WO2006072347A2 - Alkinyl-substituierte thiophene - Google Patents

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WO2006072347A2
WO2006072347A2 PCT/EP2005/013217 EP2005013217W WO2006072347A2 WO 2006072347 A2 WO2006072347 A2 WO 2006072347A2 EP 2005013217 W EP2005013217 W EP 2005013217W WO 2006072347 A2 WO2006072347 A2 WO 2006072347A2
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alkyl
cyclohexyl
substituted
group
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Tobias Wunberg
Judith Baumeister
Dirk Gottschling
Kerstin Henninger
Diana Koletzki
Josef Pernerstorfer
Andreas Urban
Alexander Birkmann
Axel Harrenga
Mario Lobell
Original Assignee
Aicuris Gmbh & Co. Kg
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/26—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D333/38—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D333/40—Thiophene-2-carboxylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals

Definitions

  • the invention relates to alkynyl-substituted thiophenes and processes for their preparation, their use for the treatment and / or prophylaxis of diseases and their use for the preparation of medicaments for the treatment and / or prophylaxis of diseases, in particular for use as antiviral agents, especially against hepatitis C. viruses.
  • HCV hepatitis C virus
  • Interferon-alpha IFN- ⁇
  • IFN- ⁇ Interferon-alpha
  • interferon interferon
  • Hepatitis C virus is the only member of the genus Hepacivirus within the family Flaviviridae. There are at least 6 genotypes and a variety of subtypes. The virus is surrounded by a shell and has as a genome a positive single strand of viral RNA. The length of the viral RNA genome is approximately 9500 nucleotides. Propagation of the viral genome and translation into protein is accomplished by means of RNA structures located at the beginning and end of the genome (5 'untranslated region, 3' untranslated region). The genome has a single reading frame (open reading frarae, ORF) which codes for a poly-protein (about 3000 amino acids).
  • ORF open reading frarae
  • NS proteins are cleaved in an infected cell by viral or host cell enzymes.
  • HCV encodes a capsid protein (c) and two envelope proteins (El and E2).
  • a small protein (p7) could be a so-called viroporin, which is essential for the infectivity of the mature virus particle.
  • the mature NS proteins include the NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B proteins. For their cleavage from the polyprotein two viral proteases are responsible.
  • the enzyme designated as NS2 / 3 protease cleaves at the NS2-NS3 interface in a manner that is as yet only slightly characterized.
  • the second protease is a serine protease contained in the N-terminal part of the NS3 protein. It catalyzes all cleavages of the polyprotein present downstream from NS3, i. NS3 NS4A proteolysis as well as NS4A NS4B, NS4B NS5A, NS5A NS5B digests.
  • the NS4A protein probably has multiple functions, for example, as a cofactor of the NS3 protease and possibly in the membrane localization of NS3 and other NS proteins. Complex formation between NS3 and NS4A is presumably a prerequisite for protein processing and increases the proteolytic activities in all cleavage sites.
  • the NS3 protein also has activity as NTPase and helicase.
  • NS5B is an RNA-dependent RNA polymerase that plays a crucial role in HCV replication. Very little is known about the functions of the NS4B and NS5A proteins. For NS5A, involvement in clinical resistance to interferon is discussed. Hepatitis C closely related viruses such as the GBV B virus, which infects New World monkeys, or the BVDV (Bovine Viral Diarrhea Virus) are often used as model viruses to study certain aspects of the virus life cycle.
  • Structurally similar compounds are described, for example, in WO02 / 100851, WO04 / 052879 and WO04 / 052885 for the treatment and / or prophylaxis of flavivirus infections, e.g. Hepatitis C, in WO 00/027823 as gastrin and / or cholecystokinin receptors for the treatment of cancer and diseases of the central nervous system, described in WO 92/010094 in combination with aryloxyacetic acid derivatives as herbicides and in EP-A 423 523 as herbicides.
  • flavivirus infections e.g. Hepatitis C
  • WO 00/027823 as gastrin
  • cholecystokinin receptors for the treatment of cancer and diseases of the central nervous system
  • WO 92/010094 in combination with aryloxyacetic acid derivatives as herbicides and in EP-A 423 523 as herbicides.
  • the invention relates to compounds of the formula
  • R 1 is (C r C6) alkyl, (C 3 -C 6) -cycloalkyl or phenyl,
  • alkyl, cycloalkyl and phenyl may be substituted with 1 to 2 substituents, wherein the substituents are independently selected from the group consisting of hydroxy, amino, (C] -C 6 ) alkylamino, 5- to 7-membered heterocyclyl and phenylsulfonylamino, in which phenylsulfonylamino may in turn be substituted by 1 to 3 substituents, the substituents being selected independently of one another from the group consisting of fluorine, chlorine, hydroxyl, amino, trifluoromethyl, t-fluoromethoxy, methyl and methoxy,
  • R 2 is branched (C 3 -C 5 ) -alkyl, cyclobutyl, cyclopentyi, cyclohexyl, tetrahydrofuranyl, pyrrolidinyl, tetrahydro-2H-pyranyl, piperidinyl, tetrahydro-2H-thiopyranyl, oxidotetrahydro-2H-thiopyranyl or 1,1-dioxotetrahydro- 2H-thiopyranyl stands,
  • alkyl may be substituted with 1 to 2 substituents wherein the substituents are independently selected from the group consisting of amino, methoxy, (C 1 -C 6 ) alkylamino, methylthio, methylsulfonyl, methylsulfoxyl or
  • R 3 is cyclohexyl
  • cyclohexyl may be substituted with 1 to 2 substituents, wherein the substituents are independently selected from the group consisting of hydroxy and (C 1 -Ca) -alkyl,
  • Compounds according to the invention are the compounds of the formula (I) and their salts, solvates and solvates of the salts, compounds referred to below as the starting examples (e) and their salts, solvates and solvates of the salts, as far as those of the formula (I) are concerned,
  • the compounds mentioned below are not already salts, solvates and solvates of the salts.
  • the compounds of the invention may exist in stereoisomeric forms (enantiomers, diastereomers).
  • the invention therefore relates to the enantiomers or diastereomers and their respective mixtures. From such mixtures of enantiomers and / or diastereomers, the stereoisomerically uniform components can be isolated in a known manner.
  • the present invention encompasses all tautomeric forms.
  • Salts used in the context of the present invention are physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention. However, also included are salts which are not suitable for pharmaceutical applications themselves, but can be used, for example, for the isolation or purification of the compounds according to the invention.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention include acid addition salts of mineral acids, carboxylic acids and sulfonic acids, for example hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, phosphoric, methanesulfonic, ethanesulfonic, toluenesulfonic, benzenesulfonic, naphthalenedisulfonic, acetic, trifluoracetic, propionic, lactic Malic acid, citric acid, fumaric acid, maleic acid and benzoic acid.
  • Physiologically acceptable salts of the compounds according to the invention also include salts of customary bases, such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and magnesium salts) and ammonium salts derived from ammonia or organic amines having 1 to 16 carbon atoms, for example and preferably, ethylamine, diethylamine, triethylamine, ethyldiisopropylamine, monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, procaine, dibenzylamine, N-methylmorpholine, arginine, lysine, ethylenediamine and N-methylpiperidine.
  • customary bases such as, by way of example and by way of preference, alkali metal salts (for example sodium and potassium salts), alkaline earth salts (for example calcium and magnesium salts) and ammonium salts
  • solvates are those forms of the compounds according to the invention which form a complex in the solid or liquid state by coordination with solvent molecules. Hydrates are a special form of solvates that coordinate with water.
  • Alkyl per se and "Alk” and "alkyl” in alkylamino stand for a linear or branched alkyl radical having usually 1 to 6 (“Ci-C ⁇ -alkyl”), preferably 1 to 4, particularly preferably 1 to 3 carbon atoms, by way of example and preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, tert-butyl, n-pentyl and n-hexyl.
  • Alkylamino is an alkylamino radical having one or two (independently selected) alkyl substituents, by way of example and preferably methylamino, ethylamino, n-
  • C 1 -C 3 -alkylamino is, for example, a monoalkylamino radical having 1 to 3 carbon atoms or a dialkylamino radical having in each case 1 to 3 carbon atoms per alkyl substituent.
  • Cycloalkyl is a cycloalkyl group having usually 3 to 7, preferably 5 to 6 carbon atoms, by way of example and preferably cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl and cycloheptyl.
  • 5- to 7-membered heterocyclyl in the context of the invention is a monocyclic, saturated or partially unsaturated heterocycle having up to three heteroatoms from the series N, O and / or S, which is linked via a ring carbon atom or a nitrogen atom of the heterocycle and optionally substituted oxo.
  • N, O and / or S which is linked via a ring carbon atom or a nitrogen atom of the heterocycle and optionally substituted oxo.
  • Tetrahydro-2H-pyranyl dihydropyranyl, piperidinyl, piperazinyl, morpholinyl, thiomorpholinyl, tetrahydro-2H-thiopyranyl, oxidotetrahydro-2H-thiopyranyl, 1,1-dioxotetrahydro-2H-thiopyranyl, tetrahydrothienyl and 1,4-diazepanyl.
  • R 1 is isopropyl, tert-butyl, cyclopropyl, cyclopentyl or cyclohexyl,
  • isopropyl, cyclopropyl, cyclopentyl and cyclohexyl may be substituted with a substituent, wherein the substituent is selected from the group consisting of hydroxy and amino,
  • R 2 is branched (C 3 -C 5 ) alkyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, tetrahydro-2H-pyranyl, piperidinyl, tetrahydro-2H-thiopyranyl, oxidotetrahydro-2H-thiopyranyl or 1,1-diocto-tetrahydro-2H-thiopyranyl .
  • alkyl may be substituted with 1 to 2 substituents, wherein the substituents are independently selected from the group consisting of methoxy, dimethylamino, methylthio, methylsulfonyl, methylsulfoxyl or methoxycarbonyl,
  • R 3 is cyclohexyl
  • cyclohexyl may be substituted with 1 to 2 substituents, wherein the substituents are independently selected from the group consisting of hydroxy and
  • R 1 is isopropyl, tert-butyl, cyclopropyl, cyclopentyl or cyclohexyl.
  • compounds of the formula (I) 3 in which R 1 is (C-O-G-O-alkyl, where alkyl may be substituted by a substituent, where the substituent is selected from the group consisting of hydroxyl, Amino or (C 1 -C f i) -alkylamino.
  • R 1 is 1-hydroxy-1-methyleth-1-yl or 1-hydroxycyclopent-1-yl.
  • R 2 is cyclobutyl, cyclopentyl or cyclohexyl.
  • R 2 is a (C 3 -C 5 ) -alkyl bonded to the nitrogen via a secondary carbon atom, where alkyl may be substituted by 1 to 2 substituents wherein the substituents are independently selected from the group consisting of methoxy, dimethylamino, methylthio, methylsulfonyl, methylsulfoxyl or methoxycarbonyl.
  • Preferred in the context of the present invention are also compounds of the formula (I) in which R 2 is isopropyl.
  • R 2 is tetrahydrofuranyl, pyrrolidinyl, tetrahydro-2H-pyranyl, piperidinyl, tetrahydro-2H-thiopyranyl, oxidotetrahydro-2H-thiopyranyl or 1,1-dioxotetrahydro- 2H-thiopyranyl stands.
  • R 3 is cyclohexyl, where cyclohexyl may be substituted by 1 to 2 substituents, where the substituents are independently selected from the group consisting of hydroxy and methyl ,
  • R 3 is trans-4-methylcyclohexyl which is substituted in the 2-position by a hydroxyl group.
  • R 3 is trans-4-methylcyclohexyl which is in the 2-position with a hydroxyl group is substituted and this hydroxy group and the carbonyl group in cis position to each other.
  • the invention further provides a process for the preparation of the compounds of the formula (I), where compounds of the formula
  • R 1 , R 2 and R 3 have the abovementioned meaning
  • R 4 is alkyl, preferably methyl, ethyl or tert-butyl,
  • reaction is generally carried out with a base in inert solvents, preferably in a temperature range from room temperature to the reflux of the solvent at atmospheric pressure.
  • Bases are, for example, alkali metal hydroxides such as sodium, lithium or potassium hydroxide, or alkali metal carbonates such as cesium carbonate, sodium or potassium carbonate, optionally in aqueous solution, lithium hydroxide in water is preferred.
  • Inert solvents are, for example, ethers, such as 1,2-dimethoxyethane, dioxane, tetrahydrofuran, glycol dimethyl ether or diethylene glycol dimethyl ether, or alcohols, such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol or tert-butanol, or mixtures of solvents is dioxane or tetrahydrofuran.
  • ethers such as 1,2-dimethoxyethane, dioxane, tetrahydrofuran, glycol dimethyl ether or diethylene glycol dimethyl ether
  • alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol or tert-butanol, or mixtures of solvents is dioxane or tetrahydrofuran.
  • reaction is generally carried out with an acid in inert solvents, preferably in a temperature range from room temperature to the reflux of the solvent at atmospheric pressure.
  • radicals R 3 contain functional groups such as, for example, hydroxyl or amino, these groups are provided with suitable protective groups known from the literature, for example acetyl, benzyl, benzyloxycarbonyl or tert-butyloxycarbonyl, which are cleaved off after the reaction to give compounds of the formula (I) ( Lit: PJ Kocienski: "Protecting Groups", Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 1994, ISBN 3-13-135601-4).
  • R 2 , R 3 and R 4 have the abovementioned meaning
  • R 1 has the meaning given above
  • the reaction is generally carried out under Sonogashira reaction conditions under argon in inert and degassed solvents, in the presence of a catalyst, optionally in the presence of an additional reagent, in the presence of a base and triphenylphosphine, preferably in a temperature range from room temperature to reflux of the solvent at atmospheric pressure (RR Tykwinski, Angew. Chem. Int Ed 2003, 42, 1566-1568, K. Sonogashira in Handbook of Organopalladium Chemistry for Organic Synthesis (Ed E.I. Negishi), 1133-1178 Wiley-Interscience, New York (2002)).
  • Catalysts are, for example, customary for Sonogashira reaction conditions palladium catalysts, preferred are catalysts such as tri (dibenzylideneacetone) dipalladium, dichlorobis (triphenylphosphine) palladium, tetrakistriphenylphosphinepalladium (O), palladium (II) - acetate, l, r-bis [(diphenylphosphino ) -ferrocene] palladium II chloride (1: 1) complex with dichloromethane.
  • catalysts such as tri (dibenzylideneacetone) dipalladium, dichlorobis (triphenylphosphine) palladium, tetrakistriphenylphosphinepalladium (O), palladium (II) - acetate, l, r-bis [(diphenylphosphino ) -ferrocene] palladium II chloride (1: 1) complex
  • Additional reagents are, for example, copper (I) iodide and triphenylphosphine.
  • bases examples include amine bases such as triethylamine.
  • Inert solvents are, for example, ethers, such as dioxane, tetrahydrofuran or 1,2-dimethoxyethane, hydrocarbons, such as benzene, xylene or toluene, or other solvents, such as nitrobenzene, dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide or N-methylpyrrolidone. Dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide or 1,2-dimethoxyethane.
  • the compounds of the formula (IV) are known or can be synthesized by known processes from the corresponding starting materials.
  • R 2 , R 3 and R 4 have the abovementioned meaning
  • halocarbon such as dichloromethane, chloroform or carbon tetrachloride and mixtures thereof, preferred is a mixture of chloroform and carbon tetrachloride.
  • the compounds of the formula (V) are known or can be prepared by reacting compounds of the formula
  • R 2 and R 4 have the abovementioned meaning
  • R 3 has the meaning given above, and
  • X 1 is halogen, preferably chlorine or bromine
  • the reaction takes place in inert solvents or in situ with the acylating reagent, if appropriate in the presence of a base, preferably in a temperature range from 0 ° C. to 120 ° C. under atmospheric pressure.
  • Inert solvents are, for example, halogenated hydrocarbons, such as methylene chloride, trichloromethane, tetrachloromethane, trichloroethane, tetrachloroethane, 1,2-dichloroethane or trichloroethylene, ethers, such as diethyl ether, methyl tert-butyl ether, dioxane, tetrahydrofuran, 1,2-dimethoxyethane , Glycol dimethyl ether or diethylene glycol dimethyl ether, hydrocarbons such as benzene, xylene, toluene, hexane, cyclohexane or petroleum fractions, or carboxylic acid amides such as N, N-dimethylformamide or N, N-dimethylacetamide, alkylnitriles such as acetonitrile, or heteroaromatics such as pyridine, or ethyl
  • bases examples include alkali metal carbonates such as cesium carbonate, sodium or potassium carbonate, alkali metal acetates such as sodium acetate or other bases such as triethylamine, diisopropylethylamine or pyridine, preferably diisopropylethylamine, triethylamine or pyridine.
  • alkali metal carbonates such as cesium carbonate, sodium or potassium carbonate
  • alkali metal acetates such as sodium acetate
  • other bases such as triethylamine, diisopropylethylamine or pyridine, preferably diisopropylethylamine, triethylamine or pyridine.
  • the compounds of the formula (VII) are known or can be synthesized by known processes from the corresponding starting materials.
  • the compounds of the formula (VI) are known or can be prepared by reacting compounds of the formula
  • R 4 has the meaning given above
  • the reaction is generally carried out in inert solvents, in the presence of a reducing agent and acetic acid, preferably in a temperature range from room temperature to the reflux of the solvent at atmospheric pressure.
  • Inert solvents are, for example, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride or 1,2-dichloroethane, ethers such as dioxane or tetrahydrofuran, alcohols such as methanol or ethanol, or N, N-dimethylformamide, preferably methylene chloride or 1, 2-dichloroethane.
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride or 1,2-dichloroethane
  • ethers such as dioxane or tetrahydrofuran
  • alcohols such as methanol or ethanol
  • N, N-dimethylformamide preferably methylene chloride or 1, 2-dichloroethane.
  • Reducing agents are, for example, sodium borohydride, sodium cyanoborohydride, sodium trisacetoxyborohydride or tetrabutylammonium borohydride, sodium trisacetoxyborohydride being preferred.
  • reaction is optionally carried out in the presence of Lewis acids such as titanium tetrachloride (analogous to J.F. Parlow, M. S. South, Tetrahedron 2003, 59, 7695-7701).
  • Lewis acids such as titanium tetrachloride
  • the compounds of formula (VIII) are known or can be synthesized by known methods from the corresponding starting materials, e.g. by Gewald synthesis (K. Gewald et al., Chem. Ber. 1966, 94-100).
  • Aldehydes, ketones, orthoesters and enol ethers containing the radical R 2 are known or can be synthesized by known methods from the corresponding starting materials.
  • the preparation of the compounds according to the invention can be illustrated by the following synthesis scheme.
  • the compounds of the invention show an unpredictable, valuable spectrum of activity. They show antiviral activity against members of the family Flaviviridae, especially against hepatitis C virus.
  • Another object of the present invention is the use of the compounds according to the invention fertilize for the treatment and / or prophylaxis of diseases, especially of infections with viruses, in particular the viruses mentioned above, and the infectious diseases caused thereby.
  • a virus infection is understood below to mean both an infection with a virus and an infection caused by a virus.
  • HCV infections in patients infected with HBV (hepatitis B virus) or other hepatotrophic viruses (for example hepatitis A virus, hepatitis G virus);
  • viruses related to HCV e.g. Yellow fever virus, Dengue virus, West Nile virus, Early summer meningoencephalitis virus, Japanese encephalitis virus;
  • hepatitis C Treatment of materials or biological agents to prevent or reduce the transmission of hepatitis C (e.g., in blood and blood products, blood donation items or surgical instruments).
  • Another object of the present invention is the use of the compounds of the invention for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of diseases, in particular the aforementioned diseases.
  • the compounds according to the invention are preferably used for the preparation of medicaments which are suitable for the prophylaxis and / or treatment of infections with hepatitis C virus or other members of the family Flaviviridae.
  • Another object of the present invention is the use of the compounds of the invention alone or in combination with other agents for the treatment and / or prophylaxis of diseases, in particular the aforementioned diseases.
  • compositions containing at least one compound of the invention preferably together with interferon (pegylated or non-pegylated) or with ribavirin or with one or more anti-HCV agents or with a combination thereof, as well as their Use for the purposes mentioned above.
  • Another object of the present invention is a method for the treatment and / or prophylaxis of diseases, in particular the aforementioned diseases, using ELLg an antiviral effective amount of the compounds of the invention.
  • the present invention furthermore relates to a method for treating an HCV infection by administering an effective amount of at least one of the compounds according to the invention, a pharmacologically acceptable salt, solvate or solvate of a salt thereof or of a medicament as described above, alone or together with interferon ( pegylated or non-pegylated) or with immunomodulators (for example ribavirin or viramidine) or with one or more anti-HCV agents or with a combination thereof, which can be administered together or separately.
  • interferon pegylated or non-pegylated
  • immunomodulators for example ribavirin or viramidine
  • Another object of the present invention is a method for the prophylaxis of HCV infection by administration of an effective amount of at least one of the compounds of the invention, a pharmacologically acceptable salt, solvate or solvate of a salt thereof or a drug as described above, alone or together with Interferon (pegylated or non-pegylated) or with immunomodulators (for example ribavirin or viramidine) or with one or more anti-HCV agents or with a combination thereof, which may be administered together or separately.
  • Interferon pegylated or non-pegylated
  • immunomodulators for example ribavirin or viramidine
  • Medicaments of the present invention may contain one or more additional active agents, preferably selected from the group of antiviral agents, immunomodulatory agents, HCV protease inhibitors, HCV polymerase inhibitors, inhibitors of another target in the HCV life cycle, HIV inhibitors, HAV inhibitors and HBV inhibitors. Examples of such agents are listed and explained below.
  • ribavirin and amantadine antiviral agents
  • class I interferons class II interferons and pegylated interferons
  • antiviral agents antiviral agents
  • class II interferons class II interferons
  • pegylated interferons inhibitors of HCV NS5B polymerase
  • HCV NS3 helicase HCV protease or IRES (inhibitors of a other targets in the HCV life cycle)
  • nucleoside inhibitors nucleoside inhibitors, non-nucleoside inhibitors, protease inhibitors, fusion inhibitors and integrase inhibitors of HTV (HIV inhibitors) or agents that inhibit HBV DNA polymerase, or hepatitis B vaccines (HBV) inhibitors.
  • HTV HBV inhibitors
  • HBV hepatitis B vaccines
  • the present invention thus also relates to a combination therapy in which at least one of the compounds according to the invention or a pharmacologically acceptable salt, solvate or solvate of a salt thereof together with at least one additional agent selected from the group of antiviral agents, immunomodulatory agents, HCV protease inhibitors , HCV polymerase inhibitors, inhibitors of another target in the HCV life cycle, HTV inhibitors, HAV inhibitors and HBV inhibitors.
  • the additional agents may be combined with the compounds of the invention to form a single pharmaceutical dosage form. Alternatively, these additional agents can be separated be administered. Such additional agents may be administered before, during or after the administration of a compound of the invention or a pharmacologically acceptable salt, solvate or solvate of a salt thereof.
  • anti-viral agent means an agent that inhibits the formation and / or replication of a virus. This includes agents that interfere with host or virus mechanisms necessary for the formation and / or replication of a virus. Anti-viral agents are e.g. Ribavirin, Amantadine, VX-497 (Merimepodib, Vertex Pharmaceuticals), Viramidine, Ceplene (Maxamine), XTL-001 and XTL-002 (XTL-Biopharmaceuticals).
  • anti-HCV agent means an agent that reduces or prevents hepatitis C-related disease symptoms.
  • Such an agent may be an anti-viral agent, an immunomodulatory agent, an HCV protease inhibitor, an HCV polymerase inhibitor or an inhibitor of another target in the HCV life cycle.
  • Immunomodulatory agent means an agent that enhances the immune response or restricts harmful immune responses.
  • Immunomodulatory agents are e.g. Class I interferons (such as alpha, beta, delta and omega interferons, tau interferons, consensus interferons and asialo interferons), Class Ü interferons (such as gamma interferons) and pegylated interferons and substances such as levovirin.
  • HCV protease inhibitor means an agent that inhibits the function of HCV NS2 / 3 metalloprotease or NS3 / 4A serine protease.
  • HCV NS3 / 4A serine protease inhibitors are e.g. BILN 2061 (Boehringer Ingelheim), or VX-950 / LY-570310 (Vertex / Eli Lilly).
  • HCV polymerase inhibitor means an agent that inhibits the function of HCV polymerase. This includes e.g. Inhibitors of HCV NS5B polymerase.
  • HCV polymerase inhibitors include non-nucleosides, for example, compounds described in WO 02/100846 and WO 02/100851 (Shire), WO 01/85172 and WO 02/098424 (GSK), WO 00/06529 and WO 97/05825 WO 02/06246 (Merck), WO 01/47883 and WO 03/000254 (Japan Tobacco) and EP 1 256 628 (Agouron).
  • HCV polymerase inhibitors include nucleoside analogs, for example, compounds described in WO 01/90121 (Idenix), WO 02/069903 (Biochryst Pharmaceuticals), WO 02/057287 and WO 02/057425 (Merck / Isis). Further examples of HCV polymerase inhibitors are JTK-002, JTK-003 and JTK-109 (Japan Tobacco).
  • inhibitor of another target in the HCV life cycle means an agent that inhibits the formation and / or replication of HCV other than by inhibiting the function HCV protease or HCV polymerase. This includes agents that interfere with host or HCV mechanisms necessary for the formation and / or replication of HCV. Inhibitors of another target in the HCV life cycle include agents that inhibit, for example, a helicase or an IRES as a target. A specific example of an inhibitor of another target in the HCV life cycle is ISIS-14803 (ISIS Pharmaceuticals).
  • HIV inhibitor means an agent that inhibits the production and / or replication of HIV. This includes agents that interfere with host or HTV mechanisms necessary for the formation and / or replication of HTV.
  • HTV inhibitors include e.g. nucleoside inhibitors, non-nucleoside inhibitors, protease inhibitors, fusion inhibitors and integrase inhibitors.
  • HAV inhibitor means an agent that inhibits the formation and / or replication of HAV. This includes agents that interfere with mechanisms of the host or HAV necessary for the formation and / or replication of HAV.
  • HAV inhibitors include Hepatitis A vaccines, for example, [for example, Havrix ® (GSK), VAQTA ® (Merck), Avaxim ® (Aventis Pasteur)] a.
  • HBV inhibitor means an agent that inhibits the formation and / or replication of HBV. This includes agents that interfere with host or HBV mechanisms necessary for the formation and / or replication of HBV.
  • HBV inhibitors include agents that inhibit HBV DNA polymerase, or hepatitis B vaccines.
  • HBV inhibitors include Lamivudine (Epivir-HBV ®), Adefovir Dipivoxil, Entecavir, FTC (Coviracil ®), DAPD (DXG), L-FMAU (Clevudine ®), AM365 (Amrad), Ldt (Telbivudine), monoval-LdC (valtorcitabine), BAY 41-4109 (Bayer), ACH-126.443 (L-Fd4C) (Achillion), MCC 4 78 (Eli Lilly), Racivir (RCV), fluoro-L and D nucleosides, Robustaflavone , ICN2001-3 (ICN), Bam 205 (Novelos), XTL-001 (XTL), imino-sugar (Nony-DNJ) (Synergy), HepBzyme, and immunomodulatory products such as Interferon alpha-2b, HE2000 (Hollis-Eden ), The
  • class I interferons means an interferon selected from a group of interferons which all bind to the type I receptor. This includes natural and synthetically produced class I interferons. Examples of class I interferons are alpha, beta and omega interferons, tau interferons, consensus interferons and asialo interferons.
  • class Ü interferons means an interferon selected from a group of interferons which all bind to the type II receptor. Examples of class H interferons are gamma interferons.
  • treatment means the administration of a drug according to the present invention to alleviate or eliminate the disease symptoms of hepatitis C and / or to reduce the amount of virus.
  • prophylaxis means the administration of a drug according to the present invention after infection with HCV, but before the onset of disease symptoms and / or prior to the detection of HCV in the blood.
  • the compounds according to the invention can act systemically and / or locally.
  • they may be applied in a suitable manner, e.g. oral, parenteral, pulmonary, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctivae otic or as an implant or stent.
  • the compounds according to the invention can be administered in suitable administration forms.
  • Parenteral administration can be accomplished by bypassing a resorption step (e.g., intravenously, intraarterially, intracardially, intraspinal, or intralumbar) or by resorting to absorption (e.g., intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, percutaneously, or intraperitoneally).
  • a resorption step e.g., intravenously, intraarterially, intracardially, intraspinal, or intralumbar
  • absorption e.g., intramuscularly, subcutaneously, intracutaneously, percutaneously, or intraperitoneally.
  • parenteral administration are suitable as application forms u.a. Injection and infusion preparations in the form of solutions, suspensions, emulsions, lyophilisates or sterile powders.
  • inhalant medicines including powder inhalers, nebulizers
  • nasal drops solutions, sprays
  • lingual, sublingual or buccal tablets to be applied, films / wafers or capsules, suppositories, ear or eye preparations
  • Vaginal capsules aqueous suspensions (lotions, shake mixtures), lipophilic suspensions, ointments, creams, transdermal therapeutic systems, milk, pastes, foams, powdered powders, implants or stents.
  • the compounds according to the invention can be converted into the stated administration forms. This can be done in a conventional manner by mixing with inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients.
  • excipients for example microcrystalline cellulose, lactose, mannitol
  • solvents for example liquid polyethylene glycols
  • emulsifiers and dispersants or wetting agents for example sodium dodecyl sulfate, polyoxysorbitanoleate
  • binders for example polyvinylpyrrolidone
  • synthetic and natural polymers for example albumin
  • Stabilizers eg, antioxidants such as ascorbic acid
  • dyes eg, inorganic pigments such as iron oxides
  • flavor and / or odoriferous include, among others.
  • Excipients for example microcrystalline cellulose, lactose, mannitol
  • solvents for example liquid polyethylene glycols
  • emulsifiers and dispersants or wetting agents for example sodium dodecy
  • Another object of the present invention are pharmaceutical compositions containing at least one erf ⁇ ndungswashe connection, usually together with one or more inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients, and their use for the purposes mentioned above.
  • the dosage is about 0.01 to 50 mg / kg, preferably 0.1 to 10 mg / kg of body weight.
  • Method 1 Instrument: HP 1100 with DAD detection; Column: Kromasil RP-18, 60 mm ⁇ 2 mm, 3.5 ⁇ m; Eluent A: 5 ml HClO 4 /! Water, eluent B: acetonitrile; Gradient: 0 min 2% B, 0.5 min 2% B, 4.5 min 90% B, 6.5 min 90% B; Flow: 0.75 ml / min; Oven: 3O 0 C; UV detection: 210 nm.
  • Method 2 HPLC, preparative separation: Column: CromSil Cl 8, 250 mm x 30 mm; Eluent A: water, eluent B: acetonitrile; Gradient: 3 min 10% B -> 31 min 90% B -> 34 min 90% B -> 34.01 min 10% B; Running time: 38 min; Flow: 50 ml / min; UV detection: 210 nm.
  • Method 3 Instrument: HP 1100 with DAD detection; Column: Kromasil RP-18, 60 mm ⁇ 2 mm, 3.5 ⁇ m; Eluent A: 5 ml HCIO 4 / l water, eluent B: acetonitrile; Gradient: 0 min 2% B, 0.5 min 2% B, 4.5 min 90% B, 9 min 90% B; Flow: 0.75 ml / min; Oven: 3O 0 C; UV detection: 210 nm.
  • the aqueous phase is extracted with ethyl acetate, the phases are separated, the organic phase is dried with sodium sulfate, filtered and the solvent is removed under gentle heating on a rotary evaporator.
  • the residue is purified by flash chromatography (gradient 100% dichloromethane to 50:50 dichloromethane: ethyl acetate) to give 4.60 g (57% of theory) of product.
  • Hepatitis C can not be replicated reproducibly with high titers in cell culture until now. Therefore, the substance activity is detected in the so-called replicon system.
  • These are genome parts of HCV or entire genomes of HCV, which are transported to cell lines (here HuH-7 cells) of human origin. By inserting a selection marker, it is possible to obtain stable cell lines which, under selection pressure, increase genomic or subgenomic RNA of HCV [Lohmann et al, Science 285, 110-113 (1999); Blight et al., Science 290, 1972-1974 (2000)].
  • the HuH5-2 cells used here harbor a selectable, luciferase-bearing, cell culture-adapted replicon as described in EP 1 043 399.
  • the cells are cultured in Dulbecco's Modified Earle's Medium (DMEM) with 10% fetal calf serum (FCS), 1% Pen / Strep, 1% NEAA, 1% L-glutamine and 250 ⁇ g / ml Geneticin (G418).
  • DMEM Dulbecco's Modified Earle's Medium
  • FCS fetal calf serum
  • Pen / Strep fetal calf serum
  • NEAA fetal calf serum
  • L-glutamine 250 ⁇ g / ml Geneticin
  • test compounds are prepared as a 50 mM stock solution in DMSO. To determine the EC 50 values, the substances are then diluted serially in DMEM in two stages. The dilutions are transferred as duplets to the cell culture plates. This is followed by the addition of the trypsinized, resuspended in medium cells. The final concentrations of the test substances in the cell culture cavities is, for example, 300 ⁇ M to 0.0001 ⁇ M. Interferon alpha serves as a reference in concentrations from 60 IU / ml to 1 IU / ml. Antimycin-alpha serves as a cytotoxicity control in concentrations from 2 ⁇ M to 0.03 ⁇ M. Untreated cells are for reference. The plates are then incubated at 37 ° C under 5% CO 2 for 4-5 days. This is followed by the different measurements or the quantification of the HCV replicon RNA.
  • the above test is prepared in a transparent cell culture plate. The qualitative evaluation is done visually under the microscope.
  • Alamar Blue is a water-soluble redox indicator, which is reduced depending on the metabolic activity of the cells to be examined.
  • the Alamar Blue test is used as a quantitative cytotoxicity assay.
  • the cells are seeded with the corresponding test substances (see above) in white 384-well cell culture plates and incubated at 37 ° C. under 5% CO 2 for 4 days. 4 to 6 hours before the actual measurement, add 5 ⁇ l Alamar Blue per well. Subsequently, the fluorescence is measured at an emission wavelength of 544 nm and at an extinction wavelength of 590 nm. If, following this test, the chemiluminescence measurement (see below) is carried out on the same plate, the dye solution is aspirated from the cells and then washed once with PBS. The PBS is also aspirated from the cells again.
  • a reporter gene is inserted into the HCV replicon HuH5-2, here the gene for the enzyme luciferase of Photinus pyralis.
  • the luciferase reagent (20 mM Tris / HCl, 20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO 4 , 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 0.27 mM Coenzyme A, 0.47 mM
  • Luciferin, 0.53 mM ATP, pH 7.8) to the cells, the chemiluminescence measurement is carried out in one Luminometer. Usually, the photons are measured in a period of 10 seconds to 60 seconds.
  • CC 50 substance concentration in ⁇ M at which the Alamar Blue fluorescence decreases by 50% compared to the untreated control;
  • EC 50 substance concentration at which luciferase activity decreases by 50% compared to untreated replicon control
  • SI (selectivity index) CC 5 o / EC S o.
  • Cells which amplify subgenomic HCV RNA are propagated as described above in 96 well or 24 well cell culture plates in DMEM / 10% FCS without addition of geniticin. If the cells are in the logarithmic growth phase, the substance is mixed in a suitable dilution in the medium. The final concentrations are, for example, 100 ⁇ M and 30 ⁇ M and dilutions thereof. After 4 to 5 days of incubation, the medium is discarded. The cells are detached from the cell culture plate using trypsin and taken up in 100 ⁇ l of phosphate buffer (PBS).
  • PBS phosphate buffer
  • test is carried out in 24 well cell culture plates, the cells are divided, one part is examined for their content of HCV RNA by means of quantitative PCR, the other part of the cells by means of the detection of luciferase activity examined (Bright Glow Kit, Fa. Promega, implementation according to the manufacturer). If the test is carried out in 96 well cell culture plates, samples are taken in parallel. As described above, one duplicate is assayed for luciferase activity, RNA is recovered from the other duplicate and assayed for HCV RNA content by quantitative PCR.
  • Received values are evaluated by curve analysis (variable curve sigmoidal dose-response curves, GraphPad Prism version 3.02 for Windows, GraphPad Software Inc.) and the effective concentration at which a 50% inhibition is achieved (EC 50 ) is determined.
  • curve analysis variable curve sigmoidal dose-response curves, GraphPad Prism version 3.02 for Windows, GraphPad Software Inc.
  • EC 50 effective concentration at which a 50% inhibition is achieved
  • untreated cells are used.
  • whole cell RNA is isolated according to the manufacturer's instructions using the Rneasy Mini Kit (Qiagen, order No. 74104). Elution is carried out in 30-50 ⁇ l of Rnase-free water. The RNA is stored at -8O 0 C. Using TaqMan ® assays (Fa. Applied Biosystems) determining the amount of HCV RNA contained.
  • the primer and gene probes used bind to the conserved 5 'untranslated region of the virus genome (primer for coding DNA strand: aatgcctggagatttgggc; primer in the opposite direction: tttcgcgacccaacactactc; Gene probe: 6-carboxyfluorescine-tgcccccgcgagactgcatagc-N, N, N ', N'-tetramethyl-6-carboxyrhodamine).
  • the expression of a cell-specific gene is determined (TaqMan Ribosomal RNA Control Reagents, Applied Biosystems P / N 4308329).
  • the kit is Platinum ® Quantitative RT-PCR thermal Script TM one step system from the company. Invitrogen (part no. 12267-019) is used. The reaction takes place in a final volume of 25 ⁇ M with 1 ⁇ l sample volume. The reaction conditions are: 30 min incubation at 5O 0 C, followed by 5 min incubation at 95 0 C. Following this step, the actual amplification phase followed with 40 repetitions of the following steps: 15 sec incubation at 95 0 C followed by 1 min of incubation at 60 0 C The measurement and evaluation took place in an Applied Biosystems Abi Prism 7700 Sequence Detection device.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the plasmid pET21 ⁇ S5Bt thus constructed expresses an NS5B protein which comprises amino acids 2420 to 2989 of the precursor HCV. Polyprotein and a poly-histidine fusion at the carboxyl terminus carries.
  • the expression and purification of such a recombinant NS5B variant in the heterologous host Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen) has already been described several times (Ferrari E, Wright-Minogue J, Fang JWS, Baroudy BM, Lau JYN and Hong Z, J. Virol Tomei L, Vitale RL, Incitti I, Serafini S, Altamura S, Vitelli A and DeFrancesco R, J. Gen.
  • the cell sediments that are collected by centrifugation (20 min; 5,000 xg; 4 ° C), to an OD (600 nm) 50 to 500 in cell disruption buffer (50 mM NaH 2 PO 4 ; 5 mM Tris-HCl (tris- (hydroxymethyl) -aminomethane) pH 8.0; 25 mM imidazole; 10 mM MgCl 2 ; 500 mM NaCl; 0.1% (v / v) ⁇ -mercaptoethanol; 1mM EDTA (ethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetate); 10% (v / v) glycerol; 1 tablet / 50 ml Complete (Roche); 10 ⁇ g / ml DNase I) and then disrupted with ultrasound (10 x 30 s, 200 watts, O 0 C).
  • cell disruption buffer 50 mM NaH 2 PO 4 ; 5 mM Tris-HCl (tris- (hydroxymethyl
  • a 10 column volume cell disruption buffer wash followed by 20 column volumes of wash buffer (50 mM NaH 2 PO 4 ; 5 mM Tris-HCl pH 8.0; 25 mM imidazole; 10 mM MgCl 2 ; 500 mM NaCl; 0.1 % (v / v) ⁇ -mercaptoethanol; 1mM EDTA; 10% (v / v) glycerol).
  • wash buffer 50 mM NaH 2 PO 4 ; 5 mM Tris-HCl pH 8.0; 25 mM imidazole; 10 mM MgCl 2 ; 500 mM NaCl; 0.1 % (v / v) ⁇ -mercaptoethanol; 1mM EDTA; 10% (v / v) glycerol).
  • wash buffer 50 mM NaH 2 PO 4 ; 5 mM Tris-HCl pH 8.0; 25 mM imidazole; 10 mM MgCl 2 ;
  • NS5B-containing fractions are pooled and purified using a PDIO column (Amersham) according to the manufacturer in storage buffer (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.3 M NaCl, 10 mM MgCl 2 , 5 mM DTT (dithiothreitol ); 1 mM EDTA; 0.1% n-dodecyl-maltosides; 30% glycerol), buffer exchanged and stored at -80 0 C.
  • the mock control procedure is analogous to a protein extract obtained from Escherichia coli BL21 (DE3) cells transformed with the empty vector pET21b.
  • RNA polymerase catalyzed primer elongation reaction is performed as previously described (Ferrari et al., 1999, Tomei et al., 2000).
  • a single-stranded, homopolymeric RNA template poly (rA) (Amersham)
  • oligo (rU) i 2 Eurogentec
  • the substrate UTP is converted to a double-stranded RNA duplex.
  • radioactively labeled UTP eg [ 32 P] -UTP can the incorporation of the substrate can be quantified.
  • tritium-labeled UTP [ 3 H] -UTP ([5 5 6- 3 H] uridine-5'-triphosphate), Perkin Elmer
  • [ 32 P] -UTP is used instead of [ 32 P] -UTP, as already described by Uchiyama et al. (Uchiyama Y, Huang Y, Kanamori H, Uchida M, Doi T, Takamizawa A, Hamakubo T and Kodama T, Hepatol. Res. 23 (2002) 90-97).
  • a Christsansatzt contains 6 ug / ml poly (rA), 90 nM oligo (rU) i 2 , 5 uM UTP and 16 ⁇ Ci / ml [ 3 H] -UTP and in 90 ul reaction buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.5 25 mM KCl; 5 mM MgCl 2 ; 1 mM EDTA; 1 mM DTT; 0.01% (w / v) BSA; 0.5 (v / v) DMSO; 100 U / ml RNasin (Promega)).
  • the substance to be tested in the desired concentration is added to the reaction mixture before the addition of template, primer and substrate.
  • the reaction is started by the addition of 12.5 nM NS5B protein and incubated at 3O 0 C.
  • the reaction is stopped with 1 volume of ice-cold stop buffer 1 (0.2 M EDTA; 100 ⁇ g / ml calf thymus DNA) and dissolved in 4 volumes of stop solution 2 (10% (w / v) tri-chloro-acetic acid; Precipitated 0.5% (w / v) sodium pyrophosphate for 30 min on ice
  • stop solution 2 10% (w / v) tri-chloro-acetic acid; Precipitated 0.5% (w / v) sodium pyrophosphate for 30 min on ice
  • the precipitate is transferred to GF / C filters in 96 well microtiter plate format (Millipore) and washed 3 times with wash solution 1 (1% (w / w)).
  • IC50 values are determined using the GraphPad Prism 3.02 analysis software (GraphPad Software, INC) using the "variable slope sigmoidal dose-response curve.”
  • the reference is the relative incorporation of [ 3 H] -UTP without the addition of a test substance used.
  • the compounds according to the invention can be converted into pharmaceutical preparations as follows:
  • Composition 100 mg of the compound of Example 1, 50 mg of lactose (monohydrate), 50 mg of corn starch (native), 10 mg of polyvinylpyrrolidone (PVP 25) (BASF, Ludwigshafen, Germany) and 2 mg of magnesium stearate.
  • Preparation The mixture of active ingredient, lactose and starch is granulated with a 5% solution (m / m) of the PVP in water. The granules, after drying with the magnesium stearate for 5 min. mixed. This mixture is compressed with a conventional tablet press (for the tablet format see above). As a guideline for the compression, a pressing force of 15 kN is used.
  • Composition 1000 mg of the compound of Example 1, 1000 mg of ethanol (96%), 400 mg of rhodigel (xanthan gum from FMC, Pennsylvania, USA) and 99 g of water.
  • a single dose of 100 mg of the compound of the invention corresponds to 10 ml of oral suspension.
  • Composition 500 mg of the compound according to the invention, 2.5 g of polysorbate and 97 g of polyethylene glycol 400. A single dose of 100 mg of the compound according to the invention corresponds to 20 g of oral solution.
  • the compound of the invention is dissolved in a concentration below saturation solubility in a physiologically acceptable solvent (e.g., isotonic saline, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%).
  • a physiologically acceptable solvent e.g., isotonic saline, glucose solution 5% and / or PEG 400 solution 30%.
  • the solution is sterile filtered and filled into sterile and pyrogen-free injection containers.

Abstract

Die Erfindung betrifft Alkinyl-substituierte Thiophene und Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere zur Verwendung als antivirale Mittel, insbesondere gegen Hepatitis C Viren.

Description

AlkinvI-substituierte Thiophene
Die Erfindung betrifft Alkinyl-substituierte Thiophene und Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Verwendung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, insbesondere zur Verwendung als antivirale Mittel, insbesondere gegen Hepatitis C Viren.
Infektionen mit dem Hepatitis C-Virus (HCV) sind weltweit die Hauptursache für non-A/non-B Hepatitis-Erkrankungen. Nach Schätzungen sind etwa 170 Millionen Menschen weltweit mit dem Virus infiziert. Bei einem hohen Prozentsatz der Virusträger führt dies zu einer chronischen Hepatitis C-Erkrankung. Für diese Gruppe an Infizierten besteht ein erhöhtes Risiko, in der Folge an lebensbedrohlichen Lebererkrankungen wie Leberzirrhose, hepatocellulärem Carcinom oder terminalem Leberversagen zu versterben. Hepatitis C-Infektion ist eine der häufigsten Ursachen für eine Lebertransplantation. Noch nicht völlig geklärt sind die Mechanismen, wie es zum Persistieren der Virusinfektion und zur hohen Rate an daraus resultierenden ernsten Lebererkrankungen kommt. Es ist unbekannt, wie das Virus mit dem menschlichen Immunsystem inter- agiert und die Immunabwehr überwindet. Die Rolle der zellulären wie der humoralen Immunantworten beim Schutz gegen HCV-Infektion ist noch nicht verstanden. Es wurde berichtet, dass Immunglobuline zum prophylaktischen Schutz gegen transfusionsbedingte virale Hepatitis eingesetzt wurden; allerdings wird der Einsatz von Immunglobulinen für diesen Zweck gegenwärtig vom Center for Disease Control nicht empfohlen. Das Fehlen einer effizienten Immunantwort steht bislang der Etablierung eines Impfstoffes im Wege, ebenso wie einer Prophylaxe, die nach Kontakt mit dem Virus eingesetzt werden könnte. In der näheren Zukunft werden daher hauptsächlich antivirale Prinzipien eine Rolle in der Bekämpfung des Hepatitis C-Virus spielen.
In verschiedenen klinischen Studien wurden Substanzen mit dem Ziel untersucht, HCV-Infek- tionen in Patienten mit chronischer Hepatitis wirkungsvoll zu therapieren. In diesen Studien kam Interferon-alpha (IFN-α), in Alleingabe oder in Kombination mit anderen antiviralen Wirkstoffen, zum Einsatz. Diese Untersuchungen haben gezeigt, dass eine erhebliche Anzahl an Patienten auf diese Therapie nicht anspricht, und dass ein großer Teil derjenigen, bei denen Interferon-alpha eine Wirkung zeigt, nach Absetzen der Substanz Rückfälle erleiden.
Bis vor kurzem war die Behandlung mit Interferon (IFN) die einzige Therapieform mit klinisch nachgewiesener Wirksamkeit bei chronischer Hepatitis C-Erkrankung. Der Anteil der Patienten mit nachhaltigem Therapieerfolg ist jedoch gering. Die Interferon-Therapie ist durchweg mit ernsten Nebenwirkungen (z.B. Leukopenie, Thrombopenie, Retinopathie, Thyroiditis, akute Pancreatitis, Depression) verbunden, die die Lebensqualität der Patienten erheblich einschränken. Vor kurzer Zeit wurde die Kombination von Interferon mit Ribavirin zugelassen. Diese Kombina- tionstherapie führt zu einer verbesserten Wirksamkeit, verbessert aber nicht das mit IFN assoziierte Nebenwirkungsprofil, zudem sind auch mit Ribavirin Nebenwirkungen (z. B. hämolytische Anämie) assoziiert. Durch den Einsatz von pegylierten Formen des IFN wie PEG-Intron® oder Pegasys® können diese unerwünschten Nebeneffekte zumindest teilweise abgemildert werden. Un- geachtet dessen besteht ein großer Bedarf an oral anwendbaren antiviralen Wirkstoffen, mit denen die Einschränkungen der bislang etablierten Therapieformen überwunden werden können (S.-L. Tan et al., Nature Rev. DrugDiscov. 2002, 1, 867-881).
Hepatitis C-Virus (HCV) ist der einzige Vertreter des Genus Hepacivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae. Man unterscheidet mindestens 6 Genotypen und eine Vielzahl von Subtypen. Das Virus ist von einer Hülle umgeben und besitzt als Genom einen Positiv-Einzelstrang an viraler RNA. Die Länge des viralen RNA-Genoms beträgt ca. 9500 Nucleotide. Die Vermehrung des viralen Genoms und die Translation in Protein erfolgt mit Hilfe von RNA-Strukturen, welche am Anfang und am Ende des Genoms liegen (5' nicht-translatierte Region, 3' nicht-translatierte Region). Das Genom hat einen einzigen Leserahmen (open reading frarae, ORF), der für ein PoIy- protein (ca. 3000 Aminosäuren) codiert. Hieraus werden in einer infizierten Zelle durch virale oder Wirtszell-Enzyme Struktur- und Nichtstruktur (NS)-Proteine gespalten. HCV kodiert für ein Kapsidprotein (c) und zwei Hüllproteine (El und E2). Ein kleines Protein (p7) könnte ein sogenanntes Viroporin sein, welches für die Infektiosität des reifen Viruspartikels essentiell ist. Zu den reifen NS-Proteinen zählen die Proteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B. Für ihre Ab- Spaltung aus dem Polyprotein sind zwei virale Proteasen verantwortlich. Das als NS2/3-Protease bezeichnete Enzym spaltet in bis jetzt nur gering charakterisierter Weise an der NS2-NS3 -Schnittstelle. Die zweite Protease (NS3-Protease) ist eine Serinprotease, die im N-terminalen Teil des NS3-Proteins enthalten ist. Sie katalysiert alle abwärts von NS3 vorhandenen Spaltungen des Polyproteins, d.h. die NS3-NS4A-Proteolyse ebenso wie die Spaltungen an den Stellen NS4A-NS4B, NS4B-NS5A, NS5A-NS5B.
Das NS4A-Protein besitzt wahrscheinlich vielfältige Funktion, so zum Beispiel als Kofaktor der NS3 -Protease und möglicherweise bei der Membranlokalisierung von NS3 und anderen NS- Proteinen. Die Komplexbildung zwischen NS3 und NS4A ist vermutlich eine Grundvoraussetzung für die Proteinprozessierung und erhöht die proteolytischen Aktivitäten bezogen auf alle Schnitt- stellen. Das NS3-Protein besitzt außerdem Aktivität als NTPase und Helikase. NS5B ist eine RNA- abhängige RNA-Polymerase, die entscheidend an der HCV-Replikation beteiligt ist. Über die Funktionen der NS4B- und NS5A-Proteine ist sehr wenig bekannt. Für NS5A wird eine Beteiligung an der klinischen Resistenz gegenüber Interferon diskutiert. Dem Hepatitis C nah verwandte Viren wie beispielsweise das GBV B-Virus, welches Neuweltaffen infiziert, oder das BVDV (Bovines Virale Diarrhoe Virus) werden häufig als Modellviren verwendet, um bestimmte Aspekte des Viruslebenszyklus zu untersuchen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, neue Verbindungen mit gleicher oder ver- besserter antiviraler Wirkung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von viralen Infektionskrankheiten bei Menschen und Tieren, insbesondere von Hepatitis C und deren Folgen, zur Verfügung zu stellen.
Strukturell ähnliche Verbindungen sind beispielsweise in WO02/100851, WO04/052879 und WO04/052885 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Flavivirus Infektionen, wie z.B. Hepatitis C, in WO 00/027823 als Gastrin und/oder Cholecystokinin Rezeptoren zur Behandlung von Krebs und Erkrankungen des Zentralen Nervensystems, in WO 92/010094 in Kombination mit Aryloxyessigsäure Derivaten als Herbizide und in EP-A 423 523 als Herbizide beschrieben.
Laval Chan, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 793-796 und Laval Chan, et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 797-800 beschreiben substituierte 5-Phenyl-thiophen-2-carbonsäuren als potente HCV-Inhibitoren.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen substituierten Thiophene antiviral hochwirksam sind.
Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel
Figure imgf000004_0001
in welcher
R1 für (CrC6)-Alkyl, (C3-C6)-Cycloalkyl oder Phenyl steht,
wobei Alkyl, Cycloalkyl und Phenyl substituiert sein können mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, (C]-C6)-Alkylamino, 5- bis 7-gliedrigem Heterocyclyl und Phenylsulfonylamino, worin Phenylsulfonylamino seinerseits substituiert sein kann mit 1 bis 3 Sub- stituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Fluor, Chlor, Hydroxy, Amino, Trifluormethyl, Tn- fluormethoxy, Methyl und Methoxy,
R2 für verzweigtes (C3-C5)-Alkyl, Cyclobutyl, Cyclopentyi, Cyclohexyl, Tetrahydrofuranyl, Pyrrolidinyl, Tetrahydro-2H-pyranyl, Piperidinyl, Tetrahydro-2H-thiopyranyl, Oxidotetrahydro-2H-thiopyranyl oder l,l-Dioxidotetrahydro-2H-thiopyranyl steht,
wobei Alkyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Amino, Methoxy, (CrC6)-Alkylamino, Methylthio, Methylsulfonyl, Methylsulfoxyl oder
Methoxycarbonyl,
R3 für Cyclohexyl steht,
wobei Cyclohexyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy und (C1-Ca)-AIlCyI,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, nachfolgend als Ausführangsbeispiel(e) genannten Verbindungen und deren Salze, Solvate und Solvate der Salze, soweit es sich bei den von Formel (I) umfassten, nachfolgend genannten Verbindungen nicht bereits um Salze, Solvate und Solvate der Salze handelt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung betrifft deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren und ihre jeweiligen Mischungen. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise isolieren.
Sofern die erfindungsgemäßen Verbindungen in tautomeren Formen vorkommen können, umfasst die vorliegende Erfindung sämtliche tautomere Formen.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung physiologisch unbedenkliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für pharma- zeutische Anwendungen selbst nicht geeignet sind aber beispielsweise für die Isolierung oder Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können. Physiologisch unbedenkliche Salze der erfmdungsgemäßen Verbindungen umfassen Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Methansulfonsäure, Ethan- sulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure, Trifluor- essigsaure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Benzoesäure.
Physiologisch unbedenkliche Salze der erfmdungsgemäßen Verbindungen umfassen auch Salze üblicher Basen, wie beispielhaft und vorzugsweise Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und Magnesiumsalze) und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C- Atomen, wie beispielhaft und vorzugsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Dicyclo-hexylamin, Dimethylaminoethanol, Prokain, Dibenzylamin, N-Methyl- morpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N-Methylpiperidin.
Als Solvate werden im Rahmen der Erfindung solche Formen der erfindungsgemäßen Verbin- düngen bezeichnet, welche in festem oder flüssigem Zustand durch Koordination mit Lösungsmittelmolekülen einen Komplex bilden. Hydrate sind eine spezielle Form der Solvate, bei denen die Koordination mit Wasser erfolgt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Substituenten, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung:
Alkyl per se und "Alk" und "Alkyl" in Alkylamino stehen für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6 („Ci-Cβ-Alkyl"), vorzugsweise 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert.- Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.
Alkylamino steht für einen Alkylaminorest mit einem oder zwei (unabhängig voneinander ge- wählten) Alkylsubstituenten, beispielhaft und vorzugsweise für Methylamino, Ethylamino, n-
Propylamino, Isopropylamino, tert.-Butylamino, n-Pentylamino, n-Hexylamino, N,N-Dimethyl- amino, N,N-Diethylamino, N-Ethyl-N-methylamino, N-Methyl-N-n-propylamino, N-Isopropyl-N- n-propylamino, N-t-Butyl-N-methylamino, N-Ethyl-N-n-penτylamino und N-n-Hexyl-N-methyl- amino. Ci-C3-Alkylamino steht beispielsweise für einen Monoalkylaminorest mit 1 bis 3 Kohlen- Stoffatomen oder für einen Dialkylaminorest mit jeweils 1 bis 3 Kohlenstoffatomen pro Alkyl- substituent. Cycloalkyl steht für eine Cycloalkylgruppe mit in der Regel 3 bis 7, bevorzugt 5 bis 6 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl.
5- bis 7-gliedriges Heterocyclyl steht im Rahmen der Erfindung für einen monocyclischen, ge- sättigten oder partiell ungesättigten Heterocyclus mit bis zu drei Heteroatomen aus der Reihe N, O und/oder S, der über ein Ringkohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom des Heterocyclus verknüpft ist und der gegebenenfalls Oxo substituiert ist. Beispielhaft und vorzugsweise seien genannt:
Tetrahydrofuryl, Dihydrofuryl, Imidazolidinyl, Thiolanyl, Dioxolanyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolinyl,
Tetrahydro-2H-pyranyl, Dihydropyranyl, Piperidinyl, Piperazinyl, Morpholinyl, Thiomorpholinyl, Tetrahydro-2H-thiopyranyl, Oxidotetrahydro-2H-thiopyranyl, l,l-Dioxidotetrahydro-2H- thiopyranyl, Tetrahydrothienyl und 1,4-Diazepanyl.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der Formel (I), in welcher
R1 für Isopropyl, tert.-Butyl, Cyclopropyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl steht,
wobei Isopropyl, Cyclopropyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl substituiert sein können mit einem Substituenten, wobei der Substituent ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy und Amino,
R2 für verzweigtes (C3-C5)-Alkyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Tetrahydro-2H- pyranyl, Piperidinyl, Tetrahydro-2H-thiopyranyl, Oxidotetrahydro-2H-thiopyranyl oder 1 , 1 -Dioxidotetrahydro-2H-thiopyranyl steht,
wobei Alkyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Methoxy, Dimethylamino, Methylthio, Methylsulfonyl, Methylsulfoxyl oder Methoxycarbonyl,
R3 für Cyclohexyl steht,
wobei Cyclohexyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy und
Methyl,
und ihre Salze, ihre Solvate und die Solvate ihrer Salze.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für Isopropyl, tert.-Butyl, Cyclopropyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl steht. Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I)3 in welcher R1 für (Ca-GO-Alkyl steht, wobei Alkyl substituiert sein kann mit einem Substituenten, wobei der Substituent ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino oder (C1- Cfi)-Alkylamino.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R1 für 1 -Hydroxy- 1-methyl-eth-l-yl oder 1-Hydroxycyclopent-l-yl steht.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R2 für Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl steht.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R2 für ein über ein sekundäres Kohlenstoffatom an den Stickstoff gebundenes (C3-C5)- Alkyl steht, wobei Alkyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Methoxy, Dimethylamino, Methylthio, Methylsulfonyl, Methylsulfoxyl oder Methoxycarbonyl.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R2 für Isopropyl steht.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R2 für Tetrahydrofuranyl, Pyrrolidinyl, Tetrahydro-2H-pyranyl, Piperidinyl, Tetrahydro- 2H-thiopyranyl, Oxidotetrahydro-2H-thiopyranyl oder l,l-Dioxidotetrahydro-2H-thiopyranyl steht.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R3 für Cyclohexyl steht, wobei Cyclohexyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy und Methyl.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R3 für trans-4-Methylcyclohexyl steht.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R3 für trans-4-Methylcyclohexyl steht, welches in 2-Position mit einer Hydroxy-Gruppe substituiert ist.
Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind auch Verbindungen der Formel (I), in welcher R3 für trans-4-Methylcyclohexyl steht, welches in 2-Position mit einer Hydroxy-Gruppe substituiert ist und diese Hydroxy-Gruppe und die Carbonyl-Gruppe in cis-Position zueinander stehen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel (I), wobei Verbindungen der Formel
Figure imgf000009_0001
in welcher
R1, R2 und R3 die oben angegebene Bedeutung haben, und
R4 für Alkyl, bevorzugt Methyl, Ethyl oder tert-Butyl, steht,
mit Basen oder Säuren umgesetzt werden.
Im Falle, das R4 Methyl oder Ethyl ist, erfolgt die Umsetzung im Allgemeinen mit einer Base in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel bei Normaldruck.
Basen sind beispielsweise Alkalihydroxide wie Natrium-, Lithium- oder Kaliumhydroxid, oder Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, gegebenenfalls in wässriger Lösung, bevorzugt ist Lithiumhydroxid in Wasser.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie 1,2-Dimethoxyethan, Dioxan, Tetrahydrofuran, Glykoldimethylether oder Diethylenglykoldimethylether, oder Alkohole wie Methanol, Ethanol, n- Propanol, iso-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol, oder Gemischen von Lösungsmitteln, bevorzugt ist Dioxan oder Tetrahydrofuran.
Im Falle, das R4 tert-Butyl ist, erfolgt die Umsetzung im Allgemeinen mit einer Säure in inerten Lösungsmitteln, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss der Lösungsmittel bei Normaldruck.
Bevorzugt ist die Umsetzung mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid, mit Chlorwasserstoff in Dioxan oder mit Salzsäure in Dioxan. Sollte der Reste R3 funktionelle Gruppen wie beispielsweise Hydroxy oder Amino enthalten, so sind diese Gruppen mit geeigneten, literaturbekannten Schutzgruppen wie beispielsweise Acetyl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl oder tert-Butyloxycarbonyl versehen, die nach der Reaktion zu Verbindungen der Formel (I) abgespalten werden (Lit: PJ. Kocienski: „Protecting Groups", Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 1994, ISBN 3-13-135601-4).
Die Verbindungen der Formel (II) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
Figure imgf000010_0001
in welcher
R2, R3 und R4 die oben angegebene Bedeutung haben,
mit Verbindungen der Formel
Figure imgf000010_0002
in welcher
R1 die oben angegebene Bedeutung hat,
umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen unter Sonogashira-Reaktionsbedingungen unter Argon in inerten und entgasten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Katalysators, gegebenenfalls in Gegenwart eines Zusatzreagenzes, in Anwesenheit einer Base und Triphenylphosphin, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss des Lösungsmittels bei Normaldruck (R.R. Tykwinski, Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 1566-1568, K. Sonogashira in Handbook of organopalladium chemistry for organic synthesis (Ed. E.-I. Negishi), 1133-1178 Wiley-Interscience, New-York (2002)). Katalysatoren sind beispielsweise für Sonogashira-Reaktionsbedingungen übliche Palladium- Katalysatoren, bevorzugt sind Katalysatoren wie z.B. Tri(dibenzylidenaceton)dipalladium, Dichlorbis(triphenylphosphin)-palladium, Tetrakistriphenylphosphinpalladium(O), Palladium(II)- acetat, l,r-Bis[(diphenylphosphino)-ferrocen]palladium-II-chlorid (l:l)-Komplex mit Dichlormethan.
Zusatzreagenzien sind beispielsweise Kupfer-(I)-iodid und Triphenylphosphin.
Basen sind beispielsweise Aminbasen wie Triethylamin.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Ether wie Dioxan, Tetrahydrofuran oder 1,2- Dimethoxyethan, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol oder Toluol, oder andere Lösemittel wie Nitrobenzol, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid oder N-Methylpyrrolidon, bevorzugt sind Lösungsmittel wie z.B. Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Dimethylsulfoxid oder 1,2-Dimethoxyethan.
Die Verbindungen der Formel (IV) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Edukten synthetisieren.
Die Verbindungen der Formel (III) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
Figure imgf000011_0001
in welcher
R2, R3 und R4 die oben angegebene Bedeutung haben,
mit N-Bromsuccinimid in Halogenkohlenwaserstoffen wie Dichlormethan, Chloroform oder Tetrachlorkohlenstoff sowie deren Gemischen umgesetzt werden, bevorzugt ist eine Mischung aus Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff.
Die Verbindungen der Formel (V) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
Figure imgf000012_0001
in welcher
R2 und R4 die oben angegebene Bedeutung haben,
mit Verbindungen der Formel
Figure imgf000012_0002
in welcher
R3 die oben angegebene Bedeutung hat, und
X1 für Halogen, bevorzugt Chlor oder Brom, steht,
umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt in inerten Lösungsmitteln oder in situ mit dem Acylierungsreagenz, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, bevorzugt in einem Temperaturbereich von 00C bis 1200C bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid, Tri- chlormethan, Tetrachlormethan, Trichlorethan, Tetrachlorethan, 1,2-Dichlorethan oder Trichlor- ethylen, Ether wie Diethylether, Methyl-tert.-butylether, Dioxan, Tetrahydrofuran, 1,2-Dimethoxy- ethan, Glykoldimethylether oder Diethylenglykoldimethylether, Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Xylol, Toluol, Hexan, Cyclohexan oder Erdölfraktionen, oder Carbonsäureamide wie N,N- Dimethylformamid oder N,N-Dimethylacetamid, Alkylnitrile wie Acetonitril, oder Heteroaromaten wie Pyridin, oder Essigsäureethylester, bevorzugt ist Pyridin oder Acetonitril.
Basen sind beispielsweise Alkalicarbonate wie Cäsiumcarbonat, Natrium- oder Kaliumcarbonat, Alkaliacetate wie Natriumacetat oder andere Basen wie Triethylamin, Diisopropylethylamin oder Pyridin, bevorzugt Diisopropylethylamin, Triethylamin oder Pyridin. Die Verbindungen der Formel (VII) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Edukten synthetisieren.
Die Verbindungen der Formel (VI) sind bekannt oder können hergestellt werden, indem Verbindungen der Formel
Figure imgf000013_0001
in welcher
R4 die oben angegebene Bedeutung hat,
mit Aldehyden, Ketonen, Orthoestern oder Enolethern, die den Rest R2 beinhalten,
unter den Bedingungen einer reduktiven Aminierung umgesetzt werden.
Die Umsetzung erfolgt im Allgemeinen in inerten Lösungsmitteln, in Gegenwart eines Reduktionsmittels und Essigsäure, bevorzugt in einem Temperaturbereich von Raumtemperatur bis zum Rückfluss des Lösungsmittels bei Normaldruck.
Inerte Lösungsmittel sind beispielsweise Halogenkohlenwasserstoffe wie Methylenchlorid oder 1,2-Dichlorethan, Ether wie Dioxan oder Tetrahydrofuran, Alkohole wie Methanol oder Ethanol, oder N,N-Dimethylformamid, bevorzugt sind Methylenchlorid oder 1 ,2-Dichlorethan.
Reduktionsmittel sind beispielsweise Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Natriumtrisacet- oxyborhydrid oder Tetrabutylammoniumborhydrid, bevorzugt ist Natriumtrisacetoxyborhydrid.
Die Umsetzung erfolgt gegebenfalls in Gegenwart von Lewissäuren wie beispielsweise Titantetrachlorid (analog zu J.F. Parlow, M.S. South, Tetrahedron 2003, 59, 7695-7701).
Die Verbindungen der Formel (VIII) sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Edukten synthetisieren, z.B. mittels Gewald-Synthese (K. Gewald et al., Chem. Ber. 1966, 94-100).
Aldehyde, Ketone, Orthoester und Enolether, die den Rest R2 beinhalten, sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Verfahren aus den entsprechenden Edukten synthetisieren. Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann durch folgendes Syntheseschema verdeutlicht werden.
Syntheseschema:
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Figure imgf000014_0002
Figure imgf000014_0004
Natriumtrisacetoxy- DIEA borhydrid
Figure imgf000014_0003
Figure imgf000014_0005
N-Brom- succinimid
Figure imgf000014_0006
Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen ein nicht vorhersehbares, wertvolles Wirkspektrum. Sie zeigen antivirale Wirkung gegenüber Vertretern der Familie der Flaviviridae, vor allem gegenüber Hepatitis C- Virus.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Verbin- düngen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten, vor allem von Infektionen mit Viren, insbesondere den vorstehend genannten Viren, und den dadurch hervorgerufenen Infektionskrankheiten. Unter einer Virusinfektion wird nachfolgend sowohl eine Infektion mit einem Virus als auch eine durch eine Infektion mit einem Virus hervorgerufene Krankheit verstanden.
Als Indikationsgebiete können beispielsweise genannt werden:
1. Behandlung von akuten und chronischen Hepatitis C-Infektionen und die Vermeidung, Linderung oder Eliminierung der Begleiterscheinungen und Folgeschäden wie beispielsweise Leberfibrose, Leberzirrhose, Leberkrebs (hepatozelluläres Karzinom) und/oder die Verminderung der Anzahl der viralen Genomkopien in einem Patienten;
2. Behandlung und Prophylaxe bei Organtransplantationspatienten, insbesondere bei einer Hepatitis C-Infektion des Organspenders oder Organempfängers; 3. Behandlung von HCV-Infektionen bei AEDS-Patienten und Patienten, welche mit HTV (humanes Immunodefizienz-Virus) infiziert sind (eine Co-Infektion von HIV mit Hepatitis C fuhrt zu einer raschen Verschlechterung des Krankheitsbildes);
4. Behandlung von HCV-Infektionen bei Patienten, welche mit HBV (Hepatitis B-Virus) oder anderen hepatotrophen Viren (beispielsweise Hepatitis A-Virus, Hepatitis G-Virus) infiziert sind;
5. Behandlung von Erkrankungen mit Viren, welche mit HCV verwandt sind, wie z.B. Gelbfieber-Virus, Dengue-Virus, West Nil-Virus, Frühsommermeningoenzephalitis-Virus, Japanisches Enzephalitis-Virus;
6. Behandlung von Säugetieren mit verwandten animalen Viren wie beispielsweise Pesti- viren;
7. Behandlung von Materialien oder biologischen Agentien, um eine Übertragung von Hepatitis C zu vermeiden oder eine solche Gefahr zu verringern (z.B. bei Blut und Blutprodukten, Blutspende-Utensilien oder chirurgischen Instrumenten).
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln verwendet, die zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Infektionen mit Hepatitis C-Virus oder anderen Mitgliedern der Familie der Flaviviridae geeignet sind.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen allein oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfindungsgemäße Verbindung, vorzugsweise zusammen mit Interferon (pegyliert oder nicht-pegy- liert) oder mit Ribavirin oder mit einem oder mehreren anti-HCV-Agentien oder mit einer Kombination hiervon, enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Erkrankungen, insbesondere der zuvor genannten Erkrankungen, unter Verwen- düng einer antiviral wirksamen Menge der erfindungsgemäßen Verbindungen. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung einer HCV- Infektion durch Gabe einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Verbindungen, eines pharmakologisch unbedenklichen Salzes, Solvates oder Solvates eines Salzes davon oder eines wie oben beschriebenen Arzneimittels, allein oder zusammen mit Interferon (pe- gyliert oder nicht-pegyliert) oder mit Immunmodulatoren (beispielsweise Ribavirin oder Viramidin) oder mit einem oder mehreren anti-HCV-Agentien oder mit einer Kombination hiervon, die zusammen oder getrennt verabreicht werden können.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Prophylaxe einer HCV- Infektion durch Gabe einer wirksamen Menge von mindestens einer der erfindungsgemäßen Ver- bindungen, eines pharmakologisch unbedenklichen Salzes, Solvates oder Solvates eines Salzes davon oder eines wie oben beschriebenen Arzneimittels, allein oder zusammen mit Interferon (pe- gyliert oder nicht-pegyliert) oder mit Immunmodulatoren (beispielsweise Ribavirin oder Viramidin) oder mit einem oder mehreren anti-HCV-Agentien oder mit einer Kombination hiervon, die zusammen oder getrennt verabreicht werden können.
Arzneimittel der vorliegenden Erfindung können eines oder mehrere zusätzliche aktive Agentien enthalten, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe antivirale Agentien, immunomodulatorische Agentien, HCV Protease-Inhibitoren, HCV Polymerase-Inhibitoren, Inhibitoren eines anderen Targets im HCV-Lebenszyklus, HIV-Inhibitoren, HAV-Inhibitoren und HBV-Inhibitoren. Beispiele solcher Agentien sind nachstehend aufgeführt und erläutert.
Bevorzugte Beispiele einiger dieser Agentien sind Ribavirin und Amantadin (antivirale Agentien), Klasse I-Interferone, Klasse II-Interferone und pegylierte Interferone (immunomodulatorische Agentien), Inhibitoren von HCV NS5B-Polymerase, HCV NS3-Helicase, HCV Protease oder IRES (Inhibitoren eines anderen Targets im HCV-Lebenszyklus), nukleosidische Inhibitoren, nicht- nukleosidische Inhibitoren, Protease-Inhibitoren, Fusions-Inhibitoren und Integrase-Inhibitoren von HTV (HIV-Inhibitoren) oder Agentien, die die HBV DNA-Polymerase inhibieren, oder Hepatitis B-Impfstoffe (HBV-Inhibitoren).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch eine Kombinationstherapie, bei der mindestens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen oder ein pharmakologisch unbedenkliches Salz, Solvat oder Solvat eines Salzes davon zusammen mit mindestens einem zusätzlichen Agens, ausgewählt aus der Gruppe antivirale Agentien, immunomodulatorische Agentien, HCV Protease- Inhibitoren, HCV Polymerase-Inhibitoren, Inhibitoren eines anderen Targets im HCV-Lebenszyklus, HTV-Inhibitoren, HAV-Inhibitoren und HBV-Inhibitoren, verabreicht werden. Die zusätzlichen Agentien können mit den erfindungsgemäßen Verbindungen zu einer einzigen pharmazeutischen Dosierungsform vereinigt werden. Alternativ können diese zusätzlichen Agentien separat verabreicht werden. Solche zusätzlichen Agentien können vor, während oder nach der Gabe einer erfmdungsgemäßen Verbindung oder eines pharmakologisch unbedenklichen Salzes, Solvates oder Solvates eines Salzes davon verabreicht werden.
Definitionen:
Der Term "anti-virales Agens" meint ein Agens, das die Bildung und/oder Replikation eines Virus inhibiert. Das schließt Agentien ein, die in Mechanismen des Wirts oder des Virus eingreifen, die für die Bildung und/oder Replikation eines Virus notwendig sind. Anti-virale Agentien sind z.B. Ribavirin, Amantadin, VX-497 (Merimepodib, Vertex Pharmaceuticals), Viramidin, Ceplene (Maxamine), XTL-001 und XTL-002 (XTL-Biopharmaceuticals).
Der Term "anti-HCV-Agens" meint ein Agens, das Hepatitis C-bedingte Krankheitssymptome vermindert oder verhindert. Ein solches Agens kann ein anti-virales Agens, ein immunomodula- torisches Agens, ein HCV Protease-Inhibitor, ein HCV Polymerase-Inhibitor oder ein Inhibitor eines anderen Targets im HCV-Lebenszyklus sein.
Der Term "immunomodulatorisches Agens" meint ein Agens, das die Immunantwort verstärkt oder schädliche Immunreaktionen eindämmt. Immunomodulatorische Agentien sind z.B. Klasse I-Inter- ferone (wie alpha-, beta-, delta- und omega-Interferone, tau-Interferone, consensus-Interferone und asialo-Interferone), Klasse Ü-Interferone (wie gamma-Interferone) und pegylierte Interferone sowie Substanzen wie Levovirin.
Der Term "HCV Protease-Inhibitor" meint ein Agens, das die Funktion der HCV NS2/3-Metallo- protease oder der NS3/4A-Serinprotease inhibiert. HCV NS3/4A-Serinprotease-Inhibitoren sind z.B. BILN 2061 (Boehringer Ingelheim), oder VX-950 /LY-570310 (Vertex/Eli Lilly).
Der Term "HCV Polymerase-Inhibitor" meint ein Agens, das die Funktion der HCV-Polymerase inhibiert. Dies schließt z.B. Inhibitoren der HCV NS5B-Polymerase ein. HCV Polymerase-Inhibi- toren schließen Nicht-Nukleoside ein, beispielsweise Verbindungen, die beschrieben sind in WO 02/100846 und WO 02/100851 (Shire), WO 01/85172 und WO 02/098424 (GSK), WO 00/06529 und WO 02/06246 (Merck), WO 01/47883 und WO 03/000254 (Japan Tobacco) und EP 1 256 628 (Agouron). Außerdem schließen HCV Polymerase-Inhibitoren Nukleosid-Analoga ein, beispielsweise Verbindungen, die beschrieben sind in WO 01/90121 (Idenix), WO 02/069903 (Biochryst Pharmaceuticals), WO 02/057287 und WO 02/057425 (Merck/Isis). Weitere Beispiele für HCV Polymerase-Inhibitoren sind JTK-002, JTK-003 und JTK-109 (Japan Tobacco).
Der Term "Inhibitor eines anderen Targets im HCV-Lebenszyklus" meint ein Agens, das die Bildung und/oder Replikation von HCV auf andere Weise als durch die Inhibition der Funktion einer HCV Protease oder der HCV Polymerase inhibiert. Das schließt Agentien ein, die in Mechanismen des Wirts oder von HCV eingreifen, die für die Bildung und/oder Replikation von HCV notwendig sind. Inhibitoren eines anderen Targets im HCV-Lebenszyklus schließen Agentien ein, die beispielsweise eine Helicase oder eine IRES als Target inhibieren. Ein spezifisches Beispiel für einen Inhibitor eines anderen Targets im HCV-Lebenszyklus ist ISIS-14803 (ISIS-Pharma- ceuticals).
Der Term "HIV-Inhibitor" meint ein Agens, das die Bildung und/oder Replikation von HIV inhibiert. Das schließt Agentien ein, die in Mechanismen des Wirts oder von HTV eingreifen, die für die Bildung und/oder Replikation von HTV notwendig sind. HTV-Inhibitoren schließen z.B. nukleosidische Inhibitoren, nicht-nukleosidische Inhibitoren, Protease-Inhibitoren, Fusions-Inhibitoren und Integrase-Inhibitoren ein.
Der Term "HAV-Inhibitor" meint ein Agens, das die Bildung und/oder Replikation von HAV inhibiert. Das schließt Agentien ein, die in Mechanismen des Wirts oder von HAV eingreifen, die für die Bildung und/oder Replikation von HAV notwendig sind. HAV-Inhibitoren schließen z.B. Hepatitis A-Impfstoffe [z.B. Havrix® (GSK), VAQTA® (Merck), Avaxim® (Aventis Pasteur)] ein.
Der Term "HBV-Inhibitor" meint ein Agens, das die Bildung und/oder Replikation von HBV inhibiert. Das schließt Agentien ein, die in Mechanismen des Wirts oder von HBV eingreifen, die für die Bildung und/oder Replikation von HBV notwendig sind. HBV-Inhibitoren schließen z.B. Agentien ein, die die HBV DNA-Polymerase inhibieren, oder Hepatitis B-Impfstoffe. Spezifische Beispiele von HBV-Inhibitoren sind: Lamivudine (Epivir-HBV®), Adefovir Dipivoxil, Entecavir, FTC (Coviracil®), DAPD (DXG), L-FMAU (Clevudine®), AM365 (Amrad), Ldt (Telbivudine), monoval-LdC (Valtorcitabine), BAY 41-4109 (Bayer), ACH-126,443 (L-Fd4C) (Achillion), MCC478 (Eli Lilly), Racivir (RCV), Fluoro-L- und D-Nukleoside, Robustaflavone, ICN2001-3 (ICN), Bam 205 (Novelos), XTL-001 (XTL), Imino-Zucker (Nony-DNJ) (Synergy), HepBzyme, sowie immunomodulatorische Produkte wie z.B. Interferon alpha-2b, HE2000 (Hollis-Eden), Theradigm (Epimmune), EHT899 (Enzo Biochem), Thymosin alpha-1 (Zadaxin®), HBV DNA Vaccine (PowderJect), HBV DNA Vaccine (Jefferon Center), HBV Antigen (OraGen), BayHep B® (Bayer), Nabi-HB® (Nabi) und Anti-hepatitis B (Cangene), sowie HBV-Impfstoffe wie z.B. Engerix B, Recombivax HB, GenHevac B, Hepacare, Bio-Hep B, TwinRix, Comvax, Hexavac.
Der Term "Klasse I-Interferone" meint ein Interferon ausgewählt aus einer Gruppe von Inter- feronen, die alle an den Rezeptor Typ I binden. Das schließt natürliche und synthetisch hergestellte Klasse I-Interferone ein. Beispiele von Klasse I-Interferonen sind alpha-, beta- und omega-Inter- ferone, tau-Interferone, consensus-Interferone und asialo-Interferone. Der Term "Klasse Ü-Interferone" meint ein Interferon ausgewählt aus einer Gruppe von Inter- feronen, die alle an den Rezeptor Typ II binden. Beispiele von Klasse H-Interferonen sind gamma- Interferone.
Der Term "Behandlung" meint die Verabreichung eines Arzneimittels entsprechend der vor- liegenden Erfindung, um die Krankheitssymptome von Hepatitis C zu lindern oder zu eliminieren und/oder um die Virenmenge zu reduzieren.
Der Term "Prophylaxe" meint die Verabreichung eines Arzneimittels entsprechend der vorliegenden Erfindung nach der Infektion mit HCV, aber vor dem Auftreten von Krankheitssymptomen und/oder vor der Detektion von HCV im Blut.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck können sie auf geeignete Weise appliziert werden, wie z.B. oral, parenteral, pulmonal, nasal, sublingual, lingual, buccal, rectal, dermal, transdermal, conjunctivae otisch oder als Implantat bzw. Stent.
Für diese Applikationswege können die erfindungsgemäßen Verbindungen in geeigneten Applika- tionsformen verabreicht werden.
Für die orale Applikation eignen sich nach dem Stand der Technik funktionierende schnell und/oder modifiziert die erfindungsgemäßen Verbindungen abgebende Applikationsformen, die die erfindungsgemäßen Verbindungen in kristalliner und/ oder amorphisierter und/oder gelöster Form enthalten, wie z.B. Tabletten (nichtüberzogene oder überzogene Tabletten, beispielsweise mit magensaftresistenten oder sich verzögert auflösenden oder unlöslichen Überzügen, die die Freisetzung der erfindungsgemäßen Verbindung kontrollieren), in der Mundhöhle schnell zerfallende Tabletten oder Filme/Oblaten, Filme/Lyophylisate, Kapseln (beispielsweise Hart- oder Weichgelatinekapseln), Dragees, Granulate, Pellets, Pulver, Emulsionen, Suspensionen, Aerosole oder Lösungen.
Die parenterale Applikation kann unter Umgehung eines Resorptionsschrittes geschehen (z.B. intravenös, intraarteriell, intrakardial, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption (z.B. intramuskulär, subcutan, intracutan, percutan oder intraperitoneal). Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen u.a. Injektions- und Infusionszubereitungen in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Lyophilisaten oder sterilen Pulvern.
Für die sonstigen Applikationswege eignen sich z.B. Inhalationsarzneiformen (u.a. Pulverinhalatoren, Nebulizer), Nasentropfen, -lösungen, -sprays; lingual, sublingual oder buccal zu applizierende Tabletten, Filme/Oblaten oder Kapseln, Suppositorien, Ohren- oder Augenpräparationen, Vaginalkapseln, wäßrige Suspensionen (Lotionen, Schüttelmixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, transdermale therapeutische Systeme, Milch, Pasten, Schäume, Streupuder, Implantate oder Stents.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in die angeführten Applikationsformen überführt werden. Dies kann in an sich bekannter Weise durch Mischen mit inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen geschehen. Zu diesen Hilfsstoffen zählen u.a. Trägerstoffe (beispielsweise mikrokristalline Cellulose, Laktose, Mannitol), Lösungsmittel (z.B. flüssige PoIy- ethylenglycole), Emulgatoren und Dispergier- oder Netzmittel (beispielsweise Natriumdodecyl- sulfat, Polyoxysorbitanoleat), Bindemittel (beispielsweise Polyvinylpyrrolidon), synthetische und natürliche Polymere (beispielsweise Albumin), Stabilisatoren (z.B. Antioxidantien wie beispielsweise Ascorbinsäure), Farbstoffe (z.B. anorganische Pigmente wie beispielsweise Eisenoxide) und Geschmacks- und / oder Geruchskorrigentien.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Arzneimittel, die mindestens eine erfϊndungsgemäße Verbindung, üblicherweise zusammen mit einem oder mehreren inerten, nicht- toxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoffen enthalten, sowie deren Verwendung zu den zuvor genannten Zwecken.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei intravenöser Applikation Mengen von etwa 0.001 bis 20 mg/kg, vorzugsweise etwa 0.01 bis 5 mg/kg Körpergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen, und bei oraler Applikation beträgt die Dosierung etwa 0.01 bis 50 mg/kg, vorzugsweise 0.1 bis 10 mg/kg Körpergewicht.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, individuellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindest- menge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
Die Prozentangaben in den folgenden Tests und Beispielen sind, sofern nicht anders angegeben, Gewichtsprozente; Teile sind Gewichtsteile. Lösungsmittelverhältnisse, Verdünnungsverhältnisse und Konzentrationsangaben von flüssig/flüssig-Lösungen beziehen sich jeweils auf das Volumen. A. Beispiele
Verwendete Abkürzungen:
BlNAP 2,2'-Bis-(diphenylphosphino)-l,r-binaphthyl
CDCl3 Deuterochloroform
CD3CN Deuteroacetonitril
DC Dünnschichtchromatographie
DCI direkte chemische Ionisation (bei MS)
DCM Dichlormethan
DIEA N,N-Diisopropylethylamin (Hünig Base)
DMAP 4-N,N-Dimethylaminopyridin
DMSO Dimethylsulfoxid
DMF N,N'-Dimethylformamid d. Th. der Theorie
EE Ethylacetat (Essigsäureethylester)
EI Elektronenstoß-Ionisation (bei MS)
ESI Elektrospray-Ionisation (bei MS)
Fp. Schmelzpunkt ges. gesättigt h Stunde
HPLC Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie konz. konzentriert
LC-MS Flüssigchromatographie-gekoppelte Massenspektroskopie
LDA Lithium-Diisopropylamid
LiOH Lithiumhydroxid
MS Massenspektroskopie
NMR Kernresonanzspektroskopie proz. prozentig
RP-HPLC Reverse Phase HPLC
RT Raumtemperatur
R* Retentionszeit (bei HPLC)
THF Tetrahydrofuran Allgemeine LCMS- und HPLC-Methoden:
Methode 1 (HPLC): Instrument: HP 1100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml HClO4/! Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2%B, 0.5 min 2%B, 4.5 min 90%B, 6.5 min 90%B; Fluss: 0.75 ml/min; Ofen: 3O0C; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 2 (HPLC, präparative Trennung): Säule: CromSil Cl 8, 250 mm x 30 mm; Eluent A: Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 3 min 10%B -> 31 min 90%B -> 34 min 90%B -> 34.01 min 10%B; Laufzeit: 38 min; Fluss: 50 ml/min; UV-Detektion: 210 nm.
Methode 3 (HPLC): Instrument: HP 1100 mit DAD-Detektion; Säule: Kromasil RP-18, 60 mm x 2 mm, 3.5 μm; Eluent A: 5 ml HCIO4/I Wasser, Eluent B: Acetonitril; Gradient: 0 min 2%B, 0.5 min 2%B, 4.5 min 90%B, 9 min 90%B; Fluss: 0.75 ml/min; Ofen: 3O0C; UV-Detektion: 210 nm.
Ausgangsverbindungen
Beispiel IA
3-(Isopropylamino)thiophen-2-carbonsäuremethylester
Figure imgf000023_0001
10.0 g (63.62 mmol) 3-Aminothiophen-2-carbonsäuremethylester werden in 250.0 ml Dichlormethan gelöst und mit 23.95 ml (254.47 mmol, 4 equiv.) 2-Methoxypropen versetzt. Anschließend fügt man 14.6 ml (254.47 mmol, 4 equiv.) Essigsäure und 26.97 g (127.23 mmol, 2 equiv.) Natriumtriacetoxyborhydrid hinzu. Der Reaktionsansatz wird für 2 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck und gelindem Erwärmen entfernt und der Rückstand mittel flash-Chromatographie (Eluent: Dichlormethan) aufgereinigt. Die Produktfraktionen werden vereinigt, im Vakkum eingeengt und am Hochvakuum getrocknet. Man erhält 12.0 g (95% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 1): R1 = 4.55 min
MS (DCI(NH3)): m/z = 200.1 (M+H)+.
1H-NMR (400MHz, CDCl3): δ = 7.32 (d, IH)5 6.62 (d, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.58-3.75 (m, IH), 1.25 (d, 6H).
Beispiel 2A
3-{Isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen-2-carbonsäuremethylester
Figure imgf000023_0002
30.0 g (211.0 mmol) trans-4-Methyl-cyclohexancarbonsäure werden unter Argon in 150.6 g (1.27 mol) Thionylchlorid gelöst und 1 h unter Rückfluss gekocht. Nach dem Erkalten wird das überschüssige Thionylchlorid im Vakuum unter gelindem Erwärmen abgezogen und der Rückstand dreimal mit trockenem Toluol coevaporiert. 5.0 g (25.09 mmol, 1 equiv) 3-(Isopropylamino)- thiophen-2-carbonsäuremethylester werden mit 8.30 ml (47.67 mmol, 1.9 equiv) Diisopropyl- ethylamin und mit 8.06 g (50.18 mmol, 2 equiv) trans-4-Methyl-cyclohexancarbonsäurechlorid versetzt. Der Reäktionsansatz wird für 18 h bei 800C gerührt und anschließend mit Wasser gequencht. Die wässrige Phase extrahiert man mit Essigsäureethylester, trennt die Phasen, trocknet die organische Phase mit Natriumsulfat, filtriert und entfernt das Lösungsmittel unter gelindem Erwärmen am Rotationsverdampfer. Der Rückstand wird mittels flash-Chromatographie (Gradient 100% Dichlormethan auf 50:50 Dichlormethan:Essigsäureethylester) aufgereinigt und man erhält 4.60 g (57% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 3): R, = 4.98 min
+
MS (DCI(NH3)): m/z = 323.8 (M+H)
1H-NMR (400MHz, CDCl3): δ = 7.56 (d, IH)5 6.87 (d, IH), 4.87-5.03 (m, IH), 3.83 (s, 3H), 1.18- 1.94 (m, 8H), 1.12 (d, 3H), 0.90 (d, 3H), 0.78 (d, 3H), 0.47-0.73 (m, 2H).
Beispiel 3A
5-Brom-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen-2-carbonsäure- methylester
Figure imgf000024_0001
Unter Argon werden 1.00 g (3.09 mmol) S-IIsopropylJXtrans^-methylcyclohexyrjcarbonyl]- amino}thiophen-2-carbonsäuremethylester in 10 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst und bei -78°C mit 5.10 ml einer 2M Lithiumdiisopropylamid Lösung in THF versetzt. Nach 2 stündigem Rühren bei -780C werden 4.82 g (18.55 mmol) l,2-Dibrom-l,l,2,2-tetrafluorethan hinzugefügt und abermals 1 h bei -780C gerührt. Man quencht den Ansatz mit 10 ml Wasser, trennt die Phasen, trocknet die organische Phase über Natriumsulfat und entfernt das Lösungsmittel unter gelindem Erwärmen bei vermindertem Druck. Der Rückstand wird in Acetonitril/Dimethylsulfoxid gelöst und mittels präparativer HPLC (RP-18 Säule, Laufmittel: Acetonitril-Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt und man erhält 0.48 g (38% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 3): R1 = 5.42 min
MS (CI+): m/z = 404.0 (M+H)+.
1H-NMR (400MHz, CDCl3): δ = 6.87 (s, IH), 4.82-5.00 (m, IH), 3.82 (s, 3H), 1.83-2.00 (m, IH), 1.22-1.75 (m, 7H), 1.13 (d, 3H), 0.93 (d, 3H), 0.81 (d, 3H), 0.57-0.76 (m, 2H).
Beispiel 4A
5-(3,3-Dimethylbut-l-in-l-yl)-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen- 2-carbonsäuremethylester
Figure imgf000025_0001
100.0 mg (0.25 mmol) 5-Brom-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen- 2-carbonsäuremethylester, 87.8 mg (1.07 mmol, 4.3 equiv) 3,3-Dimethyl-l-butin, 244.6 μL (178.6 mg, 1.76 mmol, 7.1 equiv) Triethylamin, 6.52 mg (0.02 mmol, 0.1 equiv) Triphenylphosphin und 0.95 mg (0.02 equiv) Kupfer-(I)-jodid werden in 1 ml N,N'-Dimethylformamid vorgelegt und durch die Reaktionsmischung wird für 1 h Argon durchgeleitet. Anschließend fügt man 15.9 mg (0.02 mmol, 0.07 equiv) Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium hinzu und rührt die Reaktionsmischung über Nacht bei 600C. Der Kolbeninhalt wird über Kieselgur filtriert und mittels präparativer HPLC (RP-18 Säule, Laufmittel: Acetonitril-Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Man erhält 84 mg (70% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 3): R, = 6.05 min
MS (ES+): m/z = 404 (M+H)+. 1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 7.27 (s, IH), 4.61-4.78 (m, IH), 3.75 (s, 3H), 1.75-1.92 (m, IH), 1.40-1.64 (m, 5H), 1.30 (s, 9H), 1.13-1.27 (m, 2H), 1.05 (d, 3H), 0.82 (d, 3H), 0.76 (d, 3H), 0.46-0.71 (m, 2H).
Beispiel 5A
3 - {Isopropy l[(trans-4-methy lcyclohexyl)carbonyl] amino} -5-(3 -methylbut- 1 -in- 1 -y l)thiophen-2- carbonsäuremethylester
Figure imgf000026_0001
55.0 mg (0.14 mmol) 5-Brom-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen- 2-carbonsäuremethylester, 40.0 mg (0.59 mmol, 4.3 equiv) 3 -Methyl- 1-butin, 134.5 μL (98.2 mg, 0.97 mmol, 7.1 equiv) Triethylamin, 3.59 mg (0.01 mmol, 0.1 equiv) Triphenylphosphin und 0.52 mg (0.02 equiv) Kupfer-(I)-jodid werden in 1 ml N,N'-Dimethylformamid vorgelegt und durch die Reaktionsmischung wird für 1 h Argon durchgeleitet. Anschließend fügt man 8.76 mg (0.01 mmol, 0.07 equiv) Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium hinzu und rührt die Reaktionsmischung über Nacht bei 600C. Der Kolbeninhalt wird über Kieselgur filtriert und mittels präparativer HPLC (RP- 18 Säule, Laufinittel: Acetonitril- Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Man erhält 47 mg (82% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 3): R4 = 5.88 min
MS (DCI(NH3)): m/z = 390.2 (M+H)+.
1H-NMR (400MHz, DMSOd6): δ = 7.28 (s, IH), 4.60-4.80 (m, IH), 3.75 (s, 3H), 2.80-2.97 (m, IH), 1.76-1.89 (m, IH), 1.38-1.64 (5H), 1.11-1.32 (m, 8H), 1.03 (d, 3H), 0.81 (d, 3H), 0.76 (d, 3H), 0.47-0.72 (m, 2H).
Beispiel 6A
5-(Cyclopropylethinyl)-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen-2- carbonsäuremethylester
Figure imgf000027_0001
55.0 mg (0.14 mmol) 5-Brom-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen-
2-carbonsäuremethylester, 38.9 mg (0.59 mmol, 4.3 equiv) Ethinylcyclopropan, 134.5 μL (98.2 mg, 0.97 mmol, 7.1 equiv) Triethylamin, 3.59 mg (0.01 mmol, 0.1 equiv) Triphenylphosphin und 0.52 mg (0.02 equiv) Kupfer-(I)-jodid werden in 1 ml N,N'-Dimethylformamid vorgelegt und durch die Reaktionsmischung wird für 1 h Argon durchgeleitet. Anschließend fügt man 8.76 mg
(0.01 mmol, 0.07 equiv) Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium hinzu und rührt die
Reaktionsmischung über Nacht bei 6O0C. Der Kolbeninhalt wird über Kieselgur filtriert und mittels präparativer HPLC (RP-18 Säule, Laufmittel: Acetonitril-Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Man erhält 47 mg (82% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 3): R, = 5.64 min
MS (DCI(NH3)): m/z = 388.2 (M+H)+.
1H-NMR (400MHz, DMSOd6): δ = 7.26 (s, IH), 4.62-4.76 (m, IH), 3.75 (s, 3H), 1.74-1.88 (m, IH), 1.41-1.71 (m, 6H), 1.14-1.32 (m, 2H), 1.04 (d, 3H), 0.91-0.99 (m, 2H), 0.72-0.86 (m, 8H), 0.45-0.72 (m, 2H).
Beispiel 7A
5-(3-Amino-3-methylbut-l-in-l-yl)-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}- thiophen-2-carbonsäuremethylester
Figure imgf000027_0002
100.0 mg (0.25 mmol) 5-Brom-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen- 2-carbonsäuremethylester, 88.9 mg (1.07 mmol, 4.3 equiv) 3-Amino-3-methyl-l-butin, 244.6 μL (178.6 mg, 1.76 mmol, 7.1 equiv) Triethylamin, 6.52 mg (0.02 mmol, 0.1 equiv) Triphenylphosphin und 0.95 mg (0.02 equiv) Kupfer-(I)-jodid werden in 1 ml N5N'- Dimethylformamid vorgelegt und durch die Reaktionsmischung wird für 1 h Argon durchgeleitet. Anschließend fügt man 15.93 mg (0.02 mmol, 0.07 equiv) Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium hinzu und rührt die Reaktionsmischung über Nacht bei 6O0C. Der Kolbeninhalt wird über Kieselgur filtriert und mittels präparativer HPLC (RP- 18 Säule, Laufmittel: Acetonitril- Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Man erhält 72 mg (72% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 3): R. = 4.16 min
MS (ES+): m/z = 405 (M+H)+.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 7.26 (s, IH), 4.63-4.78 (m, IH), 3.76 (s, 3H), 1.76-1.90 (m, IH), 1.12-1.64 (m, 15H), 1.03 (d, 3H), 0.81 (d, 3H), 0.76 (d, 3H), 0.46-0.71 (m, 2H).
Beispiel 8A
3-{Isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}-5-(phenylethinyl)thiophen-2- carbonsäuremethylester
Figure imgf000028_0001
100.0 mg (0.25 mmol) 5-Brom-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen- 2-carbonsäuremethylester, 109.15 mg (1.07 mmol, 4.3 equiv) Phenylacetylen, 244.6 μL (178.6 mg, 1.76 mmol, 7.1 equiv) Triethylamin, 6.52 mg (0.02 mmol, 0.1 equiv) Triphenylphosphin und 0.95 mg (0.02 equiv) Kupfer-(I)-jodid werden in 1 ml N5N '-Dimethylformamid vorgelegt und durch die Reaktionsmischung wird für 1 h Argon durchgeleitet. Anschließend fügt man 15.9 mg (0.02 mmol, 0.07 equiv) Tris(dibenzylidenaceton)dipalladium hinzu und rührt die Reaktionsmischung über Nacht bei 6O0C. Der Kolbeninhalt wird über Kieselgur filtriert und mittels präparativer HPLC (RP- 18 Säule, Laufmittel: Acetonitril- Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Man erhält 78 mg (73% d. Th.) Produkt. HPLC (Methode 1): Rt = 6.19 min
MS (DCI(NH3)): m/z = 424.2 (M+H)+.
1H-NMR (400MHz, DMSO-(I6): δ = 7.58-7.65 (m, 2H), 7.42-7.52 (m, 4H), 4.65-4.79 (m, IH), 3.78 (s, 3H), 1.80-1.92 (m, IH), 1.39-1.64 (m, 5H), 1.13-1.32 (m, 2H), 1.07 (d, 3H), 0.84 (d, 3H), 0.77 (d, 3H), 0.48-0.72 (m, 2H).
Ausfiihrungsbeispiele
Beispiel 1
5-(3,3-Dimethylbut-l-in-l-yl)-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen- 2-carbonsäure
Figure imgf000030_0001
79 mg (0.20 mmol) der Verbindung aus Beispiel 4A werden in 1.0 ml Dioxan gelöst und mit 1.0 ml einer wässrigen IN Lithiumhydroxid-Lösung versetzt. Der Reaktionsansatz wird 18 h bei RT gerührt. Unter vermindertem Druck wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in einem Gemisch aus Acetonitril und Dimethylsulfoxid gelöst und mittels präperativer HPLC (RP-18 Säule, Laufmittel: Acetonitril-Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Man erhält 52 mg (68% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 3): R, = 5.41 min
+
MS (DCI(NH3)): m/z = 390.2 (M+H)
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 7.20 (s, IH), 4.62-4.79 (m, IH), 1.77-1.92 (m, IH), 1.39-1.64 (m, 5H), 1.11-1.34 (HH), 1.04 (d, 3H), 0.83 (d, 3H), 0.76 (d, 3H), 0.46-0.72 (m, 2H).
Beispiel 2
3-{Isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}-5-(3-methylbut-l-in-l-yl)thiophen-2- carbonsäure
Figure imgf000030_0002
44 mg (0.11 mmol) der Verbindung aus Beispiel 5A werden in 1.0 ml Dioxan gelöst und mit 1.0 ml einer wässrigen IN Lithiumhydroxid-Lösung versetzt. Der Reaktionsansatz wird 18 h bei RT gerührt. Unter vermindertem Druck wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in einem Gemisch aus Acetonitril und Dimethylsulfoxid gelöst und mittels präperativer HPLC (RP-18 Säule, Laufmittel: Acetonitril-Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Man erhält 27 mg (64% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 3): R. = 5.27 min
MS (DCI(NH3)): m/z = 376.2 (MH-H)+.
1H-NMR (400MHz, DMSO-d6): δ = 13.51 (br s, IH), 7.21 (s, lH),4.62-4.77 (m, IH), 2.80-2.97 (m, IH)5 1.76-1.93 (m, IH)5 1.35-1.69 (m, 5H)5 1.16-1.33 (m, 8H), 1.04 (d, 3H), 0.83 (d, 3H)5 0.76 (d, 3H)5 0.47-0.72 (m, 2H).
Beispiel 3
5-(Cyclopropylethinyl)-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}thiophen-2- carbonsäure
Figure imgf000031_0001
46 mg (0.12 mmol) der Verbindung aus Beispiel 6A werden in 1.0 ml Dioxan gelöst und mit 1.0 ml einer wässrigen IN Lithiumhydroxid-Lösung versetzt. Der Reaktionsansatz wird 18 h bei RT gerührt. Unter vermindertem Druck wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in einem Gemisch aus Acetonitril und Dimethylsulfoxid gelöst und mittels präperativer HPLC (RP-18 Säule, Laufmittel: Acetonitril-Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Man erhält 24 mg (54% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 3): R1 = 5.06 min
MS (DCI(NH3)): m/z = 374.2 (M+H)+. 1H-NMR (400MHz, DMSOd6): δ = 13.49 (br s, IH), 7.20 (s, IH), 4.61-4.78 (m, IH), 1.76-1.92 (m, IH), 1.35-1.70 (m, 6H), 1.10-1.34 (m, 2H), 1.03 (d, 3H), 0.91-1.00 (m, 2H), 0.78-0.86 (m, 5H), 0.76 (d, 3H), 0.46-0.72 (m, 2H).
Beispiel 4
5-(3-Amino-3-methylbut-l-in-l-yl)-3-{isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}- thiophen-2-carbonsäure
Figure imgf000032_0001
65 mg (0.16 mmol) der Verbindung aus Beispiel 7A werden in 1.0 ml Dioxan gelöst und mit 1.0 ml einer wässrigen IN Lithiumhydroxid-Lösung versetzt. Der Reaktionsansatz wird 18 h bei RT gerührt. Unter vermindertem Druck wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in einem Gemisch aus Acetonitril und Dimethylsulfoxid gelöst und mittels präperativer HPLC (RP- 18 Säule, Laufmittel: Acetonitril- Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Da das so erhaltene Produkt noch verunreinigt war, wurde abermal eine weitere Aufreinigung mittels präparativer HPLC durchgeführt. Man erhält 4.6 mg (7% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 1): R1 = 3.83 min
MS (ES+): m/z = 413 (M+Na)+.
1H-NMR (400MHz, MeOD): δ = 7.16 (s, IH), 4.60-4.80 (m, IH, Signal liegt unter dem Wasser peak), 1.79-1.95 (m, IH), 1.36-1.74 (12H), 1.13-1.33 (m, 3H), 1.04 (d, 3H), 0.84 (d, 3H), 0.71 (d, 3H), 0.38-0.67 (m, 2H).
Beispiel 5
3-{Isopropyl[(trans-4-methylcyclohexyl)carbonyl]amino}-5-(phenylethinyl)thiophen-2- carbonsäure
Figure imgf000033_0001
55 mg (0.13 mmol) der Verbindung aus Beispiel 8A werden in 1.0 ml Dioxan gelöst und mit 1.0 ml einer wässrigen IN Lithiumhydroxid-Lösung versetzt. Der Reaktionsansatz wird 2 h bei RT gerührt. Der Kolbeniinhalt wird mit konzentrieter Salzsäure-Lösung angesäuert. Unter vermindertem Druck wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in einem Gemisch aus Acetonitril und Dimethylsulfoxid gelöst und mittels präperativer HPLC (RP- 18 Säule, Laufmittel: Acetonitril-Wasser Gradient 95:5->5:95) aufgereinigt. Man erhält 42 mg (79% d. Th.) Produkt.
HPLC (Methode 1): R, = 5.41 min
MS (ES+): m/z = 410 (M+H)+.
1H-NMR (400MHz, DMSOd6): δ = 13.61 (br s, IH), 7.56-7.67 (m, 2H), 7.39-753 (m, 4H), 4.66- 4.81 (m, IH), 1.82-1.96 (m, IH), 1.38-1.65 (m, 5H), 1.14-1.36 (m, 2H), 1.08 (d, 3H), 0.87 (d, 3H), 0.77 (d, 3H), 0.51-0.73 (m, 2H).
B. Bewertung der physiologischen Wirksamkeit
Abkürzungen:
DMSO Dimethylsulfoxid
DMEM Dulbecco's Modified Earle's Medium
FKS Fötales Kälberserum
G418 Geneticin
EC50 Effektive Konzentration 50
IC50 Inhibitorische Konzentration 50
CC50 Cytotoxische Konzentration 50
Pen Penicillin
Strep Streptomycin min. Minuten
NEAA Nichtessentielle Aminosäuren
PBS Phosphate buffered saline (Phosphatpuffer) h Stunden sec Sekunden
RT Raumtemperatur
Verwendete Produkte:
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000035_0001
Die in vitro-Wirkung der erfϊndungsgemäßen Verbindungen kann in folgenden Assays gezeigt werden:
1. Messung der Substanzaktivität in einem zellulären HCV-RNA-Replikationsassay f'Replikon-Svstem")
Hepatits C kann bis zum jetzigen Zeitpunkt nicht reproduzierbar mit hohen Titern in Zellkultur vermehrt werden. Daher wird die Substanzaktivität im sogenannten Replikonsystem nachgewiesen. Dabei handelt es sich um Genomteile des HCV oder um gesamte Genome von HCV, welche in Zelllinien (hier HuH-7 Zellen) menschlichen Ursprungs verbracht werden. Durch Einfügen eines Selektionsmarkers können stabile Zelllinien gewonnen werden, welche unter Selektionsdruck genomische oder subgenomische RNA von HCV vermehren [Lohmann et al, Science 285, 110-113 (1999); Blight et al., Science 290, 1972-1974 (2000)]. Die hier verwendeten HuH5-2 Zellen beherbergen ein selektionierbares, Luciferase tragendes, zellkulturadaptiertes Replikon wie in EP 1 043 399 beschrieben. Die Zellen werden in Dulbecco's Modified Earle's Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FKS), 1% Pen/Strep, 1% NEAA, 1% L-Glutamin und 250 μg/ml Geneticin (G418) kultiviert. Für die Durchführung der unten beschriebenen Assays werden die Zellen zunächst trypsiniert und mit dem oben beschriebenen DMEM-Medium ohne G418 resuspendiert. Je nach Test werden die Zellen in 24-well- oder 384-well-Platten eingesät. In Abhängigkeit vom verwendeten Auslese- oder Testverfahren werden transparente oder weiße für die ZeIl- kultur beschichtete Testplatten verwendet. a) Zubereitung der Testsubstanzen:
Die Testverbindungen werden als 50 mM-Stammlösung in DMSO angesetzt. Für die Bestimmung der EC50- Werte werden die Substanzen anschließend in DMEM seriell in Zweierstufen verdünnt. Die Verdünnungen werden als Duplets auf die Zellkulturplatten übertragen. Anschließend erfolgt die Zugabe der trypsinierten, in Medium resuspendierten Zellen. Die Endkonzentrationen der Testsubstanzen in den Zellkulturkavitäten beträgt beispielsweise 300 μM bis 0.0001 μM. Interferonalpha dient als Referenzsubstanz in Konzentrationen von 60 IU/ml bis 1 IU/ml. Antimycin-alpha dient als Zytotoxizitätskontrolle in Konzentrationen von 2 μM bis 0.03 μM. Nicht-behandelte Zellen dienen als Referenz. Die Platten werden dann bei 37°C unter 5% CO2 für 4-5 Tage inku- biert. Im Anschluss daran erfolgen die unterschiedlichen Messungen bzw. die Quantifizierung der HCV-Replikon-RNA.
b) Zytotoxizitätstest (visuell):
Für die Bewertung der Zytotoxizität der Testsubstanzen auf HUH5-2 Zellen wird der obige Test in einer transparenten Zellkulturplatte angesetzt. Die qualitative Auswertung erfolgt visuell unter dem Mikroskop.
c) Alamar Blue-Test (quantitativer Zytotoxizitätstest):
Alamar Blue ist ein wasserlöslicher Redox-Indikator, der in Abhängigkeit von der metabolischen Aktivität der zu untersuchenden Zellen reduziert wird. Der Alamar Blue-Test wird als quantitativer Zytotoxizitätsassay verwendet. Hierfür werden die Zellen mit den entsprechenden Testsubstanzen (siehe oben) in weiße 384-well-Zellkulturplatten eingesät und entsprechend bei 370C unter 5% CO2 für 4 Tage inkubiert. 4 bis 6 Stunden vor der eigentlichen Messung erfolgt die Zugabe von 5 μl Alamar Blue pro well. Anschließend wird die Fluoreszenz bei einer Emissionswellenlänge von 544 nm und bei einer Extinktionswellenlänge von 590 nm gemessen. Soll im Anschluss an diesen Test auf der gleichen Platte noch die Chemolumineszenzmessung (siehe unten) erfolgen, wird die Farbstofflösung von den Zellen abgesaugt und diese anschließend einmal mit PBS gewaschen. Das PBS wird ebenfalls wieder von den Zellen abgesaugt.
d) Messung der HCV-RNA-Menge durch Ermittlung der Aktivität eines Reporter gens:
In das HCV-Replicon-HuH5-2 ist ein Reportergen eingefügt, hier das Gen für das Enzym Luci- ferase des Photinus pyralis. Nach Zugabe des Luciferase-Reagenz (20 mM Tris/HCl, 20 mM Tricine, 2.67 mM MgSO4, 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 0.27 mM Coenzym A, 0.47 mM
Luciferin, 0.53 mM ATP, pH 7.8) zu den Zellen erfolgt die Chemolumineszenzmessung in einem Luminometer. Üblicherweise werden die Photonen in einem Zeitraum von 10 sec bis 60 sec gemessen.
Die folgenden Daten können von den Testplatten ermittelt werden:
CC50 = Substanzkonzentration in μM, bei der die Alamar Blue-Fluoreszenz im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle um 50% abnimmt;
EC50 = Substanzkonzentration, bei der die Luciferaseaktivität im Vergleich zur unbehandelten Replikonkontrolle um 50% abnimmt;
SI (Selektivitätsindex) = CC5o/ECSo.
e) Messung der Substanzaktivität mittels direkter Messung der HCV-Genommenge:
Zellen, welche subgenomische HCV-RNA vermehren, werden wie oben beschrieben in 96 well oder 24 well-Zellkulturplatten in DMEM / 10% FKS ohne Zusatz von Geniticin vermehrt. Befinden sich die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase, wird Substanz in geeigneter Verdünnung in das Medium gemischt. Die Endkonzentrationen betragen beispielsweise 100 μM und 30 μM sowie Verdünnungen hiervon. Nach 4 bis 5 Tagen Inkubation wird das Medium verworfen. Die Zellen werden mit Hilfe von Trypsin von der Zellkulturplatte gelöst und in 100 μl Phosphatpuffer (PBS) aufgenommen. Wird der Test in 24 well Zellkulturplatten durchgeführt, werden die Zellen aufgeteilt, ein Teil wird auf ihren Gehalt an HCV-RNA mit Hilfe der quantitativen PCR untersucht, der andere Teil der Zellen mit Hilfe des Nachweises der Luciferase- Aktivität untersucht (Bright Glow Kit, Fa. Promega, Durchführung gemäß Angaben des Herstellers). Wird der Test in 96 well Zellkulturplatten durchgeführt, werden parallel Proben angesetzt. Wie oben beschrieben wird ein Duplikat auf Luciferase Aktivität untersucht, von dem anderen Duplikat wird RNA gewonnen und mit Hilfe der quantitativen PCR auf den gehalt an HCV RNA untersucht. Erhaltene Werte werden durch Kurvenanalysen (sigmoidale Dosis- Wirkungskurven mit variablem Kurvenverlauf; GraphPad Prism Version 3.02 für Windows, GraphPad Software Inc.) ausgewertet und die effektive Konzentration, mit der eine 50%- Hemmung erzielt wird (EC50), ermittelt. Zum Vergleich dienen unbehandelte Zellen. Aus den restlichen zu untersuchenden Zellen wird mit Hilfe des Rneasy Mini Kits (Fa. Qiagen, Bestell-Nr. 74104) nach Angaben des Herstellers Gesamtzell-RNA isoliert. Die Elution erfolgt in 30-50 μl Rnase-freiem Wasser. Die RNA wird bei -8O0C gelagert. Mit Hilfe von TaqMan®-Assays (Fa. Applied Biosystems) wird die enthaltene Menge an HCV-RNA bestimmt. Die verwendeten primer und Gensonden binden an die konservierte 5'-nichttranslatierte Region des Virusgenoms (primer für kodierenden DNA-Strang: aatgcctggagatttgggc; primer in Gegenrichtung: tttcgcgacccaacactactc; Gensonde: 6-Carboxyfluorescin-tgcccccgcgagactgcatagc-N,N,N',N'- tetramethyl-6-carboxyrhodamine). Zur Standardisierung der eingesetzten Probe wird die Expression eines zelleigenen Genes bestimmt (TaqMan Ribosomal RNA Control Reagents, Fa. Applied Biosystems P/N 4308329). Für die Reaktion wird der Kit Platinum® Quantitative RT-PCR Thermoscript™ one step System der Fa. Invitrogen (Bestell-Nr. 12267-019) verwendet. Die Reaktion findet in einem Endvolumen von 25 μM mit 1 μl Probenvolumen statt. Die Reaktionsbedingungen sind: 30 min Inkubation bei 5O0C, danach 5 min Inkubation bei 950C. Nach diesem Schritt folgt die eigentliche Amplifikationsphase mit 40 Wiederholungen folgender Schritte: 15 sec Inkubation bei 950C gefolgt von 1 min Inkubation bei 600C. Die Messung und Auswertung erfolgte in einem Applied Biosystems Abi Prism 7700 Sequence Detection-Gerät. Mit Hilfe der erhaltenen CT- Werte aus den Reaktionen für das Zielgen (hier: HCV) und das zelluläre Referenzgen (hier: 18s RNA) wird die relative Expression errechnet wie beschrieben unter: Abi Prism 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2: Relative Quantification of Gene expression (P/N 4303859).
Tabelle A fHCV-RNA-Replikationsassav)
Figure imgf000038_0001
2. Aktivitätsbestimmung der RNA-abhängigen RNA-Polymerase (NS5B) des Hepatitis C Virus in Anwesenheit und Abwesenheit von Testsubstanzen
Ausgehend von dem Plasmid pBac5B-Chis (Lohmann V, Koerner F, Herian U und Bartenschlager R, J. Virol. 71 (1997) 8461-8428), welches die vollständige DNA-Sequenz eines rekombinanten NS5B-Gens aus dem Hepatitis C Virus Genotyp Ib enthält, wird per Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eine DNA-Sequenz amplifϊziert (Sambrock J und Rüssel DW, CoId Spring Harbor Press, New York (2001)), die für ein um 21 Aminosäuren am Carboxyl-Terminus verkürztes NS5B- Protein kodiert. Durch die Verwendung der PCR-Primer 5B21AAUP1 (51- AATTGCTAGCATGTCCTACACATGGACAGGCGCCCTGA-S1) und 5B21AAD1 (51- TATACTCGAGGCGGGGTCGGGCACGAGACAGGCT-S') kann das PCR-Produkt in den TI- Expressionsvektor pET21b (Novagen) über die Erkennungsschnittstellen für die Restriktionsendo- nukleasen NAeI und Xhol kloniert werden. Mit dem so konstruierte Plasmid pET21ΝS5Bt wird ein NS5B-Protein exprimiert, welches die Aminosäuren 2420 bis 2989 des HCV Vorläufer- Polyproteins und eine Poly-Histidin-Fusion am Carboxyl-Terminus trägt. Die Expression und Reinigung einer solchen rekombinanten NS5B-Variante im heterologen Wirt Escherichia coli BL21(DE3) (Novagen) wurde bereits mehrfach beschrieben (Ferrari E, Wright-Minogue J, Fang JWS, Baroudy BM, Lau JYN und Hong Z, J. Virol. 73 (1999) 1649-1654; Tomei L, Vitale RL, Incitti I, Serafini S, Altamura S, Vitelli A und DeFrancesco R, J. Gen. Virol. 81 (2000) 759-767). BL21(DE3)-Zellen, die mit dem Plasmid pET21NS5Bt transformiert wurden, werden bis zu einer optischen Dichte O.D. (600 nm) = 0.6 bei 370C in LB-Medium (zuzüglich 100 μg/ml Ampicillin) geschüttelt und anschließend mit 0,5 mM IPTG (Isopropyl-beta-D-Thiogalaktopyranosid) induziert. Zur Verhinderung von Zelleinschlusskörpern erfolgt eine 4-stündige Expression bei 200C bis 250C. Die Zellsedimente, die durch Zentrifugation gewonnen werden (20 min; 5000 x g; 4°C), werden auf eine O.D. (600 nm) = 50 bis 500 in Zeilaufschlusspuffer (50 mM NaH2PO4; 5 mM Tris-HCl (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan) pH 8,0; 25 mM Imidazol; 10 mM MgCl2; 500 mM NaCl; 0,1 %(v/v) ß-Mercaρto-Ethanol; 1 mM EDTA (Ethylendiamin-N,N,N',N'-tetraacetat); 10 %(v/v) Glycerol; 1 Tablette/50 ml Complete (Roche); 10 μg/ml DNase I) konzentriert und an- schließend mit Ultraschall (10 x 30 s; 200 Watt; O0C) aufgeschlossen. Die lösliche Proteinfraktion, die von der unlöslichen Proteinfraktion durch Zentrifugation (20 min; 10000 x g; 40C) getrennt wird, wird sterilfϊltriert (< 0.45 μm) und auf eine mit Zeilaufschlusspuffer equilibrierte Ni-NTA- Säule (Nickel-Nitrilotriessigsäure, Qiagen) aufgetragen. Nach der Probenaufgabe erfolgt ein Waschschritt mit 10 Säulenvolumen Zellaufschlusspuffer und anschließend mit 20 Säulenvolumen Waschpuffer (50 mM NaH2PO4; 5 mM Tris-HCl pH 8,0; 25 mM Imidazol; 10 mM MgCl2; 500 mM NaCl; 0,1 %(v/v) ß-Mercapto-Ethanol; 1 mM EDTA; 10 %(v/v) Glycerol). Die Proteinelution erfolgt mit einem Imidazol-Stufengradient (Waschpuffer supplementiert mit 50 mM, 10O mM, 250 mM und 500 mM Imidazol) mit jeweils 5 Säulenvolumen pro Imidazol-Sufe. Während der Elution werden Fraktionen von 1 bis 2 ml Volumen aufgefangen und in einer SDS- PAGE analysiert. Die NS5B-haltigen Fraktionen werden vereinigt und mit Hilfe einer PDIO-Säule (Amersham) nach Angaben des Herstellers in Lagerpuffer (25 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,3 M NaCl; 10 mM MgCl2; 5 mM DTT (Dithiothreitol); 1 mM EDTA; 0,1% n-Dodecyl-maltoside; 30% Glycerol) umgepuffert und bei -800C gelagert. Als Mock-Kontrolle wird mit einem Proteinextrakt, der aus mit dem Leervektor pET21b transformierten Escherichia coli BL21(DE3)-Zellen ge- wonnen wurde, analog verfahren.
Zum Nachweis der NS5B-Aktivität wird eine RNA-Polymerase katalysierte Primer-Elongations- Reaktion durchgeführt wie sie bereits beschrieben wurde (Ferrari et al., 1999; Tomei et al., 2000). Dabei wird ein einzelsträngiges, homopolymeres RNA-Template (poly(rA) (Amersham)) mit Hilfe von RNA-Primern (oligo(rU)i2 (Eurogentec)) und dem Substrat UTP zu einer doppelsträngigen RNA-Duplex umgesetzt. Bei Verwendung von radioaktiv markiertem UTP z.B. [32P]-UTP kann der Einbau des Substrats quantifiziert werden. In Abweichung zu der Großzahl von publizierten Assayformaten wird Tritium markiertes UTP ([3H]-UTP ([556-3H]-Uridin-5'-Triphosphat), Perkin Eimer) anstelle von [32P]-UTP verwendet, wie es bereits bei Uchiyama et al. (Uchiyama Y, Huang Y, Kanamori H, Uchida M, Doi T, Takamizawa A, Hamakubo T und Kodama T, Hepatol. Res. 23 (2002) 90-97) Verwendung fand. Ein Reaktionsansatzt enthält 6 μg/ml poly(rA), 90 nM oligo(rU)i2, 5 μM UTP und 16 μCi/ml [3H]-UTP und in 90 μl Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5; 25 mM KCl; 5 mM MgCl2; 1 mM EDTA; 1 mM DTT; 0,01% (w/v) BSA; 0,5 (v/v) DMSO; 100 U/ml RNasin (Promega)). Soll die Wirkung von Substanzen auf die Polymerase- aktivität getestet werden, wird die zu testende Substzanz in gewünschter Konzentration vor der Zugabe von Template, Primer und Substrat dem Reaktionsansatz zugesetzt. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 12,5 nM NS5B-Protein gestartet und bei 3O0C inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 120 min wird die Reaktion mit 1 Volumen eiskaltem Stoppuffer 1 (0,2 M EDTA; 100 μg/ml Kalbsthymus DNA) gestoppt und in 4 Volumen Stopplösung 2 (10 % (w/v) Tri-Chlor- Essigsäure; 0,5% (w/v) Natrium Pyrophosphat für 30 min auf Eis gefällt. Das Präzipitat wird auf GF/C-Filter im 96er- Well Mikrotiterplatten-Format (Millipore) übertragen und 3 mal mit Waschlösung 1 (1% (w/v) Tri-Chlor-Essigsäure; 0,1 % (w/v) Natrium Pyrophosphat) und 2 mal mit 95% (v/v) Ethanol gewaschen. Die getrockneten Filter werden mit Szintillationsfiüssigkeit (Liquid Scintillation Cocktails Ultima Gold XR, Packard Instruments) versetzt, weitere 30 min inkubiert und anschließend mit einem Microbeta Counter (1450 Microbeta Plus, Wallac) nach Angaben des Herstellers ausgelesen. Die eingebaute Menge [3H]-UTP bzw. die gemessenen CPM (counts per minute) sind ein Maß für die Aktivität der NS5B-Polymerase. Zur Bestimmung der IC50- Werte wird in einer Dosis-Wirkungskurve der relative Einbau von [3H]-UTP gegen die Konzentration der eingesetzten Testsubstanz aufgetragen. Die IC50- Werte werden mit Hilfe der Analysesoftware GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software, INC) unter Benutzung der Funktion „Sigmoidale Dosis-Wirkungskurve mit variabler Steigung" ermittelt. Als Bezugsgröße wird der relative Einbau an [3H]-UTP ohne Zusatz einer Testsubstanz verwendet.
C. Ausführungsbeispiele für pharmazeutische Zusammensetzungen
Die erfϊndungsgemäßen Verbindungen können folgendermaßen in pharmazeutische Zubereitungen überführt werden:
Tablette:
Zusammensetzung: 100 mg der Verbindung von Beispiel 1, 50 mg Lactose (Monohydrat), 50 mg Maisstärke (nativ), 10 mg Polyvinylpyrolidon (PVP 25) (Fa. BASF, Ludwigshafen, Deutschland) und 2 mg Magnesiumstearat.
Tablettengewicht 212 mg. Durchmesser 8 mm, Wölbungsradius 12 mm. .
Herstellung: Die Mischung aus Wirkstoff, Lactose und Stärke wird mit einer 5%-igen Lösung (m/m) des PVPs in Wasser granuliert. Das Granulat wird nach dem Trocknen mit dem Magnesiumstearat für 5 min. gemischt. Diese Mischung wird mit einer üblichen Tablettenpresse verpresst (Format der Tablette siehe oben). Als Richtwert für die Verpressung wird eine Presskraft von 15 kN verwendet.
Oral applizierbare Suspension:
Zusammensetzung: 1000 mg der Verbindung von Beispiel 1, 1000 mg Ethanol (96%), 400 mg Rhodigel (Xanthan gum der Fa. FMC, Pennsylvania, USA) und 99 g Wasser.
Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 10 ml orale Suspension.
Herstellung: Das Rhodigel wird in Ethanol suspendiert, der Wirkstoff wird der Suspension zuge- fügt. Unter Rühren erfolgt die Zugabe des Wassers. Bis zum Abschluss der Quellung des Rhodigels wird ca. 6 h gerührt.
Oral applizierbare Lösung:
Zusammensetzung: 500 mg der erfϊndungsgemäßen Verbindung, 2.5 g Polysorbat und 97 g PoIy- ethylenglycol 400. Einer Einzeldosis von 100 mg der erfindungsgemäßen Verbindung entsprechen 20 g orale Lösung.
Herstellung: Die erfindungsgemäße Verbindung wird in der Mischung aus Polyethylenglycol und Polysorbat unter Rühren suspendiert. Der Rührvorgang wird bis zur vollständigen Auflösung der erfϊndungsgemäßen Verbindung fortgesetzt. i.v.-Lösung;
Die erfϊndungsgemäße Verbindung wird in einer Konzentration unterhalb der Sättigungslöslichkeit in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel (z.B. isotonische Kochsalzlösung, Glucose- lösung 5% und/oder PEG 400-Lösung 30%) gelöst. Die Lösung wird steril filtriert und in sterile und pyrogenfreie Injektionsbehältnisse abgefüllt.

Claims

Patentansprüche
1. Verbindung der Formel
Figure imgf000043_0001
in welcher
R1 für (CrC6)-Alkyl, (C3-C6)-Cycloalkyl oder Phenyl steht,
wobei Alkyl, Cycloalkyl und Phenyl substituiert sein können mit 1 bis 2 Sub- stituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Amino, (Ci-C6)-Alkylamino, 5- bis 7- gliedrigem Heterocyclyl und Phenylsulfonylamino,
worin Phenylsulfonylamino seinerseits substituiert sein kann mit 1 bis 3 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Fluor, Chlor, Hydroxy, Amino, Trifiuormethyl, Trifluormethoxy, Methyl und Methoxy,
R2 für verzweigtes (C3-C5)-Alkyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Tetrahydrofuranyl, Pyrrolidinyl, Tetrahydro-2H-pyranyl, Piperidinyl, Tetrahydro- 2H-thiopyranyl, Oxidotetrahydro-2H-thiopyranyl oder l,l-Dioxidotetrahydro-2H- thiopyranyl steht,
wobei Alkyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Amino, Methoxy, (CrCβJ-Alkylamino, Methylthio, Methylsulfonyl, Methylsulfoxyl oder Methoxycarbonyl,
R3 für Cyclohexyl steht,
wobei Cyclohexyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy und (Ci-C3)-Alkyl, oder eines ihrer Salze, ihrer Solvate oder der Solvate ihrer Salze.
2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
R1 für Isopropyl, tert.-Butyl, Cyclopropyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl steht,
wobei Isopropyl, Cyclopropyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl substituiert sein können mit einem Substituenten, wobei der Substituent ausgewählt wird aus der
Gruppe, bestehend aus Hydroxy und Amino,
R2 für verzweigtes (C3-Cs)-AIlCyI, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Tetrahydro- 2H-pyranyl, Piperidinyl, Tetrahydro-2H-thiopyranyl, Oxidotetrahydro-2H- thiopyranyl oder l,l-Dioxidotetrahydro-2H-thiopyranyl steht,
wobei Alkyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die
Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Methoxy, Dimethylamino, Methylthio, Methylsulfonyl, Methylsulfoxyl oder Methoxycarbonyl,
R3 für Cyclohexyl steht,
wobei Cyclohexyl substituiert sein kann mit 1 bis 2 Substituenten, wobei die
Substituenten unabhängig voneinander ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy und Methyl.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R2 für Isopropyl steht.
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass R3 für trans- 4-Methylcyclohexyl steht.
5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel
(H),
Figure imgf000044_0001
in welcher
R1, R2 und R3 die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, und
R4 für Alkyl, bevorzugt Methyl, Ethyl oder tert.-Butyl, steht,
mit einer Base oder einer Säure umgesetzt wird.
6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
7. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Krankheiten.
8. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Virusinfektionen.
9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Virusinfektion eine Infektion mit dem Hepatitis C Virus oder einem anderen Vertreter der Gruppe der Flaviviridae ist.
10. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung, wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert, in Kombination mit einem weiteren Wirkstoff.
11. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in Kombination mit einem inerten, nichttoxischen, pharmazeutisch geeigneten Hilfsstoff.
12. Arzneimittel nach Anspruch 11 zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Virusinfektionen.
13. Verfahren zur Bekämpfung von Virusinfektionen in Menschen und Tieren durch Verabreichung einer antiviral wirksamen Menge mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, eines Arzneimittels nach Anspruch 10 oder 11 oder eines nach einem der Ansprüche 7 oder 9 erhaltenen Arzneimittels.
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