WO2005007839A1 - ノッチリガンドDelta-1、GM-CSF、TGF-βを用いたヒト末梢血単核球であるCD14陽性細胞からのランゲルハンス細胞の調製方法 - Google Patents

ノッチリガンドDelta-1、GM-CSF、TGF-βを用いたヒト末梢血単核球であるCD14陽性細胞からのランゲルハンス細胞の調製方法 Download PDF

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Naoyuki Katayama
Koshi Oishi
Hiroshi Shiku
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Kirin Beer Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to the culture of epidermal Langerians cells (LC), which is a subtype of dendritic cells (DCs), and comprises converting Notch ligands (Notch ligands) from positive cells that are human peripheral blood mononuclear cells.
  • LC epidermal Langerians cells
  • DCs dendritic cells
  • Notch ligands Notch ligands
  • the cells can be used as therapeutic agents for cancer, infectious disease, graft rejection, graft-versus-host disease, autoimmune disease or allergic disease.
  • DCs Dendritic cells
  • LC Epidermal Langerhans cells
  • E-Cadherin cadherin
  • CCR6 Chidermal Langerhans cells
  • LC triggers an appropriate immune response to various foreign substances that have entered the skin. Specifically, LC captures foreign substances such as pathogens and tumor cells that have invaded the skin, then migrates to regional lymph nodes, where it processes the processed antigens into naive T cells or memory T cells. To activate or re-activate them and effectively induce a specific immune response to antigens derived from the foreign body.
  • Activated T cells infiltrate foreign tissue-invaded tissues, promote their removal, and protect tissues from excessive tissue damage.
  • Human LC was obtained from allogeneic bone marrow transplantation for aplastic anemia, since the LC in the skin of the transplanted patient expressed the same histocompatibility antigen as the bone marrow donor (donor). It was thought to be cell-derived (Volc-Platzer B et al., N Engl J Med 310: 1123-1124, 1984).
  • CD34-positive hematopoietic progenitor cells from umbilical cord blood or peripheral blood were converted to granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + tumor necrosis fact or-a (TNF- ⁇ ;) It has been reported that when cultured in culture, some of the cultured cells have differentiated into LC (Caux C et al., Ature 360: 258-261, 1992; Caux C et al., J Exp Med 184: 695-706, 1996; Strunk D et al., Blood 87: 1292-1302, 1996), indicating that LC was derived from hematopoietic stem cells.
  • LC granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • hematopoiesis such as GM-CSF + interleukin4 (IL-4) + transforming growth factor-j3 (TGF- / 3), GM-CSF + IL-15, GM-CSF + TGF- / 3, etc.
  • Notch ligand Delta-1 (Ohishi K et al., Int J Hematol 75: 449-459, 2002; Ohishi K et al., Semin Cell Dev Biol 14: 143-150, 2003), CD34 derived from human peripheral blood monocytes or bone marrow It has also been reported to be involved in the differentiation of dermal DC from positive cells (Ohishi K et al., Blood 98: 1402-1407, 4010783
  • CD14-positive cells which are human peripheral blood mononuclear cells.
  • the present inventors have eagerly studied a method for culturing and differentiating dendritic cells having antigen-presenting ability in order to utilize Langerhans, a subtype of dendritic cells, for cell biology research and the development of vaccine cell therapy using DC. Study was carried out. Conventionally, attempts have been made to obtain Langerhans cells by culturing. However, cells that can be said to be Langerhans cells have not been obtained in view of the expressed antigen of the cells.
  • the present inventors cultured CD14-positive cells, which are human peripheral blood mononuclear cells, in an animal cell culture medium using Notch ligand Delta-1, GM-CSF, and TGF-j3. They have found that Langerhans cells can be obtained, and have completed the method for preparing Langerhans cells of the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a method for transmitting Langerhans cells comprising transmitting Notch signals to Notch of human peripheral blood mononuclear cells using Notch ligand, and culturing the mononuclear cells in the presence of GM-CSF and TGF- Preparation method,
  • the Notch ligand constitutes a fusion peptide with another peptide, an antibody against the other peptide is immobilized in a culture vessel, and the Notch ligand is cultured through the binding of the antibody and the other peptide.
  • the notch ligand is selected from the group consisting of Delta-1, Delta-2, Delta-3, Delta-4, Jagged-1 and Jagged-2, and is any one of [1] to [5].
  • a method for preparing Langerhans cells for treating cancer or infectious disease comprising culturing peripheral blood mononuclear cells collected from a human in the presence of Notch ligand, GM-CSF and TGF- ⁇ ,
  • Cancer infectious disease, transplant rejection associated with cell, organ or tissue transplant, including culturing peripheral blood mononuclear cells from humans in the presence of Notch ligand, GM-CSF and TGF-j3
  • FIG. 1 shows the results of analysis of the traits of cells induced from CD14-positive cells by GM-CSF + IL-4 + TGF-j3 in the presence or absence of Delta-1.
  • FIG. 2 shows the results of analysis of the traits of cells induced from CD14-positive cells by GM-CSF + IL-15 in the presence or absence of Delta-1.
  • FIG. 3 is a view showing the results of analysis of the traits of cells induced from CD14-positive cells by GM-CSF + TGF-j3 in the presence or absence of Delta-1.
  • Figure 4 shows the expression of E-force doherin and Langerin in 01 & positive cells in Delta-1 + GM-CSF + 161 ? -Like cells and the expression of E-force dherin and CCR6 in Langerin-positive cells. It is a figure showing a result of analysis.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of analysis of expression of antigen-presenting function-related molecules in cells induced by Delta-1 + GM-CSF + TGF- / 3.
  • FIG. 6 is a diagram showing the enhanced expression of the HES-1 gene by Delta-1 in CD14-positive cells.
  • FIG. 7 is a photograph showing an electron microscope image of the cultured cells.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of an examination of the uptake of FITC-dextran by LC.
  • FIG. 9 is a diagram showing the expression of HLA-ABC, HLA-DR, CD80, CD86, CD40, CD54, and CD83 in LC matured by CD40 ligand and TNF-.
  • FIG. 10 is a view showing activation of peptide-specific CD8-positive cells of mature LC generated from CD14-positive cells.
  • Figure 11 shows the results of stimulation of autologous CD4-positive cells with mature: LC and mature DC. '' Best mode for carrying out the invention
  • the present invention is a method for preparing Langerhans cells, comprising culturing human peripheral blood mononuclear cells in the presence of Notch ligand, GM-CSF and TGF- / 3.
  • Human peripheral blood mononuclear cells can be obtained by known methods from blood collected from humans.
  • peripheral blood can be collected from a human and obtained by specific gravity centrifugation using FicoU-HypaQue or the like.
  • CD14-positive cells among human peripheral blood mononuclear cells are used.
  • the CD14-positive cells can be isolated by a known method, for example, by using MACS Microbead (Mitenyi Biotec).
  • the purity of CD14-positive cells used for the preparation of Langerhans cells is 90% or more, preferably 95% or more, and more preferably. 98% or more. Whether or not the cells used are monocytes can be determined by, for example, performing non-specific esterase staining.
  • CD14-positive cells thus obtained from human peripheral blood mononuclear cells are treated with Notch ligand, GM-CSF and TGF- / 3.
  • the treatment refers to bringing CD14-positive cells into contact with these compounds, and these compounds may be added and cultured at the time of culturing CD14-positive cells.
  • all of Notch ligand, GM-CSF and TGF- ⁇ may be added in a dissolved state to the culture medium for CD-positive cells, but the Notch ligand is added to the inner surface of the vessel used for culture as described later. It is desirable to be immobilized and brought into contact with cells.
  • Notch is a protein that is involved in signal transduction related to cell differentiation and possessed by cells. Notch is activated by binding of Notch ligand to Notch.
  • Notch ligands include Delta (De lta) and Jagged (Delta-K Delta-2, De11a-3 and ZSJ) 11a-4 and Jagged-1 and Jagged-2, respectively. There is a homologue called Mumm JS et al., Dev. Biol., 228, 151-165, 2000.
  • any of these Notch ligands can be used, and also include Notch ligands to be discovered in the future.
  • Delta-1 is particularly preferred.
  • Notch ligand or DNA encoding Notch ligand can be isolated from human cells expressing De Ua-1 such as keratinocytes by a gene amplification method. It can also be synthesized based on information (Gray GE et al., Am. J. Pathol., 154, 785-793, 1999).
  • GM-CSF and TGF- / 3 can be either naturally occurring recombinant ones or can be easily prepared from known gene sequence information, or commercially available ones.
  • a medium usually used for culturing animal cells may be used, and examples thereof include RPMI 1640, DMEM, and MEM. If necessary, add animal serum such as FCS, sugars, amino acids, antibiotics, etc. to the medium.
  • animal serum such as FCS
  • a serum-free medium or a human-derived serum or a plasma or a culture medium using its components instead of animal serum such as FCS is preferable.
  • the culture vessel a vessel usually used for cell culture may be used. 04 010783 A tissue, a flask, or the like may be used.
  • the culture vessel is made by bonding suitable functional groups such as polyamino acid and amino groups suitable for immobilization of proteins and the like.
  • suitable functional groups such as polyamino acid and amino groups suitable for immobilization of proteins and the like.
  • a container is used. Alternatively, it may be performed using a blood collection bag.
  • the culture format is not limited, and may be any of batch culture and continuous culture.
  • the density of CD14-positive cells obtained from human peripheral blood during culture is 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 1 7 AiL, preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 / mL.
  • the GM-CSF concentration is preferably 10-100 ng / mL
  • TGF-] 3 is preferably 1-100 ng / mL.
  • the Notchi ligand is preferably used by immobilizing it on the inner surface of a culture vessel or the like.
  • the solid phase may be immobilized not only on the inner surface of the culture vessel but also on particles such as polystyrene beads, and the immobilized particles may be added to the culture system during cell culture.
  • the notch ligand may be immobilized directly on the inner surface of the container or the like, but is preferably immobilized via a spacer or the like.
  • the spacer is not limited, but it is desirable to use a peptide consisting of several to several tens of amino acids. Examples of peptides used for the spacer include myc protein, V5 protein, and polyhistidine such as 6XHis. These spacers and Notch ligand are bound, but the binding method is not limited, and DNA encoding these peptides and DAN encoding the Notch ligand are fused in-frame to form appropriate host cells. It may be introduced and expressed as a recombinant fusion protein.
  • the DNA fusion method and the production of the recombinant protein can be carried out by known methods.
  • J. Sambrook, EF Friends & L Mani is (1989): Molecular Cloning, alboratory manual, second edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press and Ed Harlow and David Lane (1988): can be performed according to methods well-known to those skilled in the art, such as Antibodies, alboratory manual, and Cold Spring Harbor Laboratory Press. Good.
  • Notch ligands even if other peptides are bound instead of Notch ligand alone, cells are treated with Notch ligands as long as the Notch ligand transmits Notch signals to the cells when the cells are cultured. That.
  • the peptide bound to one molecule of Notch ligand is not limited to one molecule. As the number of peptide molecules increases, the density of Notch ligand immobilized increases, and the action of Notch ligand is enhanced. One to several tens, preferably one to fifteen, peptides are linked.
  • a specific antibody that binds to the spacer peptide is bound to the inner surface of the culture vessel in advance, and the notch ligand is indirectly bound to the inner surface of the culture vessel by binding the spacer peptide to the antibody. And so on.
  • the antibody may be bonded to the inner surface of the culture vessel or the like by physical adsorption, or may be chemically bonded using a specific functional group, and can be performed by a known method.
  • the higher the solid phase density the better.
  • a concentration of 1 ⁇ / 11 ⁇ to 20 ⁇ / 1 ⁇ is used in the culture vessel.
  • Anti-1 ⁇ (; antibody should be immobilized.
  • Culture of CD14-positive cells obtained from human peripheral blood in the presence of Notch ligand, GM-CSF and TGF- / 3 can be carried out for about 1 to 10 days, for example, 6 days, during which time a part of the culture medium may be used. Or replace all. At this time, by examining the expression of the surface antigen of the cultured cells by FACS or the like, the culture period in which Langerhans cells can be obtained can be appropriately determined.
  • Langerhans cells can be prepared by isolating CD14-positive cells from peripheral blood mononuclear cells obtained from human peripheral blood and culturing them in the presence of notch ligand, GM-CSF and TGF-j3.
  • the Notch ligand binds to the notch originally possessed by the cell, and transmits the Notch signal to the cell. That is, treating a cell with a Notch ligand means transmitting Notch signals to the notch of the cell using the Notch ligand.
  • E-force doherin, Langerin and CCR6 are expressed on the cell surface.
  • HLA-AB an MHC class I molecule
  • HLA-DR an MHC class I molecule
  • CD80 and CD86 which are MHC class I molecules
  • Whether or not these antigens are expressed must be determined by microscopic observation, etc., to determine whether cells have been stained using antibodies against these antigens and labeled with a chromogenic enzyme, fluorescent compound, etc. Can be.
  • the presence or absence of a surface antigen can be determined by immunostaining cells using these antibodies, and can also be determined using magnetic beads to which the antibodies are bound.
  • the presence of a surface antigen can be determined using FACS or a flow cytometer.
  • FACS and the flow cytometer for example, FACS Vant age (manufactured by Becton Dickinson), FAC S Cal ibur (manufactured by Becton's Dickinson) and the like can be used.
  • GM-CSF and TGF-jS predominantly immature Langerhans cells can be obtained, and further matured to obtain mature Langerhans cells.
  • IL-1 such as TNF-, LPS, IL-1 / 3, etc.
  • Prostaglandins such as IL-6, PGE2, INF- ⁇ , ⁇ ,, CD40 ligand and the like, or combinations thereof, but are not limited thereto.
  • Suitable concentrations as factors for maturing immature Langerhans cells include the range of 0.1 lng / mL to 100 g / niL.
  • the TNF-concentration is preferably 1 to 200 ng / mL
  • the CD40 ligand concentration is preferably 0.1 to 10_ig / mL
  • the LPS concentration is preferably 0.1 to 10 ng / mL.
  • the present invention also encompasses Langerhans cells obtained by culturing human peripheral blood mononuclear cells in the presence of Notch ligand, GM-CSF and TGF- ⁇ according to the method described above. Include.
  • the Langerhans cells and the like express the surface antigen as described above.
  • the present invention also includes a pharmaceutical composition containing the Langerhans cells obtained by the above method.
  • the Langerhans cells of the present invention can be used for cell therapy, and a pharmaceutical composition containing the Langerhans cells of the present invention can be used as a pharmaceutical composition for use in cell therapy.
  • the pharmaceutical composition is useful for the treatment of infectious diseases such as cancer and AIDS, the suppression of transplant rejection associated with cell, organ or tissue transplantation, the treatment of graft-versus-host disease, the treatment of autoimmune diseases or allergic diseases, Can be used for treatment.
  • infectious diseases such as cancer and AIDS
  • the suppression of transplant rejection associated with cell, organ or tissue transplantation the treatment of graft-versus-host disease
  • the treatment of autoimmune diseases or allergic diseases Can be used for treatment.
  • mature Langerhans cells are suitable for treatment of infectious diseases such as cancer and AIDS because they have an immunopotentiating effect
  • immature Langerhans cells have an immunosuppressive effect
  • It is suitable for suppressing transplant rejection associated with organ or tissue transplantation, treating graft-versus-host disease, and treating autoimmune diseases or allergic diseases.
  • the Langerhans cells of the present invention may be used for the treatment of rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, type I diabetes, uveitis, autoimmune myocarditis, myasthenia gravis, systemic lupus erythematosus.
  • autoimmune hemolytic anemia systemic sclerosis, ulcerative colitis, Crohn's disease, Siedalen syndrome, autoimmune liver disease (eg, primary biliary cirrhosis), psoriasis, idiopathic thrombocytopenic purpura Disease, Goodpasture syndrome (eg, glomerulonephritis), pernicious anemia, Hashimoto's disease, vitiligo vulgaris, Behcet's disease, autoimmune gastritis, pemphigus, self-like illness like Guillain-Barre syndrome, HTLV-1 associated myelopathy It can also be used for the treatment of immune diseases or allergic diseases such as contact hypersensitivity, allergic rhinitis, food allergies and asthma.
  • allergic diseases such as contact hypersensitivity, allergic rhinitis, food allergies and asthma.
  • the Langerhans cells of the present invention When used for the treatment of cancer or infectious diseases, the Langerhans cells of the present invention can be used as they are after maturation, or CTLs (cytotoxic T lymphocytes) obtained by co-culturing peripheral blood of patients can be used. .
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • an antigen appropriately selected depending on the target disease is applied to the Langerhans cells of the present invention, and the application is performed for a period of several days. It may be given in vitro.
  • the pharmaceutical composition containing the Langerhans cells of the present invention is used for treatment, 0.5 ⁇ 10 6 to 10 3 may be administered intravenously, subcutaneously, or intradermally.
  • administration to patients can be performed at any time. Especially for transplant rejection and graft-versus-host disease associated with organ / tissue transplantation, administration prior to the expected treatment is preferable.
  • the timing and dosage of Langerhans cells can be appropriately determined according to the type of disease, the severity of the disease, the condition of the patient, and the like.
  • the present invention provides a method for cancer, infectious disease, cell, organ or tissue transplantation, comprising culturing peripheral blood mononuclear cells collected from a human in the presence of Notch ligand, GM-CSF and TGF-J3. And a method for preparing Langerhans cells for treating an autoimmune disease or an allergic disease.
  • Various diseases can be treated as described above using the therapeutic Langerhans cells obtained by this method.
  • As the cell a cell of the patient or a cell other than the patient is appropriately selected and used depending on the purpose of treatment.
  • the present invention further provides the use of the above-mentioned Langerhans cells for suppressing infectious diseases such as cancer or AIDS, suppressing transplant rejection associated with cell, organ or tissue transplantation, treating graft-versus-host disease, treating autoimmune diseases or Provided is a method for treating an allergic disease or the like.
  • the present invention further provides Langerhans cells for treating infectious diseases such as cancer or AIDS, suppressing transplant rejection associated with cell, organ or tissue transplantation, treating graft-versus-host disease, treating autoimmune diseases or allergic diseases, etc.
  • infectious diseases such as cancer or AIDS
  • suppressing transplant rejection associated with cell, organ or tissue transplantation treating graft-versus-host disease
  • treating autoimmune diseases or allergic diseases etc.
  • Sal lusto F, Lanzavecchia A Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic eel Is is maintained by granulocyte / macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor.J Exp Med 179: 1109-1118, 1994.
  • Valladeau J Valladeau J, Ravel 0, Dezut ter-Dambuyant C, Moore K, Klei jmeer M, Liu Y, Duvert-Frances V, Vincent C, Schmi tt D, Davoust J, Caux C, LebecQue S, Saeland S: Langerin, a novel C-type lectin specific to Langerhans cells, is an endocytic receptor that induces the format ion of Birbeck granules.Immunity 12: 71-81, 2000.
  • the culture solutions and reagents used are as follows.
  • the culture solution used was RPMI ⁇ 640 (Nissui Pharmaceutical, Tokyo) containing 2 ⁇ L L-glutamine, 50 U / m ⁇ penicillin, and 50 ⁇ g / ml streptomycin.
  • Fetal calf serum (FCS) (Hyc lone, Logan, UT, USA) at 10%.
  • GM-CSF was provided by Kirin Peel (Tokyo) and IL-4 was provided by Ono Pharmaceutical (Osaka).
  • TGF- ⁇ and IL-15 were purchased from R & D Systems (Minneapolis, Thigh, USA).
  • GM-CSF was used at 10 ng / ml
  • IL-4 was used at 10 ng / mK
  • TGF- / 3 was used at 10 ng / mK
  • IL-15 was used at 10 ng / ml.
  • Delta-1 was immobilized as follows.
  • Delta-1 was immobilized on a culture plate by the method described previously (Ohishi K et al., Blood 98: 1402-1407, 2001; Oliishi K et al., Blood 95: 2847-2854, 2000; Oishi) K et al., J Clin Invest 110: 1165-1174, 2002).
  • Delta-1 construct was purified from the supernatant of the transfected NS0 cell line.
  • conditioned medium of NS0 cell line without genetic modification conditioned medium of NS0 cell line without genetic modification
  • the antibodies used and sources are as follows.
  • Monoclonal antibodies used FITC-anti-CDla antibody, PE-anti-HLA-ABC antibody (DAK0, Glostrup, Denmark); PE-anti-CD14 antibody, PE-anti-CD80 antibody, PE-anti-HLA-DR antibody (Becton Dickinson Immunocytometry, San Jose, CA, USA), PE-anti-Langerin (CD207) antibody, Anti-E-Cadherin antibody (ImmiHiotech, Marseille, France), PE-anti-CD86 antibody, (Becton Dickinson Pharm in gen, San Diego, CA, USA), FITC-anti-CCR6 antibody (R & D Systems) c HTC-picture se I G2a (Becton Dickinson), FITC-rat anti-mouse IgGl, PE reference se IgGl (Becton Dickinson Pharmingen), mouse IgG2b (Coulter Miami, FL, USA).
  • the cells used in the present example were separated as follows.
  • peripheral blood was collected from healthy Japanese with heparin.
  • Peripheral blood mononuclear cells PBMCs
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • CD14-positive cells were separated from PBMCs using MACS Microbeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA) (Mitani H et al., Br J Haematol 109: 288-295, 2000; Araki H et al., Br J Haematol 114: 681- 689, 2001).
  • the purity of CD14-positive cells obtained by this method is more than 95%.
  • non-specific esterase staining Moto Chemical, Tokyo
  • CD14-positive cells were non-specific esterase positive.
  • the obtained CD14-positive cells were cultured by the following method.
  • CD14-positive cells were cultured at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / ml on a 24-well tissue culture plate using RPMI 1640 supplemented with 10% FCS. Culture medium was changed every 3-4 days. After culturing under these conditions for 6 days, morphological observation was performed using a phase contrast microscope, and the number of viable cells was calculated by the trypan blue dye exclusion method.
  • E-cadherin and Langerin For double staining of E-cadherin and Langerin, first react with anti-E-cadherin antibody, wash, add FITC-rat anti-mouse IgGl antibody, block with a sufficient amount of mouse IgGl, and Stained with Langerin antibody.
  • GM-CSF + IL-4 + TGF- ⁇ (Ge issmann F et al .; ⁇ Exp Med 187: 961-966, 1998), which has been reported to support monocyte-to-LC differentiation in culture plates GM-CSF + IL-15 (Mohamadzadeii M et al., J Exp Med 194: 1013-1020, 2001), or GM-CSF + TGF- / 3 (Guironnet G et al., J Leukoc Biol 71: 845-853, 2002) The cells were cultured for 6 days in the presence of E.
  • CD14-positive cells were cultured in a 24-well plate at a concentration of 5 ⁇ 10 5 solid Ail in the presence or absence of Delta-1 with the addition of GM-CSF + IL-4 + TGF-jS. After 6 days of culture, the cells were collected and stained with a monoclonal antibody against the antigen molecule shown in the figure.
  • FIG. 1 shows the results of analysis of the traits of cells induced from CD14-positive cells by GM-CSF + IL-4 + TGF-j8 in the presence or absence of Delta-1.
  • FIG. 1 Cells induced by GM-CSF + IL-4 + TGF-0 were morphologically DC-like, CDla-positive, CD14-negative, and expressed E-forcedherin, but did not express Langerin . Addition of Delta-1 did not change morphologically, but slightly increased E-cadherin expression (Fig. 1).
  • FIG. 1 the outline shows the results of analysis using the control antibody, and the solid part shows the results of analysis using the monoclonal antibody used. Results are from a representative one of several experiments.
  • CD14-positive cells were cultured in a 24-well plate at a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells / ml with the addition of Delta-1 + GM-CSF + TGF- / 3. After 6 days of culture, cells were collected and stained with anti-CDla antibody and anti-Langerin antibody or anti-E-cadherin antibody, anti-Langerin antibody and anti-E-forcedherin antibody or anti-CCR6 antibody, and the analysis results were shown as dot plots.
  • X 10 5 cells / ml at a concentration Delta- 1 + GM-CSF + TGF- / 3 was added to the culture.
  • the cells were collected, stained with an anti-Langerin antibody and a monoclonal antibody against the antigen molecule shown in the figure, and the expression of each antigen molecule in the Langerin-positive cells was analyzed.
  • Fig. 5 shows the results.
  • the outline shows the analysis results with the control antibody, and the solid coating shows the analysis results with the monoclonal antibody used. Results are from a representative one of several experiments.
  • the cells of the Langerin-positive fraction are class I and class II molecules of HLA-AB (; HLA-DR and co-stimulatory molecules) molecules) CD80 and CD86.
  • DCs are present in the epidermis and dermis in the skin, and are called LC and dermal DC, respectively (Steinman Thigh et al., Annu Rev Immunol 9: 271-296, 1991; Banchereau J et al., Annu Rev I awake imol 18) : 767-811, 2000).
  • DC has long been understood to be a monocyte / macrophage cell, but in the mouse bone marrow cell culture system, DCs form within colonies consisting of granulocytes and macrophages formed in the presence of GM-CSF. The presence of DC confirmed that DC was a cell belonging to the monocyte / macrophage system (Inaba K et al., Exp Med 176: 1693-1702, 1992).
  • in vitro culture systems enabled the induction of LC from CD34-positive cells such as human umbilical cord blood or peripheral blood, and the induction of dermal DC from peripheral blood CD14-positive cells.
  • CD34-positive cells such as human umbilical cord blood or peripheral blood
  • dermal DC from peripheral blood CD14-positive cells.
  • the cellular biology of the system DC has advanced dramatically and its understanding has been deepened (Caux C et al., Nature 360: 258-261, 1992; Caux C et al., J Exp Med 184: 695-706, 1996; Strunk D et al., Blood 87: 1292-1302, 1996; Geissmann F et al .; Exp Med 187: 961-966, 1998; Mohamadzade M et al., J Exp Med 194: 1013-1020, 2001; Guironnet G et al., J Leukoc Biol 71: 845-853, 2002) Based on the observation of the culture system over time, LC
  • LC is present in the epidermis together with keratinocytes, and keratinocytes express Delta-1, which affects the differentiation of CD14-positive monocytes and dermal DC (OhisM K et al., Blood 98 : 1402-1407, 2001; Ohishi K. et al., Blood 95: 2847-2854, 2000; Lowell S et al., Curr Biol 10: 491-500, 2000), from the previously reported CD14 positive monocytes. The effect of Del-l on the culture system for inducing LC was examined.
  • E-cadherin When CD14-positive monocytes are cultured in the presence of GM-CSF + IL-4 + TGF-jS or GM-CSF + IL-4 + TGF- / 3 + Delta-1, E-cadherin is obtained. Was expressed, but no expression of Langerin was observed. Langerin, a C-type lectin (1 ec t in), is a molecule closely related to birbeck granules and has high specificity for LC (Valladeau J et al., Imnumity 12: 71-81, 2000), it is difficult to say that cells in which this molecule is not expressed sufficiently retain the properties of LC.
  • Keratinocytes not only express Delta-1 (Lowell S et al., Curr Biol 10: 491-500, 2000), but also secrete GM-CSF and TGF-; 3 (Luger TA et al., J Dermatol Sci. 13: 5-10, 1996).
  • the culture system in which we induced LC from CD14-positive monocytes in vitro seems to be similar to the skin environment in vivo, and even in vivo, peripheral blood CD14-positive monocytes enter the epidermis through the dermis. It can be assumed that keratinocytes secrete or express GM-CSF, TGF-i8, and Delta-1 and differentiate into LC.
  • Example 2 The reagents and antibodies used in Example 2 were as follows.
  • CD40 ligand was purchased from Bender MedSystems (Vienna, Austria). TNF-a was provided by Dainippon Pharmaceuticals (Suita), and IL-2 was provided by Takeda Pharmaceutical (Osaka). The CD40 ligand was used at 1 g / ml, TNF- ⁇ at 20 ng / mK IL-2 at 20 IU / ml.
  • the monoclonal antibodies used were PE-anti-CD40 antibody, PE-anti-CD83 antibody (Immimotech, Marseille, France) PE-anti-CD54 antibody (Beeton Dickinson Imm leak cytometry, San Jose, CA, USA).
  • Real-tiie RT-PCR Real-time reversed transcriptase-polymerase chain reaction
  • GAPDH endogenous gene
  • forward primer 5 'GAA GGT GAA GGT CGG AGT 3'
  • GAPDH reverse primer 5, GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC 3, (SEQ ID NO: 5);
  • GAPDH probe 5, (FAM)-TTG CCA TCA ATG ACC CCT TCA TTG AC- (TAMRA) 3 '(SEQ ID NO: 6).
  • Amplification was performed using ABI Prism 7, 700 Seauence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
  • CD14-positive cells were cultured in the presence of Delta-1, GM-CSF, and TGF- ⁇ for 6 days, fixed with 2.5% daltaraldehyde, dehydrated with ethanol, and embedded in ebon. After staining the sections with lead citrate and peranil acetate, the cells were observed with a JEM-1200EX electron microscope (JE0L, Tokyo).
  • the phagocytic ability of the induced LC was measured by the following method. Delta- 1, GM- CSF, TGF- 3 in the presence of 4 days, further floating CD40 ligand and TNF- flight to a 2 X 10 5 cells of the LC obtained by culturing for 2 days in addition to 10 FCS RPMI 1640 And 1 mg / ml ⁇ -dextran (min (Sigma, St. Louis, MO, USA) for 1 hour on ice or at 37 ° C. The FITC-dextran uptake reaction was interrupted with cold 1% FCS PBS, after which the cells were washed four times with 1 FCS PBS. FITC-dextran incorporation was measured on a FACS Calibur.
  • the ELISPOT (enzymed-linked immunosorbent spot) method was performed with a slight modification of the previously reported method (Ikuta Y et al., Blood 99: 3717-3724, 2002).
  • Mature LC was prepared by culturing CD14-positive cells in the presence of Delta-1, GM-CSF, and TGF-jS for 6 days, and adding CD40 ligand and TNF- ⁇ for the latter two days.
  • the plate After washing the plate with PBS, the plate was treated with 10% AB type serum for 2 hours at 37 ° C to block nonspecific reactions. It modified 10 5 CD8-positive cells obtained healthy persons or these HLA-A0201-positive Mel an - A 26 _ 35 peptide (A27L) (ELAGIGILTV SEQ ID NO: 7) and pulse, is irradiated with (46 Gy) 4 ⁇ 10 4 mature LCs were cultured in RPMI 1640 with 10% AB serum in 24-well plates. On day 4 and day 7 of culture, IL-2 (20 ⁇ l / ml) was added. These CD8-positive cells were collected on day 10 of culture and used as effector cells.
  • Modified Melan_A 26 - 35 peptide nothing or were pulse the (A27L) not pulsed T2 cells as the target cell.
  • 1 ⁇ 10 4 effector cells and 5 ⁇ 10 4 target cells were co-cultured on ELISPOT plates. After 18 hours, the plate is washed with PBS containing 0.05% Tween, and then reacted with 1 g / ml of a biotinylated anti-interferon- ⁇ antibody (7-B6-1; MaMech) for 2.5 hours at 37 ° C and washed. Thereafter, the mixture was further reacted with 1 g / inl of streptavidin alkaline phosphatase (MaMech) for 1.5 hours.
  • MoMech streptavidin alkaline phosphatase
  • CD4-positive cells were stained with an alkaline phosphatase-linked substrate kit (BioRad, Hercules, CA, USA) and the number of spots was counted under a microscope.
  • Stimulation of CD4-positive cells by mature LC was performed by the following method. 1 10 5 mature LC and 2 X 10 5 autologous CD4-positive cells were stained with anti-CD3 antibody; culture (UCHT1, 0.5 mg / ml BD P arMingen, SanDiego, CA, USA) in 24 ⁇ El plates in the presence of Then, on the fourth day of the culture, IL-2 (20 l / ml) was added, and on the seventh day of the culture, the number of CD4-positive cells was calculated. Instead of mature LC, The same was performed using mature DCs induced from GM-CSF, IL-4 and CD40 ligand, TNF- ⁇ ; from CD14-positive monocytes.
  • the HES-1 gene is known as a target gene for a notch signal (Schroeter EH et al., Nature 393: 382-386, 1998; Struhl G et al., Cell 93: 649-660, 1998). Therefore, in order to confirm whether Delta-1 transmits a Notch signal to LC, the effect of Delta-1 on HES-1 gene expression was examined (FIG. 6). When Delta-1 was present in the culture system, HES-1 expression was increased about 8-fold compared to when Delta-1 was not present. It was confirmed that De11a-1 acts on CD14 positive cells. FIG. 6 shows the enhancement of HES-1 gene expression by Delta-1 in CD14-positive cells. The expression of the HES-1 gene in the presence and absence of Delta-1 was examined. The results were expressed as a ratio of the expression of the HES-1 gene to the expression of the GAPDH gene. A representative example of two experiments is shown.
  • the cells had many elongated cell processes, and also contained Birbeck granules in the cytoplasm (Fig. 7).
  • Figure 7 shows an electron microscope image of the cultured cells.
  • the original magnification of the left panel is 8,000x and the bar is 2111, and the original magnification of the right panel is 30,000x and the bar is 0.5. m.
  • LC phagocytic activity of LC prepared from Delta-1, GM-CSF, and TGF-] 8 from CD14-positive cells was examined by FITC-dextran uptake (FIG. 8). LC has incorporated FITC-dextran. The IX produced was found to be phagocytic.
  • FIG. 8 shows the results of an examination of the uptake of FITC-dextran by LC.
  • LCs derived from CD14-positive cells generated by Delta-1, GM-CSF and TGF-j8 were reacted with FITC-dextran at 37 ° C or on ice for 1 hour. After washing three times, analysis was performed using a FACS Calibur. Similar The results were obtained in three experiments.
  • FIG. 9 shows the expression of HLA-ABC, HLA-DR, CD80, CD86, C, CD54, and CD83 in LC matured with CD40 ligand and TNF- ⁇ .
  • CD14-positive cells were cultured with Delta-1, GM-CSF, and TGF-i3.
  • CD4 ligand and TNF- ⁇ were additionally added on the fourth day of the culture, and the cells were collected on the sixth day.
  • mature LCs generated from CD14-positive cells activate peptide-specific CD8-positive cells.
  • Mature LCs were prepared from CD14-positive cells derived from HLA-A0201-positive healthy persons using Delta-1, GM-CSF, TGF-j8, CD40 ligand, and TNF- ⁇ . 2 ⁇ 10 5 autologous CD8 + T cells were transformed into 4 ⁇ 10 4 modified Melan-A 26 — 35 peptides (A27L) Saturated mature LCs were stimulated for 10 days.
  • CD8-positive cells were harvested and co-cultured 1 X number of CD8 positive cells and the modified Melan-A 26 _ 35 peptide (A27L) (ELAGIGILTV) 5 x 10 4 cells of the T2 cells pulsed with the ELISPOT plate. Eighteen hours later, the number of autologous CD8-positive T cells that produce inferon ferrona was calculated. Each bar represents the average of two measurements. Two experimental examples are shown.
  • FIG. 11 shows the results of stimulation of autologous CD4-positive cells by mature LC and mature DC.
  • mature IX using Delta-1, GM-CSF, TGF- ⁇ , CD40 ligand, TNF-H, and GM-CSF, IL-4, CD40 ligand, TNF- ⁇
  • IL-2 was added on day 4 of culture.
  • IL-2 was added on day 7 of culture.
  • the number of CD4-positive T cells was calculated. Each bar represents the average of four measurements. A representative example of the two experiments is shown.
  • IL-4 and CD40 ligand, and higher than mature dendritic cells (DC) induced by TNF-H.
  • DC dendritic cells
  • Langerhans cells By culturing human peripheral blood mononuclear cells in the presence of Notch ligand, GM-CSF and TGF-) 3, Langerhans cells, which had not been achieved conventionally, can be prepared.
  • the Langerhans cells can be obtained in the form of immature cells or mature cells.
  • vaccine cell therapy ⁇ , infectious diseases, suppression of graft rejection associated with cell, organ or tissue transplantation, treatment of graft-versus-host disease It can be used for the treatment of autoimmune diseases or allergic diseases.
  • the Langerhans cells obtained by the method of the present invention can be used for cytobiological studies on Langerhans cells.
  • Langerhans cells prepared by the method of the present invention can be used for vaccine cell therapy, that is, suppression of transplant rejection associated with cancer, infectious disease, cell, organ, or tissue transplantation, and prevention of graft-versus-host disease. It can be used for treatment, self-immune disease or allergic disease. All publications cited herein are incorporated by reference in their entirety. It will be readily apparent to those skilled in the art that various modifications and alterations of the present invention are possible without departing from the technical concept and the scope of the invention described in the appended claims. The present invention is intended to cover such modifications and variations.

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Abstract

本発明は、ヒト末梢血単核球であるCD14陽性細胞からランゲルハンス細胞を調製するための方法を提供を目的とする、ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、GM-CSFおよびTGF-βの存在下で培養することを含む、ランゲルハンス細胞の調製方法である。

Description

明細書 ノッチリガンド Delta_l、 GM-CSF, TGF -^を用いたヒト末梢血単核球である CD14 陽性細胞からのランゲルハンス細胞の調製方法 技術分野
本発明は、 樹状細胞（dendritic cells; DC)の一亜型である表皮ランゲル八ン ス細胞（Langeriians cells; LC)の培養に関し、 ヒト末梢血単核球である 陽性 細胞からノッチリガンド （Notch ligand) Delta-K GM-CSF, TGF-3を用いてラ ンゲルハンス細胞を調製する方法に関する。 該細胞は、 癌、 感染症、 移植片拒絶、 移植片対宿主病、 自己免疫疾患あるいはアレルギー性疾患などの治療剤に利用す ることができる。 背景技術
樹状細胞（dendritic cells; DC)は、 T細胞を介する初期免疫応答を惹起する最 も強力な抗原提示細胞である（Steinman RMら、 Aimu Rev Immunol 9: 271-296, 1991; Caux Cら， Immunol Today 16: 2-5, 1995; Hart DNJ、 Blood 90: 3245- 3287, 1997; Cella MFら、 Curr Op in Immunol 9: 10-16, 1997; Banchereau J ら、 Nature 392: 245-252, 1998; Banchereau Jら、 Annu Rev Immunol 18: 767-811, 2000) 皮膚の表皮に存在する DCの一亜型である表皮ランゲルハンス細 胞（Langeriians cells; LC)は、 細胞表面にランゲリン （Langerin) 、 E-カドヘリ ン （E- Cadherin) 、 CCR6を発現し、 細胞内には Birbeck顆粒を保持するなどの特 徵を持つ（Schuler G (ed. )、 Epidermal Langeriians Cells. CRC Press, Boca Raton, FL, 1991; Valladeau Jら、 I腿 unity 12: 71-81, 2000; Tang Aら、 Nature 361: 82-85, 1993; Greaves DRら、 J Exp Med 186: 837-844, 1997)。 LC は皮膚に侵入した様々な異物に対する適切な免疫反応を引き起こす。 具体的には、 LCは皮膚に侵襲した病原体や腫瘍細胞などの異物を取り込んだ後、 所属リンパ節 に移動し、 そこでプロセッシングした抗原を naive T細胞あるいはメモリー T細胞 に提示し、 それらを初期活性化あるいは再活性化し、 異物に由来する抗原に対す る特異的免疫応答を効果的に誘導する。 活性化された T細胞が異物の侵襲した組 織に浸潤し、 それらの除去を進行させ、 過度の組織傷害から組織を防御している。 ヒトの LCは、 再生不良性貧血に対する同種骨髄移植における観察において、 移 植を受けた患者さんの皮膚の LCが骨髄の提供者（ドナー）と同じ組織適合抗原を表 現していたことから、 骨髄細胞由来であると考えられていた（Volc-Platzer Bら、 N Engl J Med 310: 1123-1124, 1984)。 これまでの in vi troの実験においては、 臍帯血あるいは末梢血の CD34陽性造血前駆細胞を granu 1 ocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) + tumor necrosis fact or- a (TNF-ο;) 在下に培養すると、 培養細胞の一部は LCに分化していることが報告されており (Caux Cら、 ature 360: 258-261, 1992; Caux Cら、 J Exp Med 184: 695-706, 1996; Strunk Dら、 Blood 87: 1292-1302, 1996)、 LCは造血幹細胞由来であるこ とが示されていた。 しかしながら、 造血幹細胞から LCまでの分化経路およびそれ らの制御機構については未だ十分に明らかにされていない。 また、 ヒト末梢血単 球を GM-CSF + interleukin4(IL-4) + transforming growth factor- j3 (TGF- /3〉、 GM-CSF + IL- 15、 GM-CSF + TGF-/3などの造血因子の組み合わせで培養すると、 一部の細胞は LCに分化すると報告されているが（Geissmann Fら、 J Exp Med 187: 961-966, 1998; Mohamadzadeh Mら 、 I Exp Med 194: 1013-1020, 2001; Guironnet Gら、 〗 Leukoc Biol 71: 845-853, 2002)、 これらの造血因子の存在 下における LCへの分化は十分なものとは言い難い。 一方、 皮膚の真皮などには、 LCとは異なる骨髄系 DCである真皮 DC (dermal DC)が存在しており、 これらの dermal DCはヒト末梢血単球から GM-CSF + IL - 4によって分化誘導される（Romani Nら、 J Exp Med 180: 83-93, 1994; Sallusto Fら、 J Exp Med 179: 1109-1118, 1994) 造血系を含め様々な組織の発生や分化に重要な役割をしていることが明 らかにされてきている Notch ligandの一つである Delta-1が（Ohishi Kら、 Int J Hematol 75: 449-459, 2002; Ohishi Kら、 Semin Cell Dev Biol 14: 143-150, 2003)、 ヒト末梢血単球あるいは骨髄由来の CD34陽性細胞からの dermal型 DCの分 化に関わっていることも報告されている（Ohishi Kら、 Blood 98:1402-1407, 4010783
2001)。 このように、 造血幹細胞から DCへの分化は、 多種類のサイ ト力インや他 の因子からなるネットヮ一クにより制御されていると推察される。 発明の開示
ヒ卜末梢血単核球である CD14陽性細胞からランゲルハンス細胞を調製するた-め の方法を提供する。
本発明者等は、 抗原提示能を有する樹状細胞の一亜型であるランゲルハンスを 細胞生物学的研究や DCを用いたワクチン細胞療法の開発に利用すべく、 該細胞の 培養分化方法について鋭意検討を行った。 従来より、 ランゲルハンス細胞を培養 により得る試みは為されていたが、 細胞の発現抗原から考え、 ランゲルハンス細 胞と言える細胞は得られていなかった。
本発明者等は、 ノッチリガンド （Notch ligand) Delta- 1、 GM-CSF、 TGF- j3を 用いた動物細胞培養培地にてヒト末梢血単核球である CD14陽性細胞を培養するこ とにより、 ランゲルハンス細胞が得られることを見出し、 本発明のランゲルハン ス細胞の調製方法を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
[1] ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、 GM- CSFおよび TGF-/3の存在下で培養 することを含む、 ランゲルハンス細胞の調製方法、
[2] ヒト末梢血単核球のノツチにノッチリガンドを用いてノツチシグナルを伝 達させ、 かつ該単核球を GM- CSFおよび TGF- の存在下で培養することを含む、 ラ ンゲルハンス細胞の調製方法、
[3] ノッチリガンドを培養用容器に固相化しておくことを特徴とする、 [1]ま たは [2]のランゲルハンス細胞の調製方法、
[4] ノッチリガンドが他のペプチドとの融合ペプチドを構成し、 培養用容器に 該他のぺプチドに対する抗体を固相化し、 ノッチリガンドが該抗体と前記他のぺ プチドの結合を介して培養用容器に固相されている、 [3]のランゲルハンス細胞 の調製方法、
[5] 他のペプチドが mycである [4]のランゲルハンス細胞の調製方法、 10783
[6] ノッチリガンドが、 Delta- 1、 Delta- 2、 Delta- 3、 Delta - 4、 Jagged— 1およ び Jagged - 2からなる群から選択される [1]から [ 5 ]のいずれかのランゲルハンス 細胞の調製方法、
[7] ノッチリガンドが Delta- 1である [ 6 ]のランゲルハンス細胞の調製方法、 [8] ヒト末梢血単核球が単離された CD14陽性細胞である、 [1]または [2]のラ ンゲルハンス細胞の調製方法、
[9] ランゲルハンス細胞表面に、 E-カドヘリン、 ランゲリンおよび CCR6が発現 されていることを特徴とする [1]から〖8]のいずれかのランゲルハンス細胞の調 製方法、
[1 0] さらに、 ランゲルハンス細胞表面に、 MHCクラス I分子である HLA- AB 腿 Cクラス II分子である HLA-DR、 CD80および CD86が発現されていることを特徴と する [9]のランゲルハンス細胞の調製方法、
[1 1] [1]から [1 0]のいずれかの調製方法で調製したランゲルハンス細胞 に CD40リガンド、 TNF-α及び LPSからなる群から選択される一種以上を添加して、 さらに培養することを含む、 ランゲルハンス細胞の調製方法、
[1 2] ランゲルハンス細胞が未成熟なものである、 [1]から [10]のいずれか のランゲルハンス細胞の調製方法、
[1 3] ランゲルハンス細胞が成熟なものである、 [1]から [1 1]のいずれかの ランゲルハンス細胞の調製方法、
[14] [1]から [1 3]のいずれかの方法で調製されたランゲルハンス細胞、 [1 5] E-カドヘリン、 ランゲリンおよび CCR6が細胞表面に発現されている [1 4]のランゲルハンス細胞、
[1 6] さらに、 MHCクラス I分子である HLA- ABC、 MHCクラス II分子である HLA-DR、 CD80および CD86が細胞表面に発現されている [1 5]のランゲルハンス細胞、
[1 7] ヒト末梢血単核球由来である、 E-カドヘリン、 ランゲリン、 CCR6、 丽 C クラス I分子である HLA- ABC、 丽 Cクラス II分子である HLA-DR、 CD80および CD86が 表面に発現されているランゲルハンス細胞、
[1 8] 未成熟細胞である、 [1 5]から [1 7]のいずれかのランゲルハンス細胞、 [1 9] 成熟細胞である、 [1 5]から [1 7]のいずれかのランゲルハンス細胞、 [2 0] [14]から [1 9]のいずれかのランゲルハンス細胞を含む医薬組成物、 [2 1] 癌または感染症治療薬である [2 0]の医薬組成物、
[2 2] ランゲルハンス細胞が成熟細胞である、 [2 1]の医薬組成物、
[2 3] 細胞、 臓器または組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主 病の治療、 自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療に用いられる、 [2 0]の 医薬組成物、
[24] ランゲルハンス細胞が未成熟細胞である、 [2 3]の医薬組成物、
[2 5] ヒトから採取した末梢血単核球を、 ノッチリガンド、 GM - CSFおよび TGF - βの存在下で培養することを含む、 癌または感染症治療用ランゲルハンス細胞の 調製方法、
[26] ヒトから採取した末梢血単核球を、 ノッチリガンド、 GM- CSFおよび TGF - j3の存在下で培養することを含む、 癌、 感染症、 細胞、 臓器もしくは組織移植に 伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主病の治療、 自己免疫疾患またはアレル ギー性疾患の治療用ランゲルハンス細胞の調製方法、
[27] ノッチリガンドが、 Delta - 1、 Delta - 2、 Delta- 3、 Delta- 4、 Jagged - 1お よび Jagged - 2からなる群から選択される [2 5]または [2 6]に記載の治療用ラン ゲルハンス細胞の調製方法、 ならびに
[2 8] ノッチリガンドが Delta - 1である [2 7 ]の治療用ランゲルハンス細胞の 調製方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 277892号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 Delta- 1存在下あるいは非存在下での GM- CSF + IL-4 + TGF- j3により CD14陽性細胞から誘導された細胞の形質の解析の結果を示す図である。
図 2は、 Delta- 1存在下あるいは非存在下での GM- CSF + IL- 15により CD14陽性 細胞から誘導された細胞の形質の解析の結果を示す図である。 3 図 3は、 Del ta- 1存在下あるいは非存在下での GM- CSF + TGF- j3により CD14陽性 細胞から誘導された細胞の形質の解析の結果を示す図である。
図 4は、 Del ta-1 + GM-CSF + 161?- で誘導された 様細胞中の 01&陽性細胞 における E-力ドヘリンとランゲリンの発現およびランゲリン陽性細胞における E- 力ドヘリンと CCR6の発現の解析の結果を示す図である。
図 5は、 Del ta- 1 + GM-CSF + TGF- /3で誘導された細胞の抗原提示機能関連分 子の発現の解析の結果を示す図である。
図 6は、 CD14陽性細胞における Del ta- 1による HES-1遺伝子の発現亢進を示す図 である。
図 7は、 培養細胞の電子顕微鏡像を示す写真である。
図 8は、 LCの FITC-デキストランの取り込みの検討の結果を示す図である。
図 9は、 CD40リガンドと TNF- «により成熟した LCの HLA- ABC、 HLA- DR、 CD80、 CD86、 CD40、 CD54、 CD83の発現を示す図である。
図 1 0は、 CD14陽性細胞から生成された成熟 LCのペプチド特異的 CD8陽性細胞 の活性化を示す図である。
図 1 1は、 成熟： LCと成熟 DCによる自己 CD4陽性細胞の刺激の結果を示す図であ る。 ' 発明を実施するための最良の形態
1 . ランゲルハンス細胞の調製
本発明は、 ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、 GM - CSFおよび TGF - /3の存在下 で培養することを含む、 ランゲルハンス細胞の調製方法である。
ヒ卜末梢血単核球は、 ヒ卜から採取した血液から公知の方法で得ることができ る。 例えば、 ヒトから末梢血を採取し、 FicoU-HypaQue等を用いた比重遠心法で 得ることができる。 本発明においてはヒト末梢血単核球のうちの CD14陽性細胞を 用いる。 該 CD14陽性細胞は、 公知の方法で単離することができ、 例えば MACS Microbead (Mi tenyi Biotec社）を用いればよい。 ランゲルハンス細胞の調製に用 いる CD14陽性細胞の純度は、 90%以上、 好ましくは 95 %以上、 さらに好ましくは. 98 %以上である。 用いる細胞が単球であるかどうかは、 例えば非特異的エステラ ーゼ染色を行うことにより判断することができる。
本発明の方法においては、 このようにしてヒト末梢血単核球より得られた CD14 陽性細胞をノッチリガンド、 GM-CSFおよび TGF- /3で処理する。 処理とは CD14陽生 細胞をこれらの化合物と接触させることをいい、 CD14陽性細胞の培養時にこれら の化合物を添加して培養を行えばよい。 この際、 ノッチリガンド、 GM - CSFおよび TGF- βのいずれも CD 陽性細胞の培養用培地に溶解状態で添加させればよいが、 ノッチリガンドは後述のように培養に用いる容器の内表面等に固相化させて細胞 と接触させるのが望ましい。
ノツチ（Notch)は細胞が有する細胞の分化に関連するシグナル伝達に関与する たんぱく質であり、 ノツチリガンドがノツチに結合することでノツチが活性化さ れる。 ノッチリガンドにはデルタ（De l t a)とジャグド（Jagged)があり、 それぞれ De l ta-K De l t a - 2、 De 11 a - 3およ ZSJ) 11 a- 4ならびに Jagged - 1および J agged- 2と呼 ばれるホモローグが存在する （Mumm JS ら.， Dev. Biol. , 228, 151-165, 2000) 。 本発明においてはこれらのいずれのノッチリガンドも用いることができ、 また今後発見されるノッチリガンドも含まれる。 この中でも特に De l t a- 1が好ま しい。 ノッチリガンドまたはノッチリガンドをコードする DNAは、 De Ua - 1を発現 しているヒト由来の細胞、 例えばケラチノサイト（kerat inocyte)より遺伝子増幅 法により単離可能であり、 また、 既に報告されている配列情報 （Gray GEら、 Am. J. Pathol.， 154, 785-793, 1999) を基に合成することもできる。
GM-CSFおよび TGF- /3は天然のものリコンビナントのものいずれを用いてもよレ^ 公知の遺伝子配列情報から容易に作製することもできるし、 市販品を用いてもよ い。
培養用培地は通常動物細胞の培養に用いられる培地を用いればよく、 例えば RPMI 1640, DMEM、 MEM等がある。 培地には必要に応じて、 FCS等の動物血清、 糖、 アミノ酸、 抗生物質等を添加する。 無血清培地あるいはヒト由来血清、 血漿ある いはその成分を FCS等の動物血清の代わりに用いた培養液が望ましい。 培養用容 器も通常細胞培養に用いる容器を用いればよく、 培養規模に応じてプレート、 デ 04 010783 イツシュ、 フラスコ等を用いればよい。 なお、 後述のようにノッチリガンドを培 養容器内面に固相化して用いる場合は、 培養容器はタンパク質等の固相化に適し たポリスチレン製容器ゃァミノ基等の適当な官能基を結合させた容器を用いるの が好ましい。 また、 採血用バッグを用いて行ってもよい。
培養形式は、 限定されず回分培養、 連続培養いずれの形式で行ってもよい。 培養時のヒト末梢血から得られた CD14陽性細胞の密度は、 1 X 104〜 1 Χ 1θ7個 AiL、 好ましくは 1 X 105〜： 1 個/ mLである。
ヒト末梢血から得られた CD14陽性細胞を培養する際の、 GM - CSF濃度は、 10〜 100ng/mLが好ましく、 TGF- ]3は 1〜 100ng/mLが好ましい。
ノツチリガンドは、 前述のように培養容器の内表面等に固相化して用いるのが 好ましい。 また、 培養容器内表面だけではなく、 ポリスチレンビーズ等の粒子上 に固相化し、 細胞培養時に培養系に該固相化粒子を添加してもよい。
ノッチリガンドの固相化は直接ノツチリガンドを容器内面等に固相化してもよ いが、 スぺーサ一等を介して固相化するのが望ましい。 スぺーサ一は限定されな いが、 アミノ酸数個から十数個からなるペプチドを用いるのが望ましい。 スぺー サ一に用いるペプチドとして、 mycタンパク質、 V5タンパク質、 6 X Hi s等のポリ ヒスチジン等を用いることができる。 これらのスぺーサ一とノッチリガンドを結 合させるが、 結合方法は限定されず、 これらのペプチドをコードする DNAとノッ チリガンドをコ一ドする DANをインフレームで融合させ、 適当な宿主細胞に導入 し、 リコンビナント融合タンパク質として発現させればよい。 DNAの融合方法、 遺伝子組み換えタンパク質の産生は公知の方法で行うことができ、 例えば、 J. Sambrook, E. F. Fri tsc & L Man iat i s (1989)： Molecul ar Cloning, a l aboratory manual, second ed i t ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press及 び Ed Harlow and David Lane (1988)： Ant ibod ies, a l aboratory manual, Cold Spr ing Harbor Laboratory Press等の当業者に良く知られた文献に記載された方 法に従って行えばよい。 本発明において、 ノッチリガンド単体ではなく他のぺプ チドが結合している場合であっても、 細胞を培養した際にノッチリガンドが細胞 にノッチシグナルを伝達する限り、 ノッチリガンドで細胞を処理するという。 ま た、 1分子のノッチリガンドに結合させるペプチドは 1分子に限らない。 ぺプチ ド分子の数が多くなると、 ノッチリガンドの固相化密度が高くなり、 ノッチリガ ンドの作用が増強される。 ペプチドは 1個から数十個、 好ましくは 1個から 1 5 個を連結させたものを用いる。
あらかじめこれらのスぺーサ一用ペプチドに結合する特異的抗体を培養用容器 内表面等に結合させ、 スぺーサ一ペプチドと抗体を結合させることにより、 間接 的にノッチリガンドを培養用容器内表面等に結合させればよい。 抗体と培養用容 器内表面等とは、 物理的吸着によって結合させてもよいし、 特定の官能基を利用 した化学的結合によってもよく、 公知の方法で行うことができる。 ノッチリガン ドの容器内表面等への結合密度に限定はなく、 用いるプレー卜やバッグ等によつ て結合性が異なり、 適宜決定することができる。 ノッチリガンドの固相化密度が 大きくなればなるほど、 ノツチリガンドの細胞に対する作用が大きくなるので、 固相化密度は大きいほうが望ましい。 例えば、 培養にポリスチレン製のプレー卜 を用い、 ノ チリガンド De l ta - 1を 6分子の mycタンパク質と融合させて用いる 場合、 培養用容器に1 ^ /11^〜20 ^ /1^の濃度の抗1^(；抗体を入れ固相化すればょ い。
ヒト末梢血から得た CD14陽性細胞のノッチリガンド、 GM- CSFおよび TGF - /3の存 在下での培養は、 1日から 10日間程度、 例えば 6日間行えばよく、 その間適宜培 地の一部または全部を交換する。 この際、 培養細胞の表面抗原の発現を FACS等で 調べることにより、 ランゲルハンス細胞が得られる培養期間を適宜決定すること ができる。
このようにヒ卜末梢血から得た末梢血単核球より CD14陽性細胞を単離し、 ノッ チリガンド、 GM-CSFおよび TGF- j3の存在下で培養することによりランゲルハンス 細胞を調製することができる。 ここで、 ノッチリガンドにより細胞を処理するこ とにより、 ノッチリガンドが細胞が元々有するノッチに結合し、 細胞にノッチシ グナルを伝達する。 すなわち、 細胞をノッチリガンドで処理することは、 細胞の ノツチにノッチリガンドを用いてノツチシグナルを伝達させることを意味する。 得られた細胞がランゲルハンス細胞であるかどうかは、 細胞の表面抗原を調べ 2004/010783 ればよく、 本発明の方法で調製されるランゲルハンス細胞においては、 細胞表面 に E -力ドヘリン、 ランゲリン、 および CCR6が発現している。 さらに、 本発明の方 法で調製されるランゲルハンス細胞の表面には、 MHCクラス I分子である HLA- AB MHCクラス I I分子である HLA- DR、 CD80および CD86が発現されている。 これらの抗 原が発現されているかどうかは、 これらの抗原に対する抗体であって、 発色酵素、 蛍光化合物等で標識した抗体を用いて細胞が染色されたか否かを顕微鏡観察等に より決定することができる。 例えば、 これらの抗体を用いて細胞を免疫染色して、 表面抗原の有無を決定することができ、 また該抗体を結合させた磁性ピーズを用 いても決定することができる。 また、 FACSまたはフローサイトメーターを用いて も表面抗原があるかどうか決定することができる。 FACS、 フローサイトメーター としては例えば FACS Vant age (べク トン · ディ ッキンソン社製） 、 FAC S Cal ibur (べクトン 'ディッキンソン社製）等を用いることができる。
なお、 本発明の方法により成熟したランゲルハンス細胞も未成熟のランゲルハ ンス細胞も得られる。
ノッチリガンド、 GM-CSFおよび TGF- jSの存在下で培養する方法によっては、 主 に未成熟のランゲルハンス細胞が得られ、 さらに成熟化させて成熟ランゲルハン ス細胞を得ることができる。 免疫応答刺激のためには、 成熟ランゲルハンス細胞 を用いることが好ましい。
未成熟のランゲルハンス細胞を成熟させるための因子として、 樹状細胞を成熟 させるために通常用いられている因子を用いることができ、 例えば TNF- 、 LPS, IL - 1 /3等の IL-1、 IL - 6、 PGE2等のプロスタグランジン、 INF -ひ、 β、 了、 CD40リ ガンド等またはこれらの組合せが挙げられるが、 これらに限定されない。
未成熟のランゲルハンス細胞を成熟させるための因子としての適当な濃度は、 0. lng/mL〜100 g/niLの範囲が挙げられる。 例えば、 TNF-ひ濃度は 1〜200 ng/mL が好ましく、 CD40リガンド濃度は 0. l〜10 _i g/mLが好ましく、 LPS濃度は 0. 1〜10 ng/mLが好ましい。
本発明は、 またヒト末梢血単核球を上記の方法によりノッチリガンド、 GM- CSF および TGF- βの存在下で培養することにより得られるランゲルハンス細胞をも包 含する。 該ランゲルハンス細胞等は、 上記のような表面抗原を発現している。
2 . ランゲルハンス細胞の利用
本発明は上記の方法により得られたランゲルハンス細胞を含む医薬組成物をも 包含する。 本発明のランゲルハンス細胞は、 細胞療法に用いることができ、 本発 明のランゲルハンス細胞を含む医薬組成物は細胞療法に用いるための医薬組成物 として利用することができる。
該医薬組成物は、 癌や AIDS等の感染症の治療、 細胞、 臓器もしくは組織移植に. 伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主病の治療、 自己免疫疾患またはアレル ギー性疾患等の治療に用いることができる。 特に成熟したランゲルハンス細胞は、 免疫増強作用を有しているため癌や AIDS等の感染症の治療に適しており、 未成熟 のランゲルハンス細胞は、 反対に免疫抑制作用を有しているため、 細胞、 臓器も しくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主病の治療、 自己免疫 疾患またはアレルギー性疾患等の治療に適している。 また、 本発明のランゲルハ ンス細胞、 特に未成熟のランゲルハンス細胞は、 慢性関節リウマチ、 多発性硬化 症、 I型糖尿病、 ぶどう膜炎、 自己免疫性心筋炎、 重症筋無力症、 全身性エリテ マ卜一デス、 自己免疫性溶血性貧血、 全身性強皮症、 潰瘍性大腸炎、 クローン病、 シエーダレン症候群、 自己免疫性肝疾患 （例えば、 原発性胆汁性肝硬変） 、 乾癬、 突発性血小板減少性紫斑病、 Goodpas ture症候群 （例えば、 糸球体腎炎） 、 悪性 貧血、 橋本病、 尋常性白斑、 ベーチェット病、 自己免疫性胃炎、 天疱瘡、 ギラ ン -バレー症候群、 HTLV-1関連脊髄症のような自己免疫疾患、 あるいは接触過敏 症、 アレルギー性鼻炎、 食物アレルギー、 喘息のようなアレルギー性疾患等の治 療に用いることもできる。
癌や感染症の治療に用いる場合、 本発明のランゲルハンス細胞を成熟させた後、 そのまま用いるか、 あるいは患者の末梢血を共培養することにより得られる CTL (cytotoxic T lymphocyte)を利用することもできる。
本発明のランゲルハンス細胞に対象疾患によって適宜選択された抗原を付与す るが、 付与は数日間の期間、 タンパク質抗原の場合、 l〜1000 g/ml、 好ましく は 10〜100 g/mlの濃度で in vi troで付与すればよい。 本発明のランゲルハンス細胞を含む医薬組成物を治療に用いる場合、 0. 5 X 1 06 〜103を、 静脈内あるいは皮下、 皮内で投与すればよい。 また、 患者への投与に 関しては随時におこなえる。 特に臓器 ·組織移植に伴う移植片拒絶、 移植片対宿 主病については、 発症が予想される処置以前での投与が好ましい。 ランゲルハン ス細胞の投与時期、 投与量は、 疾患の種類、 疾患の重篤度、 患者の状態等に応じ て適宜決定することができる。
さらに、 本発明は、 ヒトから採取した末梢血単核球を、 ノッチリガンド、 GM- CSFおよび TGF- J3の存在下で培養することを含む、 癌、 感染症、 細胞、 臓器もし くは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主病の治療、 自己免疫疾 患またはアレルギー性疾患治療用ランゲルハンス細胞の調製方法を含む。 この方 法により得られた治療用ランゲルハンス細胞により、 上記のように各種疾患の治 療を行うことができる。 細胞は、 治療目的によって患者本人の細胞あるいは患者 本人以外の細胞を適宜選択して用いる。
従って、 本発明はさらに、 上記のランゲルハンス細胞を用いて癌または AIDS等 の感染症、' 細胞、 臓器もしくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対 宿主病の治療、 自己免疫疾患またはアレルギー性疾患等を治療する方法を提供す る。
本発明はさらに、 ランゲルハンス細胞により癌または AIDS等の感染症、 細胞、 臓器もしくは組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主病の治療、 自 己免疫疾患またはアレルギー性疾患等を治療するための医薬品の製造における、 上記のヒト抗原提示細胞の使用を提供する。
以下に、 本明細書における参考文献を示す。
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本実施例において、 用いた培養液と試薬は以下の通りである。
培養液は 2ιηΜの L-グルタミン、 50 U/m】のペニシリン、 50 〃g/mlのストレプト マイ シンを含む RPMI 〗640 (日水製薬、 東京） を使用 し、 牛胎児血清 (FCS) (Hyc lone, Logan, UT, USA)を 10%で添加した。 GM - CSFはキリンピール（東京）、 IL-4は小野薬品 （大阪） か ら 供与を受けた。 TGF- β と IL-15は R&D Systems (Minneapolis，腿， USA)から購入した。 GM- CSFは 10 ng/ml、 IL- 4は 10 ng/mK TGF- /3は 10 ng/mK IL- 15は 10 ng/mlで使用した。
Delta- 1の固相化は、 以下のようにして行った。
Delta- 1はこれまでに報告してきた方法で培養用プレー卜に固相化した（Ohishi Kら、 Blood 98:1402-1407, 2001; Oliishi Kら、 Blood 95: 2847-2854, 2000; O ishi Kら、 J Clin Invest 110: 1165-1174, 2002)。 まず、 マウス抗 myc抗体 ?(&1)')2断片を？85にて5〜10 g/mlの濃度に調整し、 24ゥエル組織培養用プレー ト（Nunc, Roskilde, Denmark)に 1〜2時間 37°Cで添加し固相化した。 PBSで洗浄した 後、 非特異的結合をブロックするために 2〜10%の FCSを含む RPMI 1640を培養用プ レートへ 30分 37°Cで添加し、 その後、 ヒト Delta-1の細胞外ドメインと 6個の myc 蛋白からなる Delta-1 コンストラクトを加えて固相化した。 Delta- 1 コンストラ クトは、 遺伝子導入した NS0細胞株の上清から精製した。 Delta- 1 コンストラク トのコントロールとして、 遺伝子改変してない NS0細胞株の馴化培地
(conditioned medium) を用いた (Ohishi K. ら、 Blood 98:1402-1407, 2001; Ohishi K.ら、 Blood 95: 2847-2854, 2000) 。
使用した抗体および入手先は以下の通りである。
使用したモノクローナル抗体： FITC-抗 CDla抗体， PE-抗 HLA- ABC抗体（DAK0, Glostrup, Denmark)； PE-抗 CD14抗体， PE-抗 CD80抗体， PE-抗 HLA- DR抗体 (Becton Dickinson Immunocytometry, San Jose, CA, USA)、 PE-抗 Langerin (CD207)抗体， 抗 E- Cadherin抗体（ImmiHiotech, Marseille, France) , PE-抗 CD86抗体， （Becton Dickinson Ph arm in gen, San Diego, CA, USA)、 FITC-抗 CCR6抗体（R&D Systems) c HTC -画 se I G2a (Becton Dickinson) 、 FITC-rat anti-mouse IgGl, PE 顧 se IgGl (Becton Dickinson Pharmingen)、 mouse IgG2b (Coulter Miami, FL, USA)。 本実施例において用いた細胞の細胞分離は、 以下のようにして行った。
同意を得た後、 健常日本人より末梢血をへパリン加採取した。 末梢血単核球 (PBMCs)は Ficol卜 HypaQue (Nycomed Phama AS, Oslo, Norway)を用いての比重遠 沈法にて分離した。 CD14陽性細胞は PBMCsより MACS Microbeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)にて分離した（Mi tani Hら、 Br J Haematol 109: 288-295, 2000; Araki Hら、 Br J Haematol 114: 681-689, 2001)。 この方法で得られた CD14陽性細胞の純度は 95%以上である。 非特異的エステラーゼ染色（武藤化学、 東 京）を施行すると、 CD14陽性細胞は非特異的エステラーゼ陽性であった。
得られた CD14陽性細胞を以下の方法により培養した。
CD14陽性細胞は 5X 105個/ mlの濃度で、 10%FCSを添加した RPMI 1640を用いて 24 ゥエル組織培養用プレートに培養した。 培養液は 3〜4日毎に交換した。 このよう な条件で 6日間培養後、 位相差顕微鏡を用いて形態学的観察を行い、 生細胞数は trypan blue dye exclusion法で算定した。
細胞の評価のための細胞形質の解析は、 以下の方法により行った。
細胞表面形質の検討は蛍光標識あるいは非蛍光標識モノクローナル抗体での単 — あ る い は 二 重染 色 で 行 い 、 分 析 は FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry)を用いて施行した。 データ解析には CellQuesぃノフ卜（Becton Dickinson Imnumocytometry)を使用した。 染色方法は、 細胞を 2%AB型血清にて非 特異的結合をブロックした後、 各種抗体を 4°Cで 30分間添加して行った。 Propium iodide陽性細胞を死細胞として除去した。 なお、 E-カドヘリンとランゲリンの二 重染色は、 まず、 抗 E-カドヘリン抗体と反応させ、 洗浄後 FITC-ラット抗マウス IgGl抗体を添加し、 十分量のマウス IgGlでブロックした後、 PE-抗ランゲリン抗 体で染色した。
(1) GM-CSF + IL-4 + TGF'-j8存在化における CD14陽性細胞に対する Delta - 1 の作用
De l ta- 1のヒト末梢血単球から LCへの分化に及ぼす作用を検討するために、 P丽 Csより分離した CD14陽性細胞をあらかじめ De l ta-1が固相化された。 培養用プ レートに、 単球から LCへの分化を支持すると報告されている GM- CSF + IL-4 + TGF- β (Ge issmann Fら、 ； ί Exp Med 187 : 961-966, 1998) 、 GM- CSF + IL- 15 (Mohamadzadeii Mら、 J Exp Med 194 : 1013-1020, 2001)、 あるいは GM - CSF + TGF- /3 (Gui ronnet Gら、 J Leukoc Biol 71 : 845-853, 2002)の存在下に 6日間培 養し、 細胞形態および表現形質を検討した。 De l t a- 1のコントロールとしては、 方法に示した馴化培地を用いた。 CD14陽性細胞を 24ゥエルプレートに 5 X 105ί固 Ailの濃度で De l ta- 1存在下あるいは非存在下で GM-CSF + IL-4 + TGF- jSを添加し て培養した。 培養 6日後に、 細胞を回収し、 図に示した抗原分子に対するモノク ローナル抗体で染色した。
図 1に、 Del ta- 1存在下あるいは非存在下での GM- CSF + IL-4 + TGF- j8により CD14陽性細胞から誘導された細胞の形質の解析の結果を示す。
GM-CSF + IL- 4 + TGF- 0で誘導された細胞は、 形態学的には DC様で、 CDla陽性 CD14陰性で E -力ドヘリンを発現していたが、 ランゲリンを発現していなかった。 また、 Del ta- 1を添加しても形態学的には変化はみられなかったが、 E-カドヘリ ンの発現は若干増強された（図 1 )。 図 1中、 白抜きがコントロール抗体での解析 結果を示しており、 黒塗りが用いたモノクローナル抗体での解析結果を示してい る。 結果は数回の実験の内の代表的な 1つからのものである。
( 2 ) GM-CSF + IL- 15存在化における CD14陽性細胞に対する Del ta- 1の作用 次に、 Del ta- 1の GM- CSF + IL- 15存在下における CD14陽性細胞に対する作用を 検討した。 CD14陽性細胞を 24ゥエルプレートに 5 X 105個/ mlの濃度で De l ta- 1存在 下あるいは非存在下で GM-CSF + IL- 15を添加して培養した。 培養 6日後に、 細胞 を回収し、 図に示した抗原分子に対するモノクローナル抗体で染色した。 図 2に 結果を示す。 白抜きがコントロール抗体での解析結果を示しており、 黒塗りが用 いたモノクローナル抗体での解析結果を示している。 結果は数回の実験の内の代 表的な 1つからのものである。 GM-CSF + IL- 15で誘導された細胞は、 形態学的は マクロファージ様であり、 表面形質では CDla弱陽性 CD14弱陽性で、 E-カドヘリン とランゲリンはともに陰性であった。 Del ta- 1の添加により、 CDlaの発現は誘導 されランゲリンの発現も軽度に誘導されたが、 E-力ドヘリンの発現は誘導されな かった。
( 3 ) GM-CSF + TGF- ;3存在化における CD14陽性細胞に対する Del ta- 1の作用 GM-CSF + TGF- /3存在化における CD14陽性細胞に対する Del ta- 1の作用について も検討した。 CD14陽性細胞を 24ゥエルプレートに 5 X 105個 /mlの濃度で Del ta- 1存 在下あるいは非存在下で GM- CSF + TGF- j6を添加して培養した。 培養 6日後に、 細 胞を回収し、 図に示した抗原分子に対するモノクローナル抗体で染色した。 図 3 に結果を示す。 白抜きがコントロール抗体での解析結果を示しており、 黒塗りが 用いたモノクローナル抗体での解析結果を示している。 結果は数回の実験の内の 代表的な 1つからのものである。 GM-CSF + TGF-/3で誘導された細胞はマクロファ . ージ様の形態を示し、 CDla陰性 CD14陽性であり、 E-カドヘリンとランゲリンはと もに陰性であった。 興味深いことに、 Del ta-1の添加により CD14が発現されたま ま、 CDlaの発現が強く誘導され、 E -力ドヘリンとランゲリンともに陽性となった。
( 4 ) Del ta-1 + GM-CSF + TGF- 3で誘導された LC様細胞の CDla陽性細胞にお ける E-力ドヘリンとランゲリンの発現およびランゲリン陽性細胞における E -力ド ヘリンと CCR6の発現
Del ta-1 + GM-CSF + TGF- ;3で誘導された細胞が LCであることを検討するため に、 CDla陽性細胞における E-力ドヘリンとランゲリンの発現およびランゲリン陽 性細胞における E-力ドヘリンと CCR6の発現を検討した。 CD14陽性細胞を 24ゥエル プレートに 5 X 105個/ mlの濃度で Del ta-1 + GM-CSF + TGF- /3を添加して培養した。 培養 6日後に、 細胞を回収し、 抗 CDla抗体と抗ランゲリン抗体あるいは抗 E-カド ヘリン抗体、 抗ランゲリン抗体と抗 E-力ドヘリン抗体あるいは抗 CCR6抗体で染色 し、 解析結果をドットプロットで示した。 図 4に結果を示す。 結果は数回の実験 の内の代表的な 1つからのものである。 CD 1 a陽性細胞の 81 %の細胞がランゲリン陽 性で、 60%の細胞が E-カドヘリン陽性であった。 また、 ランゲリン陽性細胞の 78% の細胞が E-カドヘリン陽性で、 58%の細胞が CCR6陽性であった。 5 X 105個の CD14 陽性細胞から 2.1±0.7 x 105(n=5)の細胞が回収された。
(5) Delta-1 + GM-CSF + TGF- jSで誘導された LC様細胞の抗原提示機能関連 分子の発現
Delta-1 + GM-CSF + TGF- 3で誘導された LC様細胞の抗原提示機能関連分子の 発現をランゲリン陽性細胞分画で検討した。 CD14陽性細胞を 24ゥエルプレートに
5 X 105個/ mlの濃度で Delta- 1 + GM-CSF + TGF- /3を添加して培養した。 培養 6日 後に、 細胞を回収し、 抗ランゲリン抗体と図に示した抗原分子に対するモノクロ ーナル抗体で染色し、 ランゲリン陽性細胞におけるそれぞれの抗原分子の発現を 解析した。 結果を図 5に示す。 白抜きがコントロール抗体での解析結果を示して おり、 黒塗りが用いたモノクローナル抗体での解析結果を示している。 結果は数 回の実験の内の代表的な 1つからのものである。 ランゲリン陽性分画の細胞は主 要組織適合抗原（major his toco即 at ibilUy complex: 顧 C)のクラス I、 クラス II 分子である HLA- AB (；、 HLA- DRや共刺激分子 （co-stimulatory molecules) である CD80, CD86を発現していた。
上記 （1) から （5) の検討の結果より以下の事柄が判明した。
DCは皮膚においては表皮と真皮に存在しており、 それぞれ LCと dermal DCと呼 ばれている（Steinman腿ら、 Annu Rev Immunol 9: 271-296, 1991; Banchereau Jら、 Annu Rev I醒 imol 18: 767-811, 2000)。 古くから DCは単球/マクロファー ジ系の細胞であると理解されていたが、 マウスの骨髄細胞の培養系において GM - CSF存在下に形成される穎粒球およびマクロファージからなるコロニーの内に DC の存在が示されたことで、 DCが単球/マクロファージ系に属する細胞であること が確認された（Inaba Kら、 〗 Exp Med 176: 1693-1702, 1992)。 その後、 in vitroの培養系において、 ヒトの臍帯血あるいは末梢血などの CD34陽性細胞から の LCの誘導や末梢血 CD14陽性細胞からの dermal DCの誘導が可能となったことに より、 ヒトの骨髄系 DCに関する細胞生物学は飛躍的に進歩し、 それらに対する理 解も深められた（Caux Cら、 Nature 360: 258-261, 1992; Caux Cら、 J Exp Med 184: 695-706, 1996; Strunk D ら 、 Blood 87: 1292-1302, 1996; Geissmann Fら、 ； ί Exp Med 187: 961-966, 1998; Mohamadzade Mら、 J Exp Med 194: 1013-1020, 2001; Guironnet Gら， J Leukoc Biol 71: 845-853, 2002) 培養系の経時的な観察から、 LCは造血前駆細胞から CDla陽性 CD14陰性細 胞を経て、 分化した細胞と認識され、 CD14陽性の単球/マクロファージとは系列 を異にする細胞群と考えられてきた（Caux Cら、 J Exp Med 184: 695-706, 1996) しかしながら、 いくつかのサイ ト力インの組み合わせにより、 末梢血 CD14陽性単球から LC様細胞が誘導できるとの報告がなされ、 もう 1つの LCへの分 化経路の可能性が提示された（Ge is smarm Fら、 J Exp Med 187: 961-966, 1998; Mohamad zade Mら 、 J Exp Med 194: 1013-1020, 2001; Guironnet Gら Dezutter-Dambuyant Cら、 J Leukoc Biol 71: 845-853, 2002)。
LCはケラチノサイ卜とともに表皮に存在していること、 さらにケラチノサイ卜 は CD14陽性単球や dermal DCの分化に影響を与えている Delta-1を発現しているこ とから （OhisM Kら、 Blood 98:1402-1407, 2001; Ohishi K. ら、 Blood 95: 2847-2854, 2000; Lowell Sら、 Curr Biol 10: 491-500, 2000)、 我々はこれま で報告されている CD14陽性単球から LCを誘導する培養系における Del -lの作用 について検討してみた。 GM- CSF + IL-4+TGF- jSあるいは GM- CSF + IL-4 + TGF-/3 + Delta-1の存在下に CD14陽性単球を培養すると、 得られた細胞には E-カドヘリ ンは発現されていたもののランゲリンの発現は全く見られなかつた。 C- typeのレ クチン（1 ec t in)であるしランゲリンは Bi rbeck穎粒と密接に関連した分子であり、 LCに特異性が高いことから（Valladeau Jら、 Imnumity 12: 71-81, 2000)、 この 分子が発現されていない細胞は LCの特性を十分に保持しているとは言い難い。 GM-CSF + IL-15で得られた細胞は E-カドヘリンとランゲリンが陰性であり、 それ に Delta-1を加えた培養で得られた細胞はランゲリンを軽度に発現していたが、 E-力ドヘリンは陰性であり、 いずれの細胞も LCの特性を持ちあわせていないと考 えられた。 GM- CSF + TGF - j3を添加した培養で得られた細胞もランゲリンだけで なく E-カドヘリンも陰性であり、 同様のことが言えよう。 現時点で、 これまでの 報告（Geissmaim Fら、 J Exp Med 187: 961-966, 1998; Mo amadzadeh Mら、 J Exp Med 194: 1013-1020, 2001; Guironnet Gら、 J Leukoc Biol 71: 845-853, 2002)と我々の実験結果の違いは説明できず、 今後の検討が必要であると考えて いる。 しかしながら、 驚いたことに GM-CSF + TGF - j3に Delta- 1を加えた培養では， 50%以上の細胞に E-力ドヘリンとランゲリンの発現が見られ、 ランゲリン陽性細 胞のかなりの部分が E-カドヘリンも発現していた。 さらには、 ランゲリン陽性細 胞の約半分の細胞には、 未熟な LCに発現しそれら真皮への遊走に関連すると言わ れているケモカイン macrophage inhibitory protein-3 (MIP- 3 α)の受容体であ る CCR6 (Charbonnier ASら、 〗 Exp Med 190: 1755- 1768， 1999)も発現されてい た。 これらのことから、 CD14陽性単球から GM- CSF + TGF-/3 + Delta - 1で誘導さ れた細胞は LCであることが示唆された。 また、 これらの細胞がヒト顧 Cのクラス I、 クラス II分子ある HLA-ABC, HLA- DRや共刺激分子である CD80， CD86を発現していた ことは、 これらの細胞には抗原提示能があることが示唆される。
ケラチノサイトは Delta - 1を発現しているだけでなく （Lowell Sら、 Curr Biol 10: 491-500, 2000)、 GM - CSFおよび TGF- ;3も分泌している （Luger TAら、 J Dermatol Sci 13: 5-10， 1996)。 すなわち、 我々が in vi troで CD14陽性単球から LCを誘導した培養系は in vivoでの皮膚環境に近いものと思われ、 生体内でも末 梢血の CD14陽性単球が真皮を通して表皮に入り、 ケラチノサイ卜が分泌あるいは 発現する GM - CSF、 TGF- i8、 Delta-1に触れ、 LCに分化すると推測できる。 真皮に， 存在する、 付着性、 表現型、 macrophage colony-stimulating factorに対する反 応性などが単球/マクロファージ系細胞とは異なった CD14陽性の LC前駆細胞につ いての報告があるが（Larregina ATら、 Nat Immunol 2: 1151-1158, 2001)、 我々が CD14陽性細胞から誘導した LC様細胞も CD14陽性であり、 これらの 2つの細 胞群の関連性が注目される。 実施例 2 調製したランゲルハンス細胞の特性分析
実施例 2において用いた試薬および抗体は以下の通りであった。
CD40リガンドは Bender MedSystems (Vienna, Austria)から購入した。 TNF - a は大日本製薬 （吹田）から、 IL- 2は武田薬品工業 （大阪）より供与された。 CD40リ ガンドは、 1 g/ml、 TNF- αは 20 ng/mK IL- 2は 20 IU/mlで使用した。 使用し たモノクローナル抗体は、 PE-抗 CD40抗体、 PE -抗 CD83抗体 （Immimotech, Marseille, France) PE-抗 CD54抗体 （Bee ton Dickinson Imm漏 cytometry, San Jose, CA, USA)であった。
末梢血からの、 細胞分離は、 以下の方法で行った。 同意を得た後、 健常日本人 より末梢血をへパリン加採取した。 P丽 Csは Ficol卜 Hypatiue (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway)を用いての比重遠沈法にて分離した。 CD8陽性細胞と CD4陽性細胞 は PBMCsより MACS Microbeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA)にて分離し た。 この方法で得られた CD8陽性細胞と CD4陽性細胞の純度は 99%以上である。
Real-tiie RT-PCR (Real-time reversed transcriptase-polymerase chain reaction)は以前報告されている方法に準じて施行した（Ohishi K, J Clin
Invest 110: 1165-1174, 2002) 0 分離されたばかりの CD14陽性細胞を Del ta - 1、 GM - CSF、 TGF -^の存在下で 24時間培養し、 これらの細胞から total RNAを抽出し、 cDNAを合成した。 用いた primersは以下のものである。 HES- 1 forward primer, 5' TGG AAA TGA CAG TGA AGC ACC 3， （配列番号 1 ) ； HES- 1 reverse primer, 5' GTT CAT GCA CTC GCT GAA GC 3' (配列番号 2 ) ； HES- 1 robe, 5'
(FAM) -CGC AGA TGA CGG CTG CGC TG- (TAMRA) 3' (配列番号 3 ) ； the
endogenous gene, GAPDH, forward primer, 5' GAA GGT GAA GGT CGG AGT 3' (配列番号 4) ； GAPDH reverse primer, 5， GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC 3， (配列番号 5) ； GAPDH probe, 5， (FAM) - TTG CCA TCA ATG ACC CCT TCA TTG AC- (TAMRA) 3' (配列番号 6 ) 。 増幅は ABI Prism 7, 700 Seauence Detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用いて行った。
CD14陽性細胞を Delta-1、 GM-CSF, TGF- βの存在下で 6日間培養した後、 2.5% ダルタールアルデヒドで固定し、 エタノールで脱水させた後、 エボンに包埋した。 切片をクェン酸鉛と酢酸ゥラニルで染色後、 細胞を JEM - 1200EX電子顕微鏡 （JE0L、 東京）で観察した。
誘導された LCの貪食能は以下の方法で測定した。 Delta- 1、 GM- CSF、 TGF- 3の 存在下で 4日間、 さらに CD40リガンドと TNF-ひを加えて 2日間培養して得られた 2 X 105個の LCを 10 FCS RPMI 1640に浮遊し、 1 mg/mlの Π -デキストラン （分 子量 40,000; Sigma, St. Louis, MO, USA)と氷上あるいは 37°Cで 1時間反応させ た。 FITC-デキストランの取り込み反応は冷却した 1% FCS PBSで中断させ、 その 後、 細胞を 1 FCS PBSで 4回洗浄した。 FITC -デキストランの取り込みは FACS Caliburで測定した。
ELISPOT (enzymed- linked immunosorbent spot) 法は以前報告されている方法 を少し変更して施行した （Ikuta Y et al. , Blood 99: 3717-3724, 2002) 。 成 熟 LCは CD14陽性細胞を Delta- 1、 GM- CSF、 TGF-jSの存在下に 6日間培養し、 後半の 2日間は CD40リガンドと TNF- αを添加して調製した。 96ゥエルの ni trocel lulos e MAHA S4510 Millipore プレート （Millipore, Bedford, MA, USA)に 10 g/in】の 抗インタ一フエロン-ァ抗体 （卜 D1K; Mabtech, Stockholm, Sweden)を入れて、 4°Cにて一晩放置した。 このプレートを PBSで洗浄後、 非特異反応をブロックす るために、 10% AB型血清にて 2時間 37°Cで処理した。 HLA- A0201陽性の健常人か ら得られた 105個の CD8陽性細胞に改変 Mel an - A26_35ペプチド （A27L) (ELAGIGILTV 配列番号 7)をパルスし、 放射線照射 （46 Gy)をされた 4 x 104個 の成熟 LCとともに 24ゥエルプレートに、 10%AB血清添加 RPMI 1640で培養した。 培養 4日目と 7日目には IL-2 (20 Ιϋ/ml)を添加した。 これらの CD8陽性細胞を培養 10日目に回収し、 効果細胞として用いた。 改変 Melan_A26-35ペプチド（A27L)をパ ルスしたあるいは何もパルスしていない T2細胞を標的細胞とした。 1 X 104個の 効果細胞と 5 X 104個の target細胞を ELISPOT プレー卜に共培養した。 18時間後 に、 プレートを 0.05% Tweenを含む PBSで洗浄後、 1 g/mlのピオチン化抗イン ターフェロン- τ抗体 （7- B6- 1; MaMech)と 2.5時間 37°Cで反応させ、 洗浄後、 さらに 1 g/inlのストレプトアビジンアルカリフォスファタ—ゼ （MaMech)と 1.5時間反応させた。 洗浄後、 プレートをアルカリフォスファターゼ結合基質キ ット （BioRad, Hercules, CA, USA)で染色し、 顕微鏡下でスポット数を算定した。 成熟 LCによる CD4陽性細胞の刺激は、 以下の方法で行った。 1 105個の成熟 LC と 2 X 105個の自己 CD4陽性細胞を抗 CD3抗体 （UCHT1, 0.5 mg/ml； BD P arMingen, SanDiego, CA, USA)の存在下に 24ゥエルプレートに培養し、 培養 4日目に IL - 2 (20 Ιϋ/ml)を添加し、 培養 7日目に CD4陽性細胞数を算定した。 成熟 LCの代わりに、 CD14陽性単球から GM- CSF、 IL-4と CD40リガンド、 TNF- ο;で誘導された成熟 DCを用 いて、 同様のことを施行した。
実施例 2の検討により、 以下の結果が得られた。
Delta-1による HES-1遺伝子の発現
HES - 1遺伝子はノツチシグナルの標的遺伝子として知られている （Schroeter EH et al. , Nature 393: 382-386, 1998、 Struhl G et al. , Cell 93: 649-660, 1998)。 そこで、 Delta-1が LCにノッチシグナルを伝達しているかどうかを確認す るために、 Delta- 1の HES-1遺伝子発現に対する影響について検討した（図 6)。 培 養系に Delta- 1が存在したときは、 存在しないときに比べて、 HES-1の発現は約 8 倍に増加していた。 D e 11 a - 1は C D 14陽性細胞に作用していることが確認された。 図 6は、 CD14陽性細胞における Delta- 1による HES- 1遺伝子の発現亢進を示す。 Delta-1の存在下と非存在下の HES-1遺伝子の発現を検討した。 結果は、 HES- 1遺 伝子発現の GAPDH遺伝子発現に対する比で表し、 新鮮 CD14陽性細胞の HES-1遺伝子 の発現レベルを 1.0として発現レベルを示した。 2回の実験のうちの代表例を示す。
細胞は細長い多数の細胞突起を有し、 細胞質内には Birbeck顆粒も含んでいた (図 7) 。
図 7は、 培養細胞の電子顕微鏡像を示し、 左のパネルの元の倍率は 8， 000倍で バ一は 2 111であり、 右のパネルの元の倍率は 30， 000倍でバーは 0.5 mである。
LCの貪食能
CD14陽性細胞から Delta- 1、 GM - CSF、 TGF- ]8で調製された LCの貪食能を FITC-デ キストランの取り込みで検討した （図 8) 。 LCは FITC-デキストランを取り込ん だ。 生成された IXには貪食能があることが明らかになった。
図 8に、 LCの FITC-デキストランの取り込みの検討の結果を示す。 Delta-1、 GM-CSF、 TGF- j8で生成された CD14陽性細胞由来の LCを FITC-デキストランと 37°C あるいは氷上で 1時間反応させた。 3回洗浄後、 FACS Caliburで解析した。 同様の 結果が 3回の実験で得られた。
De l t a- 1、 GM-CSF, TGF- /3で生成された LCの成熟
De l ta- 1、 GM- CSF、 TGF- /3で生成された LCが CD40リガンドと TNF- αに反応して， 成熟するかどうかを検討した （図 9 ) 。 CD14陽性細胞を]) el t a- 1、 GM-CSF, TGF - β存在下で 6日間培養したが、 後半の 2日間には CD40リガンドと TNF- αを添加した c 得られた培養細胞の HLA_ABC、 HLA-DR, CD80、 CD86、 CD40, CD54の発現は著しく 亢進し、 CD83の発現も認められるようになった。 De l ta-1、 GM-CSF, TGF- j8で生 成された LCは成熟できることが示された。
図 9に、 CD40リガンドと TNF- αにより成熟した LCの HLA- ABC、 HLA-DR、 CD80、 CD86、 C謹、 CD54, CD83の発現を示す。 CD14陽性細胞を Del ta - 1、 GM-CSF, TGF- i3で培養し、 培養 4日目に CD40リガンドと TNF- αを追加添加し、 6日目に細胞を回 収した。 HLA-ABC, HLA-DRゝ C議、 CD86、 C謂、 CD54、 CD83の発現を FACS
Cal iburで解析した。 太い線が図に示した分子の発現を示しており、 細い線が i sotype cont rolを示している。 同様の結果が 5回の実験で得られている。
CD14陽性細胞由来成熟 LCによる CD8陽性細胞の刺激
CD14陽性細胞から生成された成熟 LCの機能を検討するために、 HLA- A0201陽性 の健常人より成熟 LCを調整し、 それらに HLA-A0201に特異的に結合する改変
Me lan-A26_35ぺプチド（A27L)をパルスした。 ぺプチドをパルスした成熟 LCと共培 養した自己 CD8陽性 T細胞を効果細胞として、 同じ改変ペプチドをパルスした T2細 胞を標的細胞して反応させ、 IFN- τを産生する CD8陽性 T細胞数を ELI SP0T法にて 測定した。 ペプチドをパルスした成熟 LCは IFN-ァを産生する自己 CD8陽性 T細胞を 誘導した （図 1 0 ) 。
図 1 0に示すように、 CD14陽性細胞から生成された成熟 LCはペプチド特異的 CD8陽性細胞を活性化する。 HLA- A0201陽性の健常人由来の CD14陽性細胞より、 De l ta- 1、 GM- CSF、 TGF- j8、 CD40リガンド、 TNF- αを用いて成熟 LCを調製した。 2 X 105個の自己 CD8陽性 T細胞を 4 X 104個の改変 Me l an- A26— 35ペプチド（A27L)をパル スした成熟 LCで 10日間刺激した。 その後、 CD8陽性細胞を回収し、 1 X 個の CD8陽性細胞と改変 Melan-A26_35ペプチド（A27L) (ELAGIGILTV)をパルスした 5 x 104 個の T2細胞を ELISPOT plateに共培養した。 18時間後、 イン夕一フエロン-ァを産 生する自己 CD8陽性 T細胞数を算定した。 それぞれの barは 2つの測定値の平均を示 している。 2回の実験例を示す。
CD14陽性細胞由来成熟 LCによる CD4陽性細胞の刺激
CD 陽性細胞から生成された成熟 LCの自己 CD4陽性細胞の刺激能を検討した。 成熟 LCあるいは成熟 DCと CD4陽性細胞を抗 CD3抗体存在下で培養し、 刺激を受けた CD4陽性細胞を IL- 2で増幅した。 培養 7日目に CD4陽性細胞数を算定した。 成熟 LC で刺激された CD4陽性細胞数の方が、 成熟 DCで刺激された CD4陽性細胞数より有意 に高かった （図 1 1) 。
図 1 1は、 成熟 LCと成熟 DCによる自己 CD4陽性細胞の刺激の結果を示す。 健常 人由来の CD14陽性細胞より、 Delta- 1、 GM- CSF、 TGF- β、 CD40リガンド、 TNF -ひ を用いて成熟 IXを、 GM- CSF、 IL- 4、 CD40リガンド、 TNF- αを用いて成熟 DCを生成 した。 2 X 105個の自己 CD4陽性 T細胞を 2 X 105個の成熟 LCあるいは成熟 DCで剌激 した。 培養 4日目に IL-2を添加した。 培養 7日目に、 CD4陽性 T細胞数を算定した。 それぞれの barは 4つの測定値の平均を示している。 2回の実験のうちの代表例を 示す。
実施例 2の結果が示すように、 Delta- 1がヒト末梢血 CD14陽性単球に作用して いることをノッチシグナルの標的遺伝子である HES-1遺伝子の発現増強で確認し た。 生成された LCを電子顕微鏡で観察すると、 LCに特異的な Birbeck顆粒が見ら れた。 また、 これらの LCには貪食能が認められた。 LCを CD40リガンドと TNF- αに 反応させると、 主要組織適合抗原 （major tiistoco即 atibility comple ： MHO のクラス I、 クラス Π分子である HLA-AB HLA- DRや co- sUmulatory分子であ る CD80、 CD86および接着分子である CD40、 CD54の発現が著しく亢進され、 CD83 の発現が認められるようになり、.生成された LCは成熟能を有していることが示さ れた。 癌精巣 （Cancer- testis) 抗原の 1つである Melan- A分子由来で HLA- A0201に 対する結合モチーフを持つ改変 Me l an- A26—35ペプチド （A27L) ( ELAGIGILTV)を用 いて、 成熟させた LCの Me l an- A分子に特異的な細胞傷害性 Tリンパ球 （CTL)の誘導 能を enzymed- l inked i腿 imosorbent spot (ELISPOT)法にて検討したところ、 成 熟 LCは Mel an- A分子に対する CD8陽性 CTLを誘導した。 また、 LCの自己 CD4陽性 T細 胞に対する刺激能は、 ヒト末梢血 CD14陽性単球から GM- CSF、 インターロイキン - 4
(IL-4) と CD40リガンド、 TNF-ひで誘導された成熟樹状細胞 （DC)と比べ高かつ た。 本研究は、 ヒトの LCの新たな分化経路を確認した点で生物学的に重要であり、 さらにはこれまで困難だった ex vivoおけるヒト末梢血 CD14陽性単球からの LCの 効率的な誘導方法を確立した点でその意義は大きい。 従来の DCを用いたワクチン 細胞療法では、 ヒト末梢血 CD14陽性単球から GM_CSF、 IL-4, TNF- aなどによって 誘導されるいわゆる dermal型 DCが用いられてきているが、 本研究で得られた知見 を基盤にした LCを用いた新たな免疫細胞療法の開発は、 将来のワクチン細胞療法 に飛躍的な発展をもたらす可能性がある。 産業上の利用可能性
ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、 GM - CSFおよび TGF - ) 3の存在下で培養する ことにより、 従来達成できていなかった、 ランゲルハンス細胞を調製することが できる。 該ランゲルハンス細胞は未成熟細胞または成熟細胞の状態で得ることが でき、 ワクチン細胞療法として、 瘙、 感染症、 細胞、 臓器または組織移植に伴う 移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主病の治療、 自己免疫疾患またはアレルギー 性疾患の治療に用いることができる。
本発明の方法で得られたランゲルハンス細胞をランゲルハンス細胞の細胞生物 学的研究に用いることができる。 また、 本発明の方法で調製したランゲルハンス 細胞をワクチン細胞療法に用いることができ、 すなわち、 癌、 感染症、 細胞、 臓 器または組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主病の治療、 自己免 疫疾患またはアレルギー性疾患の治療に利用することができる。 本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書に取り込 むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲 を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者 には容易に理解されるであろう。 本発明はこのような変形および変更をも包含す ることを意図している。

Claims

請求の範囲
1. ヒト末梢血単核球をノッチリガンド、 GM-CSFおよび TGF- 3の存在下で培養 することを含む、 ランゲルハンス細胞の調製方法。
2. ヒト末梢血単核球のノッチにノッチリガンドを用いてノツチシグナルを伝 達させ、 かつ該単核球を GM-CSFおよび TGF- の存在下で培養することを含む、 ラ ンゲルハンス細胞の調製方法。
3. ノッチリガンドを培養用容器に固相化しておくことを特徴とする、 請求項 1または 2記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
4. ノッチリガンドが他のペプチドとの融合ペプチドを構成し、 培養用容器に 該他のペプチドに対する抗体を固相化し、 ノツチリガンドが該抗体と前記他のぺ プチドの結合を介して培養用容器に固相されている、 請求項 3記載のランゲルハ ンス細胞の調製方法。
5. 他のぺプチドが mycである請求項 4記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
6. ノッチリガンドが、 Delta- 1、 Delta-2, Delta- 3、 Delta- 4、 Jagged- 1およ び Jagged- 2からなる群から選択される請求項 1から 5のいずれか 1項に記載のラ ンゲルハンス細胞の調製方法。
7. ノツチリガンドが Delta- 1である請求項 6記載のランゲルハンス細胞の調 製方法。
8. ヒ卜末梢血単核球が単離された CD14陽性細胞である、 請求項 1または 2に 記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
9. ランゲルハンス細胞表面に、 E -カドヘリン、 ランゲリンおよび CCR6が発現 されていることを特徵とする請求項 1から 8のいずれか 1項に記載のランゲルハ ンス細胞の調製方法。
1 0. さらに、 ランゲルハンス細胞表面に、 MHCクラス I分子である HLA-ABC、 MHCクラス II分子である HLA- DR、 CD80および CD86が発現されていることを特徴と する請求項 9記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
1 1. 請求項 1から 1 0のいずれか 1項に記載の調製方法で調製したランゲル ハンス細胞に CD40リガンド、 TNF-Q!及び LPSからなる群から選択される一種以上 を添加して、 さらに培養することを含む、 ランゲルハンス細胞の調製方法。
1 2. ランゲルハンス細胞が未成熟なものである、 請求項 1から 1 0のいずれ か 1項に記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
1 3. ランゲルハンス細胞が成熟なものである、 請求項 1から 1 1のいずれか 1項に記載のランゲルハンス細胞の調製方法。
14. 請求項 1から 1 3のいずれか 1項に記載の方法で調製されたランゲルハ ンス細胞。
1 5. E-カドヘリン、 ランゲリンおよび CCR6が細胞表面に発現されている請求 項 14記載のランゲルハンス細胞。
1 6. さらに、 MHCクラス I分子である HLA - AB 丽 Cクラス 11分子である HLA- DR、 CD80および CD86が細胞表面に発現されている請求項 1 5記載のランゲルハンス細 胞。
1 7. ヒト末梢血単核球由来である、 E-カドヘリン、 ランゲリン、 CCR6、 MHC クラス I分子である HLA_AB (：、 匪 Cクラス II分子である HLA- DR、 CD80および CD86が 表面に発現されているランゲルハンス細胞。 ·
18. 未成熟細胞である、 請求項 1 5から 1 7のいずれか 1項に記載のランゲ ルハンス細胞。
1 9. 成熟細胞である、 請求項 1 5から 1 7のいずれか 1項に記載のランゲル ハンス細胞。
20. 請求項 14から 1 9のいずれか 1項に記載のランゲルハンス細胞を含む 医薬組成物。
2 1. 癌または感染症治療薬である請求項 20記載の医薬組成物。
22. ランゲルハンス細胞が成熟細胞である、 請求項 2 1記載の医薬組成物。
23. 細胞、 臓器または組織移植に伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主 病の治療、 自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療に用いられる、 請求項 2 0記載の医薬組成物。
24. ランゲルハンス細胞が未成熟細胞である、 請求項 23記載の医薬組成物。
2 5. ヒトから採取した末梢血単核球を、 ノッチリガンド、 GM - CSFおよび TGF- iSの存在下で培養することを含む、 癌または感染症治療用ランゲルハンス細胞の 調製方法。
2 6. ヒトから採取した末梢血単核球を、 ノッチリガンド、 GM - CSFおよび TGF- j8の存在下で培養することを含む、 癌、 感染症、 細胞、 臓器もしくは組織移植に 伴う移植片拒絶反応の抑制、 移植片対宿主病の治療、 自己免疫疾患またはアレル ギー性疾患の治療用ランゲルハンス細胞の調製方法。
2 7. ノッチリガンドが、 Delta— 1、 Delta- 2、 Delta— 3、 Delta - 4、 Jagged - 1お よび Jagged-2からなる群から選択される請求項 2 5または 2 6に記載の治療用ラ ンゲルハンス細胞の調製方法。
2 8. ノッチリガンドが Delta- 1である請求項 2 7記載の治療用ランゲルハン ス細胞の調製方法。
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