WO2005062043A1 - Untersuchungsverfahren zur phagozytose - Google Patents

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WO2005062043A1
WO2005062043A1 PCT/EP2004/014606 EP2004014606W WO2005062043A1 WO 2005062043 A1 WO2005062043 A1 WO 2005062043A1 EP 2004014606 W EP2004014606 W EP 2004014606W WO 2005062043 A1 WO2005062043 A1 WO 2005062043A1
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particles
fluorescence
cells
dependent
fluorescent
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PCT/EP2004/014606
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Marion Schneider
Jörg WIEDENMANN
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Universität Ulm
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    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/5055—Cells of the immune system involving macrophages

Definitions

  • the invention relates to a method for examining the activity of cells to process phagocytized particles and / or to present fragments of phagocytated particles.
  • phagocytosis essentially comprise myeloid cells, macrophages, granulocytes, monocytes, endothelial cells and dendritic cells as well as precursors and differentiation products derived from these cell types.
  • a prerequisite for the phagocytosis of the undesired particles is that the cells capable of phagocytosis bind the particle and as
  • processing takes place primarily by means of modification or degradation by pH-dependent denaturation, by reactive oxygen species and / or proteolysis. These processing reactions are carried by enzymes from the corresponding immune cells.
  • the modified and fragmented foreign particles are made accessible by the antigen-presenting cells on the cell surface for subsequent processes of the immune reaction.
  • a disturbance in the immune response can therefore lie in opsonization, phagocytosis, processing and / or in the antigen presentation.
  • Corresponding diseases that are based on such defects in the immune system can manifest themselves, for example, through a lack of immune response to pathogens or else through an immunological overreaction. These defects can therefore z. B. manifest as immune insufficiency, tumor formation, allergy or autoimmune disease. These diseases can be caused, for example, by genetic defects, which can impair the functionality of the enzymes involved, or by a disturbed regulation of the enzymes involved, e.g. B. as a result of an infection. Possible therapy for this is either stimulation of the immune system or suppression of the immune response.
  • Such methods can be used to diagnose disorders which relate to the uptake of particles recognized as foreign to the body or as undesirable, that is to say phagocytosis in the true sense.
  • the diagnosable disorders are primarily in the area of non-specific immunity, in which monocytes and granulocytes absorb and break down undesirable particles in order to eliminate them. Faults in the subsequent processes, in particular the processing of the ingested particles and the subsequent presentation on the surface of the phagocytic cells, are not recognized using conventional methods.
  • disorders of the dendritic cells which are primarily responsible for the antigen presentation as a prerequisite for induction of the primary cytotoxic T cell response, are not covered by this.
  • the object of the invention is therefore to provide a method with which the processes downstream of phagocytosis, that is to say in particular the processing and the antigen presentation, can be examined.
  • this method is intended to make it possible to diagnose corresponding diseases, in order then to treat the defect in a targeted manner if necessary.
  • the new method is intended to detect disorders of the dendritic cell functions which are crucial for the generation of a primary cytotoxic T cell response.
  • the aim of the new method is to be able to detect the cellular initiators of a specific immune response.
  • the new method should above all be able to investigate the ability to process these various phagocytic cells and their ability to present antigens, or should it be possible to detect corresponding disorders.
  • diagnosis of clinical clinical pictures in particular of severe clinical pictures, is to be made possible, which are based on defects in molecular "trafficking", whereby the phagocytosis of foreign particles, infectious agents or agents, dead or aberrant endogenous cells, such as e.g. B. tumor cells, and the subsequent processing and presentation of these particles is disturbed or impaired.
  • the new method is intended to enable screening and / or analysis of potential therapeutically active substances which change the immune response in the desired manner.
  • the aim of the new procedure is also to be able to investigate and analyze the effects of therapeutic interventions in the event of immune response disorders.
  • the new method should make it possible to screen and / or analyze potential pathogenic or allergenic substances which cause disorders in the above-mentioned processes of the immune response.
  • the method according to the invention is used to investigate the activity of cells to process phagocytized particles as a result of the fusion of the endosome and lyosome and / or to present fragments of phagocytosed particles.
  • particles are first provided which are marked by fluorescence. These particles contain at least one pH-dependent or pH-sensitive fluorescent dye.
  • the labeled particles are incubated with the cells whose activity is to be examined.
  • the cells are analyzed by fluorescence microscopy, fluorimetric and / or fluorescence cytometric methods. It is crucial for this method that the fluorescence is at least partially detectable over at least 12 hours.
  • the temporal persistence of fluorescence depends on the experimental conditions chosen. For example, the activity of the cells has an influence on the detectability of the fluorescence. Therefore, the time of 12 hours is an indication, which can be subject to certain fluctuations.
  • the method according to the invention is therefore based on the absorption of phagocytable particles which represent, for example, a model exciter. These particles are marked by pH-dependent fluorescent dyes and in particular by pH-dependent fluorescent proteins, so that the phagocytosis of these pH-dependent fluorescent particles makes an accumulation of the fluorescence in the cell interior visible and quantifiable. In the course of processing the particles or the model exciter, the fluorescence inside the cell decreases due to the cell-specific degradation of the pH-dependent fluorescent dyes or their inactivation.
  • the cells to be examined are advantageously cells which are capable of phagocytosis.
  • Mammalian cells, in particular cells of the immune system, are particularly suitable. These are advantageously myeloid cells, that is to say cells whose precursors are generated in the bone marrow, as well as monocytes, macrophages, granulocytes, endothelial cells and dendritic cells.
  • the dendritic cells are of particular interest for the method according to the invention, since these are extremely potent antigen-presenting cells which essentially induce the primary cytotoxic T cell response and are responsible for the activation of regulatory T cells (T reg ).
  • differentiation products and / or precursors or precursors of these cells derived from these cells can be investigated with the method according to the invention.
  • the method according to the invention can also be used to examine other cells insofar as they are phagocytotically active, for example slime molds, unicellular lower organisms or the like.
  • the detection of the pH-dependent fluorescence or of the pH-dependent fluorescent dyes in the course of the analysis of the cells can be carried out both by light microscopy and fluorescence microscopy and in particular by automated methods.
  • Flow cytometry or fluorimetry is particularly preferred, in particular in plate measuring devices.
  • the labeled particles or the model pathogens are advantageously incubated with cells in whole blood or in isolated form in a manner which enables normal physiological processes to take place.
  • suitable buffer solutions are used, for example, which provide a physiological milieu.
  • the labeled particles are removed by the cells according to their - o -
  • Phagocytosis activity recorded so that after phagocytosis, the cells are marked by the pH-dependent fluorescence of the recorded particles.
  • this phagocytosis activity of the cells to be examined can be evaluated by appropriate analysis of the fluorescence of the cells, for example by using a fluorescence cytometer or by fluorimetric plate measuring devices.
  • the phagocytosed particles are located within the cells to be examined and come into contact with the degradation apparatus of the cells. The degradation or degradation or fragmentation of the ingested particles depends on the fusion of the primary endosomes, within which the phagocytized particles are initially enclosed, with lysosomes in the phagocytic cells.
  • lysosomes are equipped with different enzymes, which among other things cause the destruction or fragmentation of the phagocytosed particles and the components of the particles.
  • the particles or the model exciters are still recognizable as granular structures under the fluorescence microscope after phagocytosis. If the particle is broken down further in the course of processing, the fluorescence signal appears to be distributed uniformly in the cytoplasm of the phagocytic line. This ability to analyze the further fate of the phagocytosed particles represents a particular advantage of the method according to the invention, since this is not possible with conventional methods.
  • the fate of a particle after phagocytosis in the cell depends in particular on the stability of the components to be processed or the proteins of the particle.
  • the biochemical nature of the protein and the enzyme activation in the cell to be examined play a role.
  • the kinetics of protein degradation is denatured in Influenced by the acidic pH conditions in the lysosomes and by degradation or degradation as a result of proteolysis and / or oxidation.
  • pH-dependent fluorescence or the corresponding pH-dependent fluorescent dyes used in the process according to the invention which are essentially pH-dependent fluorescent proteins
  • functional phagocytic cells occur over time degradation of the pH-dependent fluorescent proteins, in particular through the action of acidic pH, reactive oxygen species and / or proteases.
  • the associated destruction of the tertiary structure of the pH-dependent fluorescent proteins or the pH-dependent fluorescent dyes leads to a loss of fluorescence.
  • the capacity of the cells capable of phagocytosis to break down proteins can thus be shown and quantified.
  • this capacity can be quantified on the basis of the loss of fluorescence of the cells to be examined. This is preferably done after a sufficient incubation period within which the corresponding phagocytosis and processing processes in the cell have taken place. These incubation times are preferably standardized. Furthermore, different incubation times can advantageously be used in order to be able to draw conclusions about the temporal courses of the corresponding processes.
  • the particles which are to be phagocytosed by the cells to be examined are advantageously membrane-coated structures.
  • the particles can have, for example, a double membrane, for example as in eukaryotes, certain viruses, artificial vesicles or exosomes, or a single membrane, for example in prokaryotes. It is particularly preferred if the particles have receptors which facilitate phagocytosis by so-called opsonization.
  • the particles are bacteria, cyanobacteria, fungi and / or eukaryotic cells such as, for example, tumor cells, and particles derived from tumor cells, such as, for example, exosomes or organelles, which are marked by pH-dependent fluorescence.
  • the phagocytosis, processing and / or presentation of viruses can also be advantageously examined with the method according to the invention.
  • synthetic particles such as lipid vesicles or latex beads are used. These particles primarily serve as carrier substances for the pH-dependent fluorescent dyes or antigens, the further processing of which is followed in the course of the method according to the invention.
  • the particles are advantageously infectious particles which play a role in immune reactions. In order to investigate corresponding immune reactions, such infectious particles can be used in the method according to the invention. On the other hand, it can also be preferred if particles derived from such particles are used which are not infectious, in particular for humans. This has the advantage that the method according to the invention can be carried out without security risks.
  • the most important infectious particles or pathogens To cover, the following model pathogens are preferably used as particles in the process according to the invention: Escherichia coli as a gram-negative pathogen, which plays a role in abdominal surgery, for example, and / or staphylococci as representatives of gram-positive pathogens, which are particularly involved in pneumonia.
  • viruses can also be used which can trigger acute, chronic and / or latent infections.
  • recombinant, non-infectious and / or transformation-defective organisms are advantageously used which, for example, express properties of common viruses such as CMV or EBV or of tumor antigens on the surface.
  • eukaryotic cells as particles, in particular those cells come into question which can form tumors in mammalian organisms.
  • These can also be autologous tumor cells, for example, in order to use the method according to the invention to check the immunity situation against a tumor.
  • fragments of these particles are also suitable for the process according to the invention.
  • the particles or the model exciter can be used both in the living and / or functional state and in the inactivated state.
  • Inactivation can e.g. B. by fixing the microorganisms used and has the advantage that safety risks are largely avoided, for example, in the case of infectious particles.
  • pH-dependent fluorescent dyes in particular different pH-dependent fluorescent proteins and / or peptides, can be used to provide particles labeled with pH-dependent fluorescence.
  • all pH-dependent fluorescent proteins or peptides are suitable for use in the method according to the invention have sufficient long-term detectability or a corresponding stability.
  • proteins and peptides that have been modified by chemical and / or molecular biological methods. Both naturally occurring and artificially modified pH-dependent fluorescent proteins or peptides can be produced by recombinant expression and linked to the particles to be phagocytosed, or can even be expressed within the particles by recombinant expression.
  • the term “protein” should also be understood to mean a peptide, even if this is not expressly mentioned.
  • the fluorescent dye used is the green fluorescent protein from Aequorea victo a or a protein or peptide which can be derived therefrom and which has a pH-dependent fluorescence emission spectrum.
  • these fluorescent proteins have usually been used to detect the location of fusion proteins or to measure gene activity.
  • these fluorescent dyes can now be used to label phagocytable particles, for example bacteria or other microorganisms.
  • these fluorescent dyes can also be used to label eukaryotic cells, in particular tumor cells, and to use them for the method according to the invention.
  • the particular advantage of using this green fluorescent protein or proteins or peptides derived therefrom that have a pH-dependent fluorescence emission spectrum is the extraordinary stability of these fluorescent dyes (green fluorescent protein - _
  • the green fluorescent protein from Aequorea victoria and proteins and peptides that can be derived therefrom and have a pH-dependent fluorescence emission spectrum are therefore particularly suitable for the process according to the invention owing to their extraordinary stability.
  • the pH-dependent fluorescent dye is a protein or peptide with a fluorophore, which consists of at least three amino acids.
  • the second amino acid of these at least three amino acids of the fluorophore is preferably tyrosine and / or the third amino acid is glycine.
  • the first position is variable.
  • the pH-dependent fluorescent dye is a photosynthetic pigment, e.g. B. chlorophyll, or accessory photosynthetic pigments, such as phycobiliproteins.
  • a photosynthetic pigment e.g. B. chlorophyll
  • accessory photosynthetic pigments such as phycobiliproteins.
  • the use of phycoerythrin as a pH-dependent fluorescent dye is very particularly preferred.
  • the fluorescent dye used is a pH-dependent fluorescent protein or peptide.
  • Certain immune defects are associated with an abnormal pH environment in the lysosomes of the phagocytic cells.
  • particles or model exciters in the method according to the invention which are labeled with pH-dependent fluorescent proteins or peptides.
  • Such fluorescent proteins or peptides preferably show one at an acidic pH Decrease in fluorescence.
  • the content of lysosomes normally shows an acidic pH of around pH 4-5.
  • the particles labeled with pH-dependent fluorescence have at least one naturally expressed pH-dependent fluorescent dye.
  • Particularly preferred particles are autofluorescent microorganisms, in particular bacteria, cyanobacteria (blue-green algae) and / or algae.
  • the dinoflagellates, in particular endosymbiotic dinoflagellates, are particularly advantageous here. Fragments of these particles can also be used.
  • This auto- or self-fluorescence of the microorganisms has the advantage that these particles are used without further labeling reactions , _. - 15 -
  • the particles labeled with pH-dependent fluorescence have at least one recombinantly expressed pH-dependent fluorescent dye. This is made possible in particular by an autocatalyzed formation of the fluorophore in pH-dependent fluorescent proteins or peptides.
  • at least one pH-dependent fluorescent protein or peptide is expressed within the particles. They can be particles which naturally express one or more pH-dependent fluorescent proteins or peptides, or else particles in which a corresponding expression takes place due to genetic engineering manipulation.
  • the corresponding coding DNA is introduced into the model pathogen in such a way that expression of the protein or peptide in the organism itself is possible.
  • the corresponding coding DNA is placed under the control of a suitable promoter, for example, and is introduced into the organism, which is used as a particle, in particular in the form of a suitable vector.
  • Corresponding proteins or peptides are preferably expressed stably and over a longer period of time, so that the particles can be used for the method according to the invention without further preparation.
  • the particles express the corresponding protein or peptides transiently, ie temporarily.
  • the corresponding particles or model exciters usually have to be carried out before the method according to the invention is carried out molecular biological methods are treated. Appropriate procedures open up to the expert.
  • one or more pH-dependent fluorescent dyes are bound to the particles, for example by being coupled to the surface of the particle.
  • pH-dependent fluorescent proteins and / or peptides can be cleaned or enriched in order to then bind them to the particles to be phagocytized using conventional methods.
  • recombinantly produced pH-dependent fluorescent proteins and / or peptides can also be used for this purpose.
  • the purification of the pH-dependent fluorescent proteins and / or peptides and the labeling of the particles can, for. B. advantageously by filtration and / or centrifugation techniques in one step.
  • a preferred example of a coupling of the pH-dependent fluorescent proteins or peptides is a coupling via biotin-streptavidin bonds.
  • pH-dependent fluorescent proteins and / or peptides are specifically bound to the particles.
  • the pH-dependent fluorescent proteins are bound or immobilized via metal-affine peptide tags, which are attached to the fluorescent protein in particular by molecular biological methods.
  • metal-affine peptide tags are commonly used in affinity chromatography.
  • 6x histidine tag is an example of this.
  • pH dependent fluorescent proteins and / or peptides which in particular can carry further functionalities such as the peptide tags mentioned, which are advantageous for binding to the particles or for immobilization, can also bind naturally occurring pH-dependent fluorescent proteins or peptides to corresponding particles become.
  • the phycobiliprotein phycoerythrin is an example of this.
  • the pH-dependent fluorescent dyes that is to say in particular pH-dependent fluorescent proteins or peptides, are coupled with further peptides and / or proteins.
  • This coupling is preferably carried out by a fusion of the peptides or proteins, so that the pH-dependent fluorescent dye is expressed as a fusion protein.
  • viruses are to be used as particles or model pathogens, their fluorescent labeling is preferably carried out by a suitable host organism.
  • the genetic information of the virus is changed to the extent that one or more viral proteins are expressed in fusion with pH-dependent fluorescent proteins or peptides.
  • the particles labeled with pH-dependent fluorescence have at least two different pH-dependent fluorescent dyes.
  • one type of particle for example bacteria, cyanobacteria and / or algae, has a naturally expressed pH-dependent fluorescent dye and at least one recombinantly expressed pH-dependent fluorescent dye.
  • the invention also encompasses particles which have two or more recombinantly expressed different pH-dependent fluorescent dyes.
  • the different pH-dependent fluorescent dyes in particular as a result of different pH-dependent emission spectra, produce distinguishable fluorescences.
  • This can advantageously be used for various aspects of the method according to the invention.
  • the various pH-dependent fluorescent dyes which bring about the distinguishable fluorescence react differently to the intracellular activities of the cells to be examined.
  • one of these pH-dependent fluorescent dyes, in particular one of the pH-dependent fluorescent proteins is broken down more quickly by the intracellular enzymes than the other pH-dependent fluorescent protein. This can be caused by the fact that, for example, one of the pH-dependent fluorescent proteins has specific interfaces for intracellular proteases, whereas the other protein does not contain these interfaces.
  • one of the fluorescent proteins can be a pH-dependent fluorescent protein and the other one can be a protein which is essentially unaffected by the pH within the cell.
  • one of the pH-dependent fluorescent proteins can be a protein act, the fluorescence of which decreases in contact with reactive oxygen species faster than with the other protein, the fluorescence of which remains largely stable under these conditions.
  • the pH-dependent fluorescent dyes or, in particular, the pH-dependent fluorescent proteins, which bring about the distinguishable fluorescence have different stabilities.
  • This can be, for example, compartment-specific stabilities.
  • the conditions e.g. pH value, protease equipment
  • the different compliments e.g. exosomes, lysosomes
  • pH-dependent fluorescent dyes which each react to certain of these conditions, statements can be made about compartment-specific processes.
  • a particular advantage of using different and distinguishable pH-dependent fluorescent dyes is that, for example, the use of pH-dependent fluorescent proteins with different colors and stability can improve the quantification of the processing capacity of the cells to be examined.
  • the use of two different pH-dependent fluorescent proteins which differ in their sensitivity to cellular degradation systems, makes it possible to measure the processing capacity of phagocytic cells, such as is caused by the protease activity of the enzymes involved.
  • the more stable protein serves as an internal standard for quantifying the amount of protein incorporated, whereas the more unstable protein serves as a pointer for, for example, protease-related degradation.
  • This form of test enables, for example, the diagnosis of immunodeficiencies that are triggered by an abnormal or missing protease activity.
  • pH-dependent fluorescent proteins can be used, in which such differences were generated artificially, in particular by molecular biological methods. This is done, for example, by targeted stabilization by removing suitable protease interfaces and / or by targeted destabilization by adding suitable protease interfaces.
  • a similar parallel approach can be carried out with a pH-dependent fluorescent protein and a differently colored, more stable fluorescent protein, which serves as an internal standard.
  • the protein or peptide, which serves as an internal standard must have little or no pH dependence of the fluorescence.
  • An example of a stable protein which is essentially pH-independent is the red fluorescent protein eqFP61 1 (Wiedenmann et al. (2002) Proc Natl Acad Sei 99: 1 1646-1 1651).
  • the protein lhFP516 / 581 can be used as the pH-dependent fluorescent protein.
  • pH-dependent fluorescent proteins or peptides are used, which differ both in terms of the color of the fluorescence and in terms of the stability towards reactive oxygen species. In this way, statements about the involvement of reactive oxygen species in degradation processes can be made in a particularly advantageous manner.
  • these fluorescences are brought about by at least two different pH-dependent fluorescent dyes, in particular by at least two pH-dependent fluorescent proteins or peptides.
  • the distinguishable fluorescences are brought about by at least two distinguishable pH-dependent fluorescent states of a protein.
  • These different fluorescent states of a protein preferably differ in terms of their stability.
  • An example of this is the pH-dependent fluorescent protein lhFP516 / 581 from Lobophyllia hemprichii.
  • This protein can be specifically and irreversibly converted from a green fluorescent to a red fluorescent form by irradiation with short-wave light.
  • the degree of photoconversion and thus the quantitative ratio between the green and red fluorescent form can be controlled, for example, by the intensity and duration of the irradiation and can also be carried out within a particle, in particular within a model exciter. Both conditions are pH dependent.
  • the red fluorescent form shows a lower resistance to reactive oxygen species. If both the green and the red fluorescence are quantified, for example in a fluorescence cytometer, the degradation capacity and thus the processing activity of the cells to be examined can be calculated from their ratio.
  • the presentation of fragments of the phagocytosed particles is examined by the cells to be examined.
  • This examination of the so-called antigen presentation either takes place in addition to the analysis of the processing capacity or the processing activity of the cells or becomes independent of this carried out.
  • fragments of the pH-dependent fluorescent proteins or peptides and / or fragments of the peptides and / or proteins fused with these proteins or peptides are analyzed, which appear on the surface of the cells to be examined during the course of the antigen presentation.
  • the processed components or fragments are presented as peptides of a relatively constant length by certain immune cells, in particular dendritic cells, on their surface.
  • the understanding of these relationships has been discussed above all in connection with considerations regarding vaccination strategies (Hung and Wu (2003) Gurr Opin Mol Ther 5 (1): 20-4).
  • the antigen presentation is the prerequisite for the progress of the further immune reactions of a mammalian organism.
  • the method according to the invention is particularly advantageously suitable for examining these processes and in particular the capacity of the phagocytic cells to present antigens.
  • Defined antigens are introduced into the phagocytic cells by the pH-dependent fluorescent proteins or peptides used in the method according to the invention. Since these proteins or peptides do not normally occur naturally in the mammalian organism, antigens derived from them can be detected with great certainty.
  • the fragments presented are preferably detected using antibodies which recognize fragments of the pH-dependent fluorescent proteins or peptides.
  • polyclonal and monoclonal antibodies can be used.
  • Monoclonal antibodies are particularly preferred because they show a particularly high specificity for the antigens to be recognized.
  • these antibodies are labeled, which makes it easier to detect the binding of the antibodies to the respective antigens.
  • the antibodies must be labeled with distinguishable pH-dependent fluorescent dyes.
  • Other methods of antibody detection can also be used.
  • the antibodies by suitable second antibodies z. B. carry a detectable enzymatic function can be detected. Details of this are available to the person skilled in the art.
  • the fragments presented can also be detected using cellular receptors.
  • Preferred cellular receptors are, in particular, those receptors which recognize and bind the respective fragment presented as physiological structures. These receptors can be used as very specific and effective tools for the detection and detection of antigen presentation.
  • pH-dependent fluorescent proteins or pH-dependent fluorescent peptides are fused with other peptides or proteins
  • fragments of these fusion partners can be detected with suitable antibodies.
  • other specific antigens which are derived from constituents of the particles, in particular the model pathogen can also be detected using suitable antibodies.
  • These antigens e.g. B. tumor antigens, can occur naturally or by artificial change in the particles or model pathogens.
  • the pH-dependent fluorescent proteins or peptides or the peptides or proteins fused with them are labeled with pH-dependent fluorescent dyes in such a way that they retain their fluorescence even after processing. This causes the processed fragment, which is presented on the surface of the cells, itself continues to fluoresce and can thus be detected directly on the cell surface.
  • Fluorescent dye is to be understood here as the fluorescent component of a protein or peptide which gives the respective protein or peptide the fluorescent properties.
  • the detection of these fluorescences on the surface can be carried out using customary methods, in particular using fluorescence microscopy and / or flow cytometry.
  • the specific localization on the cell surface can be checked, for example, after adding suitable cell-impermeable quenching substances.
  • a particular advantage of the method according to the invention is that this method can be carried out with isolated phagocytic cells as well as with whole blood or in the complete bone marrow.
  • whole blood it is generally advantageous to remove the non-phagocytic cells, in particular erythrocytes, before the fluorescence measurement.
  • This can be done by physical methods and / or for example by lysis.
  • the lysis can be carried out with the aid of a non-isotonic solution, that is to say a hypotonic solution, the conditions advantageously being chosen such that above all the erythrocytes and not the phagocytic cells are destroyed. This can be achieved, for example, by means of suitable buffer and / or temperature conditions.
  • the phagocytic cells are fixed before the fluorescence measurement.
  • the fixation takes place in the solution and ensures that the phagocytotic and subsequent processes in the cells are stopped or at least impaired or slowed down.
  • Such fixation or locking can be achieved in particular by adding formaldehyde, for example about 1% Paraformaldehyde.
  • the method according to the invention can be used in a particularly advantageous manner to clarify which cells of whole blood (e.g. macrophages, dendritic cells, other myeloid cells, endothelial cells) or of the bone marrow are active in relation to phagocytosis and the downstream processes.
  • the whole blood, the bone marrow or certain isolated cells are incubated with the fluorescence-labeled particles in the presence of line-specific antibodies that recognize the respective cell types.
  • Monoclonal antibodies are preferably used for this because of their special specificity.
  • These antibodies are also fluorescence-labeled, the fluorescence advantageously differing from the fluorescence with which the particles are labeled. Subsequent localization of both fluorescences allows conclusions to be drawn about the phagocytotic, processing and / or antigen presentation function of certain cell types.
  • the method according to the invention is the great sensitivity of the detection of the fluorescent marking, the cost-effective production, storage and shipping of the particles to be used or the model exciter and the automatable quantification, which can be carried out, for example, with the aid of flow cytometry and / or with suitable plate measuring devices. Above all, this enables the evaluation of large sample quantities.
  • the method according to the invention can therefore also be used with great advantage in the search and evaluation of active substances.
  • the invention therefore also includes the use of a method as described above for the screening and / or for the characterization of immunostimulating or immunosuppressive substances.
  • the efficiency and / or the mechanism of action of immunostimulants and immunosuppressants can be examined in vivo and in vitro.
  • the phagocytic cells can be mixed with potential immunostimulating or immunosuppressive substances.
  • the effect on the phagocytosis activity and the processing activity and / or the antigen presentation capacity is advantageously analyzed in each case in comparison with control cells according to the method according to the invention.
  • an immunostimulating substance for example, an increase in phagocytic activity, an increase in processing activity and / or an increase in antigen presentation can be demonstrated.
  • the method according to the invention is therefore particularly suitable for finding and evaluating therapeutically active substances which, for. B.
  • the method according to the invention can be used to find and evaluate therapeutically active substances which dampen or prevent overreactions of the immune response.
  • An example of an overreaction is an increased antigen presentation.
  • the ability to automate the method according to the invention is particularly advantageous since this enables use in the high-throughput method. Since the immune system of humans and other mammals is comparable in many respects, the method according to the invention can be used both with cells of human origin and with cells from other animals, especially from other mammals.
  • the method according to the invention can also be used in non-mammalian organisms or their cells, provided that these cells are able to carry out phagocytosis, processing and / or presentation of fragments or antigens.
  • the method according to the invention can be used to diagnose immunodeficiencies that can be congenital or acquired.
  • the defects detectable with the method according to the invention can manifest themselves, for example, as immune deficiencies, tumor formation, allergies or autoimmune diseases, for example from atherosclerosis. These immune defects can be caused, for example, by functional defects in definable antigen-presenting cells.
  • the method according to the invention is particularly advantageous for the detection of genetic defects in intracellular trafficking.
  • Congenital immunodeficiencies can e.g. B. as Griscelli syndrome (mutated Rab27a, Bahadoran et al. (2003) J Bio!
  • the method according to the invention can be used to make an immediate diagnosis for the existence of such a defect. Standardization by examining healthy controls and / or testing healthy parents or siblings is advantageous for evaluation. Furthermore, the diagnosis of chronic viral infections is particularly possible, for example. chronic African virus infections also appear to be defective
  • the method according to the invention is suitable with great advantage for monitoring a therapy of immune defects.
  • the immune defects that have already been mentioned above come into question for this.
  • both congenital and acquired immune defects can be both diagnosed and monitored during therapy with the aid of the method according to the invention.
  • Therapy that is intended to stimulate a reduced immune response, for example, or to dampen an overreacting immune response can be controlled with the aid of the method.
  • blood cells from patients and / or test subjects who have undergone immunomodulatory therapy are advantageously used in an in vitro test method. The therapeutic effect is checked on the basis of the phagocytosis activity and the processing activity and / or the presentation activity using the method according to the invention in the manner described above.
  • phagocytic dendritic cells and macrophages are particularly useful for monitoring a therapy of immune defects.
  • the invention comprises a reagent kit for examining the activity of cells to process phagocytized particles and / or to present fragments of phagocytosed particles.
  • This kit includes at least pH-dependent Fluorescence-labeled particles, which are in particular appropriately labeled bacteria, cyanobacteria, fungi, viruses and / or eukaryotic cells or fragments of these different particles. These particles are characterized in that they have at least one pH-dependent fluorescent dye. This fluorescent dye produces a cytoplasmic fluorescence, in particular, which can be detected for at least 12 hours. It is particularly preferred if the particles have or show at least two distinguishable pH-dependent fluorescences.
  • the reagent kit advantageously contains suitable customary buffers. With regard to further features of these particles marked with fluorescence or of the reagent kit, reference is made to the above description.
  • Fig. 1 fluorescence activity after phagocytosis by intact, enriched and isolated dendritic cells from whole blood.
  • Fig. 2 fluorescence activity after phagocytosis by leukocytes in whole blood.
  • FIG. 3 microscopic images of an E. coli bacteria phagocytizing single cell.
  • Phagocytic cells from the blood of a healthy donor are enriched and isolated and incubated with recombinant, fluorescent bacteria (ash chia coli).
  • Fluorescent labels which are homologous to the green fluorescent protein (GFP) from Aequorea victo a and have a pH-dependent fluorescence emission spectrum are used as the fluorescent label.
  • GFP green fluorescent protein
  • Bacteria which express fluorescent proteins (GFP) are used as particles to be phagocytosed.
  • the bacteria were transformed with plasmids (pQE32, Qiagen), which carry the coding sequences for the pH-dependent fluorescent GFP-like proteins lhFP516 / 581 (Schmitt, 2003) and eqFP61 1 (Wiedenmann et al., 2002).
  • the pH-dependent fluorescent protein lhFP516 / 581 shows green fluorescence with an emission maximum at 516 nm. The maximum excitability is 506 nm. After irradiation with UV light (366 nm), the emission maximum is shifted to 581 nm.
  • the excitation maximum shifts to 571 nm.
  • the bacterial solution was irradiated with UV light (366 nm) for 30 min.
  • These now red fluorescent bacteria were used in parallel to bacteria which contain the protein in the green fluorescent starting form.
  • the red fluorescent protein eqFP611 has an emission maximum at 611 nm and is most strongly excited at 559 nm.
  • the green or red fluorescence is detected using suitable excitation and emission filters. 1 x 10 5 dendritic cells / ml are incubated with 1 x 10 7 fluorescent bacteria / ml, which express the pH-dependent fluorescent protein lhFP516 / 581.
  • the stages of phagocytosis in particular from the uptake into primary endosomes to the release of the pH-dependent fluorescent dye into the cytoplasm of the dendritic cells, which differentiate with the phagocytic act into antigen-presenting dendritic cells, can subsequently be microscopically and / or follow flow cytometry.
  • the phagocytic activity of individual dendritic cells can be between 6 and 12 hours. It can take 12 to 48 hours for the pH-dependent fluorescent dye to be released into the cytoplasm.
  • the processes taking place can be analyzed by measuring and localizing the fluorescence.
  • 0.1 ml of heparinized whole blood (50 IU Na-heparin / ml) are incubated with 1 -5 ⁇ l fluorescent bacteria (1 x 10 9 / ml) (see above).
  • the incubation period depends on the question of the test protocol.
  • the incubation can be terminated, for example, if the release of the pH-dependent fluorescent dye into the cytoplasm is expected, for example after 12 to 48 hours.
  • the incubation can also be ended earlier, especially if the pH-dependent fluorescent dyes of the phagocytized particles in certain endosomes lose their fluorescence, for example due to organelle-specific conditions and enzymes.
  • lysis Methods or removed by lysis.
  • 2 ml of hypotonic ammonium chloride solution in sodium phosphate buffer (0.05 M, pH 7.4) with 1% paraformaldehyde and 0.1% Tween 20 added to 0.1 ml of blood.
  • the incubation is carried out on ice until the erythrocytes are lysed.
  • the cell suspension consisting of intact, fixed white blood cells and membrane residues of the erythrocytes, is washed twice with PBS and then measured in a flow cytometer.
  • a similar approach can be done with bone marrow.
  • the advantage of using whole blood or bone marrow (Vboll) is, in particular, that the phagocytic activity in all available white cells can be examined simultaneously and evaluated differentially.
  • Fig. 1 shows the phagocytosis performance, which is measured based on the fluorescence activity after 24 hours (gray histogram b).
  • phagocytic cells without bacteria are incubated and measured accordingly (black histogram a).
  • the x-axis of the flow cytometric measurement (FACScalibur, BD-Europe, Heidelberg) records the green fluorescence on a logarithmic scale.
  • the y-axis shows the number of cells measured (counts).
  • 2 shows that cells which are incubated without E. coli show a weak intrinsic fluorescence (black histogram a). The blood cells incubated with E.
  • coli show three populations (gray histogram b): i) non-fluorescent cells that have not phagocytized and are below the black negative curve, ii) weakly fluorescent cells that have little E. coli phagocytosed (fluorescence between channels 80 and about 700), and iii) a highly fluorescent population that has more phagocytosed and peaks between the fluorescence intensity channels 1,000 and 10,000.
  • FIG. 3 shows microscopic images of a single cell which E. coli bacteria have taken up by phagocytosis (A).
  • the bacteria express the pH-dependent protein lhFP516 / 581.
  • the bacterial cells show both green (B) and red fluorescence (C) due to the partial photoconversion of the protein.
  • the rod shape of the bacteria is clearly visible.
  • FIG. 5 shows the response of the green and red fluorescent forms of pH-dependent lhFP516 / 581 to an incubation at different pH Values over a period of 12 hours.
  • the fluorescence of the green form remains stable, while the fluorescence of the red form decreases sharply at a pH ⁇ 6.5.
  • the selective degradation of the red dye compared to the fluorescence intensity of the green form can be used to draw conclusions about the pH, preferably within cells. The investigation of the pH value and its change is possible both in cells which produce the protein and in cells into which the dyes are introduced from the outside, for example by expressing bacteria.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Quantifizierung und Qualifizierung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren, beschrieben, bei welchem zunächst mit Fluoreszenz markierte Partikel, die mindestens einen pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff aufweisen, bereitgestellt werden. Die markierten Partikel werden dann mit zu untersuchenden Zellen inkubiert und schließlich fluoreszenzmikroskopisch, fluorimetrisch und/oder fluoreszenzzytometrisch analysiert. Hierbei ist die Fluoreszenz, mit welcher die Partikel markiert sind, mindestens teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar.

Description

Beschreibung
Untersuchungsverfahren zur Phagozytose
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren.
Ein wichtiger Bestandteil der Immunantwort von Säugetieren sind Aufnahme, Abbau und Prozessierung von Krankheitserregern, von toten oder aberranten Körperzellen und anderen Fremdsubstanzen. Hierbei werden die als körperfremd bzw. unerwünscht erkannten Partikel durch bestimmte Zellen im Blut aufgenommen und intrazellulär abgebaut. Die zu dieser sogenannten Phagozytose befähigten Zellen umfassen im wesentlichen myeloische Zellen, Makrophagen, Granulozyten, Monozyten, Endothelzellen und dendritische Zellen sowie von diesen Zelltypen abgeleitete Vorläufer und Differenzierungsprodukte.
Voraussetzung für die Phagozytose der unerwünschten Partikel ist, dass die zur Phagozytose befähigten Zellen den Partikel binden und als
„unerwünscht" erkennen. Nur dann wird der Partikel von der Zelle umschlossen und aufgenommen. Ein wichtiger Faktor für die Erkennung der Partikel ist die sogenannte Opsonisierung, bei welcher an die
Oberfläche der Partikel Opsόnine, d. h. z. B. Antikörper oder Komplemente, gebunden werden. Die aufgenommenen Partikel werden von den entsprechenden Zellen zu Fragmenten abgebaut und im
Kontext mit Molekülen der Klasse MHC-Klasse II und in Einzelfällen auch der MHC-Klasse l als Antigene wieder an der Oberfläche präsentiert. Dieser als Prozessierung bezeichnete Abbauprozess erfolgt vor allem mittels Modifikation bzw. Abbau durch pH-abhängige Denaturierung, durch reaktive Sauerstoffspezies und/oder Proteolyse. Diese Prozessierungsreaktionen werden von Enzymen der entsprechenden Immunzellen getragen.
Nach erfolgter Erkennung, Phagozytose und Prozessierung werden die modifizierten und fragmentierten Fremdpartikel von den antigenpräsentierenden Zellen an der Zelloberfläche für darauffolgende Prozesse der Immunreaktion zugänglich gemacht.
Eine Störung der Immunantwort kann also in der Opsonisierung, der Phagozytose, der Prozessierung und/oder in der Antigenpräsentation liegen. Entsprechende Erkrankungen, die auf solchen Defekten des Immunsystems beruhen, können sich beispielsweise durch fehlende Immunreaktion auf Pathogene oder aber auch durch eine immunologische Überreaktion äußern. Diese Defekte können sich daher z. B. als Immuninsuffizienz, Tumorbildung, Allergie oder Autoimmunerkrankung manifestieren. Diese Erkrankungen können beispielsweise durch Gendefekte, welche die Funktionsfähigkeit der beteiligten Enzyme beeinträchtigen können, oder durch eine gestörte Regulation der beteiligten Enzyme, z. B. als Folge einer Infektion, verursacht werden. Als mögliche Therapie kommt hierfür entweder eine Stimulierung des Immunsystems oder eine Suppression der Immunreaktion in Frage. Diese Therapien erfordern jedoch eine präzise Diagnose der zugrundeliegenden Anomalie(n), da jeder Eingriff in das Immunsystem sehr weitreichende Folgen hat und eine entsprechende Therapie daher so gezielt wie möglich eingreifen soll. Daher ist sowohl für die Diagnose und Erforschung derartiger Krankheiten als auch für die Suche nach therapeutisch einsetzbaren Substanzen, die beispielsweise als Immunstimulanzien wirken, eine genaue Untersuchung der in diesem Bereich der Immunantwort ablaufenden Prozesse erforderlich. Weiterhin spielt eine Untersuchung dieser Prozesse auch bei der Analyse potentiell pathogener Agenzien, wie z. B. Allergene, sowie auch für eine Überwachung und Überprüfung möglicher Auswirkungen bei einer therapeutischen Behandlung eine wichtige Rolle.
Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Untersuchung der Phagozytoseleistung von Immunzellen beschrieben worden. Beispielsweise wurden Vollblut oder isolierte Granulozyten mit Mikroorganismen oder Teilchen inkubiert, die selbst mit fluoreszierenden Substanzen markiert waren. Durch anschließende Messung der aufgenommenen Fluoreszenz konnten Rückschlüsse auf die Phagozytoseaktivität gezogen werden. In der EP 0 435 226 B1 wird beispielsweise ein Verfahren beschrieben, bei welchem Säugerleukozyten im Vollblut mit fluoreszenzmarkierten Gram-negativen Bakterien inkubiert werden. Als Fluoreszenzfarbstoff wird hier FITC (Fluoreszein-Isothiocyanat) eingesetzt. Eine Phagozytoseaktivität konnte hier durch einen Anstieg der Fluoreszenz in den phagozytierenden Granulozyten und Monozyten nachgewiesen werden.
Durch derartige Verfahren können Störungen diagnostiziert werden, welche die Aufnahme von als körperfremd bzw. als unerwünscht erkannten Partikeln, also die Phagozytose im eigentlichen Sinne, betreffen. Die diagnostizierbaren Störungen liegen vor allem im Bereich der unspezifischen Immunität, bei welcher Monozyten und Granulozyten unerwünschte Partikel aufnehmen und abbauen, um sie zu eliminieren. Störungen in den nachfolgenden Prozessen, also insbesondere der Prozessierung der aufgenommenen Partikel sowie der nachfolgenden Präsentation auf der Oberfläche der phagozytierenden Zellen, werden mit herkömmlichen Verfahren nicht erkannt. Insbesondere Störungen der dendritischen Zellen, die vor allem für die Antigenpräsentation als Vorraussetzung für eine Induktion der primären zytotoxischen T- Zellantwort verantwortlich sind, werden hiervon nicht erfasst. Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem die der Phagozytose nachgeschalteten Prozesse, also insbesondere die Prozessierung und die Antigenpräsentation, untersucht werden können. Mit diesem Verfahren soll vor allem eine Diagnostizierbarkeit entsprechender Krankheiten ermöglicht werden, um dann den Defekt gegebenenfalls gezielt zu therapieren. Insbesondere sollen mit dem neuen Verfahren Störungen der dendritischen Zellfunktionen erfasst werden, die für die Generierung einer primären zytotoxischen T-Zellantwort entscheidend sind. Mit dem neuen Verfahren sollen also zunächst die zellulären Initiatoren einer spezifischen Immunantwort detektiert werden können. Hierbei handelt es sich insbesondere um Makrophagen, sowie um die verschiedenen Vertreter der dendritischen Zellreihe, wie beispielsweise lymphoide und myeloide dendritische Zellen, sowie deren im Blut zirkulierende phänotypisch definierbare Entwicklungsstadien. Diese verschiedenen Zellen sind für die Sensibilisierung und Rekrutierung von Gedächtniszellen der spezifischen Immunität verantwortlich und sind daher wichtige Zielpunkte, um eventuelle Störungen zu diagnostizieren bzw. zu therapieren.
Im weiteren soll mit dem neuen Verfahren vor allem die Fähigkeit zur Prozessierung dieser verschiedenen phagozytierenden Zellen sowie deren Fähigkeit zur Antigenpräsentation untersucht werden können bzw. sollen entsprechende Störungen detektierbar sein. Mit dem neuen Verfahren soll daher die Diagnostik von klinischen Krankheitsbildern, insbesondere von schweren Krankheitsbildern, ermöglicht werden, welche auf Defekten des molekularen „Traffickings" beruhen, wobei die Phagozytose von Fremdpartikeln, infektiösen Erregern oder Agenzien, toten oder aberranten körpereigenen Zellen, wie z. B. Tumorzellen, und die nachfolgende Prozessierung und Präsentation dieser Partikel gestört oder beeinträchtigt ist. - α -
Im weiteren soll mit dem neuen Verfahren ein Screening und/oder eine Analyse von potentiellen therapeutisch wirksamen Substanzen, welche die Immunantwort in gewünschter Weise verändern, ermöglicht werden. Weiterhin sollen mit dem neuen Verfahren die Auswirkungen von therapeutischen Eingriffen bei Störungen der Immunantwort untersucht und analysiert werden können. Darüber hinaus soll mit dem neuen Verfahren ein Screening und/oder eine Analyse von potentiellen pathogenen oder allergenen Substanzen ermöglicht werden, welche Störungen in den erwähnten Prozessen der Immunantwort bewirken.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, wie es in Anspruch 1 beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen 2 bis 26 dargestellt. Die Ansprüche 27 bis 29 betreffen verschiedene Verwendungen dieses Verfahrens. Die Ansprüche 30 und 31 beanspruchen einen Reagenzien-Kit, welcher zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient der Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel in Folge der Fusion von Endosom und Lyosom zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren. Hierfür werden zunächst Partikel bereitgestellt, die durch Fluoreszenz markiert sind. Diese Partikel enthalten mindestens einen pH-abhängigen bzw. pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff. Die markierten Partikel werden mit den Zellen inkubiert, deren Aktivität untersucht werden soll. Die Analyse der Zellen erfolgt durch fluoreszenzmikroskopische, fluorimetrische und/oder fluoreszenzzytometrische Methoden. Entscheidend für dieses Verfahren ist, dass die Fluoreszenz zumindest teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar ist. Die zeitliche Persistenz der Fluoreszenz ist von den jeweils gewählten experimentellen Bedingungen abhängig. Beispielsweise hat die Aktivität der Zellen einen Einfluss auf die Detektierbarkeit der Fluoreszenz. Von daher stellt die Zeitangabe von 12 Stunden einen Anhaltspunkt dar, der gewissen Schwankungen unterliegen kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht also auf der Aufnahme von phagozytierbaren Partikeln, die beispielsweise einen Modellerreger repräsentieren. Diese Partikel sind durch pH-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe und insbesondere durch pH-abhängige fluoreszierende Proteine markiert, so dass durch die Phagozytose dieser pH-abhängigen fluoreszierenden Partikel eine Akkumulation der Fluoreszenz im Zellinneren sichtbar und quantifizierbar wird. Im Verlauf der Prozessierung der Partikel bzw. der Modellerreger nimmt die Fluoreszenz im Zellinneren durch den zellspezifischen Abbau der pH- abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe oder deren Inaktivierung ab. Liegt bei den zu untersuchenden Zellen beispielsweise eine Störung der Prozessierungskapazität nach erfolgter Phagozytose vor, findet im Vergleich zu geeigneten Kontrollzellen keine Abnahme der Fluoreszenz im Zellinneren statt, so dass hierdurch Rückschlüsse auf die Prozessierungsaktivität bzw. die Prozessierungskapazität gezogen werden können. Daneben kann selbstverständlich auch eine Störung der Phagozytoseaktivität festgestellt werden, bei welcher im Vergleich mit Kontrollen im Zellinneren verminderte oder fehlende Fluoreszenz beobachtet wird. Darüber hinaus kann die Fähigkeit der Zellen untersucht werden, die phagozytierten Partikel nach einer Fragmentierung auf der Oberfläche zu präsentieren, welches die Voraussetzung für die Ausbildung der spezifischen Immunität darstellt. Die für dieses Verfahren eingesetzte pH-abhängige Fluoreszenz ist zumindest teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar. Das heißt, dass die verwendete Fluoreszenz nach 12 Stunden in den Zellen noch nachweisbar ist, soweit nicht zelluläre Einflüsse einen Abbau der Fluoreszenz bewirken. Vorteilhafterweise handelt es sich bei den zu untersuchenden Zellen um Zellen, die zur Phagozytose in der Lage sind. Besonders geeignet sind Säugerzellen, insbesondere Zellen des Immunsystems. Vorteilhafterwei- se handelt es sich um myeloische Zellen, also Zellen, deren Vorstufen im Knochenmark generiert werden, sowie Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, Endothelzellen und dendritische Zellen. Insbesondere die dendritischen Zellen sind für das erfindungsgemäße Verfahren von besonderem Interesse, da dies äußerst potente antigenpräsentierende Zellen sind, die im wesentlichen die primäre zytotoxische T-Zellantwort induzieren und für die Aktivierung regulatorischer T-Zellen (Treg) verantwortlich sind. Weiterhin können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren von diesen Zellen abgeleitete Differenzierungsprodukte und/ oder Vorstufen bzw. Vorläufer dieser Zellen untersucht werden. Anderer- seits können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch andere Zellen untersucht werden, soweit sie phagozytotisch aktiv sind, beispielsweise Schleimpilze, einzellige niedere Organismen oder ähnliches.
Die Detektion der pH-abhängigen Fluoreszenz bzw. der pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe im Zuge der Analyse der Zellen kann sowohl lichtmikroskopisch als auch fluoreszenzmikroskopisch und insbesondere durch automatisierte Verfahren erfolgen. Besonders bevorzugt ist hierbei die Durchflusszytometrie oder die Fluorimetrie, insbesondere in Plattenmessgeräten.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die markierten Partikel bzw. die Modellerreger mit Zellen im Vollblut oder in isolierter Form vorteilhafterweise in einer Weise inkubiert, die einen Ablauf normaler physiologischer Vorgänge ermöglicht. Hierfür werden beispielsweise geeignete Pufferlösungen eingesetzt, welche für ein physiologisches Milieu sorgen. Während dieser Inkubation werden die markierten Partikel von den Zellen entsprechend ihrer - o -
Phagozytoseaktivität aufgenommen, so dass die Zellen nach erfolgter Phagozytose durch die pH-abhängige Fluoreszenz der aufgenommenen Partikel markiert sind. Bereits diese Phagozytoseaktivität der zu untersuchenden Zellen kann durch entsprechende Analyse der Fluoreszenz der Zellen, beispielsweise durch Verwendung eines Fluoreszenzzytometers oder durch fluorimetrische Plattenmessgeräte, ausgewertet werden. Im weiteren Verlauf des Verfahrens bzw. der Inkubation befinden sich die phagozytierten Partikel innerhalb der zu untersuchenden Zellen und treten hier mit dem Degradationsapparat der Zellen in Kontakt. Der Abbau bzw. die Degradation oder Fragmentierung der aufgenommenen Partikel hängt von der Fusion der primären Endosomen, innerhalb welcher die phagozytierten Partikel zunächst eingeschlossen sind, mit Lysosomen in den phagozytierenden Zellen ab. Diese Lysosomen sind mit unterschiedlichen Enzymen ausgerüstet, welche unter anderem die Zerstörung bzw. Fragmentierung der phagozytierten Partikel und der Bestandteile der Partikel bewirken. Bei einem typischen Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens sind zunächst die Partikel bzw. die Modellerreger nach erfolgter Phagozytose unter dem Fluoreszenzmikroskop noch als granuläre Strukturen erkennbar. Erfolgt im weiteren Verlauf der Prozessierung ein weiterer Abbau des Partikels, so verteilt sich das Fluoreszenzsignal scheinbar gleichmäßig im Zytoplasma der phagozytierenden Zeile. Diese Analysierbarkeit des weiteren Schicksals der phagozytierten Partikel stellt einen besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens dar, da dies bei herkömmlichen Verfahren nicht möglich ist.
Das Schicksal eines Partikels nach erfolgter Phagozytose in der Zelle hängt insbesondere von der Stabilität der zu prozessierenden Bestandteile bzw. der Proteine des Partikels ab. Hierfür spielen zunächst vor allem die biochemische Beschaffenheit des Proteins und weiterhin die Enzymaktivierung in der zu untersuchenden Zelle eine Rolle. Die Kinetik des Proteinabbaus wird durch eine Denaturierung in Folge der sauren pH-Bedingungen in den Lysosomen sowie durch eine Degradation bzw. einen Abbau in Folge von Proteolyse und/oder Oxidation beeinflusst. Obwohl die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte pH-abhängige Fluoreszenz bzw. die entsprechenden pH- abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe, wobei es sich hierbei im wesentlichen um pH-abhängige fluoreszierende Proteine handelt, aufgrund ihrer Tertiärstruktur im wesentlichen stabil sind, kommt es bei funktionsfähigen phagozytierenden Zellen mit der Zeit zu einem Abbau der pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine, insbesondere durch die Wirkung von saurem pH-Wert, reaktiven Sauerstoffspezies und/oder Proteasen. Die damit verbundene Zerstörung der Tertiärstruktur der pH- abhängigen fluoreszierenden Proteine bzw. der pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe führt zu einem Verlust der Fluoreszenz. Damit kann erfindungsgemäß die Kapazität der zur Phagozytose fähigen Zellen zum Abbau von Proteinen gezeigt und quantifiziert werden. Durch die Analyse der Zellen im Durchflusszytometer oder in anderen geeigneten Messgeräten kann diese Kapazität anhand des Fluoreszenzverlustes der zu untersuchenden Zellen quantifiziert werden. Dies erfolgt bevorzugt nach einer ausreichenden Inkubationszeit, innerhalb derer die entsprechenden Phagozytose- und Prozessierungsprozesse in der Zelle abgelaufen sind. Bevorzugterweise werden diese Inkubationszeiten standardisiert. Weiterhin können vorteilhafterweise unterschiedliche Inkubationszeiten eingesetzt werden, um so Rückschlüsse auf zeitliche Verläufe der entsprechenden Prozesse ziehen zu können.
Besondere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen in der Automatisierbarkeit des Verfahrens sowie in den kostengünstigen und einfachen Bereitstellungsmöglichkeiten für die benötigten Nachweissubstanzen. Bei den Partikeln, die von den zu untersuchenden Zellen zu phagozytieren sind, handelt es sich vorteilhafterweise um membranumhüllte Strukturen. Hierbei können die Partikel beispielsweise eine Doppelmembran aufweisen, z.B. wie bei Eukaryonten, bestimmten Viren, artifiziellen Vesikeln oder Exosomen, oder eine Einzelmembran, wie z.B. bei Prokaryonten. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Partikel Rezeptoren aufweisen, die durch eine sogenannte Opsonisierung die Phagozytose erleichtern. In bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Partikel Bakterien, Cyanobakterien, Pilze und/oder eukaryontische Zellen wie beispielsweise Tumorzellen, sowie von Tumorzellen abstammende Partikel, wie beispielsweise Exosomen oder Organellen, welche durch pH-abhängige Fluoreszenz markiert sind. Weiterhin kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch die Phagozytose, Prozessierung und/ oder Präsentation von Viren mit Vorteil untersucht werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden synthetische Partikel, wie beispielsweise Lipidvesikel oder auch Latexkügelchen, eingesetzt. Diese Partikel dienen vor allem als Trägersubstanzen für die pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe bzw. Antigene, deren weitere Prozessierung im Zuge des erfindungsgemäßen Verfahrens verfolgt wird.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei den Partikeln um infektiöse Partikel, welche bei Immunreaktionen eine Rolle spielen. Um entsprechende Immunreaktionen zu untersuchen, können derartige infektiöse Partikel im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Andererseits kann es auch bevorzugt sein, wenn von derartigen Partikeln abgeleitete Partikel eingesetzt werden, die insbesondere für den Menschen nicht infektiös sind. Dies hat den Vorteil, dass hierdurch das erfindungsgemäße Verfahren ohne Sicherheitsrisiken durchgeführt werden kann. Um die wichtigsten infektiösen Partikel bzw. Erreger abzudecken, werden vorzugsweise folgende Modellerreger als Partikel im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt: Escherichia coli als Gramnegativer Erreger, der beispielsweise bei abdominalchirurgischen Eingriffen eine Rolle spielt, und/ oder Staphylokokken als Vertreter Gram-positiver Erreger, welche insbesondere bei Pneumonien involviert sind. Andererseits können auch Viren verwendet werden, welche akute, chronische und/oder latente Infektionen auslösen können. Insbesondere für die Untersuchung von infektiösen Viren werden vorteilhafterweise rekombinante, nicht-infektiöse und/oder transformationsdefekte Organismen eingesetzt, die auf der Oberfläche beispielsweise Eigenschaften von häufigen Viren wie CMV oder EBV oder von Tumorantigenen exprimieren. Bei der Verwendung von eukaryontischen Zellen als Partikel kommen insbesondere solche Zellen in Frage, die in Säugerorganismen Tumore bilden können. Hierbei kann es sich beispielsweise auch um autologe Tumorzellen handeln, um durch das erfindungsgemäße Verfahren die Immunitätslage gegen einen Tumor zu prüfen. Neben den beispielhaft erwähnten Partikeln kommen auch jeweils Fragmente dieser Partikel für das erfindungsgemäße Verfahren in Frage.
Die Partikel bzw. die Modellerreger können sowohl im lebendigen und/ oder funktioneilen Zustand als auch im inaktivierten Zustand eingesetzt werden. Eine Inaktivierung kann z. B. durch Fixierung der eingesetzten Mikroorganismen erfolgen und hat den Vorteil, dass beispielsweise bei infektiösen Partikeln Sicherheitsrisiken weitgehend vermieden werden.
Für die Bereitstellung von mit pH-abhängiger Fluoreszenz markierten Partikeln können unterschiedliche pH-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere unterschiedliche pH-abhängige fluoreszierende Proteine und/oder Peptide verwendet werden. Für den Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich grundsätzlich alle pH- abhängigen fluoreszierenden Proteine bzw. Peptide, die eine ausreichend langfristige Detektierbarkeit bzw. eine entsprechende Stabilität aufweisen. Neben natürlich vorkommenden pH-abhängigen fluoreszierenden Proteinen und Peptiden können auch solche Proteine und Peptide verwendet werden, die durch chemische und/oder molekularbiologische Methoden verändert wurden. Sowohl natürlich vorkommende als auch künstlich veränderte pH-abhängige fluoreszierende Proteine oder Peptide können durch rekombinante Expression hergestellt und mit den zu phagozytierenden Partikeln verknüpft werden oder aber selbst innerhalb der Partikel durch rekombinante Expression exprimiert werden. Im folgenden soll unter dem Ausdruck „Protein" auch ein Peptid verstanden werden, selbst wenn dies nicht ausdrücklich erwähnt ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird als Fluoreszenzfarbstoff das grün fluoreszierende Protein aus Aequorea victo a oder ein davon ableitbares Protein oder Peptid eingesetzt, das ein pH-abhängiges Fluoreszenzemissionsspektrum aufweist. In diesem Zusammenhang wird beispielsweise auf die deutsche Offenlegungsschrift DE 197 18 640 verwiesen, welche geeignete fluoreszierende Proteine beschreibt. Bisher wurden diese fluoreszierenden Proteine üblicherweise zum Nachweis der Lokalisation von Fusionsproteinen oder zur Messung der Genaktivität verwendet. Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Fluoreszenzfarbstoffe nun verwendet werden, um phagozytierbare Partikel, beispielsweise Bakterien oder andere Mikroorganismen, zu markieren. Weiterhin können mit diesen Fluoreszenzfarbstoffen auch eukaryontische Zellen, insbesondere Tumorzellen, markiert und für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden. Der besondere Vorteil bei der Verwendung dieses grün fluoreszierenden Proteins bzw. davon ableitbarer Proteine oder Peptide, die ein pH-abhängiges Fluoreszenzemissionsspektrum aufweisen, ist die außerordentliche Stabilität dieser Fluoreszenzfarbstoffe (Green Fluorescent Protein - _ | ^5 -
Properties, Applications and Protocols. Martin Chalfie and Steven Kain (eds.). Wiley-Liss, New York, 1998). Das grün fluoreszierende Protein aus Aequorea victoria und davon ableitbare Proteine und Peptide, die ein pH-abhängiges Fluoreszenzemissionsspektrum aufweisen, sind daher aufgrund ihrer außerordentlichen Stabilität in besonderer Weise für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff um ein Protein oder Peptid mit einem Fluorophor, welches aus mindestens drei Aminosäuren besteht. Hierbei handelt es sich bevorzugterweise bei der zweiten Aminosäure dieser mindestens drei Aminosäuren des Fluorophors um Tyrosin und/oder bei der dritten Aminosäure um Glycin. Die erste Position ist variabel.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der pH-abhängige Fluoreszenzfarbstoff ein Photosynthesepigment, z. B. Chlorophyll, oder akzessorische Photosynthesepigmente, wie beispielsweise Phycobiliproteine. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Phycoerythrin als pH- abhängiger Fluoreszenzfarbstoff.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem eingesetzten Fluoreszenzfarbstoff um ein pH-abhängiges fluoreszierendes Protein oder Peptid. Bestimmte Immundefekte gehen mit einem abnormalen pH- Milieu in den Lysosomen der phagozytierenden Zellen einher. Um solche Defekte nachweisen zu können, ist es besonders vorteilhaft, Partikel bzw. Modellerreger im erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzen, welche mit pH-abhängigen fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden markiert sind. Vorzugsweise zeigen solche fluoreszierenden Proteine oder Peptide bei saurem pH-Wert eine Abnahme der Fluoreszenz. Der Inhalt von Lysosomen zeigt im Normalfall einen sauren pH-Wert von etwa pH 4-5. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von pH- abhängigen fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden erfolgt daher bei normalem, sauren pH-Milieu in den Lysosomen eine unmittelbare Abnahme der Fluoreszenz nach Verschmelzung des primärem Endosoms mit den Lysosomen. Fehlt diese unmittelbare Abnahme der Fluoreszenz, kann auf ein abnormales pH-Milieu in den Lysosomen und einen entsprechenden Immundefekt geschlossen werden. Als besonders geeignetes pH-abhängiges fluoreszierendes Protein kann das fluoreszierende Protein lhFP516/581 (EosFP) eingesetzt werden (Schmitt, F. (2003) Ein neuartiges von grün nach rot photokonvertierendes Fluoreszenzprotein aus der indopazifischen Steinkoralle Lobophyllia hemprichii, Ehrenberg, 1834 (Cnidaria, Anthozoa) Diplomarbeit, Universitätsbibliothek Ulm; Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Röcker, C, Salih, A., Spindler, K.D., and Nienhaus, G.U. (2004). EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sei U.S.A., 101 (45), 15905-15910.).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die mit pH-abhängiger Fluoreszenz markierten Partikel mindestens einen natürlicherweise exprimierten pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff auf. Besonders bevorzugt werden als Partikel autofluoreszierende Mikroorganismen eingesetzt, insbesondere Bakterien, Cyanobakterien (Blaualgen) und/oder Algen. Vorteilhaft sind hierbei insbesondere die Dinoflagellaten, vorzugsweise endosymbiontische Dinoflagellaten. Weiterhin können auch Fragmente dieser Partikel eingesetzt werden. Diese Auto- bzw. Eigenfluoreszenz der Mikroorganismen hat den Vorteil, dass diese Partikel ohne weitere Markierungsreaktionen eingesetzt , _. - 15 -
werden können, da sie aus sich heraus die für das erfindungsgemäße Verfahren erforderliche Fluoreszenz aufweisen.
Weiterhin ist es bevorzugt, wenn die mit pH-abhängiger Fluoreszenz markierten Partikel mindestens einen rekombinant exprimierten pH- abhängigen Fluoreszenzfarbstoff aufweisen. Dies wird insbesondere durch eine autokatalysierte Bildung des Fluorophors in pH-abhängigen fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden ermöglicht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird hierbei mindestens ein pH-abhängiges fluoreszierendes Protein oder Peptid innerhalb der Partikel exprimiert. Es kann sich um Partikel handeln, die ein oder mehrere pH-abhängige fluoreszierende Proteine oder Peptide natürlicherweise exprimieren oder aber auch um Partikel, bei welchen eine entsprechende Expression aufgrund von gentechnischer Manipulation erfolgt. Für eine geeignete rekombinante Expression der pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine oder Peptide innerhalb der Partikel, insbesondere innerhalb der Modellerreger, wird die entsprechende kodierende DNA in der Weise in den Modellerreger eingebracht, dass ein Expression des Proteins oder Peptids im Organismus selbst möglich ist. Hierfür wird die entsprechende kodierende DNA beispielsweise unter die Kontrolle eines geeigneten Promotors gestellt und insbesondere in Form eines geeigneten Vektors in den Organismus, der als Partikel eingesetzt wird, eingebracht. Vorzugsweise werden entsprechende Proteine oder Peptide stabil und über einen längeren Zeitraum exprimiert, so dass die Partikel ohne weitere Vorbereitung für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können. Andererseits kann es auch vorteilhaft sein, wenn die Partikel das oder die entsprechenden Proteine und/oder Peptide transient, also vorübergehend, exprimieren. In diesem Fall müssen die entsprechenden Partikel bzw. Modellerreger in der Regel vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit molekularbiologischen Methoden behandelt werden. Entsprechende Vorgehensweisen erschließen sich dem Fachmann.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden ein oder mehrere pH-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere pH- abhängige fluoreszierende Proteine oder Peptide, an die Partikel gebunden, indem sie beispielsweise an die Oberfläche des Partikels angekoppelt werden. Hierfür können z. B. natürlich vorkommende pH- abhängige fluoreszierende Proteine und/oder Peptide gereinigt bzw. angereichert werden, um sie sodann an die zu phagozytierenden Partikel mit herkömmlichen Methoden zu binden. Andererseits können auch rekombinant hergestellte pH-abhängige fluoreszierende Proteine und/oder Peptide für diesen Zweck eingesetzt werden. Durch die Bindung an vergleichsweise große Partikel, die beispielsweise einen Durchmesser von 1 -2 μm aufweisen, kann die Aufreinigung der pH- abhängigen fluoreszierenden Proteine und/oder Peptide und die Markierung der Partikel z. B. durch Filtrations- und/oder Zentrifugationstechniken vorteilhafterweise in einem Schritt erfolgen. Ein bevorzugtes Beispiel für eine Kopplung der pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine oder Peptide ist eine Kopplung über Biotin- Streptavidin-Bindungen.
Besonders bevorzugt ist es, wenn pH-abhängige fluoreszierende Proteine und/oder Peptide, insbesondere rekombinante Proteine und/oder Peptide, spezifisch an die Partikel gebunden werden. Beispielsweise erfolgt eine Bindung bzw. Immobilisierung der pH- abhängigen fluoreszierenden Proteine über metall-affine Peptidanhängsel, die insbesondere durch molekularbiologische Methoden an das fluoreszierende Protein angefügt sind. Derartige Peptidanhängsel (tags) werden üblicherweise in der Affinitätschromatographie verwendet. Ein Beispiel hierfür ist das sogenannte 6x-Histidin-Tag. Neben rekombinant hergestellten pH- abhängigen fluoreszierenden Proteinen und/oder Peptiden, die insbesondere noch weitere Funktionalitäten wie beispielsweise die genannten Peptidanhängsel tragen können, welche für eine Bindung an die Partikel bzw. eine Immobilisierung vorteilhaft sind, können auch natürlicherweise vorkommende pH-abhängige fluoreszierende Proteine oder Peptide an entsprechende Partikel gebunden werden. Ein Beispiel hierfür ist das Phycobiliprotein Phycoerythrin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die pH- abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe, also insbesondere pH-abhängige fluoreszierende Proteine oder Peptide, mit weiteren Peptiden und/oder Proteinen gekoppelt. Diese Kopplung erfolgt vorzugsweise durch eine Fusion der Peptide bzw. Proteine, so dass der pH-abhängige Fluoreszenzfarbstoff als Fusionsprotein exprimiert wird. Sollen beispielsweise Viren als Partikel bzw. Modellerreger verwendet werden, erfolgt deren Fluoreszenzmarkierung bevorzugterweise durch einen geeigneten Wirtsorganismus. Hierfür wird die genetische Information des Virus insoweit verändert, dass ein oder mehrere virale Proteine in Fusion mit pH-abhängigen fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden exprimiert werden. Auch die bereits erwähnte Kombination der pH- abhängigen fluoreszierenden Proteine oder Peptide mit Peptidanhängseln oder ähnlichem, welche eine Bindung der pH- abhängigen fluoreszierenden Proteine oder Peptide an die Partikel ermöglicht oder erleichtert, kann durch eine Fusion der pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine oder Peptide mit entsprechenden Peptiden oder Proteinen erreicht werden, welche entsprechende Funktionalitäten bereits tragen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens weisen die mit pH-abhängiger Fluoreszenz markierten Partikel mindestens zwei verschiedene pH- abhängige Fluoreszenzfarbstoffe auf. Hierbei können entweder verschiedenartige Partikel jeweils unterschiedliche pH-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe tragen, oder aber eine Art von Partikeln weist verschiedene pH-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe auf. Besonders bevorzugt ist es, wenn eine Art von Partikeln, beispielsweise Bakterien, Cyanobakterien und/oder Algen, einen natürlicherweise exprimierten pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff sowie mindestens einen rekombinant exprimierten pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff aufweisen. Selbstverständlich werden von der Erfindung auch Partikel umfasst, die zwei oder mehr rekombinant exprimierte verschiedene pH- abhängige Fluoreszenzfarbstoffe aufweisen.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn die verschiedenen pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe insbesondere in Folge unterschiedlicher pH- abhängiger Emissionsspektren unterscheidbare Fluoreszenzen bewirken. Dies kann für verschiedene Aspekte des erfindungsgemäßen Verfahrens in vorteilhafter Weise ausgenutzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses erfindungsgemäßen Aspektes reagieren die verschiedenen pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe, welche die unterscheidbaren Fluoreszenzen bewirken, unterschiedlich auf die intrazellulären Aktivitäten der zu untersuchenden Zellen. Beispielsweise wird einer dieser pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere eines der pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine, schneller durch die intrazellulären Enzyme abgebaut als das andere pH- abhängige fluoreszierende Protein. Dies kann dadurch verursacht sein, dass beispielsweise eines der pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine bestimmte Schnittstellen für intrazelluläre Proteasen aufweist, wohingegen das andere Protein diese Schnittstellen nicht enthält. Weiterhin kann es sich beispielsweise bei einem der fluoreszierenden Proteine um ein pH-abhängiges fluoreszierendes Protein handeln und bei dem anderen um ein Protein, welches von dem pH-Wert innerhalb der Zelle im wesentlichen unbeeinflusst ist. Darüber hinaus kann es sich bei einem der pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine um ein Protein handeln, dessen Fluoreszenz bei Kontakt mit reaktiven Sauerstoffspezies schneller abnimmt als bei dem anderen Protein, dessen Fluoreszenz unter diesen Bedingungen weitgehend stabil bleibt.
Besonders bevorzugt ist es, dass die pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe bzw. insbesondere die pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine, welche die unterscheidbaren Fluoreszenzen bewirken, unterschiedliche Stabilitäten aufweisen. Hierbei kann es sich beispielsweise um kompartimentspezifische Stabilitäten handeln. Die Bedingungen (z.B. pH-Wert, Proteaseaussstattung) in den verschiedenen Kompatimenten (z.B. Exosomen, Lysosomen) können sehr unterschiedlich sein. Durch die Verwendung von pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffen, die jeweils auf bestimmte dieser Bedingungen reagieren, können Aussagen zu kompartimentspezifischen Abläufen gemacht werden.
Ein besonderer Vorteil bei der Verwendung von verschiedenen und unterscheidbaren pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffen liegt weiterhin darin, dass beispielsweise durch die Verwendung pH-abhängiger fluoreszierender Proteine mit unterschiedlicher Farbe und Stabilität die Quantifizierung der Prozessierungskapazität der zu untersuchenden Zellen verbessert werden kann. Hierbei wird durch die Verwendung zweier unterschiedlich pH-abhängiger fluoreszierender Proteine, die sich in ihrer Empfindlichkeit gegenüber zellulären Abbausystemen unterscheiden, die Prozessierungskapazität phagozytierender Zellen messbar, wie sie beispielsweise durch die Proteaseaktivität der beteiligten Enzyme bewirkt wird. Das stabilere Protein dient als interner Standard zur Quantifizierung der inkorporierten Proteinmenge, wohingegen das instabilere Protein als Zeiger für beispielsweise den proteasebedingten Abbau dient. Diese Form des Tests ermöglicht zum Beispiel die Diagnose von Immundefekten, die durch eine abnormale oder fehlende Proteaseaktivität ausgelöst werden. Hierfür können beispielsweise Unterschiede zwischen natürlich vorkommenden pH- abhängigen fluoreszierenden Proteinen oder Peptiden ausgenutzt werden. Darüber hinaus können pH-abhängige fluoreszierende Proteine eingesetzt werden, bei denen solche Unterschiede künstlich, insbesondere durch molekularbiologische Methoden, erzeugt wurden. Dies geschieht beispielsweise durch eine gezielte Stabilisierung durch Entfernung von geeigneten Proteaseschnittstellen und/oder durch eine gezielte Destabilisierung durch Hinzufügung von geeigneten Proteaseschnittstellen.
Ein ähnlicher Parallelansatz kann mit einem pH-abhängigen fluoreszierenden Protein und einem andersfarbigen stabileren fluoreszierenden Protein, welches als interner Standard dient, durchgeführt werden. Hierdurch können in besonders vorteilhafter Weise Aussagen über Störungen im pH-Milieu der Lysosomen getroffen werden, wie es weiter oben schon beschrieben ist. In diesem Fall darf das Protein oder Peptid, welches als interner Standard dient, keine oder nur wenig pH-Abhängigkeit der Fluoreszenz aufweisen. Ein Beispiel für ein stabiles Protein, welches im wesentlichen pH-unabhängig ist, ist das rot fluoreszierende Protein eqFP61 1 (Wiedenmann et al. (2002) Proc Natl Acad Sei 99:1 1646-1 1651 ). Als pH-abhängiges fluoreszierendes Protein kann das Protein lhFP516/581 eingesetzt werden.
In einem vergleichbaren Parallelansatz werden pH-abhängige fluoreszierende Proteine oder Peptide verwendet, welche sich sowohl insbesondere in der Farbigkeit der Fluoreszenz als auch hinsichtlich der Stabilität gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies unterscheiden. Hierdurch können in besonders vorteilhafter Weise Aussagen über die Beteiligung reaktiver Sauerstoffspezies an Abbauprozessen getroffen werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei welchem die Partikel mindestens zwei unterscheidbare pH-abhängige Fluoreszenzen aufweisen, werden diese Fluoreszenzen durch mindestens zwei verschiedene pH-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere durch mindestens zwei pH- abhängige fluoreszierende Proteine oder Peptide, bewirkt. Andererseits kann es auch sehr vorteilhaft sein, wenn die unterscheidbaren Fluoreszenzen durch mindestens zwei unterscheidbare pH-abhängige fluoreszierende Zustände eines Proteins bewirkt werden. Diese verschiedenen fluoreszierenden Zustände eines Proteins unterscheiden sich vorzugsweise hinsichtlich ihrer Stabilität. Ein Beispiel hierfür ist das pH-abhängige fluoreszierende Protein lhFP516/581 aus Lobophyllia hemprichii. Dieses Protein kann durch Bestrahlung mit kurzwelligem Licht gezielt und irreversibel von einer grün fluoreszierenden in eine rot fluoreszierende Form überführt werden. Der Grad der Photokonversion und damit das Mengenverhältnis zwischen grün und rot fluoreszierender Form ist beispielsweise durch die Intensität und Dauer der Bestrahlung steuerbar und kann auch innerhalb eines Partikels, insbesondere innerhalb eines Modellerregers, durchgeführt werden. Beide Zustände sind pH-abhängig. Die rot fluoreszierende Form zeigt eine geringere Widerstandsfähigkeit gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies. Wird sowohl die Grün- als auch die Rotfluoreszenz quantifiziert, beispielsweise in einem Fluoreszenzzytometer, kann aus deren Verhältnis die Abbaukapazität und damit die Prozessierungsaktivität der zu untersuchenden Zellen berechnet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Präsentation von Fragmenten der phagozytierten Partikel durch die zu untersuchenden Zellen untersucht. Diese Untersuchung der sogenannten Antigenpräsentation erfolgt entweder zusätzlich zur Analyse der Prozessierungskapazität bzw. der Prozessierungsaktivität der Zellen oder wird davon unabhängig durchgeführt. Zur Untersuchung der Antigenpräsentation werden Fragmente der pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine oder Peptide und/oder Fragmente der mit diesen Proteinen oder Peptiden fusionierten Peptide und/oder Proteine analysiert, welche auf der Oberfläche der zu untersuchenden Zellen im Zuge der Antigenpräsentation erscheinen. Die prozessierten Bestandteile bzw. Fragmente werden als Peptide einer relativ konstanten Länge von bestimmten Immunzellen, insbesondere von dendritischen Zellen, an deren Oberfläche präsentiert. Das Verständnis dieser Zusammenhänge ist vor allen Dingen im Zusammenhang mit Überlegungen zu Vakzinierungsstrategien diskutiert worden (Hung and Wu (2003) Gurr Opin Mol Ther 5 (1 ): 20-4). Die Antigenpräsentation ist die Voraussetzung für den Ablauf der weitergehenden Immunreaktionen eines Säugerorganismus. Das erfindungsgemäße Verfahren ist in ganz besonders vorteilhafter Weise dazu geeignet, diese Vorgänge und insbesondere die Kapazität der phagozytierenden Zellen, Antigene zu präsentieren, zu untersuchen. Durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten pH- abhängigen fluoreszierenden Proteine oder Peptide werden definierte Antigene in die phagozytierenden Zellen eingebracht. Da diese Proteine oder Peptide im Säugerorganismus in der Regel natürlicherweise nicht vorkommen, können daraus abgeleitete Antigene mit großer Sicherheit nachgewiesen werden.
Bevorzugterweise werden hierfür die präsentierten Fragmente mit Antikörpern nachgewiesen, die Fragmente der pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine oder Peptide erkennen. Hierfür kommen grundsätzlich polyklonale und monoklonale Antikörper in Frage. Besonders bevorzugt sind monoklonale Antikörper, da diese eine besonders große Spezifität für die zu erkennenden Antigene zeigen. In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden diese Antikörper markiert, wodurch der Nachweis der Bindung der Antikörper an die jeweiligen Antigene erleichtert werden kann. Beispielsweise können hierfür die Antikörper mit unterscheidbaren pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sein. Es können auch andere Methoden zum Nachweis der Antikörper eingesetzt werden. Mit Vorteil können die Antikörper durch geeignete zweite Antikörper, die z. B. eine nachweisbare enzymatische Funktion tragen, detektiert werden. Einzelheiten hierzu erschließen sich dem Fachmann.
Weiterhin können die präsentierten Fragmente auch mit zellulären Rezeptoren nachgewiesen werden. Als zelluläre Rezeptoren sind vor allem solche Rezeptoren bevorzugt, die als physiologische Strukturen das jeweilige präsentierte Fragment erkennen und binden. Diese Rezeptoren können als sehr spezifische und wirksame Werkzeuge zum Nachweis und zur Detektion der Antigenpräsentation eingesetzt werden.
In dem Fall, dass die pH-abhängigen fluoreszierenden Proteine bzw. pH-abhängigen fluoreszierenden Peptide mit anderen Peptiden oder Proteinen fusioniert sind, können Fragmente dieser Fusionspartner mit geeigneten Antikörpern nachgewiesen werden. Weiterhin können auch andere spezifische Antigene, die sich aus Bestandteilen der Partikel, insbesondere der Modellerreger, herleiten, mit geeigneten Antikörpern nachgewiesen werden. Diese Antigene, wie z. B. Tumorantigene, können natürlicherweise oder durch künstliche Veränderung in den Partikeln bzw. Modellerregern vorkommen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei welchem die
Antigenpräsentationskapazität der Zellen untersucht wird, sind die pH- abhängigen fluoreszierenden Proteine oder Peptide oder die mit diesen fusionierten Peptide oder Proteine in der Weise mit pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, dass sie auch nach der Prozessierung ihre Fluoreszenz beibehalten. Dies bewirkt, dass das prozessierte Fragment, welches an der Oberfläche der Zellen präsentiert wird, selbst weiterhin fluoresziert und somit direkt an der Zelloberfläche detektiert werden kann. Unter Fluoreszenzfarbstoff ist hierbei die fluoreszierende Komponente eines Proteins oder Peptids zu verstehen, welches dem jeweiligen Protein oder Peptid die fluoreszierenden Eigenschaften verleiht. Die Detektion dieser Fluoreszenzen an der Oberfläche kann mit üblichen Methoden erfolgen, insbesondere mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie und/oder der Durchflusszytometrie. Daneben kann die spezifische Lokalisation an der Zelloberfläche beispielsweise nach Zugabe von geeigneten zellimpermeablen Quenching-Substanzen geprüft werden.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass dieses Verfahren sowohl mit isolierten phagozytierenden Zellen als auch mit Vollblut oder im kompletten Knochenmark durchgeführt werden kann. Bei der Vollblutanwendung ist es im allgemeinen vorteilhaft, vor der Fluoreszenzmessung die nicht-phagozytierenden Zellen, insbesondere Erythrozyten, zu entfernen. Dies kann durch physikalische Methoden und/oder beispielsweise durch Lyse erfolgen. Die Lyse kann mit Hilfe einer nicht-isotonischen Lösung, also einer hypotonen Lösung, vorgenommen werden, wobei die Bedingungen vorteilhafterweise so gewählt werden, dass vor allem die Erythrozyten und nicht die phagozytierenden Zellen zerstört werden. Dies kann beispielsweise durch geeignete Puffer- und/oder Temperaturbedingungen erreicht werden.
Weiterhin ist es sowohl bei isolierten Zellen als auch bei Vollblut bzw. Knochenmark vorteilhaft, dass die phagozytierenden Zellen vor der Fluoreszenzmessung fixiert werden. Die Fixierung erfolgt in der Lösung und gewährleistet, dass die phagozytotischen und die nachfolgenden Vorgänge in den Zellen gestoppt oder zumindest beeinträchtigt bzw. verlangsamt werden. Eine solche Fixierung bzw. Arretierung kann insbesondere durch Zugabe von Formaldehyd, beispielsweise etwa 1 % Paraformaldehyd, erreicht werden. Durch eine Arretierung der Zellen mit nachfolgender Fluoreszenzanalyse können zeitgenaue Aussagen zu den Abläufen in der Zelle gemacht werden, die mit der Phagozytose in Zusammenhang stehen.
In besonders vorteilhafter Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Klärung der Frage genutzt werden, welche Zellen des Vollblutes (z.B. Makrophagen, dendritische Zellen, andere myeloische Zellen, Endothelzellen) oder des Knochenmarks in Bezug auf die Phagozytose und die nachgeschalteten Prozesse aktiv sind. Hierfür erfolgt die Inkubation des Vollbluts, des Knochenmarks oder bestimmter isolierter Zellen mit den fluoreszenzmarkierten Partikeln in Gegenwart von lineagespezifischen Antikörpern, die die jeweiligen Zelltypen erkennen. Vorzugsweise werden hierfür wegen ihrer besonderen Spezifität monoklonale Antikörper eingesetzt. Diese Antikörper sind ebenfalls fluoreszenzmarkiert, wobei sich die Fluoreszenz vorteilhafterweise von derjenigen Fluoreszenz unterscheidet, mit welcher die Partikel markiert sind. Durch nachfolgende Lokalisation beider Fluoreszenzen können Rückschlüsse auf die phagozytotische, Prozessierungs- und/oder Antigenpräsentationsfunktion bestimmter Zelltypen gezogen werden.
Besondere Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die große Sensitivität des Nachweises der Fluoreszenzmarkierung, die kostengünstige Herstellung, Lagerung und Versand der zu verwendenden Partikel bzw. der Modellerreger und die automatisierbare Quantifizierung, die beispielsweise mit Hilfe der Durchflusszytometrie und/oder mit geeigneten Plattenmessgeräten durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht vor allem die Auswertung großer Probenmengen. Neben dem Einsatz in der Diagnostik kann das erfindungsgemäße Verfahren daher auch mit großem Vorteil bei der Wirkstoffsuche und - evaluation eingesetzt werden. Die Erfindung umfaßt daher auch die Verwendung eines Verfahrens gemäß der obigen Beschreibung zum Screening und/oder zur Charakterisierung von immunstimulierenden oder immunsuppressiven Substanzen. Hierbei kann beispielsweise die Effizienz und/oder der Wirkmechanismus von Immunstimulanzien und Immunsuppressiva in vivo als auch in vitro untersucht werden. Hierzu können die phagozytierenden Zellen mit potentiellen immunstimulierenden oder immunsuppressiven Substanzen versetzt werden. Die Auswirkung auf die Phagozytoseaktivität und die Prozessierungsaktivität und/oder die Antigenpräsentationskapazität wird vorteilhafterweise jeweils im Vergleich mit Kontrollzellen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren analysiert. Im Fall einer immunstimulierenden Substanz kann also beispielsweise eine Erhöhung der Phagozytoseaktivität, eine Erhöhung der Prozessierungsaktivität und/oder eine Verstärkung der Antigenpräsentation nachgewiesen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher in besonderer Weise dafür geeignet, therapeutisch wirksame Substanzen zu finden und zu evaluieren, welche z. B. die Phagozytose und Prozessierung von Bakterien, Viren und/oder Tumorzellen bzw. deren Fragmenten stimulieren. Zum anderen kann beispielsweise im Hinblick auf Autoimmunerkrankungen, beispielsweise von Artherosklerose, oder auf Allergien das erfindungsgemäße Verfahren zur Findung und Evaluation von therapeutisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden, welche Überreaktionen der Immunantwort dämpfen oder verhindern. Ein Beispiel für eine Überreaktion ist eine verstärkte Antigenpräsentation. Die Automatisierbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dabei von besonderem Vorteil, da dies den Einsatz im Hochdurchsatzverfahren ermöglicht. Da das Immunsystem von Menschen und anderen Säugetieren in vieler Hinsicht vergleichbar ist, kann das erfindungsgemäße Verfahren sowohl mit Zellen humanen Ursprungs als auch mit Zellen aus anderen Tieren, insbesondere aus anderen Säugetieren, durchgeführt werden. Dies ist vor allem für das Screening und/oder die Charakterisierung von immunstimulierenden oder immunsuppressiven Substanzen vorteilhaft, da entsprechende Substanzen in einem Tiermodell durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch bei Nicht-Säugerorganismen bzw. deren Zellen eingesetzt werden, soweit diese Zellen in der Lage sind, Phagozytose, Prozessierung und/oder Präsentation von Fragmenten bzw. Antigenen durchzuführen.
In besonders vorteilhafter Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Diagnose von Immundefekten verwendet werden, die angeboren oder erworben sein können. Wie eingangs erwähnt, können sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachweisbaren Defekte beispielsweise als Immuninsuffizienzen, Tumorbildung, Allergien oder Autoimmunerkrankungen, beispielsweise von Artherosklerose, manifestieren. Diese Immundefekte können beispielsweise durch Funktionsdefekte definierbarer antigenpräsentierender Zellen verursacht sein. Das er indungsgemäße Verfahren ist besonders vorteilhaft für die Erfassung genetischer Defekte des intrazellulären Traffickings geeignet. Kongenitale Immundefekte können sich z. B. als Griscelli-Syndrom (mutiertes Rab27a, Bahadoran et al. (2003) J Bio! Chem 278 (13): 11386-92), als Herrmann Pudlack-Syndrom (mutiertes vsp33, Chiang et al. (2003) J Biol Chem 278 (22): 20332-7) oder als Chediak Higashi- Syndrom (mutiertes Lyst, Huizing et al. (2001 ) Thromb Haemost 86 (1 ): 233-45) äußern. Beispielsweise bei diesen Syndromen kann mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren eine sofortige Diagnose für das Bestehen eines derartigen Defektes getroffen werden. Für die Auswertung ist eine Standardisierung durch Untersuchung gesunder Kontrollen und/ oder die Austestung von gesunden Eltern oder Geschwistern vorteilhaft. Weiterhin ist beispielsweise auch die Diagnose von chronischen Virusinfektionen mit besonderem Vorteil möglich. Chro- nische Virusinfektionen scheinen ebenfalls defekte
Phagozytoseleistungen sowie Defekte in den nachfolgenden Prozessen, insbesondere bei Makrophagen und dendritischen Zellen, hervorzurufen. Auch können genetische Rezeptormutationen des HIV zu Veränderungen in der Immunantwort führen. Patienten mit chronischen Virusinfektionen und daraus resultierenden Immundefekten oder Autoimmunphänomenen können daher mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht und die Defekte rasch diagnostiziert werden.
Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren mit großem Vorteil zur Überwachung einer Therapie von Immundefekten geeignet. Hierfür kommen insbesondere die Immundefekte in Frage, die bereits oben erwähnt wurden. Allgemein lassen sich sowohl angeborene als auch erworbene Immundefekte mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens sowohl diagnostizieren als auch in der Therapie überwachen. Eine Therapie, die beispielsweise eine verminderte Immunantwort stimulieren soll oder eine überreagierende Immunantwort dämpfen soll, kann mit Hilfe des Verfahrens in ihrer Wirkung kontrolliert werden. Hierfür werden vorteilhafterweise in einem in-vitro-Testverfahren Blutzellen von Patienten und/oder Probanden eingesetzt, welche sich einer immunmodulatorischen Therapie unterzogen haben. Der Therapieeffekt wird anhand der Phagozytoseaktivität und der Prozessierungsaktivität und/oder der Präsentationsaktivität mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens in oben beschriebener Weise überprüft. Von besonderem Interesse sind hierbei vor allem phagozytierende dendritische Zellen sowie Makrophagen.
Die Erfindung umfasst schließlich einen Reagenzien-Kit zur Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren. Dieser Kit umfasst mindestens mit pH-abhängiger Fluoreszenz markierte Partikel, wobei es sich hier insbesondere um entsprechend markierte Bakterien, Cyanobakterien, Pilze, Viren und/oder eukaryontische Zellen bzw. Fragmente dieser verschiedenen Partikel handelt. Diese Partikel sind dadurch charakterisiert, dass sie mindestens einen pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff aufweisen. Dieser Fluoreszenzfarbstoff bewirkt eine insbesondere zytoplasmatische Fluoreszenz, die mindestens über 12 Stunden detektierbar ist. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Partikel mindestens zwei unterscheidbare pH-abhängige Fluoreszenzen aufweisen bzw. zeigen. Weiterhin enthält der Reagenzien-Kit vorteilhafterweise geeignete übliche Puffer. Bezüglich weiterer Merkmale dieser mit Fluoreszenz markierten Partikel bzw. des Reagenzien-Kits wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen und den Beispielen in Verbindung mit den Figuren. Hierbei können die verschiedenen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Figuren ist gezeigt:
Fig. 1 Fluoreszenzaktivität nach Phagozytose durch intakte, aus Vollblut angereicherte und isolierte dendritische Zellen.
Fig. 2 Fluoreszenzaktivität nach Phagozytose durch Leukozyten im Vollblutansatz.
Fig. 3 Mikroskopische Aufnahmen einer E. coli Bakterien phagozytierenden Einzelzelle.
Fig. 4 Emissionsspektrum von photokonvertiertem pH-abhängigem lhFP516/581. Fig. 5 Reaktion der grün- und rot fluoreszierenden Formen von pH- abhängigem lhFP516/581 auf eine Inkubation bei verschiedenen pH-Werten über einen Zeitraum von 12 h.
Beispiele
1. Untersuchung der Phagozytose und Prozessierunq an isolierten dendritischen Zellen
Phagozytierende Zellen aus Blut eines gesunden Spenders werden angereichert und isoliert und mit rekombinanten, fluoreszierenden Bakterien (Esche chia coli) inkubiert. Als Fluoreszenzmarkierung werden fluoreszierender Proteine, welche homolog zu dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) aus Aequorea victo a sind und ein pH- abhängiges Fluoreszenzemissionsspektrum aufweisen, eingesetzt.
Zur Isolierung der phagozytierenden Zellen werden 10 ml Vollblut mit 50 IU Na-Heparin/ml versetzt. Das Blut wird mit 10 ml PBS verdünnt und auf Ficoll (Dichte 1 ,077 g/I) überschichtet. Die mononukieären Zellen werden bei 840 x g für 20 min abzentrifugiert und zweimal in Hank's BSS gewaschen. Die mononukieären Zellen werden bei einer Zellkonzentration von 2-4 x 105/ml in Zellkultur gebracht (RPMI 1640, 25 mM Hepes, Antibiotika, L-Glutamin, 10 % FCS, endotoxinfrei). Nach 10 Tagen werden die schwimmenden Zellen grob abgenommen. Die verbleibenden schwach adhärenten Zellen werden für weitere 14 Tage in frischem Medium kultiviert. Nach weiteren 14 bis 28 Tagen lassen sich aus diesen Kulturen gut angereicherte phagozytierende dendritische Zellen entnehmen, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden.
Als zu phagozytierenden Partikel werden Bakterien (E. coli) eingesetzt, die fluoreszierende Proteine (GFP) exprimieren. Hierzu wurden die Bakterien mit Plasmiden (pQE32, Qiagen) transformiert, welche die kodierenden Sequenzen für die pH-abhängigen fluoreszierenden GFP- ähnlichen Proteine lhFP516/581 (Schmitt, 2003) und eqFP61 1 (Wiedenmann et al., 2002) tragen. Das pH-abhängige fluoreszierende Protein lhFP516/581 zeigt nach Expression eine grüne Fluoreszenz mit einem Emissionsmaximum bei 516 nm. Die maximale Anregbarkeit liegt bei 506 nm. Nach Bestrahlung mit UV-Licht (366 nm) wird das Emissionsmaximum nach 581 nm verschoben. Gleichzeitig verschiebt sich das Anregungsmaximum nach 571 nm. Um diese rot fluoreszierende Form des Proteins hinsichtlich ihrer Anwendbarkeit zu testen, wurde die Bakterienlösung für 30 min mit UV-Licht (366 nm) bestrahlt. Diese nun rot fluoreszierenden Bakterien wurden parallel zu Bakterien eingesetzt, welche das Protein in der grün fluoreszierenden Ausgangsform beinhalten. Das rot fluoreszierende Protein eqFP611 besitzt ein Emissionsmaximum bei 611 nm und wird am stärksten bei 559 nm angeregt. Die Detektion der grünen bzw. roten Fluoreszenzen erfolgt unter Verwendung entsprechend geeigneter Anregungs- und Emissionsfilter. 1 x 105 dendritische Zellen/ml werden mit 1 x 107 fluoreszierenden Bakterien/ml, welche das pH-abhängige fluoreszierende Protein lhFP516/581 exprimieren, inkubiert. Die Stadien der Phagozytose, insbesondere von der Aufnahme in primäre Endosomen bis zur Freisetzung des pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffes in das Zytoplasma der dendritischen Zellen, welche sich mit dem Phagozytoseakt in antigenpräsentierende dendritische Zellen differenzieren, lassen sich in der Folge mikroskopisch und/oder durchflusszytometrisch verfolgen. Die Phagozytoseaktivität einzelner dendritischer Zellen kann in einem Zeitraum zwischen 6 und 12 Stunden liegen. Bis zum Entlassen des pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffes in das Zytoplasma können 12 bis 48 h vergehen. Die ablaufenden Vorgänge können durch Messung und Lokalisierung der Fluoreszenz analysiert werden.
2. Untersuchung der Phagozytose und Prozessierunq im Vollblut oder Knochenmark
In einem weiteren Versuch wird Vollblut mit rekombinanten E. coli inkubiert, welche das pH-abhängige fluoreszierende Protein IhFP 516/581 exprimieren, und die Fluoreszenz der nuklearen Zellen untersucht.
0,1 ml heparinisiertes Vollblut (50 IU Na-Heparin/ml) werden mit 1 -5 μl fluoreszierenden Bakterien (1 x 109/ml) (siehe oben) inkubiert. Die Inkubationszeit richtet sich nach der Fragestellung des Versuchsprotokolls. Zur Untersuchung der Prozessierungsaktivität kann beispielsweise die Inkubation beendet werden, wenn die Entlassung des pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffes in das Zytoplasma erwartet wird, beispielsweise nach 12 bis 48 h. Die Inkubation kann auch früher beendet werden, insbesondere wenn die pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoffe der phagozytierten Partikel in bestimmten Endosomen ihre Fluoreszenz beispielsweise aufgrund Organellspezifischer Bedingungen und von Enzymen, verlieren.
Zur Beendigung der Inkubation und vor der Messung der pH- abhängigen Fluoreszenz werden die Erythrozyten durch physikalische
Methoden oder durch Lyse entfernt. Zur Lyse der Erythrozyten werden 2 ml hypotone Ammoniumchloridlösung in Natriumphosphatpuffer (0,05 M, pH 7,4) mit 1 % Paraformaldehyd und 0,1 % Tween 20 zu 0,1 ml Blut gegeben. Die Inkubation erfolgt auf Eis, bis die Erythrozyten lysiert sind. Die Zellsuspension, bestehend aus intakten, fixierten weißen Blutzellen und Membranresten der Erythrozyten, wird zweimal mit PBS gewaschen und anschließend im Durchflusszytometer gemessen. Ein entsprechender Ansatz kann mit Knochenmark durchgeführt werden. Der Vorteil des Einsatzes von Vollblut oder von Knochenmark (Vboll) besteht insbesondere darin, dass die Phagozytenaktivität in allen vorhandenen weißen Zellen simultan untersucht und differentiell ausgewertet werden kann.
Diese beiden Versuchsansätze zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren sowohl mit isolierten Zellen als auch mit Vollblut durchgeführt werden kann. Die pH-abhängige Fluoreszenz geht nicht verloren, wenn die nicht-phagozytierenden Erythrozyten lysiert und die phagozytierenden Zellen gleichzeitig fixiert werden. Das System ermöglicht es den Experimentator, die Vorgänge an jedem beliebigen Zeitpunkt zu stoppen und zu untersuchen, ob die pH-abhängige Fluoreszenz in den primären oder sekundären Endosomen, den Lysosomen oder im Zytoplasma vorhanden ist. Hierdurch können aufschlussreiche Aussagen zu den Abläufen nach erfolgter Phagozytose gemacht werden.
Fig. 1 zeigt die Phagozytoseleistung, die anhand der Fluoreszenzaktivität nach 24 Stunden gemessen wird (graues Histogramm b). Als Kontrolle werden phagozytierende Zellen ohne Bakterien entsprechend inkubiert und gemessen (schwarzes Histogramm a). Die x-Achse der durchflusszytometrischen Messung (FACScalibur, BD-Europe, Heidelberg) zeichnet die Grün-Fluoreszenz im logarithmischen Maßstab auf. Die y-Achse gibt die Menge der gemessenen Zellen an (Counts). Aus Fig. 2 geht hervor, dass Zellen, die ohne E. coli inkubiert werden, eine schwache Eigenfluoreszenz (schwarzes Histogramm a) zeigen. Die mit E. coli inkubierten Blutzellen zeigen drei Populationen (graues Histogramm b): i) nicht fluoreszierende Zellen, die nicht phagozytiert haben und unter der schwarzen Negativkurve liegen, ii) schwach fluoreszierende Zellen, welche wenig E. coli phagozytiert haben (Fluoreszenz zwischen Kanal 80 und etwa 700), und iii) eine stark fluoreszierende Population, welche mehr phagozytiert hat und einen Peak zwischen den Fluoreszenzintensitätskanälen 1.000 und 10.000 einnimmt.
Fig. 3 zeigt mikroskopische Aufnahmen einer Einzelzelle, die E. coli Bakterien durch Phagozytose aufgenommen hat (A). Die Bakterien exprimieren das pH-abhängige Protein lhFP516/581. Die bakteriellen Zellen zeigen aufgrund der teilweisen Photokonversion des Proteins sowohl grüne (B) als auch rote Fluoreszenz (C). Die Stäbchenform der Bakterien ist klar zu erkennen.
Fig. 4 zeigt das Emissionsspektrum von photokonvertiertem pH- abhängigem lhFP516/581. Neben der ausgeprägten Rotfluoreszenz (581 nm, gepunktete Linie) ist bei 516 nm Grünfluoreszenz von nicht konvertiertem Protein zu sehen. Bei einer Behandlung mit Singulett Sauerstoff (102) verschwindet die rote Fluoreszenz bei 581 nm (durchgezogene Linie). Das Maximum bei 516 nm bleibt unverändert. Dies weist auf eine höhere Stabilität der nicht konvertieren, grün fluoreszenten Form gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies hin. Singulett Sauerstoff wurde durch den thermischen Zerfall von 3,3'-(1 ,4- naphthylidene) dipropionate endoperoxide (NDP02) erzeugt.
Fig. 5 zeigt die Reaktion der grün- und rot fluoreszierenden Formen von pH-abhängigem lhFP516/581 auf eine Inkubation bei verschiedenen pH- Werten über einen Zeitraum von 12 h. Die Fluoreszenz der grünen Form bleibt stabil, während die Fluoreszenz der roten Form bei einem pH < 6.5 stark abnimmt. Die selektive Degradation des roten Farbstoffes im Vergleich zur Fluoreszenzintensität der grünen Form kann verwendet werden, um Rückschlüsse auf den pH Wert zu ziehen, vorzugsweise innerhalb von Zellen. Die Untersuchung des pH Wertes und seiner Änderung ist sowohl in Zellen möglich, welche das Protein herstellen, als auch in Zellen in welche die Farbstoffe von aussen eingebracht werden, zum Beispiel durch exprimierende Bakterien.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel in Folge der Fusion von Endosom und Lysosom zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren, umfassend die folgenden Verfahrensschritte: Bereitstellen von mit Fluoreszenz markierten Partikeln, die mindestens einen pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff aufweisen, Inkubieren der markierten Partikel mit den Zellen, fluoreszenzmikroskopische, fluorimetrische und/oder fluoreszenzzytometrische Analyse der Zellen, wobei die Fluoreszenz zumindest teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Säugerzellen sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen myeloische Zellen, Monozyten, Makrophagen, Granulozyten, Endothelzellen, dendritische Zellen und/oder Vorstufen dieser Zellen sind.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Bakterien, Cyanobakterien, Pilze, Viren und/oder eukaryontische Zellen, insbesondere Tumorzellen, und/oder Fragmente davon sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel infektiöse Partikel sind.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel Bakterien sind, insbesondere Escherichia coli und/oder Staphylococcus spec.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff das grün fluoreszierende Protein aus Aequorea victo a oder ein davon ableitbares Protein oder Peptid ist, das ein pH-abhängiges Fluoreszenzemissionsspektrum aufweist.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff ein Protein oder Peptid mit einem Fluorophor aus mindestens drei Aminosäuren ist, wobei vorzugsweise die zweite Aminosäure Tyrosin und/oder die dritte Aminosäure Glycin ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff ein fluoreszierendes Phycobiliprotein, insbesondere Phycoerythrin, ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff ein pH-abhängiges fluoreszierendes Protein oder Peptid ist, wobei vorzugsweise das fluoreszierende Protein oder Peptid bei saurem pH-Wert eine Abnahme der Fluoreszenz zeigt.
1 1. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff ein pH-abhängiges fluoreszierendes Protein oder Peptid ist, welches eine erhöhte Sensitivität gegenüber Proteasen und/oder reaktiven Sauerstoffspezies zeigt, wobei vorzugsweise das fluoreszierende Protein oder Peptid bei Anwesenheit von Proteasen und/oder bei Einwirkung von reaktivem Sauerstoffspezies eine Abnahme der Fluoreszenz zeigt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens einen natürlicherweise exprimierten pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff aufweisen.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel autofluoreszierende Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, Cyanobakterien und/oder Algen, insbesondere Dinoflagellaten, und/oder Fragmente davon sind.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens einen rekombinant exprimierten pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff aufweisen.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bereitstellen von mit Fluoreszenz markierten Partikeln mindestens ein pH-abhängiges fluoreszierendes Protein oder Peptid innerhalb der Partikel exprimiert wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bereitstellen von mit Fluoreszenz markierten Partikeln mindestens ein pH-abhängiges fluoreszierendes Protein oder Peptid, vorzugsweise Phycoerythrin, an die Partikel gebunden wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bereitstellen von mit Fluoreszenz markierten Partikeln mindestens ein pH-abhängiges fluoreszierendes Protein oder Peptid mit Peptiden und/oder Proteinen der Partikel gekoppelt, insbesondere fusioniert, wird.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mit Fluoreszenz markierten Partikel mindestens zwei pH-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere einen natürlicherweise exprimierten und mindestens einen rekombinant exprimierten Fluoreszenzfarbstoff, aufweisen.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel mindestens zwei unterscheidbare pH-abhängige Fluoreszenzen zeigen.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die unterscheidbaren pH-abhängigen Fluoreszenzen durch die intrazelluläre Aktivität der zu untersuchenden Zellen unterschiedlich beeinflusst werden.
21. Verfahren nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die unterscheidbaren pH-abhängigen Fluoreszenzen unterschiedliche Stabilitäten aufweisen.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die unterscheidbaren pH-abhängigen Fluoreszenzen durch mindestens zwei Proteine und/oder Peptide bewirkt werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die unterscheidbaren pH-abhängigen Fluoreszenzen durch unterscheidbare pH-abhängige fluoreszierende Zustände eines Proteins oder Peptids bewirkt werden.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Untersuchung der Präsentation von Fragmenten von phagozytierten Partikeln Fragmente mindestens eines pH-abhängigen fluoreszierenden Proteins oder Peptids und/oder Fragmente von mindestens einem mit einem pH- abhängigen fluoreszierenden Protein oder Peptid fusionierten Peptid und/oder Protein analysiert werden.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die präsentierten Fragmente mit Antikörpern und/oder mit zellulären Rezeptoren nachgewiesen werden.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die präsentierten Fragmente mit pH- abhängiger Fluoreszenz markiert sind.
27. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26 zum Screening und/oder zur Charakterisierung von immunstimulierenden oder immunsuppressiven Substanzen.
28. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26 zum Screening und/oder zur Charakterisierung von Substanzen, welche die Phagozytose, Prozessierung und/oder Präsentation von Bakterien, Viren und/oder Tumorzellen und/oder deren Fragmenten beeinflussen, insbesondere steigern oder hemmen.
29. Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26 zur Diagnose und/oder Überwachung einer Therapie von Immundefekten.
30. Reagenzien-Kit zur Untersuchung der Aktivität von Zellen, phagozytierte Partikel zu prozessieren und/oder Fragmente von phagozytierten Partikeln zu präsentieren, mindestens umfassend mit Fluoreszenz markierte Partikel, insbesondere Bakterien, Cyanobakterien, Pilze, Viren und/oder eukaryontische Zellen, und/oder Fragmente davon, die mindestens einen pH-abhängigen Fluoreszenzfarbstoff aufweisen, wobei die Fluoreszenz zumindest teilweise über mindestens 12 Stunden detektierbar ist.
31. Reagenzien-Kit nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel mindestens zwei unterscheidbare Fluoreszenzen zeigen.
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