WO2006013862A1 - Ｃｄｋ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法 - Google Patents

Ｃｄｋ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2006013862A1
WO2006013862A1 PCT/JP2005/014123 JP2005014123W WO2006013862A1 WO 2006013862 A1 WO2006013862 A1 WO 2006013862A1 JP 2005014123 W JP2005014123 W JP 2005014123W WO 2006013862 A1 WO2006013862 A1 WO 2006013862A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
expression
drug sensitivity
cdk4
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/014123
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hidehito Kotani
Hiraku Itadani
Kazunori Yamanaka
Tomohiro Eguchi
Toshiyasu Shimomura
Original Assignee
Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. filed Critical Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority to CA002575986A priority Critical patent/CA2575986A1/en
Priority to US11/659,258 priority patent/US20090081645A1/en
Priority to JP2006531495A priority patent/JPWO2006013862A1/ja
Priority to EP05768326A priority patent/EP1788083A4/en
Publication of WO2006013862A1 publication Critical patent/WO2006013862A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring and predicting sensitivity to a CDK4 inhibitor in a test tissue or a test cell at a molecular level.
  • background technologies related to the molecules used for the measurement and prediction are also known.
  • the cell cycle is the basic system of cell division and is the final stage of signal transduction in cell growth control.
  • the cell cycle proceeds from the G1 phase, the S phase, the G2 phase, and the M phase in this order, with the cell growth being stopped as the GO phase.
  • S phase DNA replication occurs
  • M phase cell division occurs.
  • the cyclin-CDK (Cyclin dependent kinase) complex plays a central role in the control of the cell cycle, among the forces involving various proteins. That is, cyclin D force SCDK4 (or CDK6) and cyclin E and cyclin A form a complex with CDK2 and are activated.
  • the activated complex phosphorylates Rb (Retinoblastoma) protein to promote signal transduction, and activates transcription factors such as E2F to induce cells from G1 phase to S phase. .
  • CDK4 human CDK4 gene accession number: U37022: SEQ ID NO: 1
  • U37022 SEQ ID NO: 1
  • cyclin D a gene that neutralizes its growth inhibitory activity by phosphorylating Rb protein, and is reported to be highly expressed in certain cancer cells (Adv. Cancer Res., 1996). Year, 68 ⁇ , 67 pages).
  • CipZ Kip family having homology with p21 and an INK4 family having homology with pl6 a plurality of CDK inhibitors are known, and are roughly classified into a CipZ Kip family having homology with p21 and an INK4 family having homology with pl6.
  • the ability to inhibit cell cycle progression by inhibiting the phosphorylation activity of the cyclin-CDK complex and inhibiting the phosphorylation of the Rb protein CipZKip family has multiple cyclin-CDK complexes
  • the INK4 family binds only to CDK4 or CDK6 and inhibits them.
  • p27 (Accession number of human p27 gene: NM—004064: SEQ ID NO: 2) is one of the CipZKip family. p27 was identified as a protein of approximately 27 kDa that binds to and inhibits the activity of the cyclin E ⁇ CDK2 complex in cells that have stopped growing (Genes Dev., 1994, 8 ⁇ , 9).
  • pl6 human pl6 gene accession number: NM —000077: SEQ ID NO: 3
  • pl8 human pl8 gene accession number: NM—00 1262: SEQ ID NO: 4
  • pl6 binds to CDK4 and cDNA was isolated as a CD K inhibitor that inhibits its activity (Nature, 1993, 366 ⁇ , 704).
  • pl6 is a 16kDa protein consisting of 156 amino acids.
  • pl8 was cloned by searching for a protein that interacts with CDK6 using the yeast two-hybrid system (Genes Dev., 1994, 8 ⁇ , 2939). Guan et al. Found that pl8 is strong with CDK6 but has a slow interaction with CDK4 and no interaction with other CDKs.
  • Non-Patent Document 2 Cancer Res., 2003, 63 ⁇ , 8791
  • Non-Patent Documents 1 and 2 do not mention that the expression level of pl6, pl8, or p27 can be used as an index to predict the sensitivity and resistance to drugs, and the expression levels of these genes and CDK4 There was no suggestion about the relationship between drug sensitivity and efficacy against inhibitors.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and an object thereof is to provide a gene that serves as an index in predicting the degree of drug sensitivity of a CDK4 inhibitor. Another object of the present invention is to provide a method for predicting drug sensitivity to a CDK4 inhibitor using the expression level of a powerful gene as an index.
  • the present inventors have found that the expression level of Pl6, pl8 or p27, which is known as a molecule controlling the cell cycle as a CDK4 inhibitor, is CDK4 inhibitory.
  • the present invention was completed by discovering that it can be used as an index for predicting the presence or degree of drug sensitivity to a drug.
  • the present invention is selected from the group consisting of pi 6 gene, pi 8 gene and p 27 gene used for predicting drug sensitivity to a CDK4 inhibitor based on the expression level in a test tissue or test cell.
  • a gene for predicting drug sensitivity is provided.
  • CDK4 inhibitors are useful as therapeutic agents for proliferative diseases such as cancer because they have the effect of suppressing cell growth by inhibiting the phosphorylation of Rb protein. It also has side effects that inhibit the growth of However, if drug sensitivity is predicted using the above gene for predicting drug sensitivity before CDK4 inhibitor is administered to patients, administration to patients with ineffective CDK4 inhibitors can be avoided. Can be greatly reduced.
  • the gene for predicting drug sensitivity is preferably a pl8 gene.
  • the pl8 gene correlates significantly with drug sensitivity to CDK4 inhibitors, allowing more accurate predictions.
  • the present invention also relates to the pi 6 gene, the pi 8 gene, and the p27 gene used to predict drug resistance to a CDK4 inhibitor based on the expression level in a test tissue or test cell!
  • a gene for predicting drug sensitivity selected from the group consisting of: In the case of predicting drug resistance as well as drug hypersensitivity to a CDK4 inhibitor, these drug sensitivity prediction genes can be preferably used.
  • the present invention includes an antisense nucleic acid of a gene selected from the group consisting of pl6 gene, pl8 gene and p27 gene, or an antibody that specifically recognizes a protein expressed by the gene.
  • a reagent for detecting drug sensitivity to a CDK4 inhibitor is provided. By using the reagent for detecting drug sensitivity, sensitivity to this drug can be predicted before the CDK4 inhibitor is administered to a patient.
  • a protein P 16 gene is expressed in protein SEQ ID NO: 8
  • PL8 gene is expressed in protein SEQ ID NO: 9
  • p27 gene is expressed in SEQ ID NO: 10.
  • Prediction of drug sensitivity to the above-mentioned CDK4 inhibitor is carried out by using a drug sensitivity detection probe comprising an antisense nucleic acid of a gene selected from the group consisting of pl6 gene, pl8 gene and p27 gene, It is preferable to use an antibody for drug sensitivity detection that specifically recognizes the expressed protein.
  • the present invention comprises a step of measuring the expression level of at least one gene selected from the group consisting of pl6 gene, pl8 gene and p2 7 gene in a test tissue or test cell (measurement step);
  • a method for predicting drug sensitivity to a CDK4 inhibitor comprising a step of comparing the expression level of the gene with the expression level of the gene in healthy tissues or cells (comparative step). Using this method, the sensitivity to this drug can be predicted before the CDK4 inhibitor is administered to the patient.
  • the test tissue or test cell further includes a step of determining that the drug sensitivity to the CDK4 inhibitor is high (high sensitivity determination step), the expression of the gene is detected in comparison with the healthy tissue or healthy cell.
  • the tissue or test cells are very low, it can be predicted that the drug sensitivity to the CDK4 inhibitor is high.
  • the present invention also includes a step (detection step) of detecting the expression of at least one gene selected from the group consisting of the pl6 gene, the pl8 gene, and the p27 gene in a test tissue or a test cell.
  • a step for predicting drug sensitivity to an inhibitor is provided. If this method is used, since the measurement step and the comparison step are unnecessary, the sensitivity to the DK4 inhibitor can be easily predicted.
  • the gene whose expression is detected is preferably a pi8 gene. Since the pl8 gene significantly correlates with drug sensitivity to CDK4 inhibitors, more accurate prediction can be made by the above prediction method.
  • the use of a gene serving as an index, ie, pl6, pl8, or p27 when predicting the degree of drug sensitivity of a CDK4 inhibitor Gene. Also provided is a method for predicting drug sensitivity to CDK4 inhibitors using the expression levels of these genes as an index.
  • pl6, pl8, or p27 is a factor that negatively regulates the cell cycle, and is a product of a tumor suppressor gene that has an action of inhibiting the kinase activity of the corresponding CDK. Attempts have been made to target anti-cancer drugs. It has never been possible to predict that these genes can be used to predict the sensitivity of CDK4 inhibitors that exert the same effect as CDK inhibitors.
  • FIG. 1 is a diagram confirming the change in the phosphorylation level of Rb protein by Compound A treatment.
  • FIG. 2 is a diagram comparing cell growth inhibition and apoptosis induction by compound A for cultured cells derived from various tissues.
  • FIG. 3 is a diagram showing a clustered state in which genes whose expression level changes in these cells are detected by microarray for cultured cells derived from various yarns and weaves.
  • FIG. 4 is a diagram showing the expression levels of pl8, pl6, p27 and phosphorylated Rb protein (pRB) in cultured cells derived from various tissues.
  • FIG. 5 shows the confirmation of pl8 expression in HeLa cells in which pl8 expression was induced.
  • FIG. 6 is a diagram showing the relationship between p18 expression and apoptosis induction.
  • FIG. 7 A graph in which genes whose expression levels change due to overexpression of pl6 and p27 were examined at four time points of 24, 36, 48, and 72 hr and plotted.
  • FIG. 8 is a diagram in which genes whose expression levels change due to overexpression of pl6 and p27 are confirmed at 4 time points of 24, 36, 48 and 72 hr.
  • FIG. 9 A diagram in which genes whose expression levels change due to overexpression of pl6 and p27 were detected and clustered at four time points of 24, 36, 48 and 72 hr.
  • the "test tissue” is not particularly limited as long as it is derived from a specimen (mainly human) whose sensitivity to a CDK4 inhibitor is to be measured, but it is easy to separate and extract. From the viewpoint, it is preferably blood. Blood can be considered as one supporting tissue because blood cells can be considered as cellular components and plasma containing fibrinogen as an extracellular matrix. In addition, since the target diseases of CDK4 inhibitors are mainly proliferative diseases (cancer, tumor, rheumatoid arthritis, etc.), it is preferable that the tissue is derived from an organ in which a strong disease has occurred.
  • test cell is not particularly limited as long as it is derived from a specimen (mainly human) whose sensitivity to a CDK4 inhibitor is to be measured. However, separation and extraction are easy. From the viewpoint of being, it is preferably a blood cell (not only blood cells such as red blood cells and white blood cells but also a mixture thereof).
  • a blood cell not only blood cells such as red blood cells and white blood cells but also a mixture thereof.
  • the target diseases of CDK4 inhibitors are mainly proliferative diseases (cancer / tumor, rheumatoid arthritis, etc.), it is preferable that the cells are derived from the tissue in which such diseases occurred.
  • CDK4 inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance that inhibits the activity of CDK4, and it may be a low molecular or high molecular compound or a protein or peptide. Good. Further, it may be a low molecular weight physiologically active substance. Specific examples of such a CDK4 inhibitor include Flavopiridol, BMS387032, R-Roscovitine.
  • drug sensitivity is inherently different depending on gender, age, nutritional state, and disease state, and is affected by the drug concentration in the tissue. Regardless of these factors, the drug administration value What is necessary is just to judge the degree of sensitivity on the basis of whether there is. That is, the expression level of the pl6, pl8 or p27 gene is measured, and whether or not the drug should be administered according to the expression level is examined.
  • Drug resistance is a phenomenon in which a decrease in responsiveness to a drug usually occurs when the drug is administered continuously or frequently in a short time.
  • Known causes of drug resistance include, for example, a decrease in the number of receptors, a decrease in receptor binding affinity, and a decrease in information transmission system activity.
  • drug hypersensitivity refers to a phenomenon in which, for example, when the concentration of agonist at the site of action is reduced, the reactivity to the given agonist is remarkably enhanced.
  • Known causes of drug hypersensitivity include increased receptors and increased activity of information transmission systems from receptors.
  • Drug sensitivity prediction gene refers to a pl6, pl8 or p27 gene used for predicting drug sensitivity to a CDK4 inhibitor based on the expression level in a test tissue or test cell.
  • the pl6, pl8, or p27 gene is known as a factor having an action of inhibiting the phosphorylation activity of CDK in vivo. Both of these genes inhibit cyclin CDK from phosphorylating the Rb protein by binding to the cyclin CDK complex. That is, these genes function as regulators of the Rb pathway. Based on these facts, cells with low expression of pl6, pl8 or p27 genes are expected to activate Rb pathway with high CDK activity, and there is a correlation between these genes and CDK activity. Force expected to be related CDK4 blockage There has been no knowledge of the relationship between the sensitivity to harmful agents and the expression level of p16, p18 or p27 gene.
  • the present inventors clarified the correlation between the expression level of CDK4 inhibitor and pl6, pl8 or p27 gene by classifying at the cell level or tissue level according to the difference in sensitivity to CDK4 inhibitor, and predicted drug sensitivity. The use of the above gene was found.
  • Examples of animal species from which the respective genes of CDK4, pl6, pl8, and p27 are derived include humans and non-human animals, and examples include humans, mice, rats, monkeys, monkeys, and rabbits. However, among these, humans are preferable.
  • the p18 gene is particularly preferred for use in examining drug sensitivity to a force CDK4 inhibitor that discloses use of the pl6, pl8, or p27 gene.
  • the relationship between the expression level and drug sensitivity is a remarkable force.
  • drug sensitivity detection probe for CDK4 inhibitors, pi 6 gene shall apply that of an antisense nucleic acid of a gene selected from the also the group pi 8 genetic Kooyobi P 27 gene force, its use CDK4 Used to examine drug sensitivity to inhibitors
  • the antisense nucleic acid can specifically recognize mRNAs of pl6 gene, pl8 gene and P27 gene expressed in the test tissue or test cell, respectively, the full-length gene or a part of the gene can be recognized. It may be an antisense nucleic acid of sequence or may be either DNA or RNA.
  • an antisense nucleic acid having a length of 100 bp or more is usually used. However, it is preferably 500 bp or more, and more preferably 1000 bp or more.
  • an oligonucleotide of several tens of bp may be used as long as the corresponding mRNA can be specifically recognized.
  • the antisense nucleic acid can be synthesized by PCR using the above gene as a saddle if it is DNA, and can be synthesized by the in vitro translation method using the above gene as a saddle if it is RNA. In the case of oligonucleotide, it can be synthesized by a DNA synthesizer.
  • an antibody that specifically recognizes pl6, pl8, and p27 can be used as long as it can specifically recognize pl6, pl8, and p27 expressed in a test tissue or a test cell. It may be a terminal antibody or a polyclonal antibody.
  • the above antibody can be prepared, for example, by immunizing a rabbit with the above protein or a synthetic peptide thereof, or by the nobridoma method.
  • the "drug sensitivity detection reagent” is a reagent prepared for examining drug sensitivity to a CDK4 inhibitor containing the antisense nucleic acid or the antibody as an essential component, and only the antisense nucleic acid or the antibody is effective. Preferably, it is a mixture of the antisense nucleic acid or the antibody and other components.
  • drug sensitivity detection reagents are usually dissolved in a neutral buffer solution together with the above-mentioned antisense nucleic acid or antibody together with an enzyme inhibitor or reducing agent that prevents their degradation, and other necessary components depending on the application. Can be produced.
  • the "method for predicting drug sensitivity to a CDK4 inhibitor" is an expression level of at least one gene selected from the group consisting of Pl6, pl8 and p27 in a test tissue or test cell. And a comparison step of comparing the expression level of the gene with the expression level of the gene in a healthy tissue or a healthy cell.
  • the ability to measure the expression level of at least one of the pl6, pi8, or p27 genes in the test tissue or test cell separated from the subject “At least one” means that the expression level may be measured by paying attention to any one gene of pl6, pl8 or p27, or the expression level may be measured by paying attention to two or three genes. It's okay. Even when focusing on two or three genes, in order to perform more accurate prediction, it is preferable to measure the expression level including at least pl8.
  • the measurement method is not particularly limited, but for example, the expression level of these genes can be measured by solubilizing a test tissue or test cell and then analyzing it with a DNA microarray or the like.
  • the expression level of a translation product can be investigated by Western blotting, for example.
  • pl6, pl8 or pl8 in the test tissue or test cell measured in the measurement process. Compares the expression level of the p27 gene with the expression level of the pl6, pl8, or p27 gene in healthy tissues or cells from which healthy human power is separated.
  • the comparison method is not particularly limited. 1S Specifically, for example, the fluorescence intensity on the array is quantified in the case of a DNA microarray, or the detected band is counted with a densitometer or the like in the case of Western blotting. What is necessary is just to compare by digitizing.
  • a high sensitivity determination step may be further included.
  • the hypersensitivity judgment step is performed when the expression of the gene in the test tissue or test cell is lower than the expression of the pl6, pl8 or p27 gene in the healthy tissue or healthy cell as a result of the comparison of the expression level. This is a step in which the test cell is judged to have high drug sensitivity to a CDK 4 inhibitor.
  • the test tissue when the expression level of the gene is compared in the comparison step and the expression of the gene in the test tissue or test cell is lower than that in the healthy tissue or healthy cell, the test tissue Alternatively, it can be predicted that the specimen from which the test cells are separated is highly sensitive to the CDK4 inhibitor.
  • the "method for predicting drug sensitivity to a CDK4 inhibitor" comprises expressing at least one gene selected from the group consisting of Pl6, pl8 and p27 in a test tissue or test cell. It includes a detection step of detecting.
  • the method for predicting drug sensitivity to a CDK4 inhibitor according to the first embodiment of the present invention comprises the expression levels of Pl6, pl8 and p27 genes in a test tissue or test cell and a healthy tissue or healthy cell.
  • the degree of sensitivity of these genes to CDK4 inhibitors can be determined not only by comparison with healthy tissues but also by simply confirming the presence or absence of expression. That is, in the prediction method according to the second embodiment, highly sensitive tissue cells tend to have low or no expression of the gene (particularly P18). Therefore, as a result of examining the expression of the above gene, when the expression was strong enough or could not be detected, but the expression level was extremely low, the sensitivity to the CDK4 inhibitor was It can be predicted that the acceptability is high.
  • the method for detecting the expression of the pl6, pl8 and p27 genes is not particularly limited. Specifically, for example, after solubilizing a test tissue or test cell, a DNA microarray, etc. Can be detected. Moreover, when detecting the translation product of the said gene, the presence or absence of the expression of a translation product can be investigated by Western blotting, for example.
  • a test tissue or a test cell separated from a test sample is used! The ability to detect the expression of at least one of the pl6, pl8 or p27 genes.
  • “at least one” refers to any one of ⁇ 16, ⁇ 18 or ⁇ 27.
  • the expression level may be measured, or the expression level may be measured by paying attention to two or three genes. Even when paying attention to two or three genes, it is preferable to measure the expression level including at least 18 in order to make a more accurate prediction.
  • a low sensitivity determination step is a step of determining that the test tissue or the test cell is low in drug sensitivity to the CDK4 inhibitor when the gene is expressed as a result of detection.
  • the specimen from which the test tissue or test cell is separated is sensitive to the CDK4 inhibitor. Can be predicted to be low.
  • Example 1 CDK4 inhibitor resistance experiment (Plasmid construction)
  • the pl8 gene was amplified by PCR using HeLa cell cDNA as a saddle.
  • the amplified p18 gene was inserted into pCR 2.1—TO PO vector using TOPO TA cloning kit (Invitrogene) to construct an expression vector.
  • pTRE2hyg FLAG—pl8 vector contains FLAG gene and pl8 gene as pTR.
  • HCT116, SCC-25, PA-1 and U-118MG were cultured using D-MEM medium (GIBCO) supplemented with 10% fetal bovine serum.
  • PC13, MSTO-211H, BxPC-3 and NCI-H69 were cultured using RPMI 1680 (IWAKI) supplemented with 10% fetal bovine serum.
  • SK-OV-3 was cultured using McCoy's 5a medi urn (GIBCO) with 10% fetal calf serum.
  • J82 was cultured using a 10% fetal bovine serum-added MEM medium (GIBCO).
  • HeLa Tet-On cells were purchased from Clontech and cultured using 10% Tet System Approved Fetal Bovine Serum (Clontech) supplemented DMEM medium (GIBCO).
  • Cdk4 and its activator cyclin D2 and glutathione S-transferase fusion cDNA were incorporated into a baculovirus expression vector to produce a recombinant baculovirus.
  • the produced baculovirus was infected with insect cell Sf9 and highly expressed as a cyclin D2 and dartathione S transferase fusion-Cdk4 active complex. After the cells were recovered and soluble, the active complex was adsorbed on dartathione sepharose, and the cyclin D2-Cdk4 complex was recovered with precision protease and purified by HPLC force chromatography (EMBO J. , 1996, 15th, 7060-7069
  • Cyclin D2 In the measurement of Cdk4 activity, the substrate is amino acid 775 of RB protein.
  • a synthetic peptide corresponding to No. 787 (Arg-Pro-Pro-Thr-Leu-Ser-Pro-Ile-Pro-His-lie-Pro-Arg: SEQ ID NO: 5) was used (EMBO J., 1996 Year 15, pp. 7060-7069).
  • the reaction was carried out by a partial modification of the method of Kitagawa et al. (Oncogene, 1992, Vol. 7, pp. 1067-1074).
  • the reaction volume is 21.1 ⁇ 1
  • the composition of the reaction buffer (R buffer) is 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) / 10 mM magnesium chloride / 4.5 mM 2-mercaptoethanol / ImM ethylene glycol bis (beta Aminoethyl ether) N, N, ⁇ ', ⁇ , monotetraacetic acid (EGTA).
  • Cyclin D2—Cdk4 purified in R buffer, 100 mol substrate peptide, 50 mol unlabeled adenosine triphosphate (ATP) and 1 ⁇ Ci [gamma- 33 ⁇ ] labeled ATP (2000—4000 CiZmmol: Daiichi Kagaku Were added, and reacted at 30 ° C for 45 minutes. Thereafter, 101 350 mM phosphate buffer was added to the reaction system to stop the reaction. The substrate peptide was adsorbed on a P81 paper filter 96-well plate, washed several times with 75 mM phosphate buffer, and its radioactivity was measured with a liquid scintillation counter.
  • test compound was added to the reaction system by first preparing a dimethyl sulfoxide (DMSO) dilution series of the compound and adding 1.1 ⁇ l thereof.
  • a control system was prepared by adding 1.1 ⁇ 1 of DMSO to the reaction system.
  • Cytalin D2 Cosmetic D2 except for using Cytalin D2—Cdk6 instead of Cdk4 V
  • Cytalin A-Cdk2 activity was measured using a synthetic peptide (Ala-Lys—Ala—Lys-Lys-Thr-Pro-Lys-Lys-Ala-Lys-Lys: SEQ ID NO: 6) as a substrate. Cytalin D2-Cdk4 activity was measured in the same manner as in the measurement of cytarin D2-Cdk4 except that cyclin A-Cdk2 was used instead of Cdk4.
  • the cyclin A—Cd k2 activity was measured in the same manner as the cyclin A—Cd k2 except that cyclin B—Cdkl was used instead of cyclin A—Cdk2.
  • the synthetic peptide (Tyr— Ser—Pro—Thr—3 ⁇ 4er—Pro—Thr—Tyr—3 ⁇ 4er—Pro—Thr—3 ⁇ 4er—Pro—Thr—Tyr- ⁇ er — Pro— Thr— Ser— Pro— Thr— Tyr— 3 ⁇ 4er— Pro— Thr— 3 ⁇ 4er— Pro— Thr: except for using cyclin H-Cdk7 instead of cyclin D2-Cdk4 Cyclin D2-Cdk4 activity was measured in the same manner.
  • Cell growth inhibition was measured by sulforhodamine B dye -staining method did.
  • Each cell culture medium 100 1 containing 2 ⁇ 10 3 cells as viable cells was dispensed into a 96-well cell culture dish and cultured overnight.
  • a DMSO dilution series was prepared for DMSO solution.
  • DMSO alone was added to the culture medium for each cell as a dilution series or as a control with no drug added.
  • 100 ⁇ l of culture medium supplemented with each drug dilution series or DMSO alone was added to the cells cultured in a 96-well dish, and further cultured for 3 days.
  • Table 1 shows the in vitro inhibitory activity of the CDK inhibitor (hereinafter referred to as Compound A) used in this Example. From Table 1, it was confirmed that Compound A inhibits the kinase activity of the CDK family at a low concentration. On the other hand, it was revealed that kinases other than the CDK family have no inhibitory activity at low concentrations. Therefore, Compound A was considered to be a CDK selective inhibitor.
  • CDKs IC50 (nM) Other kinases IC50 (nM)
  • a (final concentration: 3, 10, 30, ⁇ ) and DMSO were added to the culture medium for each cell as a non-drug control.
  • Cells were harvested after 24 hours of drug treatment.
  • Cellular The disrupted solution was separated by 7.5% SDS polyacrylamide gel electrophoresis and then transferred from the gel to an Immo bilon PVDF membrane (Millipore).
  • the PVDF membrane was immersed in a primary antibody solution containing anti- Ser780 (manufactured by cell signaling), which is a specific antibody of phosphorylated Rb protein, and permeated at 4 ° C. overnight. After infiltration, it was immersed in a secondary antibody solution containing HRP-conjugated goat antirabbit IgG and infiltrated at 4 degrees for 1 hour. After permeation, it was washed with TBS-T buffer. Thereafter, chemiluminescence was exposed to X-ray film using ECL (Amersham), and the abundance of the target antigen was examined.
  • the results are as shown in FIG.
  • the band in the gel indicates phosphated Rb protein (pRB).
  • Rb protein phosphate was decreased in a concentration-dependent manner when Compound A was treated. Therefore, it became clear that Compound A has an activity to inhibit CDK in cells.
  • Fig. 2 shows the results of examining the cell growth inhibitory activity and apoptosis-inducing activity of Compound A.
  • the cell growth inhibitory activity was determined using IC50 as the concentration at which cell growth was inhibited by 50% by Compound A.
  • Induction of apoptosis was analyzed using flow cytometry and examined by increasing the SubGl fraction.
  • IC50 in the figure indicates the cell growth inhibitory activity described above, and subGl induction indicates the rate of apoptosis induction.
  • RNA was purified from each cell line using the RNeasy total RNA isolation kit (Qiagen) and labeled with T7 RNA polymerase (Enzo Diagnostats). The labeled RNA was hybridized to a GeneChip TM (Affymetritas) HG-U95A chip containing about 12,000 human gene probe sets. The hybridization and tip washing procedures followed the Affymetritas 'fluidics' station protocol.
  • Criteria 1 Genes with 16 or more out of 20 comparisons that have higher expression in susceptible strains than resistant strains, or genes that have 16 or more outliers and higher expression in resistant strains than sensitive strains.
  • Clustering was performed using Genespring (Silicon Genetecs). Genes are clustered vertically along cell line strength. Clustering is a method of classifying patterns, in which cell lines and genes that are similar to Noturn are displayed side by side on a saddle diagram. This clustering shows that cell lines are classified into sensitive and weak groups. Based on this fact, it is considered that resistance to CDK inhibitors can be predicted by the expression levels of these genes.
  • Criterion 2 Comparison of sensitive and resistant strains derived from lung tissue: PC13 vs. NCI—H69, MSTO — 211H vs. NCI—H69, and ovary derived cell lines: PA—1 vs. SK—OV— In all three comparisons of III, expression in sensitive strains is higher than in resistant strains, and expression in genes or resistant strains is higher than in sensitive strains! ,gene.
  • the expression level of the pl8 (one of CDK inhibitors) gene was found to be higher in resistant strains than in susceptible strains.
  • the extract of each cultured cell was separated by 12.5% SDS polyacrylamide gel electrophoresis, and then transferred from the gel to Immobilon PVDF membrane (Millipore).
  • This PVDF membrane was immersed in a primary antibody solution containing anti-pl8 (manufactured by Santa Cruz Biotechnology) and permeated at 4 ° C all day and night. After infiltration, it was immersed in a secondary antibody solution containing HRP-conjugated goat antirabbit IgG and infiltrated at 4 ° C for 1 hour. After permeation, it was washed with TBS-T buffer, and then chemiluminescence was exposed to X-ray film using ECL (Amersham) to detect the location of the target antigen.
  • Fig. 4 shows the results of examining the expression levels of CDK inhibitor and phosphorylated Rb protein in cells in which apoptosis was not induced by compound A and in cells that were not.
  • PRB in the figure indicates phosphorylated Rb protein
  • ⁇ -actin is an internal standard for the amount of protein extracted from each cell used for analysis.
  • the CDK inhibitor is a tumor suppressor gene. It is known that these decreased expression causes cells to proliferate and lead to carcinogenesis. Cells that have become cancerous due to decreased expression of CDK inhibitor protein are considered to be highly sensitive to CDK inhibitors.
  • pl8 IND HeLa cells that can induce pl8 expression by Doxycycline were established. That is, pTRE2hyg FLAG-pl8 vector was introduced into HeLa cells using Funege 6. The introduced cells were cultured for 24 hours, then cultured so that the number of cells was about 1/50, and cultured for about 2 weeks in the presence of 0.3 mg Z ml hygromycin B (Invitrogen). The cells that formed colonies were isolated by the cylinder cloning method.
  • Fig. 5 shows the results of examining the correlation between the sensitivity to Compound A and the expression level of pi8 using the recombinant cells thus established.
  • the vector in the figure indicates a control cell into which pT RE2hyg FLAG— vector without the pi 8 gene inserted is shown.
  • Pl8 IND HeLa Shows a cell in which pTRE2hyg FLAG—pl8 vector is introduced into HeLa cells, and expression of pi 8 can be induced by Doxycyclin.
  • pl8 IND HeLa The expression level of pl8 was not changed by Doxycyclin in control cells (Vector). In contrast, pi8 expression was induced in pl8 IND HeLa cells when supplemented with 3 ⁇ & ⁇ ⁇ Doxycyclin. Therefore, it was confirmed that cells capable of inducing pl8 expression (pl8 IND HeLa) could be established.
  • pl6 and p27 overexpression was achieved by transfecting HCT116 cells with a viral vector incorporating the pl6 or p27 gene, and comparing it with a cell transfected with a viral vector incorporating lacZ (control).
  • Genes that altered expression by were examined at four time points of 24, 36, 48 and 72 hr.
  • Comparison analysis of Affymetrix Microarray 3 ⁇ 4uite version o. 0 (LreneChip Software MAS—5.0) was used for the 7th time of Fold change.
  • GeneChip Software is used to measure gene expression by microarray. The information "Signal”, Detection call "is calculated for each probe set.
  • genes that increase in expression in 48 to 72 hr are in the first quadrant (both X and y are positive values), and genes that decrease in expression in 24 to 36 hr are in the second quadrant (X Is negative, y is positive), gene expression is decreased in 48-72hr in the third quadrant (negative values for both x and y), and gene expression is increased in 24-36hr Gathered in the fourth quadrant.
  • genes whose expression changes due to CDK4 inhibition can be classified into four groups according to their expression change patterns.
  • FIG. 8 shows the expression change when comparing the transfected cells with the cells transfected with the virus vector containing pl6 or p27.
  • Figure 8 shows that the decrease in the expression of the selected gene is greater for p27 than for pl6. In other words, pl6 and p27 have different effects on gene expression.
  • GeneSpring 6 was used to calculate hierarchical clustering and display it on a graphical display. Normalize the log2 ratio value calculated when comparing cells overexpressing pl6 or p27 with cells overexpressing lacZ so that the average is 0 and the variance is 1 for each gene. The value was used in the calculation of hierarchical clustering. Pearson's correlation coefficient was applied to the distance function.
  • FIG. 8 shows the result of applying clustering. From FIG. 8, changes in expression along the time series were confirmed only in cells overexpressing p27. In addition, in cells overexpressing pl6, no change in expression occurred in some of the cells, whereas in cells overexpressing p27, expression occurred at all time points of 24, 36, 48 and 72 hr. A cluster with a decreased number was confirmed (cluseter no. 125 in Fig. 9). When I saw Yokota in the cluster, I found many genes related to M-phase speciiic microtubule proces s. Details of these genes are shown in Table 7.
  • the gene and drug sensitivity prediction method of the present invention makes it possible to predict susceptibility to a CDK4 inhibitor, in particular, drug resistance, based on the expression level of the pl6, pl8, or p27 gene. This is based on the measurement of the expression of pl6, pl8 or p27 gene in the test tissue, such as blood isolated from the test subject's test cells, and predicts the sensitivity and efficacy of the CDK4 inhibitor to be administered. Can be used for so-called custom-made medicine.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

　被検組織又は被検細胞における発現量に基づいてＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性を予測するために用いる、ｐ１６遺伝子、ｐ１８遺伝子及びｐ２７遺伝子からなる群より選択される薬剤感受性予測用遺伝子を提供する。また、被検組織又は被検細胞における上記遺伝子の発現量を指標にＣＤＫ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法を提供する。

Description

明 細 書
CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法
技術分野
[0001] 本発明は、被検組織又は被検細胞における CDK4阻害剤に対する感受性を分子 レベルで測定，予測する方法に関する。また、当該測定，予測に用いる分子に関する 背景技術
[0002] 近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで理解し 、医薬の開発に応用する薬理ゲノミタス（Pharmacogenomics)が急速に進展してい る。薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できるようになれば、副作用の強い 医薬を真に薬効の期待できる患者だけに投与することや、試行錯誤的な投薬を実施 することなぐ治療の初期から適切な投薬を実施する、いわゆるオーダーメイド医療が 可能となる。その結果、患者に無用の肉体的負担を負わせることもなくなり、また、近 年高騰する傾向にある医療費の削減にも寄与することとなる。中でも、抗癌剤は非常 に強い副作用を有する場合が多ぐオーダーメイド医療が強く望まれている。
[0003] 一方、癌が生じる一因として細胞周期の異常が挙げられる。細胞周期は細胞分裂 の基本的なシステムで、細胞増殖制御におけるシグナル伝達の最終段階を担う。細 胞周期は細胞の増殖が停止している状態を GO期として、順に G1期、 S期、 G2期、 M期と進行する。 S期では DNAの複製が行われ、 M期では細胞の分裂が行われる。 細胞周期の制御には種々のタンパク質が関与する力 中でも、サイクリン— CDK(Cy clin dependent kinase)複合体が中心的な役割を果たす。すなわち、サイクリン D 力 SCDK4 (又は CDK6)と、また、サイクリン E及びサイクリン Aが CDK2とそれぞれ複 合体を形成し活性ィ匕される。活性ィ匕された複合体は Rb(Retinoblastoma)タンパク 質をリン酸ィ匕してシグナル伝達を進行せしめ、 E2F等の転写因子を活性ィ匕すること により細胞を G1期から S期へと誘導する。
[0004] ここで、 CDK4 (ヒト CDK4遺伝子のァクセッションナンバー： U37022 :配列番号 1 )は、 303アミノ酸力もなる 34kDのタンパク質であり、サイクリン Dによって活性ィ匕され 、Rbタンパク質をリン酸ィ匕することでその増殖抑制活性を中和する遺伝子として知ら れており、ある種の癌細胞で高発現しているとの報告がある（Adv. Cancer Res. 、 1996年、 68卷、 67頁)。
[0005] また、 CDKインヒビターとしては複数種が知られており、 p21と相同性のある CipZ Kipファミリーと、 pl6と相同性のある INK4ファミリーに大別される。いずれも、サイク リン一 CDK複合体のリン酸ィ匕活性を阻害し、 Rbタンパク質のリン酸ィ匕を抑制すること によって細胞周期の進行を阻害する力 CipZKipファミリーが複数のサイクリン—C DK複合体に結合しそれらを阻害するのに対し、 INK4ファミリ一は CDK4又は CDK 6にのみ結合しこれらを阻害するなど、作用機序については違いがある。
[0006] CipZKipファミリーの一つとして p27 (ヒト p27遺伝子のァクセッションナンバー： N M— 004064 :配列番号 2)が挙げられる。 p27は、増殖を停止した細胞において、サ イクリン E · CDK2複合体に結合し、その活性を阻害する約 27kDaのタンパク質とし て同定された（Genes Dev.、 1994年、 8卷、 9頁）。
[0007] また、 INK4ファミリーの例として pl6 (ヒト pl6遺伝子のァクセッションナンバー： NM —000077 :配列番号 3)や pl8 (ヒト pl8遺伝子のァクセッションナンバー： NM— 00 1262 :配列番号 4)が挙げられる。 pl6は CDK4と結合し、その活性を阻害する CD Kインヒビターとして cDNAが単離された (Nature、 1993年、 366卷、 704頁)。 pl6 は 156アミノ酸からなる 16kDaのタンパク質である。一方、 pl8は、 CDK6と相互作 用するタンパク質を酵母 Two— hybrid systemにより探索することによりクローニン グされた (Genes Dev.、 1994年、 8卷、 2939頁)。 Guanらは、 pl8が CDK6とは強 力に、 CDK4とは緩やかに相互作用する力 他の CDKとは全く相互作用しないこと を見出した。
[0008] ところで、上述したように、薬物感受性の個人差を遺伝子レベルで判断できればォ 一ダーメイド医療等が著しく進展する。このような試みはすでになされており、癌領域 においても、 DNAマイクロアレイを用いて多くの遺伝子の発現を指標に抗癌剤に対 する感受性や耐性を検討した報告があった (Cancer Res.、 2001年、 61卷、 6474 頁：非特許文献 1)。また、 John M. Mariadasonらは、 5—FU(5—Fluorouracil) 及び CPT(Camptothecin)に対する癌細胞の薬剤感受性を各種遺伝子の発現量を 指標に検討している (Cancer Res.、 2003年、 63卷、 8791頁：非特許文献 2)。 非特許文献 l : Cancer Res.、 2001年、 61卷、 6474頁
非特許文献 2 : Cancer Res.、 2003年、 63卷、 8791頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] し力しながら、非特許文献 1及び 2には、 pl6、 pl8又は p27の発現量を指標に薬 剤に対する感受性や耐性を予測できる旨の記載はなぐこれらの遺伝子の発現量と CDK4阻害剤に対する薬剤感受性や薬効との関係についても全く示唆はな力つた。
[0010] 本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、 CDK4阻害 剤の薬剤感受性の程度を予測するに際して、指標となる遺伝子を提供することを目 的とする。また、力かる遺伝子の発現量を指標に CDK4阻害剤に対する薬剤感受性 の予測方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 CDK4阻害剤とし て細胞周期を制御する分子として知られている Pl6、pl8又は p27の発現量が CDK 4阻害剤に対する薬剤感受性の有無、又はその程度を予測する際の指標となること を見出し、本発明を完成した。
[0012] すなわち、本発明は、被検組織又は被検細胞における発現量に基づいて CDK4 阻害剤に対する薬剤感受性を予測するために用いる pi 6遺伝子、 pi 8遺伝子及び p 27遺伝子からなる群より選択される薬剤感受性予測用遺伝子を提供する。 CDK4阻 害剤は、 Rbタンパク質のリン酸ィ匕を抑制することにより細胞増殖を抑制する作用があ るために、癌などの増殖性疾患の治療薬として有用であるが、反面、健常な細胞の 増殖をも抑制する副作用も有している。し力しながら、 CDK4阻害剤を患者に投薬す る前に、上記薬剤感受性予測用遺伝子を用いて薬剤感受性を予測すれば、 CDK4 阻害剤が効力ない患者への投薬を避けることができ、副作用を大幅に軽減できる。
[0013] 上記の薬剤感受性予測用遺伝子は、 pl8遺伝子であることが好ましい。 pl8遺伝 子は、 CDK4阻害剤に対する薬剤感受性と顕著に相関するため、より正確な予測が できる。 [0014] また、本発明は、被検組織又は被検細胞における発現量に基づ!/ヽて CDK4阻害 剤に対する薬剤耐性を予測するために用いる pi 6遺伝子、 pi 8遺伝子及び p27遺 伝子からなる群より選択される薬剤感受性予測用遺伝子を提供する。 CDK4阻害剤 に対する薬剤過感受性のみならず、薬剤耐性を予測する場合においても、これらの 薬剤感受性予測用遺伝子を好適に使用することができる。
[0015] さらに、本発明は、 pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p27遺伝子からなる群より選択さ れる遺伝子のアンチセンス核酸、又は、該遺伝子が発現してなるタンパク質を特異的 に認識する抗体を含有する CDK4阻害剤に対する薬剤感受性検出試薬を提供する 。上記薬剤感受性検出用試薬を用いれば、 CDK4阻害剤を患者に投薬する前に、 この薬剤に対する感受性を予測することができる。なお、 P16遺伝子が発現してなる タンパク質は配列番号 8、 pl8遺伝子が発現してなるタンパク質は配列番号 9、 p27 遺伝子が発現してなるタンパク質は配列番号 10で表される。
[0016] 上記の CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測には、 pl6遺伝子、 pl8遺伝子 及び p27遺伝子からなる群より選択される遺伝子のアンチセンス核酸からなる薬剤感 受性検出用プローブや、上記遺伝子が発現してなるタンパク質を特異的に認識する 薬剤感受性検出用抗体を用いることが好ましい。
[0017] また、本発明は、被検組織又は被検細胞における pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p2 7遺伝子力 なる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程 (測定工程)と、該遺伝子の発現量と健常組織又は健常細胞における該遺伝子の発 現量とを比較する工程 (比較工程)とを含む CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予 測方法を提供する。この方法を用いれば、 CDK4阻害剤を患者に投薬する前に、こ の薬剤に対する感受性を予測することができる。
[0018] 上記予測方法にお!、て、発現量の比較の結果、健常組織又は健常細胞における 上記遺伝子の発現より被検組織又は被検細胞における上記遺伝子の発現が低い場 合に、上記被検組織又は被検細胞は CDK4阻害剤に対する薬剤感受性が高いと判 断する工程 (高感受性判断工程)をさらに含むようにすると、上記遺伝子の発現が、 健常組織又は健常細胞と比較して被検組織又は被検細胞にぉ ヽて低 ヽ場合に、 C DK4阻害剤に対する薬剤感受性が高いと予測できる。 [0019] また、本発明は、被検組織又は被検細胞における pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p2 7遺伝子からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を検出する工程（ 検出工程)を含む CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法を提供する。この 方法を用いれば、測定工程及び比較工程が不要であるため、簡易に DK4阻害剤に 対する感受性を予測することができる。
[0020] 上記予測方法において、検出の結果、上記遺伝子が発現している場合に、上記被 検組織又は被検細胞は CDK4阻害剤に対する薬剤感受性が低いと判断する工程（ 低感受性判断工程)をさらに含むようにすると、被検組織又は被検細胞において、上 記遺伝子の発現が検出された場合に、 CDK4阻害剤に対する薬剤感受性が低いと 予測できる。
[0021] さらに、上記の薬剤感受性の予測方法において、その発現を検出する遺伝子が pi 8遺伝子であることが好ましい。 pl8遺伝子は、 CDK4阻害剤に対する薬剤感受性と 顕著に相関するため、上記予測方法においてより正確な予測ができる。
発明の効果
[0022] 本発明の CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法によれば、 CDK4阻害剤 の薬剤感受性の程度を予測するに際して、指標となる遺伝子、すなわち、 pl6、 pl8 又は p27の用途 (薬剤感受性予測用遺伝子）が提供される。また、これらの遺伝子の 発現量を指標に CDK4阻害剤に対する薬剤感受性を予測する方法が提供される。
[0023] なお、 pl6、 pl8又は p27は、それぞれが細胞周期を負に制御する因子であって、 対応する CDKのキナーゼ活性を阻害する作用を有する癌抑制遺伝子の産物である ため、その遺伝子自体を抗癌剤のターゲットにする試みはなされてきた力 これらの 遺伝子が CDKインヒビターと同じ作用を発揮する CDK4阻害剤の感受性を予測する ために利用できるとは、これまで予想することができな力つた。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]化合物 A処理による Rbタンパク質のリン酸化のレベルの変化を確認した図であ る。
[図 2]各種組織由来の培養細胞について化合物 Aによる細胞増殖の阻害とアポトー シスの誘導を比較した図である。 [図 3]各種糸且織由来の培養細胞について、これらの細胞において発現量が変化する 遺伝子をマイクロアレイにより検出し、クラスタリングした状態を示す図である。
[図 4]各種組織由来の培養細胞について、 pl8、 pl6、 p27及びリン酸化 Rbタンパク 質 (pRB)の発現量を確認した図である。
[図 5]pl8の発現が誘導された HeLa細胞において、 pl8の発現誘導を確認した図で ある。
[図 6]p 18の発現とアポトーシス誘導との関係を示す図である。
[図 7]pl6及び p27の過剰発現によって発現量が変化する遺伝子を 24、 36、 48及び 72hrの 4つのタイムポイントにおいて調べ、プロットした図である。
[図 8]pl6及び p27の過剰発現によって発現量が変化する遺伝子を 24、 36、 48及び 72hrの 4つのタイムポイントにお!/、て確認した図である。
[図 9]pl6及び p27の過剰発現によって発現量が変化する遺伝子を 24、 36、 48及び 72hrの 4つのタイムポイントにおいて検出し、クラスタリングした図である。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
[0026] まず、本発明において用いられる用語について説明する。
[0027] 「被検組織」とは、 CDK4阻害剤に対する感受性を測定すべき検体 (主としてヒト） 由来の糸且織であればその種類は特に限定されないが、分離'抽出が容易であるとの 観点から、血液であることが好ましい。血液は、血球を細胞成分、線維素原を含む血 漿を細胞外基質と考えることができため、 1つの支持組織と捉えることができる。また、 CDK4阻害剤の標的疾患は主として増殖性疾患 (癌'腫瘍、慢性関節リウマチなど） であるため、力かる疾患が生じた臓器由来の組織であることが好ま 、。
[0028] また、「被検細胞」につ 、ても、 CDK4阻害剤に対する感受性を測定すべき検体（ 主としてヒト）由来の細胞であればその種類は特に限定されないが、分離'抽出が容 易であるとの観点から、血液細胞（赤血球、白血球等の血球細胞のみならず、これら の混合物であってもよい）であることが好ましい。また、 CDK4阻害剤の標的疾患は 主として増殖性疾患 (癌 ·腫瘍、慢性関節リウマチなど)であるため、かかる疾患が生 じた組織由来の細胞であることが好ま 、。 [0029] 「CDK4阻害剤」とは、 CDK4の活性を阻害する物質であればその種類は特に限 定されず、低分子又は高分子の化合物であってもよぐタンパク質やペプチドであつ てもよい。また、低分子の生理活性物質であってもよい。このような CDK4阻害剤とし ては、具体的には、例えば、 Flavopiridol, BMS387032, R— Roscovitineが挙 げられる。
[0030] 「薬剤感受性」は、本来、性別、年齢、栄養状態、病態によって相違するものであり 、組織内の薬物濃度にも影響を受けるが、これらの要因に係わらず、薬剤を投与する 価値があるかないかを基準として感受性の程度を判断すればよい。すなわち、 pl6、 pl8又は p27遺伝子の発現量を測定し、その発現量に応じて薬剤の投与をすべきか 否かを検討することとなる。
[0031] また、薬剤感受性が変化した場合に、薬剤耐性や薬剤過感受性を示す場合がある 。薬剤耐性とは、通常、薬剤を持続的にあるいは短時間に頻回投与することによって 薬剤に対する反応性の低下が起こる現象をいう。薬剤耐性が生じる原因としては、例 えば、受容体数の減少、受容体の結合親和性の減少、情報伝達系の活性低下など が知られている。一方、薬剤過感受性とは、例えば、作用部位でのァゴ-スト濃度を 減少させておいた場合に、その後に与えられたァゴ-ストに対する反応性が著しく亢 進する現象をいう。薬剤過感受性が生じる原因としては、受容体の増加や受容体か らの情報伝達系の活性亢進などが知られて 、る。
[0032] 「薬剤感受性予測用遺伝子」とは、被検組織又は被検細胞における発現量に基づ いて CDK4阻害剤に対する薬剤感受性を予測するために用いる、 pl6、 pl8又は p2 7遺伝子をいう。
[0033] pl6、 pl8又は p27遺伝子は、背景技術の欄において説明したとおり、生体内にお いて CDKのリン酸ィ匕活性を阻害する作用を有する因子として知られている。これらの 遺伝子はいずれも、サイクリン CDK複合体に結合することにより、サイクリン CD Kが Rbタンパク質をリン酸ィ匕することを阻害する。すなわち、これらの遺伝子は Rb経 路の調節因子として機能している。これらの事実より、 pl6、 pl8又は p27遺伝子の 発現が低い細胞では、 CDKの活性が高ぐ Rb経路が活性ィ匕されていると予想され、 これらの遺伝子と CDKの活性との間には相関関係があると予想される力 CDK4阻 害剤に対する感受性と p 16、 p 18又は p 27遺伝子の発現量との間に如何なる関係が あるかについてはこれまで知見がなカゝつた。本発明者らは、 CDK4阻害剤に対する 感受性の相違に従って細胞レベル又は組織レベルで分類することにより、 CDK4阻 害剤と pl6、 pl8又は p27遺伝子の発現量との相関関係を明らかにし、薬剤感受性 予測する上記遺伝子の用途を見出した。
[0034] CDK4、 pl6、 pl8及び p27のそれぞれの遺伝子の由来となる動物種については 、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ィヌ、ゥサギが例 示できるが、中でも、ヒトであることが好ましい。
[0035] 本発明においては、 pl6、 pl8又は p27遺伝子の用途を開示している力 CDK4 阻害剤に対する薬剤感受性を調べる用途に特に好ましいのは、 p 18遺伝子である。 その発現量と薬剤感受性との関係が顕著だ力 である。
[0036] CDK4阻害剤に対する「薬剤感受性検出用プローブ」は、 pi 6遺伝子、 pi 8遺伝 子及び P27遺伝子力もなる群より選択される遺伝子のアンチセンス核酸のことであつ て、その用途が CDK4阻害剤に対する薬剤感受性を調べるために用いるものである
[0037] 上記アンチセンス核酸は、被検組織又は被検細胞で発現する pl6遺伝子、 pl8遺 伝子及び P27遺伝子の mRNAをそれぞれ特異的に認識することができれば、遺伝子 の全長又はその一部の配列のアンチセンス核酸であってもよぐ DNAと RNAのいず れであってもよい。ノーザンブロッテイングや in situノヽイブリダィゼーシヨン等のハイ ブリダィゼーシヨン法により上記遺伝子の mRNAを検出する場合は、通常、 100 bp 以上の長さのアンチセンス核酸を用いる。し力し、好ましくは、 500 bp以上であり、さ らに好ましくは 1000 bp以上である。但し、対応する mRNAを特異的に認識すること ができれば、数十 bp程度のオリゴヌクレオチドであってもよ 、。
[0038] なお、アンチセンス核酸は、 DNAであれば上記遺伝子を铸型にして PCR法により 合成することができ、 RNAの場合は、上記遺伝子を铸型に in vitro translation 法により合成できる。オリゴヌクレオチドの場合は、 DNA合成機により合成できる。
[0039] また、 pl6、 pl8及び p27を特異的に認識する抗体は、被検組織又は被検細胞で 発現する pl6、 pl8及び p27をそれぞれ特異的に認識することができれば、モノクロ ーナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。なお、上記抗体は、例え ば、上記タンパク質又はその合成ペプチドをゥサギに免疫したり、ノ、イブリドーマ法に より調製できる。
[0040] 「薬剤感受性検出試薬」は、上記アンチセンス核酸又は上記抗体を必須成分とする CDK4阻害剤に対する薬剤感受性を調べるために調製された試薬であり、上記アン チセンス核酸又は上記抗体のみ力 なるものであってもよ 、が、上記アンチセンス核 酸又は上記抗体と他の成分との混合物であることが好ま 、。このような薬剤感受性 検出試薬は、通常、中性付近の緩衝液中に、上記アンチセンス核酸又は抗体をこれ らの分解を防ぐ酵素阻害剤や還元剤と共に溶解し、その他用途によって必要な構成 成分を含有させて製造できる。
[0041] 次に、本発明の第一実施形態に係る「CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測 方法」について説明する。
[0042] 第一実施形態に係る「CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法」は、被検組 織又は被検細胞における Pl6、pl8及び p27からなる群より選択される少なくとも一 つの遺伝子の発現量を測定する測定工程と、前記遺伝子の発現量と健常組織又は 健常細胞における前記遺伝子の発現量とを比較する比較工程とを含むことを特徴と する。
[0043] 測定工程では、被検体から分離された被検組織又は被検細胞にお!、て、 pl6、 pi 8又は p27遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する力 ここで、「 少なくとも一つ」とは、 pl6、 pl8又は p27のうち、いずれか一つの遺伝子に着目して 発現量を測定してもよいし、 2つ又は 3つの遺伝子に着目して発現量を測定してもよ い。 2つ又は 3つの遺伝子に着目する場合であっても、より正確な予測を行うために は、少なくとも pl8を含んで発現量を測定することが好ましい。また、測定の方法とし ては特に制限はないが、例えば、被検組織又は被検細胞を可溶化した後、 DNAマ イクロアレイ等で分析することによりこれらの遺伝子の発現量を測定することができる
。また、上記遺伝子の翻訳産物を検出する場合には、例えば、ウェスタンブロッテイン グにより翻訳産物の発現量を調べることができる。
[0044] 比較工程では、測定工程で測定した被検組織又は被検細胞における pl6、 pl8又 は p27遺伝子の発現量と、健常人力も分離した健常組織又は健常細胞における pl6 、 pl8又は p27遺伝子の発現量とを比較する。比較の方法としては特に制限はない 1S 具体的には、例えば、 DNAマイクロアレイであればアレイ上の蛍光強度を定量し たり、ウェスタンブロッテイングであれば、検出されたバンドをデンシトメーター等で数 値化することにより比較すればよい。
[0045] 第一実施形態においては、前記の測定工程及び比較工程に加え、さらに高感受 性判断工程を含んでいてもよい。高感受性判断工程は、発現量の比較の結果、健常 組織又は健常細胞における pl6、pl8又は p27遺伝子の発現より被検組織又は被 検細胞における当該遺伝子の発現が低 ヽ場合に、被検組織又は被検細胞は CDK 4阻害剤に対する薬剤感受性が高いと判断する工程である。
[0046] 高感受性判断工程では、比較工程で遺伝子の発現量を比較した結果、被検組織 又は被検細胞における遺伝子の発現が健常組織又は健常細胞と比較して低い場合 に、当該被検組織又は被検細胞を分離した被検体は CDK4阻害剤に対して感受性 が高いと予測できる。
[0047] 次に、本発明の第二実施形態に係る「CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測 方法」について説明する。
[0048] 第二実施形態に係る「CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法」は、被検組 織又は被検細胞における Pl6、pl8及び p27からなる群より選択される少なくとも一 つの遺伝子の発現を検出する検出工程を含むことを特徴とする。
[0049] 本発明の第一実施形態に係る CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法は、 被検組織又は被検細胞と、健常組織又は健常細胞とにおける Pl6、 pl8及び p27遺 伝子の発現量を比較することにより、 CDK4阻害剤に対する感受性の程度を予測す るものである。しかしながら、これらの遺伝子は健常組織との比較のみならず、単に発 現の有無を確認するだけで CDK4阻害剤に対する感受性の程度を判断することが できる。すなわち、第二実施形態に係る予測方法においては、感受性の高い組織' 細胞は上記遺伝子 (特に P18)の発現が低いか、全く発現していない傾向にある。従 つて、上記遺伝子の発現を調べた結果、全く発現が検出できな力つた場合あるいは 発現が検出できたが、その発現量が著しく低い場合には、 CDK4阻害剤に対する感 受性が高いものと予測できる。
[0050] ここで、 pl6、 pl8及び p27遺伝子の発現を検出する方法としては特に制限はない 力 具体的には、例えば、被検組織又は被検細胞を可溶化した後、 DNAマイクロア レイ等で検出することができる。また、上記遺伝子の翻訳産物を検出する場合には、 例えば、ウェスタンブロッテイングにより翻訳産物の発現の有無を調べることができる
[0051] 第二実施形態では、被検体から分離された被検組織又は被検細胞にお！ヽて、 pl6 、 pl8又は p27遺伝子のうちの少なくとも一つの遺伝子の発現を検出する力 ここで、 「少なくとも一つ」とは、 ρ16、 ρ18又は ρ27のうち、いずれか一つの遺伝子に着目し て発現量を測定してもよいし、 2つ又は 3つの遺伝子に着目して発現量を測定しても よい。 2つ又は 3つの遺伝子に着目する場合であっても、より正確な予測を行うために は、少なくとも 18を含んで発現量を測定することが好ま 、。
[0052] 第二実施形態においては、前記の検出工程に加え、さらに低感受性判断工程を含 んでいてもよい。低感受性判断工程は、検出の結果、前記遺伝子が発現している場 合に、前記被検組織又は被検細胞は CDK4阻害剤に対する薬剤感受性が低いと判 断する工程である。
[0053] 低感受性判断工程を実施することにより、検出工程で遺伝子の発現が検出された 場合に、当該被検組織又は被検細胞を分離した被検体は CDK4阻害剤に対して感 受性が低いと予測できる。
[0054] 以上説明したような本発明の薬剤感受性予測用遺伝子及び薬剤感受性の予測方 法により、 CDK4阻害剤に対する感受性、中でも薬剤耐性に関する知見を pl6、 pi 8又は p27遺伝子の発現量に基づいて予測することが可能となる。これは、被検体か ら分離された血液等の被検組織 ·被検細胞中の p 16、 p 18又は p27遺伝子の発現を 測定するだけで、投与しようと考える CDK4阻害剤に対する感受性や薬効を予測す ることが可能となり、いわゆるオーダーメイド医療が可能となることを意味するものであ る。
実施例
[0055] 実施例 1： CDK4阻害剤耐性実験 (プラスミドの構築）
pl8遺伝子は HeLa細胞の cDNAを铸型にして PCR法により増幅した。増幅した p 18遺伝子は TOPO TA cloning kit (Invitrogene社製)により pCR 2. 1— TO PO vectorに挿入し、発現ベクターを構築した。
[0056] また、 pTRE2hyg FLAG—pl8 vectorは、 FLAG遺伝子と pl8遺伝子を pTR
E2hyg vectorに挿入することにより構築した。
[0057] (細胞培養の方法）
全ての臨床分離癌細胞株は 37°Cで 5%CO存在下、飽和水蒸気の環境にて培養
2
した。また、 HCT116、 SCC— 25、 PA— 1及び U— 118MGは 10%牛胎児血清添 加 D— MEM培地 (GIBCO社製)を用いて培養した。また、 PC13、 MSTO— 211H 、 BxPC - 3及び NCI - H69は 10%牛胎児血清添加 RPMI 1680(IWAKI社製)を 用いて培養した。また、 SK—OV— 3は 10%牛胎児血清添カ卩 McCoy' s 5a medi urn (GIBCO社製)を用いて培養した。さらに、 J82は 10%牛胎児血清添加 MEM medium(GIBCO社製）を用いて培養した。また、 HeLa Tet— On cellsは Clonte ch社より購入し、 10% Tet System Approved Fetal Bovine Serum (Clon tech社製)添カ卩 DMEM medium(GIBCO社製)を用いて培養した。
[0058] (Cdk4阻害作用）
(1)サイクリン D2— Cdk4の精製
まず、 Cdk4及びその活性化因子サイクリン D2とグルタチオン Sトランスフェラーゼ 融合体の cDNAをバキュロウィルス発現ベクターに組み込み、組み換えバキュロウィ ルスを作製した。作製したバキュロウィルスを昆虫細胞 Sf 9に感染させてサイクリン D 2とダルタチオン Sトランスフェラーゼ融合体—Cdk4活性複合体として高発現させた 。その細胞を回収して可溶ィ匕した後、活性複合体をダルタチオンセファロースに吸着 させ、サイクリン D2— Cdk4複合体をプレシジョンプロテアーゼにて回収し、 HPLC力 ラムクロマトグラフィーで精製した（EMBO J.、 1996年、第 15卷、 7060— 7069頁
) o
[0059] (2)サイクリン D2— Cdk4の活性測定
サイクリン D2— Cdk4の活性測定において、基質は RBタンパク質のアミノ酸 775番 力ら 787番に相当する合成ペプチド（ Arg - Pro - Pro - Thr - Leu— Ser— Pro— I le— Pro— His— lie— Pro— Arg :配列番号 5)を用いた（EMBO J.、 1996年、第 15卷、 7060— 7069頁）。
[0060] 反応は北川らの方法（Oncogene、 1992年、第 7卷、 1067— 1074頁）を一部改 変して行った。反応液量は 21. 1 μ 1で、反応バッファー（Rバッファー）の組成は 20m M トリス—塩酸バッファー（pH7. 4) /10mM 塩化マグネシウム /4. 5mM 2— メルカプトエタノール/ ImM エチレングリコールビス（ベータ アミノエチルエーテ ル） N, N, Ν' , Ν，一テトラァセチックアシッド（EGTA)とした。 Rバッファーに精製 したサイクリン D2— Cdk4、 100 molの基質ペプチド、 50 molの非標識アデノシ ン三リン酸 (ATP)及び 1 μ Ciの [ガンマ—33 Ρ]標識 ATP (2000—4000CiZmmol ：第一化学薬品社製)を添加して、 30°Cで 45分間反応させた。その後、 10 1の 350 mMリン酸バッファ—を反応系に添カ卩して反応を停止させた。基質ペプチドを P81ぺ パーフィルター 96ゥエルプレートに吸着させた後、 75mMリン酸バッファーで数回 洗浄し、その放射活性を液体シンチレ―シヨンカウンタ―で測定した。
[0061] 被検化合物の反応系への添加は、まず化合物のジメチルスルホキシド（DMSO) 希釈系列を調製し、それを 1. 1 μ 1加えることで行った。反応系へ DMSOを 1. 1 μ 1 加えたものを対照とした。
[0062] (Cdk6阻害作用）
(1)サイクリン D2— Cdk6の精製
Cdk6及びその活性ィ匕因子サイクリン D2とダルタチオン Sトランスフェラーゼ融合体 の cDNAをバキュロウィルス発現ベクターに組み込み、組み換えバキュロウィルスを 作製した以外は、サイクリン D2— Cdk4の場合と同様の方法で行った。
[0063] (2)サイクリン D2— Cdk6の活性測定
[0064] サイタリン D2— Cdk4に代えてサイタリン D2— Cdk6を用 V、た以外はサイタリン D2
— Cdk4の場合と同様の方法で行った。
[0065] (Cdk2阻害作用）
(1)サイクリン A— Cdk2の精製
Cdk2及びその活性ィ匕因子サイクリン Aとダルタチオン Sトランスフェラーゼ融合体の cDNAをバキュロウィルス発現ベクターに組み込み、組み換えバキュロウィルスを作 製した以外はサイクリン D2— Cdk4の場合と同様の方法で行った。
[0066] (2)サイクリン A— Cdk2の活性測定
サイタリン A - Cdk2の活性測定は、基質として合成ペプチド (Ala - Lys— Ala— L ys - Lys - Thr - Pro - Lys - Lys - Ala - Lys - Lys：配列番号 6)を用い、サイタリ ン D2 - Cdk4に代えてサイクリン A— Cdk2を用 、た以外は、サイタリン D2— Cdk4 の活性測定の場合と同様の方法で行った。
[0067] (Cdkl阻害作用）
(1)サイクリン B— Cdklの精製
Cdklとダルタチオン Sトランスフェラーゼ融合体及びその活性ィ匕因子サイクリン Bの cDNAをバキュロウィルス発現ベクターに組み込み、組み換えバキュロウィルスを作 製した以外はサイクリン D2— Cdk4と同様の方法で行った。
[0068] (2)サイクリン B— Cdklの活性測定
サイクリン A— Cdk2に代えてサイクリン B— Cdklを用いた以外はサイクリン A— Cd k2の活性測定と同様の方法で行った。
[0069] (Cdk7阻害作用）
(1)サイクリン H— Cdk7の精製
Cdk7及びその活性ィ匕因子サイクリン Hとダルタチオン Sトランスフェラーゼ融合体 の cDNAをバキュロウィルス発現ベクターに組み込み、組み換えバキュロウィルスを 作製した以外はサイクリン D2— Cdk4と同様の方法で行った。
[0070] (2)サイクリン H— Cdk7の活性測定
サイタリン H - Cdk7の活性測定にぉ 、て、基質として合成ペプチド (Tyr— Ser— P ro— Thr— ¾er— Pro— Thr— Tyr— ¾er— Pro— Thr— ¾er— Pro— Thr— Tyr- ^er— Pro— Thr— Ser— Pro— Thr— Tyr— ¾er— Pro— Thr— ¾er— Pro— Thr: 配列番号 7)を用い、サイクリン D2 - Cdk4に代えてサイクリン H - Cdk7を用 ヽた以 外はサイクリン D2— Cdk4の活性測定と同様の方法で行った。
[0071] (細胞増殖抑制作用の測定）
細胞増殖抑制作用は、 sulforhodamine B dye -staining methodにより測定 した。それぞれの細胞を生細胞数として 2 X 103個含むそれぞれの細胞の培養用培 地 100 1ずつを 96ゥエル細胞培養用ディッシュに分注し、一晩培養した。翌日、ィ匕 合物の DMSO溶液力も DMSOによる希釈系列を調製した。次いでその希釈系列を あるいは薬剤非添加対照用として DMSOのみをそれぞれの細胞の培養用培地に添 カロした。最後に、 96ゥエルディッシュで培養した細胞に、各薬剤の希釈系列あるいは DMSOのみを添カ卩した培養用培地を 100 μ 1ずつ添カ卩し、さらに 3日間培養した。
[0072] 各ゥエルに WTS— 8 (キシダイ匕学 (株)社製)を 20 1ずつ加えてさらに 2時間培養 したのち、 650nmを参照波長として 450nmにおける光学濃度を測定して、対照群と 比較した。化合物 Aにより細胞増殖が 50%阻害される濃度を IC50として値を求めた
[0073] 本実施例で使用した CDKインヒビター（以下化合物 Aと記す）の in vitroにおける 阻害活性を表 1に示す。表 1より、化合物 Aは CDK familyのキナーゼ活性を低濃 度で阻害することが確認できた。それに対して、 CDK family以外のキナーゼに対 しては低濃度では阻害活性を持たないことが明らかとなった。従って、化合物 Aは C DK選択的な阻害剤であると考えられた。
[0074] [表 1]
CDKs IC50 (nM) Other kinases IC50 (nM)
CDK4 10 ERK1 >1000
CDK6 13 ERK2 >1000
CDK2 16 PKA >1000
CDC2 13 PKC >1000
CDK7 16
[0075] また、 CDKの細胞内の基質である Rbタンパク質のリン酸ィ匕に対する化合物 Aの効 果についても検討した。
[0076] すなわち、薬剤処理時の Rbタンパク質のリン酸化状態を、リン酸化 Rbタンパク質を 特異的に認識する抗体を用いたウェスタンブロッテイングにより調べた。
[0077] まず、細胞を 6ゥエル細胞培養用ディッシュに分注し、一晩培養した。翌日、化合物
A (最終濃度： 3、 10、 30、 ΙΟΟηΜ)と薬剤非添加対照用として DMSOをそれぞれの 細胞の培養用培地に添加した。 24時間薬剤処理した後、細胞を回収した。細胞の 破砕液を 7. 5% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離後、ゲルから Immo bilon PVDF膜 (Millipore社製)へ転写した。この PVDF膜を、リン酸化 Rbタンパク 質の特異的抗体である anti— Ser780(cell signaling社製)を含む一次抗体液に浸 し、 4度で一昼夜浸透した。浸透後、 HRP— conjugated goat antirabbit IgGを 含む二次抗体液に浸し、 4度で 1時間浸透した。浸透後、 TBS— T bufferにより洗 浄した。その後、 ECL(Amersham社製)を用いて化学発光を X線フィルムに感光さ せて、目的抗原の存在量を調べた。
[0078] その結果は、図 1に示したとおりである。ゲル中のバンドは、リン酸ィ匕した Rbタンパク 質 (pRB)を示す。これより、薬剤非添加対照用の DMSO処理した細胞中の Rbタン パク質と比較して、化合物 A処理時には濃度依存的に Rbタンパク質のリン酸ィ匕が低 下した。従って、化合物 Aは細胞内でも CDKを阻害する活性を持つことが明らかとな つた o
[0079] (アポトーシスの検出方法）
アポトーシスの誘導はフローサイトメトリーを用いて解析し、 SubGl分画の増加によ り調べた。それぞれの細胞を 6ゥエル細胞培養用ディッシュに分注し、一晩培養した 。翌日、化合物 Aと薬剤非添加対照用として DMSOをそれぞれの細胞の培養用培 地に添カ卩した。 3日間の薬剤処理後、細胞を回収した。細胞の DNAを Cycle TES TTM PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson社製)により染色し、フ ローサイトメトリーを用いて解析した。
[0080] 化合物 Aの細胞増殖阻害活性、及びアポトーシス誘導活性を調べた結果を図 2に 示す。細胞増殖阻害活性は化合物 Aにより細胞増殖が 50%阻害される濃度を IC50 として値を求めた。また、アポトーシスの誘導はフローサイトメトリーを用いて解析し、 S ubGl分画の増加により調べた。図中の IC50は、上記の細胞増殖阻害活性を示し、 subGl inductionは、アポトーシスの誘導の割合を示す。
[0081] 化合物 Aの IC50は様々な細胞に対して同程度であった。それに対して、化合物 A によるアポトーシスの誘導は細胞ごとに異なる値を示した。このことから、化合物 Aは 幅広い細胞に対して同様な増殖阻害活性を持つが、増殖阻害後にアポトーシスを誘 導される細胞とされない細胞があることが明らかとなった。 [0082] (マイクロアレイによる遺伝子発現解析）
各細胞株から、 RNeasyトータル RNAアイソレーション 'キット（キアゲン社製）を用い てトータル RNAを精製し、 T7 RNAポリメラーゼ (ェンゾ .ダイァグノステイタス社製） でピオチン'ラベルをした。ラベルした RNAを、ヒト遺伝子プローブセット約 12, 000 個を含む GeneChipTM (ァフィメトリタス社製） HG— U95Aチップにハイブリダィズ した。ハイブリダィゼーシヨン及びチップ洗浄の方法は、ァフィメトリタス 'フルイデイク ス 'ステーションのプロトコールに従った。
[0083] CDK阻害剤に対する耐性の予測に有用な遺伝子を発見するため、 CDK阻害剤 によるアポトーシスを起こしやすい細胞株と起こしにくい細胞株の間で、発現量に違 いのある遺伝子を探索した。薬剤感受性株 5種（BxPC III、 MSTO— 211H、 PA —1、 SCC— 25、及び 1^13)と薬剤而ォ性株4種（31^—0¥—111、 NCI— H69、 U1 18— MG、及び J82)の間で 20通りの総当り比較を行い、次の基準を満たす遺伝子 を、感受性株と耐性株で発現量に差のある遺伝子として抜き出した。それぞれの組 み合わせでの比較には、 Microarray Analysis Suite (マイクロアレイ'アナリシス 'スイート:ァフィメトリタス社製)を用いた。遺伝子の選択の基準として、以下の基準 1 を設けた。
[0084] 基準 1 : 20通りの比較のうち 16通り以上で感受性株での発現が耐性株より高い遺 伝子、又は 16通り以上で耐性株での発現が感受性株より高 、遺伝子。
[0085] この基準を満たす遺伝子は 87個あり、これらの遺伝子を使ってクラスタリングを行つ た（図 3)。クラスタリングは、ジーンスプリング (シリコン'ジエネテイクス社製)を用いて 行った。縦に細胞株力 横に遺伝子がクラスタリングされている。クラスタリングは、パ ターンを分類する方法で、ノターンの似ている細胞株どうし、遺伝子どうしが榭形図 上で近くに並んで表示される。このクラスタリングでは、細胞株が、感受性の強いダル ープと弱いグループに分類されていることがわかる。このこと力 、これらの遺伝子の 発現量で、 CDK阻害剤に対する耐性を予測することが可能であると考えられる。
[0086] しかし、この条件だけでは、感受性株と耐性株で発現量に差のある遺伝子でなぐ 組織特異的に発現している遺伝子が選ばれる可能性がある。例えば、耐性株に胃由 来の細胞が多ぐ感受性株に肺由来の細胞が多いと、薬剤耐性に関連のある遺伝子 でなぐ組織特異的に発現している遺伝子が選ばれる。そこで、 87個のうちさらに次 の基準 2を満たす遺伝子を選んだ。
[0087] 基準 2 : 肺組織由来の感受性株対耐性株の比較: PC13対 NCI— H69、MSTO — 211H対 NCI—H69、及び、卵巣由来の細胞株の比較： PA— 1対 SK—OV—III の 3通りの比較全てにぉ 、て感受性株での発現が耐性株より高!、遺伝子、又は耐性 株での発現が感受性株より高！、遺伝子。
[0088] その結果、感受性株で耐性株より高い発現を示す遺伝子が 15個、耐性株の方が 感受性株より高い発現を示す遺伝子が 27個見出された (表 2)。これらの中には、細 胞周期'伸長、シグナル伝達、転写制御などに関与する遺伝子が含まれており、これ らの発現の違いが、薬剤耐性の違いの原因になっていることが考えられる。特に、 CD
Kとの関連が深い遺伝子として、 pl8 (CDKインヒビターの 1つ）遺伝子の発現力 感受 性株より耐性株で高 ヽことが明らかとなつた。
[0089] [表 2]
〔〕
Figure imgf000020_0001
各培養細胞の抽出液を 12. 5% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離 後、ゲルから Immobilon PVDF膜 (ミリポア社製)へ転写した。この PVDF膜を anti — pl8(サンタクルーツ バイオテクノロジー社製)を含む一次抗体液に浸し、 4°Cで一 昼夜浸透した。浸透後、 HRP— conjugated goat antirabbit IgGを含む二次抗 体液に浸し、 4°Cで一時間浸透した。浸透後、 TBS— T bufferにより洗浄し、その 後、 ECL (アマシャム社製)を用いて化学発光を X線フィルムに感光させて、目的抗原 の存在位置を検出した。
[0091] 化合物 Aによりアポトーシスが誘導される細胞とされない細胞の中における、 CDK インヒビター及びリン酸化 Rbタンパク質の発現量を調べた結果を図 4に示す。図中の pRBは、リン酸化 Rbタンパク質を示し、 β— actinは、解析に用いた各細胞カゝら抽出 したタンパク量の内部標準である。
[0092] ここで、 CDKインヒビターは癌抑制遺伝子である。これらの発現低下により細胞は 過増殖を起こし、発癌に至ることが知られている。 CDK阻害タンパクの発現低下によ り癌化した細胞は、 CDK阻害剤に対して感受性が高いと考えられている。
[0093] この結果から、 CDK阻害剤によりアポトーシスが誘導される細胞に共通して、 pl8 の発現量が低いことが分かる。このことから、 pl8の発現量が低い細胞は CDK阻害 剤に感受性が高く、 p 18の発現量が高 、細胞は CDK阻害剤に感受性が低 、ことが 明らかとなった。
[0094] (プラスミド安定保持株の作成）
化合物 Aに対する感受性と pl8の発現量の相関を調べることを目的に、 Doxycycli nにより pl8の発現が誘導できる細胞 (pl8 IND HeLa)を榭立した。すなわち、 H eLa細胞に pTRE2hyg FLAG— pl8 vectorを Funege 6を用いて導入した。導 入した細胞を 24時間培養後、細胞数が約 50分の 1になるように培養し、 0. 3 mgZ ml hygromycin B (インビトロジェン社製)存在下で約 2週間培養した。コロニーを 形成した細胞を、シリンダークローユング法により単離した。
[0095] こうして榭立した組換え細胞を用いて、化合物 Aに対する感受性と pi 8の発現量の 相関を調べた結果を図 5に示す。図中の vectorは、 pi 8遺伝子を挿入していない pT RE2hyg FLAG— vectorを導入したコントロール細胞を示し、 pl8 IND HeLa は、 HeLa細胞に pTRE2hyg FLAG— pl8 vectorを導入し、 Doxycyclinにより pi 8の発現を誘導できる細胞を示す。
[0096] コントロール細胞（Vector)では Doxycyclinにより pl8の発現量が変わらなかった oそれに対して、 pl8 IND HeLa細胞では 3 μ & μ \ Doxycyclin添カ卩時に、 pi 8の発現が誘導されている。従って、 pl8の発現が誘導できる細胞 (pl8 IND HeL a)を榭立できたことが確認された。
[0097] 次に、化合物 Aに対する感受性と pl8の発現量の相関を調べた。その結果は、図 6 に示したとおりである。左側の 2つのグラフは、 Deoxycyclinを添カ卩していない細胞 についての結果であり（一Deoxycyclin)、右側の 2つのグラフは、 Deoxycyclinを 3 μ gZmlの濃度で添カ卩した細胞につ!、ての結果である（ + 3 g/ml Deoxycycli n) 0コントロール細胞（Vector)では Doxycyclinにより pl8の発現量が変わらず、ま た、化合物 Aにより誘導されるアポトーシスも変わっていない。それに対して、 pl8 I ND HeLa細胞では 3 μ & μ \ Doxycyclin添カ卩により ρ18の発現を誘導した時に 、アポトーシス誘導が 18%から 10%に抑制されていることが分かる。このことから、化 合物 Αに対する感受性と ρ 18の発現量の間に相関があることが明らかとなつた。
[0098] 以上より、 CDK阻害剤に対する感受性と pl8の発現量の間に相関があることが明 らかとなつた。従って、 pl8の発現量を調べることは、 CDK阻害剤が治療効果を発揮 する疾患 (特に、癌の種類)の探索に非常に有用であることが明らかとなった。
[0099] 実施例 2： CDK阻害蛋白質発現実験
(マイクロアレイ解析）
全ての実験には Affymetrix HG— U95 Av2 GeneChipを使用した。
[0100] まず、 pl6又は p27遺伝子を組み込んだウィルスベクターを HCT116細胞にトラン スフエクシヨンさせ、 lacZを組み込んだウィルスベクターをトランスフエクシヨンさせた細 胞 (コントロール）と比較することで、 pl6及び p27過剰発現により発現を変化させる 遺伝子を 24、 36、 48及び 72hrの 4つのタイムポイントにおいて調べた。 Fold chan geを U疋する 7こめに、 Affymetrix Microarray ¾uite version o. 0 (LreneC hip Software MAS— 5. 0)の Comparison Analysisを用いた。ここで、マイクロ アレイによって遺伝子の発現量を測定する際に GeneChip Softwareを用いると、 " Signal"ど， Detection call"という情報がそれぞれのプローブセットに対して算出さ れる。パーフェクトマッチのプローブセットで検出された発現量がそれと対になってい るミスマッチプローブセットで検出された発現量を p— valueO. 04未満で上回ってい る場合には" Detection call"に，， present"(P)の値がつけられる。一方、 p— value が 0. 04から 0. 06の間である場合には" marginal" (M)が、 0. 06以上である場合 には" absent" (A)の値がつけられる。 GeneChip Softwareの Comparison An alysisを用いると、 2つのサンプル間での遺伝子発現量の違いを測定し、 "Signal L og Ratio" (log2 fold change)と" Change call'，という値が算出される。 " Chan ge call'，の値とし 丄 ncrease" (I) , "Decrease" (D) , 'Marginal Increase/Dec rease" (MI/MD)及び" NO Change" (NC)の 5つの値が与えられる。
[0101] 今回の実験では、まず CDK4阻害の影響によって発現を変化させる遺伝子を抽出 するために、次の基準を使用した。
[0102] (a) : 4つのタイムポイントのうち、いずれか一つ以上のポイントにおいて、 pl6及び p27過剰発現細胞とコントロールを比較した際の" Signal Log Ratio"が 0. 6以上 で、，， Change call"が "I"又は" MI，，、若しくは、" Signal Log Ratio"が 0. 6以下 で、 "Change call"カ 'D"又は" MD"である。
[0103] (b)： pl6を過剰発現させた細胞と、 lacZをトランスフエタトした細胞での" Detecti on call"が総で ' A"ではない。
[0104] (c)： p27を過剰発現させた細胞と、 lacZをトランスフエタトした細胞での" Detecti on call"が全てのタイムポイントにおいて" A"のものは除く。
[0105] 次に、 CDK2阻害の影響によって発現を変化させる遺伝子を抽出するために、次 の基準を使用した。
[0106] (a) : p27を過剰発現させた細胞とコントロールを比較した際の" Signal Log Ra tio"が、いずれか一箇所のタイムポイントにおいて、 0. 6以上で" Change call'，が" I "又は" ΜΓ，、若しくは 0. 6以下で、" Change call'，が" D"又は" MD"である。
[0107] (b)： pl6を過剰発現させた細胞とコントロールを比較した際の" Signal Log Ra tio"が全てのタイムポイントにおいて、 0. 3以上、 0. 3以下である。
[0108] (c)： p27を過剰発現させた細胞と、 lacZをトランスフエタトした細胞での" Detecti on call"が全てのタイムポイントにおいて" A"のものは除く。
[0109] (主成分分析 (Principal Component Analysis： PCA))
統計解析ソフトウェアパッケージ S AS release 8. 2を用いて、 CDK4阻害の影響 によって発現を変化させている遺伝子として抽出されてきた遺伝子に対して主成分 分析を行なった。解析結果をグラフィカルディスプレイ上に表示させるために GeneS pirng 6を用いた。計算には log2 ratioをそのまま使用し、ノーマライズは行なわな かった。
[0110] CDK4の阻害によって 1. 5倍以上の発現変化が観察された遺伝子に対して主成 分分析を適用した結果、選ばれてきた遺伝子が、発現パターンによってどのようにグ ループ分類されるのかを調べた。
[0111] その結果を図 7に示す。図 7のグラフ中、 48〜72hrにおいて発現が増加している 遺伝子が第一象限に (X, yともに正の値）、 24〜36hrにおいて発現が減少している 遺伝子が第二象限に (Xが負で、 yが正）、 48〜72hrにおいて発現が減少している遺 伝子が第三象限に (x,yともに負の値）、 24〜36hrにおいて発現が増加している遺 伝子が第四象限に集まっていた。すなわち、 CDK4阻害によって発現変化を起こす 遺伝子を、その発現変化パターンによって 4つのグループに分類することができたこ とを示している。
[0112] また、 CDK4の阻害 (pl6、 p27の過剰発現）によって 2. 0倍以上に発現を変化さ せている遺伝子のリスト (但し、第一象限の遺伝子のみ、 1. 5倍以上）を表 3〜6に示 す。
[表 3]
塑〔
Figure imgf000025_0001
y093 〇〇 M74NE1 cclin E1
y__sat 〇〇NE1 cclin E1
vtotc ce cce miilll .pj ostuaoat0 es.58 aes 1-rnn* 3e〇〇 So G_ AYMroLENE NAME
Figure imgf000026_0001
Qypecas ad coosoe ce DNA rlinnhrmml 〔〕0115
Figure imgf000027_0001
y0806 AL14 GG ccNrolin B2
553 M27 C〇 cvclin
y_at553 M27 cclin
()tosmiin
(y)east
g_atu budd u Brolinninhibted bedaoesinzimizl
y U63374a fmilC 2
で330 X74 tdei 9akD
gp_,at3606 M7ased li DNAeedetnn>- yptotc ce ce miilll
_at _at pyecato ad c DNA rliinnhoosoe ccermml () Ώ. 3dresΦesΓ--
2rote ACC- SYMBOL GENE NAME pro be A C C SYM B O L G EN E N A M
4th Quadrant (8 probes, 8 qenes)
DNA metabolism
1916_s_at V01512 FOS v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog 3857 —at AJ223353 H2BFB H2B histone family, member B
32819_at AJ223352 H2BFT H2B histone family, member T
cell differentiation
1916_s_at V01512 FOS v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog 38489_at M60047 HBP17 heparin-binding growth factor binding protein 547_s_at S77154 NR4A2 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2 iinflammatorv response
1916_s_at V01512 FOS v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog 1 165_aT D49950 IL18 interleukin 18 (interferon-gamma-inducing factor) 547_s_at S77154 NR4A2 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2
Miscslls门 sous
38373_g_atU66042 LOC91966 hypothetical protein LOC91966
39075_aF AF040958 NEU1 sialidase 1 (lysosomal sialidase)
[0116] 第一象限において (48〜72hrで発現が増加している遺伝子群) 5つのアポトーシス 誘導関連遺伝子が観察された。 CDK4阻害による細胞周期の停止と、アポトーシス 誘導の関連は未だに明かにされていないが、これらの遺伝子が関係している可能性 がある。第二 ·第三象限においては、予想通り細胞周期関連の遺伝子が多く集まつ ていた。すなわち、 CDK4阻害による細胞周期停止と、それによつて誘導されるアポ トーシスに関連している遺伝子が抽出されていることが明ら力となった。
[0117] また、表 3〜6中に挙げた遺伝子の中で、第 2象限と第 3象限に含まれている合計 4 1個の遺伝子の log2 ratio(lacZ containing virus vector をトフンスフエクショ ンした細胞と、 pl6又は p27を含む virus vectorをトランスフエクシヨンした細胞を比 較した際の発現変化)を図 8に示す。図 8より、選択された遺伝子の発現減少が pl6よ りも p27の方が大きいことがわかる。すなわち、 pl6と p27では遺伝子発現に与える影 響が異なることが明らかとなった。
[0118] (階層的クラスタリング）
GeneSpring 6を用いて、階層的クラスタリングの計算とグラフィカルディスプレイ 上への表示を行なった。 pl6又は p27を過剰発現させた細胞と、 lacZを過剰発現さ せた細胞を比較した際に算出された log2 ratioの値を、遺伝子ごとに平均 0、分散 1 になるようにノーマライズを行い、その値を階層的クラスタリングの計算に用いた。距 離関数にはピアソンの相関係数を適用した。
[0119] CDK2の阻害によって 1. 5倍以上の発現減少がみられた遺伝子に対して、階層的 クラスタリングを適用した結果を図 8に示す。図 8より、 p27を過剰発現させた細胞内 でのみ、時系列にそった発現変化を確認できた。また、 pl6を過剰発現させた細胞 では、その一部において発現変化が全く起こっていないのに対して、 p27を過剰発 現させた細胞では 24、 36、 48及び 72hr全てのタイムポイントにおいて、発現が減少 しているクラスターが確認された (図 9の cluseter no. 125)。このクラスター内に含ま れて 、る遺 子を羊糸田に見たとこり、 M— phase speciiic microtubule proces s関連の遺伝子が多く含まれていた。これらの遺伝子の詳細を表 7に示す。
[0120] [表 7] cluster 125
probe ACC GENE NAME
1243_at U18300 damage-specific DNA binding protein 2, 48kDa 40690_at X54942 CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 319_g_at D64142 H1 histone family, member X
34783_s_at AF047473 BUB3 buddinguninhibited by benzimidazoles 3 homolog(yeast) 41547_aT AF047472 BUB3 buddinguninhibited by benzimidazoles 3 homolog(yeast) 33346丄 at M61764 tubulin, gamma 1
36069_at AB007925 formin binding protein 2
40841—at AF049910
Figure imgf000029_0001
transforming, acidic coiled-coil containing protein 1 712 s at HG2379-HT3997 SHMT1 serine hydroxymethyltransferase 1 (soluble) 産業上の利用可能性
[0121] 本発明の遺伝子及び薬剤感受性の予測方法により、 CDK4阻害剤に対する感受 性、中でも薬剤耐性に関する知見を、 pl6、 pl8又は p27遺伝子の発現量に基づい て予測可能となる。これは、被検体から分離された血液等の被検組織'被検細胞中 の pl6、 pl8又は p27遺伝子の発現を測定するだけで、投与しようと考える CDK4阻 害剤に対する感受性や薬効を予測することが可能となり、いわゆるオーダーメイド医 療に利用することが可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] 被検組織又は被検細胞における発現量に基づ ヽて CDK4阻害剤に対する薬剤感 受性を予測するために用いる、 pi 6遺伝子、 pi 8遺伝子及び p27遺伝子からなる群 より選択される薬剤感受性予測用遺伝子。
[2] 前記 pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p27遺伝子からなる群より選択される遺伝子が、 pl8遺伝子である、請求項 1記載の薬剤感受性予測用遺伝子。
[3] 前記薬剤感受性が薬剤耐性である、請求項 1又は 2に記載の薬剤感受性予測用 遺伝子。
[4] pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p27遺伝子からなる群より選択される遺伝子のアンチ センス核酸、又は、該遺伝子が発現してなるタンパク質を特異的に認識する抗体、を 含有する、 CDK4阻害剤に対する薬剤感受性検出試薬。
[5] pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p27遺伝子からなる群より選択される遺伝子のアンチ センス核酸カゝらなる、 CDK4阻害剤に対する薬剤感受性検出用プローブ。
[6] pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p27遺伝子からなる群より選択される遺伝子が発現し てなるタンパク質を特異的に認識する抗体力もなる、 CDK4阻害剤に対する薬剤感 受性検出用抗体。
[7] 被検組織又は被検細胞における、 pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p27遺伝子からな る群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現量を測定する工程と、
該遺伝子の発現量と健常組織又は健常細胞における該遺伝子の発現量とを比較 する工程と、を含む、 CDK4阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法。
[8] 発現量の比較の結果、健常組織又は健常細胞における前記遺伝子の発現より被 検組織又は被検細胞における前記遺伝子の発現が低!ヽ場合に、前記被検組織又 は被検細胞は CDK4阻害剤に対する薬剤感受性が高いと判断する工程をさらに含 む、請求項 7記載の予測方法。
[9] 被検組織又は被検細胞における、 pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p27遺伝子からな る群より選択される少なくとも一つの遺伝子の発現を検出する工程を含む、 CDK4阻 害剤に対する薬剤感受性の予測方法。
[10] 検出の結果、前記遺伝子が発現して!/ヽる場合に、前記被検組織又は被検細胞は C DK4阻害剤に対する薬剤感受性が低いと判断する工程をさらに含む、請求項 9に記 載の予測方法。
[11] 前記遺伝子カ¾ 18遺伝子である、請求項 7〜： LOのいずれか一項に記載の予測方 法。
[12] 被検組織又は被検細胞における発現量に基づ！ヽて CDK4阻害剤に対する薬剤感 受性を予測するための、 pl6遺伝子、 pl8遺伝子及び p27遺伝子からなる群より選 択される遺伝子の使用。
PCT/JP2005/014123 2004-08-02 2005-08-02 Ｃｄｋ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法 WO2006013862A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002575986A CA2575986A1 (en) 2004-08-02 2005-08-02 Method of assuming drug sensitivity to cdk4 inhibitor
US11/659,258 US20090081645A1 (en) 2004-08-02 2005-08-02 Method of assuming drug sensitivity to cdk4 inhibitor
JP2006531495A JPWO2006013862A1 (ja) 2004-08-02 2005-08-02 Ｃｄｋ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法
EP05768326A EP1788083A4 (en) 2004-08-02 2005-08-02 METHOD FOR ASSESSING SENSITIVITY TO A MEDICINAL AS A CDK4 INHIBITOR

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004226033 2004-08-02
JP2004-226033 2004-08-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006013862A1 true WO2006013862A1 (ja) 2006-02-09

Family

ID=35787145

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/014123 WO2006013862A1 (ja) 2004-08-02 2005-08-02 Ｃｄｋ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20090081645A1 (ja)
EP (1) EP1788083A4 (ja)
JP (1) JPWO2006013862A1 (ja)
CA (1) CA2575986A1 (ja)
WO (1) WO2006013862A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019512021A (ja) * 2016-02-23 2019-05-09 ザ リサーチ ファウンデーション フォー ザ ステイト ユニバーシティ オブ ニューヨーク Ｃｄｋ４活性のマーカーとしてのｐ２７チロシンリン酸化およびそれを使用するための方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9336302B1 (en) 2012-07-20 2016-05-10 Zuci Realty Llc Insight and algorithmic clustering for automated synthesis
US9880150B2 (en) 2015-01-28 2018-01-30 Thomas Jefferson University E2F reporter melanoma cells
US11205103B2 (en) 2016-12-09 2021-12-21 The Research Foundation for the State University Semisupervised autoencoder for sentiment analysis
EP3676404A1 (en) * 2017-08-31 2020-07-08 Novartis AG Methods of selecting a treatment for cancer patients

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002028894A1 (fr) * 2000-10-03 2002-04-11 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Gene se rapportant a la tolerance aux medicaments et utilisation associee

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030194734A1 (en) * 2002-03-29 2003-10-16 Tim Jatkoe Selection of markers
AU2004262369A1 (en) * 2003-07-29 2005-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Biomarkers of cyclin-dependent kinase modulation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002028894A1 (fr) * 2000-10-03 2002-04-11 Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. Gene se rapportant a la tolerance aux medicaments et utilisation associee

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GUAN K.L. ET AL: "Growth suppression by p18, a p16INK4/MTS1 and pl41NK4B/MTS2- related CDK6 inhibitor, correlates with wild-type pRb function.", GENES DEV., vol. 8, no. 24, 1994, pages 2939 - 2952, XP000614280 *
HAZLEHURST L.A. ET AL: "Adhesion to fibronectin via betal integrins regulates p27kipl levels and contributes to cell adhesion mediated drug resistance(CAM-DR).", ONCOGENE., vol. 19, no. 38, 2000, pages 4319 - 4327, XP001041532 *
KAWAKAMI Y. ET AL: "Adenovirus-mediated p16 gene transfer changes the sensibility to taxanes and Vinca alkaloids of human ovarian cancer cells.", ANTICANCER RES., vol. 21, no. 4A, 2001, pages 2537 - 2545, XP002991377 *
KIHARA C. ET AL: "Prediction of sensitivity of esophageal tumors to adjuvant chemotherapy by cDNA microarray analysis of gene-expression profiles.", CANCER RES., vol. 61, no. 17, 2001, pages 6474 - 6479, XP002960719 *
MARIADASON J.M. ET AL: "Gene Expression Profiling-Based Prediction of Response of Colon Carcinoma Cells to 5-Fluorouracil and Camptothecin.", CANCER RES., vol. 63, 2003, pages 8791 - 8812, XP002991378 *
POLYAK K. ET AL: "Cloning of p27Kipl, a cyclin-dependent kinase inhibitor and a potential mediator of extracellular antimitogenic signals.", CELL., vol. 78, no. 1, 1994, pages 59 - 66, XP000918944 *
POLYAK K. ET AL: "p27Kipl, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest.", GENES DEV., vol. 8, no. 1, 1994, pages 9 - 22, XP000940687 *
See also references of EP1788083A4 *
SERRANO M. ET AL: "A new regulatory motifin cell-cycle control causing specific inhibition of cycling D/CDK4.", NATURE., vol. 366, no. 6456, 1993, pages 704 - 707, XP002008795 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019512021A (ja) * 2016-02-23 2019-05-09 ザ リサーチ ファウンデーション フォー ザ ステイト ユニバーシティ オブ ニューヨーク Ｃｄｋ４活性のマーカーとしてのｐ２７チロシンリン酸化およびそれを使用するための方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2575986A1 (en) 2006-02-09
JPWO2006013862A1 (ja) 2008-05-01
EP1788083A4 (en) 2008-08-13
US20090081645A1 (en) 2009-03-26
EP1788083A1 (en) 2007-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Du et al. The LPS-inducible lncRNA Mirt2 is a negative regulator of inflammation
Bhatt et al. MicroRNA-34a is induced via p53 during cisplatin nephrotoxicity and contributes to cell survival
Kulkarni et al. RUNX1 and RUNX3 protect against YAP-mediated EMT, stem-ness and shorter survival outcomes in breast cancer
Ramírez-Valle et al. eIF4GI links nutrient sensing by mTOR to cell proliferation and inhibition of autophagy
Wang et al. Liver tumors escape negative control of proliferation via PI3K/Akt-mediated block of C/EBPα growth inhibitory activity
Delia et al. MRE11 mutations and impaired ATM-dependent responses in an Italian family with ataxia-telangiectasia-like disorder
Su et al. Murine CD4+ CD25+ regulatory T cells fail to undergo chromatin remodeling across the proximal promoter region of the IL-2 gene
Roh et al. MD-2 as the target of nonlipid chalcone in the inhibition of endotoxin LPS-induced TLR4 activity
Heinonen et al. Tubulin‐and actin‐associating GIMAP4 is required for IFN‐γ secretion during Th cell differentiation
Shin et al. Stromal cell-derived factor-1α and macrophage migration-inhibitory factor induce metastatic behavior in CXCR4-expressing colon cancer cells
KR101870963B1 (ko) 테트라스파닌-2를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법
Zhou et al. cDNA expression analysis of a human radiosensitive-radioresistant cell line model identifies telomere function as a hallmark of radioresistance
Liu et al. Soluble histone H2AX is induced by DNA replication stress and sensitizes cells to undergo apoptosis
Kim et al. Downregulation of Polo-like kinase 1 induces cellular senescence in human primary cells through a p53-dependent pathway
Kakimoto et al. Overexpression of miR-221 in sudden death with cardiac hypertrophy patients
WO2023038027A1 (ja) セノリシス薬のスクリーニング方法及びセノリシス薬
WO2006013862A1 (ja) Ｃｄｋ４阻害剤に対する薬剤感受性の予測方法
Song et al. Gα12 regulates osteoclastogenesis by modulating NFAT c1 expression
Santini et al. Regulation of Cyp1a1 induction by dioxin as a function of cell cycle phase
McKelvey et al. RING finger E3 ligase PPP1R11 regulates TLR2 signaling and innate immunity
Abe et al. Disruption of actin dynamics regulated by Rho effector mDia1 attenuates pressure overload-induced cardiac hypertrophic responses and exacerbates dysfunction
Xu et al. Nucleoporin 35 regulates cardiomyocyte pH homeostasis by controlling Na+-H+ exchanger-1 expression
Zhang et al. CDK7/GRP78 signaling axis contributes to tumor growth and metastasis in osteosarcoma
EP1916301A1 (en) Method for evaluating compound using molecule on the rb pathway as index and molecular diagnostic method
Zhao et al. SOX2-mediated inhibition of miR-223 contributes to STIM1 activation in phenylephrine-induced hypertrophic cardiomyocytes

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006531495

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2575986

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005768326

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005768326

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11659258

Country of ref document: US