WO2005024004A1 - 間葉系幹細胞の肝細胞への分化方法及び人工ヒト肝臓細胞 - Google Patents

間葉系幹細胞の肝細胞への分化方法及び人工ヒト肝臓細胞 Download PDF

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Hirofumi Hamada
Yoshiro Niitsu
Junji Kato
Yasushi Sato
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)

Definitions

  • the present invention relates to a technique for differentiating mesenchymal cells into hepatocytes.
  • the present invention further relates to a liver regeneration medical technology for animals including a liver-damaged person.
  • the liver also called the biochemical factory of the human body, is an important organ that has various biochemical functions such as intermediate metabolism, bile formation, blood component production / conversion, and detoxification, which are closely related to nutrition in the body.
  • liver is damaged by alcohol, viruses, drugs, or autoimmune diseases, hepatitis, and even cirrhosis, sometimes with serious consequences.
  • alcoholic liver injury chronic overdose of alcoholic beverages causes damage to liver cells, leading to fatty liver, alcoholic hepatitis, and even terminal cirrhosis. If the amount of alcohol consumed daily is 60-80 g or more, fatty liver is more likely to occur, and if alcohol consumption of 100-120 g or more per day is taken for 10 years or more, cirrhosis is said to occur. ing.
  • liver injury Conventional treatments for liver injury include (1) eliminating toxic substances such as alcohol that cause liver injury, (2) waiting for spontaneous regeneration of hepatocytes by supplementing vitamins, etc. (3) Treatment with drugs (I) Glycyrrhizin preparation (protects the function of the liver), (ii) Sho-saiko-to (reducing liver inflammation, improving liver function), (iii) Bile acid preparation (useful for liver damage due to gallstones and bile stasis), (4 ) Therapeutic agents for viral hepatitis include (i) interferon,
  • Rebetol combined use with antivirals and interferon: for chronic hepatitis C with large viral load
  • Lamivudine antivirals, hepatitis B, DNA polymerase inhibitor
  • Non-Patent Document 1 shows that the alkaline phosphatase-positive rat stem cell-like cell line was differentiated into a hepatocyte lineage in vitro. Is reported in Non-Patent Document 2.
  • Patent Document 1 describes that bone marrow cells are differentiated into hepatic parenchymal cells using a differentiation inducer.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Publication No. 2000--7 8 4 8 2
  • Non-Patent Document 1 Stem Cel ls Vol. 21, .428-436
  • Non-Patent Document 2 The Journal of Clinical Investigation, Vol. 109, p. 1291-1302
  • Hepatic pharmacotherapy is only a symptomatic treatment and is not sufficient.
  • hepatocytes and MAPCs multipotent adult progenitor cells
  • MAPCs multipotent adult progenitor cells
  • hepatocytes are differentiated into hepatocytes using mesenchymal stem cells for which proliferation techniques have been established, especially stromal cells, which are mesenchymal stem cells derived from bone marrow. It is an object to provide a means for preparing cells.
  • mesenchymal stem cells mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells
  • mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells By transplanting mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells into a mammal that has chronic liver injury caused by continuing drug administration, for example, into a rat liver, hepatocytes, They found that they differentiate into mature hepatocytes, and developed a means to differentiate mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells into mature hepatocytes.
  • mature hepatocytes can be prepared using mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells that are available in a sufficient amount.
  • hepatocytes can be differentiated from mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells prepared from an individual, and an individual-specific hepatocyte gene profile can be created, which will be useful for tiller-made medicine You can also.
  • hepatocytes can be prepared in large amounts, they can be used for analysis of the proliferation mechanism of hepatitis C virus and hepatitis B virus, and also for analysis of the mechanism of action of antiviral agents.
  • Figure 1 shows the preparation of human mesenchymal stem cells.
  • Figure 2 shows how to administer allylic alcohol, which causes chronic liver damage.
  • FIG. 3 shows antibody staining 14 days after transplantation of human mesenchymal stem cells
  • FIG. 4 shows antibody staining 28 days after transplantation of human mesenchymal stem cells
  • Figure 5 shows the expression of human albumin in rat liver transplanted with human mesenchymal stem cells.
  • Figure 6 shows the expression of human alpha-phytoprotein in rat liver transplanted with human mesenchymal stem cells
  • Figure 7 shows the human albumin production
  • Figure 8 shows that human mesenchymal stem cells, human CD34 + cells or non-mesenchymal cells Z non-CD34 + cells were treated once or continuously with aryl alcohol to human hepatocytes.
  • Fig. 9 shows the hepatic differentiation of human mesenchymal hepatocytes (MSCs) transfected with TERT (hepatic differentiation of MSCs transfected with TERT).
  • the present invention provides a method for transplanting a mesenchymal stem cell (Mesenchymal Stem Cell; also referred to as MSC), a mesenchymal progenitor cell or a mesenchymal cell into a mammal suffering from chronic liver damage by continuing drug administration.
  • MSC mesenchymal Stem Cell
  • a mesenchymal progenitor cell or a mesenchymal cell into a mammal suffering from chronic liver damage by continuing drug administration.
  • mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells into a mammal having acute hepatic injury, and to continuously administer a hepatotoxic agent after the transplantation. It is intended to provide a method for making liver damage chronic and differentiating transplanted mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells into mature hepatocytes.
  • Mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells can be derived from any mammal. Although mesenchymal stem cells, mesenchymal progenitor cells or mesenchymal cells can be used, preferred examples include humans, mice, rats, monkeys, and the like, which are commonly used as experimental animals.
  • mesenchymal stem cells for example, bone marrow, peripheral blood, skin, hair root, muscular tissue, endometrium, blood, umbilical cord blood, and stem cells obtained from an initial culture of various tissues are used. be able to. It is also known that mesenchymal stem cells can be separated from ES cells and teratoma cells.
  • a stem cell is a totipotent stem cell capable of differentiating into all totipotent cells, or is capable of differentiating into three germ layers such as fetal stem cells, but is limited to extraembryonic trophoblast cells
  • pluripotency stem cells and pluripotent stem cells that can differentiate into many cells of a certain tissue.
  • Mesenchymal stem cells are considered to be pluiripotent.
  • stem cells obtained by performing initial culture of bone marrow and obtaining from stromal cells attached to the bottom of the culture dish can be preferably used.
  • the precursor cells of mesenchymal cells refer to cells that are differentiated from mesenchymal stem cells and are in the process of differentiation into mesenchymal cells.
  • Mesenchymal cells are cells that arise from the differentiation of mesenchymal stem cells and do not have the ability to differentiate in many ways as stem cells do, but have the ability to differentiate and proliferate in certain directions. These cells are normally in the G0 phase, but can enter the G1 phase (start of division) upon stimulation. Mesenchymal cells also include, for example, stromal cells and cells having stromal cell properties. Mesenchymal cells are present in all organs, such as subcutaneous tissue, lungs, and liver, and are present in mesenchymal tissues such as bone, cartilage, fat, tendons, skeletal muscle, and bone stromal tissue.
  • an immortalizing gene for example, a gene that regulates the expression or activity of telomerase or telomerase, preferably human telomerase or a human telomerase catalytically active subunit (hTERT), is used for immortalization.
  • telomerase or telomerase preferably human telomerase or a human telomerase catalytically active subunit (hTERT)
  • hTERT human telomerase catalytically active subunit
  • the immortalizing gene is incorporated into a plasmid vector, and the vector is replaced with calcium-phosphate Stroma in the presence of Transformation by introducing into mesenchymal cells such as cells, mesenchymal stem cells, etc., or contacting the immortalizing gene with mesenchymal cells or mesenchymal stem cells together with vesicles such as ribosomes
  • An introduction method can be used.
  • a method for introduction using a virus vector there is a method using a retrovirus, an adenovirus, or an adeno-associated virus.
  • a retrovirus vector a method using a MoMLV virus is used.
  • a pBabe vector can be used.
  • the immortalized gene can be removed.
  • bone marrow-derived mesenchymal stem cells can be suitably used.
  • mesenchymal stem cells will be described.
  • mesenchymal progenitor cells and mesenchymal cells can also similarly differentiate into hepatocytes.
  • a mammal for providing a chronic liver injury tissue that provides an effective environment for differentiation of mesenchymal stem cells into hepatocytes
  • various experimental animals can be used.
  • mouse, SCID mouse, rat and the like can be preferably used, and SD rat can be used particularly preferably.
  • the rat it is preferable that the rat is as young as possible, for example, 4 to 6 weeks old.
  • hepatotoxic drug various drugs that cause hepatic impairment can be used.
  • allylic alcohol Allyl Alcohol
  • carbon tetrachloride CC14
  • carbon tetrachloride CC14
  • 2-acetylaminoiluorene 2-AAF
  • AAF can be used, and it is particularly preferable to use allyl alcohol.
  • Aryl alcohol has the effect of damaging hepatocytes, especially around the portal vein, by necrosis.
  • an immunosuppressant is preferably added in advance to reduce the immune response in the transplantation. It is desirable to administer to animals to be transplanted 2 to 2 days before.
  • a method for transplantation into an animal to be transplanted for example, local injection, intraportal injection, or tail vein injection of a mesenchymal cell-containing solution into the liver of the above-mentioned animal can be employed.
  • the timing of transplantation of mesenchymal stem cells may be affected by the hepatopathy drug.Therefore, at least 24 hours after administration of the first hepatopathy drug to the target animal It can be transplanted within three days, preferably one day later.
  • livers that already have chronic liver damage such as the liver of LEC rats, which is a model for cirrhosis of Wilson's disease, or FAH-/-mice, which have liver damage due to hypertyrosinemia.
  • liver disorder chronic in the transplantation target animal there is a method of transplanting the mesenchymal stem cells into the transplantation target animal and then continuing to administer the hepatopathy drug to make the liver damage chronic.
  • the dose of the hepatotoxic drug can be selected to be sufficient to cause acute damage to the liver but not to affect the survival of the animal in the first dose, for example, When aryl alcohol is used in the rat, an amount of about 0.5 mm o 1 Kg to about 0.7 mm o 1 / K g, preferably about 0.6 mm o 1 ZK g can be used. Wear. In the second and subsequent doses, the hepatotoxic drug can be used in an amount sufficient to make the hepatic disorder chronic.For example, when using allylic alcohol, 0.3 mm o 1 / Kg can do.
  • a suitable administration method can be selected depending on the drug.
  • oral administration, intravenous injection, or intraperitoneal injection can be used, and when alcohol is administered to a rat.
  • Can preferably be by intraperitoneal injection can be used.
  • the number of mesenchymal stem cells required to differentiate into mature hepatocytes is, for example, 2 weeks to 3 months, preferably 3 to 5 weeks, more preferably 4 weeks. it can.
  • the number of mesenchymal stem cells required to differentiate into mature hepatocytes is, for example, 2 weeks to 3 months, preferably 3 to 5 weeks, more preferably 4 weeks. it can.
  • intraperitoneal injection of 0.3 mmo1 / kg should be continued three times a week for one month Can be.
  • Markers (labels) for undifferentiated hepatocytes include GST_P, cytokeratin 19, and a-fetoprotein. Detection of these markers requires the use of antibodies against these antibodies. Or a gene-specific primer or probe encoding a marker can be used. Furthermore, undifferentiated hepatocytes (immature hepatocytes) can also be differentiated by GTP staining.
  • Markers (labels) for mature hepatocytes include albumin, ⁇ -antitrypsin, transferrin, CK18, AGPR, and the like. These markers are antibodies against the markers, gene-specific primers encoding the markers, or gene-specific primers. It can be detected using a single probe.
  • anti-albumin antibody anti-AFP (human protein) antibody
  • anti-CK19 antibody anti-CK19 antibody
  • anti-CK18 antibody anti-AGPR antibody
  • AGPR is By comparing the reactivity with lycoprotein receptor, such as ialoglycoprote in receptor, the same shall apply hereinafter.
  • the mesenchymal stem cells are transplanted into the liver of an animal different from the animal from which the mesenchymal stem cells are derived, for example, when the human mesenchymal stem cells are transplanted into a rat liver-impaired liver, the mesenchymal stem cells Animal specific origin of origin It can be confirmed by immunostaining, immunoenzymatic staining, sandwich antibody method and the like using the above-mentioned antibody specific to mature hepatocyte marker and human albumin-specific antibody.
  • a marker-specific primer When a marker-specific primer is used, a gene amplification method, for example, PCR can be used. [Recovery of differentiated hepatocytes]
  • a liver is removed from an experimental animal, separated into hepatocytes, and a fluorescently labeled antibody or cell surface marker that is specific to the animal from which the mesenchymal cells are derived and specific to the mature hepatocyte
  • -Mature hepatocytes differentiated from mesenchymal stem cells can be isolated by treating with antibodies against HLA (such as HLA) and using a fluorescent cell sorter (FACS).
  • HLA such as HLA
  • FACS fluorescent cell sorter
  • telomere Human telomerase is introduced, and immortalized TERT-introduced MSCs are differentiated into the liver by the method described above, and the perfused cells are cultured. Since hepatocytes derived from rats usually die in about one week, the remaining cells are mature hepatocytes differentiated from mesenchymal stem cells. This is cultured and propagated in an appropriate medium.
  • Hepatocytes differentiated from mesenchymal stem cells prepared from individuals can be collected, and individual-specific hepatocellular gene profiles can be created, which can be useful for tiller-made medicine.
  • hepatocytes can be prepared in large quantities, they can be used for analysis of the proliferation mechanism of hepatitis C virus and hepatitis B virus, and also for analysis of the mechanism of action of antiviral agents.
  • a large amount of human normal mature hepatocytes that could not be obtained conventionally can be obtained, they can be used for drug screening and drug toxicity tests.
  • the isolated and recovered human hepatocytes can be used for cell therapy transplantation to patients with liver failure and congenital metabolic liver disease or for the production of artificial liver.
  • mesenchymal stem cells can be used as a cell therapeutic agent to be directly administered to a liver disease site together with a suitable carrier for cell therapy of chronic hepatitis.
  • Example 1 is merely examples of the present invention, and the present invention is not limited to the examples.
  • Example 1 is merely examples of the present invention, and the present invention is not limited to the examples.
  • MSC Mesenchymal stem cells
  • Bone marrow puncture was performed from the iliac bone of a healthy adult, mononuclear cells were collected by specific gravity centrifugation, and cultured overnight in DMEM containing 10% inactivated fetal serum. From the next day, adherent cells (adherent cells) Incubate. Two weeks later, cells recovered by T_E (trypsin-EDTA) were used as primary mesenchymal stem cells and cryopreserved. Primary cultures of mesenchymal stem cells were subcultured in DMEM containing 10% inactivated fetal serum and PD 6 to 9 (from 6 to 9 generation division doublings) from the primary culture. Used for experiments ( Figure 1).
  • Spragne-Dawley (SD) rats (five weeks old, female or male) purchased from Charles River Japan were used.
  • mice On the 14th (day 14) and the 28th (day 28) after MSC administration, the mice were sacrificed, and the liver was perfused and fixed with 4% paraformaldehyde, embedded with an OTC compound, and frozen sections (6 zm) were prepared.
  • Anti-human Alb (albumin) antibody Sigma, A6684
  • anti-human AFP antibody Sigma, A8452
  • anti-human CK19 antibody Sigma, C6930
  • Immunostaining was performed using anti-human CK18 antibody (PROGEN, RCK106), AGPR antibody (Kohgo et al., Hybridoma 1993; 12.591-598) and control antibody.
  • Figure 3 shows the results at 14 times after MSC transplantation at 400x magnification.
  • Fig. 3 Upper and middle sections As shown, about 50 to 80 positive cells of anti-human AFP antibody, anti-human CK19 antibody, anti-human Alb antibody, anti-human CK18 antibody, or anti-AGPR antibody with a diameter of about 20-25 mm on the same section. In the form of clusters. No staining was observed with the control antibody. In the fluorescent immunostaining shown in the lower part, staining was carried out with the rhodamine (Rodamine) -labeled anti-human AFP antibody (left) shown in red and the FI-labeled anti-human Alb antibody (middle) shown in green, and a superposition of these was shown on the right. These merged MSCs were considered to express AFP and Alb, since they appeared yellow in the merged image. These staining patterns indicate relatively undifferentiated human hepatocytes.
  • Rodamine rhodamine
  • Figure 4 shows the results of immunostaining 28 days after MSC transplantation. As in the 14th day, the magnification was 400 times, but as shown in the upper and middle panels, positive cells of anti-human Alb antibody, anti-human CK18 antibody or anti-human CK18 antibody or AGPR antibody with a diameter of 25-30 were found on the same section. More than 300 clusters were observed in one pattern. On the other hand, positive cells with anti-human AFP antibody or anti-human CK19 antibody were only slightly scattered. In the fluorescent immunostaining shown in the lower part, similarly, redamine-labeled anti-human AFP antibody-positive cells, also shown in red, were partially observed, and the whole cells were stained with FITC-labeled anti-human Alb antibody (center). In the merged image shown on the right, the AFP antibody-positive cells appear to be yellow, indicating that most of these transplanted MSCs express Mb but partially retain AFP expression. These staining patterns indicate mature human hepatocytes.
  • Primer sequence includes primer sense strand for human albumin
  • Fig. 5 where the expression of Alb was examined, 1; HepG2 cells, which are hepatocellular carcinoma cells (positive control), 2; rat liver (negative control), 3; , 4; AA administration of CD34 + cells as a control three times a week after hepatic administration, and 5; Non-MSC / non-CD34 + cells as a control excluding MSC and CD34 were injected three times a week. 6 times AA administration, 6; MSC administered only once after hepatic injection of MSC, 7; control CD34 + cells administered once AA after hepatic injection, and 8; MSC as control And Non-MSC / non-CD34 + cells excluding CD34 were injected with AA only once after hepatic injection. On the 14th day (Day 14) and the 28th day (Day 28) after MSC administration, human Alb band was shown only when AA was administered three times a week after MSC hepatic administration.
  • AFP expression was examined, 1; HepG2 cells, a liver cancer cell (positive control), 2; rat fetal liver (negative control), 3; MSC were injected AA three times a week after hepatic administration. 4; weekly after injection of AA three times a week after injection of CD34 + cells as a control, and 5 weeks after injection of non-MSC / non-CD34 + cells excluding MSC and CD34 as control Three AA administrations, 6; MSCs injected only once after hepatic injection, 7; Controls CD34 + cells injected once only after AA administration, and 8; Controls Non-MSC / non-CD34 + cells excluding MSC and CD34 were injected into the liver and injected with AA only once. On day 14, only human AFP was administered three times a week after MSC hepatic injection, and a human AFP band was shown.
  • Fig. 7 in which Alb production was examined, from the right, 1; human liver tissue (positive control), 2; rat liver (negative control), 3; MSA administered to the liver station three times a week after AA administration , 4; AA administration three times a week after CD34 + cells were injected into the liver as a control, and 5; Non-MSC / non-CD34 + cells excluding MSC and CD34 were injected into the liver three times a week.
  • Human Alb production was 4 ng / mg of t issue / ml on the 14th day after transplantation, and 7.6 ng / mg of t issue / ml in liver tissue 28 days after the transplantation in MSC-transplanted AA continuous administration hepatic disorder rats And human Alb production, which increased significantly compared to other controls and were close to human liver tissue.
  • liver differentiation of MSC was shown in a chronic liver injury model in which AA was administered three times a week, not in the acute hepatitis group. This suggests that AA-induced persistent liver injury is an environment suitable for inducing differentiation of MSCs into liver.
  • liver differentiation was not observed in any liver injury model.
  • HSC Hematopoietic Stem Cell
  • bone marrow cells were used. This is considered to be the result that it is necessary to remove bone marrow cells by radiation (rad iaton) for hepatic differentiation to allow transplanted cells to survive in the bone marrow.
  • an MSC (TERT-MSC) into which the prepared hTERT was introduced was prepared by the method described in Reference Example 1 below. Observation was performed 28 days after local injection into the liver. As a result, as shown in FIG. 9, cells expressing human albumin were confirmed in normal rat liver tissue, and it was considered that the cells had differentiated into mature hepatocytes.
  • Rats in which the hTERT gene-derived mesenchymal stem cell-derived (hTERT-MSC) was locally injected into the liver were shaved under deep anesthesia 28 days after the local injection, followed by laparotomy.
  • Perfuse 37 ° C EGTA solution (adjusted with Hanks solution 500 mL + HEPES 1.19 g + EGTA 0.1 lg) from the portal vein. After confirming swelling of the liver, cut the inferior vena cava above and below the liver and perfuse at a rate of 10 mL / min for 10 minutes.
  • the collagenase solution ((Hanks solution 500 mL + CaC12 / 2H20
  • rat hepatocytes die in about one week, they are observed for about one week, and hTERT-MSC-derived human hepatocytes form colonies.
  • hTERT A gene encoding the catalytic subunit of human telomerase (hTERT) was used as a gene to be introduced into mesenchymal stem cells. The sequence of MERT is described, for example, in Science 277, ⁇ ⁇ 955-959.
  • pBABE-hygro-hTERT (provided by Dr. Robert A Weinberg), pBABE-hygro-hTERT is pCI-Neo as described in Pro Natl. Acad. Sci. USA vol. -hTERT EcoRV-Sall fragment obtained by PCR from hTERT-HA was cloned into BABE-hygro.
  • Solution A was gently mixed with solution B to prepare solution C, which was left at room temperature for 30 to 45 minutes.
  • the above vector was propagated in retrovirus-producing cells (CRIP / P131), and mesenchymal stem cells were transfected (infected) as follows.
  • the mesenchymal stem cells 5xl0 4 cel l / l O cm dish and so as to re-sown the medium producing Suruyu CRIP / P131 retrovirus 10% ⁇ shea serum-containing DMEM or al 12. 5% inactivated fetal serum 12.5% inactivated fetal serum / containing 2-mercaptoethanol / ydrocorto isone-Incubate instead of -MEM medium.
  • the culture supernatant was filtered through a 0.20 m filter, and polybrene was added to a final concentration of 8 / ml.
  • mesenchymal stem cells were infected with the recombinant retrovirus vector produced in the supernatant.
  • the retrovirus vector was infected with only (1) the control and (2) the pBABE-hygro-hTERT vector alone.
  • the present invention can be used in industries such as cell differentiation, cell culture, drug development, and artificial organ development, and can also be used in the industrial field related to liver regeneration medical technology.

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Abstract

肝細胞は樹立化が困難であるので、増殖手法が確立している間葉系幹細胞、特に、骨髄由来の間葉系幹細胞であるストローマ細胞を用いて、肝細胞に分化させ、肝障害の肝細胞移植治療法に役立つ肝細胞を調製する手段を提供することを課題とする。　薬剤投与を継続することにより慢性の肝障害を起こした哺乳動物、例えば、ラットの肝臓に、ヒト間葉系幹細胞を移植することで、ヒト間葉系幹細胞を肝細胞、成熟肝細胞に分化できることを見出し、間葉系幹細胞から成熟肝細胞へ分化させる手段を開発した。

Description

明 細 書 間葉系幹細胞の肝細胞への分化方法及び人工ヒト肝臓細胞 技術分野
本発明は、 間葉系細胞の肝細胞への分化技術に関する。 本発明は、 更に、 肝障 害を受けた人を含む動物に対する、 肝臓再生医療技術に関する。 背景技術
肝臓は、 人体の生化学工場とも呼ばれ、 体内で栄養に関係深い中間代謝、 胆汁 生成、 血液成分の生成 ·変換、 解毒等多様な生化学機能を持つ、 重要な臓器であ る。
ところが、 アルコール、 ウィルス、 薬物、 又は自己免疫疾患等により肝臓に障 害が起きると、 肝炎、 更に肝硬変となり、 時に重大な結果を招く。
例えば、 アルコール性肝障害では、 アルコール性飲料の慢性過剰摂取によって 肝臓の細胞に障害が起き、 脂肪肝、 アルコール性肝炎、 さらに終末的な肝硬変と 進行する。 1日に摂取するアルコール量が 60〜80 g以上あると、 脂肪肝が発生す る可能性が高く、 1 日あたり 100〜120 g以上のアルコールを 1 0年以上摂取する と肝硬変を発生するといわれている。
従来の肝障害治療においては、 （1 )肝障害の原因となるアルコールなどの毒物 を排除する、 （2 ) ビタミン等の補給により肝細胞の自然再生を待つ、 （3 ) 薬剤 による治療としては、 （i) グリチルリチン製剤 （肝臓の働きを守る）、 （i i)小柴胡 湯 （肝臓の炎症軽減、 肝機能改善）、 （i i i)胆汁酸製剤 （胆石や胆汁鬱滞による肝 障害に有用）、 （4 ) ウィルス性肝炎への治療薬としては、 （i)インターフェロン、
( i i) レべトール （抗ウィルス薬、 インターフェロンとの併用 ：ウィルス量の多 い C型慢性肝炎用）、 （i i i)ラミブジン （抗ウィルス薬、 B型肝炎用、 DNAポリメ ラーゼ阻害剤）、 及び （5 ) 生体肝移植などの方法がある。
また、 アルカリフォスファターゼ陽性ラット幹細胞様セルラインをインビトロ で肝細胞系統に分化させたことが非特許文献 1に、 成人多能細胞からの肝細胞へ の分化が非特許文献 2に報告されている。
さらに、 分化誘導剤を用いて、 骨髄細胞を肝実質細胞に分化させることについ ては、 特許文献 1に記載されている。
特許文献 1 特開 2 0 0 2— 7 8 4 8 2号
非特許文献 1 Stem Cel ls Vol. 21, . 428-436
非特許文献 2 The Journal of Cl inical Invest igat ion Vol. 109, p. 1291-1302 発明の開示
肝臓治療の薬物療法は、 対症療法にすぎず、 十分ではなく、 他方、 細胞移植治 療法に必要な、 肝細胞及び MA P C (多能性成人前駆細胞： Mul t ipotent adul t progeni tor cel l) は、 樹立化が困難である。
そこで、 増殖手法が確立している間葉系幹細胞、 特に、 骨髄由来の間葉系幹細 胞であるストローマ細胞を用いて、 肝細胞に分化させ、 肝障害の肝細胞移植治療 法に役立つ肝細胞を調製する手段を提供することを課題としている。
間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を、 薬剤投与を継続することに より慢性の肝障害を起こした哺乳動物、例えば、ラッ卜の肝臓に移植することで、 肝細胞、 成熟肝細胞に分化することを見出し、 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又 は間葉系細胞から成熟肝細胞へ分化せせる手段を開発した。
本件発明によれば、 十分量入手可能な、 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間 葉系細胞を用いて、 成熟型の肝細胞を調製することができる。 これにより、 例え ば、 個人から調製した間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞から肝細胞 を分化させ、 個人別の肝細胞遺伝子プロファイルが作成でき、 ティラーメイド医 療に役立てることもできる。 また、 肝細胞を多量に調製できるので、 C型肝炎ゥ ィルス、 B型肝炎ウィルスの増殖機構の分析、 更には、 抗ウィルス剤の作用機序 の解析にも用いることができる。 更に、 従来得られなかったヒト正常成熟肝細胞 が多量に得られるので、 薬剤スクリーニング、 薬剤毒性試験に用いることもでき る。 又更に、 分離され、 回収されたヒト肝細胞を用いて、 肝不全 ·先天的代謝肝 疾患者に移植する細胞治療若しくは人工肝臓の製造にも用いることができる。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003-303229号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒト間葉系幹細胞の調製
図 2は、 慢性肝障害を引き起こすァリルアルコールの投与方法
図 3は、 ヒト間葉系幹細胞の移植後 1 4日目の抗体染色
図 4は、 ヒト間葉系幹細胞の移植後 2 8日目の抗体染色
図 5は、 ヒト間葉系幹細胞を移植したラッ卜肝臓中におけるヒトアルブミンの 発現
図 6は、 ヒト間葉系幹細胞を移植したラット肝臓中におけるヒトアルファフィ 卜プロティンの発現
図 7は、 ヒトアルブミンの生産量
図 8は、 ヒト間葉系幹細胞、 ヒト C D 3 4 +細胞又は非間葉系細胞 Z非 C D 3 4 +細胞をァリルアルコール処理を 1回又は継続的に行った場合の、 ヒト肝細胞 への分化の有無
図 9は、 TERT導入ヒト間葉系肝細胞 （MSC) の肝分化 （TERT導入 MSCの肝分化） 発明を実施するための最良の形態
本件発明は、 間葉系幹細胞 （Mesenchymal Stem Ce l l ； MSCとも言う）、 間葉系 前駆細胞又は間葉系細胞を、 薬剤投与を継続することにより慢性の肝障害を起こ した哺乳動物に移植することで、 肝細胞、 成熟肝細胞に分化させる、 間葉系幹細 胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞の肝細胞への分化方法を提供する。
本発明では、 また、 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を、 急性の 肝障害を起こした哺乳動物に移植し、 移植後に肝障害性薬剤を継続的に投与する ことにより、 肝障害を慢性化させると共に、 移植した間葉系幹細胞、 間葉系前駆 細胞又は間葉系細胞を成熟肝細胞に分化させる方法を提供する。
[間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞、 間葉系細胞]
間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞としては、 任意の哺乳類由来の 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を用いることができるが、 好適に は、 ヒト又は、 実験動物として常用される、 マウス、 ラット、 サルなどが挙げら れる。
間葉系幹細胞としては、 例えば、 骨髄、 末梢血、 皮膚、 毛根、 筋組織、 子宮内 膜、 血液、 臍帯血、 更には、 種々の組織の初期培養物から得ることができる幹細 胞を用いることができる。 また、 ES細胞やテラトーマ細胞からも間葉系幹細胞が 分離できることが知られている。 ここで、 幹細胞とは、 全能性を有する全ての細 胞に分化できる全能性幹細胞や、 胎児性幹細胞のように三胚葉の系統には分化で きるが胚外栄養膜細胞への分化は限定的である pluripotencyである幹細胞、更に は、 ある組織の多くの細胞に分化することができる多能性幹細胞などがあるが、 間葉系幹細胞は、 pluiripotentであると考えられている。
間葉系幹細胞として、 好適には、 骨髄の初期培養を行い、 カルチャーディッシ ュの底面に付着した間質細胞から取得する幹細胞を用いることができる。
間葉系細胞の前駆細胞とは、 間葉系幹細胞から分化し、 間葉系細胞への分化の 途上にある細胞のことを意味する。
間葉系細胞は、 間葉系幹細胞の分化により生じ、 幹細胞のように多方面に分化 する能力はないが、 ある方向への分化能力と増殖能力を有している細胞である。 正常の状態では G O期に止まっているが、 刺激により G 1期 （分裂開始） に移行 できる細胞である。 間葉系細胞は、 例えば、 ストローマ細胞、 ストローマ細胞の 性質を有する細胞も包含している。 間葉系細胞は、 皮下組織、 肺、 肝等あらゆる 臓器に存在しており、 骨、 軟骨、 脂肪、 腱、 骨格筋、 骨随間質と言った間葉系組 織に存在している。
更に、 本件発明においては、 不死化遺伝子、 例えば、 テロメラーゼ又はテロメ ラ一ゼの発現又は活性を調節する遺伝子、 好適には、 ヒトテロメラーゼ又はヒト テロメラーゼ触媒活性サブユニット （hTERT) を用いて、 不死化した上記間葉系幹 細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を用いることができる。
不死化遺伝子を、 ストローマ細胞等、 間葉系幹細胞等への導入方法としては、 公知の種々の方法を用いることができるが、 例えば、 不死化遺伝子をプラスミド ベクターに組み込み、 当該ベクターをカルシウムーリン酸の存在下でストローマ 細胞のような間葉系細胞、 間葉系幹細胞等に導入して、 形質転換する方法、 或い は不死化遺伝子をリボソームの様なべシクルとともに、 間葉系細胞又は間葉系幹 細胞に接触させ導入する方法、 更に、 不死化遺伝子の存在下でエレクト口ポレー シヨンにより導入する方法、 又は不死化遺伝子を各種ウィルスベクターに組み込 み、 間葉系細胞若しくは間葉系幹細胞等に感染させて導入する方法などを用いる ことができる。
ウィルスベクターを用いる導入方法としては、 レトロウイルス、 アデノウィル ス、 又はアデノ随伴ウィルスを用いる方法があり、 レトロウイルスベクタ一とし ては、 MoMLV ウィルスを用いる方法などがある。 好適には、 p B a b eベクター を用いることができる。
更に、 不死化した細胞をヒトの治療に用いる場合、 不死化遺伝子などの外来遺 伝子はできるだけ除去しておいた方が安全性が高いと考えられ、 既に確立した技 術により、 細胞に導入した不死化遺伝子を除去することができる。 例えば、 好適 には、 不死化遺伝子が ΙοχΡ配列または ΙοχΡ様配列にはさまれて、 Cre リコンビ ナーゼなどのリコンビナーゼ処理により特異的に除去する手法を用いることがで きる。
ヒト間葉系幹細胞としては、 好適には、 骨髄由来の間葉系幹細胞を用いること ができる。
[移植対象動物、 慢性肝障害手段]
以下、 間葉系幹細胞について説明するが、 間葉系前駆細胞、 間葉系細胞を用い ても同様に、 肝細胞に分化させることができる。
間葉系幹細胞の肝細胞への分化に有効な環境を与える慢性肝障害組織を提供す る、 哺乳動物 （以下移植対象動物と呼ぶ） としては、 種々の実験動物を用いるこ とができるが、 例えば、 好適には、 マウス、 SCIDマウス、 ラット等、 特に好適に は、 SDラットを用いることができる。 なお、 ラットに関しては、 なるべく週齢の 若いもの、 例えば、 4週から 6週齢のものが好適である。
肝障害性薬剤としては、 肝障害を与える種々の薬物を用いることができ、 例え ば、 chol ine def iciency (CD) ethionine, galactosamine、 Dimethylni trosaiiiiiie
(D丽）、 Jo2抗体 （抗 Fas抗体；アポトーシス誘導） が肝臓障害剤として知られ ており、 好適には、 ァリルアルコール （Al lyl Alcohol) , 四塩化炭素（CC14)、 四 塩化炭素（CC14)及び 2 - acetylaminoiluorene (2 - AAF)を組み合わせて、 又は肝部 分切除し 2- AAF を用いることができ、 特に好適には、 ァリルアルコール （Al lyl Alcohol)用いることが望ましい。 ァリルアルコールは、 特に門脈周囲の肝細胞を ネクローシスにより傷害する効果がある。
間葉系幹細胞の由来哺乳動物と、移植対象哺乳動物とが同じ動物でない場合は、 移植における免疫反応の低減のために、 免疫抑制剤を予め、 好適には、 間葉系幹 細胞の移植 1〜 2日前に、 移植対象動物に投与することが望ましい。
移植対象動物への移植方法としては、 例えば、 間葉系細胞含有溶液を上記対象 動物の肝臓に局部注射、 門脈内注射、 尾静脈注射を採用することができる。
肝障害剤により肝障害を慢性化させる場合、間葉系幹細胞の移植時期としては、 肝障害性薬剤の影響があるので、 早くとも最初の肝障害性薬剤を対象動物に投与 後 24時間後から 3日以内に、 好適には、 1日後に移植することができる。
なお、 既に慢性の肝障害を有する肝臓、 例えば、 ウィルソン病肝硬変モデルで ある LECラットや高チロシン血症による肝障害をきたす FAH-/-マウスの肝臓に移 植することもできる。
移植対象動物において、 肝障害を慢性化させる手段としては、 間葉系幹細胞を 移植対象動物に移植後、 肝障害性薬剤の投与を続けて肝障害を慢性化する方法が ある。
肝障害性薬剤の投与量としては、 第一回目の投与は、 肝臓に急性に障害を与え るが、 動物の生存に影響しない程度に十分な程度の量を選択することができ、 例 えば、 ァリルアルコールをラッ卜に用いる場合は、 0. 5mm o 1 K g〜0. 7mm o 1 /K g程度、 好適には、 0 . 6 mm o 1 ZK g程度の量を採用することがで きる。 第 2回目以降の投与は、 肝障害性薬剤が肝障害を慢性化するために十分な 量とすることができ、 例えば、 ァリルアルコールを用いる場合は、 0 . 3 mm o 1 /K gとすることができる。
肝障害性薬剤の投与形態としては、 その薬剤により好適な投与方法を選択する ことができるが、 例えば、 経口投与、 静脈注射、 腹腔注射によることができ、 ァ リルアルコールをラッ卜に投与する場合は、 好適には腹腔注射によることができ る。
肝障害性薬剤の投与期間は、 肝障害を慢性化させるのに十分な期間投与する。 好適には、 間葉系幹細胞が成熟肝細胞に分化するのに必要な期間、 例えば、 2週 間〜 3月間、 好適には 3〜5週間、 更に好適には、 4週間投与数することができ る。 例えば、 肝障害薬剤としてァリルアルコールを用い、 ヒト間葉系幹細胞をラ ットに移植する場合には、 0 . 3 mm o 1 / k gの腹腔内注射を、 週 3回、 1月 間続けることことができる。
[肝細胞への分化の確認]
未分化肝細胞 （未熟肝細胞） のマーカー （標識） としては、 G S T _ P、 サイ トケラチン 1 9、 a—フエトプロテインがあり、 これらマーカーの検出には、 こ れらマ一力一に対する抗体、 又はマーカーをコードする遺伝子特異的なプライマ 一若しくはプローブを用いることができる。 又、 更に、 ァ— G T P染色により、 未分化肝細胞 （未熟肝細胞） を分別することもできる。
成熟肝細胞のマーカー （標識） としては、 アルブミン、 α ΐ —アンチトリプシ ン、 トランスフェリン、 CK18、 AGPR等があり、 これらマ一カーは、 該マーカー に対する抗体又マーカーをコードする遺伝子特異的なプライマー若しくはプロ一 ブを用いて検出することができる。
なお、抗アルブミン抗体、抗 AFP (ひフィ 卜プロテイン)抗体、抗 CK19抗体 ( C Kはサイトケラチン （Cytokerat in) の略。 以下同じ。）、 抗 CK18抗体、 抗 AGPR 抗体（AGPR は、 ァシァログリコプロテイン レセプ夕一 （as ialoglycoprote in receptor ) の略。 以下同じ。 ）等との反応性の比較により、 未分化、 成熟の検討 ができる。
更に、 間葉系幹細胞が由来する動物とは異なる動物の肝臓へ、 間葉系幹細胞を 移植した場合、 例えば、 ヒト間葉系幹細胞をラットの肝障害肝臓へ移植する場合 は、 間葉系細胞由来の動物特異的捏上記成熟肝細胞マ一カー特異的な抗体、 ヒト アルブミン特異的抗体を用いて、 免疫染色法、 免疫酵素染色法、 サンドイッチ抗 体法などの方法により確認することができる。
又マーカー特異的プライマ一を用いる場合は、 遺伝子増幅法、 例えば、 P C R を用いることができる。 [分化した肝細胞の回収]
例えば、 実験動物から肝臓を摘出し、 肝細胞に分離し、 間葉系細胞が由来する 動物に特異的でかつ成熟肝細胞特異的である蛍光標識した抗体や細胞表面マーカ
― (HLAなど） に対する抗体で処理し、 蛍光細胞分別機 （F A C S ) で、 間葉系 幹細胞から分化した成熟肝細胞を単離することができる。
ヒトテロメラーゼを導入して、不死化した TERT導入 MSCを上述の方法で肝に分 化させ、 灌流分離したものを培養する。 ラット由来の肝細胞は通常一週間程度で 死滅することから、残存した細胞が間葉系幹細胞から分化した成熟肝細胞である。 これを適当な培地で培養増殖させる。
[分化した肝細胞の利用]
個人から調製した間葉系幹細胞から分化させた肝細胞を回収し、 個人別の肝細 胞遺伝子プロファイルが作成でき、ティラーメイド医療に役立てることもできる。 また、 肝細胞を多量に調製できるので、 C型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルスの 増殖機構の分析、 更には、 抗ウィルス剤の作用機序の解析にも用いることができ る。 更に、 従来得られなかったヒト正常成熟肝細胞が多量に得られるので、 薬剤 スクリーニング、 薬剤毒性試験に用いることもできる。
又更に、 分離され、 回収されたヒト肝細胞を用いて、 肝不全 ·先天的代謝肝疾 患者に移植する細胞治療若しくは人工肝臓の製造にも用いることができる。
[間葉系幹細胞を用いた細胞治療剤]
又、 間葉系幹細胞は、 慢性肝炎の細胞治療に、 適切な担体と共に、 肝臓疾患部 に直接投与する、 細胞治療剤として用いることもできる。
以下、 本発明を実施例により詳細に説明するが、 実施例は本発明の一態様にす ぎず、 本発明は実施例に限定されるものではない。 実施例 1
[間葉系幹細胞から肝細胞への分化]
1一 1 間葉系幹細胞 （M S C ) ：
健康成人の腸骨より骨髄穿刺を行い、比重遠心法により単核球を採取、 10%非働 化胎児ゥシ血清含有 DMEMにて一晩培養。 翌日より付着細胞 （adherent cel l) を 培養する。 2週後に T_E (トリプシン一 EDTA) にて細胞を回収したものを初代 間葉系幹細胞とし凍結保存した。初代培養の間葉系幹細胞は、 10%非働化胎児ゥシ 血清含有 DMEMで継代培養し、 初代培養から PD 6から 9 ( 6から 9回の世代分裂 population doublingを経た時期） で、 以下の実験に使用した（図 1 )。
1 - 2 実験動物：
日本チャールズリバ一より購入した Spragne- Dawley (SD) ラット（5週齢， 雌 もしくは雄）を使用した。
1一 3 肝障害モデルと MS C投与法：
MSC 投与前々日 （day_l)よりサイクロスポリン A、 （CyA、 サンディミユン Sandi匪 un:ノバルティスファーマより購入） 10mg/kg/day で腹腔内投与を開始し た。 さらに翌日（day- 0)肝障害を起こすために Yavorkovsky ら （Hepatology 1995;21:1702-1712) の報告に基づき allyl alcohol (AA) (0.62龍 ol/kg)を腹 腔内投与した。翌々日（dayl) 、 2x106細胞/ 300ulに調整した MSC (間葉系幹細胞） を 23G注射器を用いてラット肝臓に直接局所注入した。 その後、 AA(0.3匪 ol/kg) 週 3回投与による慢性肝障害を行った （図 2)。
2 肝細胞への分化の確認
ヒト肝細胞への分化の確認は、 1) ヒト特異的な肝特異マーカ一による染色する こと， 2) ヒト特異的なアルブミン（Alb)及びアルファフエトプロテイン （AFP) の mRNAを検出すること， 並びに 3) ヒト特異的なアルブミン蛋白の産生を ELISA 法での検出により、 行った。
2— 1 ヒト肝臓特異マーカ一による染色：
MSC投与から 14日目（day 14)と 28日目（day 28)に屠殺し、 肝臓を 4 %パラホル ムアルデヒドで灌流固定し OTC compoundで包埋後、凍結切片（6 zm)を作製した。 これらを予めラット肝臓組織と交差反応しない事を確かめた抗ヒト Alb (アルブ ミン） 抗体 （Sigma社、 A6684), 抗ヒト AFP抗体 （Sigma社、 A8452), 抗ヒト CK19 抗体（Sigma社、 C6930) , 抗ヒト CK18抗体 (PROGEN社， RCK106), AGPR抗体 (Kohgo ら， Hybridoma 1993; 12. 591-598) とコントロール抗体で染色を用いて免疫染色 した。
図 3に MSC移植後 14目の結果を 400倍の倍率で示す。 図 3の上段， 中段に 示すように、 径 20- 25 ΠΙ程度の抗ヒト AFP抗体， 坑ヒト CK19抗体， 坑ヒト Alb 抗体， 坑ヒト CK18抗体， 又は抗 AGPR抗体の陽性細胞が同一切片上で 5 0から 8 0個程度のクラスター状に認められた。 コントロール抗体では染色は認められな かった。 下段に示す蛍光免疫染色では， 赤で示されるローダミン （Rodamine) 標 識抗ヒト AFP抗体 （左側） と緑で示される FI 標識抗ヒト Alb抗体 （中央） で染 色され、 右側に示すこれらの重ね合わせ （マージ） 像では、 黄色に見えることか ら、 これらの移植 MSCは AFPと Albを発現しているものと考えられた。 これらの 染色パターンは比較的未分化なヒト肝細胞であることを示している。
図 4に MSC移植後 28日後の免疫染色の結果を示す。 14日後と同様に 4 0 0倍 の倍率であるが、 上段， 中段に示すように、 径 2 5 - 30 の坑ヒト Alb抗体， 坑 ヒト CK18抗体，又は AGPR抗体の陽性細胞が同一切片上で 3 0 0個以上のクラスタ 一状に認められた。一方，坑ヒト AFP抗体， 又は抗ヒト CK19抗体の陽性細胞はわ ずかに散見されるのみであった。 下段に示す蛍光免疫染色では、 同様に赤で示さ れる Rodamine標識抗ヒト AFP抗体陽性細胞が一部に認められ FITC標識抗ヒ卜 Alb 抗体では全体に染色された （中央）。 右側に示すマージ像では， AFP抗体陽性細胞 部分は黄色に見えることから、 これらの移植 MSCのほとんどは Mbを発現してい るが一部に AFPの発現も残存しているものと考えられた。 これらの染色パターン はヒト成熟肝細胞を示すものである。
2— 2ヒト特異的なアルブミン（Alb)， ならびにアルファフエトプロティン（AFP) の mRNAの検出
肝組織から RNAを抽出し、 逆転写酵素を用いて cDNAを調製した。 この cDNAを 錶型にして、 ヒト特異的 Alb、 AFP について、 対応するプライマ一を用いて. PCR を行い、 バンドの増幅をァガロースゲル電気泳動にて確認した。
プライマ一配列としては、 ヒ トアルブミン用のプライマーセンス鎖
(Hu - Albumin (S) ) として 5' -c t tcgtc tgccaaacagagac t ca-3' (24mer)を、 ヒトァ ルブミ ン用 プライ マーア ンチセ ンス鎖 （ Hu- Albumin (AS) ) と して
5' -acagagt aatcaggatgcc t tc t tg-3' (25mer)を、 ヒトアルファフィ 卜プロテイン用 プライマ一センス鎖 （Hu_AFP (S) ) として 5 ' - t tggagaagt acggacat tcagac t - 3'
(25mer)を、 及び ヒトアルファフイ トプロテイン用プライマーアンチセンス鎖 (Hu-AFP (AS) )として 5' - gactcagt Uagtaacagt t atggct - 3' (26mer) を用いた。 DNA 試料は 9 4度で 5分間変性し、 9 4度で 1分 （変性）、 6 5度で 1分 （ァニーリン グ）、 更に 7 2度で 3 0秒 （伸長） からなるサイクルを 4 0サイクルし増幅した。 増幅産物は、 2 . 5 %ァガロースゲル電気泳動上でェチジゥムブロマイド染色で Albは 4 8 2 b p , AFPは 420bpのバンドとして可視化される （図 5， 6)。
Albの発現を検討した図 5では、 1 ；肝癌細胞である HepG2細胞 （ポジティブ コントロール）、 2 ； ラッ卜肝臓 （ネガティブコントロール）、 3 ； MSC を肝局注 後， 週三回の AA投与したもの、 4 ； コントロールとした CD34+細胞を肝局注後、 週三回の AA 投与したもの、 5 ； コントロールとした MSC と CD34 を除いた Non- MSC/non- CD34+細胞を肝局注後、 週三回の AA投与したもの、 6 ； MSCを肝局 注後、一度のみ AA投与したもの、 7；コントロールとした CD34+細胞を肝局注後、 一度のみ AA投与したもの、 及び 8 ； コントロールとした MSC と CD34を除いた Non- MSC/non- CD34+細胞を肝局注後、 一度のみ AA投与したもの、 を示している。 MSC投与後 1 4日目 （Day 14) 及び 2 8日目 （Day 28) では MSCを肝局注後、 週 三回の AA投与したもののみヒト Albのバンドが示された。
AFPの発現を検討した図 6では、 1 ；肝癌細胞である HepG2細胞 （ポジティブ コントロール）、 2 ；ラッ卜胎児肝臓 (ネガティブコントロール）、 3 ； MSC を肝 局注後、 週三回の AA投与したもの、 4 ；コントロールとした CD34+細胞を肝局注 後、 週三回の AA投与したもの、 5 ; コントロールとした MSCと CD34を除いた Non- MSC/non- CD34+細胞を肝局注後、 週三回の AA投与したもの、 6 ； MSCを肝局 注後、一度のみ AA投与したもの、 7；コントロールとした CD34+細胞を肝局注後、 一度のみ AA投与したもの、 及び 8 ； コントロールとした MSCと CD34を除いた Non- MSC/non- CD34+細胞を肝局注後、 一度のみ AA投与したもの、 を示している。 Day 14では MSCを肝局注後、 週三回の AA投与したもののみヒト AFPのバンドが 示されたが、 Day 28では認めなかった。
2 - 3 ヒト特異的なアルブミン蛋白の産生を ELISA法で検出
次に移植ヒト MSCが実際にヒ卜 Albを産生しているか、 すなわち機能している か（iunct ionalなものであるか） どうかを確認するため MSC局注部の肝組織 10mg を採取し、 そのホモジエネィトを用いてヒト特異的な Alb蛋白を検出可能なヒト アルブミン ELISA ki t (Be t yl Laboratories, Montgomery, Texas) で検討した。
Alb の産生を検討した図 7では、 右から順に 1 ； ヒト肝組織 （ポジティブコン トロール）、 2 ； ラット肝臓 （ネガティブコントロール）、 3 ； MSC を肝局注後、 週三回の AA投与したもの、 4 ；コントロールとした CD34+細胞を肝局注後、 週三 回の AA 投与したもの、 5 ; コントロールとした MSC と CD34 を除いた Non- MSC/non- CD34+細胞を肝局注後， 週三回の AA投与したもの、 6 '； MSCを肝局 注後、一度のみ AA投与したもの、 7；コントロールとした CD34+細胞を肝局注後、 一度のみ AA投与したもの、 及び 8 ； コントロールとした MSC と CD34を除いた Non- MSC/non- CD34+細胞を肝局注後、 一度のみ AA投与したもの、 を示している。
MSC移植 AA持続投与肝障害ラットでは移植後 14 日目にヒト Alb の産生が 4 ng/mg of t issue/ml, 移植後 28 日後の肝組織中に 7 . 6 ng/mg of t issue/ml と 他のコントロールと比較し有意に増加しヒト肝組織に近いヒト Albの産生を確認 した。
· 系ロ麵
ァリルアルコール （AA) を用いた肝障害においては、 急性肝炎群ではなく AA を週 3回投与する慢性肝障害モデルにおいて MSCの肝分化が示された。 このこと は AAによる持続肝障害が MSCの肝臓への分化誘導に好適な環境であることを示す ものと考えられた。
他方 MSC 以外の骨髄分画を局注した系ではいずれの肝障害モデルにおいても 肝への分化が認められなかった。 このことは、 これまでの報告 （Wang Xら. Am J Pathol 2002 ; 161 : 565-574. ) で示されているように、 HSC (造血幹細胞 ： Hematopoiet ic Stem Cel l) や骨髄細胞を用いた肝分化には 放射線 (rad iaton) による骨髄細胞の除去 （bone marrow abl at ion) を行い移植細胞の骨髄生着をさ せることが必須であることを裏付ける結果であると考えられる。
実施例 2
TERT導入 MSCの肝分化
kawano ら （Blood. 2003 ; 101, 532-40) の方法に基づき、 以下の参考例 1に記 載の方法で、 調製した hTERTを導入した MSC (TERT-MSC)を作製し、 実施例 1の方 法で肝に局注後 2 8日後に観察した。 その結果、 図 9に示されるように、 正常のラット肝組織中にヒトアルブミンの 発現を呈する細胞が確認され、 成熟肝細胞に分化したものと考えられた。
実施例 3
間葉性幹細胞由来肝細胞様細胞の灌流による分離
( 1 ) hTERT遺伝子の導入された間葉性幹細胞由来 (hTERT- MSC)を肝臓内に局注 したラット （実施例 2) を、 局注後 28 日に深麻酔下に剃毛後開腹し、 門脈より 37°C EGTA液 （Hanks液 500mL + HEPES 1.19g + EGTA 0. lgにて調整） を灌流す る。 肝臓の腫大を確認した後、 肝の上下の下大静脈を切断し、 lOmL/minの速度に て 10分間灌流する。 次に、 37でコラゲナーゼ液 （（Hanks液 500mL + CaC12/2H20
0.235g + HEPES1.19g + collagenase (collagenase Yakult) lOOmg (lOOU/mL) を lOmL/minの速度にて 10分間灌流する。 肝表面に白点が出現していることを確認 したのち、 hTERT- MSCを局注した部位を鉗子にて切断し、 冷却した Hanks液内に て摂子および鉗子を用いて細切し、 100 mおよび 70 mフィルタ一にて濾過する。 続いて、 50gにて 1分間遠心し、 上清を除去後、 再び冷却した Hanks液内にて懸 濁し、 50gにて 1分間遠心する。 これを 3回繰り返したのち細胞数を数える。 そ の結果約 2xl08個の細胞が回収される。
( 2 ) 間葉性幹細胞由来肝細胞様細胞の培養
続いて、 上記の灌流によって得られた細胞を培養する。 1.4X104 cell/cm2 に て L15medium (0.2 BSAおよび 50mg/Lゲンタマイシン ， ΙΟΟηΜデキサメタゾンぉ よび 0.5mg/Lインスリンを加えた L15500mL)に接種する。 3時間後に HCM培地（HCM BulletKit (宝酒造）） に変え、 C02インキュベータ一内で 37°Cにて培養する。
Rat 肝細胞は約 1週間で死滅することから、 これを約 1週間観察しコロニーの 形成されたものが hTERT- MSC由来ヒト肝細胞である。
〔参考例 1〕
hTERT-MSCの調製
1. 間葉系幹細胞の分離 健康成人の腸骨より骨髄穿刺を行い、 比重遠心法によ り単核球を採取、 10%非働化胎児ゥシ血清含有 DMEMにて一晩培養。 翌日より付着 細胞 （adherent cell) を培養する。 2週後に T-E (トリプシン一 EDTA) にて 細胞を回収したものを初代間葉系幹細胞とし凍結保存した。 2. hTERT 間葉系幹細胞に導入する遺伝子として、 ヒトテロメラーゼの触媒活性 サブユニット（hTERT)をコードする遺伝子を用いた。 MERT の配列は、 例えば、 Science 277, ρ· 955- 959に記載されている。
3. 間葉系幹細胞への遺伝子導入に用いるベクター （図 1)
pBABE-hygro-hTERT (Dr. Robert A Weinbergより供与） は、 pBABE-hygro- hTERT は Pro Natl. Acad. Sci. USA vol.95, pp.14723-14728中に記載されているとおり、 pCI-Neo-hTERT-HAより PCRにて得た hTERT EcoRV-Sall fragmentを BABE-hygro に cloningしたものである。
4. レトロウイルス産生細胞の作製とそれによるウィルスの感染は 「別冊実験医 学 ザ *プロトコールシリーズ 遺伝子導入 &発現解析実験法（斎藤 泉 菅野 純夫 編 羊土社)」 に準じておこなった（P58- 62)。
具体的には、 B0SC23 パッケージング細胞（Pro Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8392-8396, 1993)を用いて、次のように、 CRIPパッケージング細胞（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 3539-3543, 1993)を作成した。
4- 1. 組み換えレトロウイルスベクター産生細胞の作製
( i )BOSC23細胞を lOcmdishにトランスフエクシヨンの 18〜24時間前に 5.5x106 個播いた。
( i 15 gの]) NA (レトロウイルスベクタ一）に 0ΡΠ- MEM(Gibco/BRL)を 800 /1 静かに加え、 攪拌し A液を調製した。
( i i i)滅菌されたチューブに 0PTI_MEMを 750 1採り、 LIP0FECTAMINE(2mg/ml Gibco/BRL)を 50 1加えてゆつくり混ぜ B液を調製した。
( i v) A液を静かに B液に混ぜ C液を調製し、 室温で 30〜45分放置した。
(V) BOSC23細胞を抗生剤， FBSを除いた 37°Cの培地で 1度洗った。
(V i ) C液（1.6ml)を静かに B0SC23細胞に加えた。
(V i i ) 更に、 2.4mlの 0PTI-MEMを加えた。
(v i i i ) 5時間， 5%C02下でインキュベートした。
( i x) 4mlの 20%胎児ゥシ血清を含む DMEMを加え、 1晚インキュベートした。
(X) 10%胎児ゥシ血清を含む 37 の培地に換え、 同時にパッケージング細胞で ある ^CRIPを 10cm dishに 1〜2χ106個播いた。 ( x i ) 24時間後， B0SC23細胞の培地を 0. 45または 0. 20 ΠΙのシリンジフィル ターで濾過し、 CRIPの培地を 5mlの濾過した培地に交換した。 同時にポリプレ XHexadimethrine Bromide, SIGMA H-9268)を 8 n g/mlになるように加えた。 ( x i i ) 4〜24時間培養後、 5mlの培地を加え、 さらに一晩培養した。
( x i i i ) 薬剤選択を行い、 レトロウイルスを産生する YCRIP細胞が作成され る。
次に、上記のベクターを、レトロウイルス産生細胞（ CRIP/P131)で増殖させ、 間葉系幹細胞は次のように遺伝子導入 （感染） された。
まず、 感染を行う前日に、 間葉系幹細胞を 5xl04cel l/ l O cm dishとなるよう に播きなおし、レトロウイルスを産生するゆ CRIP/P131の培地を 10%ゥシ血清含有 DMEM か ら 12. 5%非 働化 ゥ マ 血 清 12. 5%非 働 化 胎 児 ゥ シ 血 清 /2-Mercaptoethanol/ ydrocort isone含有 -MEMの培地に代えて培養する。 当日 に培養上清を 0. 20 mフィルターで濾過してポリプレン（polybrene) を最終濃度 8 /mlになるように加えた。次に上清に産生された組み換えレトロウイルスべ クタ一を間葉系幹細胞に感染させた。 4時間後培養上清を新しい培地に換えてさ らに 2日間培養した。 その後、 pBABE- hygro- ERTはハイグロマイシン 100 x g/ml で 5日間、 薬剤選択を行った。
感染には、 レトロウイルスベクターを、 （ 1 ) コントロール、 （ 2 ) pBABE-hygro-hTERTベクタ一のみで感染させた。
なおこれらのウィルスおよび細胞は、 発明者らが保管しており、 特許後いつで も分譲できる状態にある。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願の内容をそのまま引用 により本明細書にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明は、 細胞分化、 細胞培養、 医薬開発、 人工臓器開発などの産業に利用で きるほか、 更には、 肝臓再生医療の技術に関する産業分野で利用することができ る。

Claims

請求の範囲 I . 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を、 慢性肝障害組織を用 いて肝細胞に分化させる方法。 2 . 慢性肝障害組織が、 肝細胞障害性薬剤を哺乳動物に長期間投与すること により哺乳動物の肝臓に生じた慢性肝障害組織である、 請求項 1記載の方法。 3 . 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を肝細胞に分化させる、 次の （1 ) から （3 ) の工程を含む方法。
( 1 ) 肝細胞障害性薬剤を哺乳動物に投与する工程
( 2 ) 間葉系細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を当該哺乳動物の肝臓に移植 する工程
( 3 ) 肝細胞障害性薬剤を継続的に当該哺乳動物に投与する工程
4 . 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞がヒ ト由来の間葉系幹細 胞である請求項 1〜 3いずれか 1項記載の方法。
5 . 間葉系幹細胞がヒ ト由来の間葉系幹細胞である請求項 1〜 4いずれか 1 項記載の方法。
6 . 間葉系幹細胞が h T E R T (ヒ トテロメラーゼの触媒活性サブュニッ ト） を導入した間葉系幹細胞である請求項 1〜 5いずれか 1項記載の方法。
7 . 肝細胞障害性薬剤が、 ァリルアルコールである請求項 2〜 6いずれか 1 項記載の方法。
8 . 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞の移植前に免疫抑制剤を 投与する請求項 2〜 7いずれか 1項記載の方法。
9 . 間葉系細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を肝臓に局部注射する請求 項 2〜 8いずれか 1項記載の方法。
1 0 . 哺乳動物がラットである請求項 2〜 9いずれか 1項記載の方法。
I I . 請求項 1〜 1 0いずれか 1項記載の方法で分化された肝細胞を間葉系 幹細胞由来の肝細胞に特異的標識により、 分別して回収する方法。
1 2 . 請求項 1〜1 0いずれか 1項記載の方法により分化された肝細胞。
1 3 . 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞から分化した肝細胞を 有効成分として含む肝障害治療剤。
14. 間葉系幹細胞、 間葉系前駆細胞又は間葉系細胞を有効成分として含む 肝障害治療剤。
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