WO2005085292A2 - Procede de detection de la forme libre activable du psa et son utilisation pour le diagnostic des pathologies benignes de la prostate et de l'adenocarcinome de la prostate - Google Patents

Procede de detection de la forme libre activable du psa et son utilisation pour le diagnostic des pathologies benignes de la prostate et de l'adenocarcinome de la prostate Download PDF

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Sandrine Busseret-Michel
Colette Jolivet-Reynaud
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Biomerieux
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    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96455—Kallikrein (3.4.21.34; 3.4.21.35)

Definitions

  • the present invention relates to the diagnosis of adenocarcinomas of the prostate.
  • the subject of the invention is a method of diagnosing a benign pathology of the prostate or of an adenocarcinoma of the prostate in a patient suspected of being affected by such pathologies by using binding partners capable of recognizing this.
  • specific prostate antigen or PSA, for Prostate Specifies Antigen
  • PSA is produced by the glandular epithelium of the human prostate, probably in an inactive zymogenic form (Lundwall et al. FEBS Lett.
  • PSA is the main marker of prostate cancer, which will affect one in six men in the West during their lifetime.
  • PSA protease of the kallikrein family, mainly secreted by the prostatic epithelium, is found at a concentration of 0, 5 to 5 mg / l in the seminal fluid and at a concentration a million times lower in the serum of a patient
  • PSA is normally found at a concentration lower than 2.5 ng ml in the serum.
  • this concentration increases in principle notably during prostate cancer and during benign alterations such as benign prostatic hyperplasia (BPH) or acute prostatitis.
  • BPH benign prostatic hyperplasia
  • the protein sequence of PSA has been determined. It is a glycoprotein comprising 237 amino acids ("Molecular cloning of human prostate specifies antigen cDNA". Lundwall A., Lilja H., 1987.
  • patent application WO97 / 12245 describes a method making it possible to diagnose an adenocarcinoma of the prostate without biopsy. This method involves measuring the total amount of PSA in the patient's serum or blood. If this value is between 2.5 and 20 ng / ml, the concentration of free PSA is also measured. The free PSA to total PSA ratio is then calculated. If this ratio is less than 7%, the diagnosis is directed towards an adenocarcinoma of the prostate.
  • the use of a 7% threshold for the diagnosis of prostate cancer is controversial by many authors, as shown in the publication by Lein et al.
  • the molecular forms of serum PSA from cancer patients or of BPH were mapped by two-dimensional electrophoresis, associated with clumioluminescence detection, in order to observe all of the forms of PSA, that is to say the free forms, including cleaved forms, and complexed forms.
  • the electrophoresis profiles of sera from subjects suffering from prostate adenocarcinoma are relatively homogeneous, presenting essentially the non-cleaved free forms of PSA, while those of subjects suffering from BPH may comprise a relatively large proportion of cleaved free forms and slightly more basic spots without cleaved form.
  • the increase in the ratio of serum free PSA to total serum PSA observed in patients with BPH is therefore essentially linked to the existence of cleaved free PSA, which could be enzymatically inactive and therefore incapable of binding to ACT, as well as 'to the presence of a slightly more basic form of free PSA than the active free PSA form, which could correspond to the zymogenic, inactive form of PSA.
  • the Applicant has described methods for diagnosing prostate adenocarcinoma comprising the quantification, after separation by two-dimensional electrophoresis, of the cleaved and / or uncleaved free PSA and the use of these values in order to establish a diagnostic.
  • the subject of the present invention is a method of in vitro diagnosis of a benign pathology of the prostate or of an adenocarcinoma of the prostate, characterized in that it comprises the step of detection, in a biological sample derived from a patient suspected of having a benign prostate disease or an adenocarcinoma of the prostate, of the activatable free form of PSA.
  • the different forms of PSA present in biological fluids such as the seminal fluid or the serum of a patient have often had different names according to the authors. All agree that total PSA comes in two forms: the free form (free PSA) and the form complexed with this protease inhibitors such as TACT (complexed PSA).
  • Free PSA can also be named according to its size: when it is produced in the form of ProPSA, it has additional amino acids (7 or 5 or 4 or 2). This is called zymogenic PSA or ProPSA-7, ProPSA-5, etc.
  • This proPSA after maturation and therefore loss of its additional amino acids, can be found either in intact form or in partial form. In the latter case, we speak of truncated or cleaved PSA.
  • Free PSA in intact form can also be denatured (glycosylated or deglycosylated); we then speak of a distorted form.
  • the free PSA forms include zymogenic PSA, intact PSA, denatured or not, and cleaved PSA.
  • active form is meant the forms being capable of binding to protease inhibitors, such as TACT.
  • inactive form is meant the forms incapable of such a binding capacity.
  • this activatable free form of PSA would, after activation, be equivalent to the form of PSA which complexes with ACT.
  • This free activatable form would be a form of "closed” PSA, trapping the site of attachment to ACT, its activation making it possible to transform the "closed” form into an "open” form and thus release the site of fixation.
  • the diagnostic method of the invention can be implemented either using a binding partner capable of binding specifically to activatable free PSA, or a binding partner capable of binding to non-specifically activatable free PSA.
  • the invention relates to a method of in vitro diagnosis of a benign prostate pathology or of an adenocarcinoma of the prostate, characterized in that it comprises the steps consisting in: i) contacting a binding partner capable of binding specifically to activatable free PSA with a biological sample from a patient suspected of having a benign prostate pathology or an adenocarcinoma of the prostate, i) putting in evidence the capture of the activatable free form of PSA by said binding partner, ⁇ i) calculating the ratio between the quantity of activatable free form of PSA detected in step ii) and the quantity of a form of PSA other than the activatable free form, present in a sample of the same kind taken from the same subject and iv) determine if the patients are affected by an adenocarcinoma of the prostate or by a benign pathology of the prostate by comparing the value of the ratio determined in step i ⁇ ) with a predetermined threshold value, chosen according to the type
  • the Applicant has discovered that, unexpectedly, among the binding partners suitable for the purposes of the invention, those recognizing the epitope mimicked by the sequence SEQ ID No. 1 (DTPYPWGWLLDEGYD) were actually able to bind specifically in serum to this activatable free form of PSA without binding or to the denatured or cleaved free PSA, laughed at ProPSA, and that the use of this particular property made it possible to obtain a very sensitive and very specific prostate diagnostic method for pathologies .
  • the biological samples in which the method of the invention is implemented are any biological sample likely to contain PSA. By way of example of such samples, mention may be made of seminal fluid, blood, serum, plasma and urine, serum and plasma being particularly preferred.
  • Binding partners capable of specifically binding to activatable free PSA suitable for the purposes of the invention include, for example, antibodies, antibody fragments and mirnotopes, as well as any other partner known to those skilled in the art for having this. capacity.
  • antibody fragments is generally meant in the present application, any antibody fragment which has retained the specificity of the original antibody, in the present case the ability to bind specifically to the free activatable PSA, and in particular Fab and F (ab ') 2 fragments.
  • the word "antibody” also denotes subsequently fragments of antibodies when the sense allows.
  • the antibodies useful within the meaning of the invention include in particular purified polyclonal antibodies and monoclonal antibodies.
  • polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are widely known to those skilled in the art and the principle of this preparation is recalled below.
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunization of an animal with at least one target antigen of interest, followed by the recovery of the antibodies sought in purified form, by taking the serum from said animal, and separation of said antibodies from the other constituents of the serum, in particular by affinity chromatography on a column on lacquer, an antigen specifically recognized by the antibodies is fixed, in particular a target antigen of interest.
  • the monoclonal antibodies can be obtained by the hybridoma technique, the general principle of which is recalled below.
  • an animal generally a mouse
  • a double antigen of interest the B lymphocytes of which are then capable of producing antibodies against said antigen.
  • These antibody-producing lymphocytes are then fused with myeloma cells
  • mimotopes any synthetic or recombinant peptide capable of mimicking a conformation which interacts specifically with said epitope.
  • the binding partner capable of binding specifically to the activatable free PSA fulfills at least one of the following conditions: - it is capable of recognizing the epitope mimicked by the sequence SEQ ID No. 1. - it is an antibody or an antibody fragment.
  • the sequence SEQ ID No. 1 recognized by the appropriate binding partners for the purposes of the invention mimics a conformational epitope of PSA.
  • 1 suitable for the purposes of the invention is the antibody 5D3D11, as described in Michel S., et al., 1999, Clinical Chemistry, 45 (5): 638-650.
  • the use of this particular antibody in the process of the invention is unexpected in the sense that this article indicates that this antibody is capable of inhibiting the enzymatic activity of PSA and therefore the binding of ACT, in other words that it is only capable of adhering to an active free form of "open" PSA.
  • the Applicant has also shown that it is capable of binding to the activatable free form, that is to say "closed".
  • the conjugates consisting of the binding partner capable of binding specifically to the activatable free PSA and of the activatable free form of PSA are new and also constitute an object of the invention.
  • said binding partner capable of binding specifically to the activatable free PSA of the conjugate of the invention is a binding partner capable of recognizing the epitope mimed by the sequence SEQ ID No. 1.
  • the second step of the diagnostic method of the invention consists in demonstrating the capture of said activatable free form of PSA by said binding partner capable of specifically binding to the activatable free PSA. This step can be carried out directly by detecting the bond between said binding partner and said activatable free form of PSA, or else after elution of said activatable free form of PSA immunocaptured by said binding partner.
  • the activatable free form of PSA immunocaptured by said hedgehog partner, then eluted will be called hereinafter.
  • Immunopurified activatable free PSA The elution of the activatable free form of PSA immunocaptured by said hedge partner capable of binding specifically to the activatable free PSA can be implemented by any elution method known to those skilled in the art, such as a shock. pH. Preferably, an additive shock is used, for example using a 0.1 M glycine buffer, pH 2.8.
  • the detection of the capture of said activatable free form of PSA, whether it is irrmunopurified or not can be carried out by any detection means known in the field of immunoassays, such as direct detection and indirect detection. In the case of indirect detection, i.e.
  • a detection partner capable of adhering to the activatable free form of PSA is used.
  • This detection partner binds on an epitope different from that used by said binding partner used in step i) when the activatable free PSA is not immunopurified.
  • a suitable detection partner for this purpose there may be mentioned antibodies such as anti-total PSA antibodies, which constitutes a mode of reahsation of the invention. Examples of such anti-PSA antibodies capable of recognizing an epitope different from that used by said Haison partner used in step i) are described in the article by Michel S., et al (1999, supra). These detection partners can be previously marked.
  • the term “marking” is intended to mean the attachment of a marker capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • a non-limiting Hste of these markers consists of:
  • enzymes which produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, acetylchoHne esterase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • chromophores such as luminescent compounds, dyes,
  • radioactive molecules such as 32 P, 35 S or 125 I
  • Hgand anti-Hgand pair a group consisting of fluorescent molecules, fluorescein, rhodomine, alexa or phycocyanins, and • particles such as gold particles, magnetic latex, Hposomes.
  • Indirect labeling systems can also be used, such as, for example, through another Hgand anti-Hgand pair.
  • the Hgand / anti-Hgand pairs are well known to those skilled in the art, and the following pairs may be mentioned, for example: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, pepti.de/ antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complementary to the polynucleotide. In this case, it is the Hgand which is Hey to the partner of Haison.
  • the anti-Hgand can be directly detectable by the markers described in the preceding paragraph or be itself detectable by a Hgand / anti-Hgand. These indirect systems can lead, under certain conditions, to an amplification of the signal. This signal amplification technique is well known to the person skilled in the art. etier, and reference may be made to earlier patent applications FR98 / 10084 or WO95 / 08000 from the Applicant or to article J. Histochem. Cytochem., (1997), 45: 481-491.
  • Direct detection of the capture of the Hebre form activatable by said partner of Haison can be implementation for example by plasmon resonance or by cycH voltammetry on an electrode carrying a conductive polymer.
  • Direct detection can also be implemented using the specific property of enzymatic activity of active forms of PSA.
  • activation of the activatable Hebrew form of PSA should be carried out, if appropriate after its immunopurification.
  • the activation of this activatable Hbre form makes it possible to Hbb the Haison site to the enzyme substrate, which can then be reacted with an enzyme substrate.
  • the detection is carried out by determining the enzymatic activity of the Hbre form of the immunopurified PSA and activated, which constitutes a particular embodiment of the invention.
  • enzymatic substrates which are suitable for the purposes of the invention include all the substrates revealing the chymotrypsic type protease activity widely known to those skilled in the art. Such substrates are available for example from
  • Enzyme System Products They are composed of a recognized peptide sequence and cHvée by PSA, this sequence being coupled to a chromophore or fluorophore group.
  • the activation of the activatable Hebre form of PSA can be implemented by at least one of the following methods:
  • a miHeu of high saline concentration of at least 0.15M, preferably of at least 1M, more preferably of at most 2M, - Season of PSA Hbre activable i munopurified to an antibody capable of increasing the enzymatic activity of PSA, these two methods being able to be implemented separately simultaneously or successively in any order.
  • miHeu of high saline concentration of miHeux containing 1.5M NaCl
  • an antibody capable of increasing the enzymatic activity of PSA there may be mentioned the antibody 8G8F5 (bioMérieux, France).
  • the method of the invention is characterized in that it uses, in addition to the Haison partner capable of specifically targeting Her activable PSA, an antibody capable of increasing the enzymatic activity of PSA , and in particular the antibody 8G8F5.
  • This antibody capable of increasing the enzymatic activity of PSA can be used as a capture partner in an ELISA type assay when the Haison partner capable of specifically targeting Her activatable Hebre PSA is used to immunopurify the activatable Hebre PSA.
  • the Haison partner capable of specifically targeting the activatable Hebre PSA can also be used as a detection partner, in particular when the Haison partner capable of specifically targeting the activatable Hebre PSA is used as capture partner.
  • the conjugates consisting of the Haison partner capable of specifically Herb activating the PSA Hbre, such as a Haison partner capable of recognizing the epitope mimicked by the sequence SEQ ID No. 1, and of the activable Hbre form of the PSA, lacquer is activated, are also new and constitute a particular embodiment of the invention.
  • the Haison partners capable of being Her specifically to activatable PSA Hbre, being specifically haunted to activable PSA Hbre can be used as such or in particular in the form fixed on a solid support and / or Hes to a marker.
  • the fixation of these Haison partners on a solid support is well known.
  • the support can be reacted with any solid, biological or synthetic material, endowed with adsorbent properties or capable of fixing a coupling agent.
  • Materials are known and described in the literature.
  • the solid materials capable of fixing these partners of Haison by adsorption one will quote for example polystyrene, polypropylene, latex, etc.
  • the materials allowing to fix these partners of Haison by oovalence using a coupling agent there may be mentioned in particular dextran, ceUulose, etc.
  • the support can be presented, for example, in the form of discs, tubes, tubes, cones or plates, in particular microtiter plates.
  • the Haison of Haison partners with a marker will also allow direct detection, as described above. This marker is as previously described.
  • the method of the invention can also use a capture partner. In the first case, this capture partner is able to link to an epitope different from that recognized by the partner of Haison capabb to link to the PSA Hbre activable specifically. Examples of capture partner include anti-PSA antibodies, as described above.
  • both a capture partner and both a detection partner are used in the method of the invention to assay the Pbre HSA these partners can be activated with different epitopes, themselves being different from the epitope recognized by the Haison partner capable of specifically activating with PSA Hbre activable when PSA
  • He activatable was not immunopurified.
  • the methods implementing the various partners of the activatable form of PSA for the demonstration of the capture of the activatable Hbre form of PSA by said partner of Haison are widely known to those skilled in the art.
  • Step Hi) of the method of the invention consists in calculating the ratio between the quantity of activable Hebre form of PSA detected in stage H) and the quantity of a form of PSA other than said activatable form of the invention , present in a sample of the same nature taken from the same subject
  • sample of the same nature taken from the same subject we mean either two fractions of the same sample, or two samples from two different samples but which must be of the same kind, for example serum samples.
  • the forms other than the activatable Hbre form of PSA are in particular complexed PSA, total PSA, total PSA Hbre, zymogenic PSA Hbre, denatured PSA Hbre, PSA Hbre cHve and their associations, that is to say all active or inactive forms, Hbre or complexed, of PSA.
  • the assay of each of these different forms, in particular using specific antibodies, is known.
  • the complexed PSA is assayed for example using antibodies described in patent application WO98 / 22509.
  • the total PSA is assayed for example using antibodies described by H. Nagasaki et al. (1999), Clin. Chem. 45: 4486-496.
  • the preferred ratios being relative to the quantity of PSA Hbre activatable over the quantity of (denatured PSA Hbre + PSA Hbre cHve) or the quantity of PSA Hbre activatable over the quantity of PSA Hbre inactive.
  • the form of PSA other than the activatable Hebre form used to calculate the ratio in step (in) of the process of the invention is the form of denatured Hebre PSA + the form of PSA Hbre chvé or the form of PSA
  • the quantity of total PSA the quantity of total PSA Hbre, the quantity of complexed PSA, the quantity of zymogenic PSA Hbre, the quantity of PSA Hbre cHve, the quantity of denatured PSA H is evaluated, the amount of denatured PSA Hbre + PSA Hbre cHve, the amount of denatured PSA Hbre + zymogenic PSA Hbre and the amount of inactive PSA Hbre, or their associations, on a similar sample taken from the same subject, and
  • Step iv) of the method of the invention consists in determining whether the patients are affected by an adenocarcinoma of the prostate or by a benign pathology of the prostate by comparing the value of the ratio determined in step Hi) with a value- predetermined threshold, chosen according to the type of report used and representative of the detection limit for each pathology.
  • a value- predetermined threshold chosen according to the type of report used and representative of the detection limit for each pathology.
  • a threshold value is called either a discrete value, or an interval of values corresponding to a zone of determination. Obviously, when the measured value is included in the indeterminacy interval, or is very close to the threshold value in the case of a discrete value, one cannot definitively conclude and additional investigations should be carried out. Of course, when a threshold value has been determined for a given type of report, it can be deduced therefrom threshold values corresponding to other types of reports.
  • the invention also relates to a diagnostic kit making it possible to diagnose an adenocarcinoma of the prostate or a benign pathology of the prostate, said kit comprising:
  • Haison partner capable of specifically targeting Her activable Hbre PSA, preferably a Haison partner capable of recognizing the epitope mimicked by the sequence SEQ ID No. 1, more preferably an antibody or an antibody fragment, and,
  • Means for assaying forms of PSA other than the activatable Hbre form preferably antibodies or antibody fragments.
  • Such means which can be used in said kit are as described above for the determination of the form of PSA which it is desired to quantify.
  • the method of the invention can also be implemented by using a partner of Haison capable of getting Her to the PSA Hbre non-specifically activatable.
  • partners can be partners capable of integrating with total PSA, including in particular activatable Hebre PSA.
  • This Haison partner capable of being linked to non-specifically activable Hbre PSA can be used in the process of the invention as described above with the Haison partner capable of being specifically activated to activable Hbre PSA, namely as capture partner. or to immunopurify PSA Hbre.
  • the detection of the activatable Hebre form of PSA must be implemented using the particular property of enzymatic activity of the active forms of PSA. In this case, the activatable Hbre form of PSA should be activated.
  • this activatable free form makes it possible to Hbb the Haison site to the enzyme substrate, which can then be reacted with an enzyme substrate as described above.
  • the detection is implemented by determining the enzymatic activity of the Hbre form of the activated PSA.
  • the invention relates to a diagnostic method a benign prostate pathology or an adenocarcinoma of the prostate according to claim 1, characterized in that it comprises the steps consisting in: i) bringing into contact a partner of Haison capable of being Her with PSA Hbre activatable in a non-specific manner, with a biological sample from a patient suspected of having a benign prostate pathology or an adenocarcinoma of the prostate, ⁇ ) highlight the capture of the activatable Hebre form of PSA by said partner of Haison by determination of the enzymatic activity of the Hbre form of activated PSA, after activation of the activable Hbre form of PSA ⁇ i) calculate the ratio between the quantity of activable Hbre form of PSA detected in step H) and the quantity of a form of PSA other than the activatable Hbre form, present in a similar sample taken from the same subject and iv) determining whether the patients are affected by an adenocarcinoma of the prostate or by
  • a miHeu of high saline concentration of at least 0.15M, preferably of at least 1M, more preferably of at most 2M, as described above,
  • the method of the invention is characterized in that it uses, in addition to the Haison partner capable of taking up the PSA Hbre activatable so non-specific, an antibody capable of increasing the enzymatic activity of PSA, and in particular the antibody 8G8F5.
  • This antibody capable of increasing the enzymatic activity of PSA can be used as such, in an assay, as a capture partner for activable PSA Hebre previously immunopurified in a specific or non-specific manner from biological samples.
  • HSA PSA thus activated after its capture by the antibody will be detected by its enzymatic activity which will be measured via kinetics of hydrolysis of a fluorescent substrate.
  • the slope of the kinetics will be expressed in fluorescence units.
  • the correspondence in quantities of PSA will be obtained thanks to a standard curve curve with quantities of active PSA, between With the exception of the above, steps i) to iv) of this particular embodiment are as described above. the present invention will be better understood with the aid of the following examples given solely by way of illustration and without limitation, as well as with the aid of the appended FIGS. 1 to 6, on which: - FIG.
  • FIG. 2 represents a standardization graph giving the fluorescence as a function of the PSA concentration obtained by using seminal PSA previously in-tmunopurified with the antibody 5D3D11 and assayed in total PSA,
  • FIG. 3 is a graphical representation giving the values of the PSA activable / (PSA Hbre cHve + PSA Denatured PSA) ratios obtained with the method of the invention for serum from patients with prostate cancer and treated by radiotherapy (RT ), by hormone therapy (HT) or by prostatectomy (PR), of patients with cancer but whose treatment is not known (others), of patients with benign hyperplasia (BPH) and of normal patients (PN) (part A of the graph), as well as the values of the PSA Hbre PSA total ratios obtained according to a process of the prior art (part B of the graph) with these same sera,
  • RT radiotherapy
  • HT hormone therapy
  • PR prostatectomy
  • BPH benign hyperplasia
  • PN normal patients
  • FIG. 4 is a graphical representation giving the values of the PSA ratios activable / (PSA Hbre cHve + PSA Hbre denatured) obtained with the method of the invention in sera having a PSA Hbre / PSA total ratio of between 0.15 and 0.25, the sera being from patients suffering from cancer prostate and treated with radiotherapy (RT), hormone therapy (HT) or prostatectomy (PR), patients with cancer but whose treatment is unknown (others), patients with benign hyperplasia (BPH) and of normal patients (PN), - Figure 5 is a graphical representation giving the values of the PSA activable / (PSA Hbre cHve + PSA Denatured PSA) ratios for the sera of patients with prostate cancer and patients with hyperplasia benign (BPH), with a total PSA level of less than 2.5 ng / ml, and
  • FIG. 6 is a graphical representation giving the values of the activatable PSA / (PSA Hbre cHve + PSA Hbre denatured) ratios for the sera of patients with prostate cancer and patients with benign hyperplasia (BPH), obtained with the antibody 5D5A5 or the antibody 11E5C6 as anticoips for detection of activatable PSA.
  • Preparation of LNCaP supernatants PSA was synthesized by the LNCaP eye strain according to the technique described in the articles "LNCaP Produces both putative zymogen and inactive, free form of prostate specifies antigen "E. Corey et al., 1998, Prostate 35: 135-143," Androgen-Sensitive human prostate cancer ceH, LNCaP, Produce both N-terminaUy mature and tuncated prostate specifies antigen isoform "To Herrala et al., 1997, Eur. J. Biochem.
  • the whole was then covered with oil paraffin, and incubated overnight.
  • the separation was carried out under a voltage increasing linearly from 100 to 3500 N in 8 h, and a step of focusing at 6000 N was carried out for 80 to 100 kVh.
  • the proteins having focahsed at their isoelectric point were then separated in a second dimension according to their size thanks to SDS -PAGE electrophoresis, on a large homogeneous 12% acrylamide gel at 40 mA per gel, for 5-6 h, according to the conventional protein electrophoresis technique.
  • the gels obtained after separation according to the second dimension were transferred onto a PVDF membrane (polyvinyhdene trifluoride; MiUipore) in CAPS / methanol buffer (add 3- [cyclohexilamino] -l-propanesulfonic), for 1 night under a current of 1 A, maintaining the temperature at 15 ° C.
  • the membranes were saturated overnight at 4 ° C. in TBS (Tris Buffer Saline, Tris 15 mM pH 8, ⁇ aCl 140 mM) containing 0.05% of Tween 20 and 5% of dehydrated skimmed milk.
  • TBS Tris Buffer Saline, Tris 15 mM pH 8, ⁇ aCl 140 mM
  • the anti-PSA 13C9E9 antibody previously identified to detect all forms of PSA (Charrier JP, et al., 2001, Electrophoresis, 22, 1861- 1866), was diluted in the saturation solution to 10 ⁇ g / l, and was added to the membranes. After an incubation of 1 h at 37 ° C, the membranes were washed three times (5 min) with a saturation solution, and brought into contact with the anti-mouse antibody conjugate coupled to peroxidase (Jackson ImmunoResearch, West Grove , United States of America), diluted to l / 5000 th in the saturation solution. They were then incubated for 1 h at room temperature, washed three times in saturation solution.
  • the immunoreactivity was detected by using a chemHuminescent substrate (Pierce), by incubating the membranes in Fluor S, and by making an acquisition of the image (between 1 min. And 1 h depending on the sample).
  • the images obtained were then processed using the Multi-Analyst software (Biorad).
  • the photographs of these gels are reproduced in FIG. 1 where the photograph A corresponds to the use of the antibody 5D3D11, the photograph B corresponds to the use of the antibody 6C8D8 and the photograph C corresponds to the antibody 11E5C6 (Michel S. et al., 1999, supra) which is a total anti-PSA antibody used for comparison.
  • PSA immunopurified with the anti-total PSA antibody 11E5C6 shows that, in comparison with PSA immunopurified with the anti-total PSA antibody 11E5C6, PSA immunopurified with the antibody 5D3D11 has very little chvee or truncated forms. On the other hand, these forms are present in a much greater proportion in PSA in-u unopurified with the antibody 6C8D8.
  • the PSA bands were stained with a 0.25% solution of Rouge Ponceau S in 3% TCA (trichloroacetic acid), and the band corresponding to mature PSA (approximately 30 kDa) was cut out and subjected to degradation of 'Edman on a Procise 292A protein sequencer (AppHed Biosystems).
  • the results obtained showed that the PSA immunopurified by the antibody 5D3D11 contained only the mature form (GG 7), while the PSA immunopurified by the antibody 6C8D8 contained the mature form, as well as the proPSA (-7) and proPSA (-5).
  • the total anti-PSA antibody can be either the 11E5C6 antibody which does not modify the enzymatic activity of PSA (Michel S. et al., 1999, supra), or the 8G8F5 antibody (bioMérieux, France).
  • the wells were washed with 0.05% TBS-Tween, and the PSA immunopurified by antibodies 5D3D11 or 6C8D8, diluted in TBS-BSA to 2.5 ⁇ g ml was introduced and incubated overnight at 4 ° C. The wells were then washed again in 0.05% TBS-Tween and incubated for 15 min.
  • the enzymatic activity is expressed in fluorescence units x 1000 / min.
  • This table shows that the PSA immunopurified by the antibody 5D3D11 has a detectable enzymatic activity. This activity is increased in the presence of 1.5 M NaCl.
  • the capture of PSA by the antibody 8G8F5 also increases the enzymatic activity of PSA.
  • This example demonstrates that, among the active Hbre forms of PSA in the LNCaP cells, there is the activatable Hbre form which is detectable according to the method of the invention.
  • Example 2 Detection of the activatable free form of PSA from serum from patients with prostate adenocarcinoma
  • the serum pool used is composed of 30 sera from patients with prostate cancer.
  • PSA concentration of this pool total PSA: 71 ng / ml; PSA Hbre: 12 ng / ml, determined using FappareU Vidas.
  • the resin described in paragraph 1.2 is used as a solid support having fixed the antibodies 5D3D11 and 6C8D8. 50 ⁇ l of these resins are brought into contact with 1 ml of the serum pool described above overnight at 4 ° C. with stirring.
  • the tubes are then centrifuged, the fraction containing the unbound PSA was kept, the resin was washed 3 times with 0.5% PBS-Tween (the washing fractions are combined and stored), then the PSA fixed by the antibody 5D3D11 or 6C8D8 was eluted for 5 min with 200 ⁇ l of 0.1 M Glycine PH 2.2 containing 1 mg / ml of BSA and neutralized at pH 7.2 with 2 M Tris pH 8. 2.1.
  • Measurement of the enzyme activity of immunopurified PSA from serum The wells of a black Nunc Maxisorp ELISA plate (compatible with fluorescence detection) were “coated” for 2 hours at 37 ° C.
  • the total anti-PSA antibody can be: o either the 11E5C6 antibody, which does not modify the enzymatic activity of PSA, o or the 8G8F5 antibody which increases the enzymatic activity of the captured PSA.
  • the wells were washed with 0.05% TBS-Tween, and 100 ⁇ l of PSA immunopurified from serum with the antibodies 5D3D11 or 6C8D8 were introduced and incubated overnight at 4 ° C. The wells were then washed again in 0.05% TBS-Tween and incubated for 15 min with TBS-BSA 2 mg / ml, the NaCl concentration of which was raised to 1.5 M.
  • the enzymatic activity is expressed in fluorescence units x 1000 / minute. * The activity measured directly from the serum (without immunopurification) is underestimated, because the activated PSA immediately complexes with serum FACT.
  • This table shows that we are able to measure an enzymatic activity on PSA immunopurified from serum: the serum therefore contains activatable PSA Hbre. There is always a significant difference in activity between the PSA immunopurified by the antibody 5D3D11 and that immunopurified by the antibody 6C8D8, showing that the antibody 5D3D11 specifically recognizes the activatable PSA Hbre.
  • Example 3 Use of the antibody 5D3D11 in a diagnostic test for the discrimination between a BPH and adenocarcinoma of the prostate
  • the Vidas apparatus was used, adapted to include the appropriate assay reagents, but used according to the instructions of the supplier (bioMérieux, France).
  • 3.1 Determination of activatable PSA in patient sera The antibody 5D3D11 is used as capture antibody in a sandwich type test.
  • the PSA captured is detected by the total anti-PSA antibody 5D5A5 coupled with alkaline phosphatase.
  • the protocol is as described above.
  • the standardization of the test was carried out according to the supplier's recommendations using seminal PSA immunopurified with the antibody 5D3D11 and assayed in total PSA.
  • the detection limit of the test is 0.05 ng / ml of active PSA / ml.
  • the standardization curve in the concentration range from 0 to 1.5 ng / ml is shown in Figure 2. This curve, which is close to a straight line, shows that the assay with a Haison partner recognizing the epitope mimicked by the sequence SEQ ID No. 1 makes it possible to detect PSA Hbre activatable with good sensitivity.
  • prostate cancers well identified with total PSA levels, tumor grades, Gleason scores and any information on treatments (radiotherapy, hormone therapy, prostatectomy or unknown) carried out subsequently - 65 benign hyperplasias,
  • the activable PSA Hbre / / ratio (PS A denatured Hbre + PSA Hbre cHve) obtained using the previous assays was calculated and these values were reproduced on the graph of FIG. 3, part A As well as the shows part A of FIG. 3, using a threshold of 0.66 for sera having a total PSA level of between 2.5 and 10 ng / ml, the PSA activatable / / (PSA Hebre cHve + PSA Hebre denatured) ratio ) characterizes 22/33 cancers (67%), 19/19 normal prostates (100%) and 27/28 BPH (96%).
  • the PSA Hbre to total PSA ratio was calculated using two Vidas kits (Kit PSA total and Kit PSA Hbre, bioMérieux, France) according to the supplier's recommendations. The results are reproduced on part B of the graph in FIG. 3. This part B shows that U exists an uncertainty zone for values from 0.15 to 0.25.
  • 3.4 Sensitivity of the process of the invention 3.4.1
  • the values of the activable PSA Hbre / / (denatured PSA Hbre + PSA Hbre cHve) ratios obtained according to the method of the invention for the 28 sera the area of uncertainty obtained with the method of the prior art has been reproduced in FIG. 4.
  • Example 4 Detection of the activatable free form of PSA from a binding partner capable of binding in a non-specific manner to the activatable free PSA in a biological sample 1.
  • Samples used Nine individual sera were used having total PSA concentrations varying from 157 at 3.8 ng / ml and coming from the CHU of Liège, that is to say from the hospital of the Armies, Desgenettes, located in Lyon. 2.
  • the TPSA test has a sensitivity of 0.07 ng / ml PSA and can detect up to 100 ng / ml PSA.
  • the FPSA test has a sensitivity of 0.05 ng / ml and can detect up to 10 ng / ml of PSA. 4. Measurement of the enzymatic activity of PSA 4.1. Fixation of capture antibodies The wells of an ELISA plate were coated with 100 ⁇ l of streptavin (Hluée at 10 ⁇ g / ml in carbonate buffer pH 9.6, and incubated for 2 h at 37 ° C.
  • sera 1 and 9 come from patients confirmed as having prostate cancer, which is also confirmed by the method of the invention.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape de détection, dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, de la forme libre de PSA activable. Ce procédé de diagnostic peut être mis en œuvre par les étapes consistant à : i) mettre en contact un partenaire de liaison capable de se lier spécifiquement au PSA libre activable avec un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, ii) mettre en évidence la capture de la forme libre activable du PSA par ledit partenaire de liaison, iii) calculer le rapport entre la quantité de forme libre activable de PSA détectée dans l'étape ii) et la quantité d'une forme de PSA autre que la forme libre activable, présente dans un échantillon de même nature prélevé chez le même sujet, et iv) déterminer si les patients sont affectés par un adénocarcinome de la prostate ou par une pathologie bénigne de la prostate en comparant la valeur du rapport déterminé dans l'étape iii) à une valeur-seuil prédéterminée, choisie selon le type de rapport utilisé et représentative de la limite de détection de chaque pathologie.

Description

Procédé de détection de la forme libre activable du PSA et son utilisation pour le diagnostic des pathologies bénignes de la prostate et de l' adénocarcinome de la prostate La présente invention concerne le diagnostic des adénocarcinomes de la prostate. En particulier, l'invention a pour objet un procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate chez un patient soupçonné d'être atteint de telles pathologies par utilisation de partenaires de liaison capables ce reconnaître l'antigène spécifique de la prostate (ou PSA, pour Prostate Spécifie Antigen) spécifiquement sous sa forme libre activable. Le PSA est produit par l'épithélium glandulaire de la prostate humaine, probablement sous une forme zymogène inactive (Lundwall et al. FEBS Lett. 1987), et est sécrété dans le liquide séminal sous sa forme active (Lilja, J. Clin Invest 1985). L'activité biologique du PSA dans le liquide séminal est liée à sa fragmentation protéolytique limitée des protéines prédominantes sécrétées par les vésicules séminales (Lilja, J. Clin Invest 1985 ; Lilja et al. J. Clin Invest 1987 ; Me Gee et al. Biol. reprod. 1988). Le PSA est le principal marqueur du cancer de la prostate qui affectera, au cours de sa vie, un homme sur six en Occident Cette protéase de la famille des kallikréines, principalement sécrétée par l'épithélium prostatique, est retrouvée à une concentration de 0,5 à 5 mg/ l dans le liquide séminal et à une concentration un million de fois moindre dans le sérum d'un patient Ainsi, le PSA est trouvé normalement à une concentration inférieure à 2,5 ng ml dans le sérum. Cependant cette concentration augmente en principe notablement lors d'un cancer de la prostate et lors d'altérations bénignes telles que l'hypertrophie de la prostate bénigne (BPH) ou la prostatite aiguë. La séquence protéique du PSA a été déterminée. Il s'agit d'une glycoprotéine comportant 237 acides aminés ("Molecular cloning of human prostate spécifie antigen cDNA". Lundwall A., Lilja H., 1987. FEBS Lett 214 : 317-322). Il a été proposé une méthode de diagnostic consistant à mesurer la concentration en PSA sérique et à la comparer à une valeur-seuil qui est de 4 ng/ml. Toutefois, on a constaté que cette méthode de diagnostic conduit à suspecter à tort trois patients sur quatre, ce qui est préjudiciable. De plus, cette méthode ne permet pas de diagnostiquer 30 à 45% des cas de cancers confinés à la glande, ce qui constitue pourtant un stade précoce de la maladie potentiellement curable dont le diagnostic serait donc particulièrement souhaitable. Le caractère peu satisfaisant de cette méthode est d'ailleurs démontré par l'étude rapportée dans l'article "Prostate Cancer Détection in Men With Sérum PSA Concentrations of 2.6 to 4.0 ng/ml and Benign Prostate Examination'', Catalona étal, JAMA, 14 Mai 1997 - Nol. 277, Νo. 18, qui montre que la valeur- seuil doit être inférieure à 4 ng/ml pour dépister précocement un cancer de la prostate. Par ailleurs, il a été montré que dans le sérum, le PSA s'associait à des inhibiteurs de protéase, tels que rα-l-antichymouypsine (ACT), et l'a- 2 macroglobuline (A2M). Ces associations entraînent l'inactivation de l'activité chymotrypsique du PSA, comme cela a été démontré dans l'article Εnzymatic activity of prostate spécifie antigen and its reactions with ultracellular serine proteinase inhibitors" A. Christensson, C.B. Laurell, H. Lilja, 1990 Eur. J. Biochem 194 : 755-763. Ceci a également permis de mettre en évidence que le PSA présent dans le sérum était soit sous forme libre, c'est-à-dire non associé, soit sous forme complexée, c'est-à-dire associé. L'usage du ratio PSA libre sur PSA total a alors été proposé afin d'améliorer la spécificité du diagnostic. Ainsi, la demande de brevet WO97/12245 décrit une méthode permettant de diagnostiquer un adénocarcinome de la prostate sans biopsie. Cette méthode consiste à mesurer, dans le sérum ou dans le sang des patients, la quantité totale de PSA. Si cette valeur est comprise entre 2,5 et 20 ng/ml, on mesure également la concentration de PSA libre. On calcule ensuite le ratio PSA libre sur PSA total. Si ce ratio est inférieur à 7%, le diagnostic s'oriente vers un adénocarcinome de la prostate. Toutefois, l'utilisation d'un seuil à 7%, pour le diagnostic d'un cancer de la prostate, est controversée par de nombreux auteurs, comme le montre la publication de Lein et al. "Relation of free PSA/total PSA in sérum for differentiating between patients with prostatic cancer and benign prostate hyperplasia : which cutoff should be used ?". Dans ce document publié dans la revue Cancer Investigation, 16(1), 45-49, 1998, il a été démontré qu'il est difficile, par le biais de ce ratio, de différencier systématiquement un cancer de la prostate d'une BPH. Pour ces raisons, la demanderesse s'est intéressée, dans la demande de brevet WO00/02052, à la présence dans le sérum de formes clivées du PSA parmi les formes libres du PSA. Les formes moléculaires de PSA sérique de patients atteints de cancer ou de BPH ont été cartographiées par électrophorèse bidimensionnelle, associée à une détection par clumioluminescence, afin d'observer l'ensemble des formes de PSA c'est-à-dire les formes libres, dont les formes clivées, et les formes complexées. Les profils d'électrophorèse de sérums de sujets atteints d'adénocarcinome de la prostate sont relativement homogènes, présentant essentiellement les formes libres non clivées du PSA, tandis que ceux de sujets atteints de BPH peuvent comporter une proportion relativement importante de formes libres clivées et des spots légèrement plus basiques sans forme clivée. L'augmentation du ratio PSA libre sérique sur PSA total sérique observée chez les patients atteints de BPH serait donc essentiellement liée à l'existence de PSA libre clivé, qui pourrait être enzymatiquement inactif et donc incapable de se lier à l'ACT, ainsi qu'à la présence d'une forme de PSA libre légèrement plus basique que la forme PSA libre active, qui pourrait correspondre à la forme zymogène, inactive, du PSA. En fonction de ces observations, la demanderesse a décrit des méthodes de diagnostic d'adénocarcinome de la prostate comprenant la quantification, après séparation par électrophorèse bidimensionnelle, du PSA libre clivé et ou non clivé et l'utilisation de ces valeurs afin d'établir un diagnostic. Toutefois, même si ces méthodes ont permis d'améliorer le diagnostic, elles requièrent la mise en œuvre d'électrophorèse bidimensionnelle. Elles sont par conséquent assez coûteuses et nécessitent beaucoup de temps de manipulation. Pour éviter ces manipulations, il a été décrit dans la demande de brevet WO01/77180 de nouveaux anticorps dirigés spédfiquement contre le PSA libre inactif, ainsi que leur utilisation dans un procédé de diagnostic de pathologie bénigne de la prostate ou de l' adénocarcinome de la prostate. La Demanderesse a maintenant découvert qu'il existait dans les échantillons biologiques de patient, parmi les formes libres du PSA, une nouvelle forme de PSA qui n'est pas la forme zymogène (ProPSA) mais est aussi activable, c'est-à-dire qui a potentiellement la capacité de réagir avec les inhibiteurs de protéase, et que l'utilisation de la détection d'une telle forme libre de PSA activable permettait un diagnostic différentiel entre des sujets atteints de pathologies bénignes de la prostate et des sujets atteints d'adénocarcinome de la prostate avec une excellente spécificité et sensibilité. Ainsi la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, caractérisé en ce qu'il comprend l'étape de détection, dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, de la forme libre activable du PSA. Les différentes formes du PSA, présentes dans les fluides biologiques tels que le liquide séminal ou le sérum d'un patient ont souvent eu des dénominations différentes suivant les auteurs. Tous s'accordent à considérer que le PSA total se trouvent sous deux formes que sont la forme libre (PSA libre) et la forme complexée avec des inhibiteurs ce protéase tels que TACT (PSA complexé). Le PSA libre peut également être dénommé suivant sa taille : lors de sa production sous forme de ProPSA, il possède des acides aminés supplémentaires (7 ou 5 ou 4 ou 2). On parle alors de PSA zymogène ou de ProPSA-7, ProPSA-5, etc. Ce proPSA, après maturation et donc perte de ses acides aminés supplémentaires, peut se retrouver soit sous forme intacte, soit sous forme partielle. Dans ce dernier cas, on parle de PSA tronqué ou clivé. Le PSA libre sous forme intacte peut également être dénaturé (glycosylé ou déglycosyle); on parle alors de forme dénaturée. Ainsi, les formes de PSA libres comprennent le PSA zymogène, le PSA intact, dénaturé ou non, et le PSA clivé. On parle aussi, pour ces différentes formes libres ou complexées de PSA, de formes actives et de formes inactives. Par forme active, on entend les formes étant capables de se lier aux inhibiteurs de protéase, tels que TACT. Par forme inactive, on entend les formes incapables d'une telle capacité de liaison. On sait que le PSA complexé est inactif puisqu'il s'est déjà lié à un inhibiteur. De même, le PSA libre clivé et le PSA libre dénaturé sont inactifs car ils ne possèdent plus la capacité de se lier aux inhibiteurs. Enfin, les formes du PSA zymogène sont inactives. Les autres formes libres de PSA sont donc actives. Alors que dans le liquide séminal ou dans des surnageants de la lignée cellulaire LnCaP ces formes actives sont présentes, il est couramment admis que ces formes actives n'existent pas dans le sérum car complexées aux inhibiteurs de protéase. La Demanderesse a maintenant mis en évidence, contre toute attente, que parmi ces formes libres existait, dans les échantillons biologiques des patients, une forme libre activable, c'est-à-dire ayant encore la capacité de se lier aux inhibiteurs de protéase dans le sérum, cette liaison pouvant être mise en œuvre après activation de ladite forme libre activable. Elle a également mis en évidence que l'utilisation du dosage d'une telle forme de PSA libre activable permettait le diagnostic de patients atteints de l' adénocarcinome de la prostate ou d'une BPH. Sans vouloir être lié à une théorie, la Demanderesse pense que cette forme libre activable de PSA serait, après activation, équivalente à la forme de PSA qui se complexe à l' ACT. Cette forme libre activable serait une forme de PSA « fermée », emprisonnant le site de fixation à l' ACT, son activation permettant de transformer la forme « fermée » en forme « ouverte » et libérer ainsi le site de fixation. Le procédé de diagnostic de l'invention peut être mis en œuvre soit en utilisant un partenaire de liaison capable de se lier spécifiquement au PSA libre activable, soit un partenaire de liaison capable de se lier au PSA libre activable de manière non spécifique. Ainsi, selon un premier mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de diagnostic in vitro d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : i) mettre en contact un partenaire de liaison capable de se lier spécifiquement au PSA libre activable avec un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, i) mettre en évidence la capture de la forme libre activable du PSA par ledit partenaire de liaison, ϋi) calculer le rapport entre la quantité de forme libre activable de PSA détectée dans l'étape ii) et la quantité d'une forme de PSA autre que la forme libre activable, présente dans un échantillon de même nature prélevé chez le même sujet et iv) déterminer si les patients sont affectés par un adénocarcinome de la prostate ou par une pathologie bénigne de la prostate en comparant la valeur du rapport déterminé dans l'étape iϋ) à une valeur- seuil prédéterminée, choisie selon le type de rapport utilisé et représentative de la limite de détection de chaque pathologie. La Demanderesse a découvert que, de façon inattendue, parmi les partenaires de liaison appropriés aux fins de l'invention, ceux reconnaissant l'épitope mimé par la séquence SEQ ID N°l (DTPYPWGWLLDEGYD) étaient capables effectivement de se lier spécifiquement dans le sérum à cette forme libre activable de PSA sans se lier ni au PSA libre dénaturé ou clivé, ri au ProPSA, et que l'utilisation de cette propriété particulière permettait d'obtenir un procédé de diagnostic des pathologies liées à la prostate très sensible et très spécifique. Les échantillons biologiques dans lesquels le procédé de l'invention est nis en œuvre sont tout échantillon biologique susceptible de contenir du PSA. A titre d'exemple de tels échantillons, on peut citer le liquide séminal, le sang, le sérum, le plasma et les urines, le sérum et le plasma étant particulièrement préférés. Les partenaires de liaison capables de se lier spécifiquement au PSA libre activable appropriés aux fins de l'invention comprennent par exemple les anticorps, les fragments d'anticorps et les mirnotopes, ainsi que tout autre partenaire connu de l'homme du métier pour avoir cette capacité. Par fragments d'anticorps, on entend en général dans la présente demande, tout fragment d'anticorps ayant conservé la spécificité de l'anticorps d'origine, dans le cas présent la capacité de se lier spécifiquement au PSA libre activable, et en particulier des fragments de type Fab et F(ab')2. Dans la présente demande, le mot "anticorps" désigne par la suite également des fragments d'anticorps lorsque le sens le permet. Les anticorps utiles au sens de l'invention comprennent notamment les anticorps polyclonaux purifiés et les anticorps monoclonaux. La préparation des anticorps polyclonaux et des anticorps monoclonaux est largement connue de l'homme du métier et le principe de cette préparation est rappelée ci- après. Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec au moins un antigène cible d'intérêt, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laqueEe est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment un antigène cible d'intérêt Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci- après. Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris, (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro) avec un antigène dble d'intérêt, dont les lymphocytes B sont alors capables de produire des anticorps contre ledit antigène. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses
"immortelles" (murines dans l'exemple) pour donner heu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clone, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de l'antigène tumoral d'intérêt pourront être testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité décrite ci- dessus. Par mimotopes, on entend tout peptide synthétique ou recombinant capable de mimer une conformation interagissant spécifiquement avec le dit épitope. Selon un mode de réalisation préféré, le partenaire de liaison capable de se lier spécifiquement au PSA libre activable remplit au moins l'une des conditions suivantes : - il est capable de reconnaître l' épitope mimé par la séquence SEQ ID N° 1. - c'est un anticorps ou un fragment d'anticorps. La séquence SEQ ID N°l reconnue par les partenaires de liaison appropriés aux fins de l'invention mime un épitope conformationnel du PSA. Un exemple d'anticorps capable de reconnaître l'épitope mimé par la séquence SEQ ID N° 1 approprié aux fins de l'invention est l'anticorps 5D3D11, tel que décrit dans Michel S., et al., 1999, Clinical Chemistry, 45(5) : 638-650. L'utilisation de cet anticorps particulier dans le procédé de l'invention est inattendue en ce sens que cet article indique que cet anticorps est capable d'inhiber l'activité enzymatique du PSA et donc la fixation d'ACT, en d'autres termes qu'il n'est capable que de se Her à une forme libre active du PSA « ouverte ». Dans le cas présent la Demanderesse a aussi montré qu'il était capable de se lier à la forme libre activable, c'est-à-dire « fermée ». Les conjugués constitués du partenaire de liaison capable de se lier spécifiquement au PSA libre activable et de la forme libre activable du PSA sont nouveaux et constituent également un objet de l'invention. Selon un mode de réalisation ledit partenaire de liaison capable de se lier spécifiquement au PSA libre activable du conjugué de l'invention est un partenaire de liaison capable de reconnaître l' épitope mimé par la séquence SEQ ID N°l. La deuxième étape du procédé de diagnostic de l'invention consiste à mettre en évidence la capture de ladite forme libre activable de PSA par ledit partenaire de liaison capable de se lier spédfiquement au PSA libre activable. Cette étape peut être mise en œuvre directement en détectant la liaison entre ledit partenaire de liaison et ladite forme libre activable de PSA, ou bien après élution de ladite forme libre activable de PSA immunocapturée par ledit partenaire de liaison. La forme libre activable du PSA immunocapturée par ledit partenaire de haison, puis éluée sera appelée dans la suite
PSA libre activable immunopurifié. L'élution de la forme libre activable de PSA immunocapturée par ledit partenaire de haison capable de se lier spécifiquement au PSA libre activable peut être mise en œuvre par tout procédé d' élution connu de l'homme du métier, tel qu'un choc de pH. De préférence, on utilise un choc adde, par exemple en utilisant un tampon glycine 0,1M pH 2,8. La détection de la capture de ladite forme libre activable de PSA, qu'elle soit irrrmunopurifiée ou non, peut être réalisée par tout moyen de détection connu dans le domaine des immunodosages, tel que la détection directe et la détection indirecte. Dans le cas de la détection indirecte, c'est-à-dire par rintermédiaire d'un partenaire de détection, on utilise un partenaire de détection capable de se her à la forme libre activable du PSA. Ce partenaire de détection se lie sur un épitope différent de celui utilisé par ledit partenaire de liaison utilisé dans l'étape i) lorsque le PSA libre activable n'est pas immunopurifié. A titre de partenaire de détection approprié à cette fin, on peut citer les anticorps tels que les anticorps anti-PSA total, ce qui constitue un mode de réahsation de l'invention. Des exemples de tels anticorps anti-PSA capables de reconnaître un épitope différent de celui utilisé par ledit partenaire de Haison utiHsé dans l'étape i) sont décrits dans l'article de Michel S., et al (1999, supra). Ces partenaires de détection peuvent être préalablement marqués. Par marquage, on entend la fixation d'un marqueur capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une Hste non limitative de ces marqueurs consiste en :
• les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, l'acétylchoHne estérase, la β-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,
• les chromophores comme les composés luminescents, colorants,
• les molécules radioactives comme le 32P, le 35S ou le 125I,
• les molécules fluorescentes telles que la fluorescéine, la rhodomine, l'alexa ou les phycocyanines, et • les particules teHes que les particules en or, en latex magnétique, les Hposomes. Des systèmes indirects de marquage peuvent être aussi utiHsés, comme par exemple par l'interaiédiaire d'un autre couple Hgand anti- Hgand. Les couples Hgand/anti- Hgand sont bien connus de l'homme du métier, et on peut citer par exemple les couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, pepti.de/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide. Dans ce cas, c'est le Hgand qui est Hé au partenaire de Haison. L'anti- Hgand peut être détectable directement par les marqueurs décrits au paragraphe précédent ou être lui-même détectable par un Hgand/anti- Hgand. Ces systèmes indirects peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du étier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR98/10084 ou WO95/08000 de la Demanderesse ou à l'article J. Histochem. Cytochem., (1997), 45 : 481- 491. La détection directe de la capture de la forme Hbre activable par ledit partenaire de Haison, c'est-à-dire sans l'intermédiaire d'un partenaire de détection, peut être mise en œuvre par exemple par résonance plasmon ou par voltamétrie cycHque sur une électrode portant un polymère conducteur. La détection directe peut également être mise en œuvre en utiHsant la propriété particulière d'activité enzymatique des formes actives du PSA. Dans ce cas, il conviendra de procéder à F activation de la forme Hbre activable du PSA, le cas échéant après son immunopurification. En effet l' activation de cette forme Hbre activable permet de Hbérer le site de Haison au substrat enzymatique, lequel pourra ensuite être mis à réagir avec un substrat enzymatique. Ainsi, la détection est mise en œuvre par détermination de l'activité enzymatique de la forme Hbre du PSA immunopurifi.ee et activée, ce qui constitue un mode de réalisation particuHer de l'invention. Des exemples de substrats enzymatiques qui conviennent aux fins de l'invention comprennent tous les substrats révélateurs de l'activité protéase de type chymotrypsique largement connus de l'homme du métier. De tels substrats sont disponibles par exemple chez
Enzyme System Products. Ils sont composés d'une séquence peptidique reconnue et cHvée par le PSA, cette séquence étant couplée à un groupement chromophore ou fluorophore. L' activation de la forme Hbre activable du PSA peut être mise en œuvre par au moins l'une des méthodes suivantes :
- mise en contact de ladite forme activable avec un miHeu de forte concentration saline, d'au moins 0,15M, de préférence d'au moins 1M, de préférence encore d'au plus 2M, - Haison du PSA Hbre activable i munopurifié à un anticorps capable d'augmenter l'activité enzymatique du PSA, ces deux méthodes pouvant être mises en œuvre séparément simultanément ou successivement selon n'importe quel ordre. A titre de miHeu de forte concentration saline, on peut citer les miHeux contenant du NaCl 1,5M et à titre d'anticorps capable d'augmenter l'activité enzymatique du PSA, on peut citer l'anticorps 8G8F5 (bioMérieux, France). Du fait de la propriété particulière de ces anticorps capables d'augmenter l'activité enzymatique du PSA, leur utiHsation dans le procédé de l'invention permet d'améHorer la sensibihté dudit procédé. Ainsi, selon un mode de réaHsation, le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'il utiHse, outre le partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable, un anticorps capable d'augmenter l'activité enzymatique du PSA, et notamment l'anticorps 8G8F5. Cet anticorps capable d'augmenter l'activité enzymatique du PSA peut être utiHsé à titre de partenaire de capture dans un dosage de type ELISA lorsque le partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable est utiHsé pour immunopurifier le PSA Hbre activable. H peut également être utiHsé en tant que partenaire de détection, notamment lorsque le partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable est utiHsé comme partenaire de capture. Les conjugués constitués du partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable, tel qu'un partenaire de Haison capable de reconnaître l'épitope mimé par la séquence SEQ ID N°l, et de la forme Hbre activable du PSA, laqueUe est activée, sont également nouveaux et constituent un mode de réaHsation particuHer de l'invention. Dans le procédé de l'invention, les partenaires de Haison capables de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable, se Hant spécifiquement au PSA Hbre activable, peuvent être utiHsés tels quels ou bien notamment sous forme fixés sur un support soHde et/ou Hés à un marqueur. La fixation de ces partenaires de Haison sur un support soHde est bien connue. Le support peut être réaHsé avec tout matériau soHde, biologique ou synthétique, doué de propriétés adsorbantes ou capables de fixer un agent de couplage. Des matériaux sont connus et décrits dans la Httérature. Parmi les matériaux soHdes capables de fixer ces partenaires de Haison par adsorption, on citera par exemple le polystyrène, le polypropylène, les latex, etc. Parmi les matériaux permettant de fixer ces partenaires de Haison par oovalence à l'aide d'un agent de couplage, on peut citer notamment le dextrane, la ceUulose, etc. Le support peut se présenter par exemple sous forme de disques, de tubes, de biHes, de cônes ou de plaques, en particuHer de plaques de microtitrage. La Haison des partenaires de Haison à un marqueur permettra également d'obtenir une détection directe, comme décrit précédemment. Ce marqueur est tel que décrit précédemment. Lorsque le partenaire de Haison n'est pas Hé à un support ou lorsque le PSA Hbre activable est immunopurifié, le procédé de l'invention peut également mettre en œuvre un partenaire de capture. Dans le premier cas, ce partenaire de capture est capable de se Her à un épitope différent de celui reconnu par le partenaire de Haison capabb de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable. Des exemples de partenaire de capture comprennent les anticorps anti-PSA, tels que décrits précédemment Dans la mesure où on utiHsé dans le procédé de l'invention à la fois un partenaire de capture et à la fois un partenaire de détection pour doser le PSA Hbre activable, ces partenaires se Hent à des épitopes différents, eux-mêmes étant différents de l'épitope reconnu par le partenaire de Haison capable se Her spécifiquement au PSA Hbre activable lorsque le PSA
Hbre activable n'a pas été immunopurifié. Les procédés mettant en œuvre les différents partenaires de la forme activable de PSA pour la mise en évidence de la capture de la forme Hbre activable du PSA par ledit partenaire de Haison sont largement connus de l'homme du métier. A titre d'exemple, on peut citer les méthodes de type sandwich teUe que la méthode ELISA, et les méthodes de dosage par compétition. L'étape Hi) du procédé de l'invention consiste à calculer le rapport entre la quantité de forme Hbre activable de PSA détectée dans l'étape H) et la quantité d'une forme de PSA autre que ladite forme activable de l'invention, présente dans un échantillon de même nature prélevé chez le même sujet Par l'expression "échantϋlon de même nature prélevé chez le même sujet", on entend soit deux fractions d'un même prélèvement, soit deux éehantiHons issus de deux prélèvements différents mais qui doivent être de même nature, par exemple des échantiHons sériques. Les formes autres que la forme Hbre activable du PSA sont notamment le PSA complexé, le PSA total, le PSA Hbre total, le PSA Hbre zymogène, le PSA Hbre dénaturé, le PSA Hbre cHvé et leurs associations, c'est-à-dire l'ensemble des formes actives ou inactives, Hbres ou complexées, du PSA. Le dosage de chacune de ces différentes formes notamment à l'aide d'anticorps spécifiques, est connu. Le PSA complexé est dosé par exemple à l'aide d'anticorps décrits dans la demande de brevet WO98/22509. Le PSA total est dosé par exemple à l'aide d'anticorps décrits par H. Nagasaki et al. (1999), Clin. Chem. 45 : 4486-496. D'autres anticorps capables de se Her à différentes formes du PSA Hbre, dont le PSA Hbre total, sont commerdaHsés par Chugai (Japon), BiosPacific (EmeryviHe, CA) et Euromedex US Biological (Swampscott, MA). La quantification est effectuée de façon connue à partir des procédés de mise en évidence de la détection de réactions immunologiques tels que décrits ci- dessus (sandwich, etc.), par exemple en déterminant la quantité de marqueur lorsqu'on utilise le marquage. Bien entendu, lorsque les quantités mesurées sont destinées à être comparées, il convient que ces valeurs soient comparables. En d'autres termes, il convient que les valeurs mesurées soient rapportées à une même dilution ou concentration éventueUe de l'échantillon ainsi qu'à un même volume. Les différents rapports qui peuvent être calculés dans l'étape Hi) du procédé de l'invention peuvent être choisis parmi les suivants : - quantité de PSA Hbre activable/quantité de PSA total,
- quantité de PSA Hbre activable/quantité de PSA Hbre total,
- quantité de PSA Hbre activable/quantité de PSA complexé,
- quantité de PSA Hbre activable/quantité de PSA Hbre cHvé,
- quantité de PSA Hbre activable/quantité de PSA libre zymogène, - quantité de PSA Hbre activable/quantité de PSA Hbre dénaturé, - quantité de PSA Hbre activable/quantité de (PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre zymogène),
- quantité de PSA Hbre activable/quantité de (PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre cHvé),
- quantité de PSA Hbre activable/quantité de PSA Hbre inactif (zymogène, dénaturé et cHvé) - les inverses de ces rapports, ou
- des combinaisons de ces rapports, les rapports préférés étant relatifs à la quantité de PSA Hbre activable sur la quantité de (PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre cHvé) ou la quantité de PSA Hbre activable sur la quantité de PSA Hbre inactif. Selon un mode de réaHsation particuHer de l'invention, la forme de PSA autre que la forme Hbre activable utilisée pour calculer le rapport dans l'étape (in) du procédé de l'invention est la forme de PSA Hbre dénaturé + la forme de PSA Hbre chvé ou la forme de PSA
Hbre inactif. La mise en œuvre de ce calcul se fait bien évidemment comme suit : - on évalue la quantité de PSA Hbre activable dans un échantillon biologique prélevé chez un sujet en utiHsant le partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable, comme décrit précédemment
- on évalue l'une des quantités choisies parmi la quantité de PSA total, la quantité de PSA Hbre total, la quantité de PSA complexé, la quantité de PSA Hbre zymogène, la quantité de PSA Hbre cHvé, la quantité de PSA Hbre dénaturé, la quantité de PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre cHvé, la quantité de PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre zymogène et la quantité de PSA Hbre inactif, ou leurs associations, sur un échantillon de même nature prélevé chez le même sujet, et
- on détermine ledit rapport ou ledit rapport inverse, ou ladite combinaison de rapports. L'étape iv) du procédé de l'invention consiste à déterminer si les patients sont affectés par un adénocarcinome de la prostate ou par une pathologie bénigne de la prostate en comparant la valeur du rapport déterminé dans l'étape Hi) à une valeur- seuil prédéterminée, choisie selon le type de rapport utiHsé et représentative de la limite de détection de chaque pathologie. On sait que, de façon générale, les résultats des tests immunologiques dépendent en grande partie des caractéristiques de spécifidté et d'affinité des anticorps utiHsés, et que ces caractéristiques influent sur les valeurs mesurées avec ces anticorps. On conçoit donc qu'il n'est pas possible de donner des valeurs- seuils précises et que des valeurs- seuils adaptées à chaque anticorps utiHsé peuvent être déterminées dans chaque cas par de simples expériences de routine. Il faut bien comprendre que l'on appeHe ici valeur- seuil soit une valeur discrète, soit un intervalle de valeurs correspondant à une zone d'mdétermination. Bien évidemment, lorsque la valeur mesurée est incluse dans l'intervaHe d'indétermination, ou est très proche de la valeur- seuil dans le cas d'une valeur discrète, on ne peut pas conclure définitivement et il convient de conduire des investigations supplémentaires. Bien entendu, quand on a déterminé une valeur- seuil pour un type de rapport donné, on peut en déduire des valeurs- seuils correspondant à d'autres types de rapports. Dans le cas où on considère un rapport PSA Hbre activable/(PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre cHvé) ou un rapport PSA Hbre activable/PSA Hbre inactif, on diagnostiquera un adénocarcinome de la prostate pour les patients ayant un rapport supérieur à la valeur- seuil obtenue à partir dudit rapport, et on diagnostiquera une BPH ou autre pathologie prostatique non cancéreuse (« patients normaux ») pour les patients ayant un rapport inférieur à cette valeur- seuil. D'une façon générale, lorsque la quantité de PSA Hbre activable se trouvera au numérateur du rapport calculé, on diagnostiquera un adénocarcinome de la prostate pour les patients ayant un rapport supérieur à la valeur- seuil obtenue à partir dudit rapport, et on diagnostiquera une BPH ou autre pathologie prostatique non cancéreuse (« patients normaux ») pour les patients ayant un rapport inférieur à cette valeur- seuil. En revanche, lorsque la quantité de PSA Hbre activable se trouvera au dénominateur du rapport calculé, on diagnostiquera un adénocarcinome de la prostate pour les patients ayant un rapport inférieur à la valeur- seuil obtenue à partir dudit rapport, et on diagnostiquera une BPH ou autre pathologie prostatique non cancéreuse («patients normaux ») pour les patients ayant un rapport supérieur à cette valeur- seuil. Pour mettre en œuvre le procédé de l'invention, l'invention a également pour objet un kit de diagnostic permettant de diagnostiquer un adénocarcinome de la prostate ou une pathologie bénigne de la prostate, ledit kit comprenant :
- un partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable, de préférence un partenaire de Haison capable de reconnaître l'épitope mimé parla séquence SEQ ID N°l, de préférence encore un anticorps ou un fragment d'anticorps, et,
- des moyens pour doser les formes de PSA autres que la forme Hbre activable, de préférence des anticorps ou fragments d'anticorps. De tels moyens utilisables dans ledit kit sont tels que décrits précédemment pour le dosage de la forme de PSA que l'on souhaite quantifier. Le procédé de l'invention peut également être mis en œuvre en utiHsant un partenaire de Haison capable de se Her au PSA Hbre activable de manière non spécifique. De tels partenaires peuvent être des partenaires capables de se Her avec le PSA total, dont notamment le PSA Hbre activable. A titre d'exemple de tels partenaires, on peut dter les anticorps, les fragments d'anticorps et les mimotopes, ainsi que tout autre partenaire connu de l'homme du métier pour avoir cette capacité, comme décrit précédemment et notamment l'anticorps 11E5C6 (Michel et al., 1999, supra), dont l'épitope conformationel imphque la région C-terminale du PSA (Michel S et al., 2001, J. Mol. Recognit, 14 : 406-413). Ce partenaire de Haison capable de se Her au PSA Hbre activable de manière non spécifique peut être utiHsé dans le procédé de l'invention comme décrit précédemment avec le partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable, à savoir comme partenaire de capture ou bien pour immunopurifier le PSA Hbre. Toutefois, dans ce mode de réaHsation particύHer, la détection de la forme Hbre activable du PSA doit être mise en œuvre en utiHsant la propriété particulière d'activité enzymatique des formes actives du PSA. Dans ce cas, il conviendra de procéder à l' activation de la forme Hbre activable du PSA. En effet l' activation de cette forme libre activable permet de Hbérer le site de Haison au substrat enzymatique, lequel pourra ensuite être mis à réagir avec un substrat enzymatique tel que décrit précédemment. Ainsi, la détection est mise en œuvre par détermination de l'activité enzymatique de la forme Hbre du PSA activée. Ainsi, selon ce mode de réaHsation, l'invention concerne un procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : i) mettre en contact un partenaire de Haison capable de se Her au PSA Hbre activable de manière non spécifique, avec un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, ϋ) mettre en évidence la capture de la forme Hbre activable du PSA par ledit partenaire de Haison par détermination de l'activité enzymatique de la forme Hbre du PSA activée, après activation de la forme Hbre activable du PSA ϋi) calculer le rapport entre la quantité de forme Hbre activable de PSA détectée dans l'étape H) et la quantité d'une forme de PSA autre que la forme Hbre activable, présente dans un échantillon de même nature prélevé chez le même sujet et iv) déterminer si les patients sont affectés par un adénocarcinome de la prostate ou par une pathologie bénigne de la prostate en comparant la valeur du rapport déterminé dans l'étape iH) à une valeur- seuil prédéterminée, choisie selon le type de rapport utiHsé et représentative de la limite de détection de chaque pathologie. L' activation de la forme Hbre activable du PSA peut être mise en œuvre par au moins l'une des méthodes suivantes :
- mise en contact de ladite forme activable avec un miHeu de forte concentration saline, d'au moins 0,15M, de préférence d'au moins 1M, de préférence encore d'au plus 2M, comme décrit précédemment,
- Haison du PSA Hbre activable à un anticorps capable d'augmenter l'activité enzymatique du PSA, et notamment l'anticorps 8G8F5, ces deux méthodes pouvant être mises en œuvre séparément, simultanément ou successivement, selon n'importe quel ordre. Du fait de la propriété particulière de ces anticorps capables d'augmenter l'activité enzymatique du PSA, leur utilisation dans le procédé de l'invention permet d'améliorer la sensibifité dudit procédé, ce qui constitue un mode de réaHsation préféré. Ainsi, selon ce mode de réaHsation, le procédé de l'invention est caractérisé en ce qu'il utiHse, outre le partenaire de Haison capable de se Her au PSA Hbre activable de manière non spécifique, un anticorps capable d'augmenter l'activité enzymatique du PSA, et notamment l'anticorps 8G8F5. Cet anticorps capable d'augmenter l'activité enzymatique du PSA peut être utiHsé à ce titre, dans un dosage, comme partenaire de capture du PSA Hbre activable précédemment immunopurifié de manière spécifique ou non spécifique à partir d'échantillons biologiques. Le
PSA Hbre ainsi activé après sa capture par l'anticorps sera détecté par son activité enzymatique qui sera mesurée par l'intermédiaire d'une cinétique d'hydrolyse d'un substrat fluorescent. La pente de la cinétique -era exprimée en unité de fluorescence. La correspondance en quantités de PSA sera obtenue grâce à une courbe étalon étabHe avec des quantités de PSA actif, entre A l'exception de ce qui précède, es étapes i) à iv) de ce mode de réaHsation particulier sont teUes que décrites précédemment La présente invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants donnés uniquement à titre iHustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 à 6 annexées, sur lesqueUes : - la figure 1 montre la photographie de 3 gels d'électrophorèse bidimensionneUe obtenue à partir de 0,5 μg de PSA issu du surnageant de culture des ceUules LNCaP immunopurifié avec les anticorps 5D3D11 (photographie A), 6C8D8 (photographie B) et 11E5C6 (photographie
C),
- la figure 2 représente un graphe de standardisation donnant la fluorescence en fonction de la concentration en PSA obtenu en utiHsant du PSA séminal précédemment in-tmunopurifié avec l'anticorps 5D3D11 et dosé en PSA total,
- la figure 3 est une représentation graphique donnant les valeurs des rapports PSA activable/(PSA Hbre cHvé + PSA Hbre dénaturé) obtenues avec le procédé de l'invention pour des sérum de patients atteints de cancer de la prostate et traités par radiothérapie (RT), par hormonofhérapie (HT) ou par prostatectomie (PR), de patients atteints de cancer mais dont on ne connaît pas le traitement (autres), de patients atteints d'hyperplasies bénignes (BPH) et de patients normaux (PN) (partie A du graphe), ainsi que les valeurs des rapports PSA Hbre PSA total obtenu selon un procédé de l'art antérieur (partie B du graphe) avec ces mêmes sérums,
- la figure 4 est une représentation graphique donnant les valeurs des rapports PSA activable/(PSA Hbre cHvé + PSA Hbre dénaturé) obtenues avec le procédé de l'invention dans les sérums ayant un rapport PSA Hbre/PSA total compris entre 0,15 et 0,25, les sérums étant issus de patients atteints de cancer de la prostate et traités par radiothérapie (RT), par hormonothérapie (HT) ou par prostatectomie (PR), de patients atteints de cancer mais dont on ne connaît pas le traitement (autres), de patients atteints d'hyperplasies bénignes (BPH) et de patients normaux (PN), - la figure 5 est une représentation graphique donnant les valeurs des rapports PSA activable/(PSA Hbre cHvé + PSA Hbre dénaturé) pour les sérums de patients atteints de cancer de la prostate et de patients atteints d'hyperplasies bénignes (BPH), dont le taux de PSA total est inférieur à 2,5 ng/ml, et
- la figure 6 est une représentation graphique donnant les valeurs des rapports PSA activable/(PSA Hbre cHvé + PSA Hbre dénaturé) pour les sérums de patients atteints de cancer de la prostate et de patients atteints d'hyperplasies bénignes (BPH), obtenues avec l'anticorps 5D5A5 ou l'anticorps 11E5C6 comme anticoips de détection du PSA activable.
Exemple 1 ; Détection de la forme libre activable du PSA à partir de surnageants de LNCaP 1.1 Préparation des surnageants de LNCaP On a fait synthétiser du PSA par la Hgnée œUulaire LNCaP selon la technique décrite dans les articles "LNCaP Produces both putative zymogen and inactive, free form of prostate spécifie antigen" E. Corey et al., 1998, Prostate 35:135-143, "Androgen-Sensitive human prostate cancer ceH, LNCaP, Produce both N-terminaUy mature and tuncated prostate spécifie antigen isoform" A Herrala et al., 1997, Eur. J. Biochem. 255:329-335, "Production of iHgram concentration of free prostate spécifie antigen (fPSA) from LNCaP ceH culture : Différence between fPSA from LNCaP ceU and séminal plasma." J. T. Wu et al., 1998, J. CHn. Lab. Anal. 12 : 6-13. Le PSA ainsi produit par la Hgnée œUulaire LNCaP est composé de PSA Hbre. De plus, comme la culture de la Hgnée est réahsée en présence de sérum de veau foetal, qui contient de l'ACT, une proportion de complexe PSA- ACT est ainsi également présente. 1.2 Liaison des formes Hbres du PSA du surnageant par des anticorps de Haison On a utiHsé soit l'anticorps 5D3D11, qui est un partenaire de Haison reconnaissant l'épitope mimé par la séquence SEQ ID N°l, soit l'anticorps 6D8C8 qui est un partenaire de Haison ne reconnaissant pas cet épitope (Michel S., et al., 1999, supra). On a procédé à la Haison comme suit : Les anticorps 5D3D11 ou 6C8D8 ont été fixés sur un support résine de sepharose activée au CNBr (Pharmacia) selon le protocole classique fourni par le fabricant, bien connu de l'homme de métier. Le rapport de couplage utiHsé était 5 mg d'anticorps pour 1 ml de résine gonflée. 1 ml de résine ayant fixé 5 mg d'anticorps a été mis en contact avec 200 ml d'un pool de surnageants ceUulaires de LNCaP contenant environ 500 μg de PSA total dosé à l'aide de l'appareU de détection Vidas (kit PSA total, bioMérieux, France). Après 2 passages sur la colonne d'affinité, la fraction contenant le PSA non fixé a été conservée (nommée FI), et le PSA fixé par les anticorps a été élue avec un tampon glycine 0,1 M pH 2,8 neutralisé ensuite à pH 7,2 avec du Tris 2 M pH 8. On a ainsi obtenu les formes Hbres du PSA immunopurifiees soit par l' anticorps 5D3D 11 , soit F anticorps 6C8D8. 1.3 Dosage des formes Hbres de PSA du surnageant après immunopurification par les anticorps 5D3D11 et 6C8D8 1.3.1. Analyse par électrophorèse bidimensionneUe Le PSA contenu dans les différentes fractions issues de l'immunopurification a été analysé par électrophorèse bidimensionneUe et Western- Blot Lors de la séparation selon la première dimension, les protéines migrent en fonction de leur point isoélectrique (pi) par isoélectrofocaHsation (EEF) sur un gradient de pH immobilisé sur des bandelettes de dépôt (HnmobUine Dry-strip pH 3-10, 18 cm, non linéaire, Pharmacia) en conditions dénaturantes et réductrices. 0,5 μg de PSA ont été ajoutés à 10 μl d'une solution contenant 10% de SDS et 2,3% de DIT (dithio- 1 ,4-thréitol), et le mélange a été chauffé 5 min à 96°C. Puis l'échantillon a été complété à 500 μl avec la solution de réhydratation (urée 8,3 M, thio-urée 2 M, CHAPS 4% (3-[(3-cholarrήdopropyl)αiméthylammonio]-l-piOpane sulfonate), DTT 100 mM, Servalyt 4-9 2%, Orange G 1 mg/ml), et mis en contact avec les bandelettes dans un tube à essai en verre de 20 cm de longueur. L'ensemble a ensuite été recouvert d'huile de paraffine, et incubé toute la nuit La séparation a été effectuée sous une tension augmentant de façon linéaire de 100 à 3500 N en 8 h, et une étape de focaHsation à 6000 N a été réaHsée pendant 80 à 100 kVh. Les protéines ayant focahsé à leur point isoélectrique ont ensuite été séparées dans une deuxième dimension en fonction de leur taiUe grâce à une électrophorèse SDS -PAGE, sur un grand gel homogène à 12% d'acrylamide à 40 mA par gel, pendant 5-6 h, selon la technique classique d'électrophorèse de protéines. Les gels obtenus après séparation selon la seconde dimension ont été transférés sur membrane de PVDF (polyvinyhdène trifluorure ; MiUipore) en tampon CAPS/méthanol (adde 3-[cyclohexilamino]-l-propanesulfonique), pendant 1 nuit sous un courant de 1 A, en maintenant la température à 15 °C. Les membranes ont été saturées pendant 1 nuit à 4°C en TBS (Tris Buffer Saline, Tris 15 mM pH 8, ΝaCl 140 mM) contenant 0,05% de Tween 20 et 5% de lait déshydraté écrémé. L'anticorps anti-PSA 13C9E9, précédemment identifié pour détecter toutes les formes de PSA (Charrier J.P., et al., 2001, Electrophoresis, 22, 1861- 1866), a été dilué dans la solution de saturation à 10 μg/ l, et a été ajouté aux membranes. Après une incubation d' 1 h à 37°C, les membranes ont été lavées trois fois (5 min) avec une solution de saturation, et mises en contact avec le conjugué anticorps anti- souris couplé à la peroxydase (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Etats Unis d'Amérique), dilué au l/5000e dans la solution de saturation. EUes ont ensuite été incubées 1 h à température ambiante, lavées trois fois en solution de saturation. L'immunoréactivité a été détectée en utiHsant un substrat chemHuminescent (Pierce), en incubant les membranes dans le Fluor S, et en faisant une acquisition de l'image (entre 1 min. et 1 h selon l'échantillon). Les images obtenues ont ensuite été traitées à l'aide du logiciel Multi- Analyst (Biorad). Les photographies de ces gels sont reproduites sur la figure 1 où la photographie A con-espond à l'utilisation de F anticorps 5D3D11, la photographie B correspond à l'utilisation de l'anticorps 6C8D8 et la photographie C correspond à l'anticorps 11E5C6 (Michel S. et al., 1999, supra) qui est un anticorps anti-PSA total utiHsé à titre comparatif. Cette figure montre que, par comparaison au PSA immunopurifié avec l'anticorps anti-PSA total 11E5C6, le PSA immunopurifié par l'anticorps 5D3D11 comporte très peu de formes chvées ou tronquées. En revanche, ces formes sont présentes en proportion beaucoup plus importante dans le PSA in-u unopurifié avec l'anticorps 6C8D8. 1.3.3 Caractérisation des formes zymogènes et mature du PSA immunopurifié par séquençage N- terminal du PSA 5 à 8 μg de PSA ceUulaire immunopurifié par les anticorps 5D3D11 ou 6C8D8 ont été soumis à une séparation sur gel SDS -PAGE en conditions réduites et transférés sur membrane de polyvinyHdene difluoride (PVDF) selon les techniques bien connues de l'homme du métier. Les bandes de PSA ont été colorées avec une solution de Rouge Ponceau S à 0,25% dans du TCA 3% (acide trichloroacétique), et la bande correspondant au PSA mature (environ 30 kDa) a été découpée et soumise à une dégradation d'Edman sur un sequenceur de protéines Procise 292A (AppHed Biosystems). Les résultats obtenus ont montré que le PSA immunopurifié par l'anticorps 5D3D11 ne contenait que la forme mature ( GG...), tandis que le PSA immunopurifié par l'anticorps 6C8D8 contenait la forme mature, ainsi que le proPSA(-7) et le proPSA(-5). 1.3.4 Mesure de l'activité enzymatique du PSA ceUulaire immunopurifié Les puits d'une plaque ELISA Nunc Maxisorp noire (compatible avec une détection en fluorescence) ont été coatés 2 heures à 37°C avec 100 μl d'une solution de streptavidine à 10 μg/ml en tampon carbonate pH 9,6 et bloqués pendant 2 heures à 37°C avec du TBS (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 0.15 M) contenant 2 mg/ml de BSA (Bovine Sérum Albumine) Après 3 lavages des puits en TBS-Tween 0,05%, 100 μl d'anticorps anti-PSA total biotinylé dUué à 10 μg/ml en TBS-BSA ont été introduits. L'anticorps anti-PSA total peut être soit l'anticorps 11E5C6 qui ne modifie pas l'activité enzymatique du PSA (Michel S. et al., 1999, supra), soit l'anticorps 8G8F5 (bioMérieux, France). Après 2 heures d'incubation à 37°C, les puits ont été lavés avec du TBS-Tween 0,05%, et le PSA immunopurifié par les anticorps 5D3D11 ou 6C8D8, dilué en TBS-BSA à 2,5 μg ml a été introduit et incubé toute la nuit à 4°C. Les puits ont été ensuite lavés à nouveau en TBS-Tween 0,05% et incubés 15 min. soit avec le TBS-BSA décrit ci-dessus (contenant 0,15 M de NaCl), soit avec du TBS-BSA dont la concentration en NaCl a été montée à 1,5 M. Les puits ont ensuite été vidés et mis en contact avec 100 μl du substrat fluorescent Mu- HSSKLQ-AFC (Enzyme System Products, fihale d'ICN) dUué à 300 μM en TBS-BSA contenant soit 0,15 M, soit 1,5 M de NaCl. La cinétique enzymatique a été suivie à 37°C pendant 2 heures (exdtation 390 nm, émission 510 n ; 1 mesure / minute) avec le lecteur Fluoroskan (Thermolabs Systems). L'activité enzymatique du PSA correspond à la pente de la courbe obtenue. Les résultats sont indiqués dans le tableau 1 ci- après : Tableau 1
Figure imgf000025_0001
L'activité enzymatique est exprimée en unités de fluorescence x 1000 / rninute. Ce tableau montre que le PSA immunopurifié par l'anticorps 5D3D11 possède une activité enzymatique détectable. Cette activité est augmentée en présence de NaCl 1,5 M. La capture du PSA par l'anticorps 8G8F5 augmente aussi l'activité enzymatique du PSA. Le PSA in-tmunopurifié par l'anticorps 6C8D8, quant à lui, n'a qu'une activité résidueUe détectable en présence de NaCl 1,5 M et de l'anticorps 8G8F5, montrant que cette forme de PSA immunopurifiée n'est pas activable. Cet exemple met en évidence que, parmi les formes Hbres actives du PSA dans les ceUules LNCaP, on trouve la forme Hbre activable qui est détectable selon le procédé de l'invention.
Exemple 2 ; Détection de la forme libre activable du PSA à partir de sérum de patients ayant un adénocarcinome de la prostate Le pool de sérum utiHsé est composé de 30 sérums de patients ayant un cancer de la prostate. Concentration de ce pool en PSA : PSA total : 71 ng/ml ; PSA Hbre : 12 ng/ml, déterminée à l'aide de FappareU Vidas. 2.1. Irnmunopurification de sérum On utiHse la résine décrite dans le paragraphe 1.2 comme support soHde ayant fixé les anticorps 5D3D11 et 6C8D8. 50 μl de ces résines sont mises en contact avec 1 ml du pool de sérum décrit ci- dessus pendant toute une nuit à 4°C sous agitation. Puis les tubes sont centrifugés, la fraction contenant le PSA non fixé a été conservée, la résine a été lavée 3 fois avec du PBS-Tween 0,5% (les fractions de lavages sont regroupées et conservées), puis le PSA fixé par les anticorps 5D3D11 ou 6C8D8 a été élue pendant 5 min avec 200 μl de Glycine 0,1 M PH 2,2 contenant 1 mg/ml de BSA et neutraHsé à pH 7,2 avec du Tris 2 M pH 8. 2.1. Mesure de l'activité enzymatique du PSA immunopurifié à partir de sérum Les puits d'une plaque ELISA Nunc Maxisorp noire (compatible avec une détection en fluorescence) ont été « coatés » 2 heures à 37°C avec 100 μl d'une solution de streptavidine à 10 μg/ml en tampon carbonate pH 9,6 et bloqués pendant 2 heures à 37°C avec du TBS (Tris-HCl 50 ΠM pH 7.5, NaCl 0.15 M) contenant 2 mg/ml de BSA (Bovine Sérum Albumine). Après 3 lavages des puits en TBS-Tween 0,05%, 100 μl d'anticoips anti-PSA total biotinylé diïué à 10 μg/ml en TBS-BSA ont été introduits. L'anticorps anti-PSA total peut être : o soit l'anticorps 11E5C6, qui ne modifie pas l'activité enzymatique du PSA, o soit l'anticorps 8G8F5 qui augmente l'activité enzymatique du PSA capté. Après 2 heures d'incubation à 37°C, les puits ont été lavés avec du TBS-Tween 0,05%, et 100 μl du PSA immunopurifié à partir de sérum par les anticorps 5D3D11 ou 6C8D8 ont été introduits et incubés toute la nuit à 4°C. Les puits ont ensuite été lavés à nouveau en TBS-Tween 0,05% et incubés 15 min avec du TBS-BSA 2 mg/ml dont la concentration en NaCl a été montée à 1,5 M. Les puits ont ensuite été vidés et mis en contact avec 100 μl du substrat fluorescent Mu-KGISSQY-AFC (Enzyme System Products, filiale d'ICN) dilué à 400 μM en TBS-BSA contenant 1,5 M de NaCl. La cinétique enzymatique a été suivie à 37°C pendant 2 heures (excitation 390 nm, émission 510 nm ; 1 mesure / minute) avec le lecteur Fluoroskan (Thermolabs Systems). L'activité enzymatique du PSA correspond à la pente de la courbe obtenue. Les résultats sont indiqués dans le tableau 2 ci- après : Tableau 2
Figure imgf000027_0001
L'activité enzymatique est exprimée en unités de fluorescence x 1000 / minute. *L' activité mesurée directement à partir du sérum (sans immunopurification) est sous-estimée, car le PSA activé se complexe immédiatement avec FACT sérique. Ce tableau montre que l'on est capable de mesurer une activité enzymatique sur du PSA immunopurifié à partir de sérum : le sérum contient donc du PSA Hbre activable. On constate toujours bien une différence significative d'activité entre le PSA immunopurifié par l'anticorps 5D3D11 et celui immunopurifié par l'anticorps 6C8D8, montrant que l'anticorps 5D3D11 reconnaît spécifiquement le PSA Hbre activable.
Exemple 3 ; Utilisation de l'anticorps 5D3D11 dans un test diagnostique pour la discrimination entre une BPH et l'adénocarcinome de la prostate Pour le dosage, on a utilisé l'appareil Vidas, adapté pour inclure les réactifs de dosage appropriés, mais utiHsé selon les instructions du fournisseur (bioMérieux, France). 3.1 Dosage du PSA activable dans des sérums de patients L'anticorps 5D3D11 est utiHsé comme anticorps de capture dans un test de type sandwich. Le PSA capté est détecté par l'anticorps anti-PSA total 5D5A5 couplé à la phosphatase alcaline. Le protocole est tel que décrit précédemment La standardisation du test a été effectuée selon les recommandations du fournisseur en utilisant du PSA séminal immunopurifié par l'anticorps 5D3D11 et dosé en PSA total. La limite de détection du test est 0,05 ng/ml de PSA actif/ml. La courbe de standardisation dans le domaine de concentration de 0 à 1,5 ng/ml est représentée sur la figure 2. Cette courbe, qui est proche d'une droite, met en évidence que le dosage avec un partenaire de Haison reconnaissant l'épitope mimé par la séquence SEQ ID N°l permet de détecter du PSA Hbre activable avec une bonne sensibilité. 3.2 Dosage du (PSA Hbre cHvé + PSA Hbre dénaturé) dans des sérums de patients On a répété le mode opératoire décrit précédemment, à ceci près qu'on a utiHsé l'anticorps anti-PSA Hbre 6C8D8 comme anticorps de capture pour la capture dans le sérum des formes de PSA Hbre inactif, ainsi que l'anticorps anti-PSA total 11E5C6 couplé à la phosphatase alcaline comme anticorps de détection, lequel reconnaît dans le cas présent les formes de PSA Hbre cHvé et Hbre dénaturé. 3.3 UtiHsation du rapport PSA activable/ÇPSA Hbre cHvé + PSA Hbre dénaturé) pour une meilleure discrimination entre un cancer de la prostate et une BPH Une étude rétrospective a été effectuée ayec 177 sérums de patients contenant du
PSA. Ces sérums correspondent à :
- 89 cancers de la prostate bien identifiés avec les taux de PSA totaux, les grades des tumeurs, les scores de Gleason et des informations éventueUes sur les traitements (radiothérapie, hormonotherapie, prostatectomie ou inconnu) effectués ultérieurement - 65 hyperplasies bénignes,
- 23 prostates normales (ayant des taux de PSA > à 2,5ng/ml mais des biopsies négatives). Sur ces sérums, on a calculé le rapport PSA Hbre activable/(PS A Hbre dénaturé + PSA Hbre cHvé) obtenu à l'aide des dosages précédents et on a reproduit ces valeurs sur le graphe de la figure 3, partie A Ainsi que le montre la partie A de la figure 3, en utilisant un seuiï de 0,66 pour des sérums ayant un taux de PSA total compris entre 2,5 et 10 ng/ml, le rapport PSA activable/(PSA Hbre cHvé + PSA Hbre dénaturé) permet de caractériser 22/33 cancers (67%), 19/19 prostates normales (100%) et 27/28 BPH (96%). A titre de comparaison, on a calculé le rapport PSA Hbre sur PSA total à l'aide de deux kits Vidas (Kit PSA total et Kit PSA Hbre, bioMérieux, France) selon les recommandations du fournisseur. Les résultats sont reproduits sur la partie B du graphe de la figure 3. Cette partie B montre qu'U existe une zone d'incertitude pour des valeurs de 0,15 à 0,25. 3.4 Sensibilité du procédé de l'invention 3.4.1 Pour les sérums inclus dans les zones d'incertitude des procédés de l'art antérieur Les valeurs des rapports PSA Hbre activable/(PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre cHvé) obtenues selon le procédé de l'invention pour les 28 sérums de la zone d'incertitude obtenue avec le procédé de F art antérieur ont été reproduites sur la figure 4. Cette figure met en évidence que, pour les sérums dont le rapport PSA Hbre/PSA total est compris entre 0,15 et 0,25, sérums dans lesquels les procédés connus ne permettent pas de discriminer un cancer d'une BPH, le rapport PSA activable/(PSA Hbre cHvé + PSA Hbre dénaturé) permet de caractériser 13/15 cancers (80%), 7/7 BPH (100%) et 6/6 prostates normales (100%). 3.4.2 Pour les sérums avant un taux de PSA inférieur à 2,5ng/ml On a sélectionné les 20 sérums de patients atteints de cancer (11) ou de BPH (9) ayant un taux de PSA inférieur à 2,5 ng/ml et on a reproduit les valeurs des rapports PSA Hbre activable/(PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre cHvé) sur la figure 5. Cette figure met en évidence que la discrimination entre un cancer de la prostate et une BPH en utiHsant le rapport PSA activable/(PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre cHvé) reste aussi valable pour des sérums ayant un taux de PSA inférieur à 2,5 ng/ml. 3.5 Modification de F anticorps de détection On a répété le mode opératoire ci- dessus avec 8 sérums, 5 sérums de patients atteints de cancer de la prostate et 3 sérums de patients atteints de BPH, à ceci près qu'on a utiHsé l'anticorps 11E5C6 (Michel S., et al., 1999, supra) comme anticorps de détection. Les résultats sont indiqués sur la figure 6 sur laqueUe les valeurs des rapports PSA Hbre activable/(PSA Hbre dénaturé + PSA ibre cHvé) en utilisant l'anticorps 5D5A5 comme anticorps de détection du PSA activable sont reproduites dans la partie A de la courbe, et les valeurs des rapports PSA Hbre activable/(PSA Hbre dénaturé + PSA Hbre cHvé) obtenues avec les mêmes sérums mais avec l'anticorps 11E5C6 comme anticorps de détection sont reproduites dans la partie B. Cette figure met en évidence qu'U existe bien une valeur- seuU quel que soit l'anticorps de détection utiHsé et que la valeur- seuU dépend de l'anticorps utiHsé en détection. Exemple 4 ; Détection de la forme libre activable du PSA à partir d'un partenaire de liaison capable de se lier de manière non spécifique au PSA libre activable dans un échantillon biologique 1. EchantiUons utilisés On a utiHsé neuf sérums individuels possédant des concentrations en PSA total variant de 157 à 3,8 ng/ml et provenant du CHU de Liège, soit de l'hôpital des Armées, Desgenettes, situé à Lyon. 2. Immunopurification du PSA à l'aide de l'anticorps 11E5C6 2.1. Couplage de l'anticorps avec des billes On a introduit dans des tubes 108 billes préalablement sensibiHsées à la streptavidine (Dynabeads® M- 280 Streptavidin, Dynal), soit 150 μl de solution de biUes, et on les a lavées 3 fois avec 500 μl de tampon phosphate 0,1 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, BSA 0,1% additionné de Tween 20 0,5% (tampon D + T 0,5%). Chaque lavage a été effectué à température ambiante pendant 5 min. sur la roue afin que la solution reste homogène. Les 108 biUes ont été couplées avec 500 μl d'anticorps 11E5C6 (bioMérieux,
Marcy, France) à 20 μgml, soit 10 μg d'anticorps, en tampon D -l- T 0,05% à température ambiante, pendant 30 min sur la roue. Après le couplage, 5 μl de biotine à 10 mM ont été ajoutés aux 500 μl de solution d'anticorps et incubés 30 min. à température ambiante sur la roue. Pour éliminer l'excédent de biotine et d'anticorps, les biUes ont ensuite été lavées 5 fois avec 500 μl de tampon D + T 0,5% sur la roue pendant 5 min à température ambiante. 2.2. Fixation du PSA 1 ml d'échantillon contenant le PSA (soit du PSA séminal dUué utiHsé comme témoin, soit du sérum) a été introduit dans les tubes contenant les 108 biUes et a été incubé pendant 1 nuit à 4°C. Après cette période d'incubation, le PSA non fixé a été récupéré et dosé afin de déterminer la quantité de PSA résidueUe. Trois lavages ont ensuite été effectués, afin de décrocher les protéines fixées de façon non spécifique, avec 500 μl de tampon D ayant une concentration en Tween 20 de 0,5%. 2.3. Elution Le PSA a été élue pendant 5 min. à température ambiante avec 100 μl de Tris- glycine 0,2 M pH 2,2 additionné de BSA à 1 mg/ml. Le pH acide entraîne la rupture de la Haison PSA-Ac. L'éluat récupéré a été neutraHsé avec 11 μl de Tris 0,1 M pH 9,6 afin d'éviter la dégradation de la protéine par l'acidité de la solution et de préserver son activité enzymatique. 3. Dosage des échantillons en PSA Hbre et PSA total On a effectué ce dosage en utiHsant l'appareU VIDAS (bioMérieux, Marcy, France), en utiHsant les kits de dosage mesurant le PSA total (TPSA) et le PSA Hbre (FPSA), selon les recommandations du fournisseur et selon le protocole suivant : Des anticorps spécifiques dirigés respectivement contre le PSA total ou le PSA Hbre sont fixés sur les cônes. Pour les deux tests, l'anticorps de détection est l'anticorps 11E5C6 couplé à la phophatase alcaline, qui catalyse la réaction d'hydrolyse du substrat en produit dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm. Chaque test nécessite 200 μl d'échantillon qui sont déposés dans la barrette et les résultats sont disponibles en lh. Le test TPSA a une sensibiHté de 0,07 ng/ml de PSA et peut détecter jusqu'à 100 ng/ml de PSA. Le test de FPSA a une sensibiHté de 0,05 ng/ml et peut détecter jusqu'à 10 ng/ml de PSA. 4. Mesure de l'activité enzymatique du PSA 4.1. Fixation des anticorps de capture Les puits d'une plaque ELISA ont été coatés avec 100 μl de streptavine (Hluée à 10 μg/ml en tampon carbonate pH 9,6, et incubés 2 h à 37°C. Les puits ont ensuite été saturés avec 250 μl de tampon Tris 50 mM + NaCl 0,15 M pH 7,5 (TBS) additionné de BSA à 2 mg/ml (TBS + BSA), afin d'éviter les fixations non spécifiques et donc de Hmiter le bruit de fond. Après 3 lavages en TBS contenant du Tween 20 à 0,05% (TBS + T 0,05%), 100 μl d'anticorps 8G8F5 (bioMérieux, Marcy, France) biotinylé à 10 μg/ml ont ensuite été ajoutés et incubés 2 h à 37°C. Cette étape a été suivie de 3 lavages en TBS + T 0,05%. 4.2. Incubation du PSA 85 μl de PSA dUué en TBS + BSA (PSA séminal ou sérum immunopurifié) ont été introduits dans les puits et incubés 1 nuit à 4°C. Les puits ont ensuite été lavés 3 fois en TBS + T 0.05%, ce qui permet d'éliminer le PSA non fixé. L'enzyme a ensuite été incubée 15 min à 37°C, avec 100 μl du substrat TBS + BSA additionné de NaCl à 1,5 M.. 4.3. Révélation et dosage Le substrat GISSQY-AFC a été dUué dans du TBS + BSA additionné de NaCl à 1,5 M. 100 μl de ce substrat dUué ont ensuite été ajoutés dans les puits et incubés à 37 °C. La fluorescence émise a été mesurée toutes les minutes pendant 2 h à 37°C, par l'appareU Fluoroskan (ThermoLabsystem). L'activité enzymatique de l'enzyme a été déterminée par le calcul de la pente de la cinétique et exprimée en unités de fluorescenœ*1000/min. 5. Résultats . Les résultats sont indiqués dans le tableau 3 ci- dessous.
Tableau 3
Figure imgf000032_0001
Parmi ces sérums, les sérums 1 et 9 proviennent de patients confirmés comme étant atteints du cancer de la prostate, ce qui est également confirmé par le procédé de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de diagnostic in vitro d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, caractérisé en ce qu'U comprend l'étape de détection, dans un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, de la forme Hbre activable du PSA.
2. Procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon la revendication caractérisé en ce qu'U comprend les étapes consistant à : i) mettre en contact un partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA
Hbre activable avec un échantillon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, ii) mettre en évidence la capture de la forme Hbre activable du PSA par ledit partenaire de liaison, Si) calculer le rapport entre la quantité de forme Hbre activable de PSA détectée dans l'étape H) et la quantité d'une forme de PSA autre que la forme Hbre activable, présente dans un échantiUon de même nature prélevé chez le même sujet, et iv) déteπniner si les patients sont affectés par un adénocarcinome de la prostate ou par une pathologie bénigne de la prostate en comparant la valeur du rapport déterminé dans l'étape Hi) à une valeur- seuU prédéterminée, choisie selon le type de rapport utiHsé et représentative de la limite de détection de chaque pathologie.
3. Procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit partenaire de Haison utiHsé dans l'étape i) est capable de reconnaître l'épitope mimé par la séquence SEQ ID N°1.
4. Procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que ledit partenaire de Haison utiHsé dans l'étape i) est un anticorps ou un fragment d'anticorps.
5. Procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la mise en évidence de la capture de la forme Hbre activable du PSA par ledit partenaire de Haison est mise en œuvre par détection indirecte par Intermédiaire d'un partenaire de détection, de préférence par l'utilisation d'un anticorps anti-PSA total.
6. Procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que la mise en évidence de la capture de la forme Hbre activable du PSA par ledit partenaire de Haison est mise en œuvre par détermination de l'activité enzymatique de la forme Hbre activable du PSA immunopurifiée et activée.
7. Procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon lune quelconque des revendications 2 à 6, caractérisé en ce qu'U utilise, outre le partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable, un anticorps capable d'augmenter l'activité enzymatique du PSA
8. Procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon l'une quelconque des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que la forme de PSA autre que la forme Hbre activable utUisée pour calculer le rapport est la forme Hbre inactive du PSA ou les formes Hbres chvées et dénaturées du PSA.
9. Kit de diagnostic permettant de diagnostiquer un adénocarcinome de la prostate ou une pathologie bénigne de la prostate, caractérisé en ce qu'U comprend :
- un partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable et
- des moyens pour doser les formes de PSA autres que la forme Hbre activable.
10. Kit de diagnostic selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit partenaire de Haison est capable de reconnaître l'épitope imé par la séquence SEQ ID N°l, de préférence un anticorps ou un fragment d'anticorps.
11. Kit de diagnostic selon l'une des revendications 9 ou 10, caractérisé en ce que lesdits moyens sont des anticorps ou fragments d'anticorps.
12. Conjugué constitué d'un partenaire de Haison capable de se Her spécifiquement au PSA Hbre activable et de la forme Hbre activable du PSA.
13. . Conjugué selon la revendication 12, caractérisé en ce que ledit partenaire de Haison est capable de reconnaître l'épitope iriimé par la séquence SEQ ID N°l.
14. Conjugué selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que la forme Hbre activable du PSA est activée.
15. Procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'U comprend les étapes consistant à : i) mettre en contact un partenaire de Haison capable de se Her au PSA Hbre activable de manière non spécifique, avec un échantiUon biologique issu d'un patient suspecté d'être atteint d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate, Ë) mettre en évidence la capture de la forme Hbre activable du PSA par ledit partenaire de Haison par détermination de l'activité enzymatique de la forme Hbre du PSA activée, après activation de la forme Hbre activable du PSA, m) calculer le rapport entre la quantité de forme Hbre activable de PSA détectée dans l'étape H) et la quantité d'une forme de PSA autre que la forme Hbre activable, présente dans un échantillon de même nature prélevé chez le même sujet, et iv) déterminer si les patients sont affectés par un adénocarcinome de la prostate ou par une pathologie bénigne de la prostate en comparant la valeur du rapport déterminé dans l'étape ni) à une valeur- seuU prédéterminée, choisie selon le type de rapport utiHsé et représentative de la limite de détection de chaque pathologie.
16. Procédé de diagnostic d'une pathologie bénigne de la prostate ou d'un adénocarcinome de la prostate selon la revendication 15, caractérisé en ce que F activation de la forme Hbre activable du PSA est mise en œuvre par utiHsation d'un anticorps capable d'augmenter l'activité enzymatique du PSA.
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