MÉTODO DE ANÁLISIS MOLECULAR Y TRATAMIENTO EN CÁNCER COLORRECTAL ESPORÁDICO INESTABLE
OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método de análisis molecular entre las formas esporádicas y las familiares de HPNCC en pacientes de cáncer colorrectal que puede ser utilizado como criterio de diagnóstico de dichos tumores así como en la prevención y tratamiento de los mismos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En términos absolutos, el cáncer es la segunda causa de muerte en España. De entre los múltiples tipos de cáncer destaca el cáncer colorrectal que causó el 11 % de las defunciones por cáncer en hombres y el 15% en mujeres según los datos de 1999. El riesgo acumulativo durante la vida de contraer la enfermedad es del 5-6%, estando influenciado por hábitos de vida y factores hereditarios. La forma de cáncer colorrectal más frecuente es el de tipo esporádico (80%) existiendo casos con componentes hereditarios: la poliposis adenomatosa familiar (FAP) (0,01%) y el cáncer colorrectal hereditario no-polipósico (HNPCC) (5-10%) (Lynch HT, Smyrk TC, Watson P, Lanspa SJ, Lynch JF, Lynch PM, Cavalieri RJ, Boland CR. Genetics, natural history, tumor spectrum, and pathology of hereditary nonpolyposis colorectal cáncer: an updated review. Gastroenterology. 1993 May; 104(5): 1535-49. Review), en el que los individuos afectados desarrollan en fases intermedias - tempranas de su vida (antes de los 50 años) tumores de colon, estómago, ovario, endometrio y en otros órganos. Los principales factores genéticos han podido ser determinados en los síndromes hereditarios, tanto de la poliposis familiar como en el síndrome hereditario del cáncer colorrectal no polipósico, asi como en el cáncer colorrectal esporádico. El desarrollo tumoral colorrectal es posiblemente la consecuencia de una serie de eventos
moleculares que se inician con una o varias mutaciones o eventos epigenéticos y sigue con fenómenos de progresión, en los que pueden estar involucrados factores tanto genéticos como ambientales. Recientemente se han caracterizado varias alteraciones genéticas relacionadas con el desarrollo de cáncer colorrectal, tanto en los síndromes familiares como en cánceres esporádicos. Así, el gen APC se ha localizado en el brazo largo del cromosoma 5 y relacionado con la FAP y la mayoría de cánceres esporádicos, mientras que, por otra parte, se han identificado los genes MLH1 y MSH2, como principales responsables del HNPCC. Por otra parte, también se han identificado activaciones por mutación puntual de oncogenes como el k-ras o aumento de la expresión del RNA mensajero del oncogen c-myc y pérdidas específicas del material de genes supresores, específicamente los localizados en los cromosomas 5 (APC) y 17 (p53), en especial en casos esporádicos. Clínicamente el HNPCC se define principalmente por su inicio temprano (< 50 años) y por la presencia de cánceres en familiares de primer grado en al menos dos generaciones contiguas. Los criterios clínicos están recogidos en los denominados criterios de Amsterdam I, II y Bethesda (Vasen HFA, Mecklin J-P, Khan PM, Lynch HT. The international collaborative group on Hereditary Nonpolyposis colorrectal cáncer (ICG-HNPCC). Dis. Colon Rectum 1991 ;34:424-5; Vasen HF, Watson P, Mecklin JP, Lynch HT. New clinical criteria for hereditary nonpolyposis colorectal cáncer (HNPCC, Lynch syndrome) proposed by the International Collaborative group on HNPCC. Gastroenterology. 1999 Jun; 116(6): 1453-6; Rodriguez-Bigas MA, Boland CR, Hamilton SR, Henson DE, Jass JR, Khan PM, Lynch H, Perucho M, Smyrk T, Sobin L, Srivastava S. A National Cáncer Institute Workshop on Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cáncer Syndrome: meeting highiights and Bethesda guidelines. J Nati Cáncer Inst. 1997 Dec 3; 89(23): 1758-62). Las investigaciones llevadas a cabo
mostraron que los tumores HNPCC se caracterizaban por la presencia de alteraciones somáticas en numerosas secuencias de microsatélites, que consistían en repeticiones de uno, dos o más nucleótidos (Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS et al. Clues to the pathogenesis of familial colorrectal cáncer. Science 1993;260:812-6.). Otros estudios mostraron que un subgrupo similar de tumores esporádicos (15%) mostraban también inserciones o delecciones en secuencias simples repetitivas, particularmente microsatélites (lonov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, Perucho M. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences_reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 1993;363:558-61 ; Thibodeau SN, Bren G, Schaid D. Microsatellite instability in cáncer of the proximal colon. Science 1993;260:816-9; Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS et al. Clues to the pathogenesis of familial colorrectal cáncer. Science 1993;260:812-6.). Estos tumores esporádicos mostraban características comunes con aquéllos que se desarrollaban en el síndrome de Lynch o HNPCC. Estos datos sugerían que los tumores HNPCC y cierto subgrupo de tumores esporádicos estaban asociados con un defecto que producía errores de replicación de DNA y ocasionaba alteraciones o inestabilidad en los microsatélites (lonov Y, Peinado MA, Malkhosyan S, Shibata D, Perucho M. Ubiquitous somatic mutations in simple repeated sequences reveal a new mechanism for colonic carcinogenesis. Nature 1993;363:558-61 ; Aaltonen LA, Peltomaki P, Leach FS et al. Clues to the pathogenesis of familial colorrectal cáncer. Science 1993;260:812-6.). Más tarde se observó que la alteración causada por disfunción de los genes reparadores de DNA (mismatch repair system o MMR) MLH1, MSH2 y MSH6 producía la inestabilidad de microsatélites (MSI-H) en los tumores de los pacientes con síndrome de Lynch (Strand M, Prolla TA, Liskay RM, Petes TD. Destabilization of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair. Nature. 1993 Sep 16; 365(6443): 274-6; Peltomaki P, Lothe RA, Aaltonen LA, et al. Microsatellite
instability is associated with tumors that characterise the hereditary non-polyposis colorrectal carcinoma syndrome. Cáncer Res 1993;53:5853-5; Thibodeau SN, Bren G, Schaid D. Microsatellite instability in cáncer of the proximal colon. Science 1993;260:816-9). A pesar de que el 90% de las mutaciones descritas en HNPCC hasta el momento afectan a los genes MLH1 y MSH2, sin embargo, estas mutaciones sólo están presentes en aproximadamente un 50% de los casos de HNPCC. Esto ha hecho que las estrategias de diagnóstico de HNPCC se basen tanto en criterios clínicos como en moleculares, siendo la detección de MSI-H un punto importante de inclusión en los programas de consejo genético. Sin embargo, debido a los problemas de costes y tiempo no se ha considerado efectivo realizar análisis de detección de MSI-H en todos los pacientes de cáncer colorrectal. A pesar de todo esto, si exceptuamos el inicio temprano y los antecedentes familiares, los tumores HNPCC y los MSI-esporádicos son virtualmente indistinguibles y la distinción entre ambos pasa por la laboriosa secuenciación de los genes MLH1, MSH2 y MSH6. Recientemente, (Davies H, Bignell GR, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S,
Teague J, Woffendin H, Garnett MJ, Bottomley W, Davis N, Dicks E, Ewing R, Floyd Y, Gray K, Hall S, Hawes R, Hughes J, Kosmidou V, Menzies A, Mould C, Parker A, Stevens C, Watt S, Hooper S, Wilson R, Jayatilake H, Gusterson BA, Cooper C, Shipley J, Hargrave D, Pritchard-Jones K, Maitland N, Chenevix-Trench G, Riggins GJ, Bigner DD, Palmieri G, Cossu A, Flanagan A, Nicholson A, Ho JW, Leung SY, Yuen ST, Weber BL, Seigler HF, Darrow TL, Paterson H, Marais R, Marshall CJ, Wooster R, Stratton MR, Futreal PA (2002) Mutations of the BRAF gene in human cáncer. Nature 417:949-54) se ha descubierto que el oncogén BRAF (B-Raf proto-oncogen serine/treonine-protein quinase (EC 2.7.1.-) (p94) (v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1 )) está activado por mutación en un 70% de melanomas, 10% de cánceres colorrectales y un subconjunto menor de otros tumores. La forma activada de
BRAF presenta un sitio puntual preferencial de mutación (hotspot: V599E), representado por un cambio de base en la posición 1796 del cDNA: A -> T que resulta en una substitución del aminoácido 599 que pasa a ser ácido glutámico en vez de la valina original. Esta mutación representa el 80% de las formas mutadas de BRAF y tiene una actividad quinasa aumentada y propiedades transformantes en células NIH3T3. También recientemente (Rajagopalan H, Bardelli A, Lengauer C, Kinzler KW, Vogelstein B, Velculescu VE. RAF/RAS oncogenes and mismatch-repair status. Nature 2002;418:934) se ha demostrado una asociación entre V599E y los tumores de colon con déficit de reparación, es decir, inestables para microsatélites (MSI-H). No obstante, se ha descrito que las mutaciones de BRAF en cáncer de colon no son atribuibles a defectos en el sistema de MMR (Wang L, Cunningham JM, Winters JL, et al. BRAF mutations in colon cáncer are not likely att butable to defective DNA mismatch repair. Cáncer Res 2003;63:5209-12), por lo que su implicación en el HNPCC es un interrogante y está por determinar. Por lo tanto, existe una necesidad en el estado del arte de identificar nuevos genes y/o mutaciones responsables y/o indicadores de los cánceres HNPCC versus MSI-esporádicos. La identificación de este/estos genes y sus posibles mutaciones permitiría un análisis molecular selectivo y rápido entre cáncer MSI esporádico y cáncer HNPCC que permitiría incluirlo en la práctica clínica habitual y realizar un tipado molecular universal de los tumores colorrectales diagnosticados. Al mismo tiempo produciría un ahorro de costes sanitarios y tiempos de espera inferiores a I l imitar l a secuenciación d e I os g enes responsables d e M MR a aquellos casos negativos. También permitiría la adopción de nuevos criterios pronósticos y de orientación terapéutica en los casos positivos ya que permitiría adaptar las terapias actuales y
personalizarlas a aquellos casos en los que el carácter hereditario queda indicado de forma temprana. Finalmente permitiría el diseño de terapias selectivas destinadas a inactivar estos genes. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención tiene por objeto un método de análisis de cáncer colorrectal que comprende analizar una muestra para determinar la presencia de una mutación p untual T 1796A e n e I g en B RAF q ue resulta e n I a m utación V 599E e n I a proteína BRAF cuya presencia permite descartar la naturaleza hereditaria del cáncer colorrectal como cáncer hereditario no polipósico (HNPCC) asociado a mutaciones de MLH1 o MSH2 u otras de otros genes reparadores del DNA e identificar el tumor molecularmente como MSI-H esporádico. En particular, dicha muestra puede ser DNA o RNA y puede aislarse a partir de células de tumor obtenidas por biopsia o cualquier otro método de extracción. Opcionalmente, la muestra analizada puede ser la proteína codificada por dicho gen o fragmentos de la misma. El método de diagnóstico de la presente invención comprende adicionalmente una detección mediante una amplificación por PCR, SDA o cualquier otro método de amplificación de DNA. En particular, dicha amplificación se realiza mediante el uso de cebadores alelo-específicos. Optativamente, la detección se puede llevar a cabo mediante secuenciación del DNA, por biochips de DNA realizados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo, por biochips de DNA realizados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo, por análisis conformacional del polimorfismo (SSCP) u otros métodos basados en el análisis conformacional o por análisis de restricción enzimática.
La presente invención también tiene por objeto proporcionar una molécula de DNA que cuando se encuentra mutada de forma específica permite clasificar el tumor como cáncer esporádico MSI-H, descartando el síndrome hereditario del cáncer colorrectal no polipósico HNPCC o síndrome de Lynch. La presente invención tiene también por objeto adicional proporcionar un método de análisis de pronóstico en la evolución del cáncer colorrectal esporádico inestable diferenciado del resto de los cánceres colorrectales esporádicos basado en la determinación de la actividad de la forma V599E del gen BRAF en tumores colorrectales MSI-H. El método de diagnóstico de la presente invención también tiene por objetivo el establecimiento de una estrategia terapéutica personalizada para el cáncer colorrectal esporádico inestable. Por otra parte, la presente invención tiene también por objetivo adicional proporcionar un método de análisis de compuestos para identificar agentes terapéuticos basados en la determinación de la actividad de la forma V599E del gen BRAF en tumores colorrectales MSI-H. También es objeto de la presente invención el uso de compuestos para eliminar la actividad de la forma V599E de BRAF en el tumor colorrectal esporádico para detener o revertir la progresión de este tipo de tumores. La presente invención tiene asimismo por objetivo adicional proporcionar un compuesto farmacéutico basado en interferencia de RNA para inhibir la actividad de la forma V599E del gen BRAF en tumores colorrectales MSI-H. Otro objeto adicional de la presente invencion es proporcionar un compuesto farmacéutico basado en oligonucleótidos anti-sentido para inhibir la actividad de la forma V599E del gen BRAF en tumores colorrectales MSI-H.
La presente invención también tiene por objeto adicional proporcionar un compuesto basado en interferir la replicación o traducción de la forma V599E del gen BRAF en tumores colorrectales MSI-H. Asimismo, la presente invención tiene por objeto proporcionar un compuesto basado en compuestos que inhiben de forma selectiva la actividad serina-treonina quinasa de la forma V599E BRAF en tumores colorrectales esporádicos MSI-H. La presente invención está basada en que una forma mutada del oncogén humano BRAF está siempre ausente de los tumores colorrectales que se desarrollan en el Síndrome de Lynch (HNPCC). Esta forma mutada en el nucleótido 1796 A- T implica un cambio de aminoácido de valina a un glutámico y comporta la activación constitutiva de la actividad Serina-Treonina quinasa de BRAF. Esta mutación ha sido descrita con anterioridad como presente de forma extensiva en melanomas, algunos cánceres colorrectales y otros tumores siendo una mutación preferencial (hotspot) que representa hasta el 92% de las mutaciones de substitución en este gen. Al mismo tiempo, los datos disponibles demuestran que esta mutación V599E se halla presente en, aproximadamente, la mitad de los tumores colorrectales esporádicos que presentan elevada inestabilidad de microsatélites (MSI-H). Los tumores colorrectales esporádicos y hereditarios tipo HNPCC son prácticamente indistinguibles histológica y patológicamente. El síndrome HNPCC se manifiesta por la aparición de tumores a temprana edad, la existencia de al menos dos familiares de primer g rado que han desarrollado tumores y la presencia de elevada inestabilidad de microsatélites o MSI-H. A pesar de esto, los datos clínico-familiares no son siempre claros ya que alrededor de un 20% de las familias con mutaciones germinales no cumplen los criterios de Amsterdam. La distinción molecular es muy compleja, especialmente porque también hay un subconjunto significativo de tumores esporádicos con MSI-H (aproximadamente un 15%).
Por lo tanto, la presente invención demuestra una disociación total de los tumores HNPCC y la mutación V599E de BRAF, que está presente en la mitad de los tumores colorrectales esporádicos que presentan elevada inestabilidad de microsatélites (MSI-H) lo que supone disponer por vez primera de una herramienta molecular gracias a la cual pequeños cambios genotípicos permiten distinguir de forma totalmente clara ambos tipos de tumores. Actualmente, los enfermos con criterios de Ámsterdam son primero analizados para MSI-H y, en el caso de dar un resultado positivo, son posteriormente analizados para MLH-1 y MSH-2 y, de ser estos resultados negativos, analizados para MSH-6. De acuerdo con el método de diagnóstico de la presente invención las pautas de análisis de tumores colorrectales no seleccionados quedarían de la siguiente forma:
De esta forma, un paciente que tiene un tumor colorrectai diagnosticado por una biopsia y con una apreciación clínica-familiar no definitiva sería sometido a pruebas preliminares de MSI-H. De ser positivo el resultado se procede al análisis molecular de una muestra del tumor mediante, por ejemplo, una amplificación por PCR o similar utilizando cebadores específicos para el exon 15 del gen BRAF sobre DNA genómico.
También se contempla como parte de la presente invención el uso de una terapia antineoplásica dirigida de forma específica a los pacientes con cáncer colorrectal esporádico inestable q ue muestran l a forma activada V599E BRAF. Esta terapia combina cualquier protocolo terapéutico estándar al que el paciente puede acabar desarrollando resistencia junto con una terapia específica antiBRAF. Ejemplos de terapias antitumorales estándar son tratamientos hormonales, con radiaciones ionizantes, con fármacos citotóxicos y/o citostáticos, con anticuerpos etc,. La terapia anti-BRAF c omienza p or d eterminar I a p resencia d e I a m utación V 599E e n I a m asa tumoral u otra muestra corporal. La inactivación de la vía mitogénica activada por V599E BRAF puede suponer la contención y/o regresión de la masa tumoral. El proceso de oncogénesis ocurre a través de la adquisición y selección de mutaciones somáticas múltiples cada una de las cuales contribuye a la supervivencia y expansión del tumor. El comportamiento maligno del tumor puede ser mitigado o revertido mediante la disminución selectiva de dichos oncogenes. Las aproximaciones de inhibición químicas o por anticuerpos se han probado con cierto éxito con la beta- catenina en el cáncer colorrectal y con BCR-ABL en leucemia mieloide crónica. Así, estas observaciones sugieren que ciertos oncogenes podrían ser susceptibles de una disrupción provocando la caída del fenotipo tumoral o permitiendo la eficacia del tratamiento estándar combinado. De entre los mecanismos de disrupción génica disponibles, la interferencia por RNAs de pequeño tamaño (RNAi) es una de las aproximaciones más prometedoras, inicialmente descubierto en petunias (Napoli C, Lemieux C, and Jorgensen R. ( 1990) Introduction of a chalcone synthase g ene into Petunia results ¡n reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell 2: 279-289) su mecanismo molecular de acción ha sido descrito (Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ. (2001 ) Post-transcriptional Gene Silencing by Double-stranded RNA. Nature Rev Gen 2: 110-119) y ha suscitado una gran expectativa en sus aplicaciones
antitumorales (Kittler R, Buchholz F.RNA interference: gene silencing in the fast lañe. Semin Cáncer Biol. 2003 Aug;13(4):259-65; Deveraux QL, Aza-Blanc P, Wagner KW, Bauerschlag D, Cooke MP, Hampton GM. Exposing oncogenic dependencies for cáncer drug target discovery and validation using RNAi. Semin Cáncer Biol. 2003 Aug;13(4):293-300; Bedford JS, Liber HL Applications of RNA interference for studies in DNA damage processing, genome stability, mutagenesis, and cáncer. Semin Cáncer Biol. 2003 Aug;13(4):301-8). Un ejemplo de este efecto puede postularse con líneas celulares de origen tumoral colorrectal que muestran un genotipo K-RAS negativo BRAF positivo. Un ejemplo de estas líneas son las Linea Linia RKO, con capacidad clonogénica. Ref. J Biol Chem. 2002 May 24;277(21): 19156-65. Linia HT29, con capacidad clonogénica.: Ref. Br J Cáncer. 2003 Dec 15;89(12):2277-83. Para un tratamiento específico con RNA de interferencia de pequeño tamaño
(21-mers) hay que seleccionar secuencias específicas dentro del cDNA para su uso como diana anti-BRAF. Las secuencias candidatas son comparadas mediante algoritmos BLAST o similares para eliminar aquellas que no son únicas. En la tabla siguiente se describen como ejemplo algunas de las dianas posibles en el cDNA
Las células tumorales en cultivo son conocidas por su pérdida de inhibición por contacto lo que las hace crecer a confluencia en un cultivo y posteriormente formar agregaciones que continúan creciendo en tres dimensiones (foci) Estos foci mimetizan de alguna forma el crecimiento tumoral. En un experimento tipo las células RKO o HT29 cultivadas en condiciones estándar en medio de Dulbecco modificación de Eagle (DMEM) suplementado con 10% fetal calf serum (FCS), 100 unidades/ml de penicilina, y 100 μg/ml of streptomicína, bajo 5% CO
2 forman foci. Por el contrario, las células tratadas con los RNAi no muestran una capacidad para formar estos foci y muestran una tasa de crecimiento diferente de las células sin tratar. También se contempla como parte de la presente invención el uso de la forma activada V599E BRAF para realizar análisis de compuestos terapéuticos y/o composiciones farmacéuticas que puedan remediar el potencial oncogénico de BRAF en cáncer colorrectal esporádico inestable. Estos compuestos terapéuticos y/o composiciones farmacéuticas pueden unirse a la proteína BRAF mutada y restaurar la actividad normal de la misma. De forma alternativa, estos compuestos terapéuticos y/o composiciones farmacéuticas p ueden modificar I a e xpresión d e v ías d e s eñalización celular alternativas q ue p ueden compensar la activación incontrolada de BRAF. Los análisis de compuestos terapéuticos y/o composiciones farmacéuticas pueden realizarse de forma comparativa por análisis de aplicación directa a las células normales y células con la versión activada del oncogén. Estas células pueden ser una línea celular proveniente de un tumor colorrectal o de otro tipo de tumor y con un genotipo similar al encontrado en los tumores extirpados (por ejemplo K-Ras-/BRAF+) y que pueda suponer un razonable modelo biológico para el estudio de la progresión/regresión tumoral. Alternativamente estas células pueden obtenerse directamente de tumores extraídos y puestas en cultivo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 representa la detección por polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP) de los casos HNPCC. En esta figura se muestran los amplicones obtenidos a partir de tumores colorrectales HNPCC (carriles 16 a 27 y carriles 28 a 39), junto con los controles positivo y negativo, analizados por movilidad mediante un gel radiactivo vertical no desnaturalizante. DESCRIPCIÓN DE UNA REALIZACIÓN PREFERENTE A continuación se describe una realización preferente, aunque no limitativa, de la invención. Amplificación de muestras de DNA obtenidas a partir de tumores colorrectales previamente clasificados como HNPCC. La reacción de amplificación de muestras de DNA obtenidas a partir de tumores colorrectales previamente clasificados como HNPCC se llevó a cabo sobre DNA genómico utilizando cebadores específicos para el exon 15 del gen BRAF, como por ejemplo el cebador directo 5'-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3' y el cebador reverso 5'-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3', partiendo de unos 50 ng de molde y un ciclo con una fase de desnaturalización de 30 s. a 94°C seguida de un anillamiento durante 20 s. a 60°C y una posterior extensión de 30 s. a 72°C. Este ciclo se repitió durante 30 o 35 veces. Posteriormente el producto de PCR se purificó mediante un kit de p urificación d e p roductos d e a mplificacion Wizard™ P CR P reps D NA P urification System de Promega y posteriormente se secuenció siguiendo las instrucciones del kit ABI prism Dye terminator de Perkin Elmer. Una secuencia de pasos similar puede realizarse a partir de RNA previo paso de construcción de una 1
a cadena complementaria de cDNA utilizando una mezcla de cebadores hexameros-aleatorios que priman de forma estadística todos los mensajeros de la célula y añadiendo los mononucleótidos y un tampόn necesario para la acción de
la enzima Transcriptasa Reversa. A partir de la construcción de la primera cadena de DNA complementario se puede amplificar un fragmento de cDNA de BRAF conteniendo la zona de mutación preferencial empleando en este caso oligonucleótidos cebadores adaptados al molde sin intrones. Detección por polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP) de los diferentes tumores colorrectales previamente clasificados como HNPCC. El análisis del producto de amplificación obtenido puede llevarse a cabo por secuenciación directa o por SSCP y secuenciación de los amplicones con polimorfismos. Cuando están presentes los polimorfismos provocan un cambio conformacional que redunda en una diferente velocidad de migración. En la figura 1 se muestran los amplicones que se obtuvieron a partir de tumores colorrectales HNPCC y se analizaron por movilidad mediante un gel radiactivo vertical no desnaturalizante. Como puede observarse, todos los casos eran negativos para V599E. BRAF se amplificó por PCR utilizando el mismo protocolo mencionado anteriormente, pero añadiendo isótopos radioactivos, concretamente alfa-
32P dCTP. El producto de reacción se resolvió previa desnaturalización a 95°C, en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 5% en el sistema mutation detection enhancement gels (MDE - Flowgen, Rockland, ME, USA), a 8°C durante 16 horas. Se procedió a su secado a 80°C durante 1 hora y a su exposición autoradiografica y revelado posterior, a las 24 horas. Las bandas PCR alteradas se purificaron posteriormente y se secuenciaron en un ABI Prism 377 automatic sequencer (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA) usando ABI Prism Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer).