WO2006021716A1 - Dispositif pour detecter la fixation d'un compose cible sur un compose appat immobilise sur un support et procede de detection - Google Patents

Dispositif pour detecter la fixation d'un compose cible sur un compose appat immobilise sur un support et procede de detection Download PDF

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solid support
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Franck Alain Claude Thibaudau
Anne Charrier
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Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
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Definitions

  • the present invention relates to a device and a method for detecting binding of a target compound to a bait compound, said bait compound being immobilized on a support.
  • the device and the detection method according to the invention can be used in the industry for various purposes, for example to test the presence of target compounds of interest, such as antigens, antibodies, cellular proteins, peptides , active ingredients of drugs, nucleic acids or any other molecule ligand.
  • target compounds of interest such as antigens, antibodies, cellular proteins, peptides , active ingredients of drugs, nucleic acids or any other molecule ligand.
  • the device and the method according to the invention are used in particular for detecting the presence of a target nucleic acid in a sample.
  • Devices for detecting a plurality of target compounds, such as "DNA chips” or “protein chips”, and the detection methods that implement them.
  • These chips consist of a substrate on the surface of which is immobilized a plurality of distinct bait compounds, each bait compound being located at a predetermined position on the surface of the substrate, distinct from the location of the other bait compounds.
  • the various bait compounds are spatially distributed on the substrate, in the form of a two-dimensional matrix, each box of the matrix corresponding to a bait compound.
  • the chip is first contacted with the sample under environmental conditions allowing the formation of a complex between the target compounds and the immobilized bait compounds on the surface of the substrate.
  • the formation of the complexes formed on the surface of the chip is detected and localized by various techniques. The plurality of positions where this formation has been detected then makes it possible to qualitatively or even quantitatively detect the presence of a plurality of target compounds.
  • Other devices include a plurality of microparticles baits. Bait microparticles form, under certain environmental conditions, complexes with the target compounds. A bait microparticle has characteristics that make it possible to identify the target with which it is likely to form a complex.
  • the device is dispersed with a sample containing target compounds, under conditions allowing the formation of the complexes.
  • the particles having formed complexes on their surface with the target compounds are detected, and the characteristics, for example the fluorescence characteristics of these microparticles, are determined simultaneously.
  • the identification characteristics of the particles are obtained by the incorporation of a fluorochrome in the mass of the microparticles and / or on the target compounds contained in the sample.
  • the detection of the complexes is carried out using a fluorescence detector, for example a fluorescence detector included in a flow cytometer type detection device.
  • a fluorescence detector for example a fluorescence detector included in a flow cytometer type detection device. This type of technique is described, for example, in US Patents US 6,599,331 and n 0 0 US 6,649,414.
  • Detection devices comprising a plurality of metal oxide particle layers have also been described, at least a portion of the particles being covalently bonded to the surface of a support.
  • Receptors or ligands are attached to the surface of the particles to detect the possible binding of a ligand or receptor corresponding likely to be present in a test sample, by conventional detection techniques, such as in PCT application No. WO 0 00/33078.
  • detection devices comprising a solid support on which are immobilized, by means of a non-covalent attachment to an intermediate layer, particles comprising compounds, such as nucleic acids, capable of binding to analytes, such as nucleic acids of complementary sequence, as in the US patent application No. US 2003/0017464 0.
  • the intermediate layer on which the particles are fixed is bound by covalent chemical bonds to the basic solid support.
  • the analytes for example the nucleic acids, possibly present in the sample to be tested, are detected according to conventional techniques.
  • detection devices comprising detection particles which can be prepared by a method comprising attaching a layer of detection particles dispersed in a polymeric binder.
  • Such a method may comprise a step of treating a solid flat substrate by plasma or chemical oxidation, to functionalize the support prior to the deposition and fixing of detection of particles dispersed in the polymer binder, such as in PCT application No. 0 WO 03/004993.
  • the particles may, in some cases, be separated from the solid support by a support adhesion layer, of indefinite nature, and according to a method of application that is not specified.
  • the detection of the molecules or target compounds fixed on immobilized bait compounds on a DNA chip or on a protein chip does not have the sensitivity that would be required when the sample to be tested comprises very small quantities of the compound (s) ( s) target (s), for example less than 10 6 molecules.
  • Detection techniques other than fluorescence, such as mass spectrometry, chemiluminescence or the direct detection of a modification in the electrical charge of the support on which the bait molecules are immobilized are known. However, such techniques are long and complex to implement.
  • target nucleic acids fixed on colloidal gold nanoparticles.
  • the hybridization of the target nucleic acids on the corresponding bait nucleic acids, the target nucleic acids being immobilized beforehand on the DNA chip, is then carried out by an optical detection of the colloidal gold particles to which the target nucleic acids are bound, on the surface of the DNA chip support (Fritzsche et al., 2002, Biomedical Nanotechnology Architecture and Applications, Darryl J. Bornhop, et al., Editors, Proceedings of SPIE, Vol. 4626: 17-22).
  • a high intensity optical signal is obtained by reflection of a light emission beam by the colloidal gold particles on which are fixed the target nucleic acids having hybridized with the nucleic acid baits fixed on the support of the DNA chip. Enhancement of the intensity of the optical reflection signal can be achieved by coating the colloidal gold nanoparticles with a silver-based layer.
  • this technique allows the detection of the fixation of target nucleic acids on the DNA chip with high sensitivity, it requires a preliminary step of labeling, by attachment to the colloidal gold, the target nucleic acids contained in the sample. to test. This preliminary preparation, by colloidal gold labeling, of the nucleic acids of the sample to be tested makes this technique cumbersome to implement.
  • the present invention relates to a device for detecting the binding of a target compound to a bait compound immobilized on a support, said device comprising: a) a solid support; b) a coating non-covalently bonded to the surface of said solid support; and c) a plurality of microparticles or nanoparticles on each of which is fixed at least one bait compound, said microparticles or nanoparticles being bonded to the coating.
  • the coating is a molecular layer of phospholipids and the bait compound (s) is (are) nucleic acid (s).
  • the present invention also relates to a method for detecting the binding of a target compound to a bait compound, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing into contact a sample that may contain said target compound with a device detection device as defined above, said device comprising at least one bait compound binding to said target compound; b) detecting any complexes formed between said target compound and said bait compound.
  • FIG. 1 illustrates a first diagram of the detection device according to the invention.
  • FIG. 1A illustrates a diagram of the device according to the invention before the test.
  • the microparticles or nanoparticles (1) to which the bait compounds (2) are attached are adsorbed on the surface of a layer of phospholipids (3).
  • the phospholipid layer is itself adsorbed on the surface of a solid support (4).
  • FIG. 1B the device of the invention is placed under appropriate conditions for the desorption of the microparticles or the nanoparticles.
  • the particles are desorbed from the solid support (4). Phopholipids are also desorbed from the solid support.
  • FIG. 2 illustrates a second diagram of the detection device according to the invention.
  • Figure 2A is identical to Figure 1 A.
  • the device of the invention is placed under suitable conditions for the desorption of the microparticles or the nanoparticles.
  • the particles are desorbed from the solid support (4).
  • Phospholipids are not desorbed from the solid support.
  • Figure 3 illustrates the desorption of nanoparticles from a solid support consisting of microbeads 2 mm in diameter.
  • abscissa the final amount of the target nucleic acid in the sample tested;
  • In ordinates the absorbance value at the wavelength of 527 nanometers of the desorption solution, expressed in arbitrary units.
  • FIG. 4 illustrates the desorption of nanoparticles from a solid support consisting of a polystyrene spectrophotometric cell, with three distinct target nucleic acids, respectively (i) [] a target nucleic acid forming a mismatch-free hybridization complex with the nucleic acid baits, (ii)
  • the test temperature expressed in degrees Celsius
  • the absorbance value at the wavelength of 527 nanometers of the desorption solution expressed in units of Absorbance.
  • the applicant has shown according to the invention that the attachment of a target compound or molecule on microparticles or nanoparticles comprising the corresponding bait compound, the particles being adsorbed on a coating non-covalently bound to a solid support , caused the microparticles or nanoparticles to stabilize on the surface of the solid substrate.
  • a target compound contained in a test sample such as a target nucleic acid
  • a bait compound such as a bait complementary nucleic acid.
  • target nucleic acid said bait compound being immobilized beforehand in a system comprising a solid support (4) to which a coating (3), in particular a layer of phospholipids (3), has been non-covalently bound, the bait compound (2) being immobilized on microparticles or nanoparticles (1) which are adsorbed on the surface of said coating (3), for example on the surface of the phospholipid layer (3).
  • the invention relates to a device for detecting the binding of a target compound to a bait compound immobilized on a support, said device comprising: a) a solid support; b) a coating non-covalently bonded to the surface of said solid support; and c) a plurality of microparticles or nanoparticles on each of which is fixed at least one bait compound, said microparticles or nanoparticles being bonded to said coating.
  • the plurality of microparticles or nanoparticles form a single layer of particles that is directly in contact with said coating.
  • the microparticles or nanoparticles are non-covalently bonded to said coating.
  • the microparticles or the nanoparticles are bonded to said coating exclusively by non-covalent weak bonds, including electrostatic bonds, hydrogen bonds, hydrophilic / hydrophobic interactions or linkages. Van der Waals.
  • the microparticles or the nanoparticles are simply adsorbed to said coating, without creating covalent chemical bonds between them and said coating.
  • the microparticles or the nanoparticles are simply adsorbed on the surface of the coating.
  • an aqueous solution comprising said microparticles or said nanoparticles is generally applied.
  • the microparticles or nanoparticles are not included or dispersed in a layer of any inclusion material or binder, such as a polymeric binder.
  • the fixation of one or more target compounds or molecules on the bait compound (s) immobilized in this device can be visualized with great sensitivity, because of modifying the physicochemical characteristics of the basic solid support caused by the desorption event of the microparticles or nanoparticles of the surface of said basic solid support, in the absence of complex formation between the bait compounds and the target compounds.
  • the desorption of the microparticles or nanoparticles causes a very large mass variation of the solid support and consequently a large variation of the various physico-chemical characteristics of the basic solid support. Indeed, the desorption of the microparticles or nanoparticles causes a significant modification of certain physicochemical characteristics of the basic solid support or the device, such as:
  • the electrical characteristics of resistivity and / or conductivity and / or impedance of the basic solid support for example in the embodiments of the device in which the basic solid support consists of a channel of a transistor of type to field effect
  • the detection device of the invention allow its use in detection methods that do not include any preliminary step of labeling the target compounds.
  • the detection device of the invention can be used in processes comprising a step of simple and direct detection of the bait compound / target compound complex formation, because of the change in the characteristics of the surface of the solid support and the characteristics of the solution in which the device is immersed. This is an important technical advantage over known methods which do not include a preliminary step of labeling the target compounds, such as processes comprising a step of detecting non-spectrometrically labeled bait / target compound complex complexes. massive.
  • the desorption of the microparticles or nanoparticles can also be detected by measuring the change in the physicochemical characteristics of the solution in which the device is immersed.
  • the detection can be detected by a measurement of colorimetry or turbidimetry of the solution in which the detection device is immersed.
  • a stabilization of a detection device according to the invention having a surface of the base support of 30 mm 2 by blocking the desorption of the microparticles or nanoparticles is obtained by fixing the target nucleic acids present in the liquid sample to be tested at a quantity of 100 femtomoles, or even in some cases 10 femtomoles.
  • a detection device according to the invention allows the detection of up to more than 10 9 molecules of target compound in solution per mm 2 of surface of the solid support, which is comparable to that which is obtained with conventional microarray technologies with prior labeling of target DNAs.
  • the device of the invention makes it possible to detect with a high degree of specificity the binding of the target compound (s) contained in the sample to be tested on the bait compound (s). immobilized on the device, since a sample containing a very large amount, of the order of 1 nanomole, of a nucleic acid not hybridizing with the immobilized bait compound, does not cause the blocking of the desorption microparticles or nanoparticles from the surface of the solid support, under the appropriate conditions.
  • the possible non-specific binding of compounds other than the target compounds to the detection device does not affect the capacity of the microparticles or nanoparticles to be desorbed from the surface of the solid support, in appropriate conditions, when there is no specific binding event of target compounds on the immobilized bait compounds.
  • any type of solid support whose characteristics allow a good adhesion of the coating on its surface can be used in a detection device according to the invention.
  • the choice of a particular solid support in combination with a determined coating layer can be easily achieved by one skilled in the art, by routine tests carried out in the light of the teaching contained in the present description.
  • the solid support consists of a solid support of which at least the surface in contact with the coating is negatively or positively charged in an aqueous solution at neutral pH, for example in a solution. conventional buffer such as 1 molar phosphate buffer (1 M).
  • the solid support consists of a hydrophobic material, in particular a hydrophobic organic polymer.
  • the solid support is chosen from mineral glass, silica, silicon, mica, an alumina, a quartz, a metal oxide and an organic polymer chosen from organic polymers which are negatively charged in an aqueous solution at neutral pH, for example a buffer solution at the concentration 1 Molar.
  • muscovite-type mica such as muscovite mica marketed by Metafix (Saint-Didier, France), is preferred.
  • Silica-based quartz crystals such as those marketed by Q-SENSE (Gothenburg, Sweden), are preferred as the silica-based solid support.
  • a silicon wafer such as that marketed by the AB Company is preferred.
  • a silicon nitride wafer it is also possible to use a silicon nitride wafer.
  • silicon nitride As a solid support in silicon nitride, it is possible to use a silicon wafer whose surface has been nitrided to a thickness of about 100 nanometers. As a solid support in silicon nitride, it is also possible to use a support consisting of a field effect transistor ("Ion Sensitive Field Effect Transistor") ion sensor.
  • Ion Sensitive Field Effect Transistor Ion Sensitive Field Effect Transistor
  • the metal oxide of the solid support is selected from ZnO, TiO 2 , Fe 2 O 3 and V 2 O 5 .
  • the organic polymer of the solid support is chosen from the following polymers: polyethylene, polypropylene, polybutadiene, polyoxyethylene, polystyrene, polycarbonate, polymethacrylate.
  • polystyrene As the hydrophobic organic polymer, polystyrene can be used. As a solid polystyrene support, the interior surface of polystyrene spectrophotometry vessels can be used.
  • polystyrene carboxylate it is possible to use polystyrene whose surface has carboxyl functions, the surface of which is therefore negatively charged in an aqueous solution at neutral pH.
  • polystyrene carboxylate polystyrene carboxylate microbeads having a diameter may in particular be used. ball of a few micrometers, for example from 1 .mu.m to 10 .mu.m, in particular 6 .mu.m.
  • the basic solid support includes any type of support material whose surface which is in contact with the coating of the device is functionalized, so as to confer on the surface of the support a net positive or negative charge or a hydrophobic character.
  • the solid support may consist of a material whose surface in contact with the coating of the device has been functionalized by syllanization, ion implantation or any other method of functionalization by physicochemical treatment of the surface of the support.
  • the surface of the solid support which is in contact with the coating layer is positively or negatively charged or hydrophobic.
  • the entire mass of the solid support is not necessary for the entire mass of the solid support to be itself charged or hydrophobic.
  • it is possible to use any solid material having suitable mechanical properties since the surface of the solid support which is intended to be in contact with the phospholipid layer is charged or hydrophobic.
  • it is therefore possible to use a composite solid support whose base material which is not in contact with the coating may be any solid material having properties of appropriate mechanical strength, including a metal base material, made of plastic or an organic glass.
  • Such a composite support comprises, at least on the surface on which the coating layer is adsorbed, a layer of a hydrophobic material or positively or negatively charged in an aqueous solution at neutral pH, chosen from the materials indicated above.
  • the layer of the hydrophobic material or positively or negatively charged can be applied by any conventional method known to those skilled in the art, depending on the base material of the composite solid support, such as gluing techniques, including heat sealing, or grafting or chemical crosslinking.
  • the net charge of the surface of the solid support is of the same polarity as the net charge of the surface of the microparticles or nanoparticles.
  • the surface of the solid support has a net positive charge in a solution allowing the target compound to form a complex with the bait compound
  • the surface of the microparticles or nanoparticles also has a positive net charge in the same solution.
  • the surface of the solid support has a net negative charge in a solution allowing the target compound to form a complex with the bait compound, then it is preferred that the surface of the microparticles or nanoparticles also have a negative net charge in the same solution. .
  • the net charge of the coating which is non-covalently bonded to the solid support, preferably has a polarity opposite to that of the surface of the microparticles or nanoparticles.
  • the coating has a net positive charge and the surface of the microparticles or nanoparticles has a net negative charge, in a solution allowing the target compound to form a complex with the bait compound.
  • the coating has a net negative charge and the surface of the microparticles or nanoparticles has a net positive charge, in a solution allowing the target compound to form a complex with the bait compound.
  • the net charge of the coating which is non-covalently bonded to the solid support, preferably has opposite polarity to both the surface of the solid support and the surface of the microparticles or nanoparticles.
  • the surface of the solid support has a net negative charge
  • the coating has a net positive charge
  • the surface of the microparticles or nanoparticles has a negative net charge, in a solution allowing the target compound to form a complex with the bait compound.
  • the surface of the solid support has a net positive charge
  • the coating has a net negative charge
  • the surface of the microparticles or nanoparticles has a net positive charge, in a solution allowing the target compound to form a complex with the compound bait.
  • the surface of the solid support in contact with the coating has a net negative or positive charge
  • the coating has a net charge of inverse polarity at the polarity of said surface of the solid support
  • the surface of the microparticles or nanoparticles has a net charge of polarity identical to the polarity of said surface of the solid support, and of reverse polarity to the coating.
  • the solid support consists of a silicon-based electronic microcircuit, or else it consists of a specific part of the surface of a silicon-based electronic microcircuit, such as, for example, the gate of such a micro ⁇ circuit or the channel of a field effect transistor (FET) included in such an electronic microcircuit.
  • FET field effect transistor
  • the detection device comprises at least 100 microparticles or nanoparticles per cm 2 of surface of the basic solid support.
  • the detection device of the invention may comprise up to at least 5 ⁇ 10 10 nanoparticles per cm 2 .
  • the surface value of the basic solid support which also determines the total area of the detection device, is variable.
  • the surface of the inventive detection device can vary from 0.1 .mu.m 2 to 10 cm 2, depending on the case and depending on the type of solid support used.
  • the solid base support has a flat surface, as in most oligonucleotide or protein matrix supports that make up the DNA chips or the protein chips.
  • the surface of the basic solid support generally varies from 0.1 ⁇ m 2 to 10 cm 2 , for example from 1 to 10 cm 2 .
  • the surface of the solid support may be about 0.2 ⁇ m 2 , 0.5 ⁇ m 2 , 1 ⁇ m 2 , 2 ⁇ m 2 , 3 ⁇ m 2 , 4 ⁇ m 2 , 5 ⁇ m 2 , 10 ⁇ m 2 , 20 ⁇ m 2 , 30 ⁇ m 2 , 40 ⁇ m 2 , 50 ⁇ m 2 , 100 ⁇ m 2 , 200 ⁇ m 2 , 300 ⁇ m 2 , 400 ⁇ m 2 , 500 ⁇ m 2 , 10 3 ⁇ m 2 , 5.10 3 ⁇ m 2 , 10 4 ⁇ r ⁇ n 2 , 5.10 4 ⁇ m 2 , 10 5 ⁇ m 2 , 5.10 5 ⁇ m 2 , 1 mm 2 , 2 mm 2 , 3 mm 2 , 4 mm 2 , 5 mm 2 , 10 mm 2 , 20 mm 2 , 30 mm 2 , 40 mm 2 , 50 mm 2 , 1 cm 2 ,
  • the basic solid support consists of microparticles whose largest dimension varies from 500 nanometers to 2 millimeters.
  • the solid support microparticles are spherical, their diameter preferably varies from 500 nanometers to 2 millimeters.
  • the largest dimension or diameter of the microparticles may be about 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 ⁇ m, 2 ⁇ m, 3 ⁇ m, 4 ⁇ m, 5 ⁇ m, 10 ⁇ m; 20 ⁇ m, 30 ⁇ m, 40 ⁇ m, 50 ⁇ m, 100 ⁇ m, 200 ⁇ m, 300 ⁇ m, 400 ⁇ m, 500 ⁇ m or 1 mm.
  • the bait compounds are fixed exclusively on nanoparticles, within the meaning of the present description.
  • the basic solid support is of spherical shape. It may consist of balls having an outer surface ranging from 0.1 .mu.m 2 to 10 mm 2 .
  • the beads may have an outer surface of about 0.2 ⁇ m 2 , 0.3 ⁇ m 2 , 0.4 ⁇ m 2 , 0.5 ⁇ m 2 , 1 ⁇ m 2 , 2 ⁇ m 2 , 3 ⁇ m 2 , 4 ⁇ m 2 , 5 ⁇ m 2 , 10 ⁇ m 2 , 20 ⁇ m 2 , 30 ⁇ m 2 , 40 ⁇ m 2 , 50 ⁇ m 2 , 100 ⁇ m 2 , 200 ⁇ m 2 , 300 ⁇ m 2 , 400 ⁇ m 2 , 500 ⁇ m 2 , 10 3 ⁇ m 2 , 5.10 3 ⁇ m 2 , 10 4 ⁇ m 2 , 5.10 4 ⁇ m 2 , 10 5 ⁇ m 2 , 5.10 5 ⁇ m 2 , 1 mm 2 , 2
  • the coating consists of a layer (bi-layer) comprising amphiphilic molecules, that is to say molecules which have a double affinity, both (i) hydrophilic and ( ii) hydrophobic or lipophilic.
  • the coating comprises or consists essentially of a layer or a bilayer of amphiphilic molecules chosen from lipids, in particular phospholipids, surfactants or amphiphilic organic polymers such as polyethylene glycol (PEG).
  • lipids in particular phospholipids, surfactants or amphiphilic organic polymers such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • anionic surfactants negative net charge
  • cationic surfactants positive net charge
  • Anionic surfactants are surfactants which dissociate into an amphiphilic anion and a cation, which is generally an alkali metal or a quaternary ammonium.
  • Cationic surfactants are surfactants which dissociate in aqueous solution to an organic cation and an anion, generally a halide.
  • the cationic surfactants are those which are well known per se, such as primary, secondary or tertiary fatty amine salts, optionally polyoxyalkylenated salts; quaternary ammonium salts such as chlorides or bromides of tetraalkylammonium, alkylamidoalkyl-trialkylammonium, trialkylbenzylammonium, trialkylhydroxyalkylammonium or alkylpyridinium; imidazoline derivatives, benzalkonium chloride or bromide, benzododecium chloride or bromide, cethexonium bromide or chloride, cetrimonium bromide, cetylpyridinium chloride, dequalinium chloride, dodeclonium bromide, bromide dodecyl-dimethylcarboxymethylammonium, tetradonium bromide.
  • quaternary ammonium salts such as chlorides or bromides of tetraal
  • the various anionic or cationic surfactants that can be used to prepare the coating of the detection device of the invention including those listed in the "International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook” (8 '). Ed. , 2000, Volume 2, pp. 1789-1795, J. Werminger, R. Canterbury, G. McEwen Eds.
  • the coating consists of a layer of phospholipids, the surface of the phospholipid layer having a net charge in solution at neutral pH which is either positive or negative.
  • the coating has a net charge in neutral pH solution which is either positive or negative.
  • the coating of the device may comprise a mixture of charged molecules, either positively or negatively, with uncharged molecules in neutral pH solution.
  • the coating consists of a layer (two-layer) of phospholipids, said layer (bi-layer) layer) of phospholipids being loaded either positively or negatively into a neutral pH buffer solution.
  • the surface of the phospholipid layer to which the microparticles or the nanoparticles are bonded has a net positive or negative charge in an aqueous solution at neutral pH, for example an aqueous solution which buffers the pH, in particular a phosphate buffer solution at the concentration. 1 Mr.
  • the "phospholipid layer” consists of a bilayer of phospholipids whose two externally exposed faces have a net positive or negative charge in an aqueous solution at neutral pH.
  • One of the faces of the phospholipid bilayer is maintained in contact with the surface of the solid support by virtue of non-covalent weak bonds, in particular by means of hydrogen bonds, electrostatic forces and van der Waals bonds.
  • the second outer surface of the phospholipid bi-layer is exposed to the solvent and is in contact with the microparticles or nanoparticles comprising the immobilized bait compound (s).
  • the "phospholipid layer” may consist of a monolayer of phospholipids which adheres non-covalently to the surface of the solid support, with the hydrophobic part of the phospholipid molecules. in contact with the surface of the solid support with the hydrophilic part of the phospholipid molecules which is in contact with the microparticles or the nanoparticles comprising the immobilized bait compound (s).
  • a "phospholipid layer” consisting of a monolayer of phospholipids can be used mainly with a hydrophobic solid support, such as for example polystyrene.
  • positively charged phospholipid is meant according to the invention a phospholipid having a net positive charge in an aqueous solution at a neutral pH.
  • neutral phospholipid a phospholipid which has a neutral net charge in an aqueous solution at neutral pH.
  • negatively charged phospholipid is meant according to the invention a phospholipid which has a net negative charge in an aqueous solution at neutral pH.
  • an aqueous solution has a neutral pH when the measurement value of the pH of this aqueous solution is between 6.7 and 7.3.
  • the phospholipid layer when positively charged, preferably comprises positively charged phospholipids in an amount of at least 1% by weight of all the phospholipids contained in said layer.
  • the positively charged phospholipids are selected from the following phopholipids: 1,2-Dilauroyl-SA7-Glycero-3-ethylphosphocholine, 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine (EDMPC), 1,2-Dioleoyl -SA7-Glycero-3-Ethylphosphocholine, 1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine, 1,2-Dipalmitoyl-SA7-Glycero-3-Ethylphosphocholine, 1,2-Dipalmitoyl-SA7-Glycero-3-
  • Ethylphosphocholine 1, 2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine, and 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-SA7-Glycero-3-Ethylphosphocholine.
  • the phospholipid layer may comprise neutral phospholipids as well as negatively charged phospholipids.
  • the neutral phospholipids are chosen from DMPC (1, 2-dimyristoyl-P-O-ethylphosphatidylcholine), DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) and DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine),
  • the negative phospholipids are chosen from DPPG (dipalmytoylphosphatidylglycerol), DMPG
  • DPG diphosphatidyl glycerol or cardiolipin
  • PS phosphatidylserine
  • P1 phosphatidylinositol
  • the phospholipid layer that is included in the device according to the invention may comprise a single type of phospholipid loaded positively or negatively charged, or on the contrary a mixture of several types of positively charged phospholipids, or negatively charged.
  • the phospholipid layer comprises, as phospholipids, exclusively positively charged phospholipids, or exclusively negatively charged phospholipids.
  • the phospholipid layer of the device comprises 100% by weight of positively charged phospholipids, or 100% by weight of negatively charged phospholipids, relative to the total weight of phospholipids of said layer.
  • the phospholipid layer may comprise one or more fluorescent phospholipids.
  • a detection support according to the invention has been made which comprises a solid support consisting of polystyrene carboxylate microbeads whose phospholipid layer comprises 0.25 percent by weight of a fluorescent marker, relative to the total weight phospholipids.
  • a fluorescent label for example, a fluorescent cholesteryl can be used.
  • the detection device included nanoparticles on which nucleic acid baits were immobilized. By flow cytometric analysis of the microbeads of the device, before and after desorption of the nanoparticles, it has been shown that the desorption event of the nanoparticles causes an increase in the fluorescence emission signal by a factor greater than 10.
  • Microparticles or nanoparticles of a detection device of the invention are provided.
  • microparticles are of spherical, oblong or parallelepipedal shape and their largest dimension varies from 500 nanometers to 2 millimeters, better still from 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m, and quite exactly preferred from 1 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • these nanoparticles are of spherical, oblong or parallelepiped and their largest dimension varies from 3 nanometers to 100 nanometers and preferably from 3 to 50 nanometers.
  • the microparticles or nanoparticles included in a detection device according to the invention have their external surface exposed to the solvent which consists of a metallic material, a semiconductor material or an insulating material.
  • the outer surface of the microparticles or nanoparticles has a net negative charge in a solution allowing the target compound to form a complex with the bait compound.
  • the entire mass of microparticles and nanoparticles is made of a metallic material, a semiconductor material or an insulating material.
  • the metallic material of the microparticles and nanoparticles is preferably selected from Au, Ag, Cu and Co.
  • the semiconductor material of the microparticles or nanoparticles is preferably selected from Si, Ge, ZnO, SnO, CdS, CdSe and GaAs.
  • the insulating material of the microparticles or nanoparticles is preferably chosen from glass, SiO 2 , Fe 2 O 3. , Latex, or an insulating polymer.
  • the bait compound (s) is (are) bound to the microparticles or nanoparticles by non-covalent bonds or by covalent bonds.
  • the bait compound (s) is (are) bound to the microparticles or to the nanoparticles by non-covalent weak bonds, such as hydrogen bonds, electrostatic forces. , links of Van Der Waals.
  • the bait compounds can simply be adsorbed on the outer surface of the microparticles or nanoparticles.
  • the bait compounds are bound to the microparticles or the nanoparticles by covalent chemical bonds.
  • Fixing the compounds baits covalently on the surface of the microparticles or nanoparticles can be carried out by any technique known to those skilled in the art, for example by prior functionalization of the surface of the microparticles or nanoparticles before reacting the functionalized surface microparticles or nanoparticles with the bait compound (s) of interest.
  • the surface of the microparticles or nanoparticles, in particular microparticles or glass nanoparticles can be functionalized with the aid of silylating agents.
  • Silylating agents are widely used in the state of the art to functionalize the surfaces of materials, such as silica-based surfaces. Monofunctional silylating agents were used to form functionalized surface coating monolayers while bi and trifunctional silylating agents were used to form polymerized coatings on silica surfaces.
  • silylating agents have been developed for the silylation of solid supports, such as glass supports that include functional groups that can be derived for subsequent covalent reactions.
  • the silylating agents are immobilized on the surface of the supports, such as glass, and used to prepare matrices of high density protein or oligonucleotide compounds.
  • the supports such as glass
  • N- (3- (triethyloxysilyl) -propyl) -4-hydroxybutyramide PCR Inc., Gaiensville, FIa. And Gelest, Tullytown, Philadelphia, USA
  • hydroxyalkylsilyl compounds have been used to prepare hydroxyalkyl compounds, such as glass supports.
  • N, N-bis (hydroxyethyl) aminopropyl triethoxysilane has been used to treat glass supports to enable high density oligonucleotide matrix synthesis, as described by MacGall et al. al. (1996, Proc Natl Acad Sci, vol.93: 13555-13560) and Pease et al. (1994, Proc Natl, ACAD, SCI, vol.91: 5022-5026). It has also been used to treat racétoxypropyltriéthoxysilane glass substrates, as described in PCT application N WO 0 97/39151.
  • the bait compound (s) is (are) a protein or a peptide.
  • the bait compound (s) is (are) chosen from among the growth factor receptors, the hormone receptors, the neurotransmitter receptors, the cytokines, extracellular matrix receptors, lectins, cytokines, serpins, transcription factors, DNA binding proteins, zinc finger proteins, cell surface antigens and antigens.
  • a bait compound of the transcription factor type may be immobilized on a detection device according to the invention by fixing said transcription factor on a nucleic acid comprising one or more copies of the nucleic sequence specifically recognized by said transcription factor. transcription.
  • the nucleic acid comprising the nucleic acid sequence specifically recognized by said transcription factor is attached to the nanoparticles or microparticles included in the detection device.
  • the bait compound (s) is (are) an antibody (s).
  • antibodies is meant according to the invention both a complete antibody and an antibody fragment comprising the CDR domain of an antibody specific for a target compound.
  • an “antibody” according to the invention includes Fab, Fab, F (ab ') 2 fragments, and single variable-chain antibody (ScFv) fragments, derived from polyclonal or monoclonal antibodies, or from humanized antibodies, well known in the state of the art.
  • the detection device of the invention is also illustrated below by its specific embodiment in which the bait compound (s) is (are) a nucleic acid (s).
  • Detection device of the invention comprising nucleic acid bait compounds
  • the bait compound (s) may be a bait nucleic acid (s).
  • the bait compounds consist of bait nucleic acids
  • the target compounds may be varied.
  • they may consist of proteins or peptides, as well as nucleic acids.
  • the bait nucleic acid comprises a sequence that specifically binds to a target compound.
  • the sequence of the nucleic acid which specifically binds to the target compounds may consist of the sequence of an "aptamer", for example an aptamer previously selected by means of a well-known "Selex" type process. of the skilled person.
  • the Selex process consists of a process in which one or more nucleic acids are selected which selectively bind to a target compound of interest, which target compound of interest can be of any kind, in particular a protein or a peptide of interest. .
  • nucleic acids which have a specific affinity for the target compound of interest for example the target protein or peptide of interest.
  • the bait nucleic acid comprises at least one sequence hybridizing with a target nucleic acid of interest under the hybridization conditions described below.
  • Hybridization conditions within the meaning of the invention are understood to mean hybridization conditions in a phosphate buffer comprising phosphate at a concentration which may vary from 0.01 M to 1 M.
  • a bait nucleic acid comprises exclusively the sequence specifically binding to the corresponding target compounds.
  • the bait nucleic acid comprises (i) a sequence that specifically binds to the target compounds and (ii) a sequence that does not bind to the target compounds, particularly under the hybridization conditions described above. .
  • sequence (ii) which does not bind to the target compounds may have various functions.
  • this second sequence (ii) can itself be composite.
  • the sequence (ii) of the bait nucleic acid which does not specifically bind to the target compounds consists of a linker sequence, or "linker", whose function is to physically separate the sequence binding to the compounds targets of the surface of the microparticles or nanoparticles to which the bait nucleic acid is attached, in order to increase the accessibility of the bait nucleotide sequence for the target compounds.
  • sequence (ii) of the bait nucleic acid which does not specifically bind to the target compounds can be composite and comprise, respectively (ii-a) a linker-type binding sequence of which the end is bound to (ii-b) a sequence hybridizing specifically with a sequence (ii) of a distinct bait nucleic acid.
  • two distinct nucleic acid baits contained in a detection device according to the invention bind specifically with two distinct parts of the same target compound.
  • two distinct bait nucleic acids comprise (i-1) and (i-2) bait sequences complementary to two distinct nucleotide sequences, respectively (Ci-1) and (Ci-2), contained in the same DNA or RNA target.
  • a bait nucleic acid comprises a nucleotide sequence of the hybridization probe type by which, under the appropriate hybridization conditions, two alleles of a DNA sequence which differentiate from each other can be distinguished. the substitution of a single nucleobase. Two alleles differentiate from each other by the substitution of a single nucleotide base because of a polymorphism called "single nucleotide polymorphism" (or SNP for "Single Nucleotide Polymorphism”).
  • At least one bait nucleic acid which hybridises with the first allele of said SNP site and which is hybridized with the first allele of said SNP site is used for a given polymorphic site. does not hybridize, under identical hybridization conditions, with the second allele of the SNP site.
  • a bait nucleic acid which hybridizes with the second allele of the SNP site and which does not hybridize, under identical hybridization conditions, with the first allele of the SNP site can also be used.
  • such a bait nucleic acid has, at its 3 'end, a base which is complementary to only one of the alleles of the SNP site.
  • the detection device according to the invention can be used by the detection of SNP type polymorphisms in nucleic acids of genomic DNA.
  • a detection device of the invention comprises, for a given target nucleic acid, at least two types of distinct bait nucleic acids, each of the two types of nucleic acids being bound to nanoparticles or to separate microparticles.
  • a first bait nucleic acid hybridizes with a first specific region comprised in said target nucleic acid.
  • a second bait nucleic acid hybridizes with a second specific region comprised in said target nucleic acid, distinct from the first specific region of said target nucleic acid.
  • the first acid Bait nucleic acid has a sequence complementary to the first specific region of the target nucleic acid and
  • the second bait nucleic acid has a sequence complementary to the second specific region of said target nucleic acid.
  • the target nucleic acid when present in the sample to be tested, hybridizes with both (i) the first nucleic acid bait which is bound to certain nanoparticles or microparticles and (ii) with the second bait nucleic acid which is bound to certain other nanoparticles or microparticles, which generates cross-links between the first and second types of nanoparticles or microparticles.
  • the creation of cross-links between two types of nanoparticles or microparticles because of the hybridization event of a target nucleic acid present in the sample to be tested simultaneously with two nucleic acids bait specific to two distinct regions of said target nucleic acid, has the effect of selectively stabilizing these two types of nanoparticles or microparticles on the detection device according to the invention.
  • This selective stabilization event of two types of nanoparticles or microparticles makes it possible to implement the detection device according to the invention in detection methods that have both:
  • the above embodiment of the detection device according to the invention because of its high specificity and its high sensitivity of detection, is perfectly adapted to the detection of polymorphisms nucleotides, in particular to the detection of SNP nucleotide polymorphisms, as illustrated in the examples.
  • the detection device comprises at least: (i) a first type of nanoparticles or microparticles to which is bonded a first type of nucleic acid hybridizing to a first region of a bait nucleic acid; and
  • a bait nucleic acid capable of hybridizing to both types of nanoparticles or microparticles is pre-incubated in the sample to be tested. If the test sample contains the corresponding target nucleic acid, the bait nucleic acid hybridizes with the target nucleic acid. Then, during the deposition of the sample pre-incubated with the bait nucleic acid on the detection device, said bait nucleic acid does not hybridize with the nucleic acids bound to the nanoparticles and the microparticles, because said nucleic acid bait is already hybridized with the corresponding target nucleic acid within the pre-incubated sample.
  • the bait nucleic acid remains in a non-hybridized free form during its pre-incubation in the sample to be tested. Then, during the deposition of the sample pre-incubated with the bait nucleic acid on the detection device, said bait nucleic acid hybridizes with the two types of nanoparticles or microparticles respectively by stabilizing them on the detection medium. by creating cross links or "crosslinks" between the two types of nanoparticles or microparticles.
  • the stabilization of the two types of nanoparticles or microparticles can be detected, for example due to a non-desorption of these nanoparticles or microparticles, or because of an increase in the temperature at which these nanoparticles or microparticles desorb from the support.
  • the detection device allows the detection of target compounds capable of binding selectively on nucleic acids comprising a given target sequence, such as for example various types of proteins capable of binding specifically to certain nucleotide sequences.
  • the bait nucleic acid may consist of a nucleic acid selected by a SELEX-like technique or a nucleic acid recognized by cellular proteins such as transcription factors.
  • a detection device comprises at least:
  • the event of binding of the target compound on the bait nucleic acid stabilizes on the device the preformed hybridization complex between the bait nucleic acid and the two types of nucleic acids related to the two types of nanoparticles or microparticles.
  • the stabilization of the preformed hybridization complex can be detected, due to a modification of the desorption conditions of the nanoparticles or the microparticles, for example an increase in the value of the temperature at which the nanoparticles or the microparticles desorb of the support.
  • a mutation of the target nucleic acid for example generated by exposure to UV radiation, or cleavage of the target nucleic acid, for example generated by the action of an endonuclease, reduces the number or weakens the cross-links between the two types of nanoparticles or microparticles, which results in a reduction of the stability of these nanoparticles or of these miroparticles on the support, which can be detected, for example by a decrease in the value of the temperature to which nanoparticles or microparticles desorb from the support.
  • each of the (i) first type of nucleic acid and (ii) the second type of nucleic acid comprises:
  • a first polynucleotide sequence capable of hybridizing to, for example complementary to, a first region of a given nucleic acid, as appropriate a region of a bait nucleic acid or a region of a target nucleic acid; and (b) a second polynucleotide sequence capable of hybridizing to, for example complementary to, the binding nucleic acid which is directly attached to the nanoparticles or microparticles.
  • the first sequence (a) is directly fused with the second sequence (b).
  • the first sequence (a) is separated from the second sequence (b) by a spacer polynucleotide having a length ranging from 2 to 100 nucleotides in length, preferably from 2 to 30 nucleotides in length.
  • the linker nucleic acids that are directly attached to the nanoparticles or microparticles can also be called “tags”.
  • the “tags” are capable of hybridizing to the sequences (b) defined above, said sequences (b) also being able to be called “complementary tags”.
  • the target nucleic acid consists of a nucleic acid resulting from the fusion between two starting nucleic acids under the action of a nucleic acid.
  • ligase a nucleotide polymorphism is detected at a predetermined location of a reference sequence of interest, for example an SNP polymorphism at a given nucleotide position of a genomic polynucleotide.
  • the sample to be tested comprises at least molecules of a nucleic acid comprising an SNP polymorphism site for which it is desired to determine the identity of the polymorphic nucleotide.
  • the test sample is preincubated with a pair of primers complementary to the region of the test nucleic acid which comprises the SNP site, respectively:
  • a first primer comprising, from the 3 'end to the 5' end, (M) a sequence complementary to the region of the nucleic acid to be tested, the terminal nucleotide on the 3 'side of this first primer being complementary to the nucleotide defining one of the possible alleles of said SNP site and (i2) a first "tag" sequence complementary to a first nucleic acid bait bound to nanoparticles or microparticles of a detection device according to the invention; and (ii) a second primer comprising, from the 5 'end to the 3' end, (ii1) a sequence complementary to the region of the nucleic acid to be tested, the terminal nucleotide on the 5 'side of this second primer hybridizing with the nucleotide of the test nucleic acid located immediately 3 'of the nucleotide defining said allele of the SNP site and (ii2) a second complementary "tag" sequence of a second acid nucleic bait bound to nanoparticles or microp
  • the first and second primer above immediately succeed each other on the nucleic acid to be tested without being chemically bound to each other by a phosphodiester linkage.
  • the first primer (i) is complementary to the corresponding polymorphic nucleotide located in the nucleic acid to be tested, then the first primer (i) is completely hybridized to the nucleic acid to be tested, and the first primer (i) and the second primer (ii) can be fused with one another by the action of a ligase to generate a nucleic acid whose length is equal to the sum of the nucleotide lengths of the first (i) and second (ii) primers above.
  • the nucleic acid which consists of the fused primers is a target nucleic acid capable of hybridizing, by its regions (i2) and (ii2), to the first and second bait nucleic acids of the detection device with which it will create bonds. crossed or "crosslinks".
  • the crosslinks thus generated stabilize the nanoparticles or the corresponding microparticles, which can then be detected by the absence of desorption of the nanoparticles or the microparticles, under appropriate conditions.
  • the 3 'terminal nucleotide of the first primer (i) is not complementary to the corresponding polymorphic nucleotide located in the nucleic acid to be tested, then the 3' end of the first primer (i) does not is not hybridized to the nucleic acid to be tested and the action of a ligase does not generate the fusion between the first primer (i) and the second primer (ii).
  • the deposit of the sample on the detection device will not cause crosslinks or "crosslinks" capable of strongly stabilizing the nanoparticles or microparticles. This can be detected by detecting the desorption of nanoparticles or microparticles, under desorption conditions identical to the appropriate desorption conditions above.
  • first primer in a physically separated manner, but possibly simultaneously in time, four types of first primer (i) which differ by the identity of the nucleotide located at their 3 'end (A, T, G or C), in order to positively detect in all cases the identity of the nucleotide located at the SNP site of the starting nucleic acid to be tested .
  • the nucleic acid baits are covalently bound to the surface of the microparticles or nanoparticles.
  • the bait nucleic acids can be functionalized at their 5 'end or at their 3' end with alkylthio groups of formula (I) SH- (CH 2 ) n -, in which n is an integer ranging from 1 to 10, as described in particular in US Patent Application No. 2003/0059777 published March 27, 2003 (Nanosphere Inc.).
  • the bait nucleic acids which have an alkylthio function at their 5 'end or at their 3' end, are incubated with colloidal gold nanoparticles with which these nucleic acids react, by creation. covalent bonds with the surface of the nanoparticles.
  • the microparticles or the nanoparticles contain a molecule detectable by colorimetry or fluorimetry.
  • the microparticles or nanoparticles may contain a pigment or a combination of pigments, either on the outer surface on which the bait compounds are bound, or in the entirety of the mass of said microparticles or nanoparticles.
  • the phospholipid layer contains a molecule detectable by colorimetry or fluorimetry, for example a pigment or a combination of pigment.
  • a molecule detectable by colorimetry or fluorimetry for example a pigment or a combination of pigment.
  • the number of microparticles or nanoparticles included in the detection device depends both on (i) the surface of the base solid support and (ii) the density of microparticles or nanoparticles per unit area of said basic solid support.
  • the detection device comprises at least 100 microparticles or nanoparticles per cm 2 of surface of the basic solid support
  • the detection device of the invention may comprise at least 5.10 to 10 per cm 2 nanoparticles.
  • the surface value of the basic solid support which also determines the total area of the detection device, is variable.
  • the surface of the inventive detection device can vary from 0.1 .mu.m 2 to 10 cm 2, depending on the case and depending on the type of solid support used.
  • the solid base support has a flat surface, as in most oligonucleotide or protein matrix supports that make up the DNA chips or the protein chips.
  • the surface of the basic solid support generally varies from 1 to 10 cm 2 .
  • the basic solid support consists of microparticles whose largest dimension varies from 500 nanometers to 2 millimeters
  • the basic solid support is of spherical shape. It may consist of balls having an outer surface ranging from 0.1 .mu.m 2 to 10 mm 2 .
  • a detection device as defined in the present description may be included in an assembly comprising a plurality of detection devices according to the invention, for example in a set of detection devices each comprising separate bait compounds, in particular distinct bait compounds specific for different target compounds.
  • a set of detection devices according to the invention is also referred to as a "detection system" in the present description.
  • a detection device as defined in the present description, or a detection system as defined above is implemented in a detection method according to the invention, namely a detection method of fixing a target compound on a bait compound, which comprises the steps of: a) contacting a sample that may contain said target compound with a detection device, or with a detection system according to the invention, said device or said system comprising at least one bait compound binding to said target compound; b) detecting any complexes formed between said target compound and said bait compound.
  • the solid support of the device of the invention may comprise a semiconductive surface in contact with the coating.
  • the solid support may consist essentially or wholly of a semiconductor material in contact with the coating.
  • the solid support may consist of an n-type or p-type silicon support, which has at least one ohmic contact located on at least one of its surfaces.
  • the opposite surface of the silicon support may be covered by at least one SiO 2 film having a thickness of 10 to 500 Angstroms, more preferably 50 to 150 Angstroms, for example a thickness of 100 Angstroms.
  • the coating is preferably chosen from electrically insulating coatings, such as certain insulating polymers or else phospholipids, which are coatings previously indicated in the present description.
  • the macroparticles or the microparticles are preferably covered with an electrically conductive material.
  • the macroparticles or microparticles are essentially or wholly made of an electrically conductive material.
  • the electrically conductive material may be chosen from the electrically conductive materials previously indicated in the present description, such as electrically conductive metals such as gold.
  • the detection device described above is immersed in an electrically conductive liquid, such as a buffer solution, for example a solution of a phosphate buffer at a concentration ranging from 0.1 M to 1 M .
  • an electrically conductive liquid such as a buffer solution, for example a solution of a phosphate buffer at a concentration ranging from 0.1 M to 1 M .
  • the device / electroconductive liquid medium combination constitutes a detection system according to the invention.
  • a voltage is applied between the semiconductor support and the electrically conductive liquid.
  • desorption of the microparticles or nanoparticles or conversely ii) the blocking of desorption by formation of complexes between immobilized bait compounds on the device and target compounds can be detected, qualitatively and / or quantitatively, by a measurement of the variations of the electrical signals caused by the formation of said complexes.
  • the desorption or the blocking of the desorption of the microparticles or nanoparticles by measuring the capacitance and / or resistivity components of the electrical impedance of the system for a determined voltage, then by comparing these components with the components.
  • a reference system or a control system which comprises bait compounds in free form, ie not complexed with target compounds.
  • the desorption of the microparticles or nanoparticles is detected by a variation of the capacitance value or by a variation of the resistance value of the conductive device / liquid medium system, with respect to the reference system or the control system.
  • the desorption of the microparticles or nanoparticles is accompanied by a charging effect and, incidentally, by a variation of the flat-band potential V bp of the semiconductor.
  • the flat-band potential V bp is the potential that must be applied to the conductive device / liquid medium system so that the curvature value of the semiconductor strip is zero.
  • the flatband potential V bp can be determined according to the quadrature impedance curve, by applying the well-known Mott-Schottky relation. This phenomenon of charging effect takes place at the interface between the electrically conductive liquid medium and the electrically conductive surface of the macroparticles or microparticles of the device of the invention.
  • At least three electrodes respectively (1) at least one working electrode which is the device of the invention itself, (2) at least one reference electrode which constitutes the reference system, for example an Ag / AgCl type electrode, and (3) at least one counter-electrode.
  • the impedance values are measured, which makes it possible to construct the phase impedance curve (Zp) and the quadrature impedance curve (Zq), as a function of the voltage (V). .
  • the displacement of the impedance curves in a direction parallel to the potential axis which is caused by the desorption of the coating / microparticle or nanoparticle combination, corresponds to the variations of the potential of the flat bands within the composite structure of the device of the invention.
  • the detection device in all its variants defined above, is intended to be implemented in a method for detecting the binding of a target compound on a bait compound included in said detection device, as detailed below.
  • said device is in the form of a microparticle.
  • the solid base support consists of microparticles whose outer surface or all of the mass consists of one of the various materials for the solid support which are indicated in the present description.
  • the outer surface of the solid support microparticles is covered with a coating, non-covalently bonded to the surface of the solid support.
  • a plurality of nanoparticles to which at least one bait compound is attached are bonded to the coating, the coating itself being applied to the surface of the solid support microparticles.
  • the solid support microparticles are characterized in that their largest dimension varies from 500 nanometers to 2 millimeters, preferably from 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m and quite preferably from 1 ⁇ m to 500 ⁇ m. In particular, it is possible to use solid support microparticles whose largest dimension varies from 5 ⁇ m to 200 ⁇ m.
  • the solid support microparticles can have various geometric shapes.
  • the microparticles of solid support can be of cubic, parallelepipedal or ovoid or spherical shape.
  • the microparticles of solid support can have various colors, in order to absorb, according to the type of microparticle, different wavelengths of the light spectrum.
  • the microparticles can be dyed in the mass, for example in the case of a solid support glass or polymer.
  • the microparticles of solid support can be tinted only on their surface, for example in the case of a solid metal support.
  • the solid support microparticles may also be fluorescent. According to the invention, it is possible to use any fluorescent microparticle commonly found on the market. In particular, it is possible to use fluorescent microparticles with a diameter of 10 ⁇ m or a diameter of 15 ⁇ m marketed by Molecular Probes under the trade name FluoroSpheres®.
  • fluorescent microparticles with a diameter of 10 ⁇ m or a diameter of 15 ⁇ m marketed by Molecular Probes under the trade name FluoroSpheres®.
  • the following FluoroSpheres® fluorescent microparticles can be used, characterized by their maximum absorption wavelength and their maximum emission wavelength (Abs / Em), when they are suspended in water.
  • a detection device of the invention in the form of microparticles, may have various colors, or have fluorescence properties, by inclusion of a pigment or a combination of pigments, or a fluorochrome or of a combination of fluorochromes, in the coating bound to the surface of the solid support.
  • the coating consists of a layer of phospholipids
  • the pigment (s) or the fluorochrome (s) may be added to the starting phopholipids, prior to the application of the phospholipid coating to the solid support.
  • labeled, stained or fluorescent molecules which have affinity for phospholipids, such as labeled fatty acids or labeled cholesterol, stained or fluorescent can be used. It is also possible to use phospholipids labeled with pigments or fluorochromes
  • said coating for example the phospholipid layer, comprises fluorescent molecules
  • said coating may comprise a combination of two fluorochromes, the first fluorochrome having a maximum emission wavelength identical to, or different from, maximum of 5 nanometers with respect to, the maximum absorption wavelength of the second fluorochrome.
  • two microparticulate detection devices of the invention whose respective coatings comprise the same specific combination of two fluorochromes, but for which the two fluorochromes are present in distinct proportions.
  • fluorescent phospholipids As fluorescent phospholipids, it is possible to use the fluorescent phopholipids marketed by the company Molecular Probes (Oregon, United States), such as in particular the following phospholipids: 2- (5-butyl-4,4-difluoro-4-bora-3a, 4 ⁇ -diaza-s-indacene-3-nonanoyl) -1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (-C4-BODIPY® 500/510 C9-HPC), 2- (4,4-difluoro-5,7 -dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoyl) -1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (-BODIPY® FL C12-HPC), diammonium salt of 2- ( 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora
  • fluorescent fatty acids As fluorescent fatty acids, it is possible to use the fluorescent fatty acids marketed by the company Molecular Probes (Oregon, United States), such as in particular the following fluorescent fatty acids: 5-butyl-4,4-difluoro-4-boron acid 3a, 4a-diaza-s-indacene-3-nonanoic acid (BODIPY®500 / 510 C4, C9), 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4-diaza-s-indacene acid 3-dodecanoic acid (BODIPY® FL C12), 4,4-difluoro- 5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-hexadecanoic acid (BODIPY® FL C16), acid 4 4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-
  • the nanoparticles on which the bait compounds are attached are characterized in that their largest dimension varies from 3 to 100 nanometers, preferably from 3 to 50 nanometers.
  • the nanoparticles whose largest dimension varies from 10 to 20 nanometers for example nanoparticles of 15 nanometers.
  • the final form of the detection device consists of a microparticle on which bait compounds are exposed.
  • each detection device in the final form of a microparticle on the surface of which the bait compounds are exposed, comprises a single type of bait compound per device or microparticle.
  • the microparticulate detection device of the invention comprises, attached thereto, a plurality of molecules of a single nucleic acid.
  • each microparticulate detection device as defined above comprises more than one type of bait compound, provided that the distinct types of bait compounds bind specifically to a single target compound.
  • the microparticulate device of the invention comprises, fixed thereto, (i) a plurality of molecules of a nucleic acid [1] specific bait of a compound determined target, (ii) a plurality of molecules of a nucleic acid [2] bait, distinct from the nucleic acid [1], also specific for said same target compound, ..., and (i + n-1) a plurality of molecules of a [n] bait nucleic acid, distinct from each of the [i] to [i + n-1] nucleic acids, specific for said same target compound.
  • the distinct [i] to [n] bait nucleic acids specifically hybridize to distinct nucleotide sequences comprised in a single target target nucleic acid.
  • the detection method consists in the implementation of a "detection system", said detection system comprising a plurality of detection devices.
  • distinct detection according to the invention, ie a plurality of distinct microparticulate devices as defined above. It is understood that each microparticulate detection device is capable of specifically binding a given target compound.
  • a detection system as defined above since it comprises a plurality of microparticulate detection devices according to the invention, is adapted to the detection of a plurality of distinct target compounds.
  • each detection device specific for a specific target compound, or a domain or a sequence of said determined target compound can be distinguished from other detection devices specific for a target compound. distinct, or from a different domain or sequence of the same target compound.
  • the various microparticle devices included in a detection system according to the invention can be distinguished, with respect to each other, by their shape or by their size, ie essentially by the shape or size of the basic solid support used.
  • the various microparticulate devices, included in a detection system according to the invention can be distinguished, with respect to each other, by their color or by their fluorescence characteristics, for example the length specific wave emission of a light signal, that is to say essentially by the color or the fluorescence characteristics of the basic solid support used.
  • a first microparticulate detection device specific for a first target compound comprises a spherical solid support microparticle having a diameter ranging from 10 to 30 ⁇ m.
  • a second microparticulate detection device specific for a second target compound comprises a spherical solid support microparticle having a diameter ranging from 50 to 100 ⁇ m.
  • a detection method which uses such a detection system
  • the formation of complexes between the bait compounds and the target compound, on a first type of microparticulate detection device blocks the desorption of the coating on which are fixed the nanoparticles comprising the bait compounds.
  • a second type of microparticulate detection device there is a desorption of the coating on which the nonspecific bait compounds of said target compound are attached due to the lack of complex formation with said target compound.
  • the nanoparticles on which the bait compounds are fixed are colored, as is the case, for example, for gold nanoparticles
  • the desorption of the nanoparticles causes a change in the color of the microparticulate detection device.
  • the microparticulate detection devices which fixed the target compound, by detecting, for example colorimetrically, microparticulate devices for which the desorption of the nanoparticles is blocked;
  • Example 8 A detection system as defined above is illustrated in Example 8.
  • the microparticulate detection devices comprise microparticles of solid glass support, on which is adsorbed a coating consisting of a layer of phospholipids . On the layer of phospholipids are fixed gold nanoparticles covalently bound to bait nucleic acids.
  • a first microparticulate detection device comprising molecules of a first bait nucleic acid is distinguished from a second detection microparticulate device comprising molecules of a second nucleic acid by size. of the microparticle of the basic solid support.
  • the microparticulate devices having fixed the target compound are detected by the specific red color of the gold nanoparticles, which have not been desorbed from the solid support.
  • the identity of the bait nucleic acid which has formed complexes with the target nucleic acid is determined by cytometry or microscopy, by measuring the size of the microparticulate devices having fixed the target nucleic acid.
  • the determination (i) of the microparticulate devices having fixed the target compound and (ii) the identity of the bait compound having formed complexes with said target compound can be carried out simultaneously, with the same technique or the same measuring means.
  • microparticulate devices of distinct specificity are used, which differ from each other by the wavelength of the fluorescence signal emitted after excitation at a given single wavelength.
  • nanoparticles are used on which are fixed the bait compounds which have the property of absorbing light at the single excitation wavelength above.
  • the detection step b) is carried out by illuminating said detection system at the single excitation wavelength, then analyzing the light emission spectrum resulting.
  • microparticulate sensing devices having fixed the bait compound are detected because they absorb light at the single excitation wavelength.
  • the identity of the bait compound having fixed the target compound is determined by spectral analysis of the wavelength of the fluorescence signal emitted by the set of microparticle devices contained in the detection system and determination of the length band. missing wave.
  • the missing wavelength band corresponds to the emission wavelength of the fluorochrome included in the detection device which has fixed the target compound, for which light, at the emission wavelength is absorbed by nanoparticles comprising the bait compounds, which have not been desorbed from the solid support.
  • Such a detection system of the invention is illustrated by the use of microparticulate detection devices comprising fluorescent solid support microparticles, which are distinguished from one another by the wavelength of the fluorescence signal emitted after excitation. at an excitation wavelength of less than 550 nanometers.
  • the bait compounds are attached to gold nanoparticles, which absorb light at excitation wavelengths less than 550 nanometers.
  • solid support microparticles can be used whose base material comprises a fluorochrome compound having an excitation wavelength of 488 nanometers.
  • 488 nanometers can be selected from the following fluorochrome compounds: FITC (525nm emission), Alexa fluorine 488 (525nm emission), PE (575nm emission), PE-texas red (613nm emission), PE-Cy 5, PerCP-Cy5.5 (695nm emission), PE-Cy7 (emission 760nm).
  • FITC 525nm emission
  • Alexa fluorine 488 525nm emission
  • PE 575nm emission
  • PE-texas red (613nm emission
  • PE-Cy 595nm emission PE-Cy7
  • the emission wavelength band of the fluorescent signal of said detection devices which no longer appears in the emission spectrum, due to the absorption of the excitation light at 488 nanometers and the light emitted by said detection devices.
  • the embodiment of a detection system comprising a plurality of microparticulate detection devices according to the invention has many advantages over known detection systems.
  • the identification of the bait compounds having fixed the target compound can be carried out by simple measurement of at least one physical property of the plurality of mircoparticulate detection devices included in the detection system, this measurement being able to be carried out quickly and easily at using a cytometer or a microscope, for example a fluorescence microscope.
  • the identification of the bait compounds having fixed the target compound (s) contained in the sample to be tested can be very fast, since the measurement of the emission bands of the light spectrum can be carried out instantaneously and simultaneously for all the microparticulate detection devices included in the system, for example using a spectrometer fluorescence.
  • a measurement of the emission spectrum does not even require the implementation of a device of the cytometer type, which requires the successive passage of all the microparticle detection devices in front of one or more detectors.
  • the measurement of the emission spectrum is very sensitive and does not require complex equipment.
  • the detection method of the invention can be carried out with a flow cytometer device. , which detects both (i) light scattering, to differentiate microparticulate detection devices by particle size, (ii) the proportion of each fluorochrome, to differentiate microparticulate detection devices by peaks fluorescence, and / or (iii) fluorescence intensity and / or light scattering for detecting the presence or absence of nanoparticles comprising the bait compounds for detecting the binding or non-binding of the target compound (s).
  • the invention also relates to a method for detecting the binding of a target compound to a bait compound, characterized in that it comprises the following steps: a) bringing into contact a sample that is susceptible to contain said target compound with a detection device as defined above, said device comprising at least one bait compound binding to said target compound; b) detecting any complexes formed between said target compound and said bait compound.
  • the desorption of the microparticles or nanoparticles is initiated from when the environmental conditions to which the detection device is subjected are altered by the absence of complex formation between the bait compounds and the target compounds that may be contained in the sample to be tested. In contrast, desorption has been shown to be blocked by complex formation between bait compounds and target compounds.
  • step b) comprises the following substeps: b1) the device is subjected to environmental conditions in which the microparticles or nanoparticles are desorbed from the surface of the solid support, in the absence of complex formation between the bait compound (s) and the target compound (s); b2) the desorption of microparticles or nanoparticles from the surface of the solid support is detected.
  • the device is subjected to environmental conditions in which the interactions between the layer and the support, in particular the electrostatic ones, are weakened or even reversed and / or the interactions between the layer and the nanoparticles, in particular the electrostatic ones, are reinforced.
  • step b) or b1) of the above method the device is subjected to environmental conditions in which the microparticles or nanoparticles are desorbed from the surface of the solid support, in the absence of forming complexes between the bait compound (s) and the target compound (s), by incubating or immersing the detection device in a solution with a high concentration of chloride or bromide.
  • step b) or b1) of the above process the device is subjected to environmental conditions in which the microparticles or nanoparticles are desorbed from the surface of the solid support, at least one of which no formation of complexes between the bait compound (s) and the target compound (s), by adding macromolecules having a charge of the same polarity as the charge of the nanoparticles or microparticles .
  • the detection device comprises nanoparticles or microparticles of net positive charge in neutral pH solution
  • macromolecules are used in step b) or b1) which also have a net positive charge under the same environmental conditions.
  • the detection device comprises nanoparticles or microparticles of net negative charge in solution at neutral pH
  • macromolecules which also have a negative net charge under the same conditions are used in step b) or b1). environment.
  • macromolecules having a negative net charge in solution at neutral pH dextran sulphate may be used in particular.
  • step b) or b1) of the process the charged macromolecules which are added cause the desorption of nanoparticles or microparticles which have not been stabilized on the support because of the binding of target compounds on bait compounds.
  • the final concentration of the macromolecules which is added in step b) or b1) of the process can be readily adapted by those skilled in the art, depending on the type of macromolecule added and the strength of the displacement effect that is desired. For example, if the fixation of the compound target on the bait compound does not cause the creation of crosslinks or "crosslinks" between two types of nanoparticles or microparticles of the device, the fixation of the target compound will cause a stabilization of the nanoparticles or microparticles, but this stabilization is less than when cross links are created. In this case, in step b) or b1) of the method, a lower final concentration of macromolecules is used to desorb nanoparticles or microparticles which have not fixed a target compound than when the binding of the target compound causes the creation of cross links.
  • a final concentration of dextran sulphate of at least 0.1% by weight relative to the total volume of the final solution in which is immersed the detection device according to the invention.
  • a final concentration of dextran sulfate ranging from 0.1% to 5% by weight relative to the total volume of the final solution is used.
  • a final concentration of dextran sulphate of 0.5% by weight relative to the total volume of the final solution is found to be suitable in most cases.
  • Examples 3 to 6 illustrate various implementations of the detection method according to the invention applied with a detection device comprising nucleic acid baits.
  • the detection device is incubated or immersed in a NaCl solution having a final concentration of at least 0.5 M, preferably a final concentration ranging from 0.5 M at 2 M, the final concentration being very preferably 1 M.
  • the detection device in step b1), is incubated or immersed in a KCl solution having a final concentration of at least 0.2 M, preferably final concentration ranging from 0.2 M to 1 M, the final concentration being very preferably 0.4 M.
  • Examples 9 and 10 illustrate various implementations of the detection method according to the invention in which step b) or b1) of the process is carried out with macromolecules of dextran sulfate as charged macromolecules.
  • step b2) of the detection method of the invention the desorption of the microparticles or nanoparticles is detected by a color change of the surface of the device.
  • the surface of the device when using macroparticles or nanoparticles based on gold, the surface of the device has a red color.
  • the desorption event of the microparticles or nanoparticles of the surface of the device simultaneously causes a discoloration of the surface of the device and a coloration of the solution in which the device is immersed or incubated. This color change can be observed simply with the naked eye. However, this color change can be measured by commercially available imaging and / or colorimetric measuring devices.
  • a color change of the device can also be obtained with various types of microparticles or nanoparticles, for example by using microparticles or nanoparticles whose at least the outer surface comprises a pigment or combinations of pigment or even microparticles or nanoparticles tinted with pigments directly in their mass.
  • a color change is observed, at the time of the desorption event, when the phospholipid layer itself comprises a pigment or a combination of pigments.
  • the desorption of the microparticles or nanoparticles from the surface of the detection device causes changes in the physico-chemical properties of the detection device, other than the simple change of color.
  • the desorption event of the microparticles or nanoparticles from the surface of the solid support causes significant changes in the weight load of said solid support and leads to important modifications of most of the physicochemical properties of the device, such as its electrical impedance or its electrical conductivity, its Zeta potential, its optical properties or its ability to transmit a sound or electromagnetic wave.
  • the desorption of microparticles or nanoparticles is detected by a modification of the value of an acoustic wave passing through the solid support of the device.
  • the modification of the value of an acoustic wave may consist of a modification of the frequency of said acoustic wave, for example as measured according to the QCM-D technique.
  • Dissipation Monitoring is a technique that can measure, in real time, the adsorption and desorption of molecules on solid surfaces, or the interaction between molecules on solid surfaces. It is described in particular by Richter et al. (2003, Biophysical Journal, vol.85: 3035-3047). It can be implemented with a Q-Sense D300 device marketed by Q-Sense AB (Gothenburg, Sweden).
  • the adsorption or desorption of analytes on a quartz crystal coated with a silica layer is measured in real time, simultaneously recording the changes in the resonance frequency, " ⁇ F ", and in the dissipation” ⁇ D ", which are related to the adsorbed mass as well as the friction losses of the adsorbed layer, respectively.
  • the desorption of the microparticles or nanoparticles from the surface of the solid support can also be measured, in step b2) of the method, according to a conventional technique of plasma surface resonance (SPR or "surface plasmon resonance”), which is well known in the art. skilled person.
  • the desorption of the microparticles or nanoparticles from the surface of the solid support can also be measured, in step b2) of the method, by measuring the variations in the capacitance or the electrical resistance of the device, more specifically when the device consists of a device with solid semiconductor support as described above.
  • These measurements of electrical variations are described in detail in particular by Souteyrand at al. (1997, J. Phys Chem B, Vol 101: 2980-2985) as well as in the US Patents 0 US 5,869,244, US No. 6,150,106, No. 6,355,436 and US No. US 6,562,577.
  • the detection method according to the invention can be used with bait compounds which consist of nucleic acids which bind to the compound (s) target (s).
  • the first step consists in preparing lipid vesicles with a phospholipid or a mixture of phospholipids having the final phospholipid composition of the phospholipid layer of the device.
  • Lipid vesicles may be prepared by any technique known to those skilled in the art.
  • the phospholipids can be first dissolved in chloroform and mixed in the desired final quantities, then optionally subjected to a drying step under a stream of nitrogen, then in a desiccator under vacuum.
  • the lipid vesicles are then resuspended in a saline buffer, and then homogenized.
  • Small unilamellar vesicles (SUVs for "small unilamellar vesicles") are obtained by sonication, for example with a device of the type "tip-sonicator" (misonix, NY, USA).
  • the small unilamellar vesicles (SUVs) are brought into contact with the basic solid support in order to form the phospholipid layer.
  • the phospholipid layer is obtained on the surface of the solid support by application of the small unilamellar vesicles of lipids prepared as above.
  • the solid support coated with the phospholipid layer is carried out an adsorption step microparticles or nanoparticles which consist incubating the support coated with the phospholipid layer with these microparticles or nanoparticles, for a time necessary for their adsorption, before rinsing the detection device, for example in a phosphate buffer.
  • it may be kept cold and under a nitrogen atmosphere for several weeks, or even several months.
  • the detection device according to the invention can also be stored for several weeks or even several months in a liquid medium at the temperature of a refrigerator ( 40 ° C.), preferably a conventional phosphate buffer.
  • Fixation of the phospholipid layer the glass is incubated for at least 10 minutes in a phosphate buffer ranging from 0.01 to 1 M in the presence of EDMPC vesicles.
  • Rinsing is then performed with the buffer, taking the precaution of avoiding any contact of the surface of the support coated with the phospholipid layer with air.
  • the support must be stored in phosphate buffer ranging from 0.1 M to 1 M.
  • nucleic acid baits are of commercial origin (Eurogentec). They are synthesized by standard protocols of phosphoamides chemistry and then purified by reverse phase chromatography.
  • the colloidal gold nanoparticles and their functionalization are developed according to a procedure described by J. Storhoff et al., (J. Am Chem Soc., 120, 1959, 1998): a solution of HAuCU and sodium citrate. 50 ml of 1 mM HAuCU are heated with continuous stirring. Once boiling is achieved, 5 mL of 38.8 mM sodium citrate is added to the solution. The pale yellow solution initially becomes red. Boiling and stirring are maintained for 15 minutes before allowing the solution to cool to room temperature. The solution is then filtered through filters having 0.8 ⁇ m and then 0.2 ⁇ m pores. The particles obtained have a diameter of about 14 nm.
  • oligonucleotides For functionalization, we add 18 nMole of thiolated oligonucleotides to 5 mL of nanoparticle solution. After incubation for 16 h, the solution is brought to 0.1 M NaCl, 10 mM phosphate buffer for 40 h. To eliminate the excess oligonucleotides, the solution is then rinsed by a succession of centrifugation, removal of the solvent and resuspension of the nanoparticles in 0.1 M phosphate buffer and MgCl 2 at 10 -3 M.
  • the nanoparticles are added to the buffer which bathes the sample. After a sufficient incubation time at room temperature (20-22 ° C.) (which depends on the concentration of nanoparticles) of a duration of 10 minutes to one night, the sample is rinsed in 0.1 M phosphate buffer and preserved. In this one. At this point, the sample has a red color.
  • Example 2 General Methodology of the Detection Method According to the Invention All tests are carried out with detection devices manufactured using, as a basic solid support, portions of glass coverslids for optical microscopy, their surface being approximately 30 mm 2 , or 2 mm glass beads. of diameter which were prepared as described in Example 1.
  • the hybridization assays consist in bringing the detection devices in the presence of a certain amount of target oligonucleotides of 24 bases in length, respectively:
  • the hybridization step is performed in a volume of about 200 .mu.l or 20 ⁇ L of 1M phosphate buffer 0.3M or at room temperature (2O 0 C 25 0 C). After incubation for 30 minutes to one night, a desorption test is performed by adding a certain volume of a solution of 2M KCl or 5M NaCl, or 1% dextran sulfate (Weight / Volume) without any other prior treatment. The desorption event is observed with the naked eye. During the desorption event, the coloration of the buffer solution and the discoloration of the sample are simultaneously observed. The desorption step is carried out in just a few seconds.
  • Nanoparticles No. 1 14 nm diameter, functionalized with SH- (CH 2 ) 6 5'-
  • Nanoparticles No. 2 14nm diameter, functionalized by 5'-
  • Oligonucleotides contained in the test samples Complementary Oligonucleotide: ⁇ '-TACGAGTTGAGACTGCTGAATGCG-S '(SEQ ID No. 8)
  • Oligonucleotide non Complementary 5'-AGACATCATCATGCAAAGAATCGAC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • the first comprises only No. 2 nanoparticles
  • the second comprises a mixture in a ratio of 1: 1 between nanoparticles No. 1 and nanoparticles No. 2.
  • the complementary oligonucleotide can hybridize with the No. 2 nanoparticles by forming a 12-base pair double helix, the remaining 12 remaining free.
  • the complementary oligonucleotide can hybridize with both the No. 1 nanoparticles and the No. 2 nanoparticles.
  • the complementary oligonucleotide makes it possible to create bonds between nanoparticles No. 1 and No. 2 of 24 base pairs.
  • Sample A 1/1 mixture of nanoparticles No. 1 and nanoparticles No. 2.
  • Sample B 1: 1 mixture of nanoparticles 1 and nanoparticles 2.
  • Example 4 Sensitivity of the detection device of the invention All the tests are carried out with detection devices manufactured using, as basic solid support, portions of glass microscope coverslips, which have been prepared as described in Example 1. Their surface area is about 30mm 2 .
  • Sample A 1: 1 mixture of nanoparticles 1 and nanoparticles 2.
  • Sample B 1: 1 mixture of nanoparticles 1 and nanoparticles 2.
  • Sample C 1: 1 mixture of nanoparticles 1 and nanoparticles 2.
  • Sample D 1/1 mixture of nanoparticles 1 and nanoparticles 2.
  • the desorption temperature of the phospholipids / nanoparticles set depends on the melting temperature of the hybrid complex formed between the bait nucleic acid and the target nucleic acid.
  • Sample A Mixture 1/1 nanoparticles 1 and nanoparticles 2-Hybridization with 1 nM complementary oligonucleotide for 1 h 30. 1M phosphate buffer
  • Example 6 Tests of Various Desorption Conditions of the Nanoparticles All tests are carried out with detection devices manufactured using, as basic solid support, portions of coverslips of optical microscope glasses, which have been prepared as described in FIG. Example 1. Their surface is about 30mm 2 .
  • the method can be used in a wide range of salt concentrations.
  • Example 7 Tests of various desorption conditions of nanoparticles.
  • Sample A mixture of 1: 1 nanoparticles 1 and 2 nanoparticles
  • Sample A ' mixture 1/1 nanoparticles 1 and nanoparticles 2
  • Sample B ' mixture 1/1 nanoparticles 1 and nanoparticles 2
  • Desorption can be caused by various means, such as the addition of macromolecules such as Dextran sulfate.
  • Example 8 Detection system comprising a plurality of microparticulate detection devices of the invention.
  • the device is a mixture of about one to one (1: 1) of two types of microparticles for a total weight of about 0.2mg:
  • Microparticles A spherical microparticles forming a complex with the sequence
  • Microparticles B spherical microparticles forming a complex with the 5'-ATGCTGAATGCG-3 'sequence (SEQ ID No. 6) of another target DNA.
  • identification feature diameter of 50-100 ⁇ m
  • microparticles have the characteristic of losing their red coloration during the detection process if complexes have not formed on their surface. The microparticles remaining red indicate the presence of the target complex. So after this step, microparticle spreading on a microscope slide and observation of particles under a microscope makes it possible to observe both the size of the microparticle and whether a complex has formed (red or not) indicating the presence of the target compounds.
  • microparticles are dispersed in 20 .mu.l of 0.1 M PH: 7 phosphate buffer containing 20 ⁇ M of oligonucleotide of sequence 5'-TACGAGTTGAGAATGCTGAATGCG-3 '(SEQ ID No. 1) which can form a complex with the microparticles of type B, but not with microparticles A.
  • the whole is incubated for 45 minutes at room temperature (25 ° C.) and the detection is carried out.
  • microparticles are dispersed in 20 ⁇ l of 0.1 M PH: 7 phosphate buffer containing 20 ⁇ M of oligonucleotide of sequence 5'-CGAAAGTCTGACAGTCCTAATGAG-3 '(SEQ ID NO : 7) which can form a complex with the microparticles of type A, but not with the microparticles B.
  • the whole is incubated for 45 minutes at room temperature (25 ° C.) and the detection is carried out.
  • microparticles are dispersed in 20 .mu.l of 0.1 M PH: 7 phosphate buffer containing 20 ⁇ M of oligonucleotide of sequence 5'-CGAAAGTCTGACAGTCCTAATGAG-3 '(SEQ ID No. 7) which can form a complex with the microparticles of type A, but not with microparticles B and 2OpM sequence oligonucleotide ⁇ '-TACGAGTTGAGAATGCTGAATGCG-S '(SEQ ID No. 3) which can form a complex with the microparticles of type B, but not with the microparticles A.
  • the whole is incubated for 45 minutes at room temperature (25 ° C.) and the detection is performed. Microscopic observation: particles with a diameter of 10-30 ⁇ m and particles with a diameter of 50-100 ⁇ m are red.
  • Example 9 Desorption Test of Nanoparticles with Dextran Sulfate All the tests are carried out with detection devices manufactured using, as basic solid support, glass beads of 2 mm diameter, which were prepared as described in Example 1.
  • nanoparticles 1 functionalized with TCCATTGCGGAA-3 '(CH 2 ) 3 SH [SEQ ID No. 9]
  • nanoarticles 2 functionalized with SH- (CH 2 ) 6 5'GTCAGACTTTCG [SEQ ID N 0 IO]
  • - complementary oligo 2 TTCCGCAATGGA (A) 30 CGAAAGTCTGAC [SEQ ID N 0 12]
  • FIG. 3 illustrates the results of the absorption measurements at 527 nm (absorption of the nanoparticles) of the solution after hybridization of a sample with different amounts of complementary oligonucleotides, and then addition of Dextran sulphate.
  • the samples consist of polystyrene tanks for spectrophotometry.
  • the bottom of these tanks were coated with phospholipids and nanoparticles of 2 types by the same procedures as the preparation on glass support described in Example 1:
  • FIG. 4 illustrates the desorption results of the nanoparticles after incubation with the various target sequences inducing mismatched hybridization complexes (sm), a mismatch (1 m) or three mismatches (3 m).

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Abstract

L'invention a pour objet un dispositif pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât immobilisé sur un support, ledit dispositif comprenant : a) un support solide ; b) un revêtement lié de manière non covalente à la surface dudit support solide ; et c) une pluralité de microparticules ou de nanoparticules sur chacune desquelles est fixé au moins un composé appât, lesdites microparticules ou nanoparticules étant liées au revêtement.

Description

Dispositif pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât immobilisé sur un support et procédé de détection
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte à un dispositif et à un procédé pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât, ledit composé appât étant immobilisé sur un support.
Le dispositif et le procédé de détection selon l'invention peuvent être utilisés dans l'industrie pour des objectifs variés, par exemple pour tester la présence de composés cibles d'intérêt, tels que des antigènes, des anticorps, des protéines cellulaires, des peptides, des principes actifs de médicaments, des acides nucléiques ou toute autre molécule ligand.
Le dispositif et le procédé selon l'invention sont utilisés notamment pour la détection de la présence d'un acide nucléique cible dans un échantillon.
ETAT DE LA TECHNIQUE
II existe un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux dispositifs et de nouveaux procédés susceptibles de permettre une détection améliorée de la fixation de molécules cibles sur des molécules appâts, telles que des molécules appâts constituées par des acides nucléiques, des protéines réceptrices, notamment des anticorps.
On connaît les dispositifs de détection d'une pluralité de composés cibles, telles que les « puces à ADN » ou les « puces à protéines », et les procédés de détection qui les mettent en œuvre.
Ces puces consistent en un substrat sur la surface duquel est immobilisée une pluralité de composés appâts distincts, chaque composé appât étant localisé en une position déterminée sur la surface du substrat, distincte de la localisation des autres composé appâts. En général, les différents composés appâts sont distribués spatialement sur le substrat, sous la forme d'une matrice à deux dimensions, chaque case de la matrice correspondant à un composé appât. Pour détecter une pluralité de composés cibles dans un échantillon susceptible de les contenir, la puce est d'abord mise en contact avec l'échantillon, dans des conditions d'environnement permettant la formation d'un complexe entre les composés cibles et les composés appâts immobilisés à la surface du substrat. Dans une deuxième étape, la formation des complexes formés à la surface de la puce est détectée et localisée par diverses techniques. La pluralité des positions où cette formation a été détectée permet alors de détecter de manière qualitative, voire de manière quantitative, la présence d'une pluralité de composés cibles.
D'autres dispositifs comprennent une pluralité de microparticules appâts. Les microparticules appâts forment, dans certaines conditions d'environnement, des complexes avec les composés cibles. Une microparticule appât a des caractéristiques qui permettent d'identifier la cible avec laquelle elle est susceptible de former un complexe. Dans un premier temps, on disperse le dispositif avec un échantillon contenant des composés cibles, dans des conditions permettant la formation des complexes. Dans un deuxième temps, on détecte les particules ayant formé des complexes à leur surface avec les composés cibles, et on détermine simultanément les caractéristiques, par exemple les caractéristiques de fluorescence de ces microparticules. En général, les caractéristiques d'identification des particules sont obtenues par l'incorporation d'un fluorochrome dans la masse des microparticules et/ou sur les composés cibles contenus dans l'échantillon. La détection des complexes est réalisée à l'aide d'un détecteur de fluorescence, par exemple un détecteur de fluorescence inclus dans un dispositif de détection du type cytomètre de flux. Ce type de technique est décrite, par exemple, dans les brevets américains n0 US 6,599,331 et n0 US 6,649,414.
On a également décrit des dispositifs de détection comprenant une pluralité de couches de particules d'oxyde métallique, une partie au moins des particules étant liées par des liaisons chimiques covalentes à la surface d'un support. Des récepteurs ou des ligands sont fixés à la surface des particules en vue de détecter la fixation éventuelle d'un ligand ou récepteur correspondant susceptible d'être présent dans un échantillon à tester, par des techniques de détection conventionnelles, comme dans la demande PCT n0 WO 00/33078.
On connaît aussi des dispositifs de détection comprenant un support solide sur lequel sont immobilisées, au moyen d'une fixation non covalente sur une couche intermédiaire, des particules comprenant des composés, tels que des acides nucléiques, capables de se lier à des analytes, tels que des acides nucléiques de séquence complémentaire, comme dans la demande de brevet américain n0 US 2003/0017464. Dans ce type de dispositif, la couche intermédiaire sur laquelle sont fixées les particules est liée par des liaisons chimiques covalentes au support solide de base. Les analytes, par exemple les acides nucléiques, éventuellement présents dans l'échantillon à tester, sont détectés selon des techniques conventionnelles. On connaît aussi des dispositifs de détection comprenant des particules de détection qui peuvent être préparés par un procédé comprenant la fixation d'une couche de particules de détection dispersées dans un liant polymère. Un tel procédé peut comprendre une étape de traitement d'un support solide plan par plasma ou oxydation chimique, afin de fonctionnaliser le support avant le dépôt et la fixation des particules de détection en dispersion dans le liant polymère, comme dans la demande PCT n0 WO 03/004993. Dans ce type de dispositif, les particules peuvent, dans certains cas, être séparées du support solide par une couche d'adhésion au support, de nature indéfinie, et selon un procédé d'application qui n'est pas précisé.
Il existe toujours un besoin d'améliorer les dispositifs de détection du type « puce à ADN » ou « puce à protéines», de manière à permettre la simplification de leur mise en œuvre dans des procédés de détection ou de criblage, à accroître la rapidité ainsi que le nombre d'échantillons traités simultanément dans de tels procédés de détection, et notamment d'en réduire le coût. Pour réaliser l'étape de détection de la fixation d'une molécule ou composé cible sur une puce à ADN ou sur une puce à protéines, on a classiquement recours à des techniques de détection par fluorescence, par marquage radioactif ou par révélation d'une activité enzymatique. Le plus souvent, on procède à un marquage préalable des composés contenus dans l'échantillon à tester par des molécules fluorescentes, puis on détecte, par mesure d'un signal de fluorescence, les molécules qui se sont fixées sur les composés appâts immobilisés à la surface de la puce à ADN ou de la puce à protéines. En général, la localisation des signaux de fluorescence à la surface de la puce à ADN, ou de la puce à protéines, est détectée par le capteur d'une caméra CCD ou encore par le capteur d'un microscope à balayage confocal.
Cependant, la détection des molécules ou composés cibles fixés sur les composés appâts immobilisés sur une puce à ADN ou sur une puce à protéines ne possède pas la sensibilité qui serait requise lorsque l'échantillon à tester comprend de très faibles quantités du ou des composé(s) cible(s), par exemple inférieures à106 molécules . On connaît des techniques de détection autres la fluorescence, comme la spectrométrie de masse, la chemiluminescence ou encore la détection directe d'une modification dans la charge électrique du support sur lequel sont immobilisées les molécules appâts. Toutefois, de telles techniques sont longues et complexes à mettre en œuvre..
De plus, des techniques de détection ayant recours à la spectrométrie de masse requièrent l'utilisation de dispositifs de spectrométrie de masse très coûteux.
Afin d'améliorer les conditions de détection de la fixation de molécules ou composés cibles sur la surface d'une puce à ADN, il a été proposé d'utiliser des acides nucléiques cibles fixés sur des nanoparticules d'or colloïdal. L'hybridation des acides nucléiques cibles sur les acides nucléiques appâts correspondants, les acides nucléiques cibles étant préalablement immobilisés sur la puce à ADN, est alors réalisée par une détection optique des particules d'or colloïdal auxquelles sont liés les acides nucléiques cibles, sur la surface du support de la puce à ADN (Fritzsche et al. , 2002 , Biomédical Nanotechnology Architecture and Applications, Darryl J. Bornhop, et al., Editors, Proceedings of SPIE , Vol. 4626 : 17-22).
Selon cette dernière technique, un signal optique d'une grande intensité est obtenu par réflexion d'un faisceau d'émission de lumière par les particules d'or colloïdal sur lesquelles sont fixés les acides nucléiques cibles ayant hybride avec les acides nucléiques appâts fixés sur le support de la puce à ADN. Un renforcement de l'intensité du signal de réflexion optique peut être obtenu en revêtant les nanoparticules d'or colloïdal par une couche à base d'argent. Bien que cette technique permette la détection de la fixation d'acides nucléiques cibles sur la puce à ADN avec une grande sensibilité, elle nécessite une étape préalable de marquage, par fixation sur l'or colloïdal, des acides nucléiques cibles contenus dans l'échantillon à tester. Cette préparation préalable, par marquage à l'or colloïdal, des acides nucléiques de l'échantillon à tester rend cette technique lourde à mettre en œuvre.
En conséquence, il existe un besoin pour améliorer encore les techniques de détection de la fixation d'un composé ou molécule cible sur un composé ou molécule appât préalablement immobilisé sur un support. En particulier, il serait souhaitable de disposer de techniques de détection plus simples que celles qui sont actuellement connues.
RESUME DE L'INVENTION.
La présente invention a pour objet un dispositif pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât immobilisé sur un support, ledit dispositif comprenant : a) un support solide ; b) un revêtement lié de manière non covalente à la surface dudit support solide ; et c) une pluralité de microparticules ou de nanoparticules sur chacune desquelles est fixé au moins un composé appât, lesdites microparticules ou nanoparticules étant liées au revêtement.
Selon un mode de réalisation préféré, le revêtement est une couche moléculaire de phospholipides et le ou les composé (s) appât(s) est (sont) un (des) acide(s) nucléique(s). La présente invention est également relative à un procédé pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon susceptible de contenir ledit composé cible avec un dispositif de détection tel que défini ci-dessus, ledit dispositif comprenant au moins un composé appât se fixant sur ledit composé cible; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit composé cible et ledit composé appât.
DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 illustre un premier schéma du dispositif de détection selon l'invention.
La figure 1A illustre un schéma du dispositif selon l'invention avant le test. Sur la figure 1A, les microparticules ou les nanoparticules (1 ) sur lesquelles sont fixés les composés appâts (2) sont adsorbées à la surface d'une couche de phospholipides (3). La couche de phospholipide est elle- même adsorbée à la surface d'un support solide (4).
Sur la figure 1B, le dispositif de l'invention est placé dans des conditions appropriées pour la désorption des microparticules ou des nanoparticules.. En l'absence de formation de complexes entre les composés appâts (2) et des composés cibles, les particules sont désorbées du support solide (4). Les phopholipides sont aussi désorbés du support solide. La figure 2 illustre un second schéma du dispositif de détection selon l'invention.
La figure 2A est identique à la figure 1 A.
Sur la figure 2B, le dispositif de l'invention est placé dans des conditions appropriées pour la désorption des microparticules ou des nanoparticules.. En l'absence de formation de complexes entre les composés appâts (2) et des composés cibles, les particules sont désorbées du support solide (4). Les phospholipides ne sont pas désorbés du support solide.
La figure 3 illustre la désorption de nanoparticules à partir d'un support solide constitué de microbilles de 2 mm de diamètre. En abscisse : la quantité finale de l'acide nucléique cible dans l'échantillon testé ; En ordonnées : la valeur d'absorbance à la longueur d'onde de 527 nanomètres de la solution de désorption, exprimée en unités arbitraires.
La figure 4 illustre la désorption de nanoparticules à partir d'un support solide constitué d'une cuve de spectrophotométrie en polystyrène, avec trois acides nucléiques cibles distincts, respectivement (i) [ ] un acide nucléique cible formant un complexe d'hybridation sans mésappariement avec les acides nucléiques appâts, (ii) |>]un acide nucléique cible formant un complexe d'hybridation provoquant un mésappariement avec les acides nucléiques appâts et (iii) Hun acide nucléique cible formant un complexe d'hybridation provoquant trois mésappariements avec les acides nucléiques appâts. En abscisse : la température de test, exprimée en degrés Celsius ; En ordonnées, la valeur d'absorbance à la longueur d'ondes de 527 nanomètres de la solution de désorption, exprimée en unités d'Absorbance.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
De manière surprenante, le demandeur a montré selon l'invention que la fixation d'un composé ou molécule cible sur des microparticules ou des nanoparticules comprenant le composé appât correspondant, les particules étant adsorbées sur un revêtement lié de manière non covalente à un support solide, provoquait une stabilisation des microparticules ou nanoparticules sur la surface du substrat solide.
Notamment, on a montré selon l'invention qu'il était possible de fixer sélectivement un composé cible contenu dans un échantillon à tester, tel qu'un acide nucléique cible, sur un composé appât, tel qu'un acide nucléique appât complémentaire de l'acide nucléique cible, ledit composé appât étant préalablement immobilisé dans un système comprenant un support solide (4) sur lequel on a lié, de manière non covalente, un revêtement (3), notamment une couche de phospholipides (3), le composé appât (2) étant immobilisé sur des microparticules ou des nanoparticules (1 ) qui sont adsorbées à la surface dudit revêtement (3), par exemple à la surface de la couche de phospholipides (3).
De manière surprenante, on a montré selon l'invention que lorsqu'une proportion, même minimale, des microparticules ou des nanoparticules, qui comprennent un composé appât, est liée à un composé cible, on constate une stabilisation sur le support solide (4) des microparticules ou des nanoparticules (1 ) ayant fixé le composé cible.
De plus, on constate qu'un nombre croissant de microparticules ou de nanoparticules comprenant un composé appât est stabilisé sur le support solide lorsque se forment un nombre croissant de complexes entre les composés appâts du dispositif et les composés cibles contenus dans un échantillon à tester.
A l'inverse, on a montré selon l'invention que lorsque, dans le même système placé dans des conditions d'environnement appropriées, il n'y a pas formation de complexes entre les composés appâts du dispositif et les composés cibles de l'échantillon, alors les microparticules ou nanoparticules sont désorbées en quasi totalité du support solide. Dans certains cas, la désorption des microparticules ou des nanoparticules à partir du support solide entraîne aussi, au moins partiellement, la désorption du revêtement qui est lié de manière non covalente sur le support solide. Dans d'autres cas, la désorption des microparticules ou des nanoparticules à partir du support solide n'entraîne pas la désorption de la couche de revêtement. Enfin, on a montré selon l'invention que la stabilisation des microparticules ou des nanoparticules sur le support solide était accrue lorsque le composé cible se liait simultanément à deux composés appâts fixés respectivement sur deux microparticules ou nanoparticules distinctes du dispositif et provoquait ainsi des liaisons croisées entre ces deux microparticules ou nanoparticules.
Ces résultats particulièrement surprenants ont permis au demandeur de mettre au point un dispositif pour détecter la fixation d'un composé cible, tel qu'un acide nucléique cible, sur un composé appât, tel qu'un acide nucléique appât, s'hybridant avec ledit acide nucléique cible. L'invention a pour objet un dispositif pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât immobilisé sur un support, ledit dispositif comprenant : a) un support solide ; b) un revêtement lié de manière non covalente à la surface dudit support solide ; et c) une pluralité de microparticules ou de nanoparticules sur chacune desquelles est fixé au moins un composé appât, lesdites microparticules ou nanoparticules étant liées audit revêtement.
Dans le dispositif ci-dessus, la totalité des microparticules ou des nanoparticules sur lesquelles sont fixés les composés appâts sont en contact direct avec la surface dudit revêtement. Ainsi, dans le dispositif de détection ci-dessus, la pluralité de microparticules ou de nanoparticules forment une couche unique de particules qui est directement en contact avec ledit revêtement. De manière tout à fait préférée, les microparticules ou les nanoparticules sont liées audit revêtement de manière non covalente. Ainsi, dans le mode de réalisation préférentiel du dispositif ci-dessus, les microparticules ou les nanoparticules sont liées audit revêtement exclusivement par des liaisons faibles non covalentes, y compris des liaisons électrostatiques, des liaisons hydrogène, des interactions hydrophiles/hydrophobes ou des liaisons de Van der Waals.
Ainsi, de manière tout à fait préférée, les microparticules ou les nanoparticules sont simplement adsorbées audit revêtement, sans création de liaisons chimiques covalentes entre ces dernières et ledit revêtement. Préférentiellement, les microparticules ou les nanoparticules sont simplement adsorbées à la surface du revêtement. Lors de la fabrication d'un dispositif de détection conforme à l'invention, on applique en général une solution aqueuse comprenant lesdites microparticules ou lesdites nanoparticules. Ainsi, dans le dispositif de détection selon l'invention, les microparticules ou les nanoparticules ne sont pas incluses ou dispersées dans une couche d'un quelconque matériau d'inclusion ou de liant, comme par exemple un liant polymère.
Grâce au dispositif de détection ci-dessus, la fixation d'un ou plusieurs composés ou molécules cibles sur le ou les composé(s) appât(s) immobilisé(s) dans ce dispositif peut être visualisée avec une grande sensibilité, du fait de la modification des caractéristiques physico-chimiques du support solide de base provoqué par l'événement de désorption des microparticules ou nanoparticules de la surface dudit support solide de base, en l'absence de formation de complexes entre les composés appâts et les composés cibles. La désorption des microparticules ou nanoparticules provoque une très grande variation de masse du support solide et en conséquence une grande variation des diverses caractéristiques physico-chimiques du support solide de base. En effet, la désorption des microparticules ou nanoparticules entraîne une modification importante de certaines caractéristiques physico¬ chimiques du support solide de base ou du dispositif, telles que :
- la couleur et, le cas échéant, les propriétés de fluorescence de la surface du dispositif ; - les propriétés de réflexion d'un faisceau d'énergie lumineuse sur la surface du dispositif ;
- les caractéristiques électriques de résistivité et/ou de conductivité et/ou d'impédance du support solide de base, par exemple dans les modes de réalisation du dispositif dans lesquels le support solide de base consiste en un canal d'un transistor de type à effet de champ
(FET pour « Field Effect Transistor »).
- les caractéristiques de transmission d'une onde sonore traversant le matériau du support solide de base ou se propageant à la surface de celui-ci - le potentiel Zêta de la surface du dispositif ;
- les caractéristiques d'électromigration du dispositif
Les caractéristiques spécifiques du dispositif de détection de l'invention permettent son utilisation dans des procédés de détection qui ne comprennent aucune étape préalable de marquage des composés cibles. De plus, le dispositif de détection de l'invention peut être utilisé dans des procédés comprenant une étape de détection simple et directe de la formation de complexes composé appât/composé cible, du fait du changement des caractéristiques de la surface du support solide et des caractéristiques de la solution dans laquelle le dispositif est immergé. Il s'agit d'un avantage technique important, par rapport aux procédés connus n'incluant pas d'étape préalable de marquage des composés cibles, tels que les procédés comprenant une étape de détection des complexes composés appâts/composés cibles non marqués par spectrométrie de masse. De plus, après désorption des microparticules ou nanoparticules, celles-ci sont libérées du support solide de base et sont en suspension dans la solution dans laquelle est immergé le dispositif de détection, lors de sa mise en œuvre dans un procédé de détection. Ainsi, avec un dispositif de détection conforme à l'invention, la désorption des microparticules ou nanoparticules peut être aussi détectée par la mesure du changement des caractéristiques physico-chimiques de la solution dans laquelle est immergé le dispositif. Par exemple, la détection peut être détectée par une mesure de colorimétrie ou de turbidimétrie de la solution dans laquelle est immergé le dispositif de détection.
Ainsi, on a montré dans les exemples qu'avec un dispositif selon l'invention, la fixation d'une ou plusieurs molécules ou composés cibles sur moins de 10% du nombre des molécules ou composés appâts fixés sur les microparticules ou les nanoparticules adsorbées sur le revêtement provoquait la stabilisation de la quasi totalité des microparticules ou nanoparticules, sur le support solide, ce qui permet la mise en œuvre de procédés de détection avec une très grande sensibilité.
Les divers exemples de la présente demande de brevet décrivent la fabrication d'un dispositif de détection tel que défini ci-dessus comprenant des acides nucléiques appâts liés de manière covalente à des nanoparticules.
On a montré selon l'invention qu'une stabilisation d'un dispositif de détection conforme à l'invention ayant une surface du support de base de 30 mm2 par blocage de la désorption des microparticules ou nanoparticules, est obtenue par la fixation d'acides nucléiques cibles présents dans l'échantillon liquide à tester à une quantité de 100 femtomoles, voire dans certains cas de 10 femtomoles. Ces résultats montrent la très grande sensibilité d'un procédé de détection réalisé avec le dispositif de détection de l'invention. Comme cela est illustré dans les exemples, un dispositif de détection conforme à l'invention permet la détection jusqu'à plus de 109 molécules de composé cible en solution par mm2 de surface du support solide, ce qui est comparable à ce qui est obtenu avec les technologies classiques de puces à ADN avec marquage préalable des ADN cibles. On a également montré que le dispositif de l'invention permettait de détecter avec une grande spécificité la fixation du ou des composé(s) cible(s) contenus dans l'échantillon à tester sur le ou les composé(s) appât(s) immobilisé(s) sur le dispositif, puisqu'un échantillon contenant une quantité très élevée, de l'ordre de 1 nanomole, d'un acide nucléique ne s'hybridant pas avec le composé appât immobilisé, ne provoque pas le blocage de la désorption des microparticules ou nanoparticules à partir de la surface du support solide, dans les conditions appropriées.
Ainsi, on a montré selon l'invention que la fixation non spécifique éventuelle de composés autres que les composés cibles, sur le dispositif de détection, n'affecte pas la capacité des microparticules ou nanoparticules à être désorbées de la surface du support solide, dans des conditions appropriées, lorsqu'il n'y a pas d'événement de fixation spécifique de composés cibles sur les composés appâts immobilisés.
Le support solide d'un dispositif de détection de l'invention
Tout type de support solide dont les caractéristiques permettent une bonne adhésion du revêtement sur sa surface peut être utilisé dans un dispositif de détection selon l'invention. Le choix d'un support solide particulier en combinaison avec une couche de revêtement déterminée peut être aisément réalisé par l'homme du métier, à l'aide d'essais de routine effectués à la lumière de l'enseignement contenu dans la présente description.
Dans certains modes de réalisation préférés du dispositif de détection ci-dessus, le support solide consiste en un support solide dont au moins la surface au contact avec le revêtement est chargée négativement ou positivement dans une solution aqueuse à pH neutre, par exemple dans une solution tampon conventionnelle tel qu'un tampon phosphate 1 Molaire (1 M). Dans certains autres modes de réalisation préférés du dispositif de détection ci-dessus, le support solide consiste en un matériau hydrophobe, en particulier un polymère organique hydrophobe.
De préférence, le support solide est choisi parmi le verre minéral, la silice, le silicium, le mica, une alumine, un quartz, un oxyde métallique et un polymère organique choisi parmi les polymères organiques qui sont chargés négativement dans une solution aqueuse à pH neutre, par exemple une solution tampon à la concentration 1 Molaire.
Comme support à base de mica, on préfère le mica de type muscovite, tel que le mica muscovite commercialisé par la Société METAFIX (Saint-Didier, France).
Comme support solide à base de silice, on préfère les cristaux de quartz revêtus de silice tels que ceux commercialisés par la Société Q- SENSE (Gothenburg, Suède).
Comme support solide de silicium, on préfère une galette de silicium telle que celle commercialisée par la Société AB. Comme autre support solide de silicium, on peut aussi utiliser une galette de nitrure de silicium.
Comme support solide en nitrure de silicium, on peut utiliser une galette de silicium dont la surface a été nitrurée sur une épaisseur d'environ 100 nanomètres. Comme support solide en nitrure de silicium, on peut aussi utiliser un support consistant en un capteur d'ions à transistor à effet de champ (appelé en anglais « Ion Sensitive Field Effect Transistor »).
De préférence, l'oxyde métallique du support solide est choisi parmi ZnO, TiO2, Fe2O3 et V2O5.
Préférentiellement, le polymère organique du support solide est choisi parmi les polymères suivants : polyéthylène, polypropylène, polybutadiène, polyoxyéthylène, polystyrène, polycarbonate, polymethacrylate..
Comme polymère organique hydrophobe, on peut utiliser du polystyrène. Comme support solide en polystyrène, on peut utiliser la surface intérieure de cuves de spectrophotométrie en polystyrène.
On peut aussi utiliser un support solide dont la surface en contact avec le revêtement, ou alternativement la totalité de la masse du support solide, est en polystyrène carboxylate.
Comme polystyrène carboxylate, on peut utiliser du polystyrène dont la surface possède des fonctions carboxyles, dont la surface est donc chargée négativement dans une solution aqueuse à pH neutre Comme support solide en polystyrène carboxylate, on peut notamment utiliser des microbilles de polystyrène carboxylate ayant un diamètre de bille de quelques micromètres, par exemple de 1 μm à 10 μm, en particulier 6 μm. Le support solide de base englobe tout type de matériau support dont la surface qui est en contact avec le revêtement du dispositif est fonctionnalisée, de manière à conférer à la surface du support une charge nette positive ou négative ou un caractère hydrophobe. Par exemple, le support solide peut consister en un matériau dont la surface en contact avec le revêtement du dispositif a été fonctionnalisée par syllanisation, par implantation ionique ou encore tout autre procédé de fonctionnalisation par traitement physico-chimique de la surface du support.
Pour fabriquer un dispositif de détection selon l'invention, il est avantageux que la surface du support solide qui est en contact avec la couche de revêtement soit chargée positivement ou négativement ou soit hydrophobe. En revanche, il n'est pas nécessaire que la totalité de la masse du support solide soit elle-même chargée ou hydrophobe. Ainsi, pour fabriquer le dispositif de détection selon l'invention, on peut utiliser tout matériau solide possédant des propriétés mécaniques adaptées, dès lors que la surface du support solide qui est destinée à être en contact avec la couche de phospholipides est chargée ou hydrophobe. Selon l'invention, on peut donc utiliser un support solide composite dont le matériau de base qui n'est pas en contact avec le revêtement peut être tout matériau solide ayant des propriétés de résistance mécanique appropriée, y compris un matériau de base en métal, en matière plastique ou en un verre organique. Un tel support composite comprend, au moins sur la surface sur laquelle on adsorbe la couche de revêtement, une couche d'un matériau hydrophobe ou chargé positivement ou négativement dans une solution aqueuse à pH neutre, choisie parmi les matériaux indiqués précédemment. La couche du matériau hydrophobe ou chargé positivement ou négativement peut être appliquée par toute méthode conventionnelle connue de l'homme du métier, en fonction du matériau de base du support solide composite, telle que des techniques de collage, y compris de thermocollage, ou encore de greffage ou de réticulation chimique.
Selon une première caractéristique avantageuse du dispositif de détection selon l'invention, la charge nette de la surface du support solide est de même polarité que la charge nette de la surface des microparticules ou nanoparticules. Ainsi, si la surface du support solide possède une charge nette positive dans une solution permettant au composé cible de former un complexe avec le composé appât , la surface des microparticules ou des nanoparticules possède aussi une charge nette positive dans la même solution. Inversement, si la surface du support solide possède une charge nette négative dans une solution permettant au composé cible de former un complexe avec le composé appât, alors on préfère que la surface des microparticules ou des nanoparticules possède aussi une charge nette négative dans la même solution .
Selon une caractéristique importante du dispositif de détection selon l'invention, la charge nette du revêtement, qui est lié de manière non covalente au support solide, a préférentiellement une polarité opposée à celle de à la surface des microparticules ou des nanoparticules. Ainsi, selon un premier aspect, le revêtement possède une charge nette positive et la surface des microparticules ou nanoparticules possède une charge nette négative, dans une solution permettant au composé cible de former un complexe avec le composé appât. Selon un second aspect, le revêtement possède une charge nette négative et la surface des microparticules ou nanoparticules possède une charge nette positive, dans une solution permettant au composé cible de former un complexe avec le composé appât.
Dans certains modes de réalisation du dispositif, la charge nette du revêtement, qui est lié de manière non covalente au support solide, a préférentiellement une polarité opposée à la fois à la surface du support solide et à la surface des microparticules ou des nanoparticules. Ainsi, selon un premier aspect, la surface du support solide possède une charge nette négative, le revêtement possède une charge nette positive et la surface des microparticules ou nanoparticules possède une charge nette négative, dans une solution permettant au composé cible de former un complexe avec le composé appât. Selon un second aspect, la surface du support solide possède une charge nette positive, le revêtement possède une charge nette négative et la surface des microparticules ou nanoparticules possède une charge nette positive, dans une solution permettant au composé cible de former un complexe avec le composé appât. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré du dispositif de l'invention, (i) la surface du support solide en contact avec le revêtement possède une charge nette négative ou positive, (ii) le revêtement possède une charge nette de polarité inverse à la polarité de ladite surface du support solide et (iii) la surface des microparticules ou nanoparticules possède une charge nette de polarité identique à la polarité de ladite surface du support solide, et de polarité inverse au revêtement.
Dans un mode de réalisation particulier du dispositif, le support solide consiste en micro-circuit électronique à base de silicium, ou encore consiste en une partie spécifique de la surface d'un micro-circuit électronique à base de silicium, comme par exemple la grille d'un tel micro¬ circuit ou encore le canal d'un transistor à effet de champ (FET) compris dans un tel micro-circuit électronique.
En général, le dispositif de détection comprend au moins 100 microparticules ou nanoparticules par cm2 de surface du support solide de base.
Lorsqu'on utilise des nanoparticules, par exemple des nanoparticules d'un diamètre de 15 nm, le dispositif de détection de l'invention peut comprendre jusqu'à au moins 5.1010 nanoparticules par cm2. La valeur de surface du support solide de base, qui détermine aussi la surface totale du dispositif de détection, est variable. Notamment, la surface du dispositif de détection de l'invention peut varier de 0,1 μm2 à 10 cm2, selon les cas et selon le type de support solide utilisé.
Selon un premier mode de réalisation, le support solide de base possède une surface plane, comme dans la plupart des supports de matrice d'oligonucléotides ou de protéines qui constituent les puces à ADN ou les puces à protéines. Dans ce mode de réalisation, la surface du support solide de base varie généralement de 0,1 μm2 à 10 cm2, par exemple de 1 à 10 cm2. Par exemple, dans ce mode de réalisation particulier, la surface du support solide peut être d'environ 0.2 μm2, 0.5 μm2, 1 μm2, 2 μm2, 3 μm2, 4 μm2, 5 μm2, 10 μm2, 20 μm2, 30 μm2, 40 μm2, 50 μm2, 100 μm2, 200 μm2, 300 μm2, 400 μm2, 500 μm2, 103 μm2, 5.103 μm2, 104μrτn2, 5.104 μm2, 105 μm2, 5.105 μm2, 1 mm2, 2 mm2, 3 mm2, 4 mm2, 5 mm2, 10 mm2, 20 mm2, 30 mm2, 40 mm2, 50 mm2, 1 cm2, 2 cm2, 3 cm2, 4 cm2, 5 cm2, 6 cm2, 7 cm2, 8 cm2 ou 9 cm2.Selon ce premier mode de réalisation, les composés appâts sont fixés indifféremment sur des microparticules ou sur des nanoparticules, au sens de la présente description.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le support solide de base consiste en des microparticules dont la plus grande dimension varie de 500 nanomètres à 2 millimètres. Lorsque les microparticules de support solide sont sphériques, leur diamètre varie préférentiellement de 500 nanomètres à 2 millimètres. Par exemple, la plus grande dimension ou le diamètre des microparticules peut être d'environ 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1 μm, 2 μm, 3 μm, 4 μm, 5 μm, 10 μm ; 20 μm, 30 μm, 40 μm, 50 μm, 100 μm, 200 μm, 300 μm, 400 μm, 500 μm ou 1 mm. Selon ce second mode de réalisation, les composés appâts sont fixés exclusivement sur des nanoparticules, au sens de la présente description.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier, le support solide de base est de forme sphérique. Il peut être constitué de billes ayant une surface extérieure variant de 0,1 μm2 à 10 mm2. Par exemple, les billes peuvent avoir une surface externe d'environ 0,2 μm2, 0,3 μm2, 0,4 μm2, 0,5 μm2, 1 μm2, 2 μm2, 3 μm2, 4 μm2, 5 μm2, 10 μm2, 20 μm2, 30 μm2, 40 μm2, 50 μm2, 100 μm2, 200 μm2, 300 μm2, 400 μm2, 500 μm2, 103 μm2, 5.103 μm2, 104μm2, 5.104 μm2, 105 μm2, 5.105 μm2, 1 mm2, 2 mm2, 3 mm2, 4 mm2, 5 mm2 ou 10 mm2.
Le revêtement d'un dispositif de détection de l'invention
Dans un dispositif de détection selon l'invention, le revêtement consiste en une couche (bi-couche) comprenant des molécules amphiphiles, c'est-à-dire des molécules qui présentent une double affinité, à la fois (i) hydrophile et (ii) hydrophobe ou lipophile.
Préférentiellement, le revêtement comprend ou consiste essentiellement en une couche ou une bi-couche de molécules amphiphiles choisies parmi les lipides, en particulier les phospholipides, les agents tensio-actifs ou encore des polymères organiques amphiphiles comme le polyéthylène glycol (PEG).
Parmi les agents tensio-actifs, on préfère les agents tensio-actifs anioniques (charge nette négative) et les agents tensio-actifs cationiques (charge nette positive). Les agents tensio-actifs anioniques sont les agents tensio-actifs qui se dissocient en un anion amphiphile et un cation, qui est en général un métal alcalin ou un ammonium quaternaire.
Les agents tensio-actifs cationiques sont les agents tensio-actifs qui se dissocient en solution aqueuse en un cation organique et un anion, en général un halogénure.
Les tensioactifs cationiques sont ceux bien connus en soi, tels que les sels d'aminés grasses primaires, secondaires ou tertiaires, éventuellement polyoxyalkylénées ; les sels d'ammonium quaternaire tels que les chlorures ou les bromures de tétraalkylammonium, d'alkylamidoalkyl-trialkylammo-nium, de trialkylbenzylammonium, de trialkylhydroxy-alkylammonium ou d'alkylpyridinium ; les dérivés d'imidazoline, le chorure ou bromure de benzalkonium, le chlorure ou bromure de benzododeciunium, le bromure ou chlorure de cethexonium, le bromure de cétrimonium, le chlorure de cétylpyridinium, le chlorure de dequalinium, le bromure de dodeclonium, le bromure de dodecyl-diméthyl- carboxyméthyl-ammonium, le bromure de tétradonium.
Notamment, les divers agents tensio-actifs anioniques ou cationiques susceptibles d'être mis en œuvre pour préparer le revêtement du dispositif de détection de l'invention englobant ceux qui sont listés dans l'ouvrage « International Cosmetic Ingrédient Dictionary and Handbook »(8'eme Edition, 2000, volume 2, pp : 1789-1795, J. Werminger, R. Canterbury, G. McEwen Eds.
Selon un mode de réalisation particulier du dispositif, le revêtement consiste en une couche de phospholipides, la surface de la couche de phospholipides possédant une charge nette en solution à pH neutre qui est soit positive, soit négative.
Préférentiellement, le revêtement possède une charge nette en solution à pH neutre qui est soit positive, soit négative. Pour préparer un revêtement, il n'est pas nécessaire que toutes les molécules comprises dans le revêtement soient elles-mêmes chargées. Ainsi, le revêtement du dispositif peut comprendre un mélange de molécules chargées , soit positivement, soit négativement, avec des molécules non chargées en solution à pH neutre. Dans un mode de réalisation particulier, le revêtement consiste en une couche (bi-couche) de phospholipides, ladite couche (bi- couche) de phospholipides étant chargée soit positivement, soit négativement, dans une solution tampon à pH neutre.
Préférentiellement, la surface de la couche de phospholipides sur laquelle sont liées les microparticules ou les nanoparticules possède une charge nette positive ou négative dans une solution aqueuse à pH neutre, par exemple une solution aqueuse tamponnant le pH, notamment une solution tampon phosphate à la concentration 1 M.
En général, la « couche de phospholipides » consiste en une bi- couche de phospholipides dont les deux faces exposées à l'extérieur possèdent une charge nette positive ou négative dans une solution aqueuse à pH neutre. L'une des faces de la bicouche de phospholipides est maintenue en contact avec la surface du support solide grâce à des liaisons faibles non covalentes, notamment grâce à des liaisons hydrogène, des forces électrostatiques et des liaisons de Van der Waals. La seconde surface extérieure de la bi-couche de phospholipides est exposée au solvant et est au contact avec les microparticules ou les nanoparticules comprenant le ou les composé(s) appât(s) immobilisés.
Toutefois, dans certains modes de réalisation du dispositif de détection selon l'invention, la « couche de phospholipides » peut consister en une monocouche de phospholipides qui adhère de manière non covalente à la surface du support solide, avec la partie hydrophobe des molécules de phospholipides en contact avec la surface du support solide avec la partie hydrophile des molécules de phospholipides qui est en contact avec les microparticules ou les nanoparticules comprenant le ou les composé(s) appât(s) immobilisés. Une « couche de phospholipides » consistant en une monocouche de phospholipides peut être utilisée surtout avec un support solidehydrophobe, comme par exemple le polystyrène.
Par phospholipide chargé positivement, on entend selon l'invention un phospholipide possédant une charge nette positive dans une solution aqueuse à un pH neutre.
Par phospholipide neutre, on entend selon l'invention un phospholipide qui possède une charge nette neutre dans une solution aqueuse à pH neutre. Par phospholipide chargé négativement, on entend selon l'invention un phospholipide qui possède une charge nette négative dans une solution aqueuse à pH neutre.
Selon l'invention, une solution aqueuse possède un pH neutre lorsque la valeur de mesure du pH de cette solution aqueuse est comprise entre 6,7 et 7,3.
La couche de phospholipides, lorsqu'elle est chargée positivement, comprend de préférence des phospholipides chargés positivement en une quantité d'au moins 1%o en poids de la totalité des phospholipides contenus dans ladite couche.
De préférence, les phospholipides chargés positivement sont choisis parmi les phopholipides suivants : 1 ,2-Dilauroyl-SA7-Glycero-3- Ethylphosphocholine, 1 ,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine (EDMPC), 1 ,2-Dioleoyl-SA7-Glycero-3-Ethylphosphocholine, 1 ,2-Dipalmitoyl- sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine, 1 ,2-Dipalmitoyl-SA7-Glycero-3-
Ethylphosphocholine, 1 ,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Ethylphosphocholine, et 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-SA7-Glycero-3-Ethylphosphocholine.
Comme autres phospholipides, la couche de phospholipides peut comprendre des phospholipides neutres ainsi que des phospholipides chargés négativement.
De préférence, les phospholipides neutres sont choisis parmi le DMPC (1 ,2-dimyristoyl-P-O-éthylphosphatidyl choline) le DOPC (dioléoylphosphatidyl choline) et le DPPC (dipalmitoylphosphatidyl choline),
De préférence, les phospholipides négatifs sont choisis parmi le DPPG (dipalmytoylphosphatidyl glycérol) , le DMPG
(dimyristoylphosphatidyl glycérol), le DPG (diphosphatidyl glycérol ou cardiolipine), le PS (phosphatidylsérine, le Pl (phosphatidylinositol, le PG
(phosphatidyl glycérol), le DOPS (1 ,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphosérine), le POPS (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphosérine), le DOPA (acide 1 ,2-dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphatidique), le POPA (l'acide 1-palmitoyl-2- oléoyl-sn-glycéro-3-phosphatidique, le DOPG (1 ,2-dioleoyl-sn-glycéro-3- phosphoglycérol), et le POPG (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3- phosphoglycérol),
La couche de phospholipides qui est comprise dans le dispositif selon l'invention peut comprendre un seul type de phospholipide chargé positivement ou chargés négativement, ou au contraire un mélange de plusieurs types de phospholipides chargés positivement, ou chargés négativement.
Selon un mode de réalisation particulier du dispositif selon l'invention, la couche de phospholipides comprend, en tant que phospholipides, exclusivement des phospholipides chargés positivement, ou exclusivement des phospholipides chargés négativement. Selon ce mode de réalisation, la couche de phospholipides du dispositif comprend 100% en poids de phospholipides chargés positivement, ou 100% en poids de phospholipides chargés négativement, par rapport au poids total de phospholipides de ladite couche.
Dans certains modes de réalisation du revêtement d'un dispositif de détection selon l'invention, la couche de phospholipides peut comprendre un ou plusieurs phospholipides fluorescents. A titre illustratif, on a réalisé un support de détection selon l'invention qui comprenait un support solide constitué de microbilles de polystyrène carboxylate dont la couche de phospholipides comprenait 0,25 pour cent en poids d'un marqueur fluorescent, par rapport au poids total de phospholipides. Comme marqueur fluorescent, on peut utiliser par exemple un cholesteryl fluorescent. Dans ce mode de réalisation, le dispositif de détection comprenait des nanoparticules sur lesquelles étaient immobilisés des acides nucléiques appâts. Par analyse par cytométrie de flux des microbilles du dispositif, avant et après désorption des nanoparticules, on a montré que l'événement de désorption des nanoparticules provoquait un acccroissement du signal d'émission de fluorescence d'un facteur supérieur à 10.
Les microparticules ou les nanoparticules d'un dispositif de détection de l'invention
Lorsque le dispositif de détection selon l'invention comprend des microparticules, ces microparticules sont de forme sphérique , oblongue ou parallélépipédique et leur plus grande dimension varie de 500 nanomètres à 2 millimètres, mieux de 1 μm à 1000 μm, et de manière tout à fait préférée de 1 μm à 500 μm.
Lorsque le dispositif de détection selon l'invention possède des nanoparticules, ces nanoparticules sont de forme sphérique, oblongue ou parallélépipédique et leur plus grande dimension varie de 3 nanomètres à 100 nanomètres et préférentiel lement de 3 à 50 nanomètres. On peut notamment utiliser des nanoparticules de forme sphérique dont le plus grand diamètre varie de 10 nanomètres à 20 nanomètres, le plus grand diamètre pouvant être de 15 nanomètres.
Préférentiellement, les microparticules ou les nanoparticules comprises dans un dispositif de détection selon l'invention ont leur surface extérieure exposée au solvant qui est constituée d'un matériau métallique, d'un matériau semi-conducteur ou d'un matériau isolant. De préférence, la surface extérieure des microparticules ou des nanoparticules possède une charge nette négative dans une solution permettant au composé cible de former un complexe avec le composé appât.
Dans un mode de réalisation particulier du dispositif, la totalité de la masse des microparticules et des nanoparticules est constituée d'un matériau métallique, d'un matériau semi-conducteur ou d'un matériau isolant.
Le matériau métallique des microparticules et des nanoparticules est préférentiellement choisi parmi Au, Ag, Cu et Co. Le matériau semi-conducteur des microparticules ou des nanoparticules est préférentiellement choisi parmi Si, Ge, ZnO, SnO, CdS, CdSe et GaAs.
Le matériau isolant des microparticules ou des nanoparticules est préférentiellement choisi parmi le verre, SiO2, Fe2O3., le latex, ou encore un polymère isolant.
Le ou les composé(s) appât(s) est (sont) lié(s) aux microparticules ou aux nanoparticules par des liaisons non-covalentes ou par des liaisons covalentes.
Ainsi, selon un premier mode de réalisation particulier, le ou les composé(s) appât(s) est (sont) lié(s) aux microparticules ou aux nanoparticules par des liaisons faibles non covalentes, telles que des liaisons hydrogènes, des forces électrostatiques, des liaisons de Van Der Waals. Par exemple, les composés appâts peuvent être simplement adsorbés sur la surface extérieure des microparticules ou des nanoparticules. Toutefois, selon un mode de réalisation préféré du dispositif de détection de l'invention, les composés appâts sont liés sur les microparticules ou les nanoparticules par des liaisons chimiques covalentes. La fixation des composés appâts de manière covalente à la surface des microparticules ou des nanoparticules peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier, par exemple par fonctionalisation préalable de la surface des microparticules ou des nanoparticules avant de faire réagir la surface fonctionnalisée des microparticules ou des nanoparticules avec le ou les composés appâts d'intérêt.
Par exemple, la surface des microparticules ou des nanoparticules, notamment de microparticules ou de nanoparticules de verre, peut être fonctionalisée à l'aide d'agents de silylation. Les agents de silylation sont utilisés largement dans l'état de la technique pour fonctionnaliser les surfaces de matériaux, tels que des surfaces à base de silice. Les agents de silylation monofonctionnels ont été utilisés pour former des monocouches de revêtement de surface fonctionnalisées alors que les agents de silylation bi et tri-fonctionnels ont été utilisés pour former des revêtements polymérisés sur des surfaces de silice. Plus précisément, les agents de silylation ont été développés pour la silylation de supports solides, tels que des supports de verre qui incluent des groupes fonctionnels qui peuvent être dérivés pour les réactions covalentes ultérieures. Les agents de silylation sont immobilisés sur la surface des supports, tels que du verre, et utilisés afin de préparer des matrices de composés de protéine ou d'oligonucléotide, à haute densité. Par exemple, le N-(3-(triéthyloxysilyl)-propyl)-4-hydroxybutyramide (PCR Inc ., Gaiensville, FIa. and Gelest, Tullytown, Philadelphie, Etats-Unis d'Amérique) a été utilisé pour la silylation d'un support de verre préalable à la synthèse de matrices d'oligonucléotides par synthèse photochimique, comme cela est décrit par McGaII et al. (1997 ; J. Am. Chem. Soc, vol.119 : 5081-5090). De même, des composés hydroxyalkylsilyl ont été utilisés pour préparer des composés hydroxyalkylés, tels que des supports de verre. Le N,N-bis(hydroxyéthyl) aminopropyl-triéthoxysilane a été utilisé pour traiter des supports de verre en vue de permettre la synthèse de matrice d'oligonucléotides à haute densité, comme décrit par MacGall et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci., vol.93 : 13555-13560) et par Pease et al. (1994, Proc. Natl. ACAD. SCI., vol.91 : 5022-5026). On a aussi utilisé de racétoxypropyltriéthoxysilane pour traiter des supports de verre, comme décrit dans la demande PCT N0WO 97/39151. Egalement, on a utilisé le 3- glycidoxy propyltriméthoxysilane pour traiter des supports de verre afin de fournir un groupe de liaison pour la synthèse d'oligonucléotides, comme décrit dans la demande de brevet européen N0EP 89 120 696.
D'autres techniques également bien connues de l'homme du métier sont utilisées pour immobiliser des protéines, telles que des anticorps, sur la surface de supports appropriés, comme décrit par exemple par Ausubel et al. (2000, Current Protocols in Molecular Biology. SCTN. 22, John Wiley et Duclavier and Sons, Inc.) ou encore par Schena (Ed.) (2000, Microarray Biochip Technology, Eaton Publishing Company/Bio Techniques Books Division) ainsi que dans les brevets US N°6,245,511 , N°6,215,894 ; N°6,142,681 , N°6,101 ,946 , N°6,004,755, N°5,930,117, N°5,928,437 et N°5,716,459.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier du dispositif de détection selon l'invention, au moins deux composés appâts distincts sont liés à une microparticule ou à une nanoparticule. Comme déjà spécifié précédemment, dans un mode de réalisation particulier du dispositif de détection selon l'invention, le ou les composé (s) appât(s) est (sont) une protéine ou un peptide. Selon ce mode de réalisation particulier du dispositif, le ou les composé(s) appât(s) est (sont) choisi(s) parmi les récepteurs de facteurs de croissance, les récepteurs d'hormones, les récepteurs des neurotransmetteurs, les récepteurs de cytokines, les récepteurs de la matrice extracellulaire, les lectines, les cytokines, les serpines, les facteurs de transcription, les protéines se liant à l'ADN, les protéines à doigt de zinc, les antigènes de surface cellulaires et les antigènes. A titre illustratif, un composé appât du type facteur de transcription peut être immobilisé sur un dispositif de détection conforme à l'invention par fixation dudit facteur de transcription sur un acide nucléique comprenant une ou plusieurs copies de la séquence nucléique spécifiquement reconnue par ledit facteur de transcription. Dans cet exemple illustratif, l'acide nucléique comprenant la séquence nucléique spécifiquement reconnue par ledit facteur de transcription est fixé sur les nanoparticules ou aux microparticules comprises dans le dispositif de détection.
Selon encore un autre mode de réalisation particulier du dispositif de détection selon l'invention, le ou les composé(s) appât(s) est (sont) un (des) anticorps. Par « anticorps », on entend selon l'invention aussi bien un anticorps complet qu'un fragment d'anticorps comprenant le domaine CDR d'un anticorps spécifique d'un composé cible. Ainsi, un « anticorps » selon l'invention inclut les fragments Fab, Fab, F(ab')2, et les fragments d'anticorps à chaîne variable unique (ScFv), dérivés d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux, ou encore d'anticorps humanisés, bien connus dans l'état de la technique.
Le dispositif de détection de l'invention est aussi illustré ci-dessous par son mode de réalisation spécifique dans lequel le ou les composé(s) appât(s) est (sont) un (des) acide (s) nucléiques (s).
Dispositif de détection de l'invention comprenant des composés appâts du type acide nucléique.
Comme cela a déjà été spécifié précédemment dans la présente description, le ou les composé(s) appât(s) peut (peuvent) consister en un (des) acide(s) nucléique(s) appât(s).
Lorsque, dans le dispositif de détection de l'invention, les composés appâts consistent en des acides nucléiques appâts, les composés cibles peuvent être variés. Notamment, ils peuvent consister en des protéines ou des peptides, aussi bien qu'en des acides nucléiques. Dans tous les cas, l'acide nucléique appât comprend une séquence qui se lie spécifiquement à un composé cible.
Selon un premier mode de réalisation, la séquence de l'acide nucléique qui se lie spécifiquement aux composés cibles peut consister en la séquence d'un « aptamère », par exemple un aptamère préalablement sélectionné grâce à un procédé de type « Selex » bien connu de l'homme du métier. Le procédé Selex consiste en un procédé dans lequel on sélectionne un ou plusieurs acides nucléiques qui se fixent sélectivement sur un composé cible d'intérêt, ce composé cible d'intérêt pouvant être de toute nature, en particulier une protéine ou un peptide d'intérêt. A l'issue du procédé Selex, sont sélectionnés des acides nucléiques qui possèdent une affinité spécifique pour le composé cible d'intérêt, par exemple la protéine ou le peptide cible d'intérêt.
Selon un autre mode de réalisation particulier, l'acide nucléique appât comprend au moins une séquence s'hybridant avec un acide nucléique cible d'intérêt dans les conditions d'hybridation décrites ci- dessous.
Par conditions d'hybridation, au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation dans un tampon phosphate comprenant du phosphate à une concentration pouvant varier de 0,01 M à 1 M.
Selon un premier aspect, un acide nucléique appât comprend exclusivement la séquence se liant spécifiquement aux composés cibles correspondants.
Selon un second aspect, l'acide nucléique appât comprend (i) une séquence qui se lie spécifiquement aux composés cibles et (ii) une séquence qui ne se lie pas aux composés cibles, en particulier dans les conditions d'hybridation décrites ci-dessus.
La séquence (ii) qui ne se lie pas aux composés cibles peut posséder des fonctions variées. En particulier, cette seconde séquence (ii) peut elle-même être composite.
Selon un aspect préféré, la séquence (ii) de l'acide nucléique appât qui ne se lie pas spécifiquement aux composés cibles consiste en une séquence de liaison, ou « linker », qui a pour fonction de séparer physiquement la séquence se liant aux composés cibles de la surface des microparticules ou des nanoparticules sur lesquelles est fixé l'acide nucléique appât, afin d'accroître l'accessibilité de la séquence nucléotidique appât pour les composés cibles.
Selon encore un autre aspect particulier, la séquence (ii) de l'acide nucléique appât qui ne se lie pas spécifiquement aux composés cibles peut être composite et comprendre, respectivement (ii-a) une séquence de liaison de type « linker » dont l'extrémité est liée à (ii-b) une séquence s'hybridant spécifiquement avec une séquence (ii) d'un acide nucléique appât distinct.
Selon encore un autre aspect, deux acides nucléiques appâts distincts contenus dans un dispositif de détection selon l'invention se lient spécifiquement avec deux parties distinctes du même composé cible. Par exemple, deux acides nucléiques appâts distincts comprennent des séquences (i-1 ) et (i-2) appâts complémentaires de deux séquences nucléotidiques distinctes, respectivement (Ci-1 ) et (Ci-2), contenues dans le même ADN ou ARN cible.
Selon encore un autre aspect, un acide nucléique appât comprend une séquence nucléotidique de type sonde d'hybridation grâce à laquelle on peut distinguer, dans les conditions d'hybridation appropriées, deux allèles d'une séquence d'ADN qui se différencient entre eux par la substitution d'une seule base nucléique. Deux allèles se différencient entre eux par la substitution d'une seule base nucléique du fait d'un polymorphisme appelé « polymorphisme simple nucléotidique » (ou SNP pour « Single Nucleotide Polymorphism »).
Pour l'application d'un dispositif de détection de l'invention à la détection de polymorphismes du type SNP, on utilise pour un site polymorphique déterminé, au moins un acide nucléique appât qui s'hybride avec le premier allèle dudit site SNP et qui ne s'hybride pas, dans des conditions d'hybridation identiques, avec le second allèle du site SNP. On peut aussi utiliser un acide nucléique appât qui s'hybride avec le second allèle du site SNP et qui ne s'hybride pas, dans des conditions d'hybridation identiques, avec le premier allèle du site SNP.
De préférence, un tel acide nucléique appât possède, à son extrémité 3', une base qui est complémentaire d'un seul des allèles du site SNP. Ainsi, le dispositif de détection selon l'invention peut être utilisé par la détection de polymorphismes de type SNP dans des acides nucléiques d'ADN génomique.
Dans d'autres modes de réalisation, un dispositif de détection de l'invention comprend, pour un acide nucléique cible donné, au moins deux types d'acides nucléiques appâts distincts, chacun des deux types d'acides nucléiques étant liés à des nanoparticules ou à des microparticules distinctes. Un premier acide nucléique appât s'hybride avec une première région spécifique comprise dans ledit acide nucléique cible. Un second acide nucléique appât s'hybride avec une seconde région spécifique comprise dans ledit acide nucléique cible, distincte de la première région spécifique dudit acide nucléique cible. En général, (i) le premier acide nucléique appât possède une séquence complémentaire à la première région spécifique de l'acide nucléique cible et (ii) le second acide nucléique appât possède une séquence complémentaire à la seconde région spécifique dudit acide nucléique cible. Selon ce mode de réalisation du dispositif de détection, l'acide nucléique cible, lorsqu'il est présent dans l'échantillon à tester, s'hybride à la fois (i) avec le premier acide nucléique appât qui est lié à certaines nanoparticules ou microparticules et (ii) avec le second acide nucléique appât qui est lié à certaines autres nanoparticules ou microparticules, ce qui génère des liaisons croisées ou « cross-links » entre le premier et le second type de nanoparticules ou microparticules.
Comme cela est montré dans les exemples, la création de liaisons croisées entre deux types de nanoparticules ou de microparticules, du fait de l'événement d'hybridation d'un acide nucléique cible présent dans l'échantillon à tester simultanément à deux acides nucléiques appât spécifiques de deux régions distinctes dudit acide nucléique cible, a pour effet de stabiliser sélectivement ces deux types de nanoparticules ou de microparticules sur le dispositif de détection selon l'invention. Cet événement de stabilisation sélective de deux types de nanoparticules ou de microparticules permet la mise en œuvre du dispositif de détection selon l'invention dans des procédés de détection possédant à la fois :
(i) une grande spécificité de détection, puisque la présence de l'acide nucléique cible n'est détectée qu'après la formation de complexes d'hybridation avec deux acides nucléiques appâts, et non un seul acide nucléique appât, et (ii) une grande sensibilité de détection, puisque la génération de complexes d'hybridation avec deux acides nucléiques appâts, c'est à dire la formation de complexes d'hybridation incluant une grande longueur polynucléotidique de l'acide nucléique cible, aboutit à la formation de complexes très stables et à la détection de quantité très faibles de l'acide nucléique cible susceptible d'être présent dans l'échantillon à tester, de l'ordre de 10 femtomoles, et dans certains cas de l'ordre de 1 femtomole par mm2 de détecteur.
Le mode de réalisation ci-dessus du dispositif de détection selon l'invention, du fait de sa grande spécificité et de sa grande sensibilité de détection, est parfaitement adapté à la détection de polymorphismes nucléotidiques, notamment à la détection de polymorphismes nucléotidiques du type SNP, comme cela est illustré dans les exemples.
Selon une alternative au mode de réalisation ci-dessus, le dispositif de détection selon l'invention comprend au moins : (i) un premier type de nanoparticules ou de microparticules auxquelles est lié un premier type d'acide nucléique s'hybridant à une première région d'un acide nucléique appât ; et
(ii) un second type de nanoparticules ou de microparticules auxquelles est lié un second type d'acide nucléique s'hybridant à une seconde région d'un acide nucléique appât ;
Pour la mise en œuvre d'un tel dispositif, un acide nucléique appât capable de s'hybrider aux deux types de nanoparticules ou de microparticules est pré-incubé dans l'échantillon à tester. Si l'échantillon à tester contient l'acide nucléique cible correspondant, l'acide nucléique appât s'hybride avec l'acide nucléique cible. Puis, lors du dépôt de l'échantillon pré-incubé avec l'acide nucléique appât sur le dispositif de détection, ledit acide nucléique appât ne s'hybride pas avec les acides nucléiques liés aux nanoparticules et aux microparticules, du fait que ledit acide nucléique appât est déjà hybride avec l'acide nucléique cible correspondant au sein de l'échantillon pré-incubé. Au contraire, si l'acide nucléique cible est absent de l'échantillon à tester, alors l'acide nucléique appât demeure sous une forme libre non hybridée lors de sa pré-incubation dans l'échantillon à tester. Puis, lors du dépôt de l'échantillon pré-incubé avec l'acide nucléique appât sur le dispositif de détection, ledit acide nucléique appât s'hybride avec respectivement les deux types de nanoparticules ou de microparticules en en les stabilisant sur le support de détection par création de liaisons croisées ou « crosslinks » entre les deux types de nanoparticules ou de microparticules. La stabilisation des deux types de nanoparticules ou de microparticules peut être détectée, par exemple du fait d'une non-désorption de ces nanoparticules ou de ces microparticules, ou encore du fait d'un accroissement de la température à laquelle ces nanoparticules ou ces microparticules désorbent du support.
Selon encore d'autres modes de réalisation proches du mode de réalisation décrit immédiatement ci-dessus, le dispositif de détection selon l'invention permet la détection de composés cibles capables de se lier sélectivement sur des acides nucléiques comprenant une séquence cible donnée, comme par exemple des types variés de protéines capables de se fixer spécifiquement sur certaines séquences nucléotidiques. Dans ces modes de réalisation, l'acide nucléique appât peut consister en un acide nucléique sélectionné par une technique du type SELEX ou en un acide nucléique reconnu par des protéines cellulaires telles que des facteurs de transcription. Selon ces autres modes de réalisation, un dispositif de détection selon l'invention comprend au moins :
(i) un premier type de nanoparticules ou de microparticules auxquelles un premier type d'acide nucléique comprenant une séquence s'hybridant à, par exemple complémentaire de, une première région d'un acide nucléique cible ;
(ii) un second type de nanoparticules ou de microparticules auxquelles un second type d'acide nucléique comprenant une séquence s'hybridant à, par exemple complémentaire de, une seconde région d'un acide nucléique cible, distincte de la première région dudit acide nucléique cible ;
(iii) un acide nucléique cible qui est hybride à la fois au premier type et au second type d'acide nucléique ci-dessus, ce qui crée des liaisons croisées ou « cross-links » entre le premier type et le second type de nanoparticules et de microparticules.
Lors de la mise en œuvre du mode de réalisation ci-dessus d'un dispositif de détection, l'événement de fixation du composé cible sur l'acide nucléique appât, par exemple la fixation d'un facteur de transcription présent dans l'échantillon à tester sur l'acide nucléique appât, stabilise sur le dispositif le complexe d'hybridation préformé entre l'acide nucléique appât et les deux types d'acides nucléiques liés aux deux types de nanoparticules ou de microparticules. Dans ce cas, la stabilisation du complexe d'hybridation préformé peut être détecté, du fait d'une modification des conditions de désorption des nanoparticules ou des microparticules, par exemple un accroissement de la valeur de la température à laquelle les nanoparticules ou les microparticules désorbent du support.
On peut aussi utiliser le mode de réalisation ci-dessus, dans lequel l'acide nucléique cible forme des liaisons croisées avec deux types de nanoparticules ou de microparticules, dans des procédés de détection d'altération de l'acide nucléique cible soumis à un traitement physique, chimique ou enzymatique. Par exemple, une mutation de l'acide nucléique cible, par exemple généré par une exposition à un rayonnement U.V., ou une coupure de l'acide nucléique cible, par exemple généré par l'action d'une endonucléase, réduit le nombre ou affaiblit les liaisons croisées entre les deux types de nanoparticules ou de microparticules, ce qui entraîne une réduction de la stabilité de ces nanoparticules ou de ces miroparticules sur le support, ce qui peut être détecté, par exemple par un décroissement de la valeur de la température à laquelle les nanoparticules ou les microparticules désorbent du support.
Dans tous les modes de réalisation du dispositif de détection qui sont décrits ci-dessus, qui comprennent au moins deux types de nanoparticules ou de microparticules, (i) le premier type d'acide nucléique spécifique d'une première séquence polynucléotidique d'un acide nucléique donné et (ii) le second type d'acide nucléique spécifique d'une seconde séquence polynucléotidique dudit acide nucléique donné, peuvent être liés directement à la surfaces desdites nanoparticules ou desdites microparticules. Alternativement, (i) le premier type d'acide nucléique et (ii) le second type d'acide nucléique sont liés de manière indirecte aux nanoparticules ou aux microparticules, par l'intermédiaire d'un acide nucléique de liaison. Dans ce mode de réalisation particulier d'un dispositif de détection conforme à l'invention, chacun des (i) premier type d'acide nucléique et (ii) second type d'acide nucléique comprend :
(a) une première séquence polynucléotidique capable de s'hybrider à, par exemple complémentaire de, une première région d'un acide nucléique donné, selon les cas une région d'un acide nucléique appât ou une région d'un acide nucléique cible ; et (b) une seconde séquence polynucléotidique capable de s'hybrider à, par exemple complémentaire de, l'acide nucléique de liaison qui est lié directement aux nanoparticules ou aux microparticules.
En général, la première séquence (a) est fusionnée directement avec la seconde séquence (b). Dans certains cas, la première séquence (a) est séparée de la seconde séquence (b) par un polynucléotide espaceur ayant une longueur allant de 2 à 100 nucléotides de longueur, de préférence de 2 à 30 nucléotides de longueur.
Dans ce mode de réalisation, les acides nucléiques de liaison qui sont liés directement aux nanoparticules ou aux microparticules peuvent aussi être appelés « tags ». Les « tags » sont capables de s'hybrider aux séquences (b) définies ci-dessus, lesdites séquences (b) pouvant aussi être appelées « tags complémentaires ».
Selon encore un autre mode de réalisation particulièrement adapté à la détection de polymorphismes nucléiques y compris de polymorphismes du type SNP, l'acide nucléique cible consiste en un acide nucléique résultant de la fusion entre deux acides nucléiques de départ sous l'action d'une ligase. Selon un tel mode de réalisation, on détecte un polymorphisme nucléotidique à une localisation prédéterminée d'une séquence d'intérêt de référence, par exemple un polymorphisme SNP à une position nucléotidique donné d'un polynucléotide génomique.
Selon cet autre mode de réalisation, l'échantillon à tester comprend au moins des molécules d'un acide nucléique comprenant un site de polymorphisme SNP pour lequel on cherche à déterminer l'identité du nucléotide polymorphe. Tout d'abord, on pré-incube l'échantillon à tester avec une paire d'amorces complémentaires de la région de l'acide nucléique à tester qui comprend le site SNP, respectivement :
(i) une première amorce comprenant, de l'extrémité 3' vers l'extrémité 5', (M ) une séquence complémentaire de la région de l'acide nucléique à tester, le nucléotide terminal du côté 3' de cette première amorce étant complémentaire du nucléotide définissant l'un des allèles possibles dudit site SNP et (i2) une première séquence « tag » complémentaire d'un premier acide nucléique appât lié à des nanoparticules ou des microparticules d'un dispositif de détection selon l'invention; et (ii) une seconde amorce comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', (ii1 ) une séquence complémentaire de la région de l'acide nucléique à tester, le nucléotide terminal du côté 5' de cette seconde amorce s'hybridant avec le nucléotide de l'acide nucléique à tester localisé immédiatement en 3' du nucléotide définissant ledit allèle du site SNP et (ii2) une seconde séquence « tag » complémentaire d'un second acide nucléique appât lié à des nanoparticules ou des microparticules d'un dispositif de détection selon l'invention.
Ainsi, une fois hybridées à l'acide nucléique à tester, la première et la seconde amorce ci-dessus, se succèdent immédiatement sur l'acide nucléique à tester sans être chimiquement liées l'une à l'autre par une liaison phosphodiester.
Si le nucléotide terminal en 3' de la première amorce (i) est complémentaire du nucléotide polymorphe correspondant localisé dans l'acide nucléique à tester, alors la première amorce (i) est totalement hybridée à l'acide nucléique à tester, et la première amorce (i) et la seconde amorce (ii) peuvent être fusionnées entre elles sous l'action d'une ligase pour générer un acide nucléique dont la longueur est égale à la somme des longueurs nucléotidiques des première (i) et seconde (ii) amorces ci- dessus. L'acide nucléique qui consiste en les amorces fusionnées est un acide nucléique cible capable de s'hybrider, par ses régions (i2) et (ii2), aux premier et second acides nucléiques appât du dispositif de détection avec lesquels il va créer des liaisons croisées ou « crosslinks ». Les liaisons croisées ainsi générées stabilisent les nanoparticules ou les microparticules correspondantes, ce qui peut ensuite être détecté par l'absence de désorption des nanoparticules ou des microparticules, dans des conditions appropriées.
Au contraire, si le nucléotide terminal en 3' de la première amorce (i) n'est pas complémentaire du nucléotide polymorphe correspondant localisé dans l'acide nucléique à tester, alors l'extrémité 3' de la première amorce (i) n'est pas hybridée à l'acide nucléique à tester et l'action d'une ligase ne génère pas la fusion entre la première amorce (i) et la seconde amorce (ii). Dans ce cas, le dépôt de l'échantillon sur le dispositif de détection ne provoquera pas de liaisons croisées ou « crosslinks » capables de stabiliser fortement les nanoparticules ou les microparticules. Cela peut être détecté par la détection de la désorption des nanoparticules ou des microparticules, dans des conditions désorption identiques aux conditions de désorption appropriées ci-dessus.
De manière avantageuse, dans ce mode de réalisation, on peut utiliser de manière physiquement séparée, mais éventuellement simultanément dans le temps, quatre types de première amorce (i) qui ne diffèrent que par l'identité du nucléotide localisé à leur extrémité 3'(A, T, G ou C), afin de détecter positivement dans tous les cas l'identité du nucléotide localisé au site SNP de l'acide nucléique de départ à tester.
De manière préférée, les acides nucléiques appâts sont liés de manière covalente à la surface des microparticules ou des nanoparticules.
A titre illustratif, comme cela est décrit dans les exemples, les acides nucléiques appâts peuvent être fonctionnalisés à leur extrémité 5' ou à leur extrémité 3' par des groupes alkylthio de formule (I) SH-(CH2)n-, dans laquelle n est un entier allant de 1 à 10, comme cela est décrit notamment dans la demande de brevet US N°2003/0059777 publiée le 27 Mars 2003 (Nanosphere Inc.). Selon ce mode de réalisation décrit dans les exemples, les acides nucléiques appâts, qui possèdent une fonction alkylthio à leur extrémité 5' ou à leur extrémité 3', sont incubés avec des nanoparticules d'or colloïdal avec lesquelles ces acides nucléiques réagissent, par création de liaisons covalentes avec la surface des nanoparticules. On peut par exemple utiliser les techniques décrites par Bain et Whitesides, (1989, Angew. Chem. Int. éd. Engl., vol.28 : 506-512) et Dubois et Nuzzo (1992, Annu. Rev. Phys. Chem., vol.43 : 437-464).
Dans un mode de réalisation particulier du dispositif de détection selon l'invention, les microparticules ou les nanoparticules contiennent une molécule détectable par colorimétrie ou fluorimétrie. A titre illustratif, les microparticules ou les nanoparticules peuvent contenir un pigment ou une combinaison de pigments, soit sur la surface extérieure sur laquelle sont liés les composés appâts, soit dans la totalité de la masse desdites microparticules ou nanoparticules.
Selon un autre mode de réalisation particulier du dispositif de détection de l'invention, la couche de phospholipides contient une molécule détectable par colorimétrie ou fluorimétrie, par exemple un pigment ou une combinaison de pigment. II n'existe pas véritablement de limites minimale ou maximale au nombre de microparticules ou nanoparticules qui sont comprises dans le dispositif de détection selon l'invention. Le nombre de microparticules ou de nanoparticules compris dans le dispositif de détection dépend à la fois (i) de la surface du support solide de base et (ii) de la densité de microparticules ou de nanoparticules par unité de surface dudit support solide de base. En général, le dispositif de détection comprend au moins 100 microparticules ou nanoparticules par cm2 de surface du support solide de base Lorsqu'on utilise des nanoparticules, par exemple des nanoparticules d'un diamètre de 15 nm, le dispositif de détection de l'invention peut comprendre jusqu'à au moins 5.1010 nanoparticules par cm2.
La valeur de surface du support solide de base, qui détermine aussi la surface totale du dispositif de détection, est variable. Notamment, la surface du dispositif de détection de l'invention peut varier de 0,1 μm2 à 10 cm2, selon les cas et selon le type de support solide utilisé. Selon un premier mode de réalisation, le support solide de base possède une surface plane, comme dans la plupart des supports de matrice d'oligonucléotides ou de protéines qui constituent les puces à ADN ou les puces à protéines. Dans ce mode de réalisation, la surface du support solide de base varie généralement de 1 à 10 cm2. Selon un autre mode de réalisation particulier, le support solide de base consiste en des microparticules dont la plus grande dimension varie de 500 nanomètres à 2 millimètres
Selon encore un autre mode de réalisation particulier, le support solide de base est de forme sphérique. Il peut être constitué de billes ayant une surface extérieure variant de 0,1 μm2 à 10 mm2.
De manière générale, un dispositif de détection tel que défini dans la présente description peut être inclus dans un ensemble comprenant une pluralité de dispositifs de détection conformes à l'invention, par exemple dans un ensemble de dispositifs de détection comprenant chacun des composés appâts distincts, notamment des composés appâts distincts spécifiques de composés cibles distincts. Un tel ensemble de dispositifs de détection selon l'invention est aussi désigné « système de détection », dans la présente description.
De manière générale, un dispositif de détection tel que défini dans la présente description, ou encore un système de détection comme défini ci- dessus, est mis en œuvre dans un procédé de détection conforme à l'invention, à savoir un procédé de détection de la fixation d'un composé cible sur un composé appât, qui comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon susceptible de contenir ledit composé cible avec un dispositif de détection, ou avec un système de détection selon l'invention, ledit dispositif ou ledit système comprenant au moins un composé appât se fixant sur ledit composé cible; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit composé cible et ledit composé appât.
Mode de réalisation du dispositif comprenant un support solide semi¬ conducteur
Comme déjà mentionné précédemment dans la description, le support solide du dispositif de l'invention peut comprendre une surface semi-conductrice en contact avec le revêtement. Alternativement, le support solide peut consister essentiellement ou intégralement en un matériau semi-conducteur en contact avec le revêtement.
Par exemple, le support solide peut consister en un support de silicium de type n ou de type p, qui possède au moins un contact ohmique localisé sur au moins l'une de ses surfaces. La surface opposée du support de silicium peut être recouverte par au moins un film de SiO2 d'une épaisseur allant de 10 à 500 angstrôms, mieux de 50 à 150 angstrôms, par exemple une épaisseur de 100 angstrôms.
Dans ce mode de réalisation spécifique, le revêtement est choisi préférentiellement parmi les revêtements électriquement isolants, comme certains polymères isolants ou encore les phospholipides, qui sont des revêtements précédemment indiqués dans la présente description.
Dans ce mode de réalisation, les macroparticules ou les microparticules sont préférentiellement recouvertes d'un matériau électriquement conducteur. Alternativement, les macroparticules ou les microparticules sont essentiellement ou intégralement constituées d'un matériau électriquement conducteur. Le matériau électriquement conducteur peut être choisi parmi les matériaux conducteurs d'électricité précédemment indiqués dans la présente description, tels les métaux électriquement conducteurs comme l'or.
En conditions d'utilisation, le dispositif de détection décrit ci-dessus est immergé dans un liquide électriquement conducteur, tel qu'une solution tampon, par exemple une solution d'un tampon phosphate à une concentration variant de 0,1 M à 1 M. La combinaison dispositif/milieu liquide électro-conducteur constitue un système de détection selon l'invention.
Pratiquement, on applique une tension entre le support semi¬ conducteur et le liquide électriquement conducteur. La (i) désorption des microparticules ou nanoparticules ou inversement (ii) le blocage de la désorption par formation de complexes entre les composés appâts immobilisés sur le dispositif et des composés cibles peuvent être détectées, de manière qualitative et/ou de manière quantitative, par une mesure des variations des signaux électriques provoquées par le formation desdits complexes.
Avec un tel dispositif, on peut détecter la désorption ou le blocage de la désorption des microparticules ou nanoparticules en mesurant les composantes de capacité et/ou de résistivité de l'impédance électrique du système pour une tension déterminée, puis en comparant ces composantes aux composantes d'une système de référence ou d'un système témoin qui comprend les composés appâts sous forme libre, c'est à dire non complexés avec des composés cibles. Avec un tel dispositif de l'invention, la désorption des microparticules ou nanoparticules est détectée par une variation de la valeur de capacitance ou par une variation de la valeur de résistance du système dispositif / milieu liquide conducteur, par rapport au système de référence ou au système témoin.
En utilisant un tel dispositif de l'invention, la désorption des microparticules ou nanoparticules est accompagnée par un effet de charge et, incidemment, par une variation du potentiel « flat-band » Vbp du semi- conducteur. Le potentiel « flat-band » Vbp est le potentiel qui doit être appliqué au système dispositif / milieu liquide conducteur pour que la valeur de courbure de la bande semi-conductrice soit nulle. Le potentiel « flat- band » Vbp peut être déterminé conformément à la courbe d'impédance de quadrature, par application de la relation bien connue de Mott-Schottky. Ce phénomène d'effet de charge a lieu à l'interface entre le milieu liquide électriquement conducteur et la surface électro-conductrice des macroparticules ou des microparticules du dispositif de l'invention.
Pour mettre en œuvre un procédé de détection de composés cibles avec un tel système dispositif / milieu électro-conducteur, lorsque l'on veut réaliser une mesure potentiostatique, on utilise de préférence au moins trois électrodes, respectivement (1 ) au moins une électrode de travail qui est le dispositif de l'invention lui-même, (2) au moins une électrode de référence qui constitue le système de référence, par exemple une électrode du type Ag/AgCI, et (3) au moins une contre-électrode. Avec un tel système de détection, on mesure les valeurs d'impédance, ce qui permet de construire la courbe d'impédance de phase (Zp) et la courbe d'impédance de quadrature (Zq), en fonction de la tension (V).
Le déplacement des courbes d'impédance dans une direction parallèle à l'axe des potentiels, qui est provoqué par la désorption de la combinaison revêtement/microparticules ou nanoparticules, correspond aux variations du potentiel des bandes plates (« flat bands ») au sein de la structure composite du dispositif de l'invention.
Le dispositif de détection, dans toutes ses variantes définies ci- dessus, est destiné à être mis en œuvre dans un procédé pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât compris dans ledit dispositif de détection, comme détaillé ci-dessous.
Mode de réalisation du dispositif sous la forme de microoarticules
Comme déjà mentionné précédemment dans la présente description, dans un mode de réalisation particulier d'un dispositif de détection conforme à l'invention, ledit dispositif se présente sous la forme d'une microparticule. Dans ce mode de réalisation, le support solide de base consiste en des microparticules dont la surface externe ou la totalité de la masse consiste en l'un des divers matériaux pour le support solide qui sont indiqués dans la présente description.
Conformément à la définition générale d'un dispositif de détection selon l'invention, la surface externe des microparticules de support solide est recouverte d'un revêtement, lié de manière non covalente à la surface du support solide.
Une pluralité de nanoparticules sur lesquelles est fixé au moins un composé appât sont liées au revêtement, le revêtement étant lui-même appliqué à la surface des microparticules de support solide. Avantageusement, les microparticules de support solide sont caractérisées en ce que leur plus grande dimension varie de 500 nanomètres à 2 millimètres, préférentiellement de 1 μm à 1000 μm et de manière tout à fait préférée de 1 μm à 500 μm. On peut utiliser notamment des microparticules de support solide dont la plus grande dimension varie de 5 μm à 200 μm.
Les microparticules de support solide peuvent avoir des formes géométriques variées. En particulier, les microparticules de support solide peuvent être de forme cubique, parallélépipédique ou encore ovoïde ou sphérique.
Les microparticules de support solide peuvent avoir des couleurs variées, afin d'absorber, selon le type de microparticule, des longueurs d'onde distinctes du spectre lumineux. Les microparticules peuvent être teintées dans la masse, par exemple dans le cas d'un support solide en verre ou en polymère. Alternativement, les microparticules de support solide peuvent être teintées uniquement sur leur surface, par exemple dans le cas d'un support solide en métal.
Les microparticules de support solide peuvent aussi être fluorescentes. Selon l'invention, on peut utiliser toute microparticule fluorescente couramment retrouvée dans le commerce. Notamment, on peut utiliser les microparticules fluorescentes d'un diamètre de 10 μm ou d'un diamètre de 15 μm commercialisées par la Société Molecular Probes sous la marque FluoroSpheres®. Avantageusement, on peut utiliser les microparticules fluorescentes FluoroSpheres® suivantes, caractérisées par leur longueur d'onde d'absorption maximale et leur longueur d'onde d'émission maximale (Abs/Em), lorsqu'elles sont en suspension dans de l'eau : « Blue » (365/415) ; « Blue-green » (430/465), « Green » (450/480), « Yellow-green » (505/515), « Yellow » (515/534), « Orange » (540/560), « Red-orange » (565/580), « Red » (580/605), « Carminé » (580/620), « Crimson » (625/645) and « Scarlet » (645/680).
Alternativement, un dispositif de détection de l'invention, sous forme de microparticules, peut avoir des couleurs variées, ou posséder des propriétés de fluorescence, par inclusion d'un pigment ou d'une combinaison de pigments, ou encore d'un fluorochrome ou d'une combinaison de fluorochromes, dans le revêtement lié à la surface du support solide. Par exemple, lorsque le revêtement consiste en une couche de phospholipides, on peut ajouter le ou les pigment(s) ou encore le ou les fluorochrome(s) aux phopholipides de départ, préalablement à l'application du revêtement de phospholipides sur le support solide. Par exemple, on peut utiliser des molécules marquées, colorées ou fluorescentes, qui ont une affinité pour les phospholipides, tels que des acides gras marqués ou du cholestérol marqué, colorés ou fluorescents. On peut aussi utiliser des phospholipides marqués par des pigments ou des fluorochromes
Dans l'alternative selon laquelle le revêtement, par exemple la couche de phospholipides, comprend des molécules fluorescentes, ledit revêtement peut comprendre une combinaison de deux fluorochromes, le premier fluorochrome ayant une longueur d'onde d'émission maximale identique à, ou différant au maximum de 5 nanomètres par rapport à, la longueur d'onde d'absorption maximale du second fluorochrome. Dans un tel mode de réalisation, on peut distinguer facilement entre deux dispositifs microparticulaires de détection de l'invention, dont les revêtements respectifs comprennent la même combinaison spécifique de deux fluorochromes, mais pour lesquels les deux fluorochromes sont présents dans des proportions distinctes. Comme phospholipides fluorescents, on peut utiliser les phopholipides fluorescents commercialisés par la Société Molecular Probes (Orégon, Etats-Unis), tels que notamment les phospholipides suivants : 2- (5-butyl-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacene-3-nonanoyl)-1- hexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (-C4-BODIPY® 500/510 C9- HPC), 2-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3- dodecanoyl) -1-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (-BODIPY® FL C12-HPC), sel de diammonium de 2-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-pentanoyl)-1-hexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphate (-BODIPY® FL C5-HPA), 2-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a, 4a-diaza- s-indacene-3-pentanoyl)-1-hexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (- BODIPY® FL C5-HPC), sel de triethylammonium de N-(4,4-difluoro-5,7- dimethyl-4- bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionyl)-1 ,2-dihexadecanoyl- sn- glycero-3-phosphoethanolamine (BODIPY® FL DHPE), sel de triethylammonium de N-(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4- bora-3a,4a-diaza-s- indacene-3- propionyl)-1 ,2-dihexanoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine (BODIPY® FL dicaproyl PE), 2-(4,4-difluoro-5,7-diphenyl-4-bora-3a, 4a-diaza-s- indacene-3-pentanoyl)-1 -hexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (- BODIPY® 530/550 C5-HPC), sel de triethylammonium de N-(4,4-difluoro- 5,7-diphenyl-4- bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionyl)-1 ,2- dihexadecanoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine (BODIPY® 530/550 DHPE), 2-(4,4-difluoro-5-methyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacene-3- dodecanoyl)-1 -hexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (-BODIPY® 500/510 C12-HPC), 2-(4,4-difluoro-5-octyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacene- 3-pentanoyl)-1-hexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (-C8-BODIPY® 500/510 C5-HPC), 2-(4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1 ,3- butadienyl)-4-bora- 3a,4a-diaza-s-indacene-3-pentanoyl)-1-hexadecanoyl- sn-glycero-3- phosphocholine (-BODIPY®581/591 C5-HPC), sel de triethylammonium de N-(5-dimethylaminonaphthalene-1 - sulfonyl)-1 ,2-dihexadecanoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine (dansyl DHPE), 2-(3-
(diphenylhexatrienyl)propanoyl)-1 - hexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (-DPH HPC), sel de triethylammonium de N-(DMNB-caged fluorescein)-1 ,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, sel de triethylammonium de N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)- 1 ,2-dihexadecanoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine (fluorescein DHPE), 1 -hexadecanoyl-2- (3-perylenedodecanoyl)- sn-glycero-3-phosphocholine1-hexadecanoyl-2-(1- pyrenehexanoyl)- sn-glycero-3-phosphocholine(-py-C6-HPC), sel de triethylammonium de LissamineT rhodamine B 1 ,2-dihexadecanoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine (rhodamine DHPE), sel de triethylammonium de N-((4-maleimidylmethyl) cyclohexane-1-carbonyl)-1 ,2- dihexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (MMCC DHPE), Marina Blue® 1 ,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (MarinaBlue® DHPE), sel de triethylammonium de N-(7-nitrobenz-2-oxa- 1 ,3-diazol- 4-yl)-1 ,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (NBD-PE), Oregon Green® 488 1 ,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (Oregon Green® 488 DHPE), sel de triethylammaonium de Pacific BlueT 1 ,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (Pacific BlueT DMPE), sel de triethylammonium de N-(1 -pyrenesulfonyl)-1 ,2- dihexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (pyS DHPE), N-((2-pyridyldithio)propionyl)-1 , sel de triethylammonium de 2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PDP DHPE), sel de triethylammonium de Rhodamine RedT-X 1 ,2- dihexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (Rhodamine RedT-X DHPE), sel de triethylammonium de N-(6- tetramethylrhodaminethiocarbamoyl)-1 ,2- dihexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (TRITC DHPE), sel de triethylammonium de Texas Red® 1 ,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (Texas Red® DHPE), et sel de triethylammonium de Texas Red®-X 1 ,2- dihexadecanoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine (Texas Red®-X DHPE).
Comme acides gras fluorescents, on peut utiliser les acides gras fluorescents commercialisés par la Société Molecular Probes (Orégon, Etats-Unis), tels que notamment les acides gras fluorescents suivants : acide 5-butyl-4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza- s-indacene-3-nonanoïque (BODIPY®500/510 C4, C9), acide 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacene-3-dodecanoïque (BODIPY® FL C12), acide 4,4-difluoro- 5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-hexadecanoïque (BODIPY® FL C16), acide 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacene-3- pentanoïque (BODIPY® FL C5), acide 4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora- 3a,4a-diaza-s-indacene-3-undecanoïque (BODIPY® FL C11 ), acide 4,4- difluoro-5,7-diphenyl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacene-3-dodecanoïque (BODIPY® 530/550 C12), acide 4,4-difluoro-5-methyl-4-bora-3a,4a-diaza-s- indacene-3-dodecanoïque (BODIPY® 500/510 C1 , C12), acide 4,4-difluoro- 5-octyl-4-bora-3a,4a-diaza- s-indacene-3-pentanoïque (BODIPY® 500/510 C8, C5) acide 4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1 ,3-butadienyl) -4-bora-3a,4a-diaza- s-indacene-3-pentanoïque (BODIPY® 581/591 C5), acide 4,4-difluoro-5-(2- pyrrolyl)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene-3-undecanoïque (BODIPY® 576/589 C11 ), acide 4,4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a,4a- diaza-s-indacene-3- pentanoïque (BODIPY® 564/570 C5), acide 4,4-difluoro-5-styryl-4-bora- 3a,4a- diaza-s-indacene-3-undecanoïque (BODIPY® 564/570 C11 ), acide 4,4-difluoro-1 ,3,5,7-tetramethyl-4-bora- 3a,4a-diaza-s-indacene-8- nonanoïque (BODIPY® 493/503 C9), acide 4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora- 3a,4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoïque (BODIPY® 558/568 C12), acide 12-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3- diazol-4-yl)amino)dodecanoïque, acide 6-(N- (7-nitrobenz-2-oxa-1 ,3- diazol-4-yl)amino)hexanoïque (NBD-X), acide 13- perylenedodecanoïque, acide 1-pyrenebutanoïque, acide 1- pyrenedodecanoïque, acide 1-pyrenehexadecanoïque, et acide 1- pyrenehexanoïque.
Avantageusement, les nanoparticules sur lesquelles sont fixés les composés appâts sont caractérisées en ce que leur plus grande dimension varie de 3 à 100 nanomètres, préférentiellement de 3 à 50 nanomètres. On peut utiliser notamment des nanoparticules dont la plus grande dimension varie de 10 à 20 nanomètres, par exemple des nanoparticules de 15 nanomètres. Compte tenu de la description qui précède, la forme finale du dispositif de détection consiste en une microparticule sur laquelle sont exposés des composés appâts.
Préférentiellement, dans ce mode de réalisation, chaque dispositif de détection, sous forme finale d'une microparticule à la surface de laquelle sont exposés les composés appâts, comprend un seul type de composé appât par dispositif ou microparticule. Par exemple, lorsque le composé appât consiste en un acide nucléique appât, le dispositif de détection microparticulaire de l'invention comprend, fixées sur celui-ci, une pluralité de molécules d'un acide nucléique unique. Alternativement, chaque dispositif de détection microparticulaire tel que défini ci-dessus comprend plus d'un type de composé appât, à condition que les types distincts de composés appâts se fixent spécifiquement sur un composé cible unique. Par exemple, lorsque le composé appât consiste en un acide nucléique appât, le dispositif microparticulaire de l'invention comprend, fixées sur celui-ci, (i) une pluralité de molécules d'un acide nucléique [1] appât spécifique d'un composé cible déterminé, (ii) une pluralité de molécules d'un acide nucléique [2] appât, distinct de l'acide nucléique [1], également spécifique dudit même composé cible déterminé, ..., et (i + n-1 ) une pluralité de molécules d'un acide nucléique [n] appât, distinct de chacun des acides nucléiques [i] à [i+n-1], spécifique dudit même composé cible déterminé. Par exemple, les acides nucléiques appâts [i] à [n] distincts s'hybrident spécifiquement à des séquences nucléotidiques distinctes comprises dans un unique acide nucléique cible déterminé. Conformément à ce mode de réalisation de l'invention, dans lequel le support solide consiste en des microparticules, le procédé de détection consiste en la mise en œuvre d'un « système de détection », ledit système de détection comprenant une pluralité de dispositifs de détection distincts conformes à l'invention, c'est à dire une pluralité de dispositifs microparticulaires distincts tels que définis ci-dessus. On comprend que chaque dispositif de détection microparticulaire est capable de fixer spécifiquement un composé cible donné.
Un système de détection tel que défini ci-dessus, du fait qu'il comprend une pluralité de dispositifs de détection microparticulaires selon l'invention, est adapté à la détection d'une pluralité de composés cibles distincts.
Préférentiellement, dans un tel système de détection, chaque dispositif de détection spécifique d'un composé cible déterminé, ou d'un domaine ou d'une séquence dudit composé cible déterminé, peut être distingué des autres dispositifs de détection spécifiques d'un composé cible distinct, ou d'un domaine ou d'une séquence distincte du même composé cible.
Selon un premier aspect, les différents dispositifs microparticulaires, compris dans un système de détection selon l'invention peuvent être distingués, l'un par rapport à chacun des autres, par leur forme ou encore par leur taille, c'est à dire essentiellement par la forme ou par la taille du support solide de base utilisé.
Selon un second aspect, les différents dispositifs microparticulaires, compris dans un système de détection selon l'invention, peuvent être distingués, l'un par rapport à chacun des autres, par leur couleur ou encore par leurs caractéristiques de fluorescence, par exemple la longueur d'onde spécifique d'émission d'un signal lumineux, c'est à dire essentiellement par la couleur ou par les caractéristiques de fluorescence du support solide de base utilisé.
Dans une première illustration préférée d'un système de détection de l'invention comprenant une pluralité de dispositifs de détection microparticulaires, les microparticules spécifiques de composés cibles distincts, ou de domaines ou de séquences distincts d'un composé cible déterminé, se distinguent, l'un par rapport à chacun des autres, par leur taille de microparticule. Par exemple, un premier dispositif de détection microparticulaire spécifique d'un premier composé cible comprend une microparticule de support solide sphérique ayant un diamètre variant de 10 à 30 μm. Un second dispositif de détection microparticulaire spécifique d'un second composé cible comprend une microparticule de support solide sphérique ayant un diamètre variant de 50 à 100 μm.
Dans un procédé de détection conforme à l'invention qui utilise un tel système de détection, la formation de complexes entre les composés appâts et le composé cible, sur un premier type de dispositif microparticulaire de détection bloque la désorption du revêtement sur lequel sont fixées les nanoparticules comprenant les composés appâts. Dans le même temps, pour un second type de dispositif microparticulaire de détection, il y a une désorption du revêtement sur lequel sont fixés les composés appâts non spécifiques dudit composé cible, en raison de l'absence de formation de complexes avec ledit composé cible. Lorsque les nanoparticules sur lesquelles sont fixés les composés appâts sont colorées, comme c'est le cas par exemple pour des nanoparticules d'or, la désorption des nanoparticules provoque un changement de la couleur du dispositif microparticulaire de détection. Ainsi, dans ce mode de réalisation d'un système de détection, on détermine, à l'étape b) du procédé de détection de l'invention :
(i) d'une part, les dispositifs microparticulaires de détection qui ont fixé le composé cible, par détection, par exemple colorimétrique, des dispositifs microparticulaires pour lesquels la désorption des nanoparticules est bloquée ; et
(ii) l'identité du composé appât compris dans les dispositifs microparticulaires qui ont fixé le composé cible, par exemple par détermination de la taille de ces dispositifs microparticulaires, car l'on connaît à l'avance la taille spécifique d'un dispositif microparticulaire sur lequel on a préalablement fixé un composé appât déterminé.
Dans la majorité des cas, la connaissance de l'identité du composé appât impliqué dans un complexe avec un composé cible permet d'identifier directement ledit composé cible, du fait de la spécificité de reconnaissance d'un composé cible déterminé par ledit composé appât, notamment lorsque le composé appât consiste en un acide nucléique ou encore un anticorps ou un fragment d'anticorps.
Un système de détection tel que défini ci-dessus est illustré à l'exemple 8. Dans l'exemple 8, les dispositifs microparticulaires de détection comprennent des microparticules de support solide en verre, sur lesquelles est adsorbée un revêtement consistant en une couche de phospholipides. Sur la couche de phospholipides sont fixées des nanoparticules d'or liées de manière covalente à des acides nucléiques appâts. Dans le système de détection décrit à l'exemple 8, un premier dispositif microparticulaire de détection comprenant des molécules d'un premier acide nucléique appât se distingue d'un second dispositif microparticulaire de détection comprenant des molécules d'un second acide nucléique par la taille de la microparticule du support solide de base. Lors de l'utilisation d'un tel système de détection, les dispositifs microparticulaires ayant fixé le composé cible sont détectés par la couleur rouge spécifique des nanoparticules d'or, qui n'ont pas été désorbées du support solide. L'identité de l'acide nucléique appât qui a formé des complexes avec l'acide nucléique cible est déterminée par cytométrie ou microscopie, en mesurant la taille des dispositifs microparticulaires ayant fixé l'acide nucléique cible. Selon une autre illustration de l'utilisation d'un système de détection conforme à l'invention, dans un procédé de détection, la détermination (i) des dispositifs microparticulaires ayant fixé le composé cible et (ii) de l'identité du composé appât ayant formé des complexes avec ledit composé cible peut être réalisée simultanément, avec la même technique ou le même moyen de mesure.
Par exemple, on utilise des dispositifs microparticulaires de spécificité distincte qui se distinguent, l'un par rapport à chacun des autres, par la longueur d'onde du signal de fluorescence émis après excitation à une longueur d'onde unique donnée. De plus, on utilise des nanoparticules sur lesquelles sont fixés les composés appâts qui ont la propriété d'absorber la lumière, à la longueur d'onde unique d'excitation ci-dessus.
Lorsqu'on utilise le système de détection défini ci-dessus, dans un procédé de détection conforme à l'invention, l'étape b) de détection est réalisée en illuminant ledit système de détection à la longueur d'onde unique d'excitation, puis en analysant le spectre d'émission lumineuse résultant. Dans ce mode de réalisation, les dispositifs microparticulaires de détection ayant fixé le composé appât sont détectés car ils absorbent la lumière, à la longueur d'onde unique d'excitation. De plus, l'identité du composé appât ayant fixé le composé cible est déterminé par analyse spectrale de la longueur d'onde du signal de fluorescence émis par l'ensemble des dispositifs microparticulaires contenus dans le système de détection et détermination de la bande de longueur d'onde manquante. La bande de longueur d'onde manquante correspond à la longueur d'onde d'émission du fluorochrome inclus dans le dispositif de détection qui a fixé le composé cible, pour lequel la lumière, à la longueur d'onde d'émission est absorbée par les nanoparticules comprenant les composés appâts, qui n'ont pas été désorbées du support solide.
Un tel système de détection de l'invention est illustré par l'utilisation de dispositifs microparticulaires de détection comprenant des microparticules de support solide fluorescentes, lesquelles se distinguent les unes par rapport aux autres par la longueur d'onde du signal de fluorescence émis après excitation à une longueur d'onde d'excitation inférieure à 550 nanomètres. Dans ces dispositifs microparticulaires de détection, les composés appâts sont fixés sur des nanoparticules d'or, qui absorbent la lumière aux longueurs d'onde d'excitation inférieures à 550 nanomètres.
Par exemple, on peut utiliser des microparticules de support solide dont le matériau de base comprend un composé fluorochrome ayant une longueur d'onde d'excitation de 488 nanomètres. Le composé fluorochrome ayant une longueur d'onde d'excitation de
488 nanomètres peut être choisi parmi les composés fluorochrome suivants : FITC (émission 525nm), Alexa fluor 488 (émission 525nm), PE (émission 575nm), PE-texas red (émission 613nm), PE- Cy 5 , PerCP- Cy5.5 (émission 695nm), PE-Cy7 (émission 760nm). Ainsi, à l'étape b) d'un procédé de détection conforme à l'invention, on illumine l'ensemble du système de détection avec une source lumineuse à la longueur d'onde de 488 nanomètres, puis on détermine, l'identité du composé appât qui a formé des complexes avec le composé cible, par détermination de la bande de longueur d'onde d'émission du signal fluorescent desdits dispositifs de détection qui n'apparaît plus dans le spectre d'émission, du fait de l'absorption de la lumière d'excitation à 488 nanomètres et de la lumière émise par lesdits dispositifs de détection.
Le mode de réalisation d'un système de détection comprenant une pluralité de dispositifs microparticulaires de détection selon l'invention présentent de nombreux avantages, par rapport aux systèmes de détection connus.
Notamment, l'identification des composés appâts ayant fixé le composé cible peut être réalisée par simple mesure d'au moins une propriété physique de la pluralité des dispositifs mircoparticulaires de détection compris dans le système de détection, cette mesure pouvant être réalisée rapidement et aisément à l'aide d'un cytomètre ou encore d'un microscope, par exemple un microscope à fluorescence.
Dans la seconde illustration ci-dessus d'un système de détection de l'invention comprenant une pluralité de dispositifs microparticulaires de détection, l'identification des composés appâts ayant fixé le ou les composé(s) cible(s) contenu(s) dans l'échantillon à tester peut être très rapide, puisque la mesure des bandes d'émission du spectre lumineux peut être réalisé instantanément et simultanément pour la totalité des dispositifs microparticulaires de détection compris dans le système, par exemple à l'aide d'un spectromètre de fluorescence. Une telle mesure du spectre d'émission ne nécessite même pas la mise en œuvre d'un dispositif du type cytomètre, qui impose le passage successif de tous les dispositifs microparticulaires de détection devant un ou plusieurs détecteurs. De plus, la mesure du spectre d'émission est très sensible et ne nécessite pas d'appareillage complexe.
Lorsque les dispositifs microparticulaires de détection compris dans un système de détection de l'invention comprennent chacun une combinaison d'au moins deux fluorochromes, dans une proportion spécifique donnée, le procédé de détection de l'invention peut être réalisé avec un dispositif cytomètre de flux, ce qui permet de détecter à la fois (i) la diffusion de la lumière, pour différencier les dispositifs microparticulaires de détection par la taille de particule, (ii) la proportion de chaque fluorochrome, pour différencier les dispositifs microparticulaires de détection par les pics de fluorescence, et/ou (iii) l'intensité de fluorescence et/ou la diffusion de la lumière pour la détection de la présence ou non des nanoparticules comprenant les composés appâts, pour détecter la fixation ou non du ou des composé(s) cible(s).
Procédé de détection selon l'invention L'invention a également pour objet un procédé pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon susceptible de contenir ledit composé cible avec un dispositif de détection tel que défini ci-dessus, ledit dispositif comprenant au moins un composé appât se fixant sur ledit composé cible ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit composé cible et ledit composé appât.
Comme déjà détaillé précédemment dans la présente description, on a montré selon l'invention que, de manière surprenante, on provoque la désorption des microparticules ou nanoparticules à partir lorsqu'on modifie les conditions d'environnement auxquelles est soumis le dispositif de détection, en l'absence de formation de complexes entre les composés appâts et les composés cibles susceptibles d'être contenus dans l'échantillon à tester. En revanche, on a montré que la désorption était bloquée par la formation de complexes entre les composés appâts et les composés cibles.
Ainsi, le procédé de détection ci-dessus est aussi caractérisé en ce que l'étape b) comprend les sous-étapes suivantes : b1 ) on soumet le dispositif à des conditions d'environnement dans lesquelles les microparticules ou les nanoparticules sont désorbés de la surface du support solide, en l'absence de formation de complexes entre le (s) composé (s) appât(s) et le (s) composé(s) cible (s) ; b2) on détecte la désorption des microparticules ou des nanoparticules à partir de la surface du support solide.
Préférentiel lement, à l'étape b) du procédé de détection, on soumet le dispositif à des conditions d'environnement dans lesquelles les interactions entre la couche et le support, notamment celles électrostatiques, sont affaiblies voire inversées et/ou les interactions entre la couche et les nanoparticules, notamment celles électrostatiques, sont renforcées.
Dans certains modes de réalisation de l'étape b) ou b1 ) du procédé ci-dessus, on soumet le dispositif à des conditions d'environnement dans lesquelles les microparticules ou les nanoparticules sont désorbés de la surface du support solide, en l'absence de formation de complexes entre le(s) composé(s) appât(s) et le(s) composé(s) cible(s), en incubant ou en immergeant le dispositif de détection dans une solution à forte concentration de chlorure ou de bromure. Dans certains autres modes de réalisation de l'étape b) ou b1 ) du procédé ci-dessus, on soumet le dispositif à des conditions d'environnement dans lesquelles les microparticules ou les nanoparticules sont désorbés de la surface du support solide, en l'absence de formation de complexes entre le (s) composé (s) appât(s) et le (s) composé(s) cible (s), en ajoutant des macromolécules possédant une charge de même polarité que la charge des nanoparticules ou des microparticules. Ainsi, lorsque le dispositif de détection comprend des nanoparticules ou des microparticules de charge nette positive en solution à pH neutre, on utilise à l'étape b) ou b1 ) des macromolécules qui possèdent aussi une charge nette positive dans les mêmes conditions d'environnement. A l'inverse, lorsque le dispositif de détection comprend des nanoparticules ou des microparticules de charge nette négative en solution à pH neutre, on utilise à l'étape b) ou b1 ) des macromolécules qui possèdent aussi une charge nette négative dans les mêmes conditions d'environnement. Comme macromolécules possédant une charge nette négative en solution en pH neutre, on peut utiliser notamment le sulfate de dextran.
Selon ces autres modes de réalisation de l'étape b) ou b1 ) du procédé, les macromolécules chargées qui sont ajoutées provoquent la désorption des nanoparticules ou des microparticules qui n'ont pas été stabilisées sur le support du fait de la liaison de composés cibles sur les composés appâts.
La concentration finale des macromolécules qui est ajoutée à l'étape b) ou b1 ) du procédé peut être aisément adaptée par l'homme du métier, selon le type de macromolécule ajoutée et selon la force de l'effet de déplacement qui est recherchée. Par exemple, si la fixation du composé cible sur le composé appât ne provoque pas la création de liaisons croisées ou « crosslinks » entre deux types de nanoparticules ou de microparticules du dispositif, la fixation du composé cible provoquera une stabilisation des nanoparticules ou des microparticules, mais cette stabilisation est moins grande que lorsque des liaisons croisées sont créées. Dans ce cas, on utilise, à l'étape b) ou b1 ) du procédé, une concentration finale plus faible de macromolécules pour désorber les nanoparticules ou les microparticules qui n'ont pas fixé de composé cible que lorsque la fixation du composé cible provoque la création de liaisons croisées.
Par exemple, pour détecter la stabilisation des nanoparticules ou des microparticules ayant fixé le composé cibles, lorsqu'il y a création de liaisons croisées entre deux types de nanoparticules ou de microparticules, on utilise couramment une concentration finale de sulfate de dextran d'au moins 0,1 pour cent en poids par rapport au volume total de la solution finale dans laquelle est immergé le dispositif de détection selon l'invention.
On utilise en général une concentration finale de sulfate de dextran allant de 0,1 % à 5 % en poids par rapport au volume total de la solution finale. A titre illustratif, une concentration finale de sulfate de dextran de 0,5 % en poids par rapport au volume total de la solution finale se révèle adaptée dans la plupart des cas.
Différentes mises en œuvre du procédé de détection selon l'invention sont illustrées dans les exemples.
Les exemples 3 à 6 illustrent diverses mises en œuvre du procédé de détection selon l'invention appliquées avec un dispositif de détection comprenant les acides nucléiques appâts.
Dans un mode de réalisation particulier de l'étape b1 ), le dispositif de détection est incubé ou immergé dans une solution de NaCI ayant une concentration finale d'au moins 0,5 M, de préférence une concentration finale allant de 0,5 M à 2 M, la concentration finale étant de manière tout à fait préférée de 1 M.
Selon un autre mode de réalisation préféré du procédé, à l'étape b1 ), on incube ou on immerge le dispositif de détection dans une solution de KCI ayant une concentration finale d'au moins 0,2 M, de préférence une concentration finale allant de 0,2 M à 1 M, la concentration finale étant de manière tout à fait préférée de 0,4 M .
Les exemples 9 et 10 illustrent diverses mises en œuvre du procédé de détection selon l'invention dans lesquelles l'étape b) ou b1 ) du procédé est réalisée avec, comme macromlécules chargées, des macromolécules de sulfate de dextran.
Selon un premier mode de réalisation particulier de l'étape b2) du procédé de détection de l'invention, la désorption des microparticules ou nanoparticules est détectée par un changement de couleur de la surface du dispositif.
Par exemple, lorsqu'on utilise des macroparticules ou des nanoparticules à base d'or, la surface du dispositif possède une coloration rouge. L'événement de désorption des microparticules ou des nanoparticules de la surface du dispositif provoque simultanément une décoloration de la surface du dispositif et une coloration de la solution dans lequel le dispositif est immergé ou incubé. Ce changement de couleur peut être observé simplement à l'œil nu. Toutefois, ce changement de couleur peut être mesuré par des dispositifs d'imagerie et/ou de mesure de la colorimétrie couramment commercialisés. Un changement de couleur du dispositif peut également être obtenu avec des types variés de microparticules ou de nanoparticules, par exemple en utilisant des microparticules ou des nanoparticules dont au moins la surface extérieure comprend un pigment ou des combinaisons de pigment ou encore des microparticules ou des nanoparticules teintées avec des pigments directement dans leur masse.
Egalement, un changement de couleur est observé, au moment de l'événement de désorption, lorsque la couche de phospholipides comprend elle-même un pigment ou une combinaison de pigments.
Dans tous les cas, la désorption des microparticules ou des nanoparticules à partir de la surface du dispositif de détection provoque des modifications des propriétés physico-chimiques du dispositif de détection, autres que le simple changement de couleur.
En effet, l'événement de désorption des microparticules ou des nanoparticules à partir de la surface du support solide provoque des changements importants de la charge pondérale dudit support solide et entraîne d'importantes modifications de la plupart des propriétés physico¬ chimiques du dispositif, telle que son impédance électrique ou sa conductivité électriques, son potentiel Zêta, ses propriétés optiques ou encore sa capacité à transmettre une onde sonore ou électromagnétique. Ainsi, selon un autre mode de réalisation particulier du procédé de détection de l'invention, à l'étape b2), on détecte la désorption des microparticules ou des nanoparticules par une modification de la valeur d'une onde acoustique traversant le support solide du dispositif.
Par exemple, à l'étape b2), la modification de la valeur d'une onde acoustique peut consister en une modification de la fréquence de ladite onde acoustique, par exemple comme mesurée selon la technique QCM-D.
La technique QCM-D (pour « Quartz Crystal Microbalance with
Dissipation Monitoring ») est une technique qui permet de mesurer, en temps réel, l'adsorption et la désorption de molécules sur des surfaces solides, ou encore l'interaction entre molécules sur des surfaces solides. Elle est décrite notamment par Richter et al. (2003, Biophysical Journal, vol.85 : 3035-3047). Elle peut être mise en œuvre avec un dispositif Q- Sense D300 commercialisé par la Société Q-Sense AB (Gothenburg, Suède). Plus précisément, selon la technique QCM-D, l'adsorption ou la désorption d'analytes sur un crystal de quartz revêtu d'une couche de silice est mesurée en t temps réel, en enregistrant simultanément les modifications dans la fréquence de résonance, « ΔF », et dans la dissipation « ΔD », qui sont reliées à la masse adsorbée ainsi qu'aux pertes de friction de la couche adsorbée, respectivement. La désorption des microparticules ou nanoparticules de la surface du support solide peut être aussi mesurée, à l'étape b2) du procédé, selon une technique classique de résonance de surface du plasma (SPR ou « surface plasmon résonance »), bien connue de l'homme du métier.
La désorption des microparticules ou nanoparticules de la surface du support solide peut être aussi mesurée, à l'étape b2) du procédé, par mesure des variations de la capacitance ou de la résistance électrique du dispositif, plus spécifiquement lorsque le dispositif consiste en un dispositif avec support solide semi-conducteur tel que décrit ci-dessus. Ces mesures de variations électrique sont décrites en détail notamment par Souteyrand at al. (1997, J. Phys. Chem. B, Vol. 101 : 2980-2985) ainsi que dans les brevets américains n0 US 5,869,244, n° US 6,150,106, n° US 6,355,436 et n° US 6,562,577.
Comme cela a déjà été indiqué précédemment dans la description et comme cela est illustré dans les exemples, le procédé de détection selon l'invention peut être utilisé avec des composés appâts qui consistent en des acides nucléiques se fixant sur le ou les composé(s) cible(s).
Procédé de fabrication d'un dispositif de détection selon l'invention.
Le procédé ci-dessus est décrit en relation avec le mode de réalisation du dispositif pour lequel le revêtement consiste en une couche de phospholipides. Ce procédé est directement transposable à la fabrication d'un dispositif de détection pour lequel le revêtement est choisi parmi les autres revêtements indiqués dans la présente description.
Pour fabriquer un dispositif de détection selon l'invention, la première étape consiste à préparer des vésicules lipidiques avec un phospholipide ou un mélange de phospholipides ayant la composition finale en phospholipide de la couche de phospholipides du dispositif. Des vésicules lipidiques peuvent être préparées par toute technique connue de l'homme du métier. Notamment, les phospholipides peuvent être tout d'abord dissous dans du chloroforme et mélangés dans les quantités finales désirées, puis éventuellement soumises à une étape de dessiccation sous un courant d'azote, puis dans un dessicateur sous vide. Les vésicules lipidiques sont ensuite resuspendues dans un tampon salin, puis homogénéisées . Des petites vésicules unilamellaires (SUVs pour « small unilamellar vesicles ») sont obtenues par sonication, par exemple avec un dispositif du type « tip-sonicator » (misonix, NY, USA).
Puis, les petites vésicules unilamellaires (SUVs) sont mises en contact avec le support solide de base afin de former la couche de phospholipides.
Selon un autre mode de fabrication, la couche de phospholipide est obtenue à la surface du support solide par application des petites vésicules unilamellaires de lipides préparées comme ci-dessus. Après rinçage, du support solide revêtu de la couche de phospholipide, on procède à une étape d'adsorption des microparticules ou des nanoparticules qui consistent en une incubation du support revêtu de la couche de phospholipides avec ces microparticules ou nanoparticules, pendant une durée nécessaire à leur adsorption, avant rinçage du dispositif de détection, par exemple dans un tampon phosphate. Après préparation du dispositif de détection selon l'invention, celui-ci peut être conservé au froid et sous atmosphère d'azote pendant plusieurs semaines, voire plusieurs mois.
Une fois préparé, le dispositif de détection selon l'invention peut être aussi conservé plusieurs semaines, voire plusieurs mois dans un milieu liquide à la température d'un réfrigérateur (40C), de préférence un tampon phosphate conventionnel.
La présente invention est en outre illustrée par les exemples suivants.
EXEMPLES
Exemple 1 : Procédé de fabrication d'un dispositif de détection selon l'invention
1.1. Préparation du support solide
Nettoyage du substrat de verre : bain de méthanol, puis bain de H2O + H2O2 10%. Rinçage H2O
1.2. Revêtement du support solide par la couche de phospholipides
Fixation de la couche de phospholipides: le verre est mis à incuber au moins 10 minutes dans un tampon phosphate allant de 0.01 à 1 M en présence de vésicules d'EDMPC.
Un rinçage est ensuite effectué avec le tampon, en prenant la précaution d'éviter tout contact de la surface du support revêtu de la couche de phospholipides avec l'air. Le support doit être conservé dans le tampon phosphate allant de 0.1 M à 1 M.
1.3. Liaison non covalente des nanoparticules avec la couche de phopholipides
a) Préparation des acides nucléiques appâts Les acides nucléiques thiolés utilisés sont d'origine commerciale (Eurogentec). Ils sont synthétisés par des protocoles standards de la chimie des phosphoamides, puis purifiés par chromatographie en phase inverse.
b) Fixation des acides nucléiques appâts sur les nanoparticules
Les nanoparticules d'or colloïdal et leur fonctionnalisation sont élaborées selon une procédure décrite par J. Storhoff et al., (J. Am. Chem. Soc. 120, 1959, 1998) : une solution de HAuCU et de citrate de sodium. 50 mL de HAuCU à 1 mM sont chauffés sous agitation continue. Une fois l'ébullition atteinte, 5 mL de citrate de sodium à 38.8 mM sont ajoutés à la solution. La solution jaune pâle au départ devient rouge. L'ébullition et l'agitation sont maintenues pendant 15 minutes, avant de laisser la solution refroidir à température ambiante. La solution est ensuite filtrée à travers des filtres ayant des pores de 0.8 μm, puis 0.2 μm. Les particules obtenues ont un diamètre d'environ 14 nm. Pour la fonctionnalisation, nous ajoutons 18 nMole d'oligonucléotides thiolés à 5 mL de solution de nanoparticules. Après incubation pendant 16 h, la solution est portée à 0.1 M NaCI, 10 mM buffer phosphate pendant 40 h. Pour éliminer les excès d'oligonucléotides, la solution est ensuite rincée par une succession de centrifugation, d'élimination du solvant et resuspension des nanoparticules dans du buffer phosphate 0.1 M et MgCI2 à lO"3 M.
c) Liaison non covalente des nanoparticules sur la couche de phospholipides
Adsorption des nanoparticules : les nanoparticules sont ajoutées au tampon qui baigne l'échantillon. Après un temps suffisant d'incubation à température ambiante (20-220C) (qui dépend de la concentration en nanoparticules) d'une durée de 10 minutes à une nuit, l'échantillon est rincé dans du tampon phosphate 0.1 M et conservé dans celui-ci. A ce stade, l'échantillon présente une couleur rouge.
Exemple 2 : Méthodologie générale du procédé de détection selon l'invention. Tous les essais sont réalisés avec dispositifs de détection fabriqués en utilisant, comme support solide de base, soit des parties de lamelles de verre couvre-objet pour microscopie optique, leur surface étant d'environ 30mm2, soit des billes de verre de 2 mmm de diamètre.qui ont été préparées comme décrit à l'Exemple 1.Les essais d'hybridation consistent à mettre en présence les dispositifs de détection avec une certaine quantité d'oligonucléotides cibles de 24 bases de longueur, respectivement :
- soit des oligonucléotides cibles de 24 bases complémentaires des séquences des acides nucléiques appâts préalablement fixés sur les nanoparticules ;
- soit des oligonucléotides de 24 bases non complémentaires des séquences des acides nucléiques appâts préalablement fixés sur les nanoparticules ;
L'étape d'hybridation est réalisée dans un volume d'environ 200μL ou 20μL de tampon phosphate 1 M ou 0.3M à température ambiante (2O0C- 250C). Après incubation d'une durée de 30 minutes à une nuit, un test de désorption est réalisé en ajoutant un certain volume d'une solution de KCI 2M ou NaCI 5M, ou de sulfate de dextran à 1% (Poids/Volume) sans aucun autre traitement préalable. L'événement de désorption est observé à l'œil nu. Lors de l'événement de désorption, on observe simultanément la coloration de la solution tampon et la décoloration de l'échantillon. L'étape de désorption se réalise en seulement quelques secondes.
Nanoparticules utilisées
Nanoparticules N°1 : diamètre 14nm, fonctionnalisées par SH-(CH2)65'-
CGCATTCAGCAT-3' (SEQ ID N°1 )
Nanoparticules N°2 : diamètre 14nm, fonctionnalisées par 5'-
TCTCAACTCGTA -3'(CH2)3SH (SEQ ID N°2)
Oligonucléotides contenus dans les échantillons à tester Oligonucléotide Complémentaire : δ'-TACGAGTTGAGACTGCTGAATGCG-S' (SEQ ID N°8)
Oligonucléotide non Complémentaire : 5'-AGACATCATCATGCAAAGAATCGAC-3' (SEQ ID N°4)
Echantillons à tester
Deux types d'échantillons ont été utilisés : le premier comporte que des nanoparticules N°2, le second comporte un mélange dans un rapport 1 :1 entre des nanoparticules N°1 et des nanoparticules N°2.
L'oligonucléotide complémentaire peut s'hybrider avec les nanoparticules N°2 en formant une double hélice de 12 paires de bases, les 12 autres restant libres. L'oligonucléotide complémentaire peut s'hybrider à la fois avec les nanoparticules N°1 et les nanoparticules N°2. Ainsi, l'oligonucléotide complémentaire permet de créer des liens entre les nanoparticules N°1 et N°2 de 24 paires de bases.
Exemple 3 : Spécificité du dispositif de détection selon l'invention
Tous les essais sont réalisés avec dispositifs de détection fabriqués en utilisant, comme support solide de base, des parties de lamelles de verre couvre-objet pour microscopie optique, qui ont été préparées comme décrit à l'Exemple 1. Leur surface est d'environ 30mm2.
Echantillon A: mélange 1/1 de nanoparticules N°1 et nanoparticules N°2.
- Hybridation avec 1 nmoles oligonucléotide non complémentaire pendant 30 minutes. Tampon phosphate 1 M
- Test de désorption : désorption à partir du rajout de 10μl NaCI 5M
Echantillon B: mélange 1/1 de nanoparticules 1 et nanoparticules 2.
- Hybridation avec I pmoles oligonucléotide complémentaire pendant 30 minutes. Tampon phosphate 1 M
- Test de désorption : pas de désorption , testé jusqu'au rajout de 160μl NaCI 5M
Conclusion : cette méthode permet de détecter des oligonucléotides de séquence spécifique.
Example 4 : Sensibilité du dispositif de détection de l'invention Tous les essais sont réalisés avec dispositifs de détection fabriqués en utilisant, comme support solide de base, des parties de lamelles de verre couvre-objet pour microscopie optique, qui ont été préparées comme décrit à l'Exemple 1. Leur surface est d'environ 30mm2.
Echantillon A: mélange 1/1 de nanoparticules 1 et nanoparticules 2.
- Hybridation avec 1 pmoles oligonucléotide complémentaire pendant 1 nuit. Tampon phosphate 1 M
- Test de désorption : rajout de 10μl KCI 2M : pas de désorption.
Echantillon B: mélange 1/1 de nanoparticules 1 et nanoparticules 2.
- Hybridation avec 100f moles oligonucléotide complémentaire pendant 1 nuit. Tampon phosphate 1 M
- Test de désorption : rajout de 10μl KCI 2M : pas de désorption
Echantillon C: mélange 1/1 de nanoparticules 1 et nanoparticules 2.
- Hybridation avec 10f moles oligonucléotide complémentaire pendant 1 nuit. Tampon phosphate 1 M
- Test de désorption : rajout de 6μl KCI 2M : pas de désorption, + 4μl KCI 2M : désorption.
Echantillon D: mélange 1/1 de nanoparticules 1 et nanoparticules 2.
- Incubation sans oligonucléotides pendant 1 nuit . Tampon phosphate 1 M - Test de désorption : rajout de 6μl KCI 2M : désorption.
Conclusion : nous avons été capables de détecter facilement 10OfM voire 10fmoles d'oligonucléotides.
Exemple 5 : Adaptation des paramètres de température du procédé de détection de l'invention
Dans cet exemple, et pour un dispositif de détection de l'invention comprenant des acides nucléiques appâts préparé comme décrit à l'exemple 1 , on montre que la température de désorption de l'ensemble phospholipides/nanoparticules dépend de la température de fusion du complexe hybride formé entre l'acide nucléique appât et l'acide nucléique cible.
Echantillon A: mélange 1/1 nanoparticules 1 et nanoparticules 2 - Hybridation avec 1 nM oligonucléotide complémentaire pendant 1 h30. Tampon phosphate 1 M
- Test de désorption : rajout de 60μl NaCI 5M : pas de désorption.
- Température de fusion dans tampon final » Tm théorique à 5OmM NaCI : Tm0AGC : 52.6°C, Tm(2AT+4GC) : 700C Chauffage : désorption vers 650C
Echantillon B: nanoparticules 2 (Tm dans 1 M phosphate+ >Tm théorique à 5OmM NaCI : )
- Hybridation avec 1 nM oligonucléotide complémentaire pendant 1 h30. Tampon phosphate 1 M
- Test de désorption : rajout de 560μl NaCI 5M : pas de désorption
- Température de fusion dans tampon final » Tm théorique à 5OmM NaCI : Tm %GC : 28.6 0C, Tm(2AT+4GC) : 34°C
Chauffage : désorption avant 450C
Conclusion : les températures de désorption dépendent de la température de melting.
Exemple 6 : Tests de diverses conditions de désorption des nanoparticules Tous les essais sont réalisés avec dispositifs de détection fabriqués en utilisant, comme support solide de base, des parties de lamelles de verre couvre-objet pour microscopie optique, qui ont été préparées comme décrit à l'Exemple 1. Leur surface est d'environ 30mm2.
Echantillon A: nanoparticules 1
- Hybridation avec 1 nM oligonucléotide complémentaire pendant 1 heure. Tampon phosphate 1M
- Test de désorption : pas de désorption, testé jusqu'au rajout de 1 ml KCI 2M Echantillon A', nanoparticules 1.
- Incubation sans oligonucléotides pendant 1 heure. Tampon phosphate 1M
- Test de désorption : rajout de 150μl KCI 2M : désorption
Echantillon B: nanoparticules 1
- Hybridation avec 1 nM oligonucléotide complémentaire pendant 1 heure. Tampon phosphate 0.1 M
- Test de désorption : pas de désorption, testé jusqu'au rajout de 1 ml KCI 2M
Echantillon B'\ nanoparticules 1.
- Incubation sans ologonucléotides pendant 1 heure. Tampon phosphate 0.1 M
- Test de désorption : rajout de 150μl KCI 2M : désorption
Conclusion : La méthode peut être employée dans une large gamme de concentrations en sel.
Exemple 7 : Tests de diverses conditions de désorption des nanoparticules.
Tous les essais sont réalisés avec dispositifs de détection fabriqués en utilisant, comme support solide de base, des parties de lamelles de verre couvre-objet pour microscopie optique, qui ont été préparées comme décrit à l'Exemple 1. Leur surface est d'environ 30mm2.
Echantillon A: mélange 1/1 nanoparticules 1 et nanoparticules 2
- Hybridation avec 1 pM oligonucléotide complémentaire pendant 1 h30. Tampon phosphate 0.2M
- Test de désorption : rajout de 200μl d'une solution de Dextran sulfate à 1%: pas de désorption
Echantillon A': mélange 1/1 nanoparticules 1 et nanoparticules 2
- Hybridation avec 1 pM oligonucléotide complémentaire pendant 1 h30. Tampon phosphate 0.2M
- Test de désorption : rajout de 50μl d'une solution KCI 2M : pas de désorption Echantillon B: mélange 1/1 nanoparticules 1 et nanoparticules 2
- Hybridation avec 1 nM oligonucléotide non complémentaire pendant 1h30. Tampon phosphate 0.2M
- Test de désorption : rajout de 200μl d'une solution de Dextran sulfate à 1%: désorption
Echantillon B': mélange 1/1 nanoparticules 1 et nanoparticules 2
- Hybridation avec 1 nM oligonucléotide non complémentaire pendant 1h30. Tampon phosphate 0.2M
- Test de désorption : rajout de 50μl d'une solution de solution KCI 2M : désorption
Conclusion : La désorption peut être provoquer par différents moyens, comme l'addition de macromolécules telles que le Dextran sulfate.
Exemple 8 : Système de détection comprenant une pluralité de dispositifs microparticulaires de détection de l'invention.
Le dispositif est un mélange d'environ un pour un (1 :1 ) de deux types de microparticules pour un poids total d'environ 0,2mg:
Microparticules A : microparticules sphériques formant un complexe avec la séquence
5'-CGAAAGTCTGAC-3' (SEQ ID N°5) d'un ADN cible. caractéristique d'identification : diamètre de 10-30 μm
Microparticules B : microparticules sphériques formant un complexe avec la séquence 5'-ATGCTGAATGCG-3' (SEQ ID N°6) d'un autre ADN cible. caractéristique d'identification : diamètre de 50-100 μm
La fabrication des microparticules et le procédé de détection sont décrit dans les exemples précédents.
Ces microparticules de verre ont la caractéristique de perdre leur coloration rouge au cours du procédé de détection si des complexes ne se sont pas formés à leur surface. Les microparticules restant rouges indiquant la présence du complexe cible. Ainsi après cette étape, un étalement des microparticules sur une lame de microscope et une observation des particules sous un microscope permet d'observer et à la fois la taille de la microparticule et si un complexe s'est formé (coloration rouge ou pas) indiquant la présence des composés cibles.
Expérience 1
Les microparticules sont dispersés dans 20μl de tampon phosphate 0.1 M PH :7 contenant 2OpM d'oligonucléotide de séquence 5'- TACGAGTTGAGAATGCTGAATGCG-3' (SEQ ID N°1 ) qui peut former un complexe avec les microparticules de type B , mais pas avec les microparticules A. Le tout est incubé pendant 45 minutes à température ambiante(25°C) et le la détection est effectuée.
Observation microscopique : seules les particules de diamètre 50-1 OOμm sont rouges, les particules de diamètre 10-30 sont non colorées.
Expérience 2
Les microparticules sont dispersés dans 20μl de tampon phosphate 0.1 M PH :7 contenant contenant 2OpM d'oligonucléotide de séquence 5'- CGAAAGTCTGACAGTCCTAATGAG-3' (SEQ ID N0 7) qui peut former un complexe avec les microparticules de type A, mais pas avec les microparticules B. Le tout est incubé pendant 45 minutes à température ambiante(25°C) et la détection est effectuée.
Observation microscopique : seules les particules de diamètre 10-30μm sont rouges, les particules de diamètre 50-1 OOμm sont non colorées.
Expérience 3
Les microparticules sont dispersés dans 20μl de tampon phosphate 0.1 M PH :7 contenant contenant 2OpM d'oligonucléotide de séquence 5'- CGAAAGTCTGACAGTCCTAATGAG-3' (SEQ ID N°7) qui peut former un complexe avec les microparticules de type A , mais pas avec les microparticules B et 2OpM d'oligonucléotide de séquence δ'-TACGAGTTGAGAATGCTGAATGCG-S' (SEQ ID N°3) qui peut former un complexe avec les microparticules de type B , mais pas avec les microparticules A. Le tout est incubé pendant 45 minutes à température ambiante (250C) et la détection est effectuée. Observation microscopique : les particules de diamètre 10-30μm et, les particules de diamètre 50-1 OOμm sont rouges.
Exemple 9 : Test de désorption des nanoparticules avec le sulfate de dextran. Tous les essais sont réalisés avec dispositifs de détection fabriqués en utilisant, comme support solide de base, des billes de verres de 2 mm de diamètre, qui ont été préparées comme décrit à l'Exemple 1.
- nanoparticules 1 fonctionnalisées par TCCATTGCGGAA-3'(CH2)3SH [SEQ ID N°9]
- nanoarticules 2 fonctionnalisées par SH-(CH2)65'GTCAGACTTTCG [SEQ ID N0IO]
- oligo complémentaire 1 :TTCCGCAATGGACGAAAGTCTGAC [SEQ ID N°11]
- oligo complémentaire 2 :TTCCGCAATGGA(A)30CGAAAGTCTGAC [SEQ ID N012]
Expérience A : - Echantillon avec des nanoparticulesi
- Hybridation 1 heure à Température du laboratoire avec 100 pmoles oligo complémentaire 1 dans 20 μl de tampon sodium 0.3M.
- Test de désorption : ajout de 10 μl de sulfate de Dextran à 1%
Résultats : Les nanoparticules désorbent complètement du support de microbilles. Expérience B : - Echantillon avec des nanoparticulesi et nanoparticules 2 dans une égale proportion.
- Hybridation 1 heure à T ambiant avec 100 pmoles oligo complémentaire 1 dans 20μl Na buffer 0.3M. - Test de désorption : ajout de 10μl de Dextran sulfate à 1%
Résultats : Les nanoparticules ne désorbent pas du tout.
Expérience C : - Echantillon avec des nanoparticulesi et nanoparticules 2 dans une égale proportion.
- Hybridation 1 heure à T ambiant avec 100 pmoles oligo complémentaire 2 dans 20μl Na buffer 0.3M.
- Test de désorption : ajout de 10μl de Dextran sulfate à 1%
Résultats : Les nano-particules ne désorbent pas du tout.
La figure 3 illustre les résultats des mesures d'absorption à 527 nm (absorption des nanoparticules) de la solution après hybridation d'un échantillon avec différentes quantités d'oligonucléotides complémentaires, puis ajout de sulfate de Dextran.
Exemple 10 : Détection de mismatch
Les échantillons consistent en des cuves en polystyrène pour spectrophotométrie. Le fond de ces cuves ont été revêtues des phospholipides et de nanoparticules de 2 types par les mêmes procédures que la préparation sur support de verre décrite à l'exemple 1 :
Fabrication du dispositif de détection Nanoparticules 1 SH-(CH2)65'-TTT-TTT-TTT-TTA-ATT-ACG-TGA-3' [SEQ ID N°13]
Nanoparticules 2 5'-ATT-AAT-TAT-CGA-TTT-TTT-TTT-TT-3'(CH2)3SH 3' [SEQ ID N°14] Ces cuves sont ensuite hybridées dans 50μl buffer phosphate 0.3M avec 80 pmol d'oligonucléotides :
Cuve « sm » : un complémentaire T-TAA-TGC-ACT-TAA-TTA-ATA-GCT [SEQ ID N015] Cuve « 1 m » : un oligo présentant 1 mismatch : T- TAA-TGC-ACT-CAA- TTA-ATA-GCT [SEQ ID N°16]
Cuve « 3m » : un oligo présentant 3 mismatch T-TAA-TCG-ACT-CAA-CXA- ATA-GCT [SEQ ID N017]
Procédure :
Après 30 minutes d'incubation à T ambiante, 1 ml d'une solution de Dextran sulfate à 1% sont ajoutés. Les cuves sont ensuite placée dans un spectromètre thermostaté et l'absorption à 527nm est suivie en fonction de la température. « Une courbe de Tm » peut être ainsi réalisée comme on peut le voir sur la figure 4:
Résultats :
La figure 4 illustre les résultats de désorption des nanoparticules après incubation avec les différentes séquences cibles induisant des complexes d'hybridation sans mésappariement (sm) un mésappariement (1 m) ou trois mésappariements (3m).
Sur les courbes de la figure 3, on peut voir notamment qu'à la température de 4O0C un échantillon hybride avec un mésappariement est complètement désorbé alors que l'échantillon qui est hybride sans mésappariement n'est pas désorbé.
Ces résultats illustrent la grande spécificité de détection qui peut être obtenue avec un dispositif de détection selon l'invention. Une détection de SNP est réalisable.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât immobilisé sur un support, ledit dispositif comprenant : a) un support solide ; b) un revêtement lié de manière non covalente à la surface dudit support solide ; et c) une pluralité de microparticules ou de nanoparticules sur chacune desquelles est fixé au moins un composé appât, lesdites microparticules ou nanoparticules étant liées au revêtement.
2. Dispositif selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le support solide consiste en un support solide dont la surface en contact avec le revêtement est chargée négativement ou positivement dans une solution tampon ou consiste en un support solide hydrophobe.
3. Dispositif selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que le support solide est choisi parmi le verre minéral, la silice, le silicium, le mica, une alumine, le quartz, un oxyde métallique, un polymère organique chargé négativement et un polymère hydrophobe.
4. Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'oxyde métallique est choisi parmi ZnO, Tiθ2, Fβ2θ3 et V2Os
5. Dispositif selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le polymère organique est choisi parmi les polymères suivants : polyéthylène, polypropylène, polybutadiène, polyoxyéthylène, polystyrène, polycarbonate, et polymethacrylate.
6. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le revêtement consiste en une couche comprenant des molécules amphiphiles.
7. Dispositif selon la revendication 6, caractérisé en ce que les molécules amphiphiles sont choisies parmi les lipides, les agents tensio-actifs et les polymères organiques amphiphiles.
8. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la surface de la couche de revêtement sur laquelle sont liées les microparticules ou les nanoparticules est chargée positivement dans une solution tampon.
9. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la couche de revêtement consiste en une couche de phospholipides comprenant au moins un type de phospholipides choisi parmi le 1 ,2- dilauroyl-sn-glycéro-3-éthylphosphocholine, 1 ,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3- éthylphosphocholine (EDMPC), 1 ,2-dioléoyl-sn-glycéro-3- éthylphosphocholine, 1 ,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-éthyl phosphocholine, 1 ,2-dipalmitoyl-sn-glyero-3-éthylphosphocholine, 1 ,2- distéaroyl-sn-glycéro-3-éthylphosphocholine et 1 -palmitoyl-2-oléoyl-sn- glycéro-3-éthylphosphocholine.
10. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la couche de revêtement consiste en une couche de phospholipides comprenant au moins un type de phospholipides choisi parmi le DPPG, le DMPG, le DPG, le PS, le Pl, le PG, le DOPS, le DOPA, le POPA, le DOPG et le POPG.
11. Dispositif selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que la couche de phospholipides comprend au moins un type de phospholipides choisi parmi le DMPC, le DOPC et le DPPC,
12. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 11 , caractérisé en ce que la surface extérieure des microparticules ou les nanoparticules est constituée d'un matériau métallique, d'un matériau semi-conducteur ou d'un matériau isolant.
13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que le matériau métallique est choisi parmi Au, Ag, Cu et Co.
14. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que le matériau semi-conducteur est choisi parmi Si, Ge, ZnO, SnO, CdS, CdSe et GaAs.
15. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce que le matériau isolant est choisi parmi le verre, SiO2 , Fe2O3., le latex et un polymère isolant.
16. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que le(s) composé(s) appât(s) est (sont) lié(s) de manière covalente aux microparticules ou aux nanoparticules.
17. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'au moins deux composés appâts distincts sont liés à une microparticule ou une nanoparticule.
18. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le(s) composé(s) appât(s) est(sont) une protéine ou un peptide.
19. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que le(s) composé(s) appât(s) est(sont) choisi(s) parmi les récepteurs de facteurs de croissance, les récepteurs d'hormones, les récepteurs des neurotransmetteurs, les récepteurs de cytokines, les récepteurs de la matrice extracellulaire, les lectines, les cytokines, les serpines, les facteurs de transcription, les protéines se liant à l'ADN, les protéines à doigt de zinc, les antigènes de surface cellulaires et les antigènes.
20. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que le(s) composé(s) appât(s) est(sont) un(des) anticorps.
21. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 17, caractérisé en ce que le(s) composé(s) appât(s) est(sont) un(des) acide(s) nucléique(s).
22. Dispositif selon la revendication 21 , caractérisé en ce que l'acide nucléique appât comprend une séquence se liant spécifiquement à un composé cible.
23. Dispositif selon la revendication 22, caractérisé en ce que l'acide nucléique appât comprend au moins une séquence s'hybridant avec un acide nucléique cible.
24. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce qu'il comprend des nanoparticules d'or sur lesquelles sont fixés de manière covalente des acides nucléiques appâts s'hybridant avec le ou les composé(s) cible(s).
25. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que les microparticules ou les nanoparticules contiennent une molécule détectable par colorimétrie ou fluorimétrie.
26. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce que le revêtement contient des molécules détectables par colorimétrie ou fluorimétrie.
27. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 26, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 100 microparticules ou nanoparticules.
28. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 27, caractérisé en ce que le support possède une surface plane.
29. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 27, caractérisé en ce que le support est sphérique.
30. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 27, caractérisé en ce que le support consiste en une microparticule dont la plus grande dimension varie de 500 nanomètres à 2 millimètres.
31. Dispositif selon la revendication 30, caractérisé en ce que la microparticule support, ou le revêtement, comprend un composé fluorochrome ou une combinaison de composés fluorochromes.
32. Système de détection de la fixation d'au moins un composé cible sur un composé appât, caractérisé en ce qu'il comprend une pluralité de dispositifs de détection selon l'une des revendications 1 à 31.
33. Système de détection selon la revendication 32, caractérisé en ce que les dispositifs de détection contenus dans celui-ci consistent en des dispositifs microparticulaires de détection.
34. Système de détection selon l'une des revendication 32 ou 33, caractérisé en ce chaque dispositif de détection comprenant un composé appât déterminé se distingue de chacun des autres dispositifs de détection par au moins un paramètre physique telle que la forme, la taille, la couleur ou les propriétés de fluorescence.
35. Procédé pour détecter la fixation d'un composé cible sur un composé appât, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon susceptible de contenir ledit composé cible avec un dispositif selon l'une des revendications 1 à 31 , ou avec un système de détection selon l'une des revendications 32 à 34, ledit dispositif ou ledit système comprenant au moins un composé appât se fixant sur ledit composé cible; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit composé cible et ledit composé appât.
36. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que l'étape b), comprend les sous-étapes suivantes : b1 ) on soumet le dispositif ou le système à des conditions d'environnement dans lesquelles les microparticules ou les nanoparticules sont désorbées de la surface du support solide du ou des dispositif(s), en l'absence de formation de complexes entre le(s) composé(s) appât(s) et le(s) composé(s) cible(s) ; b2) on détecte la désorption des microparticules ou des nanoparticules à partir de la surface du support solide.
37. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce qu'à l'étape b1 ) le dispositif est immergé dans une solution saline concentrée.
38. Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'à l'étape b1 ), le dispositif est immergé dans une solution de NaCI ayant une concentration finale d'au moins 0,5 M, de préférence une concentration finale allant de 0,5 M à 2 M, la concentration finale étant de manière tout à fait préférée de 1 M.
39. Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'à l'étape b1 ), le dispositif est immergé dans une solution de KCI ayant une concentration finale d'au moins 0,2 M, de préférence une concentration finale allant de 0,2 M à 1 M, la concentration finale étant de manière tout à fait préférée de 0,4 M.
40. Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'à l'étape b1 ) le dispositif est immergé dans une solution comprenant des macromolécules ayant une charge nette de même polarité que la charge nette que les microparticules ou les nanoparticules sur lesquelles est (sont) fixé(s) le(s) composé(s) appât(s).
41. Procédé selon la revendication 40, caractérisé en ce qu'à l'étape b1 ) le dispositif est immergé dans une solution comprenant du sulfate de dextran.
42. Procédé selon la revendication 41 , caractérisé en ce qu'à l'étape b1 ) le dispositif est immergé dans une solution de sulfate de dextran à une concentration finale allant de 0,1 % à 5 % en poids par rapport au volume total de la solution.
43. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce qu'à l'étape b2), la désorption est détectée par un changement de couleur de la surface du dispositif.
44. Procédé selon la revendication 36, caractérisé en ce qu'à l'étape b2), la désorption est détectée par une modification de la valeur d'une onde acoustique traversant le support solide du dispositif.
45. Procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que la modification de la valeur d'une onde acoustique consiste en une modification de la fréquence de ladite onde acoustique.
46. Procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce qu'à l'étape b2) la désorption est détectée par fluorescence.
47. Procédé selon la revendication 44, caractérisé en ce que l'étape b) est réalisée selon la technique QCM-D.
48. Procédé selon la revendication 35, caractérisé en ce que le(s)dit(s) composé(s) appât(s) consiste(nt) en un (des) acide(s) nucléique(s) se fixant sur ledit composé cible.
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