimizu et al.J.Am.Chem.Soc.

1997, 119, 2812-2818. ,参照）が挙げられる。

次の一般式（17)

[0042] [化 16]

G⁴ NHCO— (CH₂) _X— C≡C— C≡C— (CH₂) _y— CONH—G⁵ (17)

[0043] (式中、 G⁴及び G⁵はそれぞれ独立して、アルドビラノースの還元末端水酸基を除いた残基またはその中の水酸基の少なくとも一部が保護されたものを表し、 X及び yはそれぞれ独立して 3〜16の整数を表す。 )

で表される重合性双頭型糖脂質 (特開平 11 - 255791号参照)。

[0044] 次の一般式（18)の D ガラクトース誘導体、一般式（19)の L ガラクトース誘導体、一般式（20)の D マンノース誘導体、一般式（21)の L マンノース誘導体、一般式（22)の D グルコース誘導体、一般式（23)の L グルコース誘導体、及び一般式（24)の D タロース誘導体、

[0045] [化 17]

[0046] [化 18]

[0047] [化 19]

[0048] [化 20]

[0049] [化 21]

[0050] [化 22]

H OH OH

(23)

O OH OH

[0051] [化 23]

[0052] (式中、 R⁴は、炭素数 6〜15,好ましくは 8〜 12の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基、又は炭素数 8〜15の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のァルキニル基、好ましくは次式

[0053] [化 24]

(CH₂)_p-C≡C-C≡C-(CH₂)_q-

[0054] (式中、 pは 1〜5の整数を示し、 qは 2〜5の整数を示す。）で表されるアルキ-ル基を示す。）

で表される N—炭化水素化アミノ糖型化合物 (飽和炭化水素型疎水部のものは、 J.- H. et al. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 2861- 2867参照、ジアセチレン型疎水部のものは、 J.-H. Fuhrhop et al. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7437-7439、 D.F .O' Brien et al. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7436—7437、及び D.F.O' Brien et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10057- 10069,参照）。

次の一般式（25)

[0055] [化 25]

[0056] (式中、 R⁵は、炭素数 1〜15,好ましくは 1〜9の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、 R⁶は水素原子、水酸基、— CH COOH、 -CH CH COO

2 2 2

H、 -CH CH CH NH、又は— CH CH CH CH NHを示す。 )

2 2 2 2 2 2 2 2 2

で表されるアミドカルボン酸型化合物（J.- H. Fuhrhop et al. Langmuir 2001, 17, 873- 877参照)。

次の一般式（26)

[0057] [化 26]

[0058] (式中、 R⁷は、炭素数 3〜15,好ましくは 3〜6の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、 R⁸は炭素数 1〜10,好ましくは 1〜4の直鎖状又は分枝状のアルキル基、又はベンジル基を示す。 )

で表される尿素カルボン酸型化合物（A.D. Hamilton, Chem.Comm. 2003, 310-311 参照)。

次の一般式（27) [0059] [化 27]

[0060] で表されるフッ素化ダルコホスホリピッド（M.- P. Kraffl et al., Chem. Eur. J. 1996, 2 1335-1339参照）。

次の一般式（28)

[0061] [化 28]

[0062] (式中、 R⁹は、炭素数 1〜5,好ましくは 1〜3の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、 kは 6〜： L0,好ましくは 8〜 10の整数を示し、 1は 8〜15、好ましくは 10〜12の整数を示す。 )

で表されるピリジ-ゥム化合物（K. Hanabusa, Chem. Eur. J. 2003, 9, 348-354参照) 次の一般式（29)

[0063] [化 29]

(式中、 R , R , 及び R"は、それぞれ独立して水素原子、又はアミノ酸の側鎖の残基を示し、好ましくはメチル基 (つまりァラニン）、イソプロピル基 (つまりパリン）、ブチル基（つまりロイシン）、又はイソブチル基（つまりイソロイシン）を示す力これらの 4種のアミノ酸以外にグリシン、セリン、トレオニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、ァスパラギン、グルタミン、リジン、ヒドロキシリジン、ァノレギニン、システィン、メチォ二ン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン、ヒドロキシプロリン、 βァラニン、及びァラニンイソブチル酸力なる群力選ばれる 1種又は 2種以上のアミノ酸を形成する残基であってもよい。 rは 4〜24,好ましくは 7〜18の整数を示す。）

で表される双頭型ペプチド脂質。

一般式 (29)で表される双頭型ペプチド脂質において、好ましくは R^1C>、 ¹、 R¹²、 R 1³としては、これらの基がイソプロピル基である場合 (即ち、 Val— Val)、若しくはイソブチル基である場合 (即ち、 He -He)、 R¹⁰、 R¹³がイソプロピル基で R¹¹ R¹²がイソブチル基ある場合 (即ち、 Val— lie又はこの逆）、 R^1C>、 R¹³がイソブチル基で R"、 R¹²がイソプロピル基である場合 (即ち、 lie— Val又はこの逆）、 R^1C)、 R¹³、がイソブチル基で 1、 R¹²が— CH CH SCHである場合（即ち、 lie— Met又はこの逆）、又は R^1C>、 R

2 2 3

¹³が— CH CH SCHで R¹¹ R¹²がイソブチル基である場合（即ち、 Met— lie又はこ

2 2 3

の逆)などが挙げられる。これらのアミノ酸は、ラセミ体でも、 D体又は L体の光学活性体であってもよ、。全てのアミノ酸が D体又は L体の光学活性体であるものが好ましい。

さらに、一般式 (29)で表される双頭型ペプチド脂質は、次の一般式 (30)又は一般式（31)

[0065] [化 30]

[0066] [化 31]

[0067] (式中、 R¹⁰, R¹¹ R¹²、 R¹³、及び rは前記の一般式（29)と同じものを示し、 R¹⁴及び R ¹⁵はそれぞれ独立して前記 R^1C>、 Rⁿ、 R¹²、又は R¹³と同じものを示す。 ) で表されるトリペプチド型の双頭型ペプチド脂質であってもよい。一般式（30)又は一般式 (31)で表される双頭型ペプチド脂質におけるトリペプチド部分におけるトリぺプチド部分のアミノ酸配列としては、 Val— Val— Val、 lie— lie— Ile、 lie— Val— Val、 Val-Ile-VaU Val—Val—Ile、又はこれらの逆の配列などが好ましい。これらのァミノ酸もラセミ体、光学活性体のいずれであってもよいが、好ましくはすべてのアミノ酸力体又は L体の光学活性体であるものが挙げられる。これらの双頭型ペプチド脂質については、清水らの文献（T. Shimizu et al.， Chem. Commun, 1998, 1791.)、及び特許第 3012932号を参照されたい。

次の一般式（32)

[0068] [化 32]

[0069] (式中、 sは 12〜24,好ましくは 18〜20の整数を示す。）

で表されるデォキシリボース型化合物（R.Iwaura et al. Chem. Mater. 2002, 14, 3047. 及び特開 2003— 55642号参照）。

次の一般式（33)

[0070] [化 33]

[0071] で表されるジアセチレン化合物（R.C. Stevens, J. Am. Chem. Soc, 2001, 123, 3205- 3213参照）。

次の一般式（34)

[0072] [化 34]

[0073] で表されるホスホアンモ -ゥム化合物（F.M. Menger et al.， J. Am. Chem. Soc. 2002 124, 12408- 12409参照）。

次の一般式（35)

[0074] [化 35]

[0075] (式中、 2Χ は、式

[0076] [化 36]

O₂C θ₂

HO OH

[0077] で表される酒石酸塩、その鏡像体、メソ体、又は 2個の臭素イオンを示す。 )

で表されるエチレンジアンモ -ゥム化合物（I. Hue et al.， Angew. Chem., Int. Ed. 199 8, 37, 2689-2691.参照）。

次の一般式（36)

[0078] [化 37]

[0079] (式中、 R¹⁶は、水素原子又はニトロ基を示す。 ) で表される糖へミアセタール化誘導体（S. Shinkai et al., Chem. Eur. J. 1999, 5, 272 2-2728参照）。

次の一般式（37)

[0080] [化 38]

[0081] (式中、 R¹⁷及び R¹⁸は、それぞれ独立して、炭素数 6〜10,好ましくは 6〜8の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基、又はシクロペンチルメチル基若しくはシクロへキシルメチル基を示し、 tは 0〜3、好ましくは 0〜1の整数を示す。 ) で表されるグリコシル化アミノ酸誘導体（I. Hamachi et al., J. Am. Chem. Soc, 2002, 124, 10954-10955参照）。

次の一般式（38)

[0082] [化 39]

[0083] (式中、 aはそれぞれ独立して 3〜15、好ましくは 7〜 14の整数を示し、 bは 4〜15、好ましくは 4〜 12の整数を示す。 )

で表される尿素型長鎖アルキルエステル系化合物（A.D. Hamilton, et al., Angew. C hem. Int. Ed" 2000, 39, 3448.参照）。

次の一般式（39)、一般式 (40)、一般式 (41)、又は一般式 (42)

[0084] [化 40]

[0086] [化 42]

[0088] で表される長鎖フエ-ルー β一 D—ダルコビラノシド（T. Shimizu, et al., Adv. Mater.,

2001, 13， 715 - 718.参照）、又はこれらの化合物の混合物。

次の一般式 (43)

[0089] [化 44]

[0090] (式中、 dは 22〜40の整数を示す。）

で表される両端に極性のあるホスホコリンを有する化合物（A. Blume, et al., Angew.

Chem. Int. Ed" 2004, 43, 245- 247.参照）。

次の一般式 (44)

[0091] [化 45]

[0092] で表される尿素ジカルボン酸半エステル誘導体（A.D. Hamilton et al., Chem. Comm un. 2003- 2958- 2959参照）。

次の一般式 (45)

[0093] [化 46]

[0094] (式中、 R¹⁹は、炭素数 8〜15,好ましくは 10〜 12の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基、又は炭素数 8〜 15,好ましくは 10〜 12の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のフッ素化アルキル基を示す。好ましい R¹⁹としては、一 C H 、

10 21 又は C F -C H一基が挙げられる。）

8 17 2 4

で表されるジモルホリノホスホルアミデート誘導体 (Angew. Chem. Int. Ed., 1994, 33, 1514参照)。

次の一般式 (46)

[0095] [化 47]

(46) [0096] (式中、 R^2Gは、炭素数 8〜15,好ましくは 10〜 15の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基、又は炭素数 8〜 15,好ましくは 10〜 15の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のフッ素化アルキル基を示す。好ましい R^2Gとしては、— C H 、

10 21

— C H 、又は C F — C H—基が挙げられる。 )

15 31 8 17 2 4

で表されるホスホコリン誘導体（M.- P.Kraffi, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 1994, 33, 1514.参照)。

次の一般式 (47)

[0097] [化 48]

[0098] (式中、 R は、 n ブチル基、 4 ブロモベンジル基、又はメタクリルォキシェチル基を示し、 R²²は、炭素数 1〜4の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示す。）

で表される尿素ヒドロキシカルボン酸エステル誘導体（A.D. Hamilton, Chem. Commu n. 2003, 310-311.参照）。

次の一般式 (48)

[0099] [化 49]

O

CH₂— OC(CH₂)₈— cョ C一 C≡C— (CH₂)₉CH₃

O

II

HC— OC(CH₂)₈一 cョ C— C≡C一 (CH₂)₉CH₃

O

H₂C-0-P-0-(CH₂)₂__N ⁺ ₍CH₃)3

O"

[0100] で表されるジアセチレン基を含有するグリセライド誘導体 (P. Yager, et al., Mol.Cryst .Liq.Cryst., 1984, 106, 371-381. J.M. Schnur, Science, 1993, 262, 1669- 1676.参照

) o

次の一般式 (49)

[0101] [化 50]

[0102] で表されるリジンの長鎖アミド誘導体。

次の一般式（50)

[0103] [化 51]

[0104] で表されるトリスメチォニンシクロへキサン誘導体（B丄. Feringa et al., J. Am. Chem.

Soc, 2003, 125， 14252- 14253.参照）。

次の一般式（51)

[0105] [化 52]

(式中、 Xは、それぞれ独立して、 O— (CH ) — OH基、又は— NH— (CH ) -

2 2 2 2

0- (CH ) OH基を示す。 )

2 2

で表されるトリスフエ-ルァラニンシクロへキサン誘導体（B丄. Feringa, et al., J. Am. Chem. So ， 2003, 125, 14252- 14253.参照)

次の一般式（52)

[0107] [化 53]

[0108] で表されるリトコール酸 (Y. Talmon et al., Langmuir, 2002, 18, 7240- 7244.参照) 次の一般式（53)

[0109] [化 54]

[0110] (式中、は、炭素数 4〜24、好ましくは 7〜18の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、 fは 1〜3の整数を示す。 )

で表されるポリグリシン誘導体、又はそのナトリウム塩 (特願 2003— 039276号参照) 次の一般式（54)

[0111] [化 55]

(式中、 R²⁴は、炭素数 4〜24、好ましくは 7〜18の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、 gは 1〜3の整数を示す。 )

で表されるポリグリシン誘導体、又はその塩酸塩。

次の一般式（55) [0113] [化 56]

G⁶— NHCO— R ²⁵— C≡C_ C≡C一 R ^{2 6}— Z (55)

[0114] (式中、 G⁶はアルドビラノースの還元末端水酸基を除いた残基、好ましくは D—ダルコピラノシル基又は L ダルコビラノシル基を表し、 Zは水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、又はアミノエチルカルバモイル基を表し、 R²⁵及び R²⁶はそれぞれ独立して炭素数が 0〜20の 2価の炭化水素基、好ましくは炭素数力^〜 20のポリメチレン基を表す。）で表わされる重合性双頭型糖脂質。

[0115] また、ォレイン酸ナトリウム塩ゃドデシルトリメチルアンモニゥムクロライドのようなィォン性界面活性剤、ォクタエチレングリコールテトラデシルエーテル、ドデシルジメチルアミンォキシドなどの非イオン性界面活性剤、パルミトイルリソホスファチジルコリン、ォレオイルリソホスファチジルコリン、リノレオイルリソホスファチジルコリンなどのリン脂質 (双性イオン性)なども挙げられる。

[0116] 本発明の電気泳動のための分離 ·分析用充填材組成物は、前記した本発明の両親媒性化合物からなる長尺状の自己集合体を含有するものであれば特に制限はない。また、この長尺状の自己集合体を含む分離分析用充填剤組成物、あるいはそのヒドロゲル状ィ匕物は以下の様な高分子化合物を混合物として含有していてもよい。このような高分子化合物としては、例えば、数平均分子量が 10, 000〜1, 000, 000、好ましくは 10, 000〜500, 000のヒドロキシェチルセルロース、数平均分子量が 10 , 000〜1, 000, 000、好ましくは 10, 000〜500, 000のヒドロキシプロピルセル口ース、数平均分子量力 ^s10, 000〜1, 000, 000、好まし <は 10, 000〜500, 000のポリアクリルアミドなどが挙げられる。これらの分離媒体及び上記高分子混合物は、水溶液として 0. 01%〜30%、好ましくは 0. 1〜20%、より好ましくは 0. 1〜10%程度の濃度で用いられる。

したがって、本発明は、前記した本発明の両親媒性化合物からなる長尺状の自己集合体を含有してなる分離媒体、又はそれらの物理的な架橋構造によって形成されることを特徴とする分離媒体用ヒドロゲル状分離媒体からなる分離 ·分析用充填材組成物を提供するものである。さらに、本発明は、当該長尺状の自己集合体ゃヒドロゲルカヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びポリアクリルァミドなどの篩いを含有する充填材組成物を提供するものである。

[0117] 本発明の長尺状の自己集合体を製造する方法としては、通常は、本発明の長尺状の自己集合体の構造を形成する両親媒性化合物を、水などの溶媒に溶解し、必要に応じて撹拌、脱気した後、加熱してゾルイ匕し、これを冷却することにより製造することができる。使用される両親媒性ィ匕合物によっては、前記した加熱処理に代えて、 p Hの調節や、紫外線などの光の照射などの処理によりゾルイ匕する場合もある。本発明の両親媒性ィ匕合物の濃度としては、 0. l〜30wt%、好ましくは 0. l〜20wt%、0. l〜15wt%程度が挙げられる。使用される溶媒としては、 pHの調整された水が挙げられ、より好ましくは各種の緩衝液が挙げられる。好ましい緩衝液としては、 pH8の T Eバッファー（10mM Tris— HCKpH 8.0)、 ImM EDTA)ゝ pH2.5〜7.5リン酸バッファー、ホウ酸ノッファー、 2-[4-(2-hydroxyethyl)-l— piperazinyl] ethanesulfonic acid(HEPES) , N-tris(hydoroxymethyl)methyl-e-aminoethanesulfonic acid(TES), Tris- HC卜グリシンノッファー、トリス一リン酸緩衝液、あるいはこれらの混合物などが挙げられる。より好ましい緩衝液としては ρΗ8の TEバッファー（10mM Tris— HCl(pH 8.0)、 ImM EDTA) が挙げられる。

ゲルを調整する水溶液の pHとしては特に制限はなぐ使用する両親媒性ィ匕合物によるが、 ρΗ1〜10、好ましくは pH2〜 10程度であればいずれでもよい。

また、添加剤として、必要によりメタノール、エタノール、ァセトニトリル、 THF、ジォキサンなどを 0〜50%ほど含んで!/、てもよ!/、。

[0118] 本発明の分離'分析用組成物の自己集合体の調製方法をより詳細に説明すれば、両親媒性ィ匕合物の溶液を室温で超音波処理してよく脱気した後、ゾル状になるまで加熱し、具体的には 50°C〜100°Cに加熱して完全にゾル状態にする。これを、分離媒体の容器に入れゲル化させる。分離媒体の容器としてキヤピラリーを用いる場合には、これをシリンジまたはキヤピラリー電気泳動装置の試料導入装置に、吸引又は加圧などにより、必要により後述する前処理を行ったキヤビラリ一に導入した後、このキャピラリー全体を空冷、あるいは電気泳動装置に付属しているキヤビラリ一の温度制御装置を用いて冷却し、長尺状自己集合体からなる分離媒体用ヒドロゲル組織を製造することができる。

本願の分離媒体の容器としては、電気泳動における分離媒体としてのゲルを収納できる容器であれば特に制限はなぐ具体的には、例えば、スラブゲルを入れる容器、キヤピラリー電気泳動などにおけるキヤビラリ一などが挙げられる。

本願の分離媒体の容器としてキヤピラリーを用いる場合のキヤビラリ一の内径としては約 500nm〜3mmのものが使える力分離能とサンプル量などの点から約 50 μ m〜 100 /z mのものがもっとも良い。長さは、試料によって異なる力 2cm〜3mであることが望ましい。キヤビラリ一の材質はパイレックス (登録商標)ガラス、フューズドシリカ（溶融石英）、テフロン (登録商標）のいずれでもよいが、フューズドシリカが好適である。上記ガラスまたはシリカの場合には強度と柔軟性をもたせるために外壁をポリイミドで覆っていてもよいし、いなくても良い。

キヤピラリーの前処理として、分離'分析用充填材糸且成物の充填の前に、以下のような操作を行うことが好ましい。例えば、あらかじめ内壁をクロ口ホルムやメタノールなどの溶媒で洗浄し、付着している有機物を除去する。そしてさらに強酸ついで強アル力リで洗浄し、内壁の無機物を除くと共に、表面をシラノール基に変える。その後、シランカップリング剤である (3-メタクリオキシプロピルトリメトキシシラン、 3-methacryloxypr opyltrimethoxysilane)で表面処理し、続!、てアクリルアミドを導入してグラフト重合したもの（非架橋ポリアクリルアミドで内壁処理した物）を用いる。

両親媒性ィ匕合物の熱水溶液を充填したキヤビラリ一の冷却は、空冷による急冷でもよ!、が約 20°CZ秒〜 0. 1°CZ分まで変化させてもょ、。

このようにして得られた分離媒体を用いたキヤピラリー電気泳動は、例えば、以下のようにして行える。まず分離媒体を充填した長さ 30cmのキヤピラリーをキヤピラリー電気泳動装置に装着し、温度を 5°C〜50°C、好ましくは約 20°C前後にすることが望ましい。試料としては、 DNA、 RNA、タンパクなどが測定可能である力 DNA、タンパクが望ましい。特にタンパクの場合、 SDSなどであら力じめ変性させておくことが好適である。また電気泳動に用いる溶媒は、長尺状自己集合構造やそのヒドロゲルを形成したときの溶媒と同一であることが望ま U、。とくに DNAの分離にぉ、ては前述の TE ッファーが最適である。分離の前に、試料をキヤビラリ一に導入する時は、電気泳動、吸引、加圧のいずれでも良いが、分離媒体であるヒドロゲルや高分子溶液がキヤビラリ一から侵出するのを防ぐため、キヤビラリ一の両側の受容相と供給層は 5ps港度加圧しながら電圧の印可によって導入することが最適である。試料をキヤビラリ一に導入した後に、電気泳動を行うが、印可電圧はキヤビラリ一の長さによって変化する力 50V/cm〜500V/cm であることが望ましい。

検出は DNAの場合は 254nmあるいは 234nmの吸収をモニターして行う。またサンプルが微量の場合には、試料を蛍光ラベルイ匕して蛍光により検出することも可能である。

ゲルが劣化して分離能が低下したり、経時変化が著しいとき、また篩に試料ゃゴミなどが詰まって圧力が高まったときは以下のようにして簡単に分離媒体を交換することが可能である。まずキヤピラリー全体を 50°C〜100°Cまで加熱してゾル状態にもどす。次にこの温度を保持したまま、このゾルを供給漕側の加圧、あるいは受容漕側の吸引によりキヤビラリ一外部に取り出す。同時に、 50°C〜100°Cまで加熱してある新しい分離媒体溶液を同様に供給漕側の加圧、あるいは受容漕側の吸引によりキヤピラリー内部に充填する。この後に、キヤピラリーを、空冷による急冷あるいは約 20°CZ 秒〜 0. 1°CZ分の範囲で徐例して新たな分離媒体を装着したキヤピラリーを得る。

[0120] 本発明の分離'分析用充填材組成物は、加熱や pHの調整などにより流動性のあるゾル状にすることで、キヤピラリーを取り外すことなく分離媒体のみの交換を可能にすることを特徴とするものである。したがって、本発明の分離'分析用充填材組成物を使用することにより、キヤピラリーを取り外すことなくキヤビラリ一は半永久的に使用することがでさるよう〖こなる。

この交換は、キヤピラリー電気泳動装置のキヤビラリ一恒温装置に 0°C〜100°Cまで温度を変えられるプログラムを装着し、さらに温度制御可能な加熱装置を装着したサンプルトレイにゾル溶液を装備することで、コンピューターによる制御装置と連動させて完全無人化しておこなうこともできる。

発明の効果

[0121] 本発明は、可逆的、かつ容易に充填可能な両親媒性化合物の自己集合によってできる長尺状構造、およびその物理的な架橋構造によるヒドロゲル分離媒体を電気泳動、特にはキヤビラリ一電気泳動での分離媒体として用い、安価で、再現性が高く、分離媒体の交換が容易な電気泳動法、例えば、キヤビラリ一電気泳動法を提供するものである。

本発明の分離媒体のための親水部と疎水部を持つ分子の自己集合によって形成される長尺状構造を、あるヽはそれからなるヒドロゲル状組織を充填したキヤビラリ一カラムは、高理論段数を持ち、従来の充填剤に比べて極めてシャープな分離能を有しており、し力も長期間にわたって安定である。また、前述してきたように長尺状構造の自己集合を行うことができる両親媒性ィ匕合物としては、多種多様のものが知られており、分析する試料や分析の目的に応じて、多種多様な両親媒性化合物の中から分祈に適した両親媒性ィ匕合物を選択することもできる。さらに、本発明の分離'分析用充填材組成物は、加熱処理などによって再溶解するので、分離媒体が目詰まりなどで劣化した場合も、キヤピラリーを取り外すことなく篩としての充填剤のみを詰め替えることも可能である。このため、この詰め替えによってキヤビラリ一は半永久的に使用することができる。また詰め替え時に濃度やそのヒドロゲルの原料となる両親媒性ィ匕合物の種類を変えることで、篩の網目の大きさや形を試料の種類や分子量に対して調節可能である。

また、これらの長尺状構造が架橋していない場合 (ヒドロゲルを形成しない場合）にもこれまでの鎖状高分子溶液からなる分離媒体と同様に、交換が非常に簡単であること、また篩の形態やサイズ (つまり物理的な網目の大きさ）、堅さが冷却速度や溶媒、両親媒性ィ匕合物の濃度などによって制御できる。これらの特徴から、広い範囲の分子量をもつ DNA、 RNA、タンパク質などの高分子はもとより糖鎖、ペプチド、脂質、および天然生理活性物質、アミノ酸などの低分子の高理論段数をもつ電気泳動法、例えばキヤピラリー電気泳動分析に有用である。

図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、キヤピラリー電気泳動装置の概略を示すものである。

[図 2]図 2は、キヤピラリー内部を TEバッファーで満たし、ラダー DNA50〜10, OOOb Pを分析したクロマトグラム（エレクト口フエログラム）を示すものである。 [図 3]図 3は、キヤピラリー内部をゲルバッファーで満たし、ラダー DNA50〜10, 000 bpを分析したクロマトグラム（エレクト口フエログラム）を示すものである。

[図 4]図 4は、キヤビラリ一内部を本発明の分離'分析用充填材組成物の自己集合性ヒドロゲル 0. 5wt%で満たし、ラダー DNA50〜10, OOObpを分析したクロマトグラム (エレクト口フエログラム）を示すものである。

[図 5]図 5は、キヤビラリ一内部を本発明の分離'分析用充填材組成物の自己集合性ヒドロゲル 2wt%で満たし、ラダー DNA50〜10, OOObpを分析したクロマトグラム（エレクト口フエログラム）を示すものである。

[図 6]図 6は、キヤピラリー内部を TEバッファーで満たし、ラダー DNA50〜800bpを分析したクロマトグラム（エレクト口フエログラム）を示すものである。

[図 7]図 7は、キヤピラリー内部をゲルバッファーで満たし、ラダー DNA50〜800bpを分析したクロマトグラム（エレクト口フエログラム）を示すものである。

[図 8]図 8は、キヤビラリ一内部を本発明の分離'分析用充填材組成物の自己集合性ヒドロゲル 2wt%で満たし、ラダー DNA50〜800bpを分析したクロマトグラム（エレクトロフエログラム）を示すものである。

[図 9]図 9は、図 3で示したキヤピラリー内部をゲルバッファーで満たし、ラダー DNA5 0〜： L0, OOObpを分析したクロマトグラム（エレクト口フエログラム）（a)、及び図 5で示したキヤピラリー内部を本発明の分離 ·分析用充填材組成物の自己集合性ヒドロゲル 2wt%で満たし、ラダー DNA50〜10, OOObpを分析したクロマトグラム（エレクトロフエログラム）（b)をまとめて示したものである。

[図 10]図 10は、実施例 2で使用したスラブ電気泳動装置の概略を示すものである。

[図 11]図 11は、従来の 4%ポリアクリルアミドゲルをスラブゲルとして用い、ラダー DN A (図中の番号 1, 2, 3力 20bp、 100bp、 200bpのラダーに対応する）を電気泳動したクロマトグラム（エレクト口フエログラム）を示すものである。

[図 12]図 12は、 4%ポリアクリルアミドゲルと 0. 004%の本発明の化合物 35の L—酒石酸塩から成る長尺状の自己集合体を混合したものをスラブゲルとして用い、ラダー DNA (図中の番号 1, 2, 3力 20bp、 100bp、 200bpのラダーに対応する）を電気泳動したクロマトグラム（エレクト口フエログラム）を示すものである。符号の説明

[0123] 1 キヤピラリーカラム

2 緩衝液容器

3 試料容器

4 緩衝液容器

5 紫外可視吸光検出器

6 直流電源

11 図 10のゲノレ板

12 図 10の緩衝液容器

13 図 10の直流電源

発明を実施するための最良の形態

[0124] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例 1

[0125] (1) 自己集合性ヒドロゲルのキヤビラリ一への充填

まず、ガラス容器に自己集合性の両親媒性ィ匕合物である次式

[0126]

[0127] 1, 20- 3'—チミジル酸双頭型脂質（R.Iwaura et al. Chem. Mater. 2002, 14, 3047. 、及び特開 2003— 55642号公報参照）（10mg、 0. 01ミリモル、または 5mg、 0. 00 5ミリモル)を量り、これに pH値 8の TEバッファー（和光純薬工業株式会社製、商品番号 316— 90025) 0. 5mLをカ卩え、ヒートガンで熱しながら溶解し、 2wt%および 0 . 5wt%の両親媒性ィ匕合物を含む溶液を調製した。この溶液を、 0. 45ミクロンのメンブランフィルター（ゲルマンサイエンスジャパン社製、商品番号 4457)で濾過した。次に、上述の両親媒性ィ匕合物を含む溶液で温度力 0〜60°Cのものをキヤビラリ一電気泳動装置（ベックマンコールター社製、 P/ACEシステム MDQ)にセットし、 10p siで 3分間加圧することによって、内径 75ミクロン、長さ 30cmのポリアクリルアミド被覆シリカゲルキヤビラリ一（ベックマン社製、商品番号 477477)内へ充填した。この後、キヤビラリ一内部が乾燥しないように、両端を上述の両親媒性ィ匕合物を含む溶液に浸したまま、室温で 3日間静置した。これによつて、内径 75ミクロンのシリカゲルキヤピラリー中に、両親媒性化合物の自己集合力もなるヒドロゲルを得た。

上述のキヤビラリ一中には、幅 lOOnm程度の繊維状自己集合体が、三次元網目状に絡み合った構造で存在していることが、キヤビラリ一断面の電子顕微鏡観察によつて確かめられた。

[0128] (2) 装置

上述の方法によって得られたヒドロゲル充填キヤピラリーを、図 1に示す電気泳動装置に取り付け、 TEバッファー、 pH = 8の緩衝液を用いて、 20°Cにおいて 10kVの印可電圧をかけて DN Aの検出を行った。なお、図 1中、 1はキヤビラリ一力ラム、 2は緩衝液容器、 3は試料容器、 4は緩衝液容器、 5は紫外可視吸光検出器、 6は直流電源であり、 2〜4には電極が挿入される。試料を負荷する時は、試料容器 3にキヤビラリーカラム 1と電極を移動し、 6kV、 10秒間の電圧を印加した。また、 DNAの分離においては、キヤビラリ一力ラム 1と電極を、緩衝液容器 2および 4に移動し、 10kVの電圧を印カロした。さらに、キヤビラリ一内部から自己集合性ヒドロゲルが浸出することを防ぐため、キヤビラリ一の両端から 5psiの圧力をかけた。 DNAの検出は、紫外可視吸光検出器 5によって 254nmの波長をモニターすることにより行った。

[0129] (3) 分析結果 1

図 2にキヤピラリー内部を TEバッファーで満たした場合、図 3にキヤピラリー内部をゲルバッファー（ベックマン社製、商品番号 477628)で満たした場合、図 4にキヤビラリー内部を 0. 5wt%の両親媒性ィ匕合物の濃度で自己集合によって得たヒドロゲル（以下 0. 5wt%のヒドロゲルと称する）を充填した場合、図 5にキヤピラリー内部を 2wt %の両親媒性化合物の濃度で自己集合によって得たヒドロゲル (以下 2wt%のヒドロゲルと称する）を充填した場合の、ラダー DNA(50〜10, OOObp、タカラバィォ社製、商品番号 3415A)分析結果を示す。図 2〜5中、横軸は時間、縦軸は信号強度である。これらの分析結果より、図 2と図 4に示す、 TEバッファーのみで満たしたキヤビラリーおよび 0. 5wt%のヒドロゲルを充填したキヤピラリーではラダー DNAはほとんど分離されていない。一方、図 5に示す 2wt%のヒドロゲルでは、 rt= 5〜7分の付近に図 3のゲルバッファーを満たしたキヤビラリ一と比較して非常に鋭いピークが得られたこのように、本発明の分離'分析用充填材組成物では、加熱や pHの調整などにより交換可能であるだけでなぐ長尺状の自己集合体という独特の構造をした篩いの作用を利用することにより、従来の分離 ·分析用充填材組成物に比べて非常にシヤープな分離 ·分析が可能となる。

[0130] (4) 分析結果 2

図 6にキヤピラリー内部を TEバッファーで満たした場合、図 7にキヤピラリー内部をゲルバッファー（ベックマン社製、商品番号 477628)で満たした場合、図 8にキヤビラリー内部を自己集合性 2wt%のヒドロゲルで満たした場合の、ラダー DNA(50bp〜 800bp、インビトロジェン社製、商品番号 10416— 014)分析結果を示す。これらの分析結果より、 50bpから 800bpの範囲で、図 8に示すキヤビラリ一中での自己集合によって得たヒドロゲル分離媒体 2wt%を用いて DNAの分離が可能であることが示された。

[0131] (5) 理論段数の解析

前記した図 3 (ゲルバッファーで満たし、ラダー DNA50〜10000bpを分析したエレタトロフエログラム）に示した結果と、図 5 (本発明の分離'分析用充填剤組成物で、化合物 32からなる自己集合体ヒドロゲル 2wt%で満たし、ラダー DNA50〜： LOOOObp を分析したエレクト口フエログラム）に示した結果とを比較するために、これらをそれぞれ図 9 (a)及び (b)として示す。そして、それぞれのピークを左側から図 9に示されるように 1〜6番の番号を付した。図 9に示したそれぞれのピークに対する理論段数を計算した。理論段数は以下の式を用いて求めた。

理論段数 = 16 [t Z W]²

ここに、 tは泳動時間を示し、 Wはピーク幅（半値幅の 2倍)の値を示す。この計算式により計算された各ピークにおける理論段数を次の表 1に示す。 [表 1]

[0133] 表 1に示されるようにピーク 2〜5において、本発明の分離媒体は、従来のゲルバッファー (ベックマン社製、商品番号 477628) (図 9 (a) )よりも大きな理論段数を示し、本発明のヒドロゲル分離媒体によってよりシャープな分離分析が可能となることが示された。

実施例 2

[0134] 自己集合性の化合物であるエタンジィルー 1, 2 ビス（へキサデシルジメチルァンモ-ゥムブ口ミド）（ィ匕合物 35、（合成は I.Huc et al., Angew. Chem., Int. Ed. 1998, 37, 2689- 2691.参照）） (19. 94mg、 0. O352mmol)と一当量の L 酒石酸（6. 82 mg、 0. O351mmol)に、滅菌水 4. 958mLをカロ免カロ熱溶解して、 0. 4wt%のィ匕合物 35の L 酒石酸塩熱水溶液を調整した。

次に、 40%アクリルアミド Zビス溶液（BIORAD社製、商品番号 161— 0146) 1. 5 mLゝ 0. 5 XTBE緩衝液（BIORAD社製、商品番号 161— 0733の 10 XTBEを 50 倍希釈したもの） 3. 9mL、滅菌水 9. 375mL、過硫酸アンモ-ゥム（和光純薬工業株式会社製、商品番号 018— 03282) 0. lgを lmLの滅菌水に溶解して得られた溶液 0. 075mLを混合したゲル溶液に、上述した化合物 35の L—酒石酸塩から成る熱水溶液を 90— 100°Cに保った状態で 0. 15mL加えた。さらに、 N, N, Ν' , N' —テトラメチルエチレンジァミン (和光純薬工業株式会社製、商品番号 205— 06313 ) 7. 5mLをカ卩え、すばやくゲル板にゲル溶液を充填し、室温で一時間静置してゲルを形成した。

図 10に示すように、前記した方法によってゲルを充填したゲル板 11を、緩衝液容器 12、及び直流電源 13を備えた電気泳動装置に取り付け、泳動バッファーに 0. 5 X TBE緩衝液を用いて室温で 80Vの定電圧を印加して DNAの分離を行った。泳動後、ゲルをェチジゥムブロミド溶液（10—4 mg/mL, 0. 5 XTBE緩衝液）に 30 分間浸した後、紫外線照射装置を用いて紫外線を照射し DNAのバンドを観測した。

[0135] 分析結果

図 11に 4%ポリアクリノレアミドゲノレと図 12に 0. 004%のィ匕合物 35の L 酒石酸塩力成る長尺状の自己集合体を含む 4%ポリアクリルアミドゲルを用いて、 740〜20b pの DNA分子の 20bp刻みの 20bpDNAラダー標準サンプル、 1500bp〜： LOObpの DNA分子の lOObp刻みの lOObpDNAラダー標準サンプル、又は 5000〜200bp の DNA分子の 200bp刻みの 200bpDNAラダー標準サンプルの 3種類のラダー D NAサンプル（タカラ社製、 20bp DNA Ladder商品番号 3409A、 100bp DNA

Ladder商品番号 3407A、 200bp DNA Ladder商品番号 341 OA)を、それぞれ分離した結果を示す。図 11, 12中の番号 1, 2, 3がこの順で三種のラダー DN Aに対応する。長尺型自己集合体を含む 4%ポリアクリルアミドゲルを用いて泳動した場合、ポリアクリルアミドゲルを用いた場合よりバンドの幅が狭くなつており、特に 200 0 - 3000bpの DNAの分離能が向上したことがわかる。

これらの結果より、スラブ電気泳動法においても長尺状の自己集合体を少量添カロすることで従来のアクリルアミドゲルを用いた分離法より優れた分離が可能となることが示された。

産業上の利用可能性

[0136] 本発明は、産業上有用な電気泳動装置及びそれを用いた分離又は分析方法における新規な分離 ·分析用充填材組成物を提供するものであり、産業上の利用性を有している。

蛋白質た核酸の分離や分析方法は研究開発のみならず、治療や診断のための基礎データとして極めて有用なものであり、本発明の装置及び方法は産業上有用なデータの収集に寄与するものであり、産業上の利用性を有している。

Claims

請求の範囲

[I] 疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性ィヒ合物の水中での加熱溶解と冷却によつて製造することができる長尺状の自己集合体を含有してなる電気泳動のための分離 ·分析用充填材組成物。

[2] 電気泳動法が、キヤビラリ一電気泳動、キヤビラリ一ゾーン電気泳動、キヤビラリ一等電点電気泳動、キヤビラリ一等速電気泳動、ミセル動電クロマトグラフィー、キヤビラリーゲル電気泳動、又は SDSキヤビラリーゲル電気泳動である請求項 1に記載の充填材組成物。

[3] 電気泳動法が、スラブ電気泳動法、デスクゲル電気泳動法、 SDS - PAGE法、 Na tive— PAGE法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）または免疫電気泳動法である請求項 1に記載の充填材組成物。

[4] 電気泳動において、さらにブロッテイング操作が併用されるものである請求項 1に記載の充填材組成物。

[5] 電気泳動における分析対象物が、タンパク質、核酸、糖質、または脂質であることを特徴とする請求項 1〜4のいずれかに記載の充填材組成物。

[6] 長尺状の自己集合体が、物理的な架橋構造によって形成されるヒドロゲル状である請求項 1〜5のいずれかに記載の充填材組成物。

[7] ヒドロゲル力ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びポリアクリルアミドからなる群力も選ばれるヒドロゲル剤を含有するものである請求項 6に記載の充填材組成物。

[8] 疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性ィ匕合物が、両親媒性脂質である請求項 1

〜7の、ずれかに記載の充填材組成物。

[9] 疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性ィ匕合物が、チミジル酸双頭型脂質である請求項 8に記載の充填材組成物。

[10] 疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性ィ匕合物と水を混合し、これを水中で加熱溶解し、次いで冷却することからなる長尺状の自己集合体を含有してなる電気泳動のための分離 ·分析用充填材組成物を製造する方法。

[II] 長尺状の自己集合体の物理的な架橋構造によって形成されるヒドロゲル状である請求項 10に記載の充填材組成物の製造方法。

[12] ヒドロゲル力ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びポリアクリルアミドからなる群力も選ばれるヒドロゲル剤を含有するものである請求項 11に記載の充填材組成物の製造方法。

[13] 請求項 1〜9の、ずれかに記載の充填材組成物が充填された電気泳動用の分離媒体の容器。

[14] 電気泳動用の分離媒体の容器が、キヤビラリ一である請求項 13に記載の分離媒体の容器。

[15] 充填材組成物が交換可能に充填されているものである請求項 13又は 14に記載の分離媒体の容器。

[16] 請求項 13又は 14に記載の分離媒体の容器を有することを特徴とする電気泳動装置。

[17] 電気泳動用の分離媒体の容器が、キヤビラリ一である請求項 16に記載の電気泳動装置。

[18] 請求項 1〜9の、ずれかに記載の充填材組成物が充填された電気泳動用のキヤピラリーを用いて試料を電気泳動により分離'分析する方法。

[19] 電気泳動法が、キヤビラリ一電気泳動、キヤビラリ一ゾーン電気泳動、キヤビラリ一等電点電気泳動、キヤビラリ一等速電気泳動、ミセル動電クロマトグラフィー、キヤビラリーゲル電気泳動、又は SDSキヤビラリーゲル電気泳動である請求項 18に記載の分離，分析方法。

[20] 電気泳動法が、スラブ電気泳動法、デスクゲル電気泳動法、 SDS-PAGE法、 Native

-PAGE法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）、又は免疫電気泳動法である請求項 1

8に記載の分離'分析方法。

[21] 電気泳動において、さらにブロッテイング操作が併用されることを特徴とする請求項

20に記載の分離 ·分析方法。

[22] 分析対象物となる試料が、タンパク質、核酸、糖質、又は脂質である請求項 18〜2

1のいずれかに記載の分離'分析方法。

[23] キヤビラリ一電気泳動において、キヤビラリ一中の劣化した分離 ·分析用充填材組成物が充填されているキヤビラリ一力ラムを加熱して、分離'分析用充填材組成物を流動性のゾル又は分子分散状態まで再溶解し、これを吸引又は加圧することによりキヤビラリ一力ラム内の溶液化された劣化された分離'分析用充填材組成物を除去し、次いで新しい分離 ·分析用充填材組成物を当該キヤビラリ一力ラムに充填すること力もなる、キヤビラリ一力ラムの分離 ·分析用充填材組成物を交換する方法。

[24] 分離'分析用充填材組成物が、請求項 1〜9のいずれかに記載の分離'分析用充填材組成物である請求項 22に記載の交換方法。

[25] キヤビラリ一力ラムの加熱温度力 50°C〜100°Cである請求項 23又は 24に記載の交換方法。