WO2006064115A1 - UTILISATION DE SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES INTERAGISSΑΝΤ PREFERENTIELLEMENT AVEC LE COMPLEXE DE TRANSCRIPTION PPAR α - Google Patents

UTILISATION DE SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES INTERAGISSΑΝΤ PREFERENTIELLEMENT AVEC LE COMPLEXE DE TRANSCRIPTION PPAR α Download PDF

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WO2006064115A1
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polynucleotide
ppar
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pparα
seq
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PCT/FR2005/003099
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English (en)
Inventor
Eric SEREE PACHA
Pierre-Henri Villard
Yves Barra
Jean-Marc Pascussi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism

Definitions

  • the present invention relates to the use of a polynucleotide comprising a sequence of formula (I): - TGACCTNOGGGCT-, in which N represents any natural or synthetic nucleotide base and O represents an A, T or U base, characterized in that said sequence of formula (I) or complementary to (I) allows the selective interaction of said polynucleotide with one or more constituent elements of the PPAR ⁇ transcription complex.
  • PPAR Peroxisome Proliferator Activated Receptor
  • Steroid hormone receptors regulate the expression of many genes including those involved in cell differentiation and energy metablolism of the cell. In particular, they regulate signaling pathways essential to cell life, by providing a certain balance of lipid and carbohydrate levels circulating in the body [Berger J. and Moller DE (2002) Ann. Rev. Med. 53: 409-35].
  • fatty acids such as linoleic acid
  • Some carbohydrates act indirectly via hormonal intermediates, such as insulin production, which modify PPAR and thereby activate the conversion of glucose to glycogen in the liver by activation of hepatic glucokinase expression.
  • PPAR is present in the human body in the form of several protein structures. There are three types of structures: PPAR alpha (liver, digestive tract, kidneys %), PPAR gamma (adipose tissue and macrophage %) and PPAR beta or delta (expressed ubiquitously).
  • PPAR transcription factors to exert their transactivating activity, act in the form of a PPAR / RXR heterodimeric complex which recruits other proteins including coactivators. Under the influence of more or less specific ligands, the PPAR / RXR complex is activated.
  • the PPAR / RXR complex binds to particular DNA sequences, called PPRE (peroxisome proliferator activated receptor element). These sequences are part of the PPAR-regulated target gene promoter.
  • PPRE peroxisome proliferator activated receptor element
  • Ligands for preferentially activating the PPAR ⁇ and PPAR ⁇ transcription complexes have been identified and used as hypolipidemic and hypoglycemic agents in the treatment of certain metabolic diseases such as hypertriglyceridemia and diabetes mellitus. type II. [Kersten S, Desire B, Wahlie W (2000) Nature 405: 421-4].
  • the following ligands can thus be mentioned: PPAR ⁇ : fibrates such as fenofibrate and bezafibrate (synthetic ligands);
  • PPAR ⁇ thiazolidinediones, such as rosiglitazone and troglitazone (synthetic ligands);
  • the binding experiments make it possible to analyze the binding of a molecule on its molecular target and to determine its affinity. These experiments, although applicable to screening, do not make it possible to determine whether the molecule is is an agonist, inverse agonist, antagonist agonist or antagonist of the target.
  • the reporter gene techniques consist in evaluating the regulatory activity of a nucleic sequence by its action on the expression of a reporter gene. This reporter gene is not expressed in the organism studied and its expression is easily analyzed and quantified. This technology makes it possible to know if a new molecule activates the studied sequence. On the other hand, it does not make it possible to know specifically the transcription factor involved. All of these experiments alone do not provide any direct information on the specificity of action that the new ligand is capable of conferring on PPAR.
  • polynucleotides including the sequence of formula (I) or complementary to (I) as described below, could be used in processes and kits for characterizing the activity of transcription of PPAR. These uses make it possible in particular to identify new compounds (DNA sequences or ligands) capable of interacting with PPAR, and thus improve the diagnosis and treatment of metabolic diseases related to a modification of PPAR activity.
  • the subject of the present invention is therefore the use of a polynucleotide comprising i) a sequence of general formula (I):
  • A, C, G and T respectively denote the bases adenine, cytosine, guanine and thymine
  • N represents any natural or synthetic nucleotide base
  • O represents a base which is A (adenine), T (thymine) or U (uracil) ); or ii) a sequence complementary to (I) as defined under i), said sequence (I) or complementary to (I) allowing the selective interaction of said polynucleotide with one or more constituent elements of the PPAR ⁇ transcription complex, said use has for the purpose of directly evaluating the transcriptional activity of PPAR, in particular when it is in the PPAR ⁇ form, and indirectly the PPAR ⁇ transcriptional activity.
  • transcription activity is meant that the coding sequence of a gene is transcribed as RNA.
  • the transcription is carried out thanks to a transcription complex, which comprises the PPAR transcription factor associated with a certain number of constituent secondary elements, such as auxiliary proteins and ligands. These ancillary elements determine the specificity, or even the selectivity, of the complex of transcription.
  • PPAR ⁇ corresponds to an isoform of the PPAR family. It has the ability to activate, within the PPAR ⁇ transcription complex, the transcription of a set of genes called "genes under control of PPAR ⁇ ".
  • a polynucleotide is usable according to the invention also when it comprises the inverse sequence complementary to (I) in the two possible orientations (5 '-> 3' or 3 '-> 5'), this is the case for example the SEQ ID No. 2 which is the reverse complementary sequence of SEQ ID No. 1:
  • a polynucleotide corresponding to one of the following nucleotide sequences will be used: SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. ° 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18:
  • GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID NO: 3) CCGGAAGGCCGGGGCACTGGAGTCCCGACCCCAGCGTC (SEQ ID NO: 4) GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCTGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID NO: 5) CCGGAAGGCCGGGGCACTGGAGACCCGACCCCAGCGTC (SEQ ID NO: 6) TCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID NO: 7) AGGCCGGGGCACTGGAGTCCCGACCCCAGCGTC (SEQ ID NO: 8) TCCGGCCCCGTGACCTCTGGGCTGGGGTCGCAG ( SEQ ID No. 9) AGGCCGGGGCACTGGAGACCCGACCCCAGCGTC (SEQ ID NO: 10)
  • the sequence of formula (I) or complementary to (I) can thus be or be inserted theoretically at any point of a polynucleotide, whatever its size and orientation.
  • the polynucleotide according to the invention may be a single-stranded or multi-stranded DNA.
  • a polynucleotide according to the invention has at least 13 nucleotides, preferably at least 20, and more preferably at least 30 nucleotides.
  • a polynucleotide that can be used according to the invention can comprise, in addition to the sequence of formula (I) and complementary to (I), other sequences necessary for the demonstration of a transcription activity [Molecular Biology and Medicine, Kaplan JC and Delpech M, Ed Medicine-Science Flammarion ISBN: 2-257-12488-X], such as a transcription initiation site (basic promoter).
  • polynucleotide whose use is described above may comprise, in addition to the sequence of formula (I) or complementary to (I), an additional sequence of PPRE type, that is to say a sequence of DNA capable of interacting with a PPAR type transcription complex, in ⁇
  • Said polynucleotide may also comprise the sequence of a gene whose transcription is usually placed under the control of PPAR, or only the promoter sequence of this gene.
  • the polynucleotide may also include the sequence of a reporter gene. Transcription of the coding sequence of said reporter gene may, depending on the case, be placed under control of a PPRE ⁇ or PPRE ⁇ / ⁇ type sequence or in fusion with the promoter of a gene under control of PPAR ⁇ , PPAR ⁇ or PPAR ⁇ . / ⁇ .
  • the transcription of the coding sequence of the reporter gene is under total or partial control of a polynucleotide comprising a sequence of formula (I) or complementary to (I) as described above.
  • the PPAR transcription complex interacts with the sequence (I) or complement of (I) in the presence of a specific ligand thereof.
  • sequence of formula (I) or complementary to (I) is at a distance of between 40 and 300 base pairs, more preferably between 50 and 150, upstream of a transcription initiation site.
  • sequence of formula (I) and / or complementary to (I) can be inserted into the promoter part of a gene so that the transcription of this gene is placed under control of the PPAR ⁇ complex.
  • the promoter sequence of the gene acquires the properties of a PPRE ⁇ type sequence.
  • Another subject of the invention consists of an expression vector comprising at least one sequence of formula (I) or complementary to (I) as defined above and a reporter gene.
  • Another subject of the invention consists of a host cell transformed using one of the vectors defined above.
  • a host cell can serve as a biological system for qualitative and quantitative evaluation of PPAR transcription activity.
  • the reporter genes used may be for example: the chloramphenicol acetyl transferase gene; the Luciferase gene; the gene of the Green Fluorescent Protein; the ⁇ -galactosidase gene;
  • SEAP SEcreted Alkaline Phosphatase gene
  • ZsGreen gene ZsGreen gene
  • the GAL 4 gene (in the case of an indirect GAL4-UAR system in eukaryotic cells)
  • vectors that can be used for the purpose of transferring this reporter system into prokaryotic or eukaryotic cells, mention may be made of: plasmids such as psG3 , psG5, pBLCAT2, pCATpromoter, pSEAP2-control, pEGFP-1, pHRed1-1, pECFP-1, pCMV-DsRed-Express - phages such as lambda phage;
  • adenoviruses such as pDNR-CMV, pShuttle2 or pTRE-Shuttle2; retroviruses such as PIp-LNCX ...
  • Different cellular models can be envisioned as host cells.
  • Some cells like prokaryotes and yeasts do not naturally express PPAR and RXR. It is therefore necessary, beforehand, to transform them with the cDNAs coding for PPAR and RXR.
  • the bacteria that can be used for this purpose are, for example, two clones of Escherichia coli BL21 and JM83, and, as regards yeasts, various clones of Saccharomyces cerevisiae.
  • Some insects express RXR (Usp gene) but not PPAR, it is therefore necessary in this case to transfer them with the cDNAs encoding PPAR.
  • the insect cells that may be suitable include, for example, the Drosophila melanogaster S2 and Sf21 cell lines.
  • Mammalian cells especially rodent cells (murine preadipocyte 3T3-L1, etc.), express both PPAR ⁇ and RXR ⁇ .
  • rodent cells murine preadipocyte 3T3-L1, etc.
  • PPAR ⁇ and RXR ⁇ express both PPAR ⁇ and RXR ⁇ .
  • the ligand specificity for PPAR may vary depending on the species. It will therefore first be necessary to check it before extrapolating the results to the man.
  • the cells of human origin are hosts of choice, especially those expressing PPAR ⁇ important levels such as adipocytes (cells in primary culture ...) and enterocytes (CaCo-2, HT29 ). Transfection of these cells with cDNA coding for PPAR ⁇ makes it possible to increase the sensitivity. In the context of an application for high throughput screening, it is recommended to preferentially use adherent cells grown in multiwell plates.
  • a polynucleotide that can be used according to the invention can be obtained in different ways. Originally, the sequence SEQ ID No. 1 was characterized from a human gene. The polynucleotides according to the invention can however be reproduced by direct and programmed chemical synthesis or else cloned into a vector in order to be replicated in a transformed host cell. Another way of obtaining a polynucleotide according to the invention is to amplify a PPRE ⁇ sequence of interest by PCR (polymerase chain reaction) from a DNA preparation.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the present invention is based on the particular interaction properties possessed by the sequence of formula (I) or complementary to (I) for the PPAR ⁇ complex, in particular physical binding properties. These properties, not previously described, make it possible to characterize a PPAR type transcription activity, and more particularly make it possible to discriminate a PPAR ⁇ type transcription activity with respect to PPAR ⁇ .
  • a use according to the invention thus makes it possible to differentiate a PPAR ⁇ type transcription activity, in the presence of other types of transcriptional activity.
  • a use according to the invention thus makes it possible to detect a PPAR ⁇ type transcription activity in a given biological medium. This also makes it possible to characterize new sequences of the PPRE type, which may have been identified, for example, in a genomic DNA preparation.
  • a polynucleotide as described above can be used according to the invention as a hybridization probe, for example, for the purpose of detecting new PPRE sequences in a DNA preparation, containing in particular new PPRE ⁇ sequences.
  • a polynucleotide as described above may be used according to the invention to diagnose genetic abnormalities that may be at the origin of metabolic diseases, in particular diseases related to a dysregulation of the expression of genes under PPAR control. , and more particularly diseases related to a change in the transcriptional activity of PPAR, such as hypertriglyceridemia, type II diabetes or lipodystrophies.
  • a polynucleotide as defined above can be used to assay a PPAR transcription complex, preferably PPAR ⁇ , or one of its constituent elements, in a biological sample, using more particularly the adhesion properties encountered between said complex and the sequence of formula (I) or complementary to (I).
  • the assay can be carried out as follows: 1) solid phase binding of a polynucleotide as defined in claim 1; 2) bringing into contact a sample in which PPAR ⁇ or a component of the PPAR ⁇ complex is to be quantified;
  • solid supports such as microplates, magnetic beads or polystyrene, microparticles, chromatography gels.
  • a preferred attachment technique is to fix the polynucleotides on a microplate using streptavidin / biotin binding.
  • a polynucleotide as defined above can be used to identify a ligand capable of selectively activating or inhibiting the PPAR ⁇ transcription complex.
  • the invention may consist, for example, in a method for demonstrating a physical interaction between transcription factors and a polynucleotide as described above.
  • This method according to the invention is characterized in that it comprises the following steps: 1) labeling of a usable polynucleotide according to the invention;
  • the PPAR ⁇ protein can be labeled, as well as the molecules associated with it, in order to characterize PPRE-type sequences.
  • the invention may then consist of a method for determining the specificity of a PPRE type nucleotide sequence, characterized in that it comprises the following steps:
  • PPAR-RXR complex detection of molecular complexes formed around the labeled PPAR-RXR complex.
  • the labeling of the polynucleotide, PPAR (or PPAR-associated proteins), for the purpose of detection, can be radioactive (32P, 33P %), immunoenzymatic (cold probes, etc.), chemical (Bromide ethidium %) or be carried out according to any other technique known to those skilled in the art. It is considered here that a compound is capable of interfering with the PPAR transcription activity when it binds to the sequence of formula (I) or complementary to (I) or when it binds to one of the elements constituents of the PPAR transcription complex.
  • a preferred conventional method for evaluating complexes formed around PPAR is the technique of gel delay (EMSA: Electrophoretic Mobility Shift Assay) [Molecular Biology and Medicine, Kaplan JC and Delpech M, Ed Medicine-Sciences Flammarion ISBN: 2 -257-12488-X].
  • ESA Electrophoretic Mobility Shift Assay
  • the delay gel technique consists in electrophoretically migrating the complexes formed or not between the transcription factors and the target DNA sequences so that they can be compared according to their electrophoretic distance on a gel.
  • This technique is ideally used for polynucleotides of 15 to 80 nucleotides, preferably between 20 and 50 nucleotides.
  • the presence of a unique PPRE ⁇ site and a micro environment minimizes the possible interference with other transcription factors.
  • control polynucleotide in which the sequence of formula (I) or complementary to (I) has been mutated or has undergone a deletion.
  • a control polynucleotide according to the invention may consist, for example, of the sequences SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 19 and SEQ ID No. 20.
  • polynucleotides with a different specificity for the PPAR complex consisting, for example, of PPRE ⁇ or PPRE ⁇ / ⁇ type sequences.
  • the transcription activation properties conferred by the sequence of formula (I) or complementary to (I) make it possible to evaluate the transcriptional activity of PPAR, more particularly of PPAR ⁇ , in the presence of certain compounds or mixtures of compounds.
  • the invention may thus consist of a method for detecting, via a host cell, compounds capable of increasing or decreasing the transcriptional activity of PPAR ⁇ , consisting in placing a reporter gene under the control of one or more several PPRE sequences, in particular
  • PPRE ⁇ and compare the expression profiles obtained in the presence of different compounds or mixtures of compounds. This technique makes it possible, for example, to test the incidence of a compound or a mixture of compounds on the PPAR interaction on said PPRE-type sequences.
  • the invention may also consist in demonstrating compounds capable of increasing or decreasing the transcription activity of PPAR ⁇ using an expression system comprising a reporter gene.
  • This method consists of the following steps: 1) transformation of a host cell with the aid of a polynucleotide that can be used according to the invention, comprising a PPRE ⁇ sequence and a reporter gene;
  • step 2 2) culturing of the host cell obtained in step 1);
  • step 2) contacting the host cell cultured in step 2) with the compound or the mixture of compounds to be tested; 4) detection of expression of the reporter gene.
  • the reporter gene is placed under the control of PPAR ⁇ , but it is also possible to use a two-component system of GAL4 / UAR type in which the reporter gene is indirectly placed under the control of PPAR ⁇ .
  • the expression of the reporter gene is detected according to the most suitable technique (enzymatic assay, protein quantification, immunoassay, etc.), depending on the nature of the product expressed.
  • enzyme assay enzyme assay
  • protein quantification protein quantification
  • immunoassay immunoassay
  • a control host cell can be transformed using a control polynucleotide as defined previously, incapable of interacting with PPAR, because the sequence of formula (I) has been mutated, or has undergone a deletion. It is then possible to compare the results obtained between the control host cell and the PPAR ⁇ -sensitive host cell.
  • Such a method comprises the following steps:
  • control polynucleotide as defined above, that is to say a polynucleotide that can be used according to the invention, in which the sequence of formula (I) or complementary of (I) has been mutated or deleted;
  • a transcription activity in a heterologous manner by inserting a polynucleotide that can be used according to the invention at the level of the promoter of a gene in a vector or a transgenic organism. This insertion must make it possible to place the transcription of said gene. under the control of the PPAR ⁇ complex.
  • the promoter sequence thus created then has the main characteristics of a PPRE ⁇ type sequence as defined above.
  • polynucleotides corresponding to SEQ ID Nos. 7, 8, 9 and 10 are more preferably used for gel retardation methods or using a solid support and that the polynucleotides corresponding to SEQ ID No. 3, 4, 5 and 6 are used more preferably for the processes described above using a reporter gene.
  • Another aspect of the invention consists of a kit using the interaction properties between the polynucleotides as described above and the PPAR complex, in particular PPAR ⁇ , which makes it possible, in particular, to characterize the interactions between PPRE-type polynucleotide sequences and the complexes. transcription type PPAR.
  • a kit according to the invention uses at least one polynucleotide as defined in the invention, and optionally, one or more polynucleotide sequences of PPRE ⁇ and PPRE ⁇ / ⁇ type, thus making it possible to compare simultaneously the different types of polynucleotide. interactions that may exist between different types of PPRE and PPAR type sequences.
  • the general principle of a kit according to the invention is to bring the abovementioned polynucleotides into contact with a purified protein preparation PPAR and RXR, and then to detect the complexes formed preferentially between said proteins and the polynucleotide sequences defined above.
  • the polynucleotides are fixed on a support that can be, for the purposes of high throughput screening, in the form of wells, tubes or balls.
  • At least one of the PPAR and RXR proteins or nucleotide sequence present in the kit may be labeled for the purposes of detecting the interaction complexes formed.
  • reaction complex is meant the set formed by the PPAR transcription complex and the polynucleotide to which it is attached (PPAR + PPRE).
  • a preferred variant of a kit according to the invention consists of a high-throughput screening kit making it possible to demonstrate the binding of a specific ligand of PPAR.
  • the polynucleotides attached to a support and the PPAR-RXR proteins are brought into contact in the presence of a specific substrate labeled with the PPAR ⁇ , PPAR ⁇ or PPAR ⁇ / ⁇ complex.
  • specific substrate is meant a natural or synthetic chemical molecule that is known to be a ligand of one or more members of the family PPAR.
  • a test molecule preferably a potential ligand of PPAR
  • a test molecule is introduced into the reaction medium. If this molecule is capable of acting as ligand of a particular form of PPAR, such as PPAR ⁇ , then displacement by the test molecule of the binding equilibrium existing between the labeled specific substrate and the PPAR proteins occurs. -RXR within the reaction medium. Quantification of the labeled molecule in the free or bound phase of the system reflects the degree of interaction of the test molecule with the PPAR / RXR complex.
  • the PPAR activity can be determined, for example, in a protein extract extracted from the nucleus of a previously treated cell.
  • the PPAR and RXR proteins are brought into contact with at least one polynucleotide, as previously described (PPAR or RXR being preferably labeled), under the conditions permitting the binding of PPAR-RXR to the polynucleotide sequences, more particularly a sequence of formula (I) or complementary to (I).
  • Different dilutions of the nuclear protein extract to be tested are then incubated in the presence of the interaction complexes formed.
  • the proteins contained in the extract are capable of binding to a PPRE-type nucleotide sequence, such as for example PPRE ⁇
  • a PPRE-type nucleotide sequence such as for example PPRE ⁇
  • the quantification of the free or bound labeling makes it possible to indicate whether the nuclear extract contains PPARs capable of binding to a particular PPRE sequence, such as PPRE ⁇ .
  • a PPRE sequence is of PPRE ⁇ , PPRE ⁇ or PPRE ⁇ / ⁇ type.
  • PPRE sequences of known specificity such as polynucleotides comprising a sequence of formula (I) or complementary to (I) are brought into contact with a pre-labeled preparation of PPAR-RXR proteins, so as to form PPRE / PPAR-complexes. RXR.
  • the potential PPRE sequence whose specificity is to be tested is then added to the reaction medium.
  • the principle is to put the PPRE sequence of unknown specificity in competition with the PPRE sequences of known specificity, in their binding with PPAR.
  • the affinity of the PPAR-RXR proteins for the PPRE sequence tested in the medium is high, the initial binding equilibrium that appeared, for example, between the PPAR ⁇ complex and the PPRE ⁇ -type polynucleotides is modified. In this case, it is established that the PPRE sequence has a higher or equivalent affinity for PPAR ⁇ to the known PPRE ⁇ type sequence used.
  • the labeling of one of the kit proteins makes it possible to detect the modifications within the interaction complexes.
  • a kit according to the invention generally comprises at least: a preparation of at least one polynucleotide that can be used according to the invention, selectively binding PPAR ⁇ ; a preparation of the purified PPAR-RXR proteins of which at least one of the members is labeled; a means for detecting labeled molecular complexes
  • any technical possibility making it possible to demonstrate a variation of the interactions between the polynucleotides used and the PPAR-RXR proteins and between the PPAR-RXR proteins and a ligand.
  • This technical possibility passes, for example, by the supply in the kit of radioactively or chemically labeled molecules, substrates, reagents or enzymes to reveal the labeling of the molecules present in the interaction complexes, products allowing the separation physics of molecules such as electrophoresis gels, chromatography gels, magnetic beads or precipitation reagents.
  • a kit according to the invention may further comprise a control polynucleotide as defined above in which the sequence of formula (I) is mutated or deleted, as well as sequences of PPRE ⁇ type or of type
  • a kit according to the invention may further comprise a means for supporting the abovementioned polynucleotides, such as wells, wells, tubes or balls.
  • a kit according to the invention may also comprise one or more specific substrates of the different isoforms of PPAR and / or RXR, and different specific or non-specific sequences of the different isoforms of PPAR.
  • a polynucleotide as defined above can still be used for the manufacture of a medicament for the treatment of a metabolic disease, more particularly a disease related to a modification of PPAR activity. such as hypertriglyceridemia and type II diabetes or lipodistrophies.
  • a medicament may comprise, in particular, polynucleotides which can be used according to the invention as antisense DNA or in the form of siRNA (a so-called hairpin structure will then be recommended), having the effect of inhibiting the interaction of PPAR with the sequence of formula (I) or complementary to (I) or be used as a decoy for PPAR ⁇ .
  • FIGURE 1 is a diagrammatic representation of FIG. 1 :
  • FIGURE 2 is a diagrammatic representation of FIGURE 1
  • the method comprises transforming a host cell capable of expressing a reporter gene with a vector comprising said reporter gene placed under the control of a PPAR-dependent promoter (construction No. 2) or of a PPAR ⁇ -dependent promoter comprising a polynucleotide according to the invention (construction No. 1).
  • a PPAR-dependent promoter construction No. 2
  • a PPAR ⁇ -dependent promoter comprising a polynucleotide according to the invention
  • FIGURE 3 is a diagrammatic representation of FIGURE 3
  • PPRE ⁇ and PPRE consensus ( ⁇ / ⁇ ) was treated with WY-14643 at 200 ⁇ M. This promoter has been transferred to the PPRE ⁇ site (PPRE ⁇ mut) and / or the site
  • PPREconsensus (PPREconsmut).
  • the histogram shows the level of expression of the reporter gene in the different situations (and control C). This experiment shows that the ligand used is selective from PPAR ⁇ .
  • FIGURE 4
  • FIGURE 5
  • FIGURE 6 is a diagrammatic representation of FIGURE 6
  • the pRNH25c expression plasmid of the CAT reporter gene is under the control of the human CYP1A1 gene promoter was used. This construct was generously donated by Dr. Hines (Hines RN, Mathis JM and Jacob CS, 1988, Carcinogenesis, vol 9, pages 1599-1605).
  • the promoter of the human CYP1A1 gene contains the sequence characterized as being specific for PPAR ⁇ comprising the sequence of formula (I) (PPRE ⁇ site).
  • Mutations Ia sequence of formula (I) were performed at the same plasmid pRNH25c via a technique of site-directed mutagenesis to modify one or more bases (Kit Quickchange Site-Directed Mutagenesis Stratagene ®) and modify PPRE ⁇ sites and PPRE ⁇ / ⁇ (common to the different PPAR members) present on the CYP1A1 promoter.
  • the protocol used is that recommended by the kit designer:
  • the primers used for the mutation of the PPRE ⁇ site are as follows:
  • PPRE ⁇ mut-sens ⁇ 'GGCCTTCCGGCCCCGTGAATTCAGGGCTGGGGTCGCAGCS '(SEQ ID N 0 H)
  • Mutant-antisense PPRE ⁇ 5'GCTGCGACCCCAGCCCTGAAJTCACGGGGCCGGMGGCCS '(SEQ ID NO: 12)
  • the primers used for the mutation of the PPRE ⁇ / ⁇ site are as follows:
  • PPRE ⁇ / y mut-sense ⁇ 'GGACGGGCCGCCTGACCTCGATCCCCTAGAGGGATGTCGS '(SEQ ID NO: 13)
  • Mutant-antisense PPRE ⁇ fy ⁇ 'CGACATCCCTCTAGGGGATCGAGGTCAGGCGGCCCGTCCS '(SEQ ID No. 14)
  • the bold and underlined bases correspond to the mutated bases.
  • the PPRE ⁇ site was transferred to obtain the "PPRE ⁇ / ⁇ + PPRE ⁇ mut" construct.
  • the PCR product (50 ⁇ l) is then subjected to enzymatic digestion mediated by 1 ⁇ l of Dpn I (10 units / ⁇ l).
  • Dpn I endonuclease is specific for methylated and hemi-methylated DNA.
  • this enzyme will digest the parental matrix with respect to the neo-synthesized DNA by PCR (unmethylated DNA).
  • the digestion performed, the neo-synthesized DNA is ligated using the enzyme T4 DNA ligase according to the following protocol:
  • the mutated plasmid thus obtained is used to transform Epicurial CoIi XL1-Blue Supercompetent CeIIs bacteria provided in the kit.
  • a clone is selected and amplified in 2 ml of NZY + culture medium containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin.
  • the preparation of the mutated plasmid DNA was performed using the NucleoBond® PC Kit (Macherey Nagel), according to the supplier's recommendations.
  • PPRE ⁇ / ⁇ + PPRE ⁇ mut and “PPRE ⁇ / ⁇ mut + PPRE ⁇ mut” are cultured at 37 ° C. for 18 h with shaking (225 to 250 rpm) in 150 ml of NZY + containing 50 ⁇ g / ml of ampicillin.
  • the plasmid DNAs are then extracted using the NucleoBond® PC 500 kit (Macherey Nagel) following the manufacturer's "High Copy” protocol.
  • the CaCo-2 human colonic adenocarcinoma line was seeded in 6-well dishes and grown in DMEM medium, 15% fetal calf serum, 2 mM L-glutamine, 1% amino acids non-essential (MEM 100X MEM solution from Life Technologies), 100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin; in an atmosphere containing 9% CO 2 .
  • the cells were treated for 48 h with 200 ⁇ M of WY-14643 (PPAR ⁇ -specific agonist) in a medium lacking fetal calf serum (since the fetal calf serum contains ligands of PPAR ⁇ ).
  • WY-14643 PPAR ⁇ -specific agonist
  • the cells were then rinsed three times with PBS and the CAT protein level was determined using the CAT-Elisa System® Kit (Roche Diagnostics) according to the supplier's recommendations.
  • the PPAR ⁇ , PPAR ⁇ and RXR ⁇ proteins were obtained by an in vitro transcription / translation system (TNT® T7 Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega). Briefly, 40 ⁇ l of TNT T7 quick master mix, 1 ⁇ l of 1 mM methionine, 1 ⁇ g of plasmid (plasmid expressing PPAR ⁇ or PPAR ⁇ or RXR ⁇ cDNA) and water qs 50 ⁇ l were incubated. for 60 minutes at 30 ° C.
  • PPRE Consensus F ⁇ 'CCGCCAAGCTTGCTCCGCCAGGTCACAGGTCACTAGS '(SEQ ID NO : 15)
  • PPRE ⁇ probe PPRE ⁇ -F: ⁇ 'GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAGCS '
  • PPRE ⁇ -R 5 'GCTGCGACCCCAGCCCTGAGGTCACGGGGCCGGAAGGCCS' (SEQ ID NO: 18)
  • PPRE ⁇ mule-F 5'GGCCTTCCGGCCCCGTGAATrCAGGGCTGGGGTCGCAGC3 '(SEQ ID NO : 19)
  • PPRE ⁇ mutated-R ⁇ 'GCTCGACCCCAGCCCTGAATTCACGGGGCCGGMGGCCS' (SEQ ID NO: 20)
  • PPRE ⁇ / ⁇ -F ⁇ 'GGACGGGCCGCCTGACCTCTGCCCCCTAGAGGGATGTCGS '(SEQ ID NO: 21)
  • PPRE ⁇ fy-R 5'CGACATCCCTCTAGG ⁇ GAGAGGT ⁇ AGGCGGCCCGTCC3' (SEQ ID NO: 22)
  • PPRE ⁇ / ymufé-F ⁇ 'GGACGGGCCGCCTGACCTCGATCCCCTAGAGGGATGTCGS '(SEQ ID NO: 23)
  • PPRE ⁇ / Vmufé-R ⁇ 'CGACATCCCTCTAGGGGATCGAGGTCAGGCGGCCCGTCCS' (SEQ ID NO: 24)
  • the oligonucleotides F and R were hybridized in the following manner: regenerate the oligonucleotides in water at a concentration of 1 ⁇ g / ml; in a tube, add 5 ⁇ l of oligonucleotide F, 5 ⁇ l of oligonucleotide R, 5 ⁇ l of hybridization buffer 1OX (0.5M Tris pH 8.0, MgCl 2 100 mM) and 35 ⁇ l of water; heat for 5 minutes at 100 0 C then allow to come down to room temperature.
  • 1OX 0.5M Tris pH 8.0, MgCl 2 100 mM
  • the double-stranded DNA probes are labeled with P 32 using T4 polynucleotide kinase (Invitrogen) as follows: in a tube add 1 ⁇ l of double-stranded DNA probe, 2 ⁇ l of forward buffer 1.5 ⁇ l of P 32 ATP (3000 Ci / mM, 10 mCi / ml), 4.5 ⁇ l of water and 1 ⁇ l of T4 polynucleotide kinase incubate at 37 ° C. for 30 minutes and add to the mixture 40 ⁇ l of water and 2 ⁇ l of water.
  • EDTA 0.5 M Purify the ProbeQuant G-50 micro column probes (Amersham Biosciences) according to the supplier's recommendations dilute the probe solution to obtain 50000 cpm / ⁇ l
  • the mixture was subjected to a vertical gel electrophoresis of 4% polyacrylamide (# 20 cm long gels) using a 45 mM Tris Base buffer containing 45 mM boric acid as a migration buffer. 1 mM EDTA. After separation, the gel was dried and autoradiography was performed by exposing the dried gel to a Kodak X-AR film.
  • the autoradiographic cliché makes it possible to visualize the different positions occupied by the PPAR complexes on the electrophoresis gel as illustrated in FIGS. 4 to 6. Depending on the migration position, it is possible to deduce whether the interaction between the PPRE and PPAR ⁇ sequence is, under the given conditions, nonspecific (NS) or specific (Shift or Super Shift when a selective antibody is used).

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide comprenant une séquence de formule (I): -TGACCTNOGGGCT-, dans laquelle N représente n'importe quel base nucléotidique naturelle ou de synthèse et O représente une base A, T ou U, dans laquelle ladite séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) permet l'interaction sélective dudit polynucléotide avec un ou plusieurs éléments constitutifs du complexe de transcription PPARa. Cette utilisation permet d'évaluer l'activité de transcription de PPAR, d'identifier de nouveaux ligands et séquence spécifiques de PPARa, ainsi que diagnostiquer et traiter des maladies liées à une dérégulation de l'activité de PPAR. L'invention concerne en outre un vecteur comprenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus, une cellule transformée par ce vecteur, ainsi que des kits de caractérisation de l'activité de PPAR comprenant un tel polynucléotide.

Description

Utilisation de séquences nucléotidiques interagissant préférentiellement avec le complexe de transcription PPAR α
La présente invention concerne l'utilisation d'un polynucléotide comprenant une séquence de formule (I) : - TGACCTNOGGGCT- , dans laquelle N représente n'importe quel base nucléotidique naturelle ou de synthèse et O représente une base A, T ou U, caractérisée en ce que ladite séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) permet l'interaction sélective dudit polynucléotide avec un ou plusieurs éléments constitutifs du complexe de transcription PPARα.
PPAR (en anglais :"Peroxisome Proliferator Activated Receptor"), désigne une famille de facteurs de transcription appartenant à la classe des récepteurs aux hormones stéroïdes. Les récepteurs aux hormones stéroïdes régulent l'expression de nombreux gènes dont ceux impliqués dans la différenciation cellulaire et dans le métablolisme énergétique de la cellule. En particulier, ils régulent des voies de signalisation essentielles à la vie cellulaire, en assurant un certain équilibre des taux de lipides et de glucides circulant dans l'organisme [Berger J. and Moller DE (2002) Ann. Rev. Med. 53:409-35 ].
L'alimentation, ou plus précisément les nutriments peuvent modifier la transcription des gènes de différentes manières. Certains acides gras, tel l'acide linoléique, se lient directement aux facteurs de transcription en tant que ligands capable de réguler l'activité de PPAR. Certains glucides agissent au contraire de manière indirecte via des intermédiaires hormonaux, comme par exemple la production d'insuline, qui modifient PPAR et activent de ce fait la transformation du glucose en glycogène au niveau du foie par activation de l'expression de la glucokinase hépatique.
PPAR est présent dans le corps humain sous forme de plusieurs structures protéiques. On distingue trois types de structures : PPAR alpha (foie, tractus digestif, reins...), PPAR gamma (tissu adipeux et macrophage...) et PPAR bêta ou delta (exprimés de façon ubiquitaire).
Les facteurs de transcription de type PPAR, pour exercer leur activité transactivatrice, agissent sous forme d'un complexe hétérodimèrique PPAR/RXR qui recrute d'autres protéines dont des co-activateurs. Sous l'influence de ligands plus ou moins spécifiques, le complexe PPAR/RXR est activé. Le complexe PPAR/RXR se fixe sur des séquences d'ADN particulières, nommées PPRE (peroxysome proliferator activated receptor responsive élément). Ces séquences font partie du promoteur des gènes cibles régulés par PPAR. La fixation de PPAR sur les séquences PPRE a pour effet de modifier la structure de la chromatine, ce qui déclenche la «machinerie transcriptionnelle», autrement dit la transcription en ARN des gènes cibles de PPAR.
Les séquences promotrices des gènes transcrits spécifiquement par les complexes PPARα, PPARγ ou indifféremment par PPARα ou PPARγ, sont qualifiées respectivement, dans le présent mémoire, de séquences
PPREα, PPREγ ou PPREα/γ (séquences capables d'interagir à la fois avec
PPARα et PPARγ).
A ce jour, les séquences PPRE décrites dans les banques de données fixent indifféremment tous les isoformes de PPAR [Berger J. and Moller DE (2002) Ann. Rev. Med. 53:409-35]. La spécificité d'action semble donc provenir essentiellement du ligand, du taux d'expression tissulaire des différentes composantes du complexe de transcription et de celui de ses éventuels partenaires (co-activateurs, co-répresseurs...).
Des ligands permettant d'activer préférentiellement les complexes de transcription PPARα et PPARγ, d'origines synthétiques ou naturelles, ont pu être identifiés et utilisés en tant qu'hypolipémiants et hypoglycémiants dans le traitement de certaines maladies métaboliques telles que les hypertryglycéridémies et le diabète de type II. [Kersten S, Desvergne B, Wahlie W (2000) Nature 405 :421-4]. On peut ainsi citer les ligands suivants: - PPARα : fibrates tels que le fénofibrate et le bézafibrate (ligands de synthèse);
PPARγ : thiazolidinediones, telles que la rosiglitazone et la troglitazone (ligands de synthèse);
En outre, certains polluants environnementaux, tels que les phtalates, les pesticides dérivés de l'acide phénoxyacétique, ont été identifiés pour être des ligands potentiels de facteurs de transcription de type PPAR
[Maloney EK, Waxman DJ (1999) Toxicol. Appl. Pharmacol. 161 :209-18]. ,
L'identification de telles substances revêt donc une certaine importance dans Ie domaine de la toxicologie.
Concernant les ligands synthétiques de PPAR, il est essentiel de savoir si une nouvelle molécule en cours de développement est un agoniste spécifique de PPARα, PPARγ, ou PPARα et PPARγ. En effet, on considère à l'heure actuelle dans l'industrie pharmaceutique que les molécules à la fois agonistes de PPARα et de PPARγ pourraient être d'un intérêt thérapeutique majeur puisqu'elles diminueraient d'une part le taux de triglycérides circulant (activation de PPARα) et d'autre part la résistance périphérique à l'insuline (activation de PPARγ). De telles molécules pourraient s'opposer aux deux perturbations métaboliques majeures rencontrées, par exemple, dans le diabète de type II. Cependant, les premières molécules testées possédant ces propriétés présentent une toxicité trop importante.
A ce jour, pour évaluer quel est le ou les isoformes de PPAR mis en jeu dans la réponse pharmaco-toxicologique d'une nouvelle molécule en développement, il est nécessaire de mettre en œuvre toute une série d'expérimentations telles que : Microarrays ou puces à ADN Expériences de liaison (en anglais : "binding") - Techniques de Gènes rapporteurs utilisant la séquence PPRE canonique... La technique des puces à ADN, permet de déterminer quels sont les gènes affectés après exposition à une molécule donnée. Après extraction des ARNm, ceux ci sont transformés en ADNc marqués. Ces derniers sont mis en contact sur une puce où ont été fixées des cibles spécifiques d'un certain nombre de gènes. Cette technique a pour avantage de s'adapter au screening, par contre elle demeure coûteuse et ne permet de mettre en évidence que des actions marquées (facteur deux d'induction ou d'inhibition) sans toute fois accéder à une connaissance des mécanismes moléculaires sous-jacents.
Les expériences de liaison (en anglais : "binding"), quelle que soit la méthodologie utilisée, permettent d'analyser la fixation d'une molécule sur sa cible moléculaire et de déterminer son affinité. Ces expériences bien qu'applicables au screening, ne permettent pas de déterminer si la molécule se comporte comme un agoniste, un agoniste inverse, un agoniste antagoniste ou au contraire un antagoniste de la cible.
Les techniques de gènes rapporteurs consistent à évaluer l'activité régulatrice d'une séquence nucléique par son action sur l'expression d'un gène dit rapporteur. Ce gène rapporteur, n'est pas exprimé dans l'organisme étudié et son expression est facilement analysable et quantifiable. Cette technologie permet de savoir si une nouvelle molécule active la séquence étudiée. En revanche, elle ne permet pas de connaître spécifiquement le facteur de transcription impliqué. Toutes ces expériences prises isolément n'apportent aucune information directe sur la spécificité d'action que le nouveau ligand est capable de conférer à PPAR.
Les mécanismes par lesquels les ligands sont capables de conférer une spécificité aux complexes de transcription PPAR restent largement inexpliqués.
Les séquences promotrices des gènes transcrits par PPAR sont pour la plupart connues et répertoriées [base de données GeneCards : http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/index.shtml]. Cependant, il est apparu que ces éléments ne permettaient par la différenciation des complexes de transcription PPARα et PPARγ.
Les inventeurs dans le cadre de la présente invention sont allés plus loin et se sont intéressés à des domaines secondaires des régions promotrices, distincts des éléments caractéristiques mentionnés ci-dessus.
De manière inattendue, les inventeurs ont identifié de courtes séquences d'ADN dont le consensus est donné par la formule (I) - TGACCTNOGGGCT-, dans laquelle N représentant n'importe quelle base nucléotidique et O représentant une base A, T ou U, lesquelles séquences sont capables d'interagir plus spécifiquement avec le complexe de transcription PPARα, qu'avec le complexe PPARγ. II est même apparu que ces courtes séquences étaient essentielles à Ia transcription de certains gènes cibles de PPARα, et qu'elles pouvaient être utilisées pour discriminer l'activité de transcription du complexe PPARα par rapport à PPARγ.
Sur la base de ces résultats, il est apparu que des polynucléotides incluant la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) tels que décrits ci- après, pouvaient être utilisés dans des procédés et des kits permettant de caractériser l'activité de transcription de PPAR. Ces utilisations permettent en particulier d'identifier de nouveaux composés (séquences d'ADN ou ligands) capables d'interagir avec PPAR, et améliorent ainsi le diagnostique et le traitement des maladies métaboliques liées à une modification de l'activité de PPAR. La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un polynucléotide comprenant i) une séquence de formule générale (I) :
- TGACCTNOGGGCT-
dans laquelle A, C, G et T désignent respectivement les bases adénine, cytosine, guanine et thymine, N représente une base nucléotidique naturelle ou synthétique quelconque et O représente une base qui est A (adénine), T (thymine) ou U (uracile); ou ii) une séquence complémentaire de (I) telle que définie sous i), ladite séquence (I) ou complémentaire de (I) permettant l'interaction sélective dudit polynucléotide avec un ou plusieurs éléments constitutifs du complexe de transcription PPARα, ladite utilisation a pour but d'évaluer directement l'activité de transcription de PPAR, en particulier lorsqu'il se trouve sous la forme PPARα, et indirectement l'activité de transcription de PPARγ.
On entend par activité de transcription le fait que la séquence codante d'un gène soit transcrite sous forme d'ARN. Dans le cas présent, la transcription s'effectue grâce à un complexe de transcription, lequel comprend le facteur de transcription PPAR associé à un certain nombre d'éléments annexes constitutifs, tels que des protéines auxiliaires et des ligands. Ces éléments annexes déterminent la spécificité, voire la sélectivité, du complexe de transcription.
PPARα correspond à une isoforme de la famille PPAR. Celui-ci a la capacité d'activer, au sein du complexe de transcription PPARα, la transcription d'un ensemble de gènes qualifiés de "gènes sous contrôle de PPARα".
Une séquence de formule (I) préférée selon l'invention est celle présentée dans le présent mémoire sous la référence SEQ ID N°1
(SEQ ID N°1) 5' TGACCTCAGGGCT 3'
Un polynucléotide est utilisable selon l'invention également lorsqu'il comprend la séquence inverse complémentaire de (I) dans les deux orientations possibles (5'->3' ou 3'->5'), c'est le cas par exemple la SEQ ID N°2 suivante qui est la séquence complémentaire inverse de SEQ ID N°1 :
(SEQ ID N°2) 5' AGCCCTGAGGTCA 3'
De manière préférentielle, on utilisera aux fins de l'invention un polynucléotide correspondant à l'une des séquences nucléotidiques suivantes SEQ ID N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N°5, SEQ ID N°6, SEQ ID N°7, SEQ ID N°8, SEQ ID N°9, SEQ ID N°10, SEQ ID N°17 et SEQ ID N°18 :
GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID N°3) CCGGAAGGCCGGGGCACTGGAGTCCCGACCCCAGCGTC (SEQ ID N°4) GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCTGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID N°5) CCGGAAGGCCGGGGCACTGGAGACCCGACCCCAGCGTC(SEQ ID N°6) TCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID N°7) AGGCCGGGGCACTGGAGTCCCGACCCCAGCGTC(SEQ ID N°8) TCCGGCCCCGTGACCTCTGGGCTGGGGTCGCAG (SEQ ID N°9) AGGCCGGGGCACTGGAGACCCGACCCCAGCGTC(SEQ ID N°10)
GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAGC(SEQ ID N°17) GCTGCGACCCCAGCCCTGAGGTCACGGGGCCGGAAGGCC(SEQIDN°18) On entend par "interaction sélective" le fait qu'un rapprochement physique de la séquence d'ADN de formule (I) avec un ou plusieurs éléments du complexe de transcription PPAR, permet une modulation de la transcription affectant exclusivement la transcription des gènes habituellement régulés par PPARα.
On parle également d'interaction sélective lorsqu'un polynucléotide tel que défini ci-dessus se fixe avec ou retient physiquement directement ou indirectement un ou plusieurs éléments constitutifs du complexe de transcription PPARα, ou un ligand de celui-ci. Certaines expériences ont permis d'établir que la séquence de formule (I), en particulier SEQ ID N°1 , agissait en tant qu'élément de type "enhancer", c'est-à-dire un élément permettant d'augmenter l'intensité de la transcription via PPAR. Ce type d'élément interagit positivement avec un ou plusieurs éléments fonctionnels du complexe de transcription et ce indépendamment de sa localisation précise par rapport au site d'initiation de la transcription.
La séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) peut ainsi se trouver ou être insérée théoriquement à n'importe quel endroit d'un polynucléotide, quelque soit sa taille et son orientation. Le polynucléotide selon l'invention peut être un ADN mono brin ou pluricaténaire. En général, un polynucléotide selon l'invention compte au moins 13 nucléotides, de préférence au moins 20, et plus préférentiellement au moins 30 nucléotides.
Un polynucléotide utilisable selon l'invention peut comprendre, en plus de la séquence de formule (I) et complémentaire de (I), d'autres séquences nécessaires à la mise en évidence d'une activité de transcription [Biologie Moléculaire et Médecine, Kaplan JC et Delpech M, Ed Médecine-Sciences Flammarion ISBN : 2-257-12488-X], tel qu'un site d'initiation de la transcription (promoteur basique).
Ainsi, le polynucléotide dont l'utilisation est décrite plus haut, peut comprendre, en plus de la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I), une séquence supplémentaire de type PPRE, c'est-à-dire une séquence d'ADN capable d'interagir avec un complexe de transcription de type PPAR, en δ
particulier une séquence de type PPREα ou PPREα/γ.
Ledit polynucléotide peut également comprendre, la séquence d'un gène dont la transcription est habituellement placée sous le contrôle de PPAR, ou bien seulement la séquence promotrice de ce gène. Ledit polynucléotide peut également comprendre la séquence d'un gène rapporteur. La transcription de la séquence codante dudit gène rapporteur peut, selon les cas, se trouver placée sous contrôle d'une séquence de type PPREα ou PPREα/γ ou bien en fusion avec le promoteur d'un gène sous contrôle de PPARα, PPARγ ou PPARα/γ. Selon une utilisation préférée de l'invention, la transcription de la séquence codante du gène rapporteur se trouve sous contrôle total ou partiel d'un polynucléotide comprenant une séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) telle que décrite précédemment.
En général, le complexe de transcription PPAR interagit avec la séquence (I) ou complémentaire de (I) en présence d'un ligand spécifique de celui-ci.
De préférence la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) se trouve à une distance comprise entre 40 et 300 paires de bases, plus préférentiellement entre 50 et 150, en amont d'un site d'initiation de la transcription.
La séquence de formule (I) et/ou complémentaire de (I) peut être insérée dans la partie promotrice d'un gène afin que la transcription de ce gène soit placé sous contrôle du complexe PPARα. La séquence promotrice du gène acquiert dans ce cas les propriétés d'une séquence de type PPREα. Un autre objet de l'invention consiste en un vecteur d'expression comprenant au moins une séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) telle que définie précédemment et un gène rapporteur.
Un autre objet de l'invention consiste en une cellule hôte transformée à l'aide d'un des vecteurs définis ci-dessus. Une telle cellule hôte peut servir de système biologique d'évaluation qualitative et quantitative de l'activité de transcription de PPAR.
Les gènes rapporteurs utilisés, selon la cellule hôte choisie pour leur expression, peuvent être par exemple: le gène de la Chloramphénicol Acétyl Transférase; le gène de la Luciférase; le gène de la Green Fluorescent Protein; - le gène de la β-galactosidase;
- Le gène SEAP (SEcreted Alkaline Phosphatase); Le gène ZsGreen;
Le gène GAL 4 (dans le cas d'un système indirecte GAL4-UAR dans des cellules eucaryotes) Parmi les vecteurs pouvant être employés aux fins de transfécter ce système rapporteur dans des cellules procaryotes ou eucaryotes, on peut citer: des plasmides tel que psG3, psG5, pBLCAT2, pCATpromoter, pSEAP2-control, pEGFP-1, pHRed1-1, pECFP-1, pCMV-DsRed-Express - des phages tel que le phage lambda;
- des adénovirus tel que pDNR-CMV, pShuttle2 ou pTRE-Shuttle2; des rétrovirus tel que PIp-LNCX...
Différents modèles cellulaires peuvent être envisagés en tant que cellules hôtes. Certaines cellules comme les procaryotes et les levures n'expriment pas naturellement PPAR et RXR. Il est donc nécessaire, au préalable, de les transformer avec les ADNc codant pour PPAR et RXR. Les bactéries pouvant être utilisées à cet effet sont par exemple deux clones d'Escherichia coli BL21 et JM83, et, pour ce qui concerne les levures, divers clones de Saccharomyces cerevisiae. Certains insectes expriment RXR (gène Usp) mais pas PPAR, il est donc nécessaire dans ce cas de les transfécter avec les ADNc codant pour PPAR. Parmi les cellules d'insectes pouvant convenir, on peut citer par exemple, les lignées cellulaires de Drosophila melanogaster S2 et Sf21.
Les cellules de mammifères, notamment de rongeurs (préadipocyte murin 3T3-L1...), expriment à la fois PPARα et RXRα. Cependant, la spécificité de ligand pour PPAR peut varier en fonction des espèces. Il faudra donc au préalable la vérifier, avant d'extrapoler les résultats à l'homme.
Les cellules d'origine humaine sont des hôtes de choix, notamment celles exprimant à des taux importants PPARα telles que les adipocytes (cellules en culture primaire...) et les entérocytes (CaCo-2, HT29...). La transfection de ces cellules par de l'ADNc codant pour PPARα permet d'augmenter la sensibilité. Dans le cadre d'une application pour le criblage haut débit, il est recommandé d'utiliser préférentiellement des cellules adhérentes cultivées dans des plaques multi-puits.
Un polynucléotide utilisable selon l'invention peut être obtenu de différente manière. A l'origine, la séquence SEQ ID N°1 a été caractérisée à partir d'un gène humain. Les polynucléotides selon l'invention peuvent cependant être reproduits par synthèse chimique directe et programmée ou bien clones dans un vecteur afin d'être répliqué dans une cellule hôte transformée. Un autre moyen d'obtenir un polynucléotide selon l'invention est d'amplifier une séquence PPREα d'intérêt par PCR (réaction de polymérisation en chaîne) à partir d'une préparation d'ADN.
La présente invention, se base sur les propriétés d'interaction particulières que possède la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) pour le complexe PPARα, en particulier des propriétés de liaison physique. Ces propriétés non décrites auparavant permettent de caractériser une activité de transcription de type PPAR, et plus particulièrement permettent de discriminer une activité de transcription de type PPARα par rapport à PPARγ.
Une utilisation selon l'invention permet ainsi de différencier une activité de transcription de type PPARα, en présence d'autres types d'activité transcriptionnelle.
Une utilisation selon l'invention permet ainsi de détecter une activité de transcription de type PPARα dans un milieu biologique donné. Cela permet en outre de pouvoir caractériser de nouvelles séquences de type PPRE, lesquelles peuvent avoir été identifiées, par exemple, dans une préparation d'ADN génomique.
L'évaluation de l'activité de transcription de PPAR peut être réalisée selon l'invention, suivant différentes modalités décrites ci-après: Un polynucléotide tel que décrit plus haut est utilisable selon l'invention en tant que sonde d'hybridation, par exemple, dans le but de détecter de nouvelles séquences PPRE dans une préparation d'ADN, contenant en particulier de nouvelles séquences PPREα. De même, un polynucléotide tel que décrit plus haut peut être utilisé selon l'invention pour diagnostiquer des anomalies génétiques pouvant être à l'origine de maladies métaboliques, en particulier de maladies liées à une dérégulation de l'expression de gènes sous contrôle de PPAR, et plus particulièrement de maladies liées à une modification de l'activité transcriptionelle de PPAR, telle que rhypertryglycéridémie, le diabète de type II ou des lipodystrophies.
Un polynucléotide tel que défini plus haut peut être utilisé pour doser un complexe de transcription PPAR, de préférence PPARα, ou un de ses éléments constitutifs, dans un échantillon biologique, en utilisant plus particulièrement les propriétés d'adhésion rencontrées entre ledit complexe et la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I). Le dosage peut s'effectuer de la manière suivante: 1) fixation sur une phase solide d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1 ; 2) mise en contact d'un échantillon dans lequel PPARα ou un élément constitutif du complexe PPARα est à quantifier;
3) quantification de PPARα ou de l'élément constitutif du complexe PPARα retenu par lesdits polynucléotides par une méthode d'analyse conventionnelle. Par "méthode conventionnelle d'analyse", on entend une méthode usuelle connue de l'homme du métier, lui permettant de déterminer la quantité et le degré de pureté des composés fixés par le polynucléotide de l'invention, telle que, par exemple la chromatographie d'affinité.
Plusieurs types de supports solides peuvent être envisagés tels que des microplaques, des billes magnétiques ou en polystyrène, des microparticules, des gels de chromatographie.
Une technique de fixation préférée consiste à fixer les polynucléotides sur une microplaque à l'aide une liaison streptavidine/biotine.
Selon les conditions expérimentales, il est possible de retenir des composés capables de se lier avec le polynucléotide de l'invention.
Une élution dans les conditions adaptées, permet la récupération des fractions les plus spécifiques et leur purification en vue d'identifier de nouveaux composés capables de prendre part potentiellement au complexe de transcription PPAR.
Plus particulièrement, un polynucléotide tel que défini plus haut peut être utilisé pour identifier un ligand capable d'activer ou d'inhiber sélectivement le complexe de transcription PPARα.
L'invention peut consister, par exemple, en un procédé permettant de mettre en évidence une interaction physique entre des facteurs de transcription et un polynucléotide tel que décrit plus haut. Ce procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 1) marquage d'un polynucléotide utilisable selon l'invention;
2) mise en contact de PPARα/RXR et du polynucléotide marqué
3) détection des complexes moléculaires formés autour du polynucléotide marqué à l'aide de méthodes conventionnelles d'analyse, telles que, par exemple, le retard sur gel, ou bien à l'aide d'un Kit selon l'invention, décrit plus loin.
Inversement la protéine PPARα peut être marquée, ainsi que les molécules qui lui sont associées afin de caractériser des séquences de type PPRE. L'invention peut alors consister en un procédé de détermination de la spécificité d'une séquence nucléotidique de type PPRE, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
1 ) marquage du complexe formé par les protéines PPAR-RXR;
2) mise en contact du complexe PPAR-RXR marqué avec un polynucléotide tel que défini dans l'invention fixé sur un support;
3) ajout dans Ia phase libre d'une concentration de la séquence nucléotidique de type PPRE dont on cherche à déterminer la spécificité;
4) détection des complexes moléculaires formés autour du complexe PPAR- RXR marqué. Le marquage du polynucléotide, de PPAR (ou des protéines associées à PPAR), aux fins de la détection, peut être radioactif (32P, 33P...), immuno-enzymatique (sondes froides...), chimique (Bromure d'éthidium...) ou être encore réalisé selon toute autre technique connue de l'homme du métier. On considère ici qu'un composé est susceptible d'interférer avec l'activité de transcription de PPAR lorsqu'il se lie à la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) ou bien lorsqu'il se lie à un des éléments constitutifs du complexe de transcription de PPAR.
Une méthode conventionnelle préférée pour évaluer les complexes formés autour de PPAR est la technique de retard sur gel, (en anglais EMSA : Electrophoretic Mobility Shift Assay) [Biologie Moléculaire et Médecine, Kaplan JC et Delpech M, Ed Médecine-Sciences Flammarion ISBN : 2-257-12488-X].
La technique de gel retard consiste à faire migrer en électrophorèse les complexes formés ou non entre les facteurs de transcription et les séquences d'ADN cible, de sorte à pouvoir les comparer en fonction de leur distance électrophorétique sur un gel. Cette technique est utilisée idéalement pour des polynucléotides de 15 à 80 nucléotides, de préférence entre 20 et 50 nucléotides. La présence d'un site PPREα unique et un micro environnement permet de minimiser au maximum les interférences possibles avec d'autres facteurs de transcription.
Il est possible, pour améliorer un des procédés décrits ci-dessus, de pratiquer, en outre, des tests immunologiques, et notamment d'utiliser des anticorps anti-PPARα. Ces tests permettent de confirmer la nature des éléments interagissant avec les polynucléotides utilisables selon l'invention.
Pour l'ensemble des procédés décrits ci-dessus, il est recommandé d'utiliser en tant que témoin un polynucléotide, dans lequel la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) a été mutée ou a subi une délétion. Un polynucléotide témoin selon l'invention peut consister, par exemple, en les séquences SEQ ID N°11 , SEQ ID N°12, SEQ ID N°19 et SEQ ID N°20. DΘ même, il peut être utile d'utiliser à titre de comparaison des polynucléotides présentant une spécificité différente pour le complexe PPAR, consistant, par exemple, en des séquences de type PPREγ ou PPREα/γ.
Les propriétés d'activation de la transcription conférées par la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) permettent d'évaluer l'activité de transcription de PPAR, plus particulièrement de PPARα, en présence de certains composés ou mélange de composés.
L'invention peut ainsi consister en un procédé de mise en évidence, via une cellule-hôte, de composés capables d'augmenter ou de diminuer l'activité de transcription de PPARα, consistant à placer un gène rapporteur sous le contrôle d'une ou plusieurs séquences PPRE, en particulier
PPREα et de comparer les profils d'expression obtenus en présence de différents composés ou mélange de composés. Cette technique permet, par exemple, de tester l'incidence d'un composé ou d'un mélange de composés sur l'interaction de PPAR sur lesdites séquences de type PPRE.
L'invention peut également consister à mettre en évidence des composés capables d'augmenter ou de diminuer l'activité de transcription de PPARα à l'aide d'un système d'expression comprenant un gène rapporteur. Ce procédé consiste en les étapes suivantes : 1) transformation d'une cellule hôte à l'aide d'un polynucléotide utilisable selon l'invention comprenant une séquence PPREα et un gène rapporteur;
2) mise en culture de la cellule hôte obtenue à l'étape 1);
3) mise en contact de la cellule hôte cultivée à l'étape 2) avec le composé ou le mélange de composés à tester; 4) détection de l'expression du gène rapporteur.
De préférence, le gène rapporteur est placé sous le contrôle de PPARα, mais il est possible également d'utiliser un système à deux composants de type GAL4/UAR dans lequel le gène rapporteur est indirectement placé sous le contrôle de PPARα. L'expression du gène rapporteur est détecté selon la technique la mieux adaptée (dosage enzymatique, quantification de protéine, dosage immunologique etc.), en fonction de la nature du produit exprimé. Selon que le niveau d'expression du gène rapporteur est élevé ou faible, il est établi si le composé ou le mélange de composé exerce une influence positive ou négative sur le complexe PPAR et si cette influence présente un caractère sélectif, par exemple, vis-à-vis de PPARα. En complément de ce procédé, une cellule hôte témoin peut être transformée à l'aide d'un polynucléotide de contrôle tel que défini précédemment, incapable d'interagir avec PPAR, du fait que la séquence de formule (I) a été mutée, ou a subi une délétion. Il est alors possible de comparer les résultats obtenus entre la cellule hôte témoin et la cellule hôte sensible à PPARα.
Un tel procédé comprend les étapes suivantes:
1) transformation d'une cellule hôte à l'aide d'un polynucléotide utilisable selon l'invention comprenant une séquence PPREα et un gène rapporteur;
2) transformation d'une cellule hôte témoin à l'aide d'un polynucléotide témoin tel que défini plus haut, c'est-à-dire un polynucléotide utilisable selon l'invention, dans lequel la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) a été mutée ou a subi une délétion;
3) mise en culture des cellules hôtes obtenues aux étapes 1) et 2);
4) mise en contact des cellules hôtes cultivées avec le composé ou le mélange de composés à tester;
5) détection de l'expression du gène rapporteur;
II est en outre possible de moduler une activité de transcription de manière hétérologue en insérant un polynucléotide utilisable selon l'invention au niveau du promoteur d'un gène dans un vecteur ou bien un organisme transgénique, Cette insertion doit permettre de placer la transcription dudit gène sous le contrôle du complexe PPARα. La séquence promotrice ainsi créée présente alors les caractéristiques principales d'une séquence de type PPREα telle que définie plus haut.
Il est à noter que les polynucléotides correspondants à SEQ ID N°7, 8, 9 et 10 sont utilisés plus préférentiellement pour les procédés de retard sur gel ou utilisant un support solide et que les polynucléotides correspondants à SEQ ID N°3, 4, 5 et 6 sont utilisés plus préférentiellement pour les procédés décrits ci-dessus utilisant un gène rapporteur.
Un autre aspect de l'invention consiste en un kit utilisant les propriétés d'interaction entre les polynucléotides tels que décrits plus haut et le complexe PPAR, en particulier PPARα, permettant notamment de caractériser les interactions entre des séquences polynucléotidiques de type PPRE et les complexes de transcription de type PPAR.
Un kit selon l'invention utilise au moins un polynucléotide tel que défini dans l'invention, et de manière optionnelle, à une ou plusieurs séquences polynucléotidiques de type PPREγ et PPREα/γ, permettant ainsi de comparer de manière simultanée les différents types d'interactions pouvant exister entre les différents types de séquences de type PPRE et PPAR.
Le principe général d'un kit selon l'invention est de mettre en contact les polynucléotides précités avec une préparation de protéines purifiées PPAR et RXR, puis de détecter les complexes formés préférentiellement entre lesdites protéines et les séquences polynucléotides définies plus haut.
Selon un mode préféré de kit selon l'invention, les polynucléotides sont fixés sur un support pouvant se présenter, pour les besoins du criblage haut débit, sous la forme de puits, de tube ou de billes.
Selon un autre mode préféré au moins une des protéines PPAR et RXR ou séquence nucléotidique présente dans le kit peut être marquée pour les besoins d'une détection des complexes d'interaction formés.
On entend par "complexe d'interaction" l'ensemble formé par le complexe de transcription PPAR et le polynucléotide auquel il se trouve fixé (PPAR+PPRE). Une variante préférée d'un kit selon l'invention consiste en un kit de criblage haut débit permettant de mettre en évidence la fixation d'un ligand spécifique de PPAR.
Selon une variante du kit, les polynucléotides fixés sur un support et les protéines PPAR-RXR sont mises en contact en présence d'un substrat spécifique marqué du complexe PPARα, PPARγ ou PPARα/γ. On entend par substrat spécifique une molécule chimique naturelle ou de synthèse qui est connue comme étant ligand d'un ou de plusieurs des membres de la famille PPAR.
Lorsque les complexes d'interaction PPAR-PPRE et le substrat spécifique marqué se sont formés, une molécule à tester, de préférence un ligand potentiel de PPAR, est introduite dans le milieu réactionnel. Si cette molécule est de nature à agir en tant que ligand d'une forme particulière de PPAR, comme PPARα, il se produit alors un déplacement par la molécule à tester de l'équilibre de liaison existant entre le substrat spécifique marqué et les protéines PPAR-RXR au sein du milieu réactionnel. La quantification de la molécule marquée dans la phase libre ou liée du système reflète le degré d'interaction de la molécule à tester avec le complexe PPAR/RXR.
Selon une autre variante du kit, l'activité de PPAR peut être déterminée, par exemple, dans un extrait de protéines extraites du noyau d'une cellule préalablement traitée. Les protéines PPAR et RXR sont mises en contact avec au moins un polynucléotide, comme précédemment décrit (PPAR ou RXR étant de préférence marquée), dans les conditions permettant la fixation de PPAR-RXR sur les séquences des polynucléotides, plus particulièrement une séquence de formule (I) ou complémentaire de (I). Différentes dilutions de l'extrait de protéines nucléaires à tester sont alors incubées en présence des complexes d'interaction formés. Selon que les protéines contenues dans l'extrait sont capables de se lier à une séquence nucléotidique de type PPRE, comme par exemple PPREα, il se produit ou non un déplacement partiel ou total du complexe PPAR/RXR marqué vers les séquences de formule (I). La quantification du marquage libre ou lié permet d'indiquer si l'extrait nucléaire contient des PPAR capables de se fixer sur une séquence particulière PPRE, telle PPREα.
Selon une autre variante du kit, il est possible d'établir si une séquence PPRE est de type PPREα, PPREγ ou PPREα/γ. Des séquences PPRE de spécificité connue, telles que des polynucléotides comprenant une séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) sont mises en contact avec une préparation de protéines PPAR-RXR préalablement marquées, de sorte à former des complexes PPRE/PPAR-RXR. La séquence PPRE potentielle dont on cherche à tester la spécificité est alors ajoutée dans le milieu réactionnel. Le principe est de mettre la séquence PPRE de spécificité inconnue en compétition avec les séquences de PPRE de spécificité connue, dans leur liaison avec PPAR. Si l'affinité des protéines PPAR-RXR pour la séquence PPRE testée dans le milieu est importante, l'équilibre de liaison initial apparu, par exemple, entre le complexe PPARα et les polynucléotides de type PPREα se modifie. Il est dans ce cas établi, que la séquence PPRE présente une affinité supérieure ou équivalente pour PPARα à la séquence connue de type PPREα utilisée.
Comme pour les autres variantes du kit, le marquage d'une des protéines du kit permet de détecter les modifications au sein des complexes d'interaction.
Ainsi, un kit selon l'invention comprend généralement au moins : une préparation d'au moins un polynucléotide utilisable selon l'invention, liant sélectivement PPARα; - une préparation des protéines purifiées PPAR-RXR dont un des membres au moins est marqué; un moyen de détection des complexes moléculaires marqués
On entend par moyen de détection des complexes d'interaction toute possibilité technique permettant de mettre en évidence une variation des interactions entre les polynucléotides utilisés et les protéines PPAR-RXR et entre les protéines PPAR-RXR et un ligand . Cette possibilité technique passe, par exemple, par la fourniture dans le kit de molécules marquées radioactivement ou chimiquement, de substrats, de réactifs ou d'enzymes permettant de révéler le marquage des molécules présentes dans les complexes d'interaction, de produits permettant la séparation physique des molécules tels que des gels d'électrophorèse, des gels de chromatographie, des billes magnétiques ou des réactifs de précipitation.
Un kit selon l'invention peut comporter en outre un polynucléotide témoin tel que défini plus haut dans lequel la séquence de formule (I) est mutée ou a subi une délétion, ainsi que des séquences de type PPREγ ou de type
PPREα/γ, utiles à la caractérisation de l'activité du complexe de transcription de type PPAR. „ .
I y
Un kit selon l'invention peut comprendre, en outre, un moyen de support des polynucléotides précités, tels que des cupules, des puits, des tubes ou des billes. Un kit selon l'invention peut comprendre également un ou plusieurs substrats spécifiques des différents isoformes de PPAR et/ou de RXR, et différentes séquences spécifiques ou non des différents isoformes de PPAR.
Selon un autre aspect de l'invention, un polynucléotide tel que défini plus haut peut encore être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une maladie métabolique, plus particulièrement une maladie liée à une modification de l'activité de PPAR, telle que rhypertryglycéridémie et le diabète de type II ou des lipodistrophies. Un tel médicament peut comprendre, en particulier des polynucléotides utilisables selon l'invention en tant qu'ADN anti-sens ou sous la forme de siRNA (une structure dite en épingle à cheveu sera alors recommandée), ayant pour effet d'inhiber l'interaction de PPAR avec la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) ou bien servir de leurre pour PPARα.
Les figures et exemples qui suivent ont pour but d'illustrer l'invention, ils ne sauraient constituer une quelconque limitation des revendications.
FIGURE 1 :
Comparaison de séquence PPREα entre diverses espèces (rat, homme, souris). Il s'agit des séquences promotrices du gène CYPA1 séquencées chez le rat, l'homme et la souris. Chacun de ces promoteurs comprennent une séquence de formule (I) indiquée en gras. Ces résultats montrent que les séquences de formule (I) ont été conservées d'une espèce à l'autre au cours de l'évolution.
FIGURE 2:
Procédé de mise en évidence d'un composé activant spécifiquement le complexe de transcription PPAR. Le procédé consiste à transformer une cellule hôte apte à exprimer un gène rapporteur avec un vecteur comprenant ledit gène rapporteur placé sous la dépendance d'un promoteur PPAR-dépendant (construction N°2) ou bien d'un promoteur PPARα-dépendant comprenant un polynucléotide selon l'invention (construction N°1). Les résultats obtenus à l'aide des constructions N°1 et N°2 selon la spécificité du ligand testé (PPARα ou PPARα/γ) sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous. La molécule X1 exerce son action via PPARα et/ou PPARγ (absence de sélectivité du ligand X1) contrairement à la molécule X2 qui agit uniquement via PPARγ (sélectivité du ligand pour PPARγ).
Figure imgf000021_0001
FIGURE 3:
Effet d'un ligand de PPARα ou PPARγ sur l'induction de l'expression du gène CAT. Le promoteur d'un gène contenant à la fois les sites
PPREα et PPRE consensus (α/γ) a été traité par le WY-14643 à 200 μM. Ce promoteur a été muté au niveau du site PPREα (PPREαmut) et/ou du site
PPREconsensus (PPREconsmut). L'histogramme montre le niveau d'expression du gène rapporteur dans les différentes situations (et du témoin C). Cette expérience montre que le ligand utilisé est sélectif de PPARα .
FIGURE 4:
Expérience de retard sur gel impliquant une séquence PPRE consensus et une séquence PPREα correspondant à un polynucléotide utilisable selon l'invention. Les protéines PPARα et RXRα ont été préparées selon le protocole décrit dans l'exemple 2. Selon la position de migration des complexes marqués sur le gel d'électrophorèse, il est possible de déduire si l'interaction est spécifique (S : Shift ; SS : Super Shift) ou non spécifique (NS). Les interactions étudiées sont les suivantes :
1 : PPRE consensus (témoin)
2 : TNT (témoin) + PPRE consensus
3 : PPRE consensus (témoin) + RXRα 4 : PPREconsensus + PPARα
5 : RXRα + PPARα + PPREconsensus
6 : RXRα + PPARα + PPREconsensus + anticorps spécifique de PPARα
7 : PPREα (témoin)
8 : TNT + PPREα (témoin) 9 : PPREα + RXRa
10 : PPREa + PPARa
11 : PPREa + PPARa + RXRa
12 : PPREa + PPARa + RXRa + anticorps sélectif de PPARα
Cette expérience comparative montre que le complexe PPARα se lie préférentiellement à Ia séquence PPREα utilisée selon l'invention.
FIGURE 5:
Expérience comparative de retard sur gel impliquant une séquence PPRE consensus marquée avec, en compétition, une séquence PPRE consensus non marquée, une séquence PPREα utilisable selon l'invention non marquée, des séquences PPREα/γ et PPREα mutées, lesdites séquences non marquées étant utilisées à des concentrations représentant 50 ou 10 fois la concentration des séquences marquées. 1 : PPRE marquée (témoin) 2 : PPRE marquée + TNT (témoin) 3 : PPRE marquée + RXRα (témoin) 4 : PPRE marquée + PPARα (témoin)
5 : PPRE marquée + RXRα + PPARα (témoin)
6 : PPRE marquée + RXRα + PPARα + compétiteur PPRE consensus (50 fois)
7 : PPRE marquée + RXRα + PPARα + compétiteur PPRE consensus (10 fois) 8 : PPRE marquée + RXRα + PPARα + compétiteur PPRE α/γ (50 fois)
9 : PPRE marquée + RXRα + PPARα + compétiteur PPRE α/γ (10 fois)
10 : PPRE marquée + RXRα + PPARα + compétiteur PPREα (50 fois)
11 : PPRE marquée + RXRα + PPARa+ compétiteur PPREa (10 fois)
12 : PPRE marquée + RXRα + PPARa + compétiteur PPRE a/γ muté (50 fois) 13 : PPRE marquée + RXRα + PPARa + compétiteur PPREa muté (50 fois)
14 : PPRE marquée + RXRα + PPARa + anticorps spécifique de PPARα Cette expérience montre que PPREα forme un compétiteur plus actif que PPREconsensus.
FIGURE 6:
Expérience de retard sur gel mettant en évidence la non fixation de PPARγ sur la séquence PPREα. Les réactions testées consistent en les suivantes :
1 TNT + PPRE consensus
2 TNT + RXR + PPRE consensus
3 TNT + RXR + PPARα + PPRE consensus
4 TNT + RXR + PPARγ + PPREconsensus
5 TNT + PPRE α/γ
6 TNT + RXR + PPRE α/γ
7 TNT + RXR + PPARα + PPRE α/γ
8 TNT + RXR + PPARγ + PPRE α/γ
9 TNT + PPREα
10 : TNT + RXR + PPREα
11 : TNT + RXR + PPARα + PPREα
12 : TNT + RXR + PPARγ + PPREα Cette expérience montre la sélectivité de séquences PPREα selon l'invention vis-à-vis du complexe de transcription PPARα, par rapport à PPARγ.
EXEMPLE 1
Utilisation d'un polynucléotide utilisable selon l'invention pour l'activation d'un gène rapporteur
Le plasmide pRNH25c d'expression du gène rapporteur CAT est sous la dépendance du promoteur du gène CYP1A1 humain a été utilisé. Cette construction a été généreusement donnée par le Dr Hines (Hines RN, Mathis JM and Jacob CS ; 1988, Carcinogenesis, vol 9, pages 1599-1605). Le promoteur du gène CYP1A1 humain contient la séquence caractérisée comme étant spécifique de PPARα comprenant la séquence de formule (I) (site PPREα).
Des mutations de Ia séquence de formule (I) ont été réalisées à même le plasmide pRNH25c via une technique de mutagenèse dirigée permettant de modifier une ou plusieurs bases (Kit Quickchange Site-Directed Mutagenesis de Stratagene®) et modifier les sites PPREα et PPREα/γ (commun aux différents membres de PPAR) présents sur le promoteur du CYP1A1. Le protocole utilisé est celui conseillé par le concepteur du kit :
1 - Génération de la mutation par PCR
- 50 ng de pRNH25c
1 ,25 μl d'une solution à 100 ng/μl d'amorce oligonucléotidique sens contenant la mutation - 1 ,25 μl d'une solution à 100 ng/μl d'amorce oligonucléotidique antisens contenant la mutation 5μl de tampon 10 X reaction buffer 1 μl de Pfu Turbo DNA polymérase (2,5 unités par μl)
- H2O qsp 50 μl
Cycle de PCR : 1 cycle à 95°C pendant 3 minutes puis 18 cycles comprenant les étapes successives
950C pendant 30 secondes
57°C pendant 1 minute
72°C pendant 15 minutes Les amorces utilisées pour la mutation du site PPREα sont les suivantes:
PPREα mut-sens : δ'GGCCTTCCGGCCCCGTGAATTCAGGGCTGGGGTCGCAGCS' (SEQ ID N0H)
PPREα mut-antisens : 5'GCTGCGACCCCAGCCCTGAAJTCACGGGGCCGGMGGCCS' (SEQ ID N°12)
Les amorces utilisées pour la mutation du site PPREα/γ sont les suivantes :
PPREα/y mut-sens : δ'GGACGGGCCGCCTGACCTCGATCCCCTAGAGGGATGTCGS' (SEQ ID N°13)
PPREαfy mut-antisens : δ'CGACATCCCTCTAGGGGATCGAGGTCAGGCGGCCCGTCCS' (SEQ ID N°14)
Dans les deux cas, les bases en gras et soulignées correspondent aux bases mutées. Dans un premier temps, le site PPREα a été muté permettant d'obtenir la construction « PPREα/γ + PPREαmut ».
Cette dernière construction a par la suite été mutée pour obtenir la construction « PPREα/γ mut + PPREα mut ».
2 - Digestion du produit de PCR
Le produit de PCR (50 μl) est alors soumis à une digestion enzymatique médiée par 1 μl de Dpn I (10 unités/μl). L'endonucléase Dpn I est spécifique de l'ADN méthylé et hemi-méthylé. Ainsi, cet enzyme digérera la matrice parentale par rapport à l'ADN néo-synthétisé par PCR (ADN non méthylé).
3 - Ligation des produits de PCR n e
25
La digestion réalisée, l'ADN néo-synthétisé est soumis à une ligation au moyen de l'enzyme T4 DNA ligase selon le protocole suivant :
- 51 μl de produit de PCR digéré 6 μl de 10 X Ligase buffer - 2 μl de T4 DNA ligase
- 1 μl H2O
Ligation à 15°C durant 15 heures
4 - Transformation bactérienne Le plasmide muté ainsi obtenu est utilisé pour transformer des bactéries Epicurial CoIi XL1-Blue Supercompetent CeIIs fournies dans le Kit.
- 1 μl d'ADN digéré par Dpn I et ligué 50 μ I de bactéries le tout est mélangé délicatement - Incubation de 30 minutes sur glace Incubation de 45 secondes à 42°C Incubation de 2 minutes dans la glace
- Ajout de 0,5 ml de milieu de culture NZY+ (composition décrite dans le Kit) Incubation pendant 1 heure à 37°C sous agitation (225 à 250 rpm) - Dépôt de 250 μl de ces bactéries transformées sur une boite de gélose LB- Ampiciline-Agar pendant 18 heures
Pour chaque construction, un clone est sélectionné et amplifié dans 2 ml de milieu de culture NZY+ renfermant 50 μg/ml d'ampiciline.
5 - Vérification des clones bactériens ainsi obtenus :
La préparation de l'ADN plasmidial muté a été réalisée au moyen du Kit NucleoBond® PC 20 (Macherey Nagel), en se conformant aux recommandations du fournisseur.
Une vérification sommaire des constructions « PPREα/γ + PPREαmut » et « PPREα/γ mut + PPREα mut » a été réalisée par digestion enzymatique en utilisant l'enzyme de restriction Eco Rl. Cette enzyme permet de sortir le fragment correspondant au promoteur du CYP1A1 , générant ainsi deux bandes sur gel d'agarose à 1 % de 1.8 et 4.3 Kb.
6 - Amplification des constructions « PPREα/y + PPREαmut » et « PPREα/y mut + PPREα mut » Les clones bactériens transformées avec les constructions
« PPREα/γ + PPREαmut » et « PPREα/γ mut + PPREα mut » sont mises en culture à 37°C pendant 18 h sous agitation (225 à 250 rpm) dans 150 ml de NZY+ renfermant 50 μg/ml d'ampicilline.
Les ADN plasmidiaux sont ensuite extraits au moyen du kit NucleoBond® PC 500 (Macherey Nagel) en suivant le protocole « High Copy » du fabricant.
Après dosage spectrophotométrique, les constructions « PPREα/γ + PPREαmut » et « PPREα/γ mut + PPREα mut » ont été séquencées afin de vérifier la spécificité des mutations.
7 - Transfection transitoire par lipofection des cellules CaCo-2 et détermination du taux de protéine CAT (« Cat Assav »)
Brièvement, la lignée d'adénocarcinome colique humain CaCo-2 a été ensemencée dans des boites 6 puits et cultivée dans un milieu renfermant du DMEM, 15 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 1% d'acides aminés non-essentiels (solution de MEM 100X de la société Life Technologies), 100 Ul/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine; dans une atmosphère renfermant 9% de CO2.
Lorsque les cellules ont atteint 40-60% de confluence, elles ont été transfectées transitoirement par lipofection au moyen de Lipofectine® (Invitrogen) selon les recommandations du fournisseur et avec 1 μg de construction (pRNH25C, ou « PPREα/γ + PPREαmut », ou « PPREα/γ mut + PPREα mut »).
48 heures après la transfection, les cellules ont été traitées pendant 48 h avec 200 μM de WY-14643 (agoniste spécifique de PPARα) dans un milieu dépourvu de sérum de veau fœtal (car le sérum de veau fœtal renferme des ligands de PPARα). Les cellules ont ensuite été rincées trois fois au PBS et le taux de protéine CAT a été déterminé au moyen du kit CAT-Elisa System® (Roche Diagnostics) en suivant les recommandations du fournisseur.
EXEMPLE 2
Mise en évidence de la fixation spécifique du complexe PPARα/RXRα sur un polynucléotide utilisable selon l'invention par la technique du gel retard
Afin de prouver la fixation spécifique du complexe PPARα/RXRα par rapport au complexe PPARγ/RXRα des expériences de retard sur gel (EMSA) ont été entreprises.
1 - Synthèse in vitro des protéines PPARα, PPARγ et RXRα
Les protéines PPARα, PPARγ et RXRα ont été obtenues par un système in vitro de transcription/traduction (TNT® T7 Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega). Brièvement, 40 μl de TNT T7 quick master mix, 1 μl de méthionine 1 mM, 1 μg de plasmide (plasmide exprimant l'ADNc de PPARα, ou de PPARγ, ou de RXRα) et de l'eau qsp 50 μl ont été incubés pendant 60 minutes à 300C.
2 - Marquage des sondes
Cinq sondes ont été marquées au P32 (sites PPRE soulignés, bases mutées en gras) :
Sonde PPRE consensus :
PPRE Consensus F : δ'CCGCCAAGCTTGCTCCGCCAGGTCACAGGTCACTAGS' (SEQ ID N015)
PPRE Consensus-R : δ'CTAGTGACCTGTGACCTGGCGGAGCAAGCTTGGCGGS' (SEQ ID N°16)
Sonde PPREα : PPREα-F : δ'GGCCTTCCGGCCCCGTGACCTCAGGGCTGGGGTCGCAGCS'
(SEQ ID N°17)
PPREα-R : 5' GCTGCGACCCCAGCCCTGAGGTCACGGGGCCGGAAGGCCS' (SEQ ID N°18)
Sonde PPREα muté :
PPREαmulé-F : 5'GGCCTTCCGGCCCCGTGAATrCAGGGCTGGGGTCGCAGC3' (SEQ ID N019) PPREα muté-R : δ'GCTCGACCCCAGCCCTGAATTCACGGGGCCGGMGGCCS' (SEQ ID N°20)
Sonde PPREα/γ :
PPREα/γ-F : δ'GGACGGGCCGCCTGACCTCTGCCCCCTAGAGGGATGTCGS' (SEQ ID N°21) PPREαfy-R : 5'CGACATCCCTCTAGG^G^ÇAGAGGTÇAGGCGGCCCGTCC3' (SEQ ID N°22)
Sonde PPREα/γ muté :
PPREα/ymufé-F : δ'GGACGGGCCGCCTGACCTCGATCCCCTAGAGGGATGTCGS' (SEQ ID N°23) PPREα/Vmufé-R : δ'CGACATCCCTCTAGGGGATCGAGGTCAGGCGGCCCGTCCS' (SEQ ID N°24)
Dans un premier temps, les oligonucléotides F et R ont été hybrides de la façon suivante : régénérer les oligonucléotides dans de l'eau à la concentration de 1 μg/ml; - dans un tube ajouter 5 μl de l'oligonucléotide F, 5 μl l'oligonucléotide R, 5 μl de tampon d'hybridation 1OX (Tris 0.5M à pH 8.0, MgCI2 100 mM) et 35 μl d'eau; chauffer 5 minutes à 100 0C puis laisser redescendre à la température ambiante. Dans un deuxième temps, les sondes d'ADN double brin sont marquées au P32 au moyen de T4 polynucléotide kinase (Invitrogen) de la façon suivante : dans un tube ajouter 1 μl de sonde d'ADN double brin, 2 μl de forward buffer, 1.5 μl de P32 ATP (3000 Ci/mM, 10 mCi/ml), 4.5 μl d'eau et 1 μl de T4 polynucléotide kinase incuber à 370C pendant 30 minutes rajouter au mélange 40 μl d'eau et 2 μl d'EDTA 0.5 M purifier les sondes sur colonne ProbeQuant G-50 micro column (Amersham Biosciences) selon les recommandations du fournisseur diluer la solution de sonde jusqu'à obtenir 50000 cpm/μl
3 - Gel retard
Dans un premier temps, 2 μl de protéines (PPARα, ou PPARγ, ou RXRα, ou PPARα+RXRα, ou PPARγ+RXRα) ont été incubées 20 min à température ambiante avec 1 μl de sonde radiomarquée (50000 cpm/μl) dans un tampon renfermant 10 mM Tris Base (pH 8.0), 100 mM KCI, 10% glycérol, 1 mM dithiothréitol, 1 μg poly (dldC) et 0.5 μg de sperme de saumon, en présence ou en absence de 1 μl de compétiteur non marqué (utilisé à une concentration finale 10-fois ou 50-fois supérieure à celle de la sonde marquée, les solutions sont préparées dans le tampon d'hybridation décrit précédemment et ramenées à la concentration 1X avec de l'eau). Lors des expériences de « supershift » un anticorps anti-PPARα humain (anti human PPARα antibody N-19, Santa Cruz Biotechnology) a été rajouté au mélange (0.25 μl d'une solution d'anticorps à 200 μg/ml).
Dans un deuxième temps, le mélange a été soumis à une électrophorèse en gel vertical de 4% de polyacrylamide (gels de #20 cm de longueur) en utilisant comme tampon de migration un tampon Tris Base 45 mM renfermant 45 mM d'acide borique et 1 mM d'EDTA. Après séparation, le gel a été séché et une autoradiographie a été réalisée en exposant le gel séché sur un film Kodak X-AR.
Le cliché autoradiographique permet de visualiser les différentes positions occupées par les complexes PPAR sur le gel d'électrophorèse comme illustré dans les figures 4 à 6. Selon la position de migration, il est possible de déduire si l'interaction entre la séquence PPRE et PPARα est, dans les conditions données, non spécifique (NS) ou spécifique (Shift ou Super Shift lorsqu'un anticorps sélectif est utilisé).

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un polynucléotide comprenant i) une séquence de formule (I)
- TGACCTNOGGGCT-
dans laquelle A, C, G et T désignent respectivement les bases adénine, cytosine, guanine et thymine, N représente une base nucléotidique naturelle ou synthétique quelconque modifiée ou non et O représente une base qui est A, T ou U; ou ii) une séquence complémentaire de (I) telle que définie sous i), ladite séquence (I) ou complémentaire de (I) permettant l'interaction sélective dudit polynucléotide avec un ou plusieurs éléments constitutifs du complexe de transcription PPARα, pour évaluer l'activité de transcription de PPAR.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la séquence de formule (I) correspond à SEQ ID N0L
3. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la séquence de formule (I) correspond à une séquence choisie parmi SEQ ID N°2, SEQ ID
N°3, SEQ ID N°4, SEQ ID N°5, SEQ ID N°6, SEQ ID N°7, SEQ ID N°8, SEQ ID N°9, SEQ ID N0IO, SEQ ID N°17 et SEQ ID N°18.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit polynucléotide comprend en outre, une séquence de type PPRE.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit polynucléotide comprend en outre la séquence d'un gène dont la transcription est placée sous le contrôle de PPAR.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit polynucléotide comprend en outre la séquence d'un gène rapporteur.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle l'élément fonctionnel interagissant avec la séquence (I) ou complémentaire de (I) est le complexe de transcription PPARα, en présence d'un ligand spécifique de celui-ci.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle permet de différencier une activité de transcription de type
PPARγ et PPARα.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle l'activité de transcription est dépendante de PPARα.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle l'évaluation de l'activité de transcription de PPAR permet de caractériser de nouvelles séquences de type PPRE.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle permet de diagnostiquer une maladie liée à une dérégulation de l'expression de gènes sous contrôle de PPAR.
12. Utilisation selon la revendication 11 , dans laquelle ladite maladie est une maladie liée à une modification de l'activité de PPAR, telle que rhypertryglycéridémie et le diabète de type II.
13. Un vecteur comprenant au moins une séquence nucléotidique de formule (I) ou complémentaire de (I) telle que définie dans la revendication 1 , et un gène rapporteur.
14. Une cellule hôte contenant un vecteur tel que défini dans la revendication 13 ou un polynucléotide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6.
15. Procédé de dosage de PPARα ou d'un élément constitutif du complexe PPARα, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
1) fixation sur une phase solide d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1;
2) mise en contact d'un échantillon dans lequel PPARα ou un élément constitutif du complexe PPARα est à quantifier; 3) détection de PPARα ou de l'élément constitutif du complexe PPARα retenu par lesdits polynucléotides.
16. Procédé de mise en évidence de composés susceptibles d'interférer avec l'activité de transcription de PPAR, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
1) marquage d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1 ;
2) mise en contact de PPARα et du polynucléotide marqué, en présence d'un ou plusieurs composés;
3) détection des complexes moléculaires marqués.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il permet de mettre en évidence des composés capables d'interagir sélectivement avec PPARα.
18. Procédé de détermination de la spécificité d'une séquence nucléotidique de type PPRE, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
1) marquage du complexe formé par les protéines PPAR-RXR;
2) mise en contact du complexe PPAR-RXR marqué avec un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1 , 2 ou 3 fixé sur un support;
3) ajout dans la phase libre d'une concentration de la séquence nucléotidique de type PPRE dont on cherche à déterminer la spécificité;
4) détection des complexes moléculaires formés autour du complexe PPAR-RXR marqué.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, dans lequel on utilise un polynucléotide témoin n'interagissant pas avec PPAR, ledit polynucléotide témoin correspondant à un polynucléotide tel que défini dans les revendication 1 , 2 ou 3 dans lequel la séquence de formule (I) ou complémentaire de (I) a été mutée ou a subi une délétion.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le polynucléotide témoin comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID N°11 , SEQ ID N°12, SEQ ID N°19 et SEQ ID N°20.
21. Procédé de mise en évidence de composés capables d'augmenter ou de diminuer l'activité de transcription de PPARα, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
1) transformation d'une cellule hôte à l'aide d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 6, comprenant une séquence PPREα et un gène rapporteur;
2) mise en culture de la cellule hôte obtenue à l'étape 1);
3) mise en contact de la cellule hôte cultivée à l'étape 2) avec le composé ou le mélange de composés à tester;
4) détection de l'expression du gène rapporteur.
22. Procédé de mise en évidence de composés, suivant la revendication 21 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
1) transformation d'une cellule hôte à l'aide d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 6, comprenant une séquence PPREα et un gène rapporteur;
2) transformation d'une cellule hôte témoin à l'aide d'un polynucléotide témoin tel que défini dans les revendications 19 et 20;
3) mise en culture des cellules hôtes obtenues aux étapes 1 ) et 2); 4) mise en contact des cellules hôtes cultivées avec le composé ou le mélange de composés à tester;
5) détection de l'expression du gène rapporteur;
6) comparaison des résultats obtenus.
23. Procédé de préparation d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend une étape consistant en
1) la synthèse chimique directe et programmée; ou
2) la réplication d'une séquence PPREα d'intérêt dans une cellule hôte; ou
3) l'amplification d'une séquence PPREα d'intérêt par PCR.
24. Kit de caractérisation des interactions entre séquences polynucléotidiques de type PPRE et complexes de transcription de type PPAR, caractérisé en ce qu'il comprend au moins: une préparation d'au moins un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1 , 2 ou 3; - une préparation des protéines purifiées PPAR-RXR, dont un des membres au moins est marqué; un moyen de détection des molécules marquées.
25. Kit selon la revendication 24, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre un polynucléotide témoin tel que défini dans la revendication 19 ou 20, et/ou une séquence de type PPREγ et/ou une séquence de type PPREα/γ.
26. Kit selon l'une des revendications 24 et 25, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, un substrat spécifique marqué ou non marqué permettant d'incuber PPAR en présence d'un polynucléotide qui lui est spécifique.
27. Un médicament caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide tel que défini dans les revendications 1 , 2 ou 3.
28. Utilisation d'un polynucléotide tel que défini dans la revendication 1 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement d'une maladie liée à une modification de l'activité de PPAR, telle que l'hypertryglycéridémie, le diabète de type II ou les lipodystrophies.
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Non-Patent Citations (4)

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