Implantat zur Behandlung von osteochondralen Defekten, sowie Verfahren zu dessen HerstellungImplant for the treatment of osteochondral defects, and process for its preparation
Die Erfindung betrifft ein Implantat zur Behandlung von osteochondralen Defekten, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung.The invention relates to an implant for the treatment of osteochondral defects, and to a method for its production.
Osteochondrale Defekte, also Defekte, die sowohl den Gelenkknorpel als auch den direkt darunter befindlichen Knochen umfassen, können auf zweierlei Art entstehen: zum einen durch fortgeschrittene entzündliche Prozesse wie Arthrosen, welche neben dem Knorpelgewebe auch schon den Knochen geschädigt haben, und zum anderen durch Verletzungen oder weit fortgeschrittenen Verschleiß.Osteochondral defects, ie defects that involve both the articular cartilage and the bone directly beneath it, can arise in two ways: on the one hand by advanced inflammatory processes such as arthrosis, which have already damaged the bone next to the cartilaginous tissue, and on the other hand by injuries or far advanced wear.
Osteochondrale Defekte werden zum Teil aber auch aus therapeutischen Gründen vom Arzt bewusst erzeugt: da sich ein reines Knorpel-Implantat in der nur 2 mm bis 5 mm dicken Knorpelschicht der Gelenke schlecht verankern lässt, wird manchmal nicht nur das geschädigte Knorpelgewebe entfernt, sondern der Defekt absichtlich in Richtung des darunter liegenden Knochens vergrößert, um im Anschluss daran ein Implantat dann besser fixieren zu können.Osteochondral defects are also partly consciously produced by the doctor for therapeutic reasons: since a pure cartilage implant can hardly be anchored in the cartilage layer of the joints, which is only 2 mm to 5 mm thick, sometimes not only the damaged cartilage tissue is removed, but the defect as well intentionally enlarged in the direction of the underlying bone, in order then fix an implant then better.
Zur Behandlung der Defekte werden sowohl Implantate, die aus natürlichem Gewebe gewonnen werden, als auch Implantate mit Gewebeersatzmaterialien, die meist durch Tissue Engineering hergestellt werden, verwendet. Zur Herstellung von Implantaten durch Tissue Engineering wird im ersten Schritt eine die extrazelluläre Struktur imitierende Matrix mit vielen Hohlräumen aus vorzugsweise biologisch abbaubaren Materialien geschaffen, deren Hohlräume dann im nächsten Schritt mit vorwiegend körpereigenen Zellen besiedelt und durch Schaffung entsprechender Wachstumsbedingungen ausgefüllt werden. Es ist auch bekannt, Zellen in gelartigen Trägermaterialien zu immobilisieren. Matrixmaterial und Zellen werden spezifisch danach ausgewählt, ob ein knöchernes oder ein Knorpelgewebe implantiert werden soll.To treat the defects, both implants derived from natural tissue and implants with tissue replacement materials, most commonly made by tissue engineering, are used. For the production of implants by tissue engineering, in the first step an extracellular structure-imitating matrix with many cavities of preferably biodegradable materials is created, the cavities of which are then colonized in the next step with predominantly autologous cells and filled by creating appropriate growth conditions. It is also known to immobilize cells in gelatinous carrier materials. Matrix material and cells are specifically selected according to whether a bony or a cartilaginous tissue is to be implanted.
Implantate, die an der Grenzfläche von zwei oder mehr unterschiedlichen Gewebetypen eingesetzt werden sollen, sind optimalerweise bi- oder mehrphasisch aufgebaut, um den Anforderungen aller jeweiligen Umgebungsgewebe gerecht zu werden, mit denen das Implantat in Kontakt kommt.Implants to be used at the interface of two or more different tissue types are optimally biphasic or polyphasic in order to meet the requirements of all the respective surrounding tissues with which the implant comes into contact.
Bereits bekannte biphasische Implantatmaterialien für osteochondrale Defekte bestehen jeweils aus zwei gänzlich unterschiedlichen Material-Komponenten, die dann zu einem Werkstück zusammengesetzt werden. Für die Knochenmatrix werden z. B. poröse
Calciumphosphat-Keramiken (ß-TCP) und für die Knorpelmatrix Gele verwendet. Das Problem dieser zusammengesetzten Implantate ist die Verbindung der unterschiedlichen Komponenten. Nach dem Stand der Technik erfolgt diese z. B. durch Verklebung mit Fibrinkleber, welche allerdings den im Gelenk auftretenden Scherbelasrungen auf Dauer nicht gewachsen ist.Previously known biphasic implant materials for osteochondral defects each consist of two completely different material components, which are then assembled to form a workpiece. For the bone matrix z. B. porous Calcium phosphate ceramics (ß-TCP) and gels used for cartilage matrix. The problem with these composite implants is the connection of the different components. According to the prior art, this z. As by gluing with fibrin glue, which, however, is not equal to the occurring in the joint Scherbelasrungen in the long run.
DE 197 21 661 beschreibt beispielsweise ein Knochen-Knorpel-Implantat, welches aus einer Vielzahl von regelmäßig in einem Gitter angeordneten Stäben besteht. Die Verbindung der Gitterstrukturen geschieht zum einen durch Kleben und zum anderen durch Verschmelzen bzw. Schweißen der Gittermaterialien. Letzteres schafft einen festeren Verbund, setzt aber entsprechende Materialien voraus.DE 197 21 661, for example, describes a bone-cartilage implant which consists of a plurality of rods regularly arranged in a grid. The connection of the lattice structures happens on the one hand by gluing and on the other hand by fusing or welding of the mesh materials. The latter creates a firmer bond, but requires appropriate materials.
In der WO 97/46665 nach Fig. 2 ist ein biphasisches Implantat beschrieben. Eine Kammer wird an einer Seite von einer porösen Knochenmatrix abgeschlossen. Die Kammer wird mit Knorpelzellen besiedelt. Die Knorpelzellen wachsen in die Knochenmatrix ein. Dadurch und durch die Produktion der Knorpelmatrix entsteht ein fester Verbund beider Schichten, ohne dass eine Klebeverbindung erforderlich wäre. Die Besiedelung mit den Knorpelzellen muss vor der Operation erfolgen.In WO 97/46665 of Fig. 2, a biphasic implant is described. A chamber is closed on one side by a porous bone matrix. The chamber is populated with cartilage cells. The cartilage cells grow into the bone matrix. As a result of this and the production of the cartilage matrix, a firm bond of both layers is produced without the need for an adhesive bond. The colonization with the cartilage cells must be done before the operation.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Implantat zur Behandlung von osteochondralen Defekten anzugeben, bei dem Knochen- und Knorpelmatrix fest miteinander verbunden sind.The object of the invention is to specify an implant for the treatment of osteochondral defects in which the bone and cartilage matrix are firmly connected to one another.
Die Aufgabe wird erfmdungsgemäß gelöst durch ein Implantat mit wenigstens zwei übereinanderliegenden Schichten, darunter einer porösen Knochenmatrix und einer porösen Knorpelmatrix, wobei die Schichtmaterialien an den Grenzflächen der sich berührenden Schichten lokal vermischt sind.The object is achieved according to the invention by an implant having at least two superimposed layers, including a porous bone matrix and a porous cartilage matrix, wherein the layer materials are locally mixed at the interfaces of the contacting layers.
Die lokale Vermischung bewirkt ein Ineinandergreifen der Schichten an ihren Berührungsstellen bis hinunter zur molekularen Ebene. In einem schmalen Bereich durchdringen sich die Schichtmaterialien. Im Grenzflächenbereich liegen vergleichsweise ähnliche Verknüpfungen der Matrixmoleküle vor wie innerhalb der Schichten. Hierdurch werden die Schichten auch ohne Kleber stark miteinander verbunden. Die Verbindung ist auch auf Scherkräfte belastbar.The local mixing causes the layers to intermesh at their points of contact down to the molecular level. In a narrow area, the layer materials penetrate. In the interface region, comparatively similar linkages of the matrix molecules are present as within the layers. As a result, the layers are strongly bonded even without glue. The compound is also resilient to shear forces.
Ein solches Implantat mit wenigstens zwei Schichten, darunter eine poröse Knochen- und eine poröse Knorpelmatrix, wird erfindungsgemäß hergestellt mit den Schritten a) Herstellen der einzelnen Schichten bzw. des jeweiligen Schichtmaterials, wobei wenigstens eine Schicht bzw. ein Schichtmaterial mit einem Lösungsmittel, das wenigstens die
Oberflächen der anderen Schichten anlösen kann, in einen pastösen oder flüssigen Zustand überführt wird, b) Übereinanderlegen oder -schichten der Schichten bzw. Schichtmaterialien und c) Gefriertrocknen des Verbundes.Such an implant with at least two layers, including a porous bone and a porous cartilage matrix, is produced according to the invention with the steps of a) producing the individual layers or the respective layer material, wherein at least one layer or a layer material with a solvent which at least the Can dissolve surfaces of the other layers, is converted into a pasty or liquid state, b) superimposing or layers of the layers or layer materials and c) freeze-drying of the composite.
Dadurch, dass die Schichten zumindest teilweise in fließfähiger oder pastöser Form vorliegen und ein Lösungsmittel enthalten, das auch die Oberfläche der benachbarten Schicht anlösen kann, vermischen sich die Schichten lokal an den sich berührenden Grenzflächen.Because the layers are at least partially in flowable or pasty form and contain a solvent that can also dissolve the surface of the adjacent layer, the layers mix locally at the contacting interfaces.
Das Lösungsmittel der Schichten ist dabei so ausgewählt, dass es während des Gefriertrocknens, d. h. durch das Anlegen eines Vakuums an das eingefrorene Material, direkt aus dem gefrorenen Zustand in den gasförmigen Zustand übergeht. Neben Wasser sind Essigsäure und Cyclohexan weitere bevorzugte Lösungsmittel.The solvent of the layers is selected so that during freeze-drying, i. H. by applying a vacuum to the frozen material, passes directly from the frozen state to the gaseous state. Besides water, acetic acid and cyclohexane are further preferred solvents.
Die Porengröße der Matrixschichten wird dabei vorzugsweise durch Einfrieren eingestellt. Durch Gefriertrocknen bleiben an den Stellen, an denen im gefrorenen Zustand Lösungsmittelkristalle enthalten waren, Poren zurück. Es wird ein schwammartiger, schaumstoffähnlicher Werkstoff gebildet, der eine Vielzahl statistisch verteilter Poren enthält, die in einem nach außen offenen Porensystem angeordnet sind. (s. a. M. Gelinsky, U. König, A. Sewing, W. Pompe: Poröse Scaffolds aus mineralisiertem Kollagen - ein biomimetisches Knochenersatzmaterial. Materialwiss. Werkstofftech. 2004, 35, 229-233).The pore size of the matrix layers is preferably adjusted by freezing. By freeze-drying, pores remain at the points where solvent crystals were contained in the frozen state. A sponge-like, foam-like material is formed which contains a plurality of randomly distributed pores arranged in an outwardly open pore system. (See M. Gelinsky, U. König, A. Sewing, W. Pompe: Porous scaffolds of mineralized collagen - a biomimetic bone substitute material., Materials Science., 2004, 35, 229-233).
Das Implantat kann vorteilhaft beliebig geformt sein und damit in seiner äußeren Geometrie an die Größe und Struktur des zu ersetzenden Knochen- und Knorpel-Gewebes angepasst werden.The implant can advantageously be shaped as desired and thus adapted in its outer geometry to the size and structure of the bone and cartilage tissue to be replaced.
Das erfindungsgemäße Implantat ist im feuchten Zustand elastisch und passt sich damit der Defektgeometrie an, was einen guten Kontakt zwischen den Geweben und dem Implantatmaterial garantiert. Außerdem erlaubt die Elastizität eine Vorkultivierung mit Zellen unter zyklischer mechanischer Stimulation. Seine Druckfestigkeit ist höher als bei konventionell hergestellten, unvernetzten Kollagenschwämmchen vergleichbarer Porosität, deren Poren zumeist bereits beim Anfeuchten kollabieren; es wird daher bevorzugt für die Therapie kleinerer bis mittlerer Defekte verwendet. In zyklischen Druckexperimenten weist ein Implantat mit Zylindergeometrie bei einer 30%igen uniaxialen Kompression in Richtung der Zylinderachse bevorzugt einen E-Modus von 10-40 kPa, besonders bevorzugt 15 bis 25 kPa auf.The implant according to the invention is elastic in the wet state and thus adapts to the defect geometry, which guarantees good contact between the tissues and the implant material. In addition, the elasticity allows precultivation with cells under cyclic mechanical stimulation. Its compressive strength is higher than that of conventionally produced, uncrosslinked collagen sponges of comparable porosity, the pores of which usually collapse when moistened; It is therefore preferably used for the therapy of minor to moderate defects. In cyclic pressure experiments, an implant with cylinder geometry with a 30% uniaxial compression in the direction of the cylinder axis preferably has an E-mode of 10-40 kPa, more preferably 15 to 25 kPa.
Das Implantat ist porös, mit nach außen offenen und interkonnektierenden Poren, vorzugsweise komplett resorbierbar und kann entweder zellfrei, oder aber in vitro
vorbesiedelt mit einem oder mehreren Zelltypen implantiert werden. Die durchschnittliche Porengröße beträgt bevorzugt mindestens 80 μm, besonders bevorzugt 100 bis 200 μm, ein Durchmesser, der optimal für die Besiedlung mit Zellen ist. Knochenanteil und Knorpelanteil weisen bevorzugt eine vergleichbare Porosität auf (gleiche durchschnittliche Porengröße, Verteilung der Poren). Unter resorbierbarem Material ist hier und im folgenden Text zu verstehen, dass das Material nach der Implantation im Körper langsam durch biologische oder chemische Prozesse abgebaut wird bzw. sich langsam auflöst. Eine partielle Resorption des Materials kann auch während der Zellkultivierung in vitro einsetzen.The implant is porous, with outwardly open and interconnecting pores, preferably completely resorbable, and may be either cell-free or in vitro pre-populated with one or more cell types. The average pore size is preferably at least 80 .mu.m, more preferably 100 to 200 .mu.m, a diameter which is optimal for colonization with cells. Bone content and cartilage proportion preferably have a comparable porosity (same average pore size, distribution of pores). By resorbable material is meant here and in the following text that the material is slowly degraded after implantation in the body by biological or chemical processes or slowly dissolves. Partial absorption of the material may also be used during cell culture in vitro.
Das Implantat wird binnen 3 bis 24 Wochen, bevorzugt zwischen 4 und 8 Wochen, im Körper vollständig resorbiert und zu lebendem Gewebe umgebaut.The implant is fully resorbed in the body within 3 to 24 weeks, preferably between 4 and 8 weeks, and converted into living tissue.
Zur Behandlung eines osteochondralen Defektes wird der nicht-mineralisierte Knorpelersatzanteil vorzugsweise mit autologen Knorpelzellen (Chondrozyten) besiedelt. Der Knochenanteil wird in einer besonderen Ausführungsform mit autologen Knochenzellen (Osteoblasten) oder auch autologen mesenchymalen Stammzellen des Patienten vorbesiedelt.For treating an osteochondral defect, the non-mineralized portion of cartilage replacement is preferably populated with autologous cartilage cells (chondrocytes). The bone content is in a particular embodiment pre-colonized with autologous bone cells (osteoblasts) or autologous mesenchymal stem cells of the patient.
Die Knochenmatrix besteht im wesentlichen aus fibrillärem Kollagen Typ I, welches vorzugsweise mit Calciumphosphat, besonders bevorzugt mit Hydroxylapatit (HAP), mineralisiert ist - und imitiert damit die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix des Knochengewebes.The bone matrix consists essentially of fibrillar collagen type I, which is preferably mineralized with calcium phosphate, more preferably with hydroxyapatite (HAP) - and thus mimics the composition of the extracellular matrix of the bone tissue.
Das mineralisierte Kollagen wird bevorzugt nach dem bereits aus EP0945146 oder EP0945147 bekannten Verfahren hergestellt.The mineralized collagen is preferably prepared by the process already known from EP0945146 or EP0945147.
Die Knorpelmatrix besteht bevorzugt aus fibrillärem, nicht-mineralisiertem Kollagen Typ I und/oder Kollagen Typ II oder Hyaluronsäure bzw. Hyaluronsäure-Derivaten oder aus einem Komposit aus Kollagen und Hyaluronsäure oder Hyaluronsäure-Derivaten und gegebenenfalls weiteren Bestandteilen der extrazellulären Knorpelmatrix, wie Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat und/oder Heparansulfat.The cartilage matrix preferably consists of fibrillar, non-mineralized collagen type I and / or collagen type II or hyaluronic acid or hyaluronic acid derivatives or of a composite of collagen and hyaluronic acid or hyaluronic acid derivatives and optionally other constituents of the extracellular cartilage matrix, such as chondroitin sulfate, dermatan sulfate , Keratan sulfate and / or heparan sulfate.
Bevorzugt wird der Komposit aus fibrillärem Kollagen und Hyaluronsäure dadurch gebildet, dass die Hyaluronsäure während der Fibrillogenese des Kollagens anwesend ist und damit zumindest teilweise in die sich während der Fibrillogenese bildenden Kollagenfibrillen eingebaut wird. Dadurch entsteht ein Kompositmaterial, in dem beide Komponenten homogen verteilt und miteinander verbunden sind.Preferably, the composite of fibrillar collagen and hyaluronic acid is formed in that the hyaluronic acid is present during fibrillogenesis of the collagen and thus at least partially incorporated into the collagen fibrils forming during fibrillogenesis. This creates a composite material in which both components are homogeneously distributed and interconnected.
Das Kollagen für die Knochenmatrix ist bevorzugt vom Typ I, welches als humanes Kollagen rekombinant hergestellt oder aus Rindersehnen oder anderen tierischen Quellen isoliert wurde
und zur klinischen Anwendung zugelassen ist. Bevorzugt wird ein säurelösliches Kollagen gewählt, wie z. B säurelösliches bovines Kollagen I des Herstellers Syntacoll (Saal/Donau, Deutschland).The collagen for the bone matrix is preferably Type I which has been recombinantly produced as human collagen or isolated from bovine tendons or other animal sources and is approved for clinical use. Preferably, an acid-soluble collagen is selected, such as. B acid-soluble bovine collagen I from the manufacturer Syntacoll (Saal / Danube, Germany).
Das Kollagen für die Knorpelmatrix ist bevorzugt vom Typ I oder II oder eine Mischung beider Typen. Es wird als humanes Kollagen ebenfalls bevorzugt rekombinant hergestellt oder aus Kalbshaut bzw. anderen tierischen Quellen isoliert und sollte zur klinischen Anwendung zugelassen sein, wie beispielsweise das Produkt Collaplex 1.0 des Herstellers GfN (Waldmichelbach, Deutschland).The collagen for the cartilage matrix is preferably type I or II or a mixture of both types. It is also preferably recombinantly produced as human collagen or isolated from calf skin or other animal sources and should be approved for clinical use, such as the product Collaplex 1.0 from the manufacturer GfN (Waldmichelbach, Germany).
Die Hyaluronsäure für die Knorpelmatrix ist bevorzugt eine durch Mikroorganismen (z. B. Streptococcus equi) hergestellte. Der Begriff Hyaluronsäure schließt dabei auch ihre Salze mit ein, wie z. B. das von Fa. Fluka angebotene Produkt Hyaluronsäure Natriumsalz mit einer Löslichkeit in Wasser von 5 mg/ml. Bevorzugte Hyaluronsäure-Derivate sind Hyaluronsäure- Ester (z. B. Benzylester).The hyaluronic acid for the cartilage matrix is preferably one produced by microorganisms (eg Streptococcus equi). The term hyaluronic acid also includes its salts, such as. As the product offered by Fa. Fluka product hyaluronic acid sodium salt having a solubility in water of 5 mg / ml. Preferred hyaluronic acid derivatives are hyaluronic acid esters (eg benzyl esters).
In einer besonderen Ausführungsform des Implantats liegt zwischen den Schichten für den Knochenersatz und für den Knorpelersatz eine filmartige, aus resorbierbaren Biopolymeren bestehende porenlose bzw. -arme Zwischenschicht.In a particular embodiment of the implant lies between the layers for the bone substitute and for the cartilage replacement a film-like, resorbable biopolymers existing pore-less or -arme intermediate layer.
Die Zwischenschicht besteht dabei bevorzugt aus einem Biopolymer, das wenigstens an der Oberfläche vom Lösungsmittel der Schichten für den Knochenersatz und den Knorpelersatz anlösbar ist. Dadurch sind die Materialien der sich berührenden Schichten an den jeweiligen Grenzflächen ebenfalls lokal vermischt.The intermediate layer preferably consists of a biopolymer which is dissolvable at least on the surface by the solvent of the layers for the bone substitute and the cartilage replacement. As a result, the materials of the contacting layers are also locally mixed at the respective interfaces.
Bevorzugt besteht die Zwischenschicht aus einer Folie aus Hyaluronsäure oder Hyaluronsäure-Drivaten oder einer Folie aus einem anderen Glycosaminoglycan, wie z. B. Chondroitinsulfat, Dermatansulfat, Keratansulfat und Heparansulfat, Die Zwischenschicht wird bevorzugt an Luft getrocknet. Sie ist dabei im Vergleich zur Knochen- bzw. Knorpelmatrix weitgehend porenlos und dadurch für Chondrozyten und/oder Osteoblasten bzw. mesenchymale Stammzellen undurchlässig Sie erfüllt damit eine Doppelfunktion. Hinsichtlich der Festigkeit des Implantats verbindet sie und in Bezug auf das Einwachsen der Zellen wirkt sie als Trennschicht.Preferably, the intermediate layer consists of a film of hyaluronic acid or hyaluronic acid Drivaten or a film of another glycosaminoglycan, such as. B. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate and heparan sulfate, the intermediate layer is preferably dried in air. Compared to the bone or cartilage matrix, it is largely pore-free and thus impermeable to chondrocytes and / or osteoblasts or mesenchymal stem cells. It thus fulfills a dual function. In terms of strength of the implant connects them and in terms of ingrowth of the cells acts as a release layer.
In einer vorzugsweisen Ausführung enthält das Implantat eine Stützstruktur mit Öffnungen. Die Stützstruktur versteift das Implantat. Durch die Öffnungen können sich die Schichtmaterialien direkt berühren und ebenfalls lokal vermischen
Bevorzugt wird als Stützstruktur ein zwei- oder dreidimensionale Gestick aus resorbierbaren und biokompatiblen Polymerfasern (bevorzugt aus Poly-L-lactid, Poly-DL-lactid, Polyglykolid, Polyhydroxybutyrat oder Copolymeren aus diesen) eingesetzt.In a preferred embodiment, the implant includes a support structure with openings. The support structure stiffens the implant. Through the openings, the layer materials can touch each other directly and also mix locally Preferably, a two- or three-dimensional embroidery of resorbable and biocompatible polymer fibers (preferably of poly-L-lactide, poly-DL-lactide, polyglycolide, polyhydroxybutyrate or copolymers thereof) is used as the support structure.
In einer weiteren Ausführungsform bestellt die Stützstruktur aus einem mit Fasern beflockten Trägermaterial gemäß DE 103 12 144.7, wobei der Abstand zwischen den Flockfasern so dimensioniert sein muss, dass die flüssigen Matrixmaterialien die Zwischenräume vollständig ausfüllen können. Der bevorzugter Abstand der Fasern liegt hierbei bei ca. 200-1000 μm.In a further embodiment, the support structure is ordered from a fiber-flocked support material according to DE 103 12 144.7, wherein the distance between the flock fibers must be dimensioned so that the liquid matrix materials can completely fill the interstices. The preferred spacing of the fibers is approximately 200-1000 μm.
Durch die parallele Anordnung der Flockfasern wird eine mechanische Stabilisierung in Richtung der Fasern erreicht.The parallel arrangement of the flock fibers achieves mechanical stabilization in the direction of the fibers.
Als Materialien des Basismaterials, der Fasern und des Klebstoffs kommen grundsätzliche alle in DE 103 12 144.7 genannten resorbierbaren Materialien in Betracht.As materials of the base material, of the fibers and of the adhesive, it is possible to use in principle all absorbable materials mentioned in DE 103 12 144.7.
Bevorzugte Materialien für die Fasern sind Polyhydroxybutyrate oder Polylactide und als Klebstoff findet bevorzugt Gelatine Verwendung.Preferred materials for the fibers are polyhydroxybutyrates or polylactides, and gelatin is preferably used as the adhesive.
Das Trägermaterial gemäß DE 103 12 144.7 besteht dabei bevorzugt aus einer Schicht eines Basismaterial, welches auf einer Seite mit Fasern beflockt ist. Bevorzugt besteht das Basismaterial selbst aus einem Tape aus mineralisiertem Kollagen und bildet die unterste Schicht des Knochenersatzanteils. Der poröse Knochenersatzmaterialanteil liegt dabei bevorzugt auf dem Tape aus mineralisiertem Kollagen auf und umgibt die Fasern, bevorzugt jedoch nur den unteren Teil oder die unteren Enden (d. h. die Enden der Fasern, die mit dem Basismaterial verbunden sind). Die Knorpelersatzanteilschicht schließt sich dabei bevorzugt so an die Knochenersatzmaterialanteilschicht an, dass ein Teil der Fasern oder die Spitzen der Fasern noch in die Knorpelmatrix hineinragen.The carrier material according to DE 103 12 144.7 preferably consists of a layer of a base material which is flocked on one side with fibers. Preferably, the base material itself consists of a tape of mineralized collagen and forms the lowest layer of the bone replacement portion. The porous bone substitute material portion is preferably on the mineralized collagen tape and surrounds the fibers, but preferably only the lower part or ends (i.e., the ends of the fibers bonded to the base material). The cartilage replacement share layer preferably adjoins the bone substitute material portion layer in such a way that some of the fibers or the tips of the fibers still protrude into the cartilage matrix.
In einer besonderen Variante des erfindungsgemäßen Implantats enthält der Knochen¬ ersatzanteil und/oder der Knorpelersatzanteil Wirkstoffe, wie z. B. pharmazeutische Stoffe, Aminosäuren oder Aminosäurederivate, Peptide, Proteine, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Antikörper, Oligonukleotide, cDNA, DNA-Fragmente, Nukleinsäuren oder Nukleinsäurederivate.In a particular variant of the implant according to the invention, the bone replacement component and / or the cartilage replacement component contain active substances, such as, for example, As pharmaceutical substances, amino acids or amino acid derivatives, peptides, proteins, growth factors, cytokines, antibodies, oligonucleotides, cDNA, DNA fragments, nucleic acids or nucleic acid derivatives.
Vorteilhaft lassen sich mit dem Verfahren leicht Implantate in beliebiger Form und Größe und somit - für die Herstellung von Implantaten für osteochondrale Defekte - auch mit einem individuellen Dicke- Verhältnis von Knochenersatzanteil und Knorpelersatzanteil erzeugen.
Das Übereinanderschichten geschieht bevorzugt durch Übereinandergießen in einem dreidimensionalen Behälter. Zum Zeitpunkt des Übereinanderschichtens liegen dazu die Matrixmaterialien bevorzugt in pastöser oder flüssiger Form vor.Advantageously, the method can easily implants in any shape and size and thus - for the production of implants for osteochondral defects - also produce an individual thickness ratio of bone replacement and cartilage replacement. The stacking is preferably done by pouring over in a three-dimensional container. At the time of stacking, the matrix materials are preferably present in pasty or liquid form.
Geometrie und Größe des Implantats werden durch die Geometrie und Größe des zum Übereinanderschichten der Schichten verwendeten Behälters bestimmt, der vorteilhaft beliebig geformt sein kann. Außerdem kann sowohl der eingefrorene Körper (vor der Gefriertrocknung) als auch das gefriergetrocknete Implantat durch Schneiden, Fräsen, Bohren oder dergl. bearbeitet werden und damit die Größe und Form des Implantats vorteilhaft weiter angepasst werden.The geometry and size of the implant are determined by the geometry and size of the container used for stacking the layers, which can advantageously be shaped as desired. In addition, both the frozen body (before lyophilization) and the freeze-dried implant can be machined by cutting, milling, drilling, or the like, and thus advantageously further adjusting the size and shape of the implant.
Die Mikrostruktur der Poren, insbesondere die Porengröße, des Implantats ist abhängig von der Größe der während des Einfrierens gebildeten Lösungsmittelkristalle. Diese kann vorteilhaft durch Geschwindigkeit und Temperatur des Einfrierens eingestellt werden. Poren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 100 bis 250 μm, der optimal für das Einwachsen von Zellen ist, werden vorteilhaft durch langsames Einfrieren bei -5°C bis -50°C, vorzugsweise -15°C bis -35°C gebildet. Das langsame Einfrieren wird beispielsweise dadurch erreicht, dass der übereinandergeschichtete Knochersatzanteil und der Knorpelersatzanteil, bzw. der Behälter, der diese enthält, in einen auf die entsprechende Temperatur vortemperierten Gefrierschrank gestellt wird.The microstructure of the pores, in particular the pore size, of the implant is dependent on the size of the solvent crystals formed during the freezing. This can be advantageously adjusted by the speed and temperature of the freezing. Pores having an average diameter of 100 to 250 μm, which is optimal for ingrowth of cells, are advantageously formed by slow freezing at -5 ° C to -50 ° C, preferably -15 ° C to -35 ° C. The slow freezing is achieved, for example, by placing the stacked bone substitute portion and the cartilage replacement portion, or the container containing it, in a freezer preheated to the corresponding temperature.
Die Mikrostruktur der Poren wird auch durch den Lösungsmittelgehalt der Schichten für den Knochersatzanteil und den Knorpelersatzanteil beeinflusst. Um die gewünschte, hohe Porosität zu erhalten, enthalten beide Schichten vor dem Einfrieren bevorzugt 75 bis 98%, besonders bevorzugt 80 bis 90% LösungsmittelThe microstructure of the pores is also influenced by the solvent content of the layers for the bone substitute fraction and the cartilage replacement fraction. In order to obtain the desired, high porosity, both layers preferably contain 75 to 98%, particularly preferably 80 to 90%, of solvent before freezing
In einer besonderen Variante des Verfahrens wird zunächst die eine Schicht in einen Behälter gegossen und eingefroren. Vor oder bei dem Übereinanderschichten mit der zweiten Schicht wird dann die erste (gefrorene) Schicht an der Oberfläche angetaut. Die zweite Schicht vermischt sich dann lokal mit der angetauten Oberfläche. Die zweite Schicht wird dazu entweder auf die angetaute Oberfläche gegossen, oder selbst etwas erwärmt, so dass die Oberfläche der ersten Schicht durch das Übereinanderschichten selbst angetaut wird. Bevorzugt wird hier die gefrorene Schicht vor dem Übereinandergießen durch Schneiden, Fräsen, Bohren oder dergl. an die gewünschte Form angepasst. Diese Variante hat damit den Vorteil, dass die Verbundfläche zwischen Knochenersatzanteil und Knorpelersatzanteil beliebig dreidimensional gestaltet und damit an die natürliche Form des Gelenks angepasst
werden kann. Darüberhinaus kann durch eine dreidimensionale Verbundfläche die Festigkeit des Implantats gegenüber einer zweidimensionalen Verbundfläche erhöht werden.In a particular variant of the method, first the one layer is poured into a container and frozen. Before or during the superposition with the second layer, the first (frozen) layer on the surface is then thawed. The second layer then mixes locally with the thawed surface. For this, the second layer is either poured onto the thawed surface, or even slightly heated, so that the surface of the first layer is thawed by the superposition itself. Preferably, the frozen layer is adapted to the desired shape by cutting, milling, drilling or the like before the superimposing. This variant thus has the advantage that the composite surface between bone replacement portion and cartilage replacement portion designed arbitrarily three-dimensional and adapted to the natural shape of the joint can be. In addition, the strength of the implant over a two-dimensional composite surface can be increased by a three-dimensional composite surface.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das nach der Gefriertrocknung erhaltene Implantat chemisch quervernetzt, um die Schichten durch die Einführung chemischer Bindungen in sich zu stabilisieren und fest miteinander zu verknüpfen. Die Einführung chemischer Bindung geschieht bevorzugt mit einem chemischen Crosslinker, wie z. B. Glutaraldehyd oder einem Carbodiimid-Derivat, besonders bevorzugt mit EDC (N- Dimethylaminopropyl-N'-ethyl-carbodiimid Hydrochlorid). Durch EDC als chemischen Crosslinker werden beispielsweise Aminoguppen des Kollagens kovalent mit Carboxylgruppen zu Arnidbindungen verknüpft sowie Carboxylgruppen des Kollagens bzw. der Hyaluronsäure kovalent mit Hydroxylgruppen der Hyaluronsäure zu Esterbindungen verknüpft.In a preferred embodiment of the invention, the implant obtained after lyophilization is chemically cross-linked to stabilize the layers in themselves by the introduction of chemical bonds and to firmly bond them together. The introduction of chemical bonding is preferably done with a chemical crosslinker, such. As glutaraldehyde or a carbodiimide derivative, particularly preferably with EDC (N-dimethylaminopropyl-N'-ethyl-carbodiimide hydrochloride). For example, by using EDC as a chemical crosslinker, amino groups of collagen are covalently linked to aryl bonds with carboxyl groups and carboxyl groups of collagen or hyaluronic acid are covalently linked to hydroxyl groups of hyaluronic acid to form ester bonds.
Zur mechanischen Verstärkung kann eine Stützstruktur, bevorzugt aus resorbierbaren und biokompatiblen Polymerfasern (bevorzugt aus Poly-L-lactid, Poly-DL-lactid, Polyglykolid, Polyhydroxybutyrat oder Copolymeren aus diesen), in das Implantat eingebracht werden. Hierzu wird eine zwei-, oder dreidimensionale Faserstruktur, bevorzugt erzeugt durch Sticken, vor dem Einfüllen der ersten Phase in die Form gelegt. Die gießfähige Lösung oder Suspension der ersten Phase wird nun so darübergegossen, dass die Zwischenräume zwischen den Fasern ausgefüllt werden. Hierzu kann auch ein leichter Unterdruck angelegt oder aber kurz zentrifugiert werden. Anschließend wird wie beschrieben die zweite Phase darübergeschichtet, das Konstrukt eingefroren und gefriergetrocknet. Die Faserstruktur kann sich entweder im gesamten Implantat befinden oder aber nur in einer der beiden Phasen.For mechanical reinforcement, a support structure, preferably of resorbable and biocompatible polymer fibers (preferably of poly-L-lactide, poly-DL-lactide, polyglycolide, polyhydroxybutyrate or copolymers of these), are introduced into the implant. For this purpose, a two- or three-dimensional fiber structure, preferably produced by embroidering, is placed in the mold before filling in the first phase. The pourable solution or suspension of the first phase is then over poured so that the spaces between the fibers are filled. For this purpose, a slight negative pressure can be applied or briefly centrifuged. Then, as described, the second phase is overcoated, the construct is frozen and freeze-dried. The fiber structure can either be in the entire implant or only in one of the two phases.
Zur Herstellung eines Implantates, welches ein vermittels Flocktechnik hergestelltes Trägermaterial gemäß DE 103 12 144.7 enthält, wird entsprechend verfahren: das Trägermaterial wird, mit dem Basismaterial nach unten, in die Form gelegt, in welcher das Implantat hergestellt werden soll. Dann werden, wie beschrieben, die beiden Lösungen oder Suspensionen nacheinander übereinandergegossen. Zum besseren Eindringen der Lösungen oder Suspensionen in die Faserzwischenräume kann ein leichter Unterdruck angelegt oder aber kurz zentrifugiert werden. Die Flockfasern können entweder das Implantat in seiner gesamten Höhe durchdringen, oder aber nur einen Teil derselben. In direktem Kontakt mit dem Basismaterial kann sich entweder der Knochenersatzanteil, oder aber der Knorpelersatzanteil befinden.
Zur Herstellung von Implantaten, welche mit Wirkstoffen funktionalisiert worden sind, können verschiedene Verfahren angewendet werden. Die Wirkstoffe können entweder einer oder beiden Phasen vor dem Übereinanderschichten zugegeben werden, oder aber nach dem ersten Gefriertrocknen (und damit noch vor der chemischen Quervernetzung). Die Wirkstoffe können in fester Form in den Lösungen oder Suspensionen suspendiert werden— oder aber als Lösung auf das gefriergetrocknete Implantat aufgebracht werden. Empfindliche Wirkstoffe, insbesondere Wachstumsfaktoren, welche durch die Prozeßschritte in ihrer biologischen Wirksamkeit beeinträchtigt werden könnten, werden bevorzugt erst nach der chemischen Quervernetzung und der zweiten Gefriertrocknung aufgebracht. Eine weitere Variante stellt die Funktionalisierung des Implantats mit Wirkstoffen direkt vor der Operation dar: in diesem Fall wird der Wirkstoff oder werden die Wirkstoffe in steriler Form auf das gleichfalls sterile Implantat aufgebracht, bevorzugt als Lösung aufgetropft. Der Knochenersatzanteil und der Knorpelersatzanteil kann in allen Fällen entweder mit den selben Wirkstoffen funktionalisiert werden, oder aber mit verschiedenen — oder aber es wird nur der Knochen- oder der Knorpelersatzanteil mit einem oder mehreren Wirkstoffen funktionalisiert.To produce an implant which contains a carrier material produced by means of flock technology according to DE 103 12 144.7, the procedure is analogous: the carrier material, with the base material downwards, is placed in the mold in which the implant is to be produced. Then, as described, the two solutions or suspensions are successively übereinandergegossen. For a better penetration of the solutions or suspensions in the fiber interstices, a slight negative pressure can be applied or briefly centrifuged. The flock fibers can either penetrate the implant in its entire height, or only a part of the same. In direct contact with the base material, either the bone replacement portion or the cartilage replacement portion may be present. For the preparation of implants which have been functionalized with active ingredients, various methods can be used. The active ingredients can be added either one or both phases before stacking, or after the first freeze-drying (and thus before the chemical cross-linking). The active compounds can be suspended in solid form in the solutions or suspensions or else applied as a solution to the freeze-dried implant. Sensitive active substances, in particular growth factors, which could be impaired by the process steps in their biological activity, are preferably applied only after the chemical crosslinking and the second freeze-drying. Another variant represents the functionalization of the implant with active ingredients directly before the operation: in this case, the active ingredient or the active ingredients are applied in sterile form to the likewise sterile implant, preferably as a solution dripped. The bone replacement portion and the cartilage replacement portion can be functionalized in all cases either with the same active ingredients, or with different - or else only the bone or cartilage replacement portion is functionalized with one or more active ingredients.
Anhand der nachfolgend beschriebenen Figuren und Ausfuhrungsbeispiele wird die Erfindung näher erläutert. Im einzelnen sind dies:The invention will be explained in more detail with reference to the figures and exemplary embodiments described below. In detail these are:
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines osteochondralen Defektes A, bei dem sowohl der Gelenkknorpel B als auch der darunterliegende (subchondrale) Knochen C betroffen ist.Fig. 1 shows a schematic representation of an osteochondral defect A, in which both the articular cartilage B and the underlying (subchondral) bone C is affected.
Fig. 2 zeigt links schematisch den Aufbau eines biphasischen Implantates für osteochondrale Defekte mit Zylinder-Geometrie, welches aus einer Knorpelmatrix 1 und einer Knochenmatrix 2 aufgebaut ist. Die Knorpelmatrix 1 besteht aus einem Kollagen- Hyaluronsäure-Komposit, die Knochenmatrix 2 aus mineralisiertem Kollagen. Rechts ist in Form eines Längsschnittes schematisch der Aufbau eines individuell geformten, biphasisches Implantates dargestellt, bei welchem die Knochenmatrix 2 nur mit Teilbereichen des Knorpelmatrix 1 verbunden ist.2 shows schematically on the left the construction of a biphasic implant for osteochondral defects with cylinder geometry, which is constructed from a cartilage matrix 1 and a bone matrix 2. The cartilage matrix 1 consists of a collagen-hyaluronic acid composite, the bone matrix 2 of mineralized collagen. On the right, in the form of a longitudinal section, the structure of an individually shaped, biphasic implant is shown schematically, in which the bone matrix 2 is connected only to partial regions of the cartilage matrix 1.
Zur Herstellung dieser Implantate gemäß Fig. 2 wird für den Aufbau der Knochenmatrix 2 zunächst eine Suspension aus mineralisierten Kollagen-Fibrillen und für die Knorpelmatrix 1 eine Suspension aus Kollagen-Hyaluronsäure hergestellt. a.) Herstellung der Suspension aus mit Hydroxylapatit mineralisierten Kollagen-Fibrillen:For the production of these implants according to FIG. 2, a suspension of mineralized collagen fibrils and for the cartilage matrix 1 a suspension of collagen-hyaluronic acid is first prepared for the construction of the bone matrix 2. a.) Preparation of the Hydroxylapatite Mineralized Collagen Fibril Suspension:
In einem 2 1 Erlenmeyerkolben wird dazu 1 g säurelösliches Kollagen (Kollagen Typ I isoliert aus Rindersehnen der Fa. Innocoll in Saal/Donau, Deutschland) in 1 1 10 mmol/1 HCl
(hergestellt aus 100 ml 0,1 mol/1 HCl und 900 ml deioiisiertem Wasser) unter kräftigem Rühren (großer Rührfisch/Magnetrührer) gelöst. Unter kräftigem Rühren wird nun der Reihe nach zugegeben:In a 2 liter Erlenmeyer flask, 1 g of acid-soluble collagen (collagen type I isolated from bovine tendons from Innocoll in Saal / Donau, Germany) in 1 l of 10 mmol / l HCl (prepared from 100 ml of 0.1 mol / 1 HCl and 900 ml of deionized water) with vigorous stirring (large stirring / magnetic stirrer). With vigorous stirring, it is then added in order:
1) 180 ml 0,1 mol/1 CaCl2-Lösung1) 180 ml of 0.1 mol / 1 CaCl 2 solution
2) 120 ml 2 mol/1 NaCl-Lösung2) 120 ml 2 mol / 1 NaCl solution
3) 168 ml 0,5 mol/1 TRIS-Pufferlösung (pH = 7,5)3) 168 ml of 0.5 mol / l TRIS buffer solution (pH = 7.5)
4) 500 ml deionisiertes Wasser4) 500 ml of deionized water
5) 22,6 ml Phosphatpuffer nach Sörensen (0,5 mol/1; pH = 7,4)5) 22.6 ml Sorbensen phosphate buffer (0.5 mol / l, pH = 7.4)
Bei der Zugabe des Phosphatpuffers tritt eine milchige, farblose Trübung der Lösung auf (ausfallende Calciumphosphate). Zum Schluß wird mit deionisiertem Wasser auf 2,0 1 aufgefüllt. Nachdem noch für etwa 1 min. kräftig gerührt wurde, verschließt man den Kolben mit Parafüm oder Alu-Folie und stellt ihn für 12-24 h in ein auf 350C temperiertes Wärmebad.Upon addition of the phosphate buffer, a milky, colorless turbidity of the solution occurs (precipitated calcium phosphates). Finally, it is made up to 2.0 liters with deionized water. After still for about 1 min. vigorously stirred, the flask is sealed with paraffin or aluminum foil and placed him for 12-24 h in a heated to 35 0 C heat bath.
Das mineralisierte Kollagen wird durch Zentrifugation abgetrennt. Hierzu wird der gallertartige Niederschlag kräftig aufgerührt und dann in geeignete Zentrifugenröhrchen (z. B. Metall-Becher für 200 ml oder Glasröhrchen für 50 ml) gefüllt. Es wird für 15 min bei 2500 U/min in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert (um eine Erwärmung des Produktes zu verhindern) und dann vom Überstand abgegossen; hierbei werden 120 ml des Überstandes für die spätere Verwendung aufbewahrt. Nun wird von der Kollagen-Suspension nachgefüllt und die Zentrifugation so oft wiederholt, bis alle 2 1 entsprechend behandelt worden sind. Nach dem letztmaligen Abgießen des Überstandes werden die Pellets mit einem Löffelspatel aus den Röhrchen geholt und in einem 125 ml Becherglas gesammelt. Unter Rühren mit einem schweren Rührfisch wird nun gerade soviel Mutterlauge tropfenweise zugegeben, bis eine gießfahige Suspension entsteht.The mineralized collagen is separated by centrifugation. For this purpose, the gelatinous precipitate is stirred vigorously and then filled into suitable centrifuge tubes (eg metal cup for 200 ml or glass tube for 50 ml). It is centrifuged for 15 min at 2500 rpm in a refrigerated centrifuge (to prevent heating of the product) and then poured off the supernatant; 120 ml of the supernatant are stored for later use. Now refill the collagen suspension and repeat the centrifugation until all 2 liters have been treated appropriately. After the last time the supernatant is poured off, the pellets are removed from the tubes with a spatula and collected in a 125 ml beaker. While stirring with a heavy stirring fish just enough mother liquor is added dropwise until a pourable suspension is formed.
Dieses Verfahren zur Herstellung von mineralisiertem Kollagen entspricht im wesentlichen EP0945146 (J.-H. Bradt, K. Weis, W. Pompe). Alternativ wird das mineralisierte Kollagen ausgehend von rekombinatem Kollagen nach dem in EP0945147 beschriebenen Verfahren hergestellt. b.) Herstellung der Suspension aus Kollagen und Hyaluronsäure:This process for the production of mineralized collagen substantially corresponds to EP0945146 (J.-H. Bradt, K. Weis, W. Pompe). Alternatively, the mineralized collagen is prepared from recombinant collagen according to the method described in EP0945147. b.) Preparation of the suspension of collagen and hyaluronic acid:
Für den Aufbau des Knorpelersatzanteils 1 wird zunächst eine Suspension aus Kollagen und Hyaluronsäure mit 20 Gew.-% Hyaluronsäure hergestellt. Dazu werden 200 mg Hyaluronsäure (Hyaluronsäure Natriumsalz aus Streptococcus equi, Fa. Fluka
(Sigma/Aldrich, Taufkirchen) in 40 ml deionisiertem Wasser gelöst und für 1 h gerührt, bis eine farblose, transparente Suspension hoher Viskosität entstanden ist.To build up the cartilage replacement portion 1, a suspension of collagen and hyaluronic acid with 20% by weight hyaluronic acid is first prepared. For this purpose, 200 mg of hyaluronic acid (hyaluronic acid sodium salt from Streptococcus equi, Fa. Fluka (Sigma / Aldrich, Taufkirchen) dissolved in 40 ml of deionized water and stirred for 1 h until a colorless, transparent suspension of high viscosity is formed.
In der Zwischenzeit wird 1 g säurelösliches Kollagen (z. B. Collaplex 1.0, aus Kalbshäuten isoliertes Kollagen Typ I des Herstellers GfN, Waldmichelbach) zu 1 1 10 mM HCl in einen Erlenmeyerkolben gegeben und unter Rühren gelöst (Magnetrühr er). Danach werden 80 ml Phosphatpuffer nach Sörensen (0,5 M; pH = 7,4) und 130 ml 2 M NaCl zugegeben, die Lösung wird mit 750 ml deionisiertem Wasser aufgefüllt und nochmals verrührt. Unter kräftigem Rühren wird die Hyaluronsäure-Lösung zugegeben. Der Kolben wird anschließend für etwa 14 h in ein auf 370C temperiertes Wärmebad gestellt. Der hierbei entstehende Komposit aus fϊbrillärem Kollagen und Hyaluronsäure fällt als unlöslicher Niederschlag aus. Die Suspension wird aufgerührt, in geeignete Zentrifugen-Gläser abgefüllt und für 15 min bei 2500 U/min zentrifugiert. Vom anfallenden Überstand werden etwa 100 ml aufbewahrt. Die durch die Zentrifugation erzeugten Pellets aus dem Kollagen-Hyaluronsäure-Komposit werden in einem Becherglas mit gerade soviel Überstand gründlich verrührt (Magnetrührer), bis eine homogene und pipettierfahige Suspension entsteht. c.) Herstellung des biphasischen, porösen Implantats:In the meantime, 1 g of acid-soluble collagen (eg Collaplex 1.0, calfskin type I collagen isolated from GfN, Waldmichelbach) is added to 1 l of 10 mM HCl in an Erlenmeyer flask and dissolved with stirring (magnetic stirrer). Thereafter, 80 ml of Sörensen's phosphate buffer (0.5 M, pH = 7.4) and 130 ml of 2 M NaCl are added, the solution is made up with 750 ml of deionized water and stirred again. With vigorous stirring, the hyaluronic acid solution is added. The flask is then placed in a heated to 37 0 C heat bath for about 14 h. The resulting composite of fibrillar collagen and hyaluronic acid precipitates as an insoluble precipitate. The suspension is stirred up, filled into suitable centrifuge glasses and centrifuged for 15 min at 2500 rpm. From the resulting supernatant about 100 ml are stored. The pellets of the collagen-hyaluronic acid composite produced by the centrifugation are thoroughly stirred in a beaker with just enough supernatant (magnetic stirrer) until a homogeneous suspension which can be pipetted is formed. c.) Production of the biphasic, porous implant:
Zur Herstellung des biphasischen, porösen Implantates wird nun zunächst ca. 1 ml der gemäß a) hergestellten Suspension aus mineralisierten Kollagen-Fibrillen mit einer Pipette in die Vertiefung einer 24er Wellplatte gegeben. Darauf wird nun vorsichtig und so, dass sich die beiden Phasen nicht vermischen, 1 ml der unter b) beschriebenen Kollagen/Hyaluronsäure- Suspension pipettiert. Die Wellplatte wird nun bei ca. -25°C eingefroren und anschließend im Ölpumpenvakuum (ca. 0,1 mbar) gefriergetrocknet. Der hierbei entstandene poröse, schwammartige Scaffold wird aus der Wellplatte entnommen und für eine Stunde in einer 1%-igen Lösung von N-Dimethylaminopropyl-N'-ethyl-carbodiimid Hydrochlorid (EDC) in 80 Vol-% Ethanol chemisch quervernetzt. Im Anschluß an die Quervernetzung wird der Scaffold erst gründlich mit dest. Wasser, dann mit einer l%igen, wässrigen Glycin-Lösung und zuletzt nochmals mit dest. Wasser gewaschen. Zuletzt wird das Implantat wieder eingefroren und gefriergetrocknet.To prepare the biphasic, porous implant, approximately 1 ml of the suspension of mineralized collagen fibrils prepared according to a) is now introduced with the aid of a pipette into the well of a 24-well plate. Then, carefully and in such a way that the two phases do not mix, pipette 1 ml of the collagen / hyaluronic acid suspension described under b). The corrugated sheet is then frozen at about -25 ° C and then freeze-dried in an oil pump vacuum (about 0.1 mbar). The resulting porous, sponge-like scaffold is removed from the corrugated sheet and chemically cross-linked for one hour in a 1% solution of N-dimethylaminopropyl-N'-ethyl-carbodiimide hydrochloride (EDC) in 80% by volume of ethanol. Following the cross-linking, the scaffold is first thoroughly distilled. Water, then with a 1% aqueous glycine solution and finally again with dist. Washed water. Finally, the implant is frozen again and freeze-dried.
Fig. 3 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme eines Dünnschnittes in Längsrichtung durch ein - wie zu Fig. 2 beschrieben hergestelltes - Implantat (Vergrößerung 10*). Die mineralisierte Knochenmatrix 2 (oben) ist dunkel gefärbt - die nicht-mineralisierte Knorpelmatrix 1 (unten) ist deutlich heller. Gut erkennbar ist, dass die Matrixmaterialien direkt miteinander verbunden sind und sich an der Grenzfläche 3 gegenseitig durchdringen.
Beide Phasen weisen mit einem Porendurchmessern von ca. 50-200 μm eine vergleichbare Porosität auf.Fig. 3 shows a light micrograph of a thin section in the longitudinal direction by - as described for Fig. 2 produced - implant (magnification 10 *). The mineralized bone matrix 2 (top) is dark colored - the non-mineralized cartilage matrix 1 (bottom) is much brighter. It can be clearly seen that the matrix materials are directly connected to each other and penetrate each other at the interface 3. Both phases have a pore diameter of about 50-200 microns to a comparable porosity.
Fig. 4 zeigt eine Raster-Elektronenmikroskopieaufhahme (REM) eines Längsschnittes durch ein wie zu Fig. 2 beschrieben hergestelltes Implantat (Vergrößerung 15x). Die mineralisierte (hier heller erscheinende) Knochematrix 2 Teil befindet sich links im Bild, die Knorpelmatrix 1 rechts. Gut erkennbar ist wieder, dass die Matrixmaterialien direkt miteinander verbunden sind und sich an der Grenzfläche 3 gegenseitig durchdringen, wobei beide Schichten eine vergleichbare Porosität aufweisen.4 shows a scanning electron micrograph (SEM) of a longitudinal section through an implant produced as described for FIG. 2 (magnification 15x). The mineralized (appearing brighter) Knochematrix 2 part is on the left in the picture, the cartilage matrix 1 on the right. It is again clearly recognizable that the matrix materials are directly connected to one another and penetrate one another at the interface 3, wherein both layers have a comparable porosity.
Fig. 5 zeigt REM Element-Mapping-Aufhahmen der Grenzfläche zwischen der mineralisierten Knochenmatrix 2 (links) und der nicht-mineralisierten Knorpelmatrix 1 (rechts) des wie zu Fig. 2 beschrieben hergestellten Implantates Die Abbildungen stellen jeweils einen Ausschnitt von Fig. 4 dar (Vergrößerung: jeweils 5Ox). Die mineralisierte (hier heller erscheinende) Knochenmatrix 2 befindet sich jeweils links im Bild, die Knorpelmatrixl 1 rechts.FIG. 5 shows SEM element mapping of the interface between the mineralized bone matrix 2 (left) and the non-mineralized cartilage matrix 1 (right) of the implant fabricated as described with reference to FIG. 2. The figures are each a detail of FIG (Magnification: 5Ox each). The mineralized (appearing brighter) bone matrix 2 is located on the left side of the image, cartilage matrix 1 on the right.
Oben links in Fig. 5 ist ein normales REM-BiId gezeigt (Fig. 5A). Oben rechts ist eine BSE- Aufhahme (Fig. 5B - Detektion der rückgestreuten Elektronen = backscattered electrons) abgebildet. Die im linken Bereich der Fig. 5B zu sehende Hellfärbung weist die Anwesenheit von Atomen höherer Ordungszahl nach. Diese Hellfärbung ist auf die in der Knochenmatrix enthaltenen Calcium- und Phosphoratome des Calciumphosphats zurückzuführen.At the top left of Fig. 5, a normal SEM image is shown (Fig. 5A). At the top right is a BSE image (Figure 5B - detection of the backscattered electrons = backscattered electrons). The light coloration to be seen in the left-hand area of FIG. 5B detects the presence of atoms of higher order number. This light coloration is due to the calcium and phosphorus atoms of the calcium phosphate contained in the bone matrix.
Die unteren Bilder in Fig. 5 zeigen den Nachweis von Calcium (unten links, Fig. 5C) und unten rechts den Nachweis von Phosphor (Fig. 5D) einzeln. Die Hellfärbung weißt jeweils auf Calcium (Fig. 5C) bzw. Phosphor (Fig. 5D) hin.The lower images in Fig. 5 show the detection of calcium (lower left, Fig. 5C) and the lower right detection of phosphorus (Fig. 5D) individually. The light color indicates calcium (FIG. 5C) or phosphorus (FIG. 5D).
Fig. 5 verdeutlicht die nur partielle Mineralisierung des Implantats: die Bestandteile des Calciumphosphates (Calcium und Phosphor) können nur in der mineralisierten Knochenmatrix 2 (in den Abbildungen jeweils links) nachgewiesen werden. Die Grenzfläche 3 ist nur in den Figuren 5B-D gut zu erkennen.Fig. 5 illustrates the only partial mineralization of the implant: the components of calcium phosphate (calcium and phosphorus) can be detected only in the mineralized bone matrix 2 (in the pictures on the left). The interface 3 is clearly visible only in FIGS. 5B-D.
Fig. 6 zeigt eine Detailaufhahme der Grenzfläche zwischen der nicht-mineralisierten Knorpelmatrix 1 (oben) und der mineralisierten Knochenmatrix 2 (unten). Die Figur stellt einen Ausschnitt von Fig. 4 dar (Vergrößerung: 500x). Deutlich sichtbar sind die hell erscheinenden Calciumphosphat-Kristallite im unteren Teil des Bildes, welche die mineralisierte Phase charakterisieren und deren Oberfläche rauher erscheinen lassen. Die oben zu sehende Knorpelmatrix 1, bestehend aus einem Komposit aus Kollagen I und Hyaluronsäure, besitzt dagegen eine glatte Oberfläche.
Fig. 7 zeigt einen vergrößerten Ausschnitt des direkten Kontaktbereichs zwischen der Knorpelmatrix 1 (oben) und der mineralisierten Knochenmatrix 2 (unten) (Vergrößerung: 100Ox). Die innige Verbindung beider Phasen im Bereich der Verbundfläche 3 ist gut zu erkennen. d.) Besiedlung des Implantats mit ChondrozytenFig. 6 shows a detail of the interface between the non-mineralized cartilage matrix 1 (top) and the mineralized bone matrix 2 (bottom). The figure shows a detail of Fig. 4 (magnification: 500x). Clearly visible are the bright appearing calcium phosphate crystallites in the lower part of the image, which characterize the mineralized phase and make their surface look rougher. The above-mentioned cartilage matrix 1, consisting of a composite of collagen I and hyaluronic acid, on the other hand, has a smooth surface. Fig. 7 shows an enlarged section of the direct contact area between the cartilage matrix 1 (top) and the mineralized bone matrix 2 (bottom) (magnification: 100Ox). The intimate connection of both phases in the area of the composite surface 3 can be clearly seen. d.) colonization of the implant with chondrocytes
Zur in vzϊrσ-Besiedlung des Knorpelersatzanteiles mit primären humanen Chondrozyten wird ein steriles zylindrisches biphasisches Implantat mit einem Durchmesser von 10 mm und einer Höhe von 6 mm (3 mm Knorpelersatz- und 3 mm Knochenersatzphase) für 24 Stunden in 5 ml modifiziertem DMEM-Zellkulturmedium (Gibco Life Technologies GmbH, Karlsruhe) eingelegt und gequollen, wobei das Medium 4 Mal gewechselt wird. Zur Zellbesiedelung wird das Implantat aus dem Medium herausgenommen und auf ein steriles Filterpapier gesetzt, so dass das Medium weitgehend aus der porösen Struktur herausgesaugt wird. Nun werden auf die oben befindliche Knorpelersatzphase 5><105 primäre humane Chondrozyten, suspendiert in 200 μl Zellkulturmedium, pipettiert. Nach 2 Stunden Lagerung im Brutschrank werden die besiedelten Implantate in eine 24er Wellplatte mit frischem Zellkulturmedium überführt und nach Standardbedingungen bis zur Implantation kultiviert. e.) Herstellen eines Implantats mit einer Zwischenschicht aus einer HyaluronsäurefolieFor vzϊrσ colonization of the cartilage replacement portion with primary human chondrocytes, a sterile cylindrical biphasic implant having a diameter of 10 mm and a height of 6 mm (3 mm cartilage replacement and 3 mm bone replacement phase) for 24 hours in 5 ml of modified DMEM cell culture medium ( Gibco Life Technologies GmbH, Karlsruhe) and swelled, the medium is changed 4 times. For cell colonization, the implant is removed from the medium and placed on a sterile filter paper, so that the medium is largely sucked out of the porous structure. Now 5 × 10 5 primary human chondrocytes, suspended in 200 μl of cell culture medium, are pipetted onto the cartilage replacement phase located above. After 2 hours storage in the incubator, the colonized implants are transferred to a 24 well plate with fresh cell culture medium and cultured according to standard conditions until implantation. e.) Producing an implant with an intermediate layer of a hyaluronic acid film
Zur Herstellung eines Implantats mit einer Zwischenschicht aus einer Hyaluronsäurefolie werden wie unter a.) und b.) beschrieben Suspensionen aus mineralisiertem Kollagen bzw. einem Kollagen-Hyaluronsäure-Komposit hergestellt. Eine Hyaluronsäure-Folie wird durch Eintrocknen einer gesättigten wäßrigen Lösung von Hyaluronsäure Natriumsalz aus Streptococcus equi (Fa. Fluka; Sigma/Aldrich, Taufkirchen) an Luft erzeugt. Hierzu wird eine Hyaluronsäure-Lösung günstigerweise in eine Petrischale gegossen. Wie unter c.) beschrieben, wird 1 ml der mineralisierten Kollagen-Suspension in die Vertiefung einer 24er Wellplatte pipettiert. Auf die Suspension wird nun ein passend zugeschnittenes Stück der Hyaluronsäurefolie gelegt, worauf wiederum die Suspension des Kollagen-Hyaluronsäure- Komposites pipettiert wird. Wie unter c.) beschrieben, wird das entstandene biphasische Konstrukt eingefroren, gefriergetrocknet, chemisch quervernetzt, gewaschen und zuletzt erneut gefriergetrocknet.To produce an implant with an intermediate layer of a hyaluronic acid film, suspensions of mineralized collagen or a collagen-hyaluronic acid composite are prepared as described under a.) And b.). A hyaluronic acid film is produced by drying a saturated aqueous solution of hyaluronic acid sodium salt from Streptococcus equi (Fluka, Sigma / Aldrich, Taufkirchen) in air. For this purpose, a hyaluronic acid solution is conveniently poured into a Petri dish. As described under c.), 1 ml of the mineralized collagen suspension is pipetted into the well of a 24 well plate. A suitably cut piece of the hyaluronic acid film is now placed on the suspension, whereupon in turn the suspension of the collagen-hyaluronic acid composite is pipetted. As described under c.), The resulting biphasic construct is frozen, freeze-dried, chemically cross-linked, washed and finally freeze-dried again.
Fig. 8 zeigt schematisch den Querschnitt durch ein solches Implantat, wobei mit 1 die Knorpelmatrix (oben), mit 2 die mineralisierte Knochenmatrix (unten) und mit 4 die Hyaluronsäurefolie als Trennschicht bezeichnet sind.Fig. 8 shows schematically the cross-section through such an implant, with 1 the cartilage matrix (top), with 2 the mineralized bone matrix (bottom) and 4 the Hyaluronsäurefolie referred to as a release layer.
' f.) Herstellen eines Implantats mit einem dreidimensionalen Gestick als Stützstruktur'f.) Producing an implant with a three-dimensional embroidery as a support structure
;/
Wie unter a.)~α) beschrieben wird ein biphasisches Implantat durch Übereinanderschichten zweier Suspensionen hergestellt, mit dem Unterschied, dass vor dem Einfüllen der ersten Phase in die dafür vorgesehene Form in letztere ein Gestick aus Polyhydroxybutyrat-Fäden eingelegt wird. Zum besseren Eindringen der Suspension in die Zwischenräume des Gestickes wird nach dem Aufpipettieren der beiden Suspensionen jeweils für 5 Min. für 1000 U/min zentrifugiert./ As described under a.) ~ Α), a biphasic implant is produced by stacking two suspensions, with the difference that a bead of polyhydroxybutyrate threads is inserted into the latter before the first phase is filled into the mold provided for this purpose. For better penetration of the suspension in the interstices of the embroidery is centrifuged after pipetting up the two suspensions each for 5 min. For 1000 rev / min.
Fig. 9 demonstriert den schematischen Aufbau eines solchen Implantates in Form eines Querschnittes durch eine zylindrische Probe. Mit 1 ist die Knorpelmatrix (oben), mit 2 die mineralisierte Knochenmatrix (unten) und mit 5 das Gestick aus Polyhydroxybutyrat-Fäden bezeichnet, welches beide Phasen durchdringt. g.) Herstellen eines Implantats mit über Flocktechnik hergestellter StützstrukturFig. 9 demonstrates the schematic structure of such an implant in the form of a cross section through a cylindrical sample. 1 is the cartilage matrix (top), 2 is the mineralized bone matrix (below), and 5 is the polyhydroxybutyrate threads that penetrate both phases. g.) Producing an implant with a support structure made by flocking technique
Analog wie unter f.) beschrieben verfährt man, wenn man ein gemäß DE 103 12 144.7 vermittels Flocktechnik hergestelltes Trägermaterial als Stützstruktur in das Implantat integrieren will. Das Trägermaterial - bestehend aus einem Basismaterial aus einer mineralisierten Kollagen-Membran, einer Klebeschicht aus Gelatine und Flockfasern aus Polyhydroxybutyrat — wird, mit dem Basismaterial nach unten, in die Vertiefung einer 24er Wellplatte gelegt, in welcher das Implantat hergestellt werden soll. Dann werden, wie unter a.)-c.) beschrieben, jeweils 1 ml der beiden Suspensionen nacheinander übereinandergegossen. Zum besseren Eindringen der Suspensionen in die Faserzwischenräume wird, wie unter f.) beschrieben, kurz zentrifugiert. Weiter verfahrt man wie unter c.) und f.) beschrieben.The procedure is analogous to that described under f.), If one intends to integrate a carrier material produced in accordance with DE 103 12 144.7 by means of flocking technology into the implant as a support structure. The support material - consisting of a base material of a mineralized collagen membrane, an adhesive layer of gelatin and flock fibers of polyhydroxybutyrate - is placed, with the base material down, in the recess of a 24-well plate in which the implant is to be produced. Then, as described under a.) - c.), In each case 1 ml of the two suspensions poured successively übereinandergegossen. For better penetration of the suspensions in the fiber interstices, as described in f.) Briefly centrifuged. Continue as described under c.) And f.).
Fig. 10 zeigt das Ergebnis als schematischen Längsschnitt, wobei mit 1 die Knorpelmatrix (oben), mit 2 die mineralisierte Knochenmatrix (unten), mit 6 das Basismaterial (Membran aus mineralisiertem Kollagen), mit 7 die Klebeschicht (Gelatine) und mit 8 die Flockfasern (Polyhydroxybutyrat) des Trägermaterials bezeichnet sind.
10 shows the result as a schematic longitudinal section, with 1 the cartilage matrix (top), with 2 the mineralized bone matrix (bottom), with 6 the base material (membrane of mineralized collagen), with 7 the adhesive layer (gelatin) and with the 8 Flock fibers (polyhydroxybutyrate) of the carrier material are designated.