WO2005000861A1 - 糖鎖の合成方法 - Google Patents

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WO2005000861A1
WO2005000861A1 PCT/JP2004/009523 JP2004009523W WO2005000861A1 WO 2005000861 A1 WO2005000861 A1 WO 2005000861A1 JP 2004009523 W JP2004009523 W JP 2004009523W WO 2005000861 A1 WO2005000861 A1 WO 2005000861A1
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reaction
solid
phenyl
group
sugar chain
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PCT/JP2004/009523
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Osamu Kanie
Original Assignee
Mitsubishi Chemical Corporation
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
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    • C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
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    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages

Definitions

  • Boons et al. A synthetic method using the double bond isomerization of aryluvul for the synthesis of sugar chains was used to synthesize a trisaccharide library by Boons et al., Demonstrating the potential for the future.
  • a solution reaction was used, and a library in which the sugar binding position was determined by the sprit and mix method was successfully obtained (Boons, G. -J., Heskamp, ⁇ ⁇ , Hout, F. (1996). Engl. 35, 2845-2847) 0 Boons et al.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently chemically synthesizing biomolecules represented by nucleotides (nucleic acids), peptides (proteins), and sugar chains.
  • an object of the present invention is to provide a method which is the basis of a sugar chain synthesis apparatus without a commercially available synthesis apparatus.
  • the present inventors have diligently studied to solve the above-mentioned problems, and firstly, synthesize various types of monosaccharide units capable of synthesizing sugar chains and further improving the efficiency of combinatorial chemistry of sugar chains. did. Next, focusing on controlling the temperature rise rate of the reaction system when performing solid-phase sugar chain synthesis in which multiple types of sugar chains are synthesized using multiple types of synthesized monosaccharide units, It was found that sugar chains can be efficiently synthesized by changing the temperature in accordance with the rate of temperature increase determined using the reduction of side reactions in the reaction system as an index. Furthermore, the present inventors have found that stirring in the solid-phase synthesis of biomolecules such as sugar chains, etc. It has been found that solid-phase synthesis of sugar chains can be performed efficiently by performing a reaction controlled by diffusion without using this process. The present invention has been completed based on these findings.
  • a sugar chain solid phase synthesis method for synthesizing a plurality of types of sugar chains in at least one or more types of sugar chain synthesis reaction systems including a plurality of types of monosaccharide units
  • the temperature of the sugar chain synthesis reaction system is controlled by the reaction system
  • a method for solid-phase synthesis of a sugar chain characterized in that the sugar chain is changed in accordance with a heating rate determined using an index to reduce side reactions in the sugar chain.
  • L represents a linker one
  • O represents an oxygen atom of the non-reducing end monosaccharide
  • a 1 is a single hydroxyl group which does not participate in the reaction are protected by protecting group X represents a sugar skeleton, and X represents a leaving group that is stable under the conditions for activating the leaving group Y.
  • a 2 represents a monosaccharide skeleton in which a hydroxyl group not involved in exchange is protected with a protecting group
  • Y represents a leaving group that is stable under the conditions for activating the leaving group X.
  • a 3 represents a monosaccharide skeleton in which a hydroxyl group not involved in the reaction is protected by a protecting group
  • X ′ represents a leaving group or a hydroxyl group at position 1 that is stable under the conditions for the activation of the leaving group Y. Represents a group.
  • a step of obtaining a saccharide is a step of obtaining a saccharide.
  • step (b) a sugar chain in which three sugars are linked is synthesized using a monosaccharide unit of the formula (4) wherein X ′ is a hydroxyl group or a protecting group at position 1.
  • X ′ is a hydroxyl group or a protecting group at position 1.
  • the leaving group X is one of a phenylthio group and a fluorine group
  • the leaving group Y is a phenylthio group X is the other of the fluorine groups, according to any one of (2) to (5).
  • N-phospho succinimido trifluoromethane sulfonic acid N-phospho succinimido trifluoromethane sulfonic acid
  • DMTST dimethyl methyl thiosulfonium triflate
  • the monosaccharide skeleton represented by A 1 , A 2 and A 3 is a monosaccharide skeleton of three kinds of sugars selected from monosaccharides existing in a living body, according to any one of (2) to (8). Method for solid-phase synthesis of sugar chains.
  • (10) monosaccharide backbone indicated by A ⁇ A 2 ⁇ Pi A 3 is a mannose, glucose, galactose, xylylene toast, Darukosamin, galactosamine, a monosaccharide backbone of glucuronic acid, fructose or sialic acid, (2) The method for solid-phase synthesis of a sugar chain according to any one of (1) to (9).
  • (18) 3 selected from monosaccharides present in a living body, synthesized by the solid-phase sugar chain synthesis method according to any one of (1) to (10) or the solid-phase reaction method according to (17).
  • Monosaccharides present in living organisms are mannose, glucose, galactose,
  • reaction section for performing a solid-phase reaction, having an introduction section for injecting or sucking a liquid phase and having a space for containing a solid;
  • FIG. 1 shows an outline of the orthogonal method used in the present invention.
  • FIG. 2 shows a monosaccharide derivative library used in the present invention.
  • Figure 3 shows the pores of the resin beads.
  • FIG. 4 shows the solid-phase reaction method according to the conventional method and the diffusion-mixing solid-state reaction method according to the present invention.
  • Figure 5 shows a Anoma isomers are two 3.
  • Figure 6 shows the glycosylation reaction by activating glycosyl fluoride on the solid phase, from -15 ° C to 10 in 3 hours.
  • the results of MALDI-T0FMS analysis when the temperature was raised to C (8.3 ° CZ time) are shown.
  • Figure 8 shows that in the glycosylation reaction by activating glycosyl fluoride on the solid phase, the temperature was raised from -15 ° C to 10 ° C in 6 hours (4.2 ° C / hour). The following shows the results of MALDI-T0FMS analysis.
  • Figure 11 shows the results of a glycosylation reaction by thioglycoside activation on a solid phase, in which the temperature was raised from -15 ° C to 10 ° C (2.1 ° CZ time) in 12 hours.
  • the results of MALDI-T0FMS analysis are shown.
  • FIG. 12 shows the results of tracing the glycosylation reaction by swelling the donor-bound resin with the acceptor solution and adding the promoter.
  • FIG. 13 shows the results of tracing when the glycosylation reaction was carried out by swelling the donor-bound resin with a mixture of the acceptor and the promoter.
  • Figure 14 shows 2,3-di-benzyl-L-fucoviranosyl- (1 ⁇
  • Figure 15 shows that 2,3-di- ⁇ benzyl-L-fucoviranosyl- (1 ⁇
  • Figure 16 shows 2,3-di-benzyl-L-fucoviranosyl- (1 ⁇
  • FIG. 18 shows MALDI-T0FMS of a trisaccharide derivative synthesized on a solid phase.
  • FIG. 19 shows MALDI-TOFMS of a trisaccharide derivative synthesized on a solid phase.
  • FIG. 20 shows MALDI-T0FMS of a trisaccharide derivative synthesized on a solid phase.
  • FIG. 21 shows MALDI-TOFMS of a trisaccharide derivative synthesized on a solid phase.
  • FIG. 22 shows MALDI-TOFMS of a trisaccharide derivative synthesized on a solid phase.
  • FIG. 23 shows MALDI-TOFMS of a trisaccharide derivative synthesized on a solid phase.
  • FIG. 24 shows MALDI-TOFMS of a trisaccharide derivative synthesized on a solid phase.
  • FIG. 25 shows MALDI-TOFMS of a trisaccharide derivative synthesized on a solid phase.
  • the sugar chain solid phase synthesis method of the present invention is a sugar chain solid phase synthesis method for synthesizing a plurality of types of sugar chains in at least one or more types of sugar chain synthesis reaction systems containing a plurality of types of monosaccharide units.
  • the method is characterized in that the temperature of the system is changed in accordance with a heating rate determined using the reduction of side reactions in the reaction system as an index.
  • the present inventors have conducted intensive studies on these problems, and as a result, have found that they contain multiple types of monosaccharide units.
  • the temperature of these reaction systems should be reduced to reduce side reactions in the reaction system. It was found that if the temperature was changed in accordance with the temperature rise rate determined using as an index, the sugar chain solid-phase synthesis reaction could be performed efficiently without having to consider the optimal reaction temperature for each monosaccharide unit. That is, it was found that by changing the reaction temperature, the monosaccharide units contained in each reaction system reacted at the time when they reached the respective optimum temperatures, and a sugar chain synthesis reaction was performed. Further, as a result of further studies by the present inventors, it is apparent that the sugar chain solid-phase synthesis reaction can be performed more efficiently if the rate of temperature increase is determined as an index to reduce side reactions in the reaction system. Became.
  • the sugar chain solid-phase synthesis method of the present invention which has been completed by intensive efforts, efficiently synthesizes various types of sugar chains without having to consider the reaction temperature of the sugar chain solid-phase synthesis reaction, which has been a major problem in the past. It has a great effect that it can be performed.
  • the sugar chain synthesis reaction itself performed in the present invention can be carried out by a method known to those skilled in the art. Specifically, the first monosaccharide unit bound to the solid phase is placed in a suitable solvent inert to the reaction. By sequentially adding and reacting a solution containing the second monosaccharide unit, a solution containing the third monosaccharide unit, and, if desired, a solution containing the subsequent monosaccharide unit, these monosaccharide units are respectively added. They can be combined in order.
  • the term “sugar chain” simply refers to a chain formed by combining two or more monosaccharides.
  • the kind of the plurality of monosaccharide units used in the present invention is not particularly limited as long as it is a monosaccharide, but preferably includes a monosaccharide skeleton selected from monosaccharides present in a living body. Particularly preferred monosaccharide skeletons are those of mannose, glucose, galactose, xylitol, darcosamine, galactosamine, glucuronic acid, fructose or sialic acid.
  • a plurality of types of sugar chains are synthesized in at least one or more sugar chain synthesis reaction systems by using a plurality of these monosaccharide units.
  • the sugar chain synthesis reaction system may be one reaction system or two or more reaction systems.
  • one or more monosaccharide units are combined.
  • One or more solutions containing a monosaccharide unit are added to one reaction system containing a solid phase, and a sugar chain synthesis reaction is performed to synthesize a sugar chain composed of two monosaccharides.
  • one or more solutions containing a monosaccharide unit are added to the reaction system, and the following sugar chain synthesis reaction is performed to synthesize a sugar chain composed of three monosaccharides. .
  • a sugar chain having a desired length can be synthesized.
  • This reaction product is further divided into halves, and a solution containing a different monosaccharide unit (for example, Z 1 and Z 2) is added to each reaction system, and a sugar chain synthesis reaction is performed to obtain three monosaccharides. Can be synthesized.
  • a solution containing a different monosaccharide unit for example, Z 1 and Z 2
  • a sugar chain synthesis reaction is performed to obtain three monosaccharides.
  • Can be synthesized thereby, in each reaction system, eight kinds of reaction products of all combinations of XI, X2, Yl, ⁇ 2, Zl, ⁇ 2 can be obtained. Since there is no need to separate and purify the target sugar chain after the reaction, the method of performing the reaction in the plurality of reaction systems is preferably used in the present invention. For example, to synthesize eight types of sugar chains as described above, four reaction systems are prepared in advance for the first reaction, and eight reaction systems are prepared in advance for the second reaction. I'll do it.
  • One of the features of the present invention is that the temperature of the above-mentioned sugar chain synthesis reaction system is changed in accordance with the temperature increase rate determined using the index of reducing the side reaction in the reaction system as an index. As shown in the examples of the present specification, it was found that when the rate of temperature rise was increased, by-products were generated, and the reaction efficiency of the sugar chain synthesis reaction was reduced. Therefore, in the present invention, the sugar content is determined in accordance with the temperature increase rate determined using as an index that the side reaction in the reaction system is reduced as much as possible. By changing the temperature of the chain synthesis reaction system, an efficient sugar chain synthesis reaction can be performed.
  • the side reaction means a reaction that generates a by-product that hinders the reaction efficiency of a desired sugar chain synthesis reaction.
  • the by-product includes, for example, an elimination reaction product (elimination product), hydrolysis, and the like. Means things, etc.
  • the elimination product is, for example, a glycal or the like generated by an intramolecular reaction in place of a glycosylation reaction which is a target bimolecular reaction. That is, in the present invention, the phrase "to reduce the side reaction as an index" means, for example, "to make the index that the presence or amount of by-products is low enough not to inhibit the target reaction". I do. In particular, it is preferable that the amount of the desorbed substance is sufficiently low.
  • reaction efficiency is poor and many unreacted substances remain, it is more preferable to reduce the unreacted substances as an index.
  • the presence or amount of by-products can be detected and confirmed by, for example, mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), high performance liquid chromatography (HPLC), absorbance measurement, optical rotation measurement, etc. it can.
  • the rate of temperature rise and the reaction start temperature are appropriately set depending on the monosaccharide and leaving group used. If the reaction temperature is high, the side reaction tends to proceed, but if the reaction start temperature or the rate of temperature rise is too low, the reaction time will be long.
  • the leaving group is a fluorine group or phenyl.
  • the monosaccharide unit having a thio group is reacted with another monosaccharide unit having a hydroxyl group under the activation condition of a fluorine group or a phenylthio group.
  • the rate of temperature rise is, for example, 8 ° CZ hours or less, preferably 7 ° C / hour or less, and more preferably 5.6 ° CZ hours or less.
  • the preferable range of the rate of temperature rise differs depending on the leaving group and the monosaccharide used, and thus may be determined by conducting appropriate confirmation experiments.
  • the reaction initiation temperature varies depending on the monosaccharide unit used, but is set according to the most reactive monosaccharide that is likely to cause side reactions among the monosaccharides present in the system, and the temperature is raised from that temperature. Just do it.
  • the temperature is 130 ° ( : It can be started from about 15 ° C. In this way, by setting the heating rate and the reaction start temperature suitable for each monosaccharide, the side reaction can be reduced as much as possible, The chain synthesis reaction can be performed with high efficiency.
  • Sugar chains are regarded as the third biopolymer after nucleic acids and proteins, and play a very important role in the biological functions of multicellular organisms such as cell differentiation, immunity, canceration, and infectious diseases.
  • Chemical synthesis equipment for nucleic acids and proteins has been sold, and it has greatly contributed to the advancement of science. However, chemical synthesis equipment for sugar chains has not been sold and hopes for early development. J., Palmacci, ER, Seeberger, PH (2001) Science, 291: 1523-1527].
  • Solid-phase synthesis is the basis of chemical synthesis, and it is necessary to perform elementary reactions and increase the efficiency of the overall process as a pre-stage for instrumentation. In order to achieve this object, the sugar chain solid phase synthesis method of the present invention is very useful.
  • the sugar chain synthesis reaction itself can use a known method, and among them, orthogonal methods based on independence of reactivity (mutual selectivity) are preferable.
  • the Glycosylic method (hereinafter sometimes referred to as the “orthogonal method”) is an optimal method.
  • a 2 represents a monosaccharide skeleton in which a hydroxyl group that does not participate in the reaction is protected by a protecting group, and Y represents a leaving group that is stable under the conditions for activating the leaving group X.
  • a 3 represents a monosaccharide skeleton in which a hydroxyl group not involved in the reaction is protected with a protecting group
  • X ′ represents a leaving group or a hydroxyl group or a protecting group at the 1-position which is stable under the activating condition of the leaving group Y. Represents a group.
  • the orthogonal method utilizes the properties of the leaving group of the two types (X and Y described above) that have different activation conditions from each other and are stable under the other activation conditions, as described above. It is a continuous and efficient synthesis method. In this specification, These two types of leaving groups are said to be "orthogonally related.”
  • the saccharide of the formula (5) obtained in the step (b) is subjected to the reaction of the step (a), By repeating the reaction (b), a sugar chain having a desired length can be synthesized.
  • Solid phase represented by P may be any of those generally used for solid-phase synthesis of sugar chains, and include various resins such as polystyrene resin, polyacrylamide resin, polyether resin, and the like. And porous glass, beads, microchannels (fused silica cavities, microchips, etc.), Sepharose and the like. Each of these has a functional group such as an amino group, a bromomethyl group, a hydroxyl group, a thiol group, a carboxyl group, etc., which serves as a scaffold for linking a linker, a spacer or the like during solid phase synthesis. Further, those having an appropriate side chain, modification, or the like may be used.
  • linker represented by L is a group capable of linking the solid phase to the oxygen atom at the non-reducing end of the monosaccharide under mild conditions that do not affect the product after the synthesis reaction. Any material can be used as long as it can be selectively cut out.
  • the solid phase indicated by P The linker indicated by L is more specifically described, for example, in Kanemitsu, T. and Kanie, 0., Combinatorial Chemistry & Hign Througnput screening, 5, 339-360 (2002). Appropriate ones can be selected and used from the solid phase linkers generally used for the sugar chain synthesis reaction described above.
  • AA 2 and A 3 each represent a monosaccharide skeleton in which a hydroxyl group not involved in the reaction is protected by a protecting group, and these may be the same or different. Specific examples of the monosaccharide skeleton are as described above.
  • the hydroxyl-protecting group is not particularly limited as long as it can protect the hydroxyl group during the sugar chain synthesis reaction, and a hydroxyl-protecting group known to those skilled in the field of organic synthesis can be appropriately used. Specific examples of the hydroxyl-protecting group include the following: No.
  • (Ether type) methyl group methoxymethyl group, methylthiomethyl group, benzyloxymethyl group, t-butoxymethyl group, 2-methoxyethoxymethyl group, 2,2,2-trichloroethoxymethyl group, bis (2 —Cross ethoxy) Methyl group, 2 — '(trimethylsilyl) ethoxymethyl group, tetrahydrobilanyl group, 3 —bromotetrahydroviranyl group, tetrahydrothiopyrani group, 4-methoxytetrahydroviranyl group, 4-methoxytetrahydrothiolane Pyranyl group, 4-methoxytetrahydrothiolanyl S, S-dioxide group, tetrahydrofuranyl group, tetrahydrothiofurayl group;
  • Methinocarbonate, ethynolecarbonate, 2,2,2-trichloroethynolecarbonate, isobutycarbonate, bi: ⁇ recarbonate, arinolecarbonate, cinnamami / recapone, nitronitrophenol Carbonate, benzinolecarbonate, ⁇ -methoxybenzinorecarbonate, 3,4-dimethoxybenzene / recarbonate, ⁇ -nitrobenzinorecarbonate, ⁇ -nitrobenzinorecarbonate, S-benzylthiocarbonate;
  • a benzyl group can be particularly preferably used.
  • the leaving group X (and X ') is one of an arylthio group or an arylseleno group or a fluorine group
  • the leaving group ⁇ is an arylaryl group or an arylseleno group, or the other of the fluorine groups
  • the aryl (Ar) moiety in the arylthio group (-S-Ar) or arylseleno group (-Se-Ar) is not particularly limited as long as it satisfies the activation conditions, but is preferably aryl having 6 or more carbon atoms. , Phenyl or naphthalene; and phenyl is most preferred.
  • the case of (1) is particularly preferable, in which the activation of the phenylthio group is carried out by N-phospho succinimidyl trifluoromethanesulfonic acid (NI ST f OH) or dimethyl methyl thiol.
  • Sulfonium triflate (DM TST) can be used.
  • An activator combining NIS and TfOH hereinafter sometimes referred to as a “promoter”) reacts to generate rhododium ions (1+) in the system.
  • Other combinations of reagents can also be used as the activator, as long as the combination is activated and can generate odonium ions with high efficiency.
  • DMTST can be added as it is as an activator, for example, by adding Me S SMe (dimethyl disulfide) and Me OTf (methyl trifluoromethane sulfonate (methyl triflate)). Can generate DMTST in the system.
  • Me S SMe dimethyl disulfide
  • Me OTf methyl trifluoromethane sulfonate (methyl triflate)
  • Sn (C 10 4) 2 is S n C 1 2 (stannous chloride) ⁇ Pi A gC 10 4 a (perchlorate), S n (OT f) 2 is SnC 1 2 ⁇ Pi Agot f (Silver triflate), Cp 2 Hf. (C 10 4) 2 is C p 2 H f C 1 2 ( hafnocene (II) chloride) ⁇ Phi AgC l O 4, Cp 2 Hf (OT f) 2 is Cp 2 H by adding f C 1 2 and Agot f, is generated in each system can be activated by.
  • the sugar chain bound to the solid phase (P) thus synthesized can be obtained by washing the solid phase with an appropriate solvent as necessary and cleaving the solid phase with an appropriate compound such as sodium methoxide. it can.
  • X arylthio group
  • Y fluorine group
  • Sn (C 10 4) 2 the Sn (OT f) 2, C p 2 H f (CI 0 4) 2, or Cp 2 Hf (OT f) 2, etc.
  • Sn and Y can be activated in any order.
  • synthesis is performed in a direction opposite to that of biosynthesis, and proceeds from a non-reducing end to a reducing end.
  • the coupling product already has a leaving group for the next reaction, and thus has an advantage that the shortest number of steps in sugar chain synthesis can be achieved.
  • the effectiveness of the above orthogonal method can be further enhanced by applying it to the sugar chain solid phase synthesis method of the present invention. That is, comparing the method of synthesis from the non-reducing end (Method A) with the method of proceeding with synthesis from the reducing end (Method B), in Method B, the functional group (hydroxyl group) derived from the unreacted product in the coupling reaction Must be protected, so one cycle consists of three steps: coupling, cabling, and deprotection. On the other hand, in method A, by-products (hydrolysates and elimination reaction products) accumulate on the solid phase for each coupling reaction, but they do not react under the next coupling reaction conditions, so that cabling is necessary.
  • a stereoisomer ( ⁇ /] 3) is generated in a coupling reaction in the synthesis of a sugar chain, but a general synthesis method is to selectively synthesize a target stereoisomer.
  • a general synthesis method is to selectively synthesize a target stereoisomer.
  • it is necessary to perform stereoselective coupling.
  • the presence of a protecting group as a control factor not only doubles the number of required monosaccharide units, but also doubles the number of reaction steps required for the synthesis of such derivatives and can be used to complicate the molecule. It also limits the type of reaction.
  • the monosaccharide unit contained in the library include, for example, the sugar chain solid-phase synthesis method of the present invention, particularly, the method combining the orthogonal method. It is desirable that a phenylthio group be used as X, a fluorine group be used as Y, and all hydroxyl groups not participating in the reaction be benzyl groups. Further, since X and Y have an orthogonal relationship, it is desirable to synthesize a more stable thiothioglycoside form and convert it to a fluoride form as needed.
  • the protecting group to be used is preferably an alkyl group which does not involve an adjacent group, and most preferably a benzyl group generally used in an organic synthesis reaction. In the case of 2-amino sugars, it is desirable to provide 2-azido sugars using an azide group that does not show adjacent group involvement.
  • sialic acid, dalcuronic acid, and fucose which are present only at the non-reducing end except for polysaccharides in human sugar chains, are solid phase. It is sufficient to synthesize a derivative in which only the hydroxyl group at the position to be retained at the position is released.
  • monosaccharides that is, glucose, galactose, mannose, xylose, dalcosamine, and galactosamine
  • derivatives in which only the hydroxyl group of each monosaccharide is free can be synthesized.
  • the hydroxyl groups of sialic acid, dalcuronic acid and fucose can also be distinguished from each other similarly to other monosaccharide derivatives.
  • FIG. 2 shows an example of a monosaccharide unit (a phenylthiodalicoside) designed by the present inventors and utilized in the solid-phase synthesis of a sugar chain in combination with the orthogonal method of the present invention.
  • the monosaccharide library containing is useful as a monosaccharide library for performing the bran chain solid-phase synthesis method of the present invention described in the above (1).
  • the monosaccharide unit shown in Fig. 2 is a monosaccharide unit that is indispensable for constructing a sugar chain and a sugar chain library containing it using a chemical synthesis method for nine types of monosaccharides that constitute the sugar chains present in the living body. It is.
  • Gal-2-0H Marzabadi, CH; Spilling, CD. (1993). Org. Chem. 58, 3761-6.
  • Gal-3-0H Kanie, 0 .; Ito, Y .; Ogawa, T. (1996) Tetrahedron Lett. 37, 4551-4554.
  • Gal-4-0H Greenberg, WA; Priestley, ES; Sears, PS; Alper, PB; Rosenbohm, C .; Hendrix, M .; Hung, S.-C .; Wong, C.-H. (1999) J. Am. Chem. Soc. 121, 6527-6541.
  • Gal—6-OH Magaud, D .; Gran jean, C .; Doutheau, A .; Anker, D .; Shevchik, V .; Cotte-Pattat, N .; Robert-Baudouy, J. (1998) Carbohydr. Res. 314, 189-199.
  • Glc-2-OH Ennis, SC; Cumpstey, I .; Fairbanks, AJ; Butters, TD; Mackeen, M .; Wormald, MR (2002) Tetrahedron 58, 9403-9411.
  • Glc-4-0H Motawia, MS; 01 sen, C. E .; Enevoldsen, K .; Marcuss en, J .; Moeller, B. L. (1995) Carbohydr. Res. 277, 109-23.
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  • GlcN-6-OH Takahashi, S .; Kuzuhara, H .; Nakajima, M. (2001) Tetrahedron 57, 6915-6926.
  • the present invention further provides a method of performing a solid-phase reaction in a solid pore having a size causing a capillary phenomenon, wherein the reaction is performed in a state where no excess liquid phase exists on the outer surface of the solid. About the method.
  • Solid phase synthesis is an essential synthetic technique for the synthesis of polymeric biomolecules such as nucleotides, peptides, sugar chains, and the like. It is also the basis of combinatorial chemistry, which has recently attracted attention as a method for rapidly synthesizing drug-lid compounds.
  • the advantage of solid-phase synthesis is that in the ordinary solution reaction, the reaction process required for each reaction step and the subsequent column chromatography operation are replaced with washing operations, thereby simplifying the reaction process and consequently simplifying the reaction process. A reduction in working time is achieved.
  • the resin is an inorganic or organic polymer, and the actual reaction site is internal pores (Figure 3).
  • the pores provide a large surface area and become a reaction site, but the movement of molecules in these pores is by diffusion.
  • the solid-phase synthesis reaction is an extension of the solution reaction in which the resin is swollen in an excess amount of solvent, and the reaction is stirred, shaken, or fed.
  • Figure 4 “Conventional method”. For example, one of the reactants is maintained on a solid phase and the other reactant is provided as a solution (liquid phase).
  • the amount of the solvent in the liquid phase is excessive with respect to the amount necessary for the resin to swell. Migration by diffusion into the pores is required. Furthermore, the reactants provided as a liquid phase are uniform, and the movement of molecules in the pores is by diffusion, so that external physical forces such as stirring cannot be reached. In the conventional method, it was considered that these reduced the reaction efficiency of the solid-phase reaction. Therefore, the present inventors have concluded that the actual reaction field of the solid-phase reaction is pores, as described above, so that the reaction is considered to be governed by diffusion. Since the diffusion of the reactants into the reaction zone is also governed by the diffusion, an excessive amount of the liquid phase is considered to decrease the reaction efficiency.
  • the present inventors have found that in a method of performing a solid-phase reaction in a solid pore having a size that causes a capillary phenomenon, the reaction is carried out in a state where there is no excess liquid on the outer surface of the solid.
  • the solid-phase reaction method of the present invention characterized in that the solid-phase reaction was performed, was established.
  • the method is further characterized in that the reaction is performed only by diffusion mixing without requiring external force such as stirring and shaking.
  • the solid phase reaction by diffusion mixing in the present invention is a principle of the solid phase reaction, and is applicable to any reaction on a solid phase without being limited to a sugar-related reaction.
  • the solid-phase reaction method by diffusion mixing described above can be preferably applied to a chemical reaction or a biochemical reaction. Specific examples include a sugar chain synthesis reaction, a peptide synthesis reaction, a nucleic acid synthesis reaction, a synthesis reaction of analogs and complexes thereof, an organic chemical synthesis reaction, an enzyme reaction, and the like, and more preferably a sugar chain synthesis reaction. And particularly preferably to the sugar chain solid phase synthesis reaction of the present invention described in the above (1).
  • a reaction in which a first monosaccharide bonded to a solid phase is reacted with a second monosaccharide to bind the first monosaccharide is carried out by adding a liquid phase containing the second monosaccharide to the bound solid phase and reacting with the solid phase.
  • the first substance involved in the reaction is previously bound to the solid phase, and the second substance to be reacted therewith is placed on the solid phase.
  • the reaction may be performed by adding a liquid phase containing the mixture.
  • the solid used as the solid phase in the present invention may be any solid that has pores sized to cause a capillary phenomenon therein, and can perform the solid phase reaction as described above in the pores. obtain.
  • the solid is, for example, when performing a sugar chain solid phase synthesis method, It preferably has some functional group on its surface, and further has a linker capable of binding to a substrate involved in the reaction to this functional group.
  • As the functional group linker those described in detail in the sugar chain solid phase synthesis method (1) can be used.
  • the solid material those described in detail in the sugar chain solid-phase synthesis method (1) can be used, and specific examples thereof include resin, silica, and glass (porous glass).
  • the resin examples include polystyrene, TG (TentaGel (Novabiochem Chido)), PEGA (Aery 1 amide-PEG Co-polymer (Novabiochem)) and the like, and these have appropriate pores inside. It is possible to use the one molded in ⁇ ⁇ . The size of the pores existing inside these may be a size that causes a capillary phenomenon, but an appropriate one may be selected and used in consideration of the reaction, solvent, and the like to be applied.
  • the size and shape of the solid may be appropriately selected according to the reaction vessel and apparatus used.
  • resin and silica molded into various shapes are commercially available.
  • resin beads molded into beads (granular) are preferably used because they are easy to handle.
  • the particle size is about 1 to 1000 ⁇ m.
  • irregular-shaped ones can also be used.
  • Those having various particle diameters and fine pore diameters are commercially available, and those suitable for the intended reaction may be selected and used. An example is shown in Table 1 below.
  • a solid having a monolith structure can also be preferably used.
  • Monolith is a word that has the meaning of seamless, monolithic, etc., and refers to a continuum composed of a single material with a certain texture.
  • the silica skeleton and voids have a continuous structure in one object. Due to such a structure, the monolithic silica has a higher porosity than, for example, those filled with true spherical particles, and has a large number of through-holes due to its continuous structure. Suitable for the method.
  • Other materials, such as polystyrene monolith can form a solid having a monolith structure. Such a material also has a shape suitable for the reaction vessel and equipment used. The size can be selected and used in the present invention.
  • an object having artificially formed pores can also be used.
  • those having a flow path or the like artificially formed to have the same effect as the above-described pores can be used in the same manner.
  • a microchannel structure hereinafter, sometimes referred to as a “microchannel”
  • a chip provided with these, and the like can be used.
  • the microchannel means a channel having a cross-sectional shape in which a micro-mouth effect appears when a liquid is introduced into a channel (flow path), that is, a change in behavior occurs in the liquid.
  • these micro-effects those which cause at least a capillary phenomenon are used.
  • the appearance of the micro effect depends on the physical properties of the solvent used as the liquid phase, but it is the shortest of the cross-sectional shapes, that is, the shape of the surface perpendicular to the main flow direction of the channel. It is appropriate that the length is usually 5 mm or less, preferably 500 / m or less, more preferably 200 / im or less.
  • the lower limit of this length is not particularly limited, as long as it has a function as a microchannel.
  • the chip means a member of a portion including the flow channel structure.
  • a microchip means a chip having a microchannel structure including the microchannels.
  • the size and shape of the chip are not particularly limited, can be arbitrarily set according to the intended use, and can be manufactured by a known method which is known per se.
  • the solid used in the present invention is preferably a solid having a large void due to pores present inside the solid, that is, a solid having a high porosity.
  • a solid having a high porosity In particular, those having a small pore diameter and a high porosity are preferable.
  • the reaction is carried out on the solid surface in the pores. Therefore, if the pore diameter is constant, generally, the higher the porosity and the larger the surface area, the higher the reaction efficiency.
  • performing the reaction in a state where no excess liquid phase exists on the outer surface of the liquid does not necessarily mean that there is no liquid phase at all, and it is only necessary to use an excess or excess amount of the liquid phase. Is unnecessary, since the reaction efficiency is reduced. Means that In other words, as long as the desired reaction efficiency is sufficiently achieved, some excess liquid phase may be present, and diffusion without applying external force such as stirring, shaking, and continuous liquid sending. Include all products that can be efficiently reacted only by mixing.
  • the liquid phase needs at least a small amount of liquid to fill the pores to such an extent that diffusion in the pores can sufficiently occur. That is, if the amount is too small or too large, the reaction efficiency decreases and the solvent is wasted. Therefore, it is preferable to use a necessary and minimum liquid phase. Theoretically, it is most efficient to carry out the reaction with the maximum liquid volume that just fills the solid pores.
  • the maximum liquid volume that the solid pores are likely to fill is, for example, for a solid that does not swell even when a liquid phase is added such as silica beads / silica monolith, the amount of pore pores present in the solid ( Hereinafter, this may be referred to as “void volume”).
  • the void amount can be determined by a commonly used measurement method known per se.
  • the required liquid volume (hereinafter referred to as the “swelling liquid volume”) is determined by the following method. May be simply determined. For the former solid that does not swell, the amount of voids determined by measurement or calculation may not always match the actual required liquid volume. Is preferred.
  • the amount of liquid required to swell the resin can be determined with reference to Table 1 below, Bayer, E. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1991) 30, 113. However, it can be easily confirmed experimentally as follows.
  • the amount of the solvent at this time may be determined as the amount of the solvent used for the reaction.
  • the resin beads are weighed into a suitable experimental container such as a cylinder, and when the solvent is dropped therein, the resin beads gradually swell with the drop.
  • excess solvent more than necessary is merely superimposed on the resin bead layer. In this way, the amount of the swelling liquid (that is, the point at which the solvent is filled in the pores and no more swelling) can be easily confirmed experimentally.
  • the solid-phase reaction itself is carried out by a commonly used method known per se.
  • the reaction is carried out preferably without any external force such as stirring, shaking, continuous liquid feeding, or the like, and preferably standing still.
  • the reaction is performed by diffusion mixing. It is preferable to have a temperature control function, a liquid sending function, and the like as needed.
  • reaction vessel may be any as long as it can maintain a state in which diffusion mixing and the reaction itself are not hindered and can proceed sufficiently, and the desired reaction, solid phase and liquid phase to be used What is necessary is just to select what is suitable for the above. It is preferable to use a material that can be appropriately sealed for the purpose of preventing drying of the liquid phase. .
  • the reaction tank can be configured to be filled with these at an appropriate density.
  • a material having a structure capable of adding and recovering a liquid phase is used.
  • a structure similar to columns generally used for purification / separation of substances and the like can be mentioned (for example, FIG. 4 “Invention”).
  • the solid be accommodated in a reaction tank suitable for the size and shape of the solid.
  • the chip when an object having artificially formed pores, for example, a chip having a microchannel structure (microchannel) is used, the chip itself can be used as a reaction tank, The liquid phase only needs to have a structure that allows the liquid phase to flow into the established flow channel (channel) by capillary action and recover the liquid phase after the reaction.
  • the flow path of the chip having such a structure can be filled with the solid such as the above-mentioned bead or monolith structure, or the inner wall of the flow path can be coated.
  • the solid-phase sugar chain synthesis method according to the above (1) is a method for performing high-efficiency solid-phase synthesis of sugar chains by controlling the rate of temperature rise and changing the temperature of the reaction system.
  • the synthesis can be performed more efficiently.
  • a sugar chain library is to be constructed by combinatorial chemistry
  • a large number of reactions are run simultaneously
  • the reaction can be carried out only by allowing the sugar chain solid-phase synthesis method of the above (1) to stand in a small amount of liquid phase (equipment related to stirring, shaking, continuous liquid sending, etc. is unnecessary) It is very suitable to combine this solid-phase reaction method.
  • the desired sugar chain can be obtained by washing the thus obtained resin to which the sugar chain is bound with an appropriate solvent as described above and cutting out the sugar chain from the resin.
  • the solid-phase reaction method by diffusion mixing it is not necessary to perform physical mixing operations such as stirring and shaking in the solid-phase reaction. That is, the solid-phase reaction is achieved by entrusting the solid-phase reaction to the diffusion of molecules in the resin pores. As a result, the size of the reaction device can be reduced.
  • the reaction apparatus for performing the method of the present invention includes (i) a reaction tank, A device consisting of a temperature controller, a dispenser and a gas replacement device, or (ii) a device consisting of a reaction tank, a temperature controller, a flow path converter, and a liquid pump can be used.
  • a reactor for performing a solid-phase reaction by diffusion mixing comprising at least the following (1) and (2).
  • monosaccharide existing in the living body mannose, glucose, galactose, xylitol, dalcosamine, galactosamine, glucuronic acid, fructose or sialic acid can be preferably used.
  • the importance of the glycan library is expected to increase in the future, but its target is a trisaccharide library consisting of a combination of three arbitrarily selected 9 types of monosaccharides that exist in living organisms. Rally is desirable.
  • the sugar chain library obtained in this way can be used as a probe for direct function studies, used as a drug lead, or used as a library imitating sugar chains in vivo for screening of drugs, etc. Can also be used.
  • sugar chains in a living body are formed by linking 1 to 5 monosaccharides, and it is known that these are involved in complex recognition phenomena such as intercellular recognition in immune reactions and the recognition of viruses and bacteria.
  • the library of the present invention comprising a sugar chain composed of all combinations of three types of sugars selected from monosaccharides present in the living body, averages the sugar chains actually present in the living body of the human.
  • Useful as a simulated library There are 140,824 combinations of trisaccharides consisting of monosaccharides that exist in the nine kinds of living bodies, but the range covered by the library can be limited.
  • TLC is used Merk Art 5715 Silicagel 60 F254, detection UV absorption ⁇ Pi coloring reagent (10% 3 ⁇ 4S0 4 - Etanoru) in KoTsuta.
  • Merk Art 7734 Silicagel 60 70-230mesh was used. 3 ⁇ 4 and 13 C-thigh were measured with BUKER ACVANCE 500 using JEOL EX-270, and chemical shift values were expressed as ⁇ values (ppm) with respect to the internal standard (tetramethylsilane).
  • MALDI-T0FMAS was measured with Perseptive Voyger TM, and 2,5-dihydrobenzoic acid was used for the matrix.
  • FT-IR used H0RIBA FT720.
  • Man-2-0H, Man-3-0H, Man-4-0H and Man-6-OH see Kametani, T .; Kawamura, K .; Honda, T. (1987) J. Am. Chem. Soc. 109, 3010-17; Lemanski, G .; Ziegler, T. (2000) Tetrahedron 56, 563-579; Lemanski, G .; Ziegler, T. (2000) Helvetica Chim. Acta 83, 2655-2675; Oshitari, T .; Shibasaki, M .; Yoshiza a, T .; Tomita, M .; Takao, K .; Kobayashi, S.
  • Pheninole 4 benzylidene- 1 i-0-p-methoxybenzinole-1 -thio- ⁇ -D-gunoleco viranoside (2)
  • the calculation of the yield was determined by performing a cleavage reaction.
  • the resin (30.0 mg) was swollen with CH 2 C 12 (0.5 mL) and methanol (0.5 mL), 0.5 M sodium methoxide-methanol (0.1 mL) was added, and the mixture was left at room temperature for 2 hours.
  • Amberlite IR 120B + neutralized with suction filtration, concentrated under reduced pressure, and phenyl 2,3-di-benzyl-1-thio- ⁇ -L-fucoviranoside (3.0 mg, 6.9 / imol, 85%) Got.
  • DAST (26raL, 0. 19 ⁇ ol), BS (35mg, 0. 19mmol) was dissolved in C 2 H 4 C1 2 (1. 5mL), bound phenylene Lucio resin - L-Fukobiranoshido (300 mg, 35 mg : fuc) and left at -15 ° C for 1 hour, then raised to 0 ° C over 1 hour, and left at 0 ° C for 8 hours.
  • the progress of the reaction was determined by taking out a part of the resin, measuring it by IR, adding it to CH 2 C 12 (0.5 mL) and methanol (0.5 mL), and adding 0.5 M sodium methoxide (10 L) dropwise at room temperature.
  • Method 1 Method of swelling a resin bound with a donor with a mixture of an acceptor and a promoter
  • reaction times of Method 1 and Method 2 can be interpreted as the time required for the second and subsequent reactants to diffuse from the point of addition to the whole by adding the reactants in order. Based on the results of these experiments, it is recommended that all possible reagents should be added to the resin as a single solution, and the resin will saturate due to the nature of the solid-phase reaction that proceeds in the microchannel (pores inside the resin). If it is necessary to avoid mixing only the reactants, they can be added separately.
  • This solution portion was added to phenylthio-L-fucoviranoside (169 mg, 20 mg: Fuc) bound to the resin at 0 ° C., and left to stand for 12 hours.
  • the progress of the reaction was determined by taking out a part of the resin, measuring it by IR, adding it to CH 2 C 12 (0.5 mL) and methanol (0.5 mL), and adding 0.5 M NaOMe (10 ⁇ L) dropwise for 1 hour at room temperature. It was cut out from the solid phase by leaving it to stand, and this was observed by TLC and MALDI-T0FMS. After completion of the reaction, the resin was washed with CH 2 C 12 , methanol and CH 2 C 12 and dried under reduced pressure.
  • Phenyl 2,3,6-tri-0 to benzyl-1-thio- ⁇ -D-glucopyranoside (41.Omg, 0.074mmol) is dissolved in EtCN (0.45mL), MS4A (20mg) is added, and the mixture is placed under a nitrogen stream. The mixture was stirred at room temperature for 3 hours (Solution A). Separately AgOTf (57. Omg, 0.222 Yuzuru ol), under nitrogen flow was added to MS4A (20 mg) and CH 2 C1 2 (0.45mL), was stirred at room temperature for 3 hours, at 0 ° C Cp 2 HfCl 2 ( 42. Omg, 0.1 mmol) and stirred for 5 minutes (Solution B).
  • Example 1 nine major monosaccharides (Example 1) constituting an appropriately protected living body are essential for achieving the chemical synthesis of sugar chain riparies. Furthermore, steric control in daricosylation in sugar chain synthesis is a very difficult problem, and it is impossible to control all darikosylic reactions in library synthesis. Therefore, a stereo-nonselective methodology is suitable for the construction of a sugar chain library. For this reason, it is desirable that the 2-position of the protected monosaccharide be a substituent that does not involve adjacent air. In this example, the protected monosaccharide designed in this manner was synthesized as a stable thiodaricoside, and could be converted to glycosyl fluoride as needed.
  • a sugar chain library can be synthesized by using such a monosaccharide derivative and reacting in an arbitrary combination.
  • An appropriate solid phase synthesis method is required to perform library synthesis, and one of them is a solid phase synthesis method utilizing the solid phase reaction method by diffusion mixing of the present invention (Example 2).
  • the reactant is dissolved in a minimum amount of solvent necessary for swelling of the resin, which is a place for solid-phase reaction, and the resin is swelled with this solution, so that the inside of the pores, which is the place for the reaction, is formed. It was shown that the reaction was quickly introduced, and that the reaction proceeded based on the diffusion, so that it was released from the device by physical means such as stirring.
  • the orthogonal glycosylation method in the solid phase is a method for achieving the solid-phase synthesis of sugar chains in the shortest process.
  • the orthogonal dalicosylation reaction was carried out using the solid phase reaction method by diffusion, which was shown to be useful in Example 2, and good results were obtained.
  • the present invention provides a method for efficiently synthesizing a biomolecule represented by a nucleotide, a peptide, or a sugar chain.
  • a sugar chain solid phase synthesis method of the present invention capable of performing a solid phase synthesis of a sugar chain with high efficiency by controlling the temperature rise rate and changing the temperature of the reaction system; and a solid phase reaction using a small amount of solvent. Any solid phase reaction method by diffusion that can be performed efficiently is useful for the chemical synthesis of the biomolecule, and is particularly useful for combinatorial chemistry and the like. In addition, it is difficult to control the conventional synthesis, and it is particularly useful for synthesizing sugar chains without a commercially available synthesizer.

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Abstract

　本発明の目的は、ヌクレオチド（核酸）、ペプチド（タンパク質）、糖鎖に代表される生体分子を効率良く化学合成する方法を提供することである。本発明によれば、複数種の単糖ユニットを含む少なくとも１以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、該糖鎖合成反応系の温度を、反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることを特徴とする、糖鎖固相合成方法が提供される。

Description

明細書
糖鎖の合成方法 技術分野
本発明は、 重要な機能を有する生体成分の一群をなす糖鎖の化学合成、 特に糖 鎖の固相合成に関する。 背景技術
化学合成によるオリゴ糖鎖及ぴその複合体の合成が報告されている （Paulsen, H. (1982) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 21, 155—173； Toshima, K. , Tatsuta, K. (1993) Chem. Rev. 93, 1503- 1531；及ぴ Boons, G. - J. (1996) Tetrahedron, 52, 1095-1121)。 しかしながら、 現存の化学合成では、 操作が煩雑で時間を要する反 応後のクロマトグラフィ一による単離精製操作が必要不可欠であり、 操作に習熟 を要する（Kanie, 0. , Hindsgaul, 0. (1992) Curr. Opin. Struc. Biol. 2, 674-681) , その解決法の一つとして固相合成がある。 固相合成法はぺプチドゃヌクレオチド 合成でも使用され、 その有用性は高い。 オリゴ糖鎖の合成には、 カツプリング反 応に伴う立体選択的なグリコシド結合形成と位置選択的なグリコシル化を行うた めの保護基の巧みな使い分けが必要不可欠であり、 近年まで困難な課題と考えら れてきたが、これまでの研究の結果、幾つかの成功例が報告されている（Fr§chet， J. M. , Schuerch, C. (1972) Carbohydr. Res. 22, 399-412 ； Chiu, S. - H. L. , Anderson, L. (1976) Carbohydr. Res. 50, 227-238 ； Yan, L. , Taylor, C. M. , Goodnow, R. Jr. , Kahne, D. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 6953-6954； Redemann, J. , Schmidt, R. R. (1997) J. Org. Chem. 62, 3650-3653； Heckel, A.， Mross, E. , Jung, K. -H. , Rademann, J.， Schmidt, R. R. (1998) Synlett, 171—173； Nicolaou, K. C. , inssinger, N. , Pastor, J. , DeRoose, F. (1997) /. Am. Chem. Soc. 119， 449-450； Nicolaou, K. C. , Watanabe, N. , Li, J. , Pastor, J. , Wissinger, N. (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37, 1559-1561； Rodebaugh, R.， Joshi, S. , Fraser-Reid, B. , Geysen, H. M. (1997) J. Org. Chem. 62， 5660-5661 ； Danishefsky, S. J. , McClure, K. F. , Randolph, J. T. , Ruggeri, R. B. (1993) Science, 260, 1307-1309； Zheng, C. , Seeberger, P H. , Danishefsky, S. J. (1998) J. Org. Chem. 63, 1126 - 1130； Ito, Y. , Kanie, 0. , Oga a, T. (1996) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 2510-2512 ; Douglas, S. P. , Whitfield, D. M. , Krepinsky, J. J. (1995) J. Am. Chem. Soc. 117, 2116-2117； Verduyn, R.， van der Klein, P. A. M. , Dou es, M. , van der Marel, G. A. , van Boom, J. H. (1993) J. R. Neth. Chem. Soc. 112, 464-466； Shimizu, H. , Ito, Y. , Kanie, 0. ' Ogawa, T. (1996) Bioorg. Med. Chem. Lett. 6, 2841-2846； Adoinolfi, M.， Barone, G. , DeNapoli, L. , Ladonisi, A. , Piccialli, G. (1996) Tetrahedron Lett. 37， 5007-5010； Seberger, P. H. , Beebe, X.， Sukenick, G. D.， Pochapsky, S. , Danishefsky, S. J. (1997). Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 36, 491-493； Kanemitsu, T. , Kanie, . 0. , Wong, C.一 H. (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37, 3415—3418；及ぴ、 WO 0 2 / 1 6 3 8 4号公報)。
そのような多数の知見に基づいて、 糖鎖の合成を効率的に行うために有用と考 えられている糖鎖ライブラリーの合成も数多く行われてきている。 例えば、 Hindsgaulらは、 糖鎖化学の基礎を根底から見直し無保護の糖受容体に対する Bn 保護された糖供与体（イミデート）によるグリコシル化反応（ランダムグリコシル 化）を試し、その結果位置選択性の無レ、ランダムな縮合物混合物が容易に得られる ことを見出した。 この方法は単一化合 の合成を目的としていないが、 シークェ ンスは反応の順に従っている。 さらに、 与えられた混合物が糖転移酵素によりス クリーニングされ、特異的に既知反応をピックアップすることが示された（Kanie, 0. , Barresi, F.， Ding, Y.， Labbe, J. , Otter, A. , Forsberg, L. S. , Ernst, B. , Hindsgaul, 0. (1995) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, 2720— 2722；及ぴ Ding, Y. , Kanie, 0. , Labbe, J. , Palcic, M. M. , Ernst, B. , Hindsgaul, 0. "Synthesis and Biological Activity of Oligosaccharide Libraries" in Glycoimmunology, Eds. by Alavi, A.， Axford, J. S. , (1995) Avd. Exp. Med. Biol. 376, Plenum press New York, pp. 259-269) 0
固相上でグリコシル化とアミノ基の誘導化を行い split and mix法によるライ ブラリー合成も Kahne, Still らにより報告された。 おのおののステップ毎にタ ツギングがなされ、 固相上での脱保護の後、 アツセィとデコーディングによりレ クチンに対する既知リガンドよりも強力なリガンド構造が見い出された （Liang, R. , Yan, L. , Loebach, J. , Ge， M.， Uozumi, Y. , Sekanina, K.， Horan, N. , Gildersleeve, J. , Thompson, C. , Smith, A. , Biswas, K. , Still, W. C. , Kahne, D. (1996) Science 21 , 1520-1522)。 ァリルービュルの二重結合異性化を巧みに 糖鎖合成に用いる合成法により、 三糖ライブラリーが Boons らにより合成され、 今後への可能性が示された。 ここでは溶液反応が用いられ、 sprit and mix法に より糖結合位置の決定したライブラリーを得ることに成功している （Boons, G. -J. , Heskamp, Β· , Hout, F. (1996) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35， 2845-2847) 0 Boonsらはまた、固相上での化学種選択的なダリコシル化反応を試みるとともに、 ライブラリー合成も行い 12 の三糖のライブラリーを報告した （Johnson, M.， Aries, C.， Boons, G.—J. (1998) Tetrahedron Lett. 39, 9801-9804；及び Zhu, T. , Boons, G. -J. (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 37, 1898 - 1900)。 Ichikawa らはグリカールを IDCP によって活性化し、 無保護のジオール単糖受容体とカツ プリング、 立体選択的であるが、位置選択性の無い 2- deoxy糖三糖ライブラリー を合成した（Izumi, M.， Ichikawa, Y. (1998) Tetrahedron Lett. 39, 2079—2082)。 Wong らは、 オルトゴナル保護（Baranay, G. , Merrifield, R. Β·， (1977) J. Am. Chem. Soc. 116, 7363 - 7365)した単糖を母核とし保護基を欲しい順に脱保護する ことで直鎖三糖から高度に分岐した五糖保護糖のライブラリ一を合成した (Wong, C. -H. , Ye, X. -S. , Zhang, Ζ. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120, 7137-7138)。 ま た、化学種選択的なダリコシル化反応におけるァノメリック位保護基 (チォダリコ シド）の反応性を精査し、 Armed-disarmedグリコシル化による one- potグリコシ ル化を完成、 これに基づくコンピューターによる反応の選択、 オルトゴナルな保 護基の除去を通じ、 糖鎖ライブラリーの自動化への道を開いた （Zhang, Ζ· , Ollmann, I. R. , Ye, X.— S.， Wischnat, R.， Baasov, T. , Wong, C.— H. (1999) J. Am. Chem. Soc. 121, 734-753)。 Armstrong らは 1994年いち早く糖鎖ライブラ リーに着目し、 末端にカルボン酸をもつジェン系のオスミウム酸化と還元的環化 により C-グリコシルニ糖の還元末端相当糖の水酸基の立体異性体ライブラリ一 を発表した （Armstrong, R. W. , Sutherlin, D. P. (1994) Tetrahedron Lett. 35， 7743-7745)。
また、 WO 9 6 / 0 6 1 0 2号公報及ぴオーストラリァ特許公報 AU3346495号 公報 （発行日 ： 1 9 9 6年 3月 1 6日） には糖鎖ライブラリーの構築法が記載さ れている。 WO 9 6 / 0 6 1 0 2号公報及ぴオーストラリァ特許公報 AU3346495 号公報 （発行日 ： 1 9 9 6年 3月 1 6日） においては、 保護基を持たない糖受容 体を用い、 これに対して保護糖供与体を化学的に反応させることにより、 位置ラ ンダムの糖鎖ライブラリー合成を迅速に行っている。
また米国特許第 5 , 7 2 1， 0 9 9号公報には、 レジン上に核酸、 ペプチド、 糖鎖等を有機合成化学的手法によって構築する方法が記載されている。 米国特許 第 5 , 7 2 1 , 0 9 9号公報では、 同一レジン上にモレキュラーコーディングを 行う。 ライブラリー合成はスプリッ ト &ミックス法で行われ、 したがって、 1 レ ジン一 1 化合物のレジン混合物を与える。 合成の最後に全ての脱保護を行い、 タ ンパク質等のバイオ分子のスクリーニングに直接用いる。 合成物質が極微量であ るので、 ヒットしたビーズのみのデコードを行って、 ビーズ上の化合物の構造を 特定する。
し力 し、 上記したような多数の糖鎖ライブラリーの合成例、 構築例は、 いずれ も成功例とは言いがたい。 その理由としては、 例えば、 立体選択的、 位置選択的 なダリコシル化反応を行うためには数多くの単糖ュニットを必要とするが、 労力 もコス トも膨大に必要となることからそれらを網羅的に合成することは困難だつ たことが挙げられる。
このような理由から、 十分な数の糖鎖を含む糖鎖ライブラリ一の合成を簡便に 行えるような、 効率の良い糖鎖固相合成方法の確立が強く望まれている。 一方、 糖鎖等の合成において繁用されている固相反応方法は、 前記のとおり、 ペプチドやヌクレオチド合成でも広く用いられ、 その有用性は高く評価されてい る。 すなわち、 反応に固相を利用することによって、 単離精製操作等が簡略化さ れ、 効率も良く、 熟練者でなくても操作が可能であるほか、 装置の開発等への貢 献も大きい。
例えば、 ペプチド合成及びヌクレオチド （核酸） 合成においては、 基本的な合 成方法はほぼ確立しており、 多数の合成装置が市販されている （例えば、 米国特 許第 5 4 6 2 7'4 8号公報参照）。 し力 し、いずれの装置も大型で、溶液を多量に 必要とすることから、 装置の小型化、 試薬の少量化やコストダウン等については 未だ改良の余地がある。 また、 糖鎖については、 未だに合成装置は市販されてい ない。 いくつ力試みられた例はある （例えば、 WO O 2 / 1 6 3 8 4号公報参照） が、 いずれも何らかの問題点を有するものであり、 実用化には至っていない。 こ れらのことから、 小型で必要とする液量が少なく、 効率的に固相反応を行うこと のできる方法及び装置の開発、 特に糖鎖の合成装置の開発が強く望まれている。 発明の開示
本発明は、 ヌクレオチド （核酸）、 ペプチド （タンパク質）、 糖鎖に代表される 生体分子を効率良く化学合成する方法を提供することを解決すべき課題とした。 特に、 本発明は、 市販の合成装置が無い糖鎖の合成装置の基礎となる方法を提供 することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、 先ず、 糖鎖の合成、 さら には糖鎖のコンビナトリァルケミストリーの効率化を可能とする各種の単糖ュニ ットを合成した。 次いで、 合成した複数種の単糖ユニットを用いて複数種の糖鎖 を合成する糖鎖固相合成を行う際に反応系の昇温率を制御することに着目し、 糖 鎖合成反応系の温度を、 反応系中の副反応を低下させることを指標として決定し た昇温率に従って変化させることにより、 糖鎖を効率良く化学合成できることを 見出した。 さらに、 本発明者らは、 糖鎖等の生体分子の固相合成において撹拌等 のプロセスを使用することなく、 拡散支配による反応を行うことによって糖鎖の 固相合成を効率良く行うことができることを見出した。 本発明はこれらの知見に 基づいて完成したものである。
即ち、 本発明によれば、 以下の発明が提供される。
(1) 複数種の単糖ュニットを含む少なくとも 1以上の糖鎖合成反応系におい て複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、 該糖鎖合成反応系の温度 を、 反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変 化させることを特徴とする、 糖鎖固相合成方法。
(2) 糖鎖固相合成方法が以下の工程を含む、 （ 1 )に記載の糖鎖固相合成方法。
(a) 下記式 （1) ：
P— L— O— A1— X (1)
(式中、 Pは固相を示し、. Lはリンカ一を示し、 Oは単糖の非還元末端の酸素原 子を示し、 A 1は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、 Xは脱離基 Yの活性化条件下で安定な脱離基を示す。 )
の単糖ユニットに、 下記式 （2) ：
HO— A2— Y (2)
(式中、 A2は尽応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、
Yは脱離基 Xの活性化条件下で安定な脱離基を示す。 )
の単糖ユニットを脱離基 Xの活性化条件下で反応させて、 下記式 （3) ：
P_L— O— A1— O— A2— Y (3)
の糖類を得る工程：及び
(b) 上記工程 （a) で得た式.（3) の糖類に、 下記式 （4) ：
HO— A3— X， （4)
(式中、 A3は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、 X ' は脱離基 Yの活性化条件下で安定な脱離基あるいは 1位の水酸基または保護 基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基 Yの活性ィ匕条件下で反応させて、 式 （5) ： P— L— O— Ai— O— A2— O— A3— X, (5)
の糖類を得る工程。
(3) 工程 （b) において X' が 1位の水酸基または保護基である式 （4) の 単糖ユニットを使用し、 3つの糖が連結した糖鎖を合成する、 （2)に記載の糖鎖 固相合成方法。
(4) 工程 （b) で得た式 （5) の糖類に対し、 工程 （a) と工程 （b) の反 応を繰り返すことを含む、 （2) に記載の糖鎖固相合成方法。
(5) 式 （1)、 (2) 及び （4) の単糖ユニットを一反応系に同時に反応させ て反応を行う、 （2) から （4) の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
(6) 脱離基 Xがフエ二ルチオ基又はフッ素基の片方であり、 脱離基 Yがフエ 二ルチオ基 Xはフッ素基の他方である、 （2) から （5) の何れかに記載の糖類固 相合成方法。
(7) フエ二ルチオ基の活性化を N—ョードサクシンイミ ドートリフルォロメ タンスルホン酸 （N I S— T f OH) またはジメチルメチルチオスルフォニゥム トリフラート （DMTST)により行い、フッ素基の活性化を S n (C 104) 2、 S n (OT f ) 2、 C p 2H f (C 104) 2、 または Cp2Hf (OT f ) 2によ り行う、 （6) に記載の糖鎖固相合成方法。
(8) 保護基がベンジル基である、 （2) から （7) の何れかに記載の糖鎖固相 合成方法。
(9) A1, A2及び A3が示す単糖骨格が生体中に存在する単糖から選ばれる 3種類の糖の単糖骨格である、 （2) から （8) の何れかに記載の糖鎖固相合成方 法。
(10) A\ A 2及ぴ A 3が示す単糖骨格が、 マンノース、 グルコース、 ガラ クトース、 キシリ トース、 ダルコサミン、 ガラクトサミン、 グルクロン酸、 フル クトース又はシアル酸の単糖骨格である、 （2) から （9) の何れかに記載の糖鎖 固相合成方法。
(1 1) フエニル 1一チォ一 3， 4, 6—トリー O—ベンジルー] 3—D—マン ノピラノシド、 フエニル 1—チォー 2， 4 , 6—トリ一 O—ベンジル一 /3— D— マンノピラノシド、 フエニル 1—チォー 2， 3， 6—トリー O—べンジルー j3— D—マンノピラノシド、 フエニル 1一チォ一 2， 3 , 4—トリ一 O—ベンジノレ一 ]3—D—マンノピラノシド、 フエュル 1—チォ一 3 , 4， 6 _トリ一0—べンジ ル一j3—D—ガラク トピラノシド、 フエニル 1一チォ一 2， 4， 6 _トリー O— ベンジル一 i3—D—ガラクトピラノシド、 フエニル 1一チォー 2 , 3， 6—トリ 一 O—べンジルー /3—D—ガラタトピラノシド、 フエニル 1ーチォ一 2， 3 , 4 —トリ一 O—べンジルー i3—D—ガラタトピラノシド、 フエニル 2 , 3—ジ一 O —ベンジル一 1—チォ一 13—D—キシロビラノシド、 フエニル 3， 4ージ一 O— ペンジノレー 1一チォー j3—D—キシロビラノシド、 フエュノレ 2， 4—ジ一 O—べ ンジルー 1一チォ一 /3—D—キシロビラノシド、 フエニル 1—チォ一 2， 3—ジ —0—ベンジル一 /3— L—フコピラノシド、 フエニル 2—アジド一 4 , 6—ジー O—ベンジルー 2—デォキシ _ 1一チォー j3—D—ガラクトビラノシド、 フエ二 ル 2—アジドー 3 , 6—ジ _ 0—ベンジル一 2—デォキシ一 1—チォ一 β— D— ガラタトピラノシド、 フエニル 2—アジド一 3， 4—ジ一 Ο—ベンジル一 2—デ ォキシ _ 1ーチォ一) 3— D—ガラクトビラノシド、 フエニル 3， 4 , 6—トリー Ο—ベンジル一 1一チォ— _ D—ダルコピラノシド、 フエニル 2， 4， 6—ト リ一 Ο—ペンジノレー 1一チォ一 一 D—グノレコピラノシド、 フエ二ノレ 2， 3， 6 —トリ一O—べンジルー 1—チォ一 β _ D—ダルコビラノシド、フエニル 2 , 3 , 4一トリ一0—べンジルー 1—チォ一 β—D—グノレコピラノシド、 フエ-ル 2— アジドー 4， 6—ジー Ο—べンジルー 2—デォキシー 1一チォー β _ D—グレコ ピラノシド、 フエニル 2—アジドー 3 , 4—ジ一 O—べンジルー 2—デォキシー 1一チォー — D—ダルコピラノシド、 フエニル 2—アジドー 3 , 6—ジー Ο— ベンジル一 2—デォキシー 1—チォ一 β— D—ダルコピラノシド、
メチル （フエニル 1一チォ一 2， 3—ジ一 Ο—ベンジル一 j3—D—ダルコピラノ シド） ゥロネート、 メチル （フエニル 5—ァセトアミ ドー 4， 7 , 8 , 9—テト ラ一O—ァセチル一 3 , 5一ジデォキシ一 2一チォ一 —D—グリセロー D—ガ ラタトー 2—ノヌロビラノシド） ォネート、 メチル （フエニル 5—ァセトアミ ド -4, 7, 8， 9—テトラ一 O—ァセチル _3， 5—ジデォキシ一2—チォ一α —D—グリセ口一 D—ガラクトー 2—ノヌロビラノシド） ォネート、 メチル （フ ェニル 5—ァセトアミドー 3， 5—ジデォキシ一 2—チォー β一 D—グリセ口一 D—ガラタト一 2—ノヌロビラノシド） ォネート、 メチル （フエニル 5—ァセト アミドー 3， 5—ジデォキシー 2—チォ一α— D—グリセ口一 D—ガラクトー 2 ーノヌロビラノシド） ォネート、 並びに上記化合物中のフエ二ルチオ基をフッ素 基に置換した化合物から成る群から選択される少なくとも 1以上の単糖誘導体を 含む、 （1) から （10) の何れかに記載の糖鎖固相合成方法を行うための単糖ラ イブラリー。
(12) 毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、 固体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする固相 反応方法。
(13) 反応が拡散混合により行われることを特徴とする （12) に記載の固 相反応方法。
(14) 固体が、 内部に細孔を有する樹脂粒子である、 （12) 又は （1 3) に 記載の固相反応方法。
(15) 固相反応が化学反応または生化学的反応である、 （12) から （14) の何れかに記載の固相反応方法。
(16) 固相反応が糖鎖合成反応である、 （12) から （15) の何れかに記載 の固相反応方法。
(1 7) 固相反応が （1) から （10) の何れかに記載の糖鎖固相合成反応で ある、 （12) から （16) の何れかに記載の固相反応方法。
(18) (1) から （10) の何れかに記載の糖鎖固相合成方法または （1 7) に記載の固相反応方法により合成された、 生体中に存在する単糖から選ばれる 3 種類の糖の全ての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリー。
(19) 生体中に存在する単糖が、 マンノース、 グルコース、 ガラクトース、 キシリ トース、 ダルコサミン、 ガラクトサミン、 グルクロン酸、 フルクトース又 はシアル酸である、 （18) に記載のライブラリー。
(20) 少なくとも以下の （1) と （2) とを含む、 （12) から （17) の何 れかに記載の固相反応方法を行うための反応装置。
(1) 液相を注入又は吸引するための導入部を有し、 かつ固体を収容する空間を 有する、 固相反応を行うための反応部、 及び
(2) 反応部の温度を調節するための温度調節部 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明で用いるオルトゴナル法の概要を示す。
図 2は、 本発明で用いる単糖誘導体ライブラリーを示す。
図 3は、 樹脂ビーズの細孔を示す。
図 4は、 従来法による固相反応法と本発明による拡散混合固相反応法の様子を 示す。
図 5は、 23通りのァノマー異性体を示す。
図 6は、 固相上でのグリコシルフルォリ ドの活性化によるグリコシル化反応に おいて、 3時間で- 15°Cから 10。Cへ の昇温 （8. 3°CZ時間） を行った際の MALDI-T0FMS の解析結果を示す。
図 7は、 固相上でのグリコシルフルォリ ドの活性化によるグリコシル化反応に おいて、 4. 5時間で- 15°Cから 10°Cへ の昇温 （5. 6°C/時間） を行った際の MALDI-T0FMS の解析結果を示す。
図 8は、 固相上でのグリコシルフルォリ ドの活性化によるグリコシル化反応に おいて、 6時間で- 15°Cから 10°Cへ の昇温 （4. 2°C/時間） を行った際の MALDI-T0FMS の解析結果を示す。
図 9は、固相上でのチォグリコシドの活性化によるダリコシル化反応において、 4.5時間で- 15°Cから 10°Cへ の昇温（ 5.6 °C/時間）を行つた際の MALDI- TOFMS の解析結果を示す。 図 1 0は、 固相上でのチォグリコシドの活性化によるグリコシル化反応におい て、 6時間で- 15°Cから 10°Cへ の昇温（ 4 . 2 °CZ時間）を行つた際の MALDI- T0FMS の解析結果を示す。
図 1 1は、 固相上でのチォグリコシドの活性化によるグリコシル化反応におい て、 1 2時間で- 15°Cから 10°Cへ の昇温 （2 . 1 °CZ時間） を行った際の MALDI-T0FMS の解析結果を示す。
図 1 2は、 供与体が結合した樹脂を受容体溶液で膨潤しプロモーターを加える 方法でグリコシル化反応を行つた場合の追跡結果を示す。
図 1 3は、 供与体が結合した樹脂を受容体とプロモーターの混液により膨潤す る方法でグリコシル化反応を行った場合の追跡結果を示す。
図 1 4は、 樹脂に結合した 2, 3-ジ- ベンジル- L-フコビラノシル -（1→
2) -3, 4, 6-ト リ - (9~ベンジル - a -D-ガラク ト ビラノ シルフルォライ ドの MALDI-T0FMSを示す。
図 1 5は、 樹脂に結合した 2, 3-ジ -^ベンジル- L-フコビラノシル -（1→
3) -2, 4, 6 -ト リ一 0~ベンジル - a -D-ガラク トビラノ シルフルォライ ドの MALDI-T0FMSを示す。
図 1 6は、 樹脂に結合した 2， 3-ジ-^べンジル -L -フコビラノシル -（1→
4) -2, 3, 6 -ト リ -(^ベンジル - a -D-ガラク トピラノ シルフルォライ ドの MALDI-T0FMSを示す。
図 1 7は、 樹脂に結合した 2, 3-ジ- べンジル-し-フコピラノシル-（1→ 6) -2, 3, 4-ト リ -0~ベンジル- a - D-ガラク トビラノシルフルォライ ドの MALDI-T0FMSを示す。
図 1 8は、 固相上で合成した三糖誘導体の MALDI-T0FMSを示す。
図 1 9は、 固相上で合成した三糖誘導体の MALDI- T0FMSを示す。
図 2 0は、 固相上で合成した三糖誘導体の MALDI-T0FMSを示す。
図 2 1は、 固相上で合成した三糖誘導体の MALDI-TOFMSを示す。
図 2 2は、 固相上で合成した三糖誘導体の MALDI- T0FMSを示す。 図 2 3は、 固相上で合成した三糖誘導体の MALDI- T0FMSを示す。
図 2 4は、 固相上で合成した三糖誘導体の MALDI- T0FMSを示す。
図 2 5は、 固相上で合成した三糖誘導体の MALDI- T0FMSを示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について説明するが、 以下の構成要件の説明は、 本 発明の実施態様の代表例であり、 本発明はこれらの内容のみに特定されるもので はない。 なお、 以下に記載する糖鎖固相合成反応、 用いる固相、 液相等は、 特に 例示した場合を除き、 「固相合成ハンドブック （Novabiochem社 （Merck社） 刊」 等に記載の公知の方法から適宜選択して行うことができる。
( 1 ) 昇温率を制御した糖鎖固相合成方法
本発明の糖鎖固相合成方法は、 複数種の単糖ュニットを含む少なくとも 1以上 の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、 該糖鎖合成反応系の温度を、 反応系中の副反応を低下させることを指標として決 定した昇温率に従って変化させることを特徴とする方法である。
従来糖鎖合成反応においては、 反応させようとする糖によって至適な反応温度 が異なるために、 反応系の反応温度を細かく制御する必要があることは知られて いた。 反応温度の制御を十分に行わないと、 未反応物、 脱離物等が生じ、 所望の 反応生成物を十分量得ることができないためである。 しかし、 糖には多種多様な ものが存在するだけでなく、 それぞれが立体異性や位置異性を有しており、 それ らの要因によつても反応性が異なることから、 反応を行うたびに用レ、る糖ごとに 至適反応温度を決定するとなると膨大な検討が必要になってしまう。 そこで、 従 来は、 反応数が多い場合には用いる糖ごとに至適反応温度を検討することができ ず、 ごく一般的と考えられる平均的な温度を設定して反応を行う等の方法を用い ており、 そのために十分量の反応生成物を得ることが困難なことが多かつた。 本発明者らは、 これらの問題を鋭意検討した結果、 複数種の単糖ユニットを含 む少なくとも 1以上の糖鎖合成反応系、 好ましくは、 2以上の糖鎖合成反応系を 用いて反応を行う場合に、 これらの反応系の温度を、 反応系中の副反応を低下さ せることを指標として決定した昇温率に従って変化させれば、 各々の単糖ュニッ トごとに至適な反応温度を検討する必要なく、 効率的に糖鎖固相合成反応を行え ることを見出した。 すなわち、 反応温度を変化させることによって、 各反応系中 に含まれる単糖ュニットがそれぞれに至適な温度に到達した時点で反応し、 糖鎖 合成反応が行われることを見出した。また、本発明者らによる更なる検討の結果、 前記昇温率を反応系中の副反応を低下させることを指標に決定すれば、 さらに効 率よく糖鎖固相合成反応を行えることも明らかになった。
力べして完成された本発明の糖鎖固相合成方法は、 従来大きな課題であった糖 鎖固相合成反応の反応温度を逐一検討する必要なく、 効率的に多種類の糖鎖を合 成することができるという大きな効果を奏するものである。
本発明で行う糖鎖合成反応自体は当業者に公知の手法で行うことができ、 具体 的には反応に不活性な適当な溶媒中で、 固相に結合した第一の単糖ュニットに、 第二の単糖ュュットを含む溶液、 第三の単糖ユニットを含む溶液、 並びに所望に よりそれ以降の単糖ュニットを含む溶液を順次添加して反応させることにより、 これらの単糖ユニットをそれぞれ順番に結合させていくことができる。 なお、 本 明細書で単に糖鎖という場合には、 単糖が 2以上結合して鎖状になったものを意 味する。
本発明で用いる複数種の単糖ュニットの種類は単糖類である限り特に限定され ないが、 好ましくは生体中に存在する単糖から選ばれる単糖骨格を含むものであ る。 特に好ましい単糖骨格は、 マンノース、 グルコース、 ガラクトース、 キシリ トース、 ダルコサミン、 ガラクトサミン、 グルクロン酸、 フルクトース又はシァ ル酸の単糖骨格である。 本発明ではこれらの単糖ユニットの複数を使用して、 少 なくとも 1以上の糖鎖合成反応系において複数種の糖鎖を合成する。 糖鎖合成反 応系は 1反応系でもよいし、 2以上の複数の反応系でもよい。
1反応系で反応を行う場合には、 1種又は 2種以上の単糖ュニットを結合した 固相を含む 1反応系に、 単糖ュニットを含む 1種又は 2種以上の溶液を添加して 糖鎖合成反応を行って 2つの単糖から成る糖鎖を合成する。 次いで、 この反応系 に、 単糖ユニットを含む 1種又は 2種以上の溶液を添カ卩して、 次の糖鎖合成反応 を行い、 3つの単糖から成る糖鎖を合成することができる。 以下、 これを繰り返 すことにより所望の長さの糖鎖を合成することができる。 ただし、 このように一 反応系で同時に複数種類の糖鎖を合成する場合には、 反応の各段階において、 も しくは最終段階において、 各糖鎖を分離 ·精製する操作が必要である。
2以上の複数の反応系で反応を行う場合には、 例えば、 それぞれ異なる単糖ュ ニット （例えば X Iと X 2 ) を結合した固相を含む 2種類の反応系をそれぞれ 2 個ずつ用意し （合計 4個の反応系）、それぞれに異なる単糖ュニット （例えば Y 1 と Y 2 ) を含む溶液を添加して糖鎖合成反応を行って 2つの単糖から成る糖鎖を 合成する。 これにより、 4個の反応系においてはそれぞれ、 X Iと Y 1から成る 二糖、 X Iと Y 2から成る二糖、 X 2と Y 1から成る二糖、 及ぴ X 2と Y 2から 成る二糖が生成する。 この反応生成物をさらに半分ずつに分割して、 それぞれの 反応系に、 異なる単糖ュニット （例えば Z 1と Z 2 ) を含む溶液を添加して、 糖 鎖合成反応を行って 3つの単糖から成る糖鎖を合成することができる。 これによ り、 各反応系において、 X I、 X 2、 Y l、 Υ 2、 Z l、 Ζ 2の全ての組み合わ せの 8通りの反応生成物を得ることができる。 反応後に目的の糖鎖を分離 ·精製 する必要がないことから、 本発明においてはこの複数の反応系で反応を行う方法 が好ましく用いられる。 例えば、 上記のように 8種類の糖鎖を合成したい場合に は 1回目の反応では 4つの反応系、 2回目の反応では 8つの反応系を予め用意し、 好ましくはこれらを同時並行で反応させればよ 、。
本発明の特徴の一つは、 上記した糖鎖合成反応系の温度を、 反応系中の副反応 を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変化させることである。 本明細書の実施例で示す通り、 昇温率を大きくすると副生物が生成し、 糖鎖合成 反応の反応効率が低下することが判明した。 従って、 本発明においては、 反応系 中の副反応をできるだけ低下させることを指標にして決定した昇温率に従って糖 鎖合成反応系の温度を変化させることにより、 効率の良い糖鎖合成反応を行うこ とができる。
ここで、 副反応とは、 所望の糖鎖合成反応の反応効率を妨げるような副生物を 生じる反応を意味し、 副生物とは、 例えば、 脱離反応生成物 （脱離物）、加水分解 物等を意味する。 脱離物とは、 例えば、 目的とする 2分子間反応であるグリコシ ル化反応に代わって分子内反応が起こることにより生成するグリカール等である。 すなわち、 本発明において 「副反応を低下させることを指標にする」 とは、 例え ば、「副生物の存在または量が目的の反応を阻害しない程度に低いことを指標にす ること」 を意味する。 特に、 脱離物の量が十分に低いことが好ましい。 また、 反 応の効率が悪レヽと未反応物が多く残存することから、 この未反応物を低下させる こともあわせて指標とすることがさらに好ましい。 副生物の存在または量は、 例 えば、 質量分析法 （M S )、.核磁気共鳴分光法 （NMR)、 高速液体クロマトダラ フィー （H P L C)、吸光度測定、旋光度測定等により検出し確認することができ る。
温度の制御は、 前記したような 1反応系もしくは 2以上の複数の反応系の温度 を、 決定した昇温率に従って変化させながら糖鎖合成反応を行うことのできる方 法であればいかなる方法で行われてもよい。 具体的には、 温度の制御は、 それ自 体公知の通常用いられる化学反応等に利用可能な温度調節装置等を用いればよレ、。 1反応系を用いる場合には、 該反応系の温度を予め決定した昇温率に従って変化 させればよい。 2以上の複数の反応系を用いる場合には、 各々の反応系の温度を 予め決定した昇温率に従って変化させてもよいし、 複数の反応系をまとめて一つ の温度調節装置により温度制御してもよい。 特に糖鎖ライブラリ一の合成を行う 場合等には、 複数の反応系をまとめて一つの温度調節装置により温度制御し、 同 時並行で多数の糖鎖を合成する方法が好ましく用いられる。
昇温率や反応開始温度は、 用いる単糖や脱離基により適宜設定される。 反応温 度が高いと副反応が進行しやすいが、 反応開始温度や昇温率が低すぎると反応時 間が長くなる。 本発明の好ましい例では、 脱離基としてフッ素基またはフエニル チォ基を有する単糖ュニットを、 フッ素基またはフエ二ルチオ基の活性化条件下 で水酸基を有する別の単糖ユニットと反応させる。 このとき、 昇温率は、 たとえ ば、 8 °CZ時間以下、 好ましくは 7 °C/時間以下、 より好ましくは 5 . 6 °CZ時 間以下である。好ましい昇温率の範囲は、用いる脱離基や単糖により異なるので、 適宜確認実験を行い決定すればよい。 反応開始温度は、 用いる単糖ユニットによ り異なるが、系に存在する単糖のうち、最も反応性の高い（副反応を生じやすい） 単糖に合わせて設定し、 その温度から昇温させればよい。 たとえば、 本発明にお いて好ましい例として用いる生体内に存在する 9種の単糖の中でもっとも反応性 の高い （すなわち、 反応温度を低く設定すべき） フコースの場合で、 一3 0 ° (：〜 一 1 5 °C程度から開始させることができる。 このように、 各単糖に適した昇温率 および反応開始温度を設定することにより、 副反応をできるだけ低下させて、 目 的の糖鎖合成反応を高効率で行うことができる。
糖鎖は、 核酸やタンパク質に次いで第 3の生体高分子と捉えられ、 細胞分化、 免疫、 癌化、 感染症等、 多細胞生物の生物機能に非常に重要な役目を果たしてい る。 核酸、 タンパク質については化学合成装置が販売され、 科学の進歩 '発展に 大きく貢献しているが、 糖鎖の化学合成装置は販売されておらず早期の開発が望 まれてレヽる [Plante, 0. J. , Palmacci, E. R. , Seeberger, P. H. (2001) Science, 291: 1523-1527]。 化学的手法による合成の基盤をなすのは固相合成であり、 装置化の 前段階としては素反応、 また、 総合的なプロセスの効率化を行う必要がある。 こ の目的の達成のために本発明の糖鎖固相合成方法は非常に有用である。 また、 本 発明の方法においては、 前述の通り、 糖鎖合成反応自体は公知の方法を用いるこ とができるが、 その中でも、 反応性の独立性 （相互選択性） を基礎とするオルト ゴナルグリコシルイヒ法 （以下、 これを 「オルトゴナル法」 と称することがある） が、 最適な方法としてあげられる。 [Kanie， 0. , Ito, Y. , Ogawa, Τ. , (1994) /. Am. Chem. Soc. , 116, 12073-12074. b) Kanie, 0.， Ito, Y. , Ogawa, T. , (1996) Tetrahedron Lett. , 37, 4551—4554. c) Ito, Y. , Kanie, 0. , Ogawa, T.， (1996) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 35, 2510-2512] 上記したオルトゴナルグリコシル化法による本発明における糖鎖固相合成反応 の具体例としては、 以下の工程を含む反応が挙げられる。 また、 その概要を図 1 に示す。
(a) 下記式 （1) ：
P— L一 O— A1— X (1)
(式中、 Pは固相を示し、 Lはリンカ一を示し、' Oは単糖の非還元末端の酸素原 子を示し、 A 1は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、 Xは脱離基 Yの活性化条件下で安定な脱離基を示す。 )
の単糖ュニット （以下、 これを「供与体」 と称することがある） に、下記式（2) ： HO— A2— Y (2)
(式中、 A2は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、 Yは脱離基 Xの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ユニット （以下、 これを 「受容体」 と称することがある） を脱離基 Xの活 性化条件下で反応させて、 下記式 （3) ：
Figure imgf000019_0001
の糖類を得る工程：及ぴ
(b) 上記工程 （a) で得た式 （3) の糖類に、 下記式 （4)：
HO— A3— X， （4)
(式中、 A3は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、 X' は脱離基 Yの活性化条件下で安定な脱離基あるいは 1位の水酸基または保護 基を示す。）
の単糖ユニットを脱離基 γの活性ィヒ条件下で反応させて、 式 （5) ：
P_L— O— A1— O— A2— O— A3— X， (5)
の糖類を得る工程。
すなわち、 オルトゴナル法とは、 上記のように 2種類 （上記 X及び Y) の互い に活性化条件が異なり、 かつ、 他方の活性化条件下で安定な組み合わせの脱離基 の性質を利用した、 連続的かつ効率的な合成方法である。 本明細書においては、 このような 2種類の脱離基を 「オルトゴナルな関係にある」 という。
上記の反応において、 3つの糖が連結した糖鎖を合成する場合には、工程（b ) において X ' が 1位の水酸基または保護基である式 （4 ) の単糖ユニットを使用 することができる。
また、上記の反応において、 4つ以上の糖が連結した糖鎖を合成する場合には、 工程 （b ) で得た式 （5 ) の糖類に対し、 工程 （a ) の反応、' さらに工程 ( b ) の反応を繰り返すことにより所望の長さの糖鎖を合成することができる。
Pが示す固相の具体例としては、 糖鎖の固相合成に一般的に用いられるもので あればよいが、 各種の樹脂、 たとえば、 ポリスチレン樹脂、 ポリアクリルアミド 樹脂、 ポリエーテル系樹脂、 およびそれらの複合樹脂や、 また、 多孔性ガラス、 ビーズ、微小流路（溶融シリカキヤビラリ一、マイクロチップ等）、セファロース 等が挙げられる。 これらはいずれも、 固相合成に際してリンカーゃスぺーサ一等 を連結させるための足場となる、 アミノ基、 ブロモメチル基、 水酸基、 チオール 基、カルボキシル基等の官能基を有しているものであって、さらに、適当な側鎖、 修飾等を有するものでもよい。
Lが示すリンカーの具体例としては、 固相と単糖の非還元末端の酸素原子とを 連結できる基であって、 合成反応の後に生成物に影響を与えないような温和な条 件下で選択的に切り出すことが可能なものであればいかなるものでもよい。
Pが示す固相おょぴ Lが示すリンカ一は、より具体的には、たとえば、 Kanemitsu, T. and Kanie, 0. , Combinatorial Chemistry & Hign Througnput screening, 5， 339-360 (2002)等に記載の糖鎖の合成反応に一般的に用いられる固相おょぴリン カーの中から、 適当なものを選択して用いることができる。
A A 2、 及び A 3は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格 を示し、 これらは互いに同一でも異なっていてもよい。 単糖骨格の具体例は上記 した通りである。 水酸基の保護基としては、 糖鎖合成反応の際に水酸基を保護で きる基であれば特に限定されず、 有機合成分野で当業者に公知の水酸基の保護基 を適宜使用することができる。 水酸基の保護基の具体例としては、 以下のものが 挙げられる。
(エーテル型） メチル基、メ トキシメチル基、メチルチオメチル基、ベンジルォキシメチル基、 t—ブトキシメチル基、 2—メ トキシエトキシメチル基、 2， 2 , 2—トリクロ 口エトキシメチル基、 ビス （2—クロ口エトキシ） メチル基、 2—'（トリメチル シリル） エトキシメチル基、 テトラヒ ドロビラニル基、 3—ブロモテトラヒ ドロ ビラニル基、 テトラヒドロチォピラニ 基、 4ーメ トキシテトラヒドロビラニル 基、 4ーメ トキシテトラヒドロチォピラニル基、 4ーメ トキシテトラヒ ドロチォ ビラニル S , S—ジォキシド基、 テトラヒ ドロフラニル基、 テトラヒドロチオフ ラエル基；
1 _エトキシェチル基、 1—メチル一 1—メ トキシェチル基、 1一 （イソプロ ポキシ） ェチノレ基、 2 , 2 , 2—トリクロロェチノレ基、 2— (フエニノレセレニ 7レ） ェチル基、 t—ブチル基、 ァリル基、 シンナミル基、 p—クロロフヱニル基、 ベ ンジノレ基 > p—メ トキシベンジノレ基、 o—ニトロべンジノレ基、 p—ニトロべンジ ル基、 p—ハ口べンジル基、 p—シァノベンジル基、 3—メチル _ 2—ピコリル N—ォキシド基、 ジフエ二ルメチル基、 5—ジベンゾスべリル基、 トリフエニル メチル基、 α—ナフチルジフエニルメチル基、 ρ—メ トキシフエ二ルジフエニル メチル基、 - ( ρ ' —ブロモフエナシルォキシ） フエニルジフエニルメチル基、 9—アントリル基、 9 _ ( 9—フエニル） キサンテュル基、 9 - ( 9一フエニル — 1 0—ォキソ） アントリル基、 ベンズイソチアゾリル S， S—ジォキシド基、 ； トリメチルシリル基、 トリェチルシリル基、 イソプロピルジメチルシリル基、 t—ブチルジメチルシリル基 (T B DM S基）、 （トリフエニルメチル） ジメチル シリル基、 t一プチルジフエニルシリル基、 メチルジィソプロビルシリル基、 メ チルジー t—プチルシリル基、 トリベンジルシリル基、 トリ— p—キシリルシリ ル基、 トリイソプロビルシリル基、 トリフエニルシリル基；
(エステル型）
ホノレメート、 ベンゾイノレホノレメート、 アセテート、 クロ口アセテート、 ジクロ 口アセテート、 トリクロ口アセテート、 トリフルォロアセテート、 メ トキシァセ テート、 トリフエニルメ トキシアセテート、 フエノキシアセテート、 p—クロ口 フエノキシアセテート、 2， 6—ジクロロー 4—メチルフエノキシアセテート、 2， 6—ジクロロー 4— ( .1， 1 , 3， 3—テトラメチルブチル） フエノキシァ セテート、 2， 4一ビス （1 , 1—ジメチ^/プロピレ） フエノキシアセテート、 クロロジフエニゾレアセテート、 p—フエェノレアセテート、 3—フエ二ノレプロピオ ネート、 3—べンゾイスレプロピオネート.、ィソブチレ一ト、モノスクシノエ一ト、 4一ォキソペンタノエート、 ピノ 口エート、 ァダマントエート、 クロ トネート、 4—メ トキシク口トネート、 （E) — 2—メチル一 2—ブテノエ一ト、ベンゾエー ト、 o— (ジブ口モメチノレ） ベンゾエート、 o— (メ トキシカノレポ二/レ） ベンゾ エート、 p—フエ二 7レベンゾエート、 2 , 4， 6— トリメチゾレべンゾエート、 p 一べンゾエート、 α—ナフトエート ；
(カーボネート型）
メチノレカーボネート、 ェチノレカーボネート、 2 , 2， 2—トリクロロェチノレ力 ーボネート、 イソブチ カーボネート、 ビ: =^レカーボネート、 ァリノレカーボネー ト、 シンナミ/レカ一ポネート、 ： —ニトロフエ二ノレカーボネート、 ベンジノレカー ポネート、 ρ—メ トキシベンジノレカーボネート、 3， 4—ジメ トキシべンジ/レカ ーボネート、 ο—二トロべンジノレカーボネート、 ρ—ニトロべンジノレカーボ不一 ト、 S—ベンジルチオカーボネート ；
(その他）
Ν—フエ二ルカルバメート、 Ν—イミダゾリルカルバメート、 ボレート、 ニト レート、 Ν， Ν, N，， N ' ーテトラメチルホスホロジアミダート、 2 , 4—ジニ トロフエニノレスノレフエネ一ト ：
なお、 上記したような水酸基の保護基の導入法及び脱保護法は当業者に公知で あり、 例 ば、 Teodora, W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John & Wiley & Sons Inc. (1981) などに記載されている。
本発明では特に好ましくは、 ベンジル基を使用することができる。 x (及び χ') が示す脱離基 Υの活性ィヒ条件下で安定な脱離基、並びに Υが示す 脱離基 Xの活性化条件下で安定な脱離基の組み合わせの具体例としては；
(1) 脱離基 X (及び X') がァリールチオ基又はァリールセレノ基、 あるいは フッ素基の片方であり、 脱離基 Υがァリールチオ基又はァリールセレノ基、 ある いはフッ素基の他方である場合、 並びに
(2) 脱離基 X (及び Χ，） がェチルチオ基 （_SC2H5) であり、 脱離基 Y がピリジルスルホン基 （一 S O 2 P y r .) である場合；
である。
ここでァリールチオ基 （一S— Ar) 又はァリールセレノ基 （一 S e— Ar) におけるァリール （Ar) 部分は、 活性化条件に適合する限り特に限定されない が、 炭素数 6以上のァリールが好ましく、 例えば、 フエニル又はナフタレンなど が挙げられ、 フエエルが最も好ましい。
上記の中でも特に好ましいのは、 （1) の場合であり、 この場合、 フエ二ルチオ 基の活性化は、 N—ョードサクシンイミ ドートリフルォロメタンスルホン酸 （N I S-T f OH) またはジメチルメチルチオスルフォニゥムトリフラート (DM TST) 等により行うことができる。 N I S及ぴ T f OHを組み合わせた活性化 剤 （以下、 これを 「プロモーター」 と称することがある） では、 これらが反応し て系内でョードニゥムイオン （1+) を生成することにより活性化が行われ、 高 効率でョードニゥムイオンを発生することのできる組み合わせであれば、 他の試 薬の組み合わせも同様に活性化剤として用いることができる。 DMTSTは、 こ れをそのまま活性化剤として加えることもできるし、たとえば、 Me S SMe (ジ メチルジスルフィ ド）及ぴ Me OT f (メチルトリフロロメタンスルホナート（メ チルトリフラート））を加えることにより系内で DMTSTを生成させることもで きる。
また、 フッ素基の活性化は、 Sn (C 104) 2 (過ヨウ素酸第一スズ）、 S n (OT f ) 2 (トリフロロメタンスルホン酸スズ （II))、 C p 2H f (C 104) 2 (過ヨウ素酸ハフノセン （11))、 または Cp2Hf (OT f ) 2 (トリフロロメタ ンスルホン酸ハフノセン （II)) 等により行うことができる。 Sn (C 104) 2 は S n C 12 (塩化第一スズ） 及ぴ A gC 104 (過塩素酸銀） を、 S n (OT f ) 2は SnC 12及ぴ AgOT f (銀トリフラート） を、 Cp2Hf. (C 104) 2は C p 2H f C 12 (塩化ハフノセン （II)) 及ぴぴ AgC l O4を、 Cp2Hf (O T f ) 2は Cp2H f C 12及び AgOT f を加えることにより、 それぞれ系内で 生成させて活性化を行うことができる。
かくして合成される固相 （P) に結合した糖鎖は、 必要に応じて固相を適当な 溶媒で洗浄し、 適当な化合物、 たとえばナトリウムメ トキシド等により固相から 切り出すことにより取得することができる。
上記したオルトゴナル法においては、 力ップリング反応に関与する 2種の脱離 基、例えば、 X (ァリールチオ基）は N I S-T f OH又は DMT ST等により、 そして Y (フッ素基） は S n (C 104) 2、 Sn (OT f ) 2、 C p 2H f (C I 04) 2、 または Cp2Hf (OT f ) 2等により、 それぞれ選択的に活性化するこ とができる （図 1)。 ここで、 X及び Yは任意の順序で活性化することができる。 このようなオルトゴナル法によれば、 合成は生合成とは逆方向になされ、 非還元 末端から還元末端方向に行われる。 この時、 受容体側の脱離基は供与体の活性化 条件下安定であるので、保護基は不必要である。また、オルトゴナル法によれば、 カツプリング生成物は既に次の反応のための脱離基を有しているので、 糖鎖合成 において最短の工程数を達成できるという利点を有している。
上記のオルトゴナル法は本発明の糖鎖固相合成方法に応用することにより、 さ らにその有効性を高めることができる。 即ち、 非還元末端からの合成法 （A法） と還元末端から合成を進める方法 （B法） とを比較すれば、 B法においては、 力 ップリング反応における未反応物由来の官能基（水酸基） を保護（キヤッビング） する必要があり、 従って、 1サイクルはカップリング、 キヤッビング、 脱保護の 3工程からなる。一方、 A法においてカツプリング反応毎に副生物（加水分解物、 脱離反応生成物） が固相上に蓄積するものの、 それらは次のカップリング反応条 件においては反応しないため、 キヤッビングの必要が無く、 従って、 固相反応に おいても 1サイクルは 1工程である。 固相合成法はもともと高効率化の目的で開 発された方法であり、 本発明の糖鎖固相合成方法はそれをさらに効率良く改良し たものであるので、 オルトゴナル法を組み合わせて用いることによりさらなる総 合的な反応プロセスの効率化が期待される。 また、 本明細書中以下に記載する拡 散混合による固相反応方法とさらに組み合わせることにより、 反応時間の短縮、 溶媒の節約、 節電等のメリットもあり、 糖鎖の固相合成装置の開発にも有用であ る。
( 2 ) 単糖ライブラリー
生体内で多彩で重要な機能を果たす糖鎖を自在合成するためには、 適当に保護 された単糖ユニットが必要である。 また、 それらを多数含む単糖ライブラリーを 作製しておくことは非常に有用である。 上記の （1 ) で述べたように糖鎖の高効 率合成には総合的なプロセスの効率化が重要であるので、 どのような単糖ュニッ トを用いるかは重要である。
また、 糖鎖の合成におけるカップリング反応においては立体異性体 （α / ]3 ) が生じるが、 通常の合成法では目的の立体異性体を選択的に合成する方法が一般 的である。 しかし、 生体成分の再構築のための化学合成から脱却し、 例えば、 積 極的に創薬等を目的としコンビナトリアルケミストリーを行おうとするような場 合には、 立体選択的カツプリングのために必要な制御因子としての保護基の存在 は、 必要な単糖ユニット数を倍にするばかりでなく、 そのような誘導体合成に要 する反応工程を数倍とし、 分子が複雑となるために用いることができる反応の種 類にも制約を与える。 従って、 コンビナトリアルケミストリーにおいては、 例え ば、 まずは立体非選択的な合成を行って、 立体異性体混合物を効率良く合成し、 その後、 HPLC等により分離することが望ましい。 本発明の方法や単糖ライブラリ 一は、 このような手法にも好適である。
ライブラリーに含まれる単糖ユニットとしては、 具体的には、 例えば、 本発明 の糖鎖固相合成方法、 中でもオルトゴナル法を組み合わせた方法においては、 前 記 Xとしてフエ二ルチオ基を使用し、 Yとしてフッ素基を使用し、 反応に関与し ない水酸基を全てべンジル基とすることが望ましい。 また、 Xと Yはオルトゴナ ルな関係にあるので、より安定なフエュルチオグリコシド体として合成しておき、 使用に際して適宜フルオリ ド体へと転換することが望ましい。 使用する保護基は 隣接基関与を示さないアルキル基が望ましく、 有機合成反応で一般的に用いられ るべンジル基が最も望ましい。 2—ァミノ糖の場合は、 隣接基関与を示さないァ ジド基を用いて、 2—アジド糖として与えることが望ましい。
糖鎖ライブラリーの合成を考慮して単糖ライブラリーを作製する場合、 ヒ トの 糖鎖において多糖以外においては非還元末端にのみ存在しているシアル酸、 ダル クロン酸、 フコースについては固相に保持させる位置の水酸基のみ遊離の誘導体 を合成すればよい。 その他の単糖、 すなわち、 グルコース、 ガラクトース、 マン ノース、 キシロース、 ダルコサミン、 ガラクトサミンについては、 単糖の各々の 水酸基のみが遊離の誘導体をそれぞれ合成することができる。 シアル酸、 ダルク ロン酸、 フコースについても他の単糖誘導体同様にそれぞれの水酸基を区別する こともできる。
本発明者らによってデザインされ、 本発明のオルトゴナル法と組み合わせた糖 鎖の固相合成において活用される単糖ュニットの例（フエ二ルチオダリコシド体） を図 2に示す。 図 2に記載の化合物（フエ二ルチオグリコシド体）、並びにこれら の化合物中のフエ二ルチオ基をフッ素基に置換した化合物 （フルオリ ド体） から 成る群から選択される少なくとも 1以上の単糖ュニットを含む単糖ライブラリー は、 上記 （1 ) に記載した本発明の糠鎖固相合成方法を行うための単糖ライブラ リーとして有用である。 また、 立体制御を行いたい場合にはァシル基に置換した 化合物を任意に用いることもできる。 図 2に記載の単糖ユニットは、 生体に存在 する糖鎖を構成する 9種の単糖について化学合成法で糖鎖やそれを含む糖鎖ライ ブラリーを構築するために必要不可欠な単糖ュニットである。
なお、 図 2に記載の単糖ユニット中、 既知化合物について以下に論文を記載す る。 Man- 2- OH: Marzabadi, C. H.； Spilling, C D. (1993) J. Org. Chem. 58, 3761—6. Man— 3 - OH: Oshitari, T.； Shibasaki, M.； Yoshizawa, T.； Tomita, M.； Takao, K.； Kobayashi, S. (1997) Tetrahedron 53, 10993 - 11006
Man— 4— OH: Lemanski, G.； Ziegler, T. (2000) Helvetica Chim. Acta 83, 2655-2675.
Man- 6 - OH: Lemanski, G.； Ziegler, T. (2000) Tetrahedron 56, 563-579.
Gal-2-0H: Marzabadi, C. H.； Spilling,. C D. (1993) . Org. Chem. 58, 3761-6. Gal-3-0H: Kanie, 0.； Ito, Y.； Ogawa, T. (1996) Tetrahedron Lett. 37， 4551-4554.
Gal-4-0H: Greenberg, W. A.； Priestley, E. S.； Sears, P. S.； Alper, P. B.； Rosenbohm, C.； Hendrix, M.； Hung, S. - C.； Wong, C. - H. (1999) J. Am. Chem. Soc. 121, 6527-6541.
Gal— 6 - OH: Magaud, D.； Gran jean, C.； Doutheau, A.； Anker, D.； Shevchik, V.； Cotte-Pattat, N.； Robert- Baudouy, J. (1998) Carbohydr. Res. 314, 189-199. Glc - 2 - OH: Ennis, S. C.； Cumpstey, I.； Fairbanks, A. J.； Butters, T. D.； Mackeen, M.； Wormald, M. R. (2002) Tetrahedron 58, 9403-9411.
Glc-4~0H:Motawia, M. S.； 01 sen, C. E.； Enevoldsen, K.； Mar cuss en, J.； Moeller, B. L. (1995) Carbohydr. Res. 277, 109-23.
Glc— 6— OH: Pfaeffli, P. J.； Hixson, S. H.； Anderson, L. (1972) Carbohydr. Res. 231, 195-206.
GlcN- 4- OH: Mart in - Lomas, M.； Fl or e s -Mo s quer a, M.； Chiara, J. L. (2000) Europ. J. Org. Chem. 1547-1562.
GlcN- 6- OH: Takahashi, S.； Kuzuhara, H.； Nakajima, M. (2001) Tetrahedron 57, 6915-6926.
Sia: Marra, A.； Sinay, P. (1989) Carbohydr. Res.， 187 35-42. ( 3 ) 拡散混合による固相反応方法 本発明はさらに、 毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法 において、 固体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うことを特徴 とする固相反応方法に関する。
固相合成は、 ポリマー性生体分子、 たとえば、 ヌクレオチド、 ペプチド、 糖鎖 等の合成に欠かすことのできない合成手法である。 また、 近年、 迅速に医薬品リ 一ド化合物を合成する手法として注目を集めているコンビナトリアルケミストリ 一においても基礎となっている。 固相合成の利点は、 通常の溶液反応において反 応行程毎に必要な反応処理とそれに続くカラムクロマトグラフィーの操作を、 洗 いの操作に置き換えることにより反応プロセスの簡略ィヒを図り、 結果として作業 時間の短縮が達成されることである.。
固相合成において反応の場を提供する固相の例として、 樹脂は、 無機あるいは 有機ポリマーであり、実際の反応の場は内部の細孔である （図 3 )。細孔は広い表 面積を与えるため反応の場となるが、 この細孔中での分子の移動は拡散によって いる。 しかし、 従来の固相合成においてはこのような認識はされておらず、 固相 合成反応は溶液反応の延長として過剰量の溶媒に樹脂を膨潤させ、 撹拌、 振盪、 あるいは、 送液化で反応を行っている （図 4 「従来法」）。 例えば、 反応剤の 1つ は固相に保持され、 他の反応剤は溶液 （液相） として与えられる。 この時、 液相 の溶媒は樹脂が膨潤するのに必要な量に対して過剰量であるので、 過剰な液相か ら反応剤の反応の場 （固相） である樹脂の内部、 すなわち細孔内へと拡散による 移行が必要となる。 さらに、 液相として与えられる反応剤は均一であり、 また、 細孔中の分子の移動は拡散によっているので、撹拌等の外的物理力はおよばなレ、。 従来法では、これらのことが固相反応の反応効率を低下させていると考えられた。 そこで本発明者らは、 上記したような、 固相反応の実際の反応の場は細孔であ るので反応は拡散により支配されると考えられること、 及ぴ、 液相から細孔の内 部への反応剤の移行も拡散に支配されているために過剰量の液相はかえつて反応 効率を下げると考えられること、 の 2点の問題について鋭意検討を行った。 その 結果、 従来の固相反応は、 上記の 2点の改善により格段に効率ィヒが達成されるこ とを確認した。 2つの改善点とは、 （a ) 拡散支配による反応 （拡散混合による固 相反応） と、 （b ) 必要最低限量の溶媒による反応である。 （a ) による効果は、 例えば、 液量低下や、 攪拌、 振盪装置等が不要となることによる合成口ポットの 小型化であり、 （b ) による効果は、例えば、液相に含まれる反応剤の濃縮による 反応時間短縮である。 また、 これらの改善を行うことにより、 省エネルギー、 廃 液の削減、 住 （研究） 環境の改善を同時に達成することができる。
これらの改善、 検討の結果、 本発明者らは、 毛管現象を生じる大きさの固体細 孔中で固相反応を行う方法において、 固体の外表面に余剰の液体が存在しない状 態で反応を行うことを特徴とする本発明の固相反応方法を確立した。 該方法は、 さらに、 攪拌、 振盪等による外的な力を必要とせず、 拡散混合によってのみ反応 を行うことを大きな特徴としている。
本発明における拡散混合による固相反応は固相反応の原理であり、 糖関連の反 応に限定されずにいかなる固相上の反応にも適応できる。 上記した拡散混合によ る固相反応方法は、 好ましくは化学反応または生化学的反応に適用することがで きる。 具体的には、 例えば、 糖鎖合成反応、 ペプチド合成反応、 核酸合成反応、 それらのアナログや複合体等の合成反応、 有機化学合成反応、 酵素反応等が挙げ られ、 さらに好ましくは糖鎖合成反応に適用することができ、 特に好ましくは上 記 （1 ) に記載した本発明の糖鎖固相合成反応に適用することができる。
具体的には、 例えば、 糖鎖固相合成反応の場合には、 固相に結合した第一の単 糖に、 第二の単糖を反応させて結合させる反応は、 第一の単糖が結合している固 相に第二の単糖を含む液相を添カ卩して該固相と反応させることにより行われる。 同様に、 他の化学反応または生化学反応を行う場合にも、 反応に関与する第一の 物質をあらかじめ固相上に結合させておき、 該固相に、 これと反応させる第二の 物質を含む液相を加えて反応を行えばよい。
本発明において固相として用いられる固体とは、 その内部に毛管現象を生じる 大きさの細孔を有し、 その細孔中で前記したような固相反応が行えるものであれ ばいかなるものでも用い得る。固体は、例えば糖鎖固相合成方法を行う場合には、 好ましくはその表面に何らかの官能基を有しているものであって、 さらにこの官 能基に反応に関わる基質と結合し得るリンカーが結合している。 官能基ゃリンカ 一としては、 前記 （1 ) の糖鎖固相合成方法において詳述したもの等を用いるこ とができる。 固体の材質としても、 前記 （1 ) の糖鎖固相合成方法において詳述 したもの等を用いることができ、具体的には、例えば、樹脂、 シリカ、ガラス （多 孔性ガラス）等が挙げられる。樹脂としては、例えば、ポリスチレン、 TG (TentaGel (Novabiochem千土製) )、 PEGA (Aery 1 amide - PEG Co-polymer (Novabiochem社製) ) 等が挙げられ、 これらが内部に適当な細孔を有するように成型されたものを ¾ ^ま しく用いることができる。 これらの内部に存在する細孔の大きさは、 毛管現象を 生じる大きさであればよいが、 適用する反応、 溶媒等に鑑みて適当なものを選択 して用いればよい。
固体の大きさや形状は、 用いる反応容器や装置に応じて適当なものを選択すれ ばよい。 例えば、 樹脂やシリカは、 種々の形状に成型されたものが市販されてい るが、 取扱いが容易である点から、 ビーズ状 （粒状） に成型された樹脂ビーズ等 が好ましく用いられる。 樹脂ビーズの場合、 例えば、 その粒径は 1〜1 0 0 0 μ m程度である。 また、 不定形のものも用いることができる。 それぞれ様々な粒径 及ぴ細孔径を有するものが市販されており、 それらの中から目的の反応に適した ものを選択して用いればよい。 その一例を、 後記表 1に示す。
また、 例えば、 モノリス構造を有する固体も好ましく用いることができる。 モ ノリス （monolith) とは、 つなぎ目のないもの、 一枚岩のようなもの、 との意味 を持つ言葉であって、 一定の質感をもつ単一の素材によって構成されている連続 体を意味する。 例えば、 シリカで構成される 「モノリスシリカ」 の場合、 シリカ の骨格と空隙が一つの物体の中で連続構造をとつている。 このような構造によつ て、 モノリスシリカは、 例えば真球状の粒子が充填されたものと比べて高い空隙 率を有し、 連続構造であるために多くの貫通孔を有するため、 本発明の方法に好 適である。 ポリスチレンモノリス等、 他の材質でもモノリス構造を有する固体の 形成は可能である。 このようなものも、 用いる反応容器や装置に適した形状ゃ大 きさのものを選択して本発明に用い得る。
さらに、 本発明においては、 人工的に形成された細孔を有する物体も用いるこ とができる。 例えば、 人工的に上述したような細孔と同様の効果を奏するように 形成された流路等を有するもの等も、 同様に用いることができる。 より具体的に は、 例えば、 微小流路構造 （以下、 これを 「マイクロチャネル」 と称することが ある） や、 これらが配設されたチップ等を利用することができる。
ここでマイクロチャネルとは、 チャネル （流路） に液体を導入した時に、 マイ ク口効果が現れる、 すなわち液体に何らかの挙動変化が現れる断面形状を持つチ ャネルを意味する。 本発明においては、 このマイクロ効果のうち、 少なくとも毛 管現象が生じるものを用いる。 マイクロ効果の発現には、 液相として用いる溶媒 の物性によっても異なるが、 断面形状、 すなわちチャネルの主流方向に垂直な面 の形状のうち、 最も短い間隔 （長方形なら短辺、 楕円なら短径に相当する） の長 さが通常 5 mm以下、 好ましくは 5 0 0 // m以下、 より好ましくは 2 0 0 /i m以 下であることが適当である。 この長さの下限は特に限定されず、 マイクロチヤネ ルとしての機能を有する長さであればよい。 また、 チップとは、 流路構造を含む 部分の部材を意味する。 またマイクロチップとは、 上記マイクロチャネルよりな る微小流路構造を備えるチップを意味する。 チップの大きさ、 形状は特に限定さ れず、 用途に応じて任意に設定することができ、 それ自体公知の通常用いられる 手法によって作製され得る。
上記いずれの形状のものであっても、本発明において用いられる固体としては、 固体の内部に存在する細孔による空隙が大きいもの、 すなわち、 空隙率が高いも のが好ましい。 特に、 細孔径が小さく空隙率が高いものが好ましい。 本発明の方 法は細孔中の固体表面において反応が行われるので、 細孔径が一定であれば、 一 般に空隙率が高く表面積が大きいものほど反応の効率が高いためである。
本発明において、 液体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うと は、 必ずしも液相がまったく存在しないことを意味するものではなく、 あくまで も余剰もしくは過剰量の液相を用いても反応効率が低下することから、 不要であ ることを意味している。 すなわち、 目的に適う反応効率が十分に達成されるもの であれば多少の余剰の液相が存在してもよく、 攪拌、 振盪、 連続的な送液等の外 的な力を与えずに拡散混合のみによつて効率的に反応が行われるものをすベて包 含する。
液相は、 細孔中での拡散が十分に起こり得る程度に細孔を満たす液量が少なく とも必要である。 すなわち、 少なすぎても多すぎても反応効率は低下し、 また、 溶媒も無駄になるので、 必要かつ最小限の液相を用いるのがよい。 理論上、 固体 細孔がちょうど満たされる最大液量で反応を行うことが最も効率が良い。
固体細孔がちようど満たされる最大液量は、 例えば、 シリカビーズゃシリカモ ノリスのように液相が添加されても膨潤しない性質の固体については、 その固体 に存在する細孔の空隙の量 （以下、 これを 「空隙量」 と称することがある） と理 論上同じである。 空隙量は、 それ自体公知の通常用いられる測定方法により求め ることができる。 一方、 多くの樹脂ビーズのように液相が添加されると膨潤する 性質の固体については、 例えば、 次に例示するような手法により必要な液量 （以 下、 これを 「膨潤液量」 と称することがある） を簡便に決定することができる。 前者の膨潤しない性質の固体についても、 必ずしも測定や計算により求められた 空隙量と実際に必要とされる液量が一致するとは限らない場合もあるため、 同様 の方法により最適な液量を確認することが好ましい。
樹脂を膨潤させるために必要な液量については、以下の表 1や、 Bayer, E. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1991) 30, 113.等を参考にして決定することができるが、 次のようにして実験的に容易に確認し、 知ることができる。
まず、 一定量の樹脂を秤量し、 これに使用する溶媒を滴下する。 この時、 滴下 量を計測する。 大まかな樹脂の膨潤は 1 0分程度で完了するのでこれを目安に滴 下を行う。 必要十分量以上の溶媒が添加された時、 樹脂ビーズ間の摩擦力が低下 し 「液状化」 現象が生じる。 この時の溶媒量を反応に用いる溶媒量と決定すれば よい。 このとき、 例えば樹脂ビーズをシリンダー等の適当な実験容器に秤量し、 この中で溶媒の滴下を行うと、滴下にともなって樹脂ビーズは次第に膨潤する力 膨潤液量を過ぎると必要以上の余剰の溶媒が樹脂ビーズの層の上にただ重層され るだけとなる。 このようにして、膨潤液量（すなわち、細孔中に溶媒が満たされ、 これ以上膨潤しない点） は実験的に容易に確認することができる。 表 1
樹脂 Swelling ml/g
DMF THF MeOH Tol. H,0 CH Cl9
Polystyrene 3 8 2 7 一 7
(200-400 mesh)
Polystyrene 3 8 2 7 一 7
(100-200 mesh)
TG (90 m) 5 6 4 5 4 5
TG (130 μ τα) 5 6 4 5 4 5
PEGA 11 13 13 12 16 13
本発明者らの実験により、 固相、 例えば樹脂の膨潤液量に必要な反応剤 （具体 的には、 例えば、 糖鎖合成法の場合には、 反応に関わる単糖ユニット、 活性化剤 等） を溶解することにより、 反応剤量を同一とした場合には、 反応の場である樹 脂の細孔内部と過剰の液相との間で拡散による移行が不要となった結果、 反応時 間の短縮が達成された。 また、 反応剤が複数ある場合、 反応剤の添加は全て同時 に行うことも複数回に分けて行って、 細孔中で混合させることもできる。
液相として用いる溶媒としては、 それぞれの固相反応に適したものであればい かなるものでも用い得るが、 それ自体が目的の反応に関与しないものであって、 樹脂等の固相とも反応しないものを用いる。 また、 固相との組み合わせにより毛 管現象が生じ易いものを選択することも好ましい。
かくして選択された固相と液相を用いて、 本発明の固相反応方法を行うことが できる。
固相反応自体は、 それ自体公知の通常用いられる手法により行われるが、 本発 明の方法においては、 攪拌、 振盪、 連続的な送液等の外的な力を加えず、 好まし くは静置して行われる。 静置することにより、 反応は拡散混合により行われる。 必要に応じて、 温度調節機能、 送液機能等を備えていることが好ましい。
反応容器 （反応槽） としては、 拡散混合及び反応自体が妨げられず、 十分に進 行できるような状態を維持できるものであればいかなるものでもよく、 目的の反 応、 用いる固相、 液相等に適したものを選択すればよい。 液相の乾燥を防ぐ目的 で適度に密閉が可能なものが好ましい。.
例えば、 固相として用いられる固体としてビーズ状 （粒状） のものを用いる場 合には、 反応槽は、 これらを適当な密度で充填した構造とすることができる。 好 ましくは、 液相を添加、 回収できる構造を有するものを用いる。 具体的には、 例 えば、 一般的に物質の精製 ·分離等に用いられているカラム類と類似の構造等が 挙げられる （例えば、 図 4 「本発明」）。 また、 モノリス構造を有する固体を用い る場合も、 同様に固体の大きさや形状に適した反応槽に収容されることが好まし い。
一方、 人工的に形成された細孔を有する物体、 例えば、 微小流路構造 （マイク ロチャネル） を有するチップ等を用いる場合には、 チップ自体が反応槽として用 いられることができ、 これに配設された流路 （チャネル） に毛管現象によって液 相が流入し、 反応後の液相を回収可能な構造となっていればよい。 また、 このよ うな構造のチップの流路内に上記のようなビーズ状もしくはモノリス構造等の固 体を充填することもできるし、 流路内壁をコーティングすることもできる。 前記 （1 ) に記載の糖鎖固相合成方法は、 昇温率を制御して反応系の温度を変 化させることにより高効率で糖鎖の固相合成を行う方法であるので、 本法のよう に固相反応を少量の溶媒で効率良く行うことができる方法と組み合わせることに より、 さらに効率的に合成を行うことができる。特に、例えば、前記したように、 コンビナトリアルケミストリーにより糖鎖ライブラリーを構築しょうとする場合 等には、 少量でも非常に多数の組み合わせで反応を行って多種類の糖鎖を合成す る必要がある。 この目的のために、 一度に多数の反応を同時進行させることので きる前記 （1 ) の糖鎖固相合成方法と、 少量の液相で静置しておくだけで反応を 行うことができる （攪拌、 振盪、 連続的な送液等に関わる装置が不要な） この固 相反応方法とを組み合わせることは、 非常に好適である。
以下に、 本法と前記 （1 ) に詳述した本発明の糖鎖固相合成方法を組み合わせ て用いる場合を例に挙げて、 さらに具体的に説明する。
まず単糖ユニット （供与体） が結合した樹脂 （P— L— O— A i _ X) を準備 する。 次に、 たとえばこの樹脂を結合せしめる単糖ユニット （受容体； H O— A 2 - Y) を含む溶液で膨潤し、 脱離基の活性化剤 （プロモーター） を加えて反応 させる方法 （方法 1 )、 又は、 樹脂 （P— L— Ο— Α 1— X) と結合せしめる単糖 ユニット （Η Ο _ Α 2— Υ) と脱離基の活性化剤の混液により膨潤して反応させ る方法 （方法 2 ) を繰り返すことにより、 樹脂上に任意の長さの糖鎖を合成する ことができる。 方法 1又は 2は、 反応の進行状態に応じて、 いずれの方法でも任 意に選択することができる。
か して得られる糖鎖が結合した樹脂を、 前記のとおり必要に応じて適当な溶 媒で洗浄し、 樹脂から糖鎖を切り出すことにより、 目的の糖鎖を取得することが できる。
本発明による拡散混合による固相反応方法によれば、 固相反応において撹拌、 振盪等物理的に混合のための操作を施す必要がない。 すなわち、 固相反応を樹脂 細孔内の分子の拡散に委ねることにより、 固相反応が達成される。 これにより反 応装置の小型化が達成できる。 従来の合成装置が反応槽、 温度調節器、 分注器、 撹拌装置、 ガス置換装置から構成されているのに対し、 本発明の方法を行うため の反応装置としては、 （ i )反応槽、温度調節器、分注器及びガス置換装置から成 る装置、 あるいは、 （i i )反応槽、温度調節器、流路変換装置及び送液ポンプか ら成る装置などを利用できる。
即ち、 本発明によれば、 少なくとも以下の （1 ) と （2 ) とを含む、 拡散混合 による固相反応を行うための反応装置が提供される。
( 1 ) 液相を注入又は吸引するための導入部を有し、 かつ固体を収容する空間を 有する、 固相反応を行うための反応部、 及び
( 2 ) 反応部の温度を調節するための温度調節部
( 4 ) 本発明の糖鎖固相合成方法で得られるライブラリー
上記 （1 ) に記載した本発明の糖鎖固相合成方法により合成された、 生体中に 存在する単糖から選ばれる 3種類の糖の全ての組み合わせから成る糖鎖により構 成されるライブラリーも本発明の範囲内である。生体中に存在する単糖としては、 好ましくは、 マンノース、 グルコース、 ガラクトース、 キシリ トース、 ダルコサ ミン、 ガラクトサミン、 グルクロン酸、 フルクトース又はシアル酸を使用するこ とができる。
糖鎖ライブラリーの重要性は今後増大すると考えられるが、 そのターゲットと しては、 生体に存在する 9撣類の単糖から任意に 3種類を選択して得られる組み 合わせから成る 3糖ライブラリーとすることが望ましい。 このようにして得られ る糖鎖ライブラリ一は、 直接機能研究のためのプローブとして使用したり、 また は医薬リードとして用いたり、 生体内の糖鎖を模したライブラリーとして医薬品 のスクリーユング等にも用い得る。
生体内の糖鎖は、 一般に 1〜 5個の単糖が連結したものであり、 これらが免疫 反応等における細胞間認識、 ウィルスやバクテリアの認識等、 複雑な認識現象に かかわつていることが知られている。 本発明の生体内に存在する単糖から選ばれ る 3種類の糖のすべての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリー は、 実際にヒ トの生体内に存在する糖鎖を平均的に摸したラブラリーとして有用 である。 9種の生体内に存在する単糖から成る 3糖の組み合わせの数は 140, 824 通りであるが、 ライブラリ一がカバーする範囲を限定することもできる。
本発明においては、 本明細書中上記した任意の単糖ユニットを用い、 本明細書 中上記したオルトゴナルグリコシル化法に基づいて、 本明細書中上記した拡散混 合固相反応法に従い糖鎖の合成を行うことにより、 ァセタール （ァノメリック） 位の立体異性体 (23=8) 混合物が得られ、必要に応じてこれらを HPLCを用いて分 離することができる。 （図 5 )。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されるものではない。 なお、 以下の実施例で用いる化学反応および糖鎖 合成反応の一般的手法、試薬等.は、「固相合成ハンドブック（Novabiochem社（Merck 社） 刊」 等の一般的実験書等に記載のものを用いることができる。 実施例
TLCは Merk Art 5715 Silicagel 60 F254を用い、 検出は UV吸収及ぴ発色試薬 (10%¾S04-ェタノール）で行つた。 カラムクロマトグラフィーは Merk Art 7734 Silicagel 60 70- 230meshを用いた。 ¾及び13 C-腿は BUKER ACVANCE 500あるレヽ は JE0L EX- 270で測定し、ケミカルシフト値は内部標準物質（テトラメチルシラン） に対する δ値 (ppm)で示した。 MALDI- T0FMASは Perseptive Voyger™で測定し、 matrixには 2, 5-ジヒドロ安息香酸を用いた。 FT- IRは H0RIBA FT720を使用した。 Resin ίま NovasynR TG amino resin HL (0. 29mmol/g loading)を使用した。 反応【こ 用いた C2H4C12は Aldrich 1, 2dichloroethane anhydrous 99. 8%を用い、 EtCNは CaH2により減圧蒸留した。 固相反応には BohdanR Miniblock™を用いた。 実施例 1 ：保護単糖ライブラリ一
図 1に記載の単糖ライブラリー中、 Man- 2- 0H、 Man- 3- 0H、 Man- 4- 0H、 Man- 6_0H、 Gaト 2- 0H、 Gaト 3- 0H、 Gal- 4- 0H、 Gal- 6- 0H、 Glc- 2- 0H、 Glc- 4- 0H、 Glc- 6- 0H、 GlcN- 4- 0H、 GlcN- 6-0H、 Siaの 1 4種類については本明細書中上記した通り公知化合物である。
Man- 2- 0H、 Man- 3- 0H、 Man- 4- 0H、 Man- 6- OHの合成については、 Kametani, T.； Kawamura, K.； Honda, T. (1987) J. Am. Chem. Soc. 109, 3010-17； Lemanski, G.； Ziegler, T. (2000) Tetrahedron 56, 563 - 579； Lemanski, G.； Ziegler, T. (2000) Helvetica Chim. Acta 83, 2655 - 2675； Oshitari, T.； Shibasaki, M.； Yoshiza a, T.； Tomita, M.； Takao, K.； Kobayashi, S. (1997) Tetrahedron 53, 10993 - 11006； Marzabadi, C. H.； Spilling, C. D. (1993) J. Org. Chem. 58, 3761-6 ; Street, I. P.； Withers, S. G. (1986) Can. J. Chem. 64, 1400-3 ； Muragata, T. ； K. , Masami； S.， Y. ; S.， H. ； Suzuki, S.； Ogawa, T Jpn. Kokai Tokkyo Koho (1994) , 44 pp. CODEN: JKXXAF JP 06293790 A2 19941021 Heisei. Patent written in Japanese. Application: JP 93-81955 19930408. CAN 123 : 83943 AN 1995 : 662332 を参照で さる。
Siaの合成については、 Dasgupta, F. (Glycomed, Inc. , USA) . U. S. (1992) , 9 pp. CODEN: USXXAM US 5138044 A . 19920811 Patent written in English. Application: US 90-566682 19900813. CAN 118 : 81335 AN 1993 : 81335 CAPLUS (Copyright 2003 ACS)； Marra, A. ； Sinay, P. (1989) Carbohydr. Res. , 187 35-42 ； Sharma, N. , M. ； Eby, R. (1984) Carbohydr. Res. , 127 201- 210を参照できる。 上記以外の単糖については以下の通り合成した。
( 1 ) ガラクトース誘導体のフッ素化物の合成
フエニル 2-0~ク口口ァセチル- 3， 4， 6-トリ ベンジル- 1-チォ- 3 - D -ガラクトピ ラノシド
Figure imgf000038_0001
化合物 28 (300mg, 0. 55mmol)を CH2C12 (5. 4mL)、ピリジン （0. 3mL)に溶解させ、 氷冷下でク口口ァセチル chloride (88 μ L， 1. llmmol)を加え、 室温で 4時間撹拌 した。 反応終了後、 CH2C12で抽出し、 HC1で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮 した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン：酢酸ェチル =15 ： 1)で精製し、化合物 38 (323mg, 0. 52讓 ol)を 94%の収率で得た。 TLC トルエン：酢 酸ェチル =6 ： 1 Rf=Q. 62. ¾- MR (CDCL)： δ 7. 50-7. 22 (20Η, m, Ph x 4) , 5. 45 (IH, t, J=9.5Hz, H- 2), 4.93, 4.68, 4.63, 4.56, 4.50, 4.43 (6H， each d, 7=12. OHz, ベンジルメチレン x 3), 4.68 (IH, d, H- 1), 4.00 (IH, t, J=2.8Hz, H-4), 3.97 (IH, d, 一 CH2C1), 3.90 (1H， d, ゾ =15. OHz, — CH2C1)， 3.66-3.63 (3H， m, H— 3， H— 5, H-6a), 3.58 (IH, dd, J=9.5Hz, J=3. OHz, H— 6b).
2 -^ク口口ァセチル- 3, 4, 6-トリ - ベンジル- β - D -ガラクトピラノシルフルォリ ド (39)
Figure imgf000039_0001
化合物 38 (308mg, 0.50mmol)、 を CH2C12 (4. OmL)に溶解させ、 窒素気流下- 15 で MST (79 μ L, 0.60mmol)、 BS (107mg, 0.60mmol)を加え、 1時間撹拌した。 反 応終了後、 CH2C12で抽出し、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチル =20 ： 1)で 精製し、 化合物 39 (180mg, 0.34mmol)を 68%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢酸 ェチル =6： 1 Rf=0.60. ¾-NMR (CDC13)： δ .68—7.26 (15H, m, Ph x 3), 5.80 (IH, dd, /li2=2.8Hz, /1(F=54.6Hz, H— 1)， 5.41 (IH, dd, /=10.5Hz, J=25. OHz, H - 2)， 4.93: 4.72, 4.63, 4.57, 4.50, 4.44 (6H, each d, =11. OHz, ベンジルメチレン x 3)， 4.13 (IH, t, J=6.5Hz) , 4.08 (IH, d, H-4), 4.05-4.01 (2H, m, - CH2C1), 3.96 (IH, dd, J=2.5Hz, /=10.5Hz, H - 3), 3.60-3.59 (2H, m, H- 6a， H- 6b).
3, 4, 6-トリ - ベンジル- β - D-ガラタトピラノシルフルォリ ド（40)
Figure imgf000040_0001
化合物 39 (146mg, 0.28mmol)をピリジン （6. OmL)、 エタノール （1.0ml)に溶解 させ、 チォ尿素 （21mg， 0.28mmol)を加え、 80°Cで 1時間撹拌した。 反応終了後、 CH2C12で抽出し、 HC1、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これ をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチル =10 ： 1)で精製 し、 化合物 40 (94mg, 0.21匪 ol)を 75%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢酸ェチ ル =6 ： 1 Rf^Q.31. ー腿 (CDC13)： δ 7.40-7.22 (15H, m, Ph x 3), 5.65 (1H, dd, , 2=2.8Hz， /liF=54.7Hz, H— 1), 4.87, 4.73, 4.61, 4.56, 4.51， 4.44 (6H， each d, ゾ =11.8Hz， ベンジルメチレン X3)， 4.20 (1H, dd, =10. lHz， =25.4Hz, H - 2)， 4.12 (1H, t, /=6.8Hz, H— 5)， 4.06 (1H, d， J=l.6Hz, H— 4)， 3.75 (1H, dd, J=2.6Hz, ゾ =10.2Hz, H-3) , 3.65-3.57 (2H, m, H_6a, H— 6b) . 13C -應 R (CDC13) ： δ 108.3, 106.2, 7.6, 74.7， 73.5, 73.1, 72.2， 71.9, 68.3, 60.7 フェニル 3- -ク口口ァセチル- 2， 4， 6-トリ - -ベンジル -1 -チォ- β - D-ガラクトピ ラノシド（41)
Figure imgf000040_0002
化合物 32 (140mg, 0.25mmol)を CH2C12 (2.7mL)、ピリジン（0.15mL)に溶解させ、 氷冷下でク口口ァセチルク口ライド（41μ L, 0.51mmol)を加え、室温で 1.5時間撹 拌した。 反応終了後、 C¾C12で抽出し、 HC1で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃 縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチル
=20 ： 1)で精製し、 化合物 41 (145mg, 0.23mmol)を 91%の収率で得た。 TLC トル ェン： 酢酸ェチル =6 ： 1 =0.70. -腿 （CDC13)： δ 7.58- 7· 15 (20Η, m, Ph x 4), 4.98 (IH, dd, /=3.0Hz, J=9.7Hz, H— 3), 4.83, 4.68, 4.57, 4.53, 4.52, 4.45 (6H, each d, J=U.1Hz, ベンジルメチレン X3), 4.59 (IH, d, /=7.5Hz, H— 1)， 4.05 (IH, d, /=2.9Hz, H-4), 3.95 (IH, t, J=9.6Hz, H— 2), 3.74 (IH, t， =6.6Hz， H— 6a): 3.66 (1H， d， 7=11.8Hz, — CH2C1), 3.58 (IH, d, /=11.8Hz, — CH2C1)， 3.63-3.54 (H-4, H-5, H-6b) - ク口口ァセチル- 2, 4, 6-トリ -0·ベンジル- β -D -ガラタトピラノシルフルォリ ド (42)
Figure imgf000041_0001
化合物 41 (132mg, 0.21mmol)、 を CH2C12 (2.5mL)に溶解させ、 窒素気流下- 15°C で MST (34 0.25ramol)、 BS (46mg, 0.25腿 ol)を加え、 1時間撹拌した。 反 応終了後、 CH2C12で抽出し、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン：酢酸ェチル =20： 1)で精 製し、 化合物 42 (llOmg, 0.21匪 ol)を 98%の収率で得た。 TLC トルエン：酢酸ェ チル =6 ： 1 Rf=0.68. ¾—雇 R (CDC13)： δ 7.40-7.17 (15H, m, Ph x 3) , 5.60 (IH, dd, J=2.7Hz, /=53.2Hz, H - lb), 5.28 (1H， dd, =4.7Hz, /=10.8Hz, H— 3)， 5.05 (IH, dd, /=6.9Hz, H- lb), 4.83, 4.69, 4.66, 4.58， 4.53, 4. 6 (6H， each d, 7=11.7Hz, ベンジルメチレン x 3), 4.22 (IH, t, J=6.8Hz, H - 5), 4.14 (1H， d, J=2.5Hz, H-4), 4.04 (IH, dd, J=2.8Hz, =10.3Hz, H— 3)， 4.01 (1H， t, J=2.5Hz, H-2), 3.94-3.89 (2H, m, H— 6a, H— 6b)， 3.81 (IH, d, J= .8Hz, CH2C1), 3.74 (IH, d， /=14. 8Hz, CH2C1) .
2, 4， 6-トリ一 0~ベンジル- /3 - D-ガラタトピラノシルフルォライド （43)
Figure imgf000042_0001
42 43 方法 1
化合物 42 (lOlmg, 0. 19画 ol)をピリジン (6. OmL)、 ェタノール (1. 0ml)に溶解さ せ、チォ尿素 （16mg, 0. 21mmol)を加え、 80°Cで 1時間撹拌した。反応終了後、 CH2C12 で抽出し、 HC1、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリ 力ゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチル =12 ： 1)で精製し、 化 合物 43 (67mg, 0. 15譲 ol)を 77%の収率で得た。 方法 2
化合物 32 (191mg, 0. 35勤 1)、 を CH2C12 (2. 5mL)に溶解させ、 窒素気流下 - 15°C で DAST (233 μ L, 1. 72讓 ol)、 BS (69mg, 0. 39腿 ol)を加え、 1時間撹拌した。 反 応終了後、 CH2C12で抽出し、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチル =12 ： 1)で 精製し、 化合物 43 (60mg, 0. 13mmol)を 38%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢酸 ェチル =6 ： 1 Rf:Q. 40. ¾-NMR (CDC13) ： δ 7. 35—7. 16 (15H， m, Ph χ 3) , 5. 60 (1Η, dd,ん =2. 5Hz,人 F=53. 7Hz， H- 1) , 4. 81, . 73, 4. 68, 4. 62, 4. 52, 4. 43 (6H, each d， /=11. 4Hz, ベンジルメチレン x 3) , 4. 15 (1H, t, J=6. 8Hz, H- 5) , 4. 07 (1H, dd, /=3. 2Hz, /=9. 6Hz, H— 3)， 3. 99 (1H, d, J=2. 6Hz, H— 2)， 3. 80 (1H, dd, J=9. 9Hz, 7=25. 2Hz, H-2) , 3. 61-3. 58 (1H, . m, H-6a, H- 6b) . 13C- MR (CDC13) ： δ 108. 1, 104.3, 76.5, 75.9， 75.2， 73.4, 73.0， 71.6, 69.8, 68.2 フエニル 4 -^ク口ロアセチル -2, 3, 6-トリ - ベンジル- 1 -チォ- j3 -D -ガラク トピ ラノシド （44)
Figure imgf000043_0001
化合物 34 (150mg, 0.28匪 ol)を CH2C12 (2.7mL)、 ピリジン （0.15mL)に溶解さ せ、 氷冷下でクロロアセチルクロライド （44 zL, 0.55讓 ol)を加え、 室温で 2時 間撹拌した。 反応終了後、 CH2C12で抽出し、 HC1で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減 圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチ ル =20 ： 1)で精製し、 化合物 44 (160mg, 0.26mmol)を 94%の収率で得た。 TLC ト ルェン： 酢酸ェチル =6 ： 1 J?f=0.70. ¾-NMR (CDC13)： δ 7.61-7.13 (20Η, m, Ph x 4), 5.70 (1H, d, /=3. OHz, H- 4), 4.76, 4.75, 4.72, 4.64, 4.53, 4.52 (6H, each d, ベンジルメチレン x 3)， 4.60 (1H, /=7.8Hz, H— 1), .04 (1H, d, ゾ =14.9Hz， -CH2C1) , 3.98 (lh, d, /=14.9Hz, — CH2C1), 3.78 (1H, t, ゾ =6.8Hz, H— 5), 3.66 (1H, dd, J=3.2Hz, J=9.1Hz, H— 3), 3.63-3.58 (2H, m, H - 6a, H - 6b), 3.51 (1H, t, H-2).
4 -^ク口口ァセチル- 2， 3, 6 -トリ - -ベンジル- β _D -ガラクトビラノシルフルオラ ィド （45)
Figure imgf000044_0001
化合物 44 (146mg, 0.23醒 ol)、 を CH2C12 (2.5mL)に溶解させ、 窒素気流下- 15°C で DAST (38 μ L, 0.28ramol)、 NBS (50mg, 0.28mmol)を加え、 1時間撹拌した。 反 応終了後、 CH2C12で抽出し、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチル =20 ： 1)で 精製し、 化合物 45 (117mg, 0.22墮 ol) を 94%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢 酸ェチル =6 ： 1 Rf=Q.69. ¾- MR (CDC13)： δ 7.51 - 7.29 (15H, m， Ph x 3), 5.73 (IH, d, J=2.4Hz, H-4), 5.60 (IH, dd，人 2=2.6Hz， Jv F=53.0Hz, H— 1)， 4.82, 4.77, 4.67, 4.58， 4.54, 4.30 (6H, each d， /=11.8Hz, ベンジルメチレン X 3), 4.27 (IH, t， 7=6.5Hz, H-5), 4.03 (IH, d, /=15.3Hz, - CH2C1), 3.99-3.94 (2H, m, H - 3, -CH2C1) , 3.71 (IH, dd, /=9.7Hz, 7=25.3Hz, H-2), 3.54 (IH, dd, /=6.2Hz, J=9.0Hz, H-6a), 3.45 (IH, t, J=9.3Hz, H - 6b).
2, 3， 6-トリ - -ベンジル- β - D-ガラクトビラノシルフルォライド （46)
Figure imgf000044_0002
方法 1
化合物 45 (108mg, 0.20mmol)をピリジン （6. OmL)、 エタノール （1.0ml)に溶解 させ、 チォ尿素 （16mg, 0.21匪 ol)を加え、 80°Cで 1時間撹拌した。 反応終了後、 CH2C12で抽出し、 HC1、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これ をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トノレェン： 酢酸ェチル =12 ： 1)で精製 し、 化合物 46 (51mg, 0· llramol)を 55%の収率で得た。 方法 2
化合物 34 (120mg, 0. 22励 1)、 を CH2C12 (2. 5mL)に溶解させ、 窒素気流下 - 15°C で DAST (146 1. 11讓 ol)、 NBS (43mg, 0. 24mmol)を加え、 1時間撹拌した。 反 応終了後、 CH2C12で抽出し、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチル =12 ： 1)で 精製し、 化合物 46 (40mg, 0. 09mmol)を 40%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢酸 ェチル =6 ： 1 Rf=0. 47. ¾-NMR (CDC13) ： 7. 37 - 7. 17 (15H， m, Phx3) , 5. 40 (1H, dd, 人 2=2. 6Hz， ， F=53. 0Hz， H-l a ) , 5. 15 (1H, dd, J=l. 2Hz, 7=52. 7Hz, H— 1 /3 ) , 4. 83， 4. 78, 4. 74, 4. 71, 4. 60, 4. 55 (6H， each d, =11. 4Hz， ベンジルメチレン x 3) , 4. 09 (1H, s， H-4) , 4. 07 (1H, t, J=5. 7Hz, H— 5)， 3. 91 (1H, dd, J=2. 5Hz, J=9. 8Hz, H-3) , 3. 81-3. 64 (3H, m, H— 2， H— 6a， H— 6b) . 13C—腿 (CDC13) δ 108. 1, 104. 3, 76. 5, 75. 9, 73. 4, 73. 0, 71. 6, 69. 8, 68. 2. フエ二ノレ も- 0~ク口口ァセチル- 2, 3, 4-トリ - ベンジル -トチ才- β -D -ガラクトピ ラノシド （47)
Figure imgf000045_0001
化合物 37 (150mg, 0. 28mmol)を CH2C12 (2. 7mL)、 ピリジン (0. 15mL)に溶解さ せ、 氷冷下でク口口ァセチルク口ライド （44 μ L, 0. 55mmol)を加え、 室温で 2時 間撹拌した。 反応終了後、 （： ( 12で抽出し、 HC1で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減 圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチ ル =15 ： 1)で精製し、 化合物 47 (171mg, 0. 28腿 ol)を定量的に得た。 TLC トルェ ン： 酢酸ェチル =6 ： 1 Rf=0. 52. ¾ -匪 R (CDC13) ： δ 7. 56-7. 18 (20Η, m, Ph x 4) , 5. 00, 4. 83, 4. 79, 4. 74, 4. 63, 4. 62 (6H, each d, 7=11. 8Hz, ベンジルメチレ ン x 3) , 4. 74 (IH, d, H— 1) , 4. 35 (IH, dd, /=7. 1Hz, 7=11. 2Hz, H— 6a)， 4. 13 (IH, dd, /=5. 5Hz, ゾ =11. 3Hz, H— 6b)， 3. 95-3. 87 (3H， m, H— 3， — CH2C1)， 3. 82 (IH, d, =2. 4Hz, H-4) , 3. 61—3. 59 (1H， m, H—2, H— 5) .
6 -^ク口口ァセチル -2， 3, 4-トリ - ί? "ベンジル- β - D-ガラクトピラノシルフルオラ ィド （48)
Figure imgf000046_0001
化合物 47 (171mg, 0. 27mmol)、 を CH2C12 (2. 5mL)に溶解させ、 窒素気流下- 15°C で DAST (44 μ L, 0· 33腿 ol)、 BS (59mg, 0. 33讓 ol)を加え、 1時間撹拌した。 反 応終了後、 CH2C12で抽出し、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチル =20 ： 1)で 精製し、 化合物 48 (119mg, 0. 22mmol)を 82%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢酸 ェチル =6 ： 1 Rf=Q. 50.
Figure imgf000046_0002
化合物 48 (119mg, 0.23腿 ol)をピリジン （6. OmL)、 エタノール （1.0ml)に溶解 させ、チォ尿素 （20.6mg, 0.27mmol)を加え、 80°Cで 1時間撹拌した。反応終了後、 CH2C12で抽出し、 HC1、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これ をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチル =10 ： 1)で精製 し、 化合物 49 (78mg, 0.17墮 ol)を 76%の収率で得た。
Compound 49 α ： TLC トルエン： 酢酸ェチル =6 ： 1 Rf=Q.47. - NMR (CDC13)： δ 7.41-7.15 (15H, m, Ph x 3) , 5.60 (1H， dd, J=2.3Hz, J=53.8Hz, H- 1), 4.95, 4.88, 4.83, 4.72, 4.68, 4.64 (6H, each d, /=11.6Hz, ベンジルメチレン X 3)， 4.12 (1H， dd, H-2), 4.08—3.91 (3H, m， H— 3， H— 4, H— 5), 3.75 (IH, dd, J=9.6Hz, =5.8Hz, H - 6a), 3.52 (IH, dd, J=5.6Hz, H- 6b). 13C—證 (CDC13) ： δ 104.4 (C - 1): 78.3 (C - 2), 75.9, 73.7, 72.9, 61.9 (C - 6).
Compound 49/3 TLC トルエン：酢酸ェチル =6 ： 1 J?f=0.40. - MR (CDC13) : δ 7.38-7.25 (15H, m, Ph x 3) , 5.20 (IH, dd, /=6.6Hz, =53.1Hz, H - 1), 4.94, 4.86, 4.85, 4.80, 4.74, 4.69, 4.64 (6H， each d， J=ll.6Hz, ベンジルメチレン x 3)， 3.98 (IH, m, H - 2), 3.87-3.81 (2H, m， H— 4， H— 6a)， 3.60 (IH, d, H - 3), 3.55—3.50 (2H, m, H— 5， H-6b) . 13C— NMR (CDC13) ： δ 108.5 (C—l)， 80.4, 79.1 (C— 2)， 76.5, 72.5， 61.9(c- 6)
Gal-!
Figure imgf000048_0001
Tt.. 3? (1595)4551-4554
Figure imgf000048_0002
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( 2 ) キシロース誘導体の合成
フエニル 2, 3， 4 -トリ- ^ァセチル- 1-チォ- J3 -D-キシロビラノシド（50)
Figure imgf000049_0001
D-xylose 50
D -キシロース（10g, 0. 06mol)をピリジン（30mL)に溶解させ、氷冷下、 Ac20 (30mL) を加え室温で 12時間撹拌した。反応終了後、 トルエンを加えて減圧濃縮し、化合 物 50 (17. 6g, 0. 06mol)を定量的に得た。 TLC トルエン： 酢酸ェチル =4 ： 1 Rf=0. 42. フエニル 2, 3, 4 -トリ - ァセチル - 1 -チォ- - D-キシロビラノシド（51)
Figure imgf000050_0001
化合物 50 (23g, 0. 07mol)を CH2C12 (20mL)に溶解させ、 PhSH (8. 2mL, 0. 08mol) と BF3Et 20 (18. 3mL, 0. 14mol)を窒素気流下で氷冷しながら加え、 2時間攪拌し た。 反応終了後、 CH2C12で抽出し、 MgS04.で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシ リカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル =4： 1)で精製し、 ィ匕 合物 51 (22g, 0. 064mol)を 83%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢酸ェチル =4 ： 1 Rf=0. 50. フエニル 1-チォ - ]3 - D-キシロビラノシド（52)
Figure imgf000050_0002
化合物 51 (22g， 0. 06mol)をメタノール（50mL)に溶解させ 0. 5M CH30Na/メタノ ール (0. 5mL)を加え、 1時間攪拌した。反応終了後、イオン交換樹脂を加え中性に 戻し、 PH試験紙で確認後、ろ過をした。得られたろ液を減圧濃縮し、化合物 52 (14g, 0. 06mol)を定量的に得た。 TLC CH2C12 ： メタノール t二 4 ： 1 Rf^O. 49. フエニル 3, 4-ジ- ベンジル- 1-チォ - i3 -D-キシロビラノシド（53)， フエニル 2，4-ジ - ベンジル- 1 -チォ - j3 - D-キシロビラノシド（54) , 及ぴフエニル 2, 3 -ジ - ベンジ /レ- 1 -チォ- j3 -D-キシロピラノシド（55)
Figure imgf000051_0001
化合物 52 (300mg, 1.2mmol)をトルエン （lOmL)に溶解させ、 Bu2SnO (340mg, 1.3mmol)を加え、 3時間加熱還流した後、減圧濃縮した。得られた残渣を DMF (lOmL) に溶力、し、 CsF (900mg, 7.2mmol)と BnBr (800 ^L, 7.2mmol)を加え 2時間攪拌し た。 反応終了後、 酢酸ェチルで抽出し、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、減圧 濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン：酢酸ェチル =10:1)で精製し、 化合物 53 (180mg, 36.1%)、 54 (250mg, 50.1%) 、 55 (26mg, 5.3%)が得られた。
Compound (53)： TLC トル ン： 酢酸ェチル =2 ： 1 Rf=Q.73. -墮 (CDC13) δ： 7.51-7.23 (15H, m， Ph x 3) , 5.30 (1H, d, /1>2=4.7Hz, H— 1), 4.79, 4.75, 4.64, 4.60 (4H, d. ベンジル メチレン χ 2), 4.41 (1H, dd, , 5a=11.9Hz, a5b=ll.9Hz, H-5a) , 3.71 (1H, t, ,3=4.9Hz, H— 2)， 3.64 (1H， q, H— 4), 3.51 (1H, dd, ム, 5b=5.2Hz, a,5b=11.5Hz， H - 5b)， 3.10 (1H, d, H- 3). 13C - NMR (CDC13) 8 : 86.7, 77.8, 73.5, 73.4, 71.9, 68.0, 65.4, 64.7.
Compound (54)： TLC トルエン： 酢酸ェチル =2 ： 1 Rf=Q.79. ¾-腿 (CDC13) δ： 7.54-7.21 (15H, m, Ph x 3), 4.92 (1H, d, ん =6.2Hz, H-l)， 4.83, 4.76, 4.65, 4.61 (4H, d, ベンジル メチレン X 2), 4.30 (1H， dd,人 5a=11.8Hz， /5a>5b=3.1Hz, H-5a) , 3.72 (IH, t, J=5.90Hz, H— 2), 3.62 (IH, t， ,4=6.1Hz, H - 3), 3.58 (IH, q, H-4), 3.57 (1H， dd, , 5b=6.0Hz， /5a,5b=2.9Hz) . 13C-腿 (CDC13) 8： 88.1, 80.4, 77.9, 77.3， 76.7, 75.2, 73.1, 67.5.
Compound (55)： TLC トルエン： 酢酸ェチル =2 ： 1 Rf^.75. - NMR (CDC13) δ： 7.54-7.21 (15H， m, Ph x 3) , 4.71 (IH, d, ,2=5. lHz)， 4.92, 4.74, 4.68, 4.61 (4H, d， ベンジル メチレン x2), 4.04 (IH, dd,ム, 5a=5.0Hz, a，5b=ll.6Hz， H- 5a)， 3.72 (IH, t， 3=8.8Hz, H- 2)， 3.51 (IH, q, H-4), 3.30 (IH, t,人4=9.3Hz， H - 3)， 3.20 (IH, t, /5a 5b =11.1Hz, H - 5b). 13C-NMR (CDC13) δ： 88.9， 79.2, 75.9, 73.9， 72.4, 70.8.
PhS-^-Xyl & Xylo-I
Figure imgf000052_0001
Lee, E.； Bruzzi, A.； 0， Brien, E.； 0， Colla, P. S. (1979) Carbohydr. Res. 331-4.
Lopez, R.； Fernandez - Mayoralas, A. (1994) J. Org. Chem. 59, 737 - 45.
(3) フコース誘導体の合成
1, 2, 3, 4, 6-ペンタ-^ァセチル j3 -L-フコピラノシド（56)
Figure imgf000053_0001
L-フコース （10g, 0. 06mol)をピリジン（30mL)に溶解させ、氷冷下、 Ac20 (30mL) を加え室温で 12時間撹拌した。反応終了後、 トルエンを加えて減圧濃縮し、化合 物 56 (17. 6g, 0. 06mol)を定量的に得た。 TLC トルエン：酢酸ェチル =4： 1 ^=0. 42. フェニル 2, 3 4, 6 - terta- ァセチル -：!-チォ- β -L -フコピラノシド（57)
Figure imgf000053_0002
化合物 56 (22g, 0. 076mol)を CH2C12 (30mL)に溶解させ、 PhSH (8. 6mL, 0. 083mol) と BF3Et 20 (19. 3mL， 0. 152mol)を窒素気流下で氷冷しながら加え、 2時間攪拌し た。 反応終了後、 CH2C12で抽出し、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシ リカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル =2： 1)で精製し、 化 合物 57 (22g, 0. 064mol)を 85%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢酸ェチル -4 ： 1
Rf=0. 50. フエニル 1 -チォ- - L-フコピラノシド（58)
Figure imgf000054_0001
化合物 57 (18g, 0.047mol)をメタノール（50mL)に溶解させ、ナトリウムメ トキシ ド メタノールを加え、 1時間攪拌した。 反応終了後、 イオン交換樹脂を加え中 性に戻し、 pH試験紙で確認後、ろ過をした。 得られたろ液を減圧濃縮し、 化合物 58 (12g, 0.047mol)を定量的に得た。 TLC CH2C12 ： メタノール t=4 ： 1 Rf=Q.49. フェニル 3, 4-0"ベンジリデン -1-チォ- β - L-フコピラノシド（59)
Figure imgf000054_0002
化合物 58 (2. Og, 5.9mmol)を DMF (7. OmL)に溶解させ、ベンズアルデヒ ドジメチ ルァセタール（1.33mL, 8.9mmol)と TsOH (112mg， 0.59讓 ol)を加え、 45°Cで 1時 間攪拌した。 反応終了後、 'トリェチルァミンで中和し、 減圧濃縮した。 これをシ リカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン： 酢酸ェチル =3 ： 1)で精製し， ィ匕 合物 59 (1.84g(a, b mixture) , 5.1謹 ol)を 87%の収率で得た。
Compound 59a: TLC トルエン： 酢酸ェチル =4 ： 1 f=0.52. -賺 (CDC13)： δ 7.54-7.26 (10H, m, Ph x 2) , 6.19 (IH, s， ベンジリデンメチン）, 5.17 (IH, dd, J=6.8Hz, /=10.4Hz, H— 2), 4.67 (IH, d， =10. OHz, H— 1), .48 (1H， t, J=5.7Hz, H-4), 4.11 (IH, dd, J=2.9Hz, 7=5.3Hz, H— 3), 3.87 (1H， q, H— 5), 1.38 (3H, d, J=6.5Hz, H-6). Compound 59b: TLC トルエン： 酢酸ェチル =4 ： 1 J?f=0.49. - NMR (CDC13)： δ 7.89-7.27 (10H, m, Phx2), 5.89 (IH, s, ベンジリデンメチン）， 5.06 (IH, dd, J=6.7Hz, /=10.0Hz, H— 2)， 4.69 (IH, d, J=10.1Hz, H - 1)， 4.36 (IH, t, J=6.3Hz, H— 4), 4.15 (IH, dd, J=2.1Hz, J=5.8Hz, H-3), 3.98 (IH, q, H— 5)， 1.38 (3H, d, 7=6.3Hz, H - 6). フェニル 2 -^べンジル _3, 4- (^ベンジリデン- 1-チォ- -L -フコピラノシド （60)
Figure imgf000055_0001
化合物 59 (1. lg(a,b mixture), 3.0醫 1)を DMF (20mL)に溶解させ、 BnBr (760 μ L, 6. lmmol)を加え、 氷冷しながら NaH (8.8mg, 0.61mmol)を加え、 1.5時間攪 拌した。 反応終了後、 酢酸ェチルで抽出し、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へキサン：酢酸ェチル =4： 1)で精 製し、 化合物 60 (783mg(a,b mixture), 1.74mmol)を 58%の収率で得た。
Compound 60a: - NMR (CDC13)： δ 7.59-7.22 (15H, m, Ph x 3) , 5.99 (IH, s, ベ ンジリデンメチン）， 4.88, 4.78 (2H, each d, =11.4Hz, ベンジルメチレン）， 4.67 (IH, d, /=9.5Hz, H - 1), 4.55 (1H， t， J=6.0Hz, H-4), 4.07 (IH, dd, /=9.5Hz, J=l.8Hz, H-3), 3.77 (1H， q, H— 5)， 3.64 (IH, dd, J=5.6Hz, J=9.8Hz, H— 2)， 1.41 (3H， d, /=6.7Hz, H-6).
Compound 60b: - NMR (CDC13)： 57.58-7.22 (15H, m， Ph x 3) , 5.89 (IH, s, ベ ンジリデンメチン）, 4.73， 4.56 (2H, each d,ゾ =11.4Hz， ペンジノレメチレン）， 4.65 (IH, d, /=10.1Hz, H— 1)， 4.37 (IH, t, =5.8Hz, H-4), 4.11 (1H， dd, J=6.5Hz, 7=2.5Hz, H-3), 3.91 (IH, q, H— 5), 3.52 (1H， dd, J=5.6Hz, J=9.8Hz, H—2)， 1.46 (3H, d， J=6.5Hz, H-6). フエ二/レ 2， 3- di - ペンジノレ- 1 -チォ- j3 - L -フコピラノシド（61)及ぴフエ-ル 2， 4- di- ベンジル- 1-チォ- /3 - L -フコピラノシド（62)
Figure imgf000056_0001
化合物 60 (90mg(60a,b mixture), 0.021mmol)を THF (1.4mL)に溶解させ、 MS3A (500mg)を加え、 窒素気流下で NaBH3CN/THF (UOmL, 0.17腿 ol)を加え、 2時間攪 拌し、 HC1/ジェチルエーテル (5. OmL)を加えた。反応終了後、 CH2C12で抽出し、 MgS04 で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （へ キサン：酢酸ェチル =4： 1)で精製し、化合物 61 (45mg, 0. Olmmol, 50%)、 62 (25mg， 0.006腿 ol， 27%)をで得た。
Compound 61： TLC へキサン： 酢酸ェチル =4 ： 1 Rf=0.89. -丽 R (CDC13)： δ 7.59-7.15 (20Η, m, Ph x 4) , 4.85, 4.75, 4.70, 4.61 (6H, each, d, ベンジ ルメチレン X 2), 4,61 (1H, d, H-l), 3.81 (1H, t, H - 4), 3.69 (1H， t, J2_3=9.24Hz, H - 2) , 3.59—3.12 (2H, m, H— 3， H - 5)， 1.36 (3H, d， — 5=6.3Hz , H-6), 5.27 (1H, s, OH). 13C - NMR (CDC13) ： 587.5 (C— 1)， 82.8 (C— 3), 77.5 (C-5) , 76.5 (C一 2)， 74.2 (C— 5)， 16.9 (C- 6).
Compound 62： ¾ - MR (CDC13)： 57.58-7.18 (20H, m, Ph x 4) , 4.89, 4.76, 4.72, 4.61 (6H, each, d， ベンジルメチレン x 2), 4.56 (1H, d, 人 2=8.5Hz, H-l), 3.70-3.63 (2H, m， H- 2, H - 4)， 3.59-3.52 (2H, m, H— 3， H- 5), 1.36 (3H, d, ー 5=6.3 , H-6), 5.26 (1H, s, OH). 13C—NMR (CDC13) ： δ 87.1 (C一 1), 79.3 (C— 3), 77.9 (C-5), 76.0 (C— 2), 74.5 (C-5) , 16.6 (C - 6). フエニル ベンジル- 1 -チォ- β - L -フコピラノシド（63)
Figure imgf000057_0001
化合物 60 (2. 7g (mix) , 6. 1醒 ol)を酢.酸 (80mL)に溶解させ、その後に水 (20mL) を 1滴ずつ加え、 45°Cで 5時間撹拌した。 反応終了後、 減圧濃縮し、 シリカゲル カラムクロマトグラフィー （CH2C12： メタノール =100 ： 1)で精製し、 化合物 63 (1. 9g, 5. 6醒 ol)を 91%の収率で得た。 TLC トルエン：酢酸ェチル =4 : 1 Rf=0. 22. フエニル 2, 3- di - 0 "ベンジル- 1-チォ- β - L フコピラノシド（61)
Figure imgf000057_0002
化合物 63 (1. 9g, 5. 6mmol)をトルエン （30mL)に溶解させ、 Bu2SnO (1. 66g, 6. 6mmol)を加え、 3時間加熱還流した後、減圧濃縮した。得られた残渣を DMF (30mL) に溶力、し、 CsF 1. lg, 6. 6腿 ol)と BnBr (820 /z L， 6. 6mmol)を加え 3時間攪拌した。 反応終了後、 酢酸ェチルで抽出し、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮 した。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン：酢酸ェチル =10： 1)で精製し、 化合物 61 (1. 9g, 2. 4mmol)を 89%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢 酸ェチル = ： 1 Rf=0. 51. . フェニル 2, 3 - di -^べンジル -4 - -スクシノィル- 1 -チォ- jS - L-フコピラノシド (64)
Figure imgf000058_0001
化合物 61 (492mg, 1.13mmol)をピリジン （5. OmL)、 CH2C12 (5. OmL)に溶解させ、 DMAP 278mg, 2.25mmol)、 無水コハク酸 （225mg, 2.25mmol)を加えて室温で 12時 間撹拌した。 反応終了後、 CH2C12で抽出し、 HC1で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減 圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン： 酢酸ェチ ル =2 ： 1)で精製し、 化合物 64 (556mg， 1.02nmol)を 92%の収率で得た。 TLC ト ルェン： 酢酸ェチル =2 ： 1 =0.32. ¾- NMR (CDC13)： δ 7.59- 7.25 (15H, m, Ph x 3), 5.38 (IH, d, H— 4)， 4.63 (IH, d, H - 1), 4.78, 4.74, 4.71, 4.50 (4H, each, d, J=10.6Hz, ベンジルメチレン x 2)， 3.70-3.31 (3H, m， H - 2, H - 3, H— 5), 2.74 (4H, m， 00¾¾00), 1.24 (3H， d， 5=6.3Hz， H-6). 13C—腿 (CDC13) ： 177.5 (CO), 171.8 (CO), 87.4 (C— 1)， 70.2 (C— 4), 16.8 (C-6)， 81.1， 76.3, 71.8.
PhS-p-Fuc
Figure imgf000059_0001
Lee, E. ； Bruzzi, A. ； O' Brien, E. ； 0' Col la, P. S. (1979) Carbohydr. Res. 71, 331-4.
Lopez, R. ； Fernandez-Mayoralas, A. (1994) J. Org. Chem. 59, 737-45.
( 4 ) ガラクトサミン誘導体の合成
フエニル 2 -ァセトアミ ド- 3, 4, 6-トリ- ァセチル- 2-デォキシ- 1-チォ - J3 -D -ガ ラタトピラノシド（2)
Figure imgf000059_0002
化合物 1 (1. 0 g, 2. 6 mmol) の C¾C12 (5 ml)溶液に PhSH (0. 2 ml, 2. 6腿 ol)、 SnCl4 (0. 2 ml, 1. 7 mmol) を加え外温 50°Cでー晚還流した。 室温に戻し酢酸ェ チルで希釈し、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え酢酸ェチル抽出し、 ¾0 で 洗レヽ MgSC で脱水し溶媒留去した。得られた結晶を酢酸ェチル -へキサンを用いて 再結晶し化合物 2 (0.53 g, 46.9 %) を得た。 ¾ NMR (CDC13)： δ 7.53-7.50 (m, 2H, aromatic - H)， 7.30—7.28 (m, 3H, aromatic— H), 5.74 (br. d, 1H, J = 9.2Hz, NH), 5.38 (d, 1H, ゾ = 3.3 Hz, H - 4), 5.23 (dd， 1H, J= 3.3, 10.7 Hz, H- 3), 4.94 (d, 1H， / = 10.5 Hz, H—l)， 4.26—4.08 (m, 3H, H - 2 and H— 6), 3.95 (t， 1H, ゾ = 6.5 Hz, H-5), 2.13， 2.03， 1.99， 1.97 (each 3H, s, C0CH3) . 13C NMR (CDCI3)： δ 87.06 (C-1), 74.39 (C - 5), 71.07 (C— 3)， 66.96 (C— 4)， 61.85 (C - 6)， 49.74
(C-2), 23.36， 20.61 (C¾). フェニル 2 -ァジド- 2-デォキシ- 1-チォ- β - D-ガラタトピラノシド（3)
Figure imgf000060_0001
飽和水酸化バリウム水溶液 （150 ml) に化合物 2 (1.0 g， 2.4 mmol) を加え外 温 120°Cで 24時間還流した後、 C02ガスを bubblingしガラスフィルターろ過しろ 液を溶媒留去した。残さをメタノール (50 ml) に溶解し、 DMAP (0.32 g, 2.6 mmol) , 0.4Μ TfN C¾C12溶液 (15 ml, 0.6 mmol) を加え窒素気流下 2 日間室温で撹拌 し溶媒留去した。 残さをシカゲルカラムクロマトグラフィー （シリカゲル 20 g) に付し、 酢酸ェチル溶出部より化合物 3 (0.92 g, quant, in 2 steps) を得た。 ¾ NMR (CD3OD)： δ 7.59-7.55 (m, 2H, aromatic-H), 7.33—7.26 (m, 3H, aromatic— H)， 4.51 (d, 1H, / = 9.9 Hz, H— 1), 3.85 (br. s, 1H, H- 4), 3.77 (dd, 1H, J= 6.5, 11.3 Hz, H - 6), 3.70 (dd, 1H, /= 5.0, 11.3 Hz, H - 6)， 3.54-3.49 (m, 3H, H - 2, 3 and 5H) . 13C NMR (CD3OD)： δ 88.12 (C-1) , 80.64 (C— 3) , 75.22 (C— 5), 69.72 (C-4) , 64.52 (C-2) , 62.74 (C— 6). フエニル 2 -ァジド- 4， 6- ベンジリデン- 2-デォキシ- 1 -チォ- β - D-ガラタトピラ ノシド (4)
Figure imgf000061_0001
化合物 3 (37 mg, 0.12 mmol) の DMF (1 ml) 溶液にベンズアルデヒドジメチル ァセタール (40μ1， 0.27 mmol) CSA (ミクロスパーテル 1杯）を加え外温 60°Cに て 3時間撹拌した。 氷冷した飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液に反応液を注ぎ、 酢 酸ェチル抽出し、 brine で洗い、 MgS04 で脱水し溶媒留去した。 残さをシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー （シリカゲル 10g) に付し、 n-へキサン： 酢酸ェチ ル = 1 ： 1溶出部より化合物 4 (47 mg, 97.6%) を得た。 ¾ NMR (CDClj)： δ 5.51 (s, IH, C ）, 4. 0 (d, 1H， = 9.8 Hz, H— 1), 4.37 (dd, 1H， / = 2.0, 12.5 Hz, H-6), 4.15 (d, IH, /= 2.3 Hz, H—4)， 4.00 (dd, IH, = 1.8， 12.6 Hz, H-6), 3.53 (t, IH, = 9.3 Hz, H— 2). 13C NMR (CDC13) ： δ 101.31 (CHPh) , 85.07 (C— 1), 74.41 (C-4), 73.08 (C-3 or C— 5), 69.82 (C-3 or C— 5), 69.15 (C— 6), 62.03 (C— 2). フェニル 2-ァジド- 4, 6 - -ベンジリデン- 2-デォキシ- 3 - - -メ トキシベンジル - 1-チォ- - D-ガラタトピラノシド（5)
Figure imgf000061_0002
化合物 4 (0.38 g, 0.99 mmol)の DMF (8 ml) 溶液に 60% NaH (51 mg, 1.28 mmol) を加え室温で 1時間撹拌後 PMBC1 (150 μ1， 1.1 mmol) を加え室温でー晚撹拌し た。氷を加えた後酢酸ェチル抽出し、 brineで洗い MgS0 で脱水し溶媒留去した。 残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （シリカゲル 10 g) に付し n -へキ サン： 酢酸ェチル = 2 :1溶出部より化合物 5 (0.35 g, 70.8%)、 n-へキサン： 酢 酸ェチル = 1 : 1溶出部より化合物 4 (0.9 g, 23.1%) を得た。 ¾ NMR (CDC13) δ 5.46 (s, 1H， C P ), 4.64 (s, 2H, ベンジルメチレン）， 4.39 (d, 1H, J =9.9Hz, H - 1)， 4.35 (dd, 1H, J= 1.5, 12.2 Hz, H— 6)， 4.07 (d, 1H, / = 3.3 Hz, H— 4)， 3.97 (dd, 1H, J : 1.5, 12.2 Hz, H— 6), 3.80 (t, 1H, / = 9.9 Hz, H - 2), 3.80 (s， 3H, 0CH3) , 3.44 (dd, 1H， / = 3.3, 9.4 Hz, H— 3)， 3.37 (br. s, 1H, H - 5). 13C腿 (CDC13) δ 101.06 (CHPh), 85.14 (C - 1), 79.08 (C— 3)， 72.09 (C— 4), 71.12 (ベンジルメチレン）， 69.81 (C- 5)， 69.26 (C - 6)， 59.73 (C - 2), 55.18 (CH3) . フエ二ノレ 2 -アジド- 2-デォキシ- 3- - -メ トキシベンジル- 1-チォ- ;3 - D-ガラクト ビラノシド（6)
Figure imgf000062_0001
化合物 5 (0.17 g, 0.30 mmol) を 90%酢酸水溶液に溶解し外温 50°Cで 4時間 撹拌し溶媒留去した。 残さをシリカゲル力ラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g)に付し、 トルエン：酢酸ェチル =9： 1溶出部より化合物 5 (0.13 g, 7.3%), トルエン： 酢酸ェチル = 1 ： 1溶出部より化合物 6 (0.10 g, 84.9%) を得た。 NMR (CDCIQ) δ4.63 (s, 2H, ベンジルメチレン）， 4.40 (d, 1H， = 10.1 Hz, H— 1), 4.00 (d, 1H, /= 1.9 Hz, H-4), 3.95 (t, 1H, / = 5.8 Hz, H— 6)， 3.81 (s, 3H， CH3), 3.62 (t, 1H, /= 9.9 Hz, H- 2), 3.46 (t, 1H， = 5.4 Hz, H— 5), 3.41 (dd, 1H, ゾ = 3.0, 9.5 Hz, H-3). 13C NMR (CDClg) δ 86.19 (C— 1)， 80.55 (C-3), 78.15 (C-5) , 71.77 (ベンジルメチレン）， 66.03 (C-3) , 62.63 (C - 6) , 60.92 (C- 2). フエニル 2-ァジド- 4, 6-ジ-^ベンジル- 2-デォキシ- 3- -;?-メ トキシべンジル- 1 - チォ- β - D-ガラタトピラノシド（7)
Figure imgf000063_0001
化合物 6 (0.19 g, 0.45 mmol)の DMF (4 ml)溶液に 60 % NaH (0.09 g, 2.2 mmol) を加え室温で 1時間撹拌後 BnBr (260 μΐ, 2.2 mmol)を加え室温でー晚撹拌した。 氷を加え酢酸ェチル希釈し、 ¾0, brineで洗い MgS04で脱水し溶媒留去した。 残 さをシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g)に付し n-へキサン: 酢酸ェチル =4 : 1溶出部より化合物 7 (0.17 g, 63.4 %) を得た。 NMR (CDC13) δ4.87 (d, 1H， 11.4 Hz, ベンジルメチレン）， 4.66-4.35 (m, 5H, ベンジル メチレン）， 4.39 (d, 1H, J = 10.0 Hz, H—l), 3.90 (d, 1H, J = 2.2 Hz, H - 4), 3.81 (t, 1H, / = 9.9 Hz, H— 2)， 3.77 (s, 3H, CH3), 3.64-6.61 (m, 2H, H— 6), 3.57—3.52 (m, 1H, H - 5), 3.39 (dd, 1H, J = 2.7, 9.8 Hz, H - 3). 13C NMR (CDCI3) 686.31 (C-l) , 82.05 (C-3) , 77.32 (C— 5)， 74.32 73.50 and 71.99 (ベンジル メチレン）， 72.13 (C-4) , 68.48 (C— 6), 61.40 (C— 2)， 55.19 (C¾). フェニル 2-ァジド- 4, 6-ジ-^ベンジル- 2-デォキシ- 1-チォ- β -D -ガラタトピラ ノシド (8)
Figure imgf000064_0001
化合物 8 (0.16 g， 0.27 mmol) を C¾C12- ¾0 (19:1, 2 ml) に溶解し氷冷下 DDQ (0.07 g, 0.32 mmol) を加え室温で 2時間撹拌し、 セライトろ過し溶媒留去 した。 残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （シリカゲル 10 g) に付しト ルェン： 酢酸ェチル = 9 : 1溶出部より化合物 8 (0.10 g, 80.7 ) を得た。 ¾ NMR (CDClo) 54.69 (s, 2H， ベンジルメチレン）， 4.55 (d, 1H, J = 11.8 Hz, ベ ンジルメチレン）， 4.48 (d, 1H, /= 11.7 Hz, ベンジルメチレン）， 4.42 (d, 1H, = 9.2 Hz, H-l), 3.88 (d, 1H， /= 2.1 Hz, H— 4), 3.73-3.66 (m, 3H), 3.58—3.55 (m, 2H), 2.24 (br. s, 1H, 3- OH). 13C NMR (CDC13) 885.40 (C- 1)， 77.36 (C- 3 or C - 5), 75.25 (C-4) , 74.30 (C- 3 or C- 5), 74.99 and 73.50 (ベンジルメチレン）， 68.14 (C - 6)， 63.33 (C- 2). フエニル 2-アジド- 3- ベンジル- 4, 6- ベンジリデン- 2-デォキシ- 1-チォ- - D -ガラクトピラノシド（9)
Figure imgf000064_0002
化合物 4 (0.58 g, 1.50 mmol) の DMF (10 ml) 溶液に 60% NaH (0.10 g, 2.4 醒 ol) を加え室温で 1時間撹拌後 BnBr (0.26 μ I, 2.1 mmol) を加え室温でー晚 撹拌した。 氷を加えた後酢酸ェチル抽出し、 brineで洗い MgS04で脱水し溶媒留 去した。 残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （シリカゲル 20 g) に付し n一へキサン： 酢酸ェチル = 2 :1 溶出部より化合物 9 (0.55 g， 77.2 %)を得た。 ¾ NMR (CDC13) 55.43 (s, 1H, C Ph) , 4.68 (s, 2H, ベンジルメチレン）， 4.37 (d, 1H, = 10.0Hz, H-l), 4.32 (dd, 1H, /= 1.1, 12.5 Hz, H - 6)， 4.06 (d, 1H， = 3.0 Hz， H-4), 3.93 (dd, 1H, ゾ = 1,5， 12.5 Hz, H- 6), 3.79 (t， 1H， /= 9.8 Hz, H— 2)， 3.43 (dd, 1H， ゾ = 3.1, 9.6 Hz, H— 3), 3.33 (d, 1H, /= 0.8 Hz, H - 5). 13C NMR (CDC3) δ 101.03 (fflPh), 85, 10 (C—l)， 79.46 (C— 3), 71.99 (C一 4), 71.48 (ベンジスレメチレン）， 69.74 (C-5) , 69.24 (C— 6)， 59.73 (C— 2)
PhS- -GalN3
Figure imgf000065_0001
Horton, D.； Rodemeyer, G.； Saeki, H. (1977) Carbohydr. Res. 59， 607-11. Miyajima, K.； Nekado, T.； Ikeda, K.； Achi a, K. (1998) Chem. Pharm. Bull. 46, 1676-1682.
Mukaiyama, T.； Ikegai, K.； Jona, H.； Hashihayata, T.； Takeuchi, K. (2001) Chem. Lett. 840-841. (5) グルコース誘導体の合成
フエ二ノレ 4, ベンジリデン—1 i—0~p-メ トキシベンジノレ- 1 -チォ- β - D-グノレコ ビラノシド (2)
Figure imgf000066_0001
化合物 1(120 mg, 0.33 mmol)の toluene (4 ml)溶液に Bu2SnO(85 mg, 0.34 mmol) を加え窒素雰囲気下、外温 150°Cで 3時間 refluxし溶媒留去した。残さを DMF(3.3 ml)に溶解し PMBCI ( 54/x l, 41mmol)、 CsF (64 mg, 42画 1)を加え室温でー晚撹拌 した。 AcOEt抽出し、 brineで洗い Na2S04で脱水し溶媒留去した。 残さ.をシリカ ゲル力ラムクロマトグラフィー（シリカゲル 11 g)に付し Toluene/Ac0Et=20/l溶 出部より化合物 2(110 mg, 75 %)を得た。
1H MR(CDC13) 7.53-6.82 (m, 14H, Ph, SPA, PMB) , 5.55 (s, IH, CH? ) , 4.87 (d, IH, benzylmethlene), 4.71 (d, IH, benzylmethlene), 4.61 (IH, d, /1 2=9.7Hz, H - 1)， 4.37 (dd, IH,み6, =5.0Hz, 6, =10.5Hz, H - 6， ), 3.79-3.75 (m, 4H, 6, =10.5Hz, H-6, CH3), 3.67-3.60 (m, 2H, H— 3, H- 4)， 3.50— 3.46 (m， 2H, /1 2=9.7Hz, H— 2, 6. =10.5Hz， H-5)； 13CNMR(CDC13)159.45, 137.30, 133.19, 131.47, 129.83, 129.05, 128.34, 128.29， 126.07, 113.95 (aromatic— C)， 101.29 ( HPh) , 88.45 (C-1), 81.30, 81.17, 74.48 (benzylmethylene) , 72.25 (C- 2)， 70.79 (C - 5), 68.67 (C-6) , 55.28 (CH3) . フエニル 3- メ トキシベンジル- 1-チォ- j3 - D -ダルコビラノシド（3)
Figure imgf000066_0002
化合物 2 (78 mg, 0.16 mmol)の 90%AcOH水溶液に溶解し外温 50°Cで 3時間撹拌 し溶媒留去した。 残さをシリカゲル力ラムクロマトグラフィー（シリカゲル 10 g) に付し Toluene:AcOEt=l:l溶出部より化合物 3(56 mg, 88 %)を得た。
1HNMR(CD30D)7.53-6.86 (m, 9H, SPh, PMB), 4.85 (d, IH, benzylmethlene), 4.68 (d, IH, benzylmethlene) , 4.45 (IH, d, ん =9.7Hz, H- 1), 3.85- 3.62 (m, 5H, H - 6， , H-6, CH3)， 3.33-3.26 (m, 4H, H- 2, H - 3, H- 4, H- 5)， 2.59 (s, 2H, OH)； 13CNMR(CD30D)132.71, 130.73, 129.86, 128.31， 114.57 (aromatic - C), 89.63(C - 1), 87.56, 82.04, 75.96， 73.91, 71.21, 62.81 (C— 6)， 55.67 (CH3) フエ二ノレ 2，4，6- tri- 0-ベンジ /レ -3- 0- p-メ トキシベンジル- 1 -チォ- j3 -D-グル コピラノシド （4)
Figure imgf000067_0001
化合物 3(0.63 mg, 1.6 mmol)の DMF(5 ml)溶液に 60°/。NaH(0.21 mg, 5.2 mmol) を加え室温で 1時間撹拌後 BnBr(0.7 ml, 5.7 mmol)を加えー晚撹拌した。 氷を加 えた後 AcOEt抽出し、 brineで洗い MgS04で脱水し溶媒留去した。残さをシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル 40 g)に付し Ac0Et:Hex=l:5溶出部より 化合物 4 (0.87 mg, 82 %)を得た。
1H MR(CDC13)7.62-6.82 (m, 24H, Ph, SPA, PMB), 4.92- 4.52 (m， 9H)， 3.77 (s, 3H, CH3) 3.76-3.48 (m, 5H)； 13C MR (CDC13) 159.19， 138.24, 138.06, 133.76, 131.86, 130.49, 129.43, 128.81, 128.36, 128.27, 128.07, 127.78, 127.71, 127.57, 127.48, 127.33， 126.99, 126.86, 113· 80 (aromatic— C)， 87.35(C— 1)， 86.40, 80.79, 79.03, 76.82, 76.53, 75.45, 75.29, 74.92, 73.32 (benzylmethylene) , 68.97 (C- 6)， 55.17(CH3) 2, 4, 6 - tri - 0 -べンジル -1-チォ- β -D -ダルコビラノシド （5)
Figure imgf000068_0001
化合物 4 (93 mg, 0.14 mmol)を CH2C12- 0 (19： 1, 1 ml)に溶解し氷冷下 DDQ (34 mg, 0.15 匪 ol)を加え室温で 2時間撹拌した。 セライトる過し溶媒留去した。 残さを シリ カゲルカ ラムク ロマ ト グラ フ ィ ー（シリ カゲル 10 g) に付し Toluene :AcOEt=49： 1溶出部より化合物 5 (68 rag, 89 )を得た。
1HNMR(CDC13)7.58-7.15 (m, 20H, Ph, SPA), 4.94-4.50 (m, 7H, H- 1, benzylmethlene), 3.85 - 3.68 (m， 3H, H—3, H— 6, H - 6， ), 3.56-3.48 (m, 2H, H— 4, H-5), 3.36(t, 1H，
Figure imgf000068_0002
H-3)； 13CNMR(CDC13) 138.20, 138.06, 133.80, 131.73, 131.61, 128.99, 128.86, 128.73， 128.54, 128.43， 128.28, 128.16, 127.98, 127.89, 127.78, 127.66, 127.53， 127.37 (aromatic- C)， 87.01(C-1), 80.58 (C- 2), 78.76， 78.58 (C- 3), 77.34, 75.04, 74.56, 73.37(benzylmethylene), 69.04(C-6)
PhS-p-Glc
Figure imgf000069_0001
Pfaeffli, P. J. ; Hixson, S. H.； Anderson, L. (1972) Carbohydr. Res. 231, 195-206.
Motawia, M. S.； Olsen, C. E.； Enevoldsen, K.； Marcussen, J.； Moeller, B. L. (1995) Carbohydr. Res. 277， 109-23.
Bousquet, E.； Khitri, M.； Lay, L.； Nicotra, F.； Panza, L.； Russo, G. (1998) Carbohydr. Res. 311, 17ト 181.
Ennis, S. C.； Cumpstey, I.； Fairbanks, A. J.； Butters, T. D.； Mackeen, M.； Wormald, M. R. (2002) Tetrahedron 58, 9403-9411.
Gordon, D. M. ; Danishef sky, S. J. (1990) Carbohydr. Res. 206, 361 - 6
Micheel, F.； Kreutzer, U. (1969) Justus Liebig. Ann. Chem. 722, 228-31. Mukaiyama, T.； Chiba, H.； Funasaka, S. (2002) Chem. Lett. 392—393.
( 6 ) ダルコサミン誘導体の合成
フエニル 2-アジド- 4，6- ベンジリデン- 2-デォキシ- 3- メ トキシベンジル - 1 -チォ- β - D -ダルコビラノシド（2)
Figure imgf000070_0001
1 2 化合物 1 (90 mg， 0.23 mmol) の DMF (2.5 ml)溶液に 60%NaH (18 mg, 0.30 mmol) を加え室温で 1時間撹拌後 PMBC1 (38 μΐ, 0.28 mmol) を加え 1時間撹拌した。 氷を加えた後酢酸ェチル抽出し、 brineで洗い Na2S04で脱水し溶媒留去した。 残 さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （シリカゲル 70 g) に付しトルエン溶 出部より化合物 2 (98 mg, 83 %) を得た。
化合物 2： ¾NMR (CDC13) δ 7.56-7.25 (m, 14H, Ph, SPA, PMB) , 5.56 (s， 1H, Q¾Ph), 4.83 (d， 1H, ベンジルメチレン）， .72 (d, 1H, ベンジルメチレン）， 4.47 (1H, d, /1>2=10.2Hz, H-l), 4.38 (dd， 1H, 人 6, =5.0Hz， ，6, =10.5Hz, H - 6， ）， 3.80-3.76 (m, 4H， ,6, =10.5Hz， H~6, CH3), 3.65-3.59 (m, 2H, H- 3, H- 4), 3.45 (m, IH, H-5), 3.34 (dd, IH, 2=10.2Hz, /2>3=8.7Hz, H - 2). 13CNMR (CDC13) δ 159.54, 137.13, 133.97， 130.63, 130.06, 129.70, 129.13, 128.75, 128.32, 126.00, 113.89 (aromatic - C) , 101.30 ( HPh), 86.61 (C - 1), 81.34 (C一 3)， 80.58 (C-4) , 74.85 (ベンジル メチレン）， 70.55 (C— 5)， 68.53 (C—6)， 64.67 (C—2), 55.28 (CH3). フエニル 2-アジド- 2-デォキシ- 3- -；?-メ トキシベンジル- 1-チォ- j3- D-ダルコピ ラノシド（3)
Figure imgf000070_0002
化合物 2 (0.21 g, 0.42 mmol) の 90%水溶液に溶解し外温 50°Cで 3時間撹拌し 溶媒留去した。 残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （シリカゲル 18 g) に付しトルエン：酢酸ェチル =1:1溶出部より化合物 3 (0.12 g, 67 %) を得た。 化合物 3 ： ¾ MR (CDC13) δ 7.53-6.86 (m， 9H, SPh, PMB) , 4.85 (d, 1H, ベン ジルメチレン）， 4.68 (d, 1H, ベンジルメチレン）， 4.45 (1H, d, 1>2=9.7Hz, H- 1), 3.85—3.62 (m, 5H, H— 6， ， H— 6， CH3), 3.51 (t, 1H， H—3), 3.33—3.26 (m, 3H, H - 2， H-4, H-5), 2.59 (s, 2H, OH). 13C NMR (CDC13) δ 159.54， 133.16， 131.26, 129.82, 129.80, 129.07, 128.40, 114.08 (aromatic- C), 86.34 (C- 1)， 84.26 (C- 5), 79.40 (C-4) , 75.05 (ベンジルメチレン）， 70.08 (C— 3)， 64.85 (C— 2), 62.25 (C一 6)， 55.22 (CH3) - フエニル 2-アジド- 4， 6- di-ί? "ベンジノレ- 2-デォキシ- 3 - -メ トキシベンジル- 1- チォ- -D -グルコピラノシド (4)
Figure imgf000071_0001
化合物 3 (91 mg, 0.22 mmol) の DMF (2.2 ml)溶液に 60%NaH (34 mg, 0.56 mmol) を加え室温で 1時間撹拌後 BnBr (61 μ 1， 0.52 mmol) を加え 3時間撹拌した。 氷 を加えた後酢酸ェチル抽出し、 brineで洗い Na2S04で脱水し溶媒留去した。 残さ をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （シリカゲル 12 g) に付しトルエン溶出 部より化合物 4 (100 mg, 81 %) を得た。
化合物 4 ： ¾ NMR (CDC13) δ 7.60-6.82 (m, 19H, Ph, SPh, PMB), 4.81-4.51 (m, 6H, ベンジル methlene), 4.40 (1H, d，人2=10.1Hz, H- 1), 3.77-3.71 (m, 5H, H-6, H-6' ， CH3), 3.58 (m, 1H，人 3=み 4=9.4Hz， H- 3)， 3.51-3.44 (m, 2H,み 4=9.4Hz, H-4, H-5), 3.32 (dd, 1H, /1>2=10.1Hz, 23=9.4Hz, H— 2). 13C MR (CDC13) δ 159.55, 138.30, 138.02, 133.70, 131.27, 129.96, 129.87, 129.02, 128.51, 128.41, 128.38, 127.90, 127.82, 127.64, 127.60, 114.00 (aromatic-C), 85.95 (C - 1), 84.80 (C-4) , 79.44 (C- 5), 77.37 (C- 3), 75.57， 75.03, 73.48 (ベンジル メチ レン）， 68.84 (C - 2)， 65.14 (C一 6)， 55.30 (CH3) . フエニル 2-アジド- 4, 6-ジ - -ベンジル- 2-デォキシ- 1-チォ- β - D -ダルコピラノ シド (5)
Figure imgf000072_0001
化合物 4 (0.10 g, 0.12 mmol) を CH2C12- ¾0 (19:1， 1.8 ml) に溶解し氷冷下 DDQ (0.05 mg, 0.20 mmol) を加え室温で 4時間撹拌した。 セライトろ過し溶媒留 去した。 残さをシリカゲルカラムクロマトグラフィー (シリカゲル 10 g) に付し トルエン溶出部より化合物 5 (0.05 g， 58 %) を得た。
化合物 5 ： ¾ NMR (CDC13) δ 7.61- 7.22 (m, 15H， Ph, SPh) , 4.71-4.55 (d， 4H, ベ ンジルメチレン）， 4.44 (1H, d, ん =10.1Hz, H- 1), 3.80 (dd, 1H, ，6, =2.0Hz, 人 6, =11.0Hz， H-6' ), 3.76 (dd, 1H， 6=4.0Hz，み 6, =11.0Hz, H- 6), 3.59 (t, 1H, H-3), 3.51 (t, 1H, H - 4)， 3.45 (m, 1H, H- 5), 3.28 (dd, 1H, 人 2=10· lHz， H-2). 13C NMR (CDC13) δ 138.15, 137.98, 133.39， 131.49, 128.40, 128.29, 128.12: 128.00, 127.65 (aromatic-C), 86.10 (C - 1)， 79.11 (C— 5)， 77.34 (C- 3), 77.26 (C-4) , 73.53 (ベンジルメチレン）， 68.81 (C- 6)， 65.00 (C- 2).
Figure imgf000073_0001
Benakli, K, ； Zha, C. ； Kerns, R. J. (2001) J. Am. Chem. Soc. 123, 9461-9462. Buskas, T. ； Garegg, P. J. ； Konradsson, P. ; Maloisel, J. ~L. (1994) Tetrahedron-' Asymmetry 5， 2187 - 94.
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( 7 ) フエニル 2， 3 -ジ- -ベンジル- 1-チォ - /3 -D -ダルコビラノシド（70)
Figure imgf000073_0002
化合物 68 (1. 9g, 3. 3腿 ol)を酢酸（120mL)に溶解させ、その後に水 (2½L)を 1 滴ずつ加え、 45°Cで 4時間撹拌した。 反応終了後、 減圧濃縮し、 シリカゲルカラ ムクロマトグラフィー （CH2C12： メタノール =200 ： 1)で精製し， 化合物 70 (1. 3g, 2· 7腿 ol)を 81%の収率で得た。 TLC トルエン： 酢酸ェチル =1 ： 1 f=0.20. ¾ NMR (CDC13)： δ 7.52-7.26 (15H, m， Ph x 3), 4.97-4.69 (5H， m, H- 1， ベンジルメチ レン x2), 3.91 (IH, dd, J=2.9Hz, J=7.8Hz, H - 6a)， 3.76 (IH, t, J=Q.7Hz, H- 4), 3.59 (IH, t, H-6b) , 3.53 (IH, t, J=6.7Hz, H - 3), 3.48 (IH, t, J=8.1Hz, H - 2), 3.34 (IH, q, H - 5). フエニル 2， 3-ジ-^ベンジル- 6- - トリチル- 1-チォ- - D -ダルコビラノシド (71)
Figure imgf000074_0001
化合物 70 (696mg, 1.5mmol)をピリジン （6. OmL)に溶解させ、 TrCl (858mg, 3. Immol)と DMAP (188mg, 1.5膽 ol)を加え、 55°Cで 12時間攪拌した。反応終了後、 メタノールを加え、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー (へキサン： 酢酸ェチル =6 ： 1)で精製し、 化合物 71 (1.24g, 2.2腿 ol)を 72%に 得た。 TLCへキサン： 酢酸ェチル =3 ： 1 Rf=Q.49. ¾ NMR (CDC13)： δ 7.66-7.21 (30H， m, Ph χ 6), 4.98, 4.88, 4.76, 4.74 (4H, each d, /=10.8Hz, ベンジル メチレン x 2)， 4.68 (IH, d, /=7.7Hz , H - 1)， 3.65 (IH, t， ), 3.48 (IH, t, J=7.7Hz, H - 2)， 3.41 (1H， dd, J=3.4Hz, H— 6a)， 3.41-3.18 (4H, m, —3, H— 4， H - 5, H - 6b) . フ エ 二 ノレ 4-0- ク 口 口 ァ セ チノレ - 2, 3-di-0-ベ ン ジル - 1-チ ォ - ]3 -D-glucopyranoside (72)
Figure imgf000075_0001
化合物 71 (550mg, 0. 97mmol)を CH2C12 (7. 2mL)、ピリジン （0. 4mL)に溶解させ、 氷冷下でクロロアセチルクロライド（154mL, 1. 94mmol)を加え、 12時間撹拌した。 その後、 メタノール（3. OmL)カ卩えて反応を終了させ、 CH2C12で抽出し、 HC1、 NaHC03 で洗浄、 MgS04で脱水した後、 減圧濃縮した。 得られた残渣を CH2C12 (5. 0mL)、 メ タノール （2. 5mL)に溶解させ、 TsOH (33mg, 0. 17mmol)を加え室温で 3時間攪拌し た。 反応終了後、 トリェチルァミンで中性に戻し、 減圧濃縮した。 これをシリカ ゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン：酢酸ェチル =6 ： 1)で精製し、 化合物 72 (440mg, 0. 78腿 ol)を 88% (2steps)の収率で得た。 TLC トルエン： 酢酸ェチル =4 ： 1 Rf=0. 51. ¾ NMR (CDC13) ： δ 7. 55-7. 22 (15H, m, Ph x 3) , 5. 00 (1H, t, =9. 7Hz, H-4) , 4. 68 (1H, d, , 2=8. 0Hz， H - 1)， 4. 87, 4. 83, 4. 75, 4. 65 (4H, each d, /=11. 2Hz, ベンジルメチレン x 2) , 3. 79-3. 58 (5H， m, H - 3， H- 6a, H- 6b, -0¾C1) , 3. 53 (1H, t, H-2) , 3. 42 (1H, q, H-5) . メチル（フエニル —0~ゥ口口ァセチル- 2, 3-ジ- ベンジル- 1-チォ- β - D -ダルコ ピラノシド）ゥロネート（73)
Figure imgf000075_0002
化合物 72 (390mg, 0. 74mmol)をアセトン（lOmL)に溶解させ、 K2Cr207 (409mg, 1. 39腿 ol)、 3. 5M H2S04 (1. 6mL)を加えて、 55°Cで 1時間撹拌した後、 CH2C12で抽 出、 MgS04で脱水し、 減圧濃縮した。 この残渣を HC1 -メタノール (20mL)に溶解さ せ、 室温で 2時間撹拌した。 反応終了後、 CH2C12で抽出し、 NaHC03で洗浄、 MgS04 で脱水した後、 減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ト ルェン： 酢酸ェチル =7 ： 1)で精製し、 化合物 73 (474mg, 0.49腿 ol)を 66%で得 た。 TLC トルエン：酢酸ェチル =4： 1 0.80. ¾NMR (CDC13)： δ 7.61-7.22 (15Η， m, Ph x 3) , 5.18 (1H, t, J=9.6Hz, H— 4)， 4.70 1H, d, H- 1) , 4.90, 4.83, 4.72, 4.64 (4H, each d, 7=11. Hz, ベンジルメチレン x 2), 3.93 (1H, d, J=9.8Hz, -OCH2CI), 3.85-3.71 (3H， m, H - 4, H- 5, - 0C C1), 3.74 (3H, s, OMe), 3.68 (1H, t, J=9.6Hz, H-3), 3.58 (1H， t, J=9.7Hz, H - 2). メチル（フエニル 2， 3-ジ- ベンジル- 1-チォ- β - D -ダルコビラノシド）ゥロネー ト（74)
Figure imgf000076_0001
化合物 73 (500mg, 0.92mmol)をピリジン （10.3mL)、 ェタノール （1.7mL)に溶 解させ、 チォ尿素 （70.2mg, 9.2mmol)を加えて、 80°Cで 1時間撹拌した。 反応終 了後、 CH2C12で抽出し、 HC1、 NaHC03で洗浄、 MgS04で脱水した後、減圧濃縮した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー （トルエン：酢酸ェチル =3 ： 1)で精 製し、 化合物 74 (420mg， 0.92mmol)を定量的に得た。 TLC トルエン： 酢酸ェチル =4 ： 1 Rf=Q.58. ¾ NMR (CDC13)： δ 7.58-7.24 (15H, m, Ph x 3), 4.70 (1H, d, H-l), 4.89, 4.83, 4.72, 4.66 (4H, each d, =11· 2Hz， ベンジルメチレン x 2), 3.87 (1H, H-4), 3.80 (3H, s, OMe), 3.57 (1H， t, J=8.7Hz, H-3), 3.51 (1H, t, 7=9.3Hz, H - 2)， 3.02 (1H, d, H - 5). 13C NMR (CDC13) ： 5169.5 (C一 6)， 88.4 (C一 1)， 85.2 (C-3), 79.5 (C - 2), 77.2 (C— 5)， 71.8 (C— 4)， 52.8 (0CH3) . PhS-p-GlcA
Figure imgf000077_0001
Trumtel, M.； Tavecchia, P.； Veyrieres, A,； Sinay, P. (1990) Carbohydr. Res.
202, 257-75. 実施例 2 ：拡散混合固相反応
本発明においては、 必要かつ最小限の液量で樹脂を膨潤させて反応を行うこと を特徴としている。 樹脂を膨潤させるための液量については、 前記表 1等を参考 にした。 かつ、 実際に秤量した一定量の樹脂に、 これに使用する溶媒を滴下して 樹脂ビーズ間の摩擦力が低下し「液状化」現象が生じる液量を確認し、決定した。
( 1 ) アミノレジンへのカルボン酸化合物の導入 （アミド化反応）
樹脂に結合したマンノシル供与体の拡散混合固相反応法による合成
Figure imgf000078_0001
Η2Ν- ： amino Tenta Gel フェニル 2, 3， 6-トリー0~ベンジル- 4- スクシノィル-；！-チォ- β - D-マンノビラ ノシド（295mg, 0. 46ramol) , DIPC (108 L, 0. 69mmol)、 HOBt (ヒドロキシベンゾ トリァゾール） （74. 5mg, 0. 55匪 ol) を溶解した CH2C12 (5. 0ml) を NovaSyn amino TG resin (511mg, 15. 0 /z mol loading) に加え、 室温で 14時間放置した。 反応終 了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 DMF、 CH2C12で洗浄し、 減圧乾固した。 同一行 程を 2回繰り返し樹脂を減圧乾固した。 Ac20 (3. 0mL)、 ピリジン （3. OmL) を加 え室温で 12時間放置した後、 CH2C12、 メタノール、 ¾ 2で洗浄し、 減圧乾固す ることでキヤッビングを行い樹脂（530mg)を得た。
FT-IR (ATR) ： cm—1 1739. 4 (0C=0) , 1671. 9 ( HC=0) - 収率の算出は、 切り出し反応を行って決定した。 樹脂 (49. 0mg)をとりだし、 CH2C12 (0. 5mL)、 メタノール（0. 5mL)で膨潤させ、 0. 5Mナトリウムメトキシド-メ タノール（0. ImL)を加え室温で 1時間放置した。 その後、 Amberlite IR 120B+で中 和し、 吸引ろ過したろ液を減圧濃縮することでフエニル 1-チォ- 2， 3, 6-トリ-^ ベンジル- β - D-マンノビラノシド（4. 8mg, 7. 7 μ mol, 62%)を得た。 樹脂に結合したフコシル供与体の拡散混合固相反応法による合成
Figure imgf000079_0001
フェニル 2， 3-ジ -^ベンジル- 4 - -スクシノィル- 1 -チォ- )3 - L -フコピラノシド (316mg， 0.59腿 ol)、 DIPC (138 μΐ, 0.88讓 ol)、 HOBt (96mg, 0.71膽。1) を溶解 した DMF (6.0ml) を NovaSyn amino TG resin (982mg, 0.29匪 ol loading) にカロ え、 室温で 48時間放置した。 反応終了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 CH2C12で 洗浄し、 減圧乾固した。 Ac20 (3. OmL)、 ピリジン （3. OmL) を加え室温で 12時間 放置した後、 CH2C12、 メタノール、 CH2C12で洗浄し、 減圧乾固することでキヤツビ ングを行い樹脂 (1.05g) が得られた。
FT-IR (ATR) ： cm—1 1739.4 (0C=0) , 1671.9 ( ΗΟ0).
収率の算出は、 切り出し反応を行って決定した。 樹脂 （30.0mg) を、 CH2C12 (0.5mL)、 メタノール (0.5mL)で膨潤させ、 0.5Mナトリウムメトキシド-メタノ一 ル（0. ImL)を加え、 室温で 2時間放置し、 その後、 Amberlite IR 120B+で中和し、 吸引ろ過したろ液を減圧濃縮し、フエニル 2， 3-ジ- -ベンジル- 1-チォ- β - L-フコ ビラノシド（3.0mg, 6.9/imol, 85%) を得た。
(2) 固相上でのチォグリコシド体のフルオリ ド体への拡散混合固相反応法によ る変換反応
樹脂に結合した L-フコピラノシルフルォライド
Figure imgf000080_0001
DAST (26raL, 0. 19囊 ol)、 BS (35mg, 0. 19mmol) を C2H4C12 (1. 5mL) に溶解し、 樹脂の結合したフエ二ルチオ- L-フコビラノシド（300mg, 35mg : fuc) に- 15°Cで加 え 1時間放置した後、 1時間かけて 0°Cまで温度をあげ、 0°Cで 8時間放置した。 反応の進行は樹脂を一部取りだし、 IR で測定後、 CH2C12 (0. 5mL)、 メタノール (0. 5mL) に加え、 0. 5Mナトリウムメトキシド（10 L) を滴下して室温で 1時間放 置することで固相から切り出し、 これを TLC及ぴ MALDI-TOFMS で観測した。 反 応終了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 CH2C12で洗浄し、 減圧乾固した。
FT-IR (ATR) ： cm"1 1737. 5 (0C=0) , 1673. 9 (NHC=0) , 1041. 4 (C - F) .
( 3 ) 固相上でのグリコシルフルォリ ドの活性化によるグリコシル化反応 樹脂に結合した 2, 3 -ジ-^べンジル -L-フコピラノシル-（1→6) -フェニル -2, 3, 4- トリ -^べンジル- 1-チォ- a - D -ガラタトビラノシド
Figure imgf000080_0002
フェニル 2， 3， 4-トリ -(^ベンジル- 1 -チォ- β - D-ガラクトピラノシド （24. Omg, i mol) を EtCN (0. 25mL) に溶解し、 MS4A (20mg) を加え窒素雰囲気下、 室温で 3時間撹拌した。 別に AgOTf (33. 8mg, 0. 132mmol)を CH2C12 (0. 25mL)に溶解し、 MS4A (20mg)を加え窒素雰囲気下、室温で 3時間撹拌した後、これに Cp2HfCl2 (25nig， 0. 066墮 ol) を加え 5分間攪拌した。 これらを - 15°Cで樹脂に結合した L-フコピ ラノシルフルォライド（lOOmg, 9. 8mg : Fuc) に加え、 反応温度を 10°Cまで徐々に 上げた。 反応の進行は樹脂を一部取りだし、 IRで測定後、 CH2C12 (0· 5mL)、 メタ ノール（0. 5mL) に加え、 0. 5M NaOMe (10 μ L) を滴下して室温で 1時間放置するこ とで固相から切り出し、 これを TLC及ぴ MALDI-TOFMS で観測した。 反応終了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 C C12で洗浄し、 減圧乾固した。
FT-IR (ATR) ： cm-1 1737. 5 (0C=0)， 1673. 9 (NHC=0) .
MALDI-TOFMS : Calcd for C33H3609 : m/z 868. 3 Found : m/z 891 [M+Na] +.
反応温度を - 15°Cから 10°C へと徐々に変化させた場合の反応を行い、 昇温率 について検討した。 結果を表 2と図 6〜図 8に示す。
Figure imgf000081_0001
その結果、 MALDI-T0FMSの解析結果（図 6〜図 8 )から、 8. 3°C/hでは脱離物 （Fw: 316)が僅かに存在していたのに対し、昇温率を下げるとダリコシル化反応が優先 的に進行することが判明した。 グリコシルフルォリ ドの活性化によるグリコシル 化反応においては、 このような昇温率を用いることができる。
( 4 ) 固相上でのチォグリコシドの活性化によるグリコシル化反応
樹脂に結合した 2， 3-ジ - -ベンジル- L-フコピラノシル-（1→6) - 2, 3, 4-トリ -0~べ ンジル - a - D-ガラクトピラノシルフルォライド
Figure imgf000082_0001
2, 3， 4-トリ—0~ベンジル- α - D-ガラク トビラノシルフルォライド （23. Omg, 51.6 mol) を CH2C12 (0.25mL)、 EtCN(0.25mL) に溶解し、 MS4A (20mg) を加え窒 素雰囲気下、室温で 3時間撹拌した後、 0°Cで MeSSMe (6.9 μ L, 77.2 μ mol)、 MeOTf (8.7/zL, 77.2 mol) を加え、 10分間撹拌した。 この溶液を - 15°Cで樹脂に結合 した L-フコビラノシド（88mg， 14mg: Fuc) にカ卩え、 10°Cまで徐々に加温した。 反 応の進行は樹脂を一部取りだし、 IRで測定後、 CH2C12 (0.5mL)、メタノール (0.5mL) に加え、 0.5MNa0Me (10 μΐ) を滴下して室温で 1時間放置することで固相から切 り出し、 これを TLC及ぴ MALDI- T0FMSで観測した。反応終了後、樹脂を CH2C12、 メタノール、 CH2C12で洗浄し、 減圧乾固した。
FT-IR (ATR) ： cm—1 1735.6 (000)， 1671.9 ( HC=0) , 1029.8 (C— F), 636.9. MALDI - T0FMS: Calcd for C47H51F09: m/z 778.9 Found: m/z 802.5 [M+Na]+.
これまでチォダリコシドの活性化によるダリコシルイヒ反応を固相上で行う際、 供与体 1.0に対して DMTSTを 8.0当量加えていた。 しかし同様の反応を液相で行 つた場合では DMTSTは 2.0当量で充分であることから、 8.0当量以下でも反応が 進行するのではないかと考えた。 そこで今回、 樹脂による立体的な影響を考慮し て供与体に対し DMTSTの当量を 3.0に固定し、ダリコシル化反応の検討を行った。 反応温度を - 15°Cから 10°Cへと徐々にした場合の反応について、 昇温率について 検討した （表 3及び図 9〜図 1 1)。 質量分析データの解析結果 （図 9〜図 1 1) から、 チォグリコシドの DMTSTによる活性化においては、昇温率が大きい場合に おいても副反応は進行せず、 生成物量は時間に依存することが判明した。 3.0 当 量の DMTSTを用いた場合、反応時間が本実験では不十分であつたが、少なくとも 糖供与体であるチォグリコシドが糖受容体であるフッ化グリコシルの存在下選択 的に活性化されることが示された。 また、 オルトゴナルグリコシル化反応に用い ることができることが明確に示された。 また、 反応時間に関しては、 より過剰の DMTST の添加により達成する、 あるいは、 さらに強力なプロモーター （例えば NIS-TfOH) の使用により克服できる。 表 3 ：
Figure imgf000083_0001
( 5 ) 拡散混合固相反応法を基礎とするダリコシル化反応における反応剤の導入 順序
(方法 1 ) 供与体が結合した樹脂を受容体とプロモーターの混液により膨潤する 方法
樹脂に結合した 2， 3 -ジ- ^ベンジル- L-フコピラノシル-（1→6) -2， 3, 4-トリ - 0~ベ ンジル - α -D-ガラクトピラノシルフルォライド
2, 3, 4-トリ—0~べンジル- α - D-ガラク トビラノシルフルオラィ ド（16. 8mg, 0. 04mmol) を C2H4C12 (0· 2mL)、 EtCN (0. 2mL) に溶解し、 MS4A (20mg) を加え窒素 雰囲気下、 室温で 3時間撹拌した後、 0°Cで MeSSMe (13. 4 0. 15mmol)、 MeOTf (16. 9 0. 15nimol) を加え、 10分間撹拌した。 この溶液部を 0°Cで 樹脂に結 合したフエ二ルチオ- L-フコビラノシド（79mg, 10mg : Fuc) に加え、 12 時間放置 した。 反応の進行は樹脂を一部取りだし、 IR で測定後、 CH2C12 (0. 5mL)、 メタノ ール（0. 5mL) に加え、 0. 5Mナトリウムメトキシド（10 μ L) を滴下して室温で 1時 間放置することで固相から切り出し、これを TLC及ぴ MALDI- T0FMSで観測した。 反応終了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 CH2C12で洗浄し、 減圧乾固した。
FT-IR (ATR) ： cm—1 1735.6 (0C=0), 1671.9 ( HC=0) , 1029.8 (C—F), 636.9. MALDI-TOFMS: Calcd for C47H51F09: m/z 778.9 Found: m/z 802.5 [ +Na]+.
このグリコシル化反応の追跡結果は図 1 2の通りであり、 8当量の DMTSTを用 レ、た場合 6時間で反応が完結し、 収率も満足のいくものであった。
(方法 2 ) 供与体が結合した樹脂を受容体溶液で膨潤しプロモーターを加える方 法
樹脂に結合した 2， 3-ジ- ίλ·ベンジル- L -フコピラノシル -（1→6)- 2， 3， 4-トリ—0-ベ ンジル- a - D-ガラタトピラノシルフルオライド
Figure imgf000084_0001
2, 3, 4-トリ一 0~ベンジル- α - D-ガラク トピラノシルフルォライ ド（77. Omg, 0.14励 1) を C2H4C12 (0.5mL)、 EtCN (0.5mL)に溶解し、 MS4A (200mg) を加え窒 素雰囲気下、 室温で 3時間撹拌した後、 溶液部 （上清） を樹脂に結合したフエ二 ルチオ- L-フコビラノシド（340mg, 46mg: Fuc) を CH2C12 (0.5mL)、 EtCN(0.5mL) で 膨潤させた懸濁液に加えた。 ここに 0°C で MeSSMe (61.7 L, 0· 56腿 ol)、 MeOTf (77.7^L, 0.56腿 ol) を加え、 12時間放置した。 反応の進行は樹脂を一部取りだ し、 IR で測定後、 CH2C12 (0.5mL)、 メタノール（0.5mL) に加え、 0.5M NaOMe (10 μΐ) を滴下して室温で 1時間放置することで固相から切り出し、 これを TLC及 ぴ MALDI - TOFMSで観測した。 反応終了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 C¾C12で 洗浄し、 減圧乾固した。 このグリコシル化反応の追跡結果は図 1 3の通りであり、 方法 1の場合との相 違点はプロモーターを同時に加えるか別途加えるかのみであるが、 反応には 1 2 時間を要した。
方法 1および方法 2の反応時間の差は、 反応剤を順序立てて加えることによる 2番目以降の反応剤が添加点から全体に拡散するのに要した時間と解釈できる。 これらの実験結果より、 マイクロチャンネル （樹脂内部の細孔） 内で進行する 固相反応の性質上、 可能な限り全ての反応剤は 1つの溶液として樹脂に加え S彭潤 するのが良い。 また、 反応剤のみの混合を避ける必要がある場合には、 別々に加 えることもできる。
この 2つの方法の検討結果、方法 1、 2共に同様に有効であることが判明した。 従って、 反応剤を予め混合すると反応する場合には、 順次反応剤を加える方法 1 を、 反応剤の混合が可能な場合には方法 2を用いることができる。
( 6 ) 本 明の拡散による固相反応方法と従来の固相反応方法の比較
本発明の拡散固相反応方法の有用性を確認するため、 拡散によらない攪拌等の 外的な力を利用した従来法との比較を行つた。
それぞれの反応方法においては、 比較のために濃度条件と撹拌の有無意外の条 件を同一にした。また、あえて反応が完結する前に反応を止めて収率を比較した。 本発明の方法 （拡散固相反応方法） においては、 樹脂の膨潤に必要最低限の量の 溶媒を用いて撹拌などを一切行わず静置した。 一方、 従来法 （撹拌を行う固相反 応方法） では同量の溶媒では撹拌することができないので、 使用した試薬量を同 一とし、 溶液量は倍とした。
Octyi 2， 3 - Di~0-benzyl_ a , β -L-fucopyranosi ae
Figure imgf000086_0001
MeSSMe (9. 2 μ Ι, 101 μ mol)に窒素雰囲気下、 MeOTf (11. 6 M L, lOl z mol)を加 え室温で 5 分間攪拌した。 これに DCE (300 // L)、 MeCN (300μυを加え、 0. 169 M- DMTST ストック溶液を調製した。 次にこの溶液に Acceptor : 1-Octanol (10. 4 μ ΐ, 65. 4 μ mol)を加え、 0. 109M- Acceptor I 0. 169M-DMTST ストック溶液を調製 した。
[拡散固相反応方法]
0. 109M- Acceptor I 0. 169M- DMTSTストック溶液（200 μ L, Acceptor : 21. 8 μ mol, DMTST ·' 33· 8 mol)を Resin - bound- Phenyl- 1 - tnio-L - fucopyranoside (40. 5mg, 11. 2 μ mol)に窒素雰囲気下、 - 30°Cでカ卩え、 15分間膨潤反応させた。反応終了後、 樹脂を DCM、 DMF、 DCMで洗浄した。 次に樹脂に sat. NaOMe-MeOH/THF=l/4 (200 μ L)で室温、 1時間放置することで固相から切り出し、 DCMで洗浄後、 減圧乾燥し、 得られた残渣を ¾ NMRで観測した。
[撹拌を行う固相反応方法 （従来法) ]
0. 109M- Acceptor I 0. 169M - DMTSTストック溶液を DCE/MeCN=l/l溶液で倍希釈 し、 0. 055M- Acceptor / 0. 085M- DMTST ス トック溶液とし、 この溶液（400 μ L, Acceptor : 22 μ mol, DMTST: 34 μ mol) を Resin—bound-Phenyl- 1- thio - L- fucopyranoside (40. 4mg, 11. 2 μ mol)に窒素雰囲気下、 - 30°Cで加え、 15 分間攪 拌反応させた。 以下、 上記拡散固相反応方法と同様に行った。
Figure imgf000087_0001
NMR より、 4. 32pm, 1. 35ppm 付近のダブレツトは主生成物の Octyl - fucopy oside 4. 28ppm, 1. 18ppm付近のダブレツ卜は副生成物の Fucose - dimer である。 Fucose - dimer は反応後処理の際に混入した水による加水分解物であり、 また原料である Phenyl j3 - fucopyranosideは完全に消失している。 これより原料 由来である生成物は Octyl j3 -fucopyranosideと Fucose- dimerであるので、反応 の進行度は、主生成物の Octyl β -fucopyranosideと原料由来物 との比により計 算できる。 本発明の拡散固相反応方法： 1. 00 / (1. 00+0. 61) = 62. 1%
撹拌を行う固相反応方法 （従来法） ： 1. 00 / (1. 00+1. 30) = 43. 5% この結果より、 本発明の拡散固相反応方法の方が従来法よりも明らかに有利で あることがわかった。 すなわち、 結果より、 本発明の方法の方が反応が 143%早 いことが示された。 これは、 同じ試薬量で反応を行おうとする場合、 必要最低限 の量で攪拌等を行わずに静置して反応を行えば、 非常に効率的に反応が行えるこ とを意味している。 また、 もし濃度を同一とする場合には、 従来法では本発明の 方法の 2倍の試薬が必要になり、 非効率である。 さらに、 本発明の方法では撹拌 が不要であることから、 固相である樹脂を静置しておく反応容器の他は特別な装 置等も不要である。
これらのこと力ゝら、 本発明の拡散固相反応法が非常に効率的な方法であること が示された。 実施例 3 ：オルトゴナルダリコシル化法に基づく拡散混合固相反応法による糖鎖 の合成
( 1 ) チォグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した 2, 3-ジ- ベンジル- L-フコピラノシル -（1→2) - 3, 4, 6-トリ—0~ベ ンジル- α - D -ガラタトピラノシルフルオライド
Figure imgf000088_0001
3, 4, 6-トリ一 0~ベンジル- α - D-ガラタ トビラノシルフルォライ ド（35. 3mg, 0. 08mmol) を C2H4C12 (0. 45mL)、 EtCN(0. 45mL) に溶解し、 MS4A (20mg) を加え窒 素雰囲気下、室温で 3時間撹拌した後、 0°Cで MeSSMe (27. 0 μ L， 0. 30ramol)、 MeOTf (34. 0 L, 0. 30mmol) を加え、 10分間撹拌した。 この溶液部を 0°C で樹脂に結 合したフエ二ルチオ- L -フコビラノシド（169mg, 20mg : Fuc) に加え、 12時間放置 した。 反応の進行は樹脂を一部取りだし、 IR で測定後、 CH2C12 (0. 5mL)、 メタノ ール（0. 5mL) に加え、 0. 5Mナトリウムメ トキシド（lO /^ L) を滴下して室温で 1 時間放置することで固相から切り出し、 これを TLC及び MALDI - T0FMS で観測し た。 反応終了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 CH2C12で洗浄し、 減圧乾固した。 FT-IR (ATR) ： cm-1 1735. 6 (0C=0) , 1671. 9 (NHC=0) , 1029. 8 (C_F) , 636. 4. MALDI— TOFMS : Calcd for C47H51F09 : m/z 778. 9 Found: m/z 802. 5 [M+Na]+. (図 1 4)
(2) チォグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した 2, 3-ジ- ベンジル- L-フコピラノシル-（1→3) - 2, 4， 6-トリ - 0~ベ ンジル - a- D -ガラクトピラノシルフルォライ ド
Figure imgf000089_0001
2， 4， 6-トリ—0~ベンジル- α - D-ガラク トピラノシルフルォライ ド（35. Omg, 0.08mmol) を CH2C12 (0.45mL)、 EtCN(0.45mL) に溶解し、 MS4A (20mg) を加え窒 素雰囲気下、室温で 3時間撹拌した後、 0°Cで MeSSMe (27.0/ L, 0.30mmol)、 MeOTf (34.0 L, 0.30匪 ol) を加え、 10分間撹拌した。 この溶液部を 0°Cで樹脂に結 合したフエ二ルチオ- L-フコビラノシド（169mg, 20mg: Fuc) に加え、 12時間放置 した。 反応の進行は樹脂を一部取りだし、 IR で測定後、 CH2C12 (0.5mL)、 メタノ ール（0.5mL) に加え、 0.5M NaOMe (10 μ L) を滴下して室温で 1時間放置すること で固相から切り出し、 これを TLC及ぴ MALDI- T0FMS で観測した。 反応終了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 CH2C12で洗浄し、 減圧乾固した。
FT-IR (ATR) ： cm—1 1735.6 (0C=0) , 1671.9 (NHC=0) , 1029.8 (C— F), 636.4. MALDI-T0FMS: Calcd for C47H51F09: m/z 778.9 Found: m/z 802.5 [M+Na]+.
(図 1 5)
(3) チォグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した 2， 3 -ジ- べンジル -L-フコピラノシル-（1→4)- 2, 3， 6-トリ - 0-ベ ンジル - a- D-ガラクトビラノシルフルォライド
Figure imgf000090_0001
2, 3, 6-トリ一 ( ベンジル- α - D -ガラク トビラノシルフルォライ ド （34.8mg, 0.08mmol)を CH2C12 (0.45mL)、 EtCN (0..45mL) に溶解し、 MS4A (20mg) を加え窒 素雰囲気下、室温で 3時間撹拌した後、 0°Cで MeSSMe (27. Ομί, 0.30mmol)、 MeOTf (34.0 iL, 0.30mmol) を加え、 10分間撹拌した。 この溶液部を 0°Cで樹脂に結合 したフエ二ルチオ- L -フコビラノシド（169mg， 20mg: Fuc) に加え、 12時間放置し た。 反応の進行は樹脂を一部取りだし、 IRで測定後、 CH2C12 (0.5raL；)、 メタノー ル (0.5mL) に加え、 0.5Mナトリウムメ トキシド（10 ^L) を滴下して室温で 1時間 放置することで固相から切り出し、 これを TLC及び MALDI - T0FMS で観測した。 反応終了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 CH2C12で洗浄し、 減圧乾固した。
FT-IR (ATR) ： cm—1 1735.6 (0C=0) , 1671.9 (NHC=0) , 1029.8 (C - F)， 636.3. MALDI-TOFMS: Calcd for C47H51F09: m/z 778.9 Found: m/z 802.5 [M+Na]+.
(図 1 6)
(4) チォグリコシドの活性化による二糖の合成
樹脂に結合した 2, 3-ジ - -ベンジル- L -フコピラノシル -（1→6)- 2， 3, 4-トリ一 ンジル- α -!) -ガラクトビラノシルフルオラィド
Figure imgf000090_0002
2, 3, 4 -トリ—0~ベンジル- α - D -ガラク トビラノシルフルオラィ ド （34.6mg, 0.08mmol) を CH2C12 (0, 45mL)、 EtCN(0.45mL) に溶解し、 MS4A (20mg) を加え窒 素雰囲気下、室温で 3時間撹拌した後、 0°Cで MeSSMe (27.0 μ L, 0.30mmol)、 MeOTf (34.0/zL, 0.30腿 ol) を加え、 10分間撹拌した。 この溶液部を 0°Cで樹脂に結合 したフエ二ルチオ- L-フコビラノシド（169mg, 20mg: Fuc) に加え、 12時間放置し た。 反応の進行は樹脂を一部取りだし、 IR で測定後、 CH2C12 (0.5mL)、 メタノー ル (0.5mL) に加え、 0.5Mナトリウムメトキシド（10 を滴下して室温で 1時間 放置することで固相から切り出し、 これを TLC及ぴ MALDI - T0FMS で観測した。 反応終了後、 樹脂を C C12、 メタノール、 CH2C12で洗浄し、 減圧乾固した。
FT-IR (ATR) ： cm—1 1735.6 (0C=0) , 1671.9 (NHC=0) , 1029.8 (C— F), 636.9. MALDI-TOFMS: Calcd for C47H51F09: m/z 778.9 Found: m/z 802.5 [M+Na]+.
(図 1 7)
(5) 固相上での三糖誘導体の合成
フエニル 2， 3, 6-トリ -0~べンジル -1 -チォ- β -D-グルコピラノシド（41. Omg, 0.074mmol)を EtCN(0.45mL)に溶解し、 MS4A (20mg)を加え窒素気流下、 室温で 3 時間撹拌した （A液）。 別に AgOTf (57. Omg, 0.222讓 ol)、 MS4A (20mg)を CH2C12 (0.45mL)に加え窒素気流下、 室温で 3時間撹拌した後、 0°Cで Cp2HfCl2 (42. Omg, 0. lllmmol)を加え、 5分間撹拌した （B液)。 調製した A、 B液を合し窒素気流下、 - 15°Cで樹脂に結合したジサッ力ライド（169mg，0.037讓 ol)に加え、 6時間かけて 10°Cまで上昇させた後、 3 時間放置した。 反応の進行は樹脂を一部取りだし、 IR で測定後、 CH2C12 (0.5mL)、 メタノール（0.5mL)に加え、 0.5Mナトリウムメトキシ ド（ΙΟμϋを滴下して室温で 1 時間放置することで固相から切り出し、 これを MALDI- T0FMSで観測した。 反応終了後、 樹脂を CH2C12、 EtCN, CH2C12で洗浄し、 減 圧乾固した。
今回、 先に合成した 4種類の化合物について同様の操作を行った。 それぞれの スキームと MALDI- T0FMSのチャートを以下及ぴ図 1 8から 2 1に示す。
Figure imgf000092_0001
MALDI-TOFMS: Calcd for C8。H84014S: m/z 1301.6 Found: m/z 1325.6 [M+Na]+. (図 1 8)
Figure imgf000092_0002
MALDI-TOFMS: Calcd for C80H84014S: m/z 1301.6 Found: m/z 1325.6 [M+Na]+. (図 1 9)
Figure imgf000092_0003
MALDI-TOFMS: Calcd for C80H84014S: m/z 1301.6 Found: m/z 1326.3 [M+Na]+. (図 2 0)
Figure imgf000093_0001
MALDI-TOFMS : Calcd for C8。H84014S : m/z 1301. 6 Found: m/z 1325. 6 [M+Na] +. (図 2 1 ) 図 1 8から図 2 1の MALDI-T0FMSのチヤ一トより、 4種類の反応全てにおいて 目的化合物由来の擬親ピークが確認されたことでグリコシル化反応が進行したこ とが明らかである。 反応温度勾配を一定とし、 最終到達温度を 1 0 °C高く設定す ることで反応を完結することができる。
卜ォクタノ一ル（92. 8 L, 0. 30mmol)を CH2C12 (0. 45mL)、 EtCN (0. 45mL)に溶解 させ、 MS4A (20mg)を加え窒素気流下、室温で 3時間撹拌した後、 0°Cで MeSSMe (26. 6 μ ΐ, 0. 30醒 ol)、 MeOTf (33. 5 L, 0. 30mmol) を加え、 10分間撹拌した。 この溶 液を - 15°Cで樹脂に結合したトリサッカライド（169mg, 20mg: Fuc)に加え、 6. 5時 間かけて 20°Cまで上昇させた後、 8時間放置した。 反応の進行は樹脂を一部取り だし、 IRで測定後、 C¾C12 (0. 5mL)、 メタノール（0. 5mL)に加え、 0. 5M Na0Me (10 μ L)を滴下して室温で 1時間放置することで固相から切り出し、 これを TLC及ぴ MALDI-TOFMSで観測した。 反応終了後、 樹脂を CH2C12、 メタノール、 CH2C12で洗浄 し、 減圧乾固した。
今回、 既に合成した 4種類の三糖誘導体について同様の操作を行った。 それぞ れのスキームと MALDI-TOFMSのチャートを以下に示す。
Figure imgf000094_0001
MALDI-TOFMS : Calcd for C82H95015: m/z 1320. 7 Found: m/z 1343. 8 [M+Na]+. (図 2 2 )
MALDI-TOFMS : Calcd for C82H95015: m/z 1320. 7 Found: m/z 1343. 8 [M+Na]+. (図 2 3 )
MALDI-TOFMS : Calcd for C82H95015: m/z 1320. 7 Found: m/z 1343. 8 [M+Na]+. (図 2 4 )
MALDI-TOFMS : Calcd for C82H95015: m/z 1320. 7 Found: m/z 1343. 8 [M+Na]+. (図 2 5 )
図 2 2から図 2 5の MALDI-TOFMSのチャートより、 4種類とも目的化合物由来 のピーク（FW: 1301)が確認されたことでグリコシル化反応が進行したことが明ら かとなつた。 し力 し、 1367、 912、 694、 480 付近に副生成物と考えられるピーク が多く見られることから更なる条件の最適化が必要とされる。 実施例 4 ： オルトゴナルダリコシル化法に基づく拡散混合固相反応法による糖鎖 ライブラリーの合成
実施例 1力 ら 3の結果を用いれば、 糖鎖ライブラリ一の合成が可能である。 すなわち、 適当に保護された生体を構成する 9種の主立った単糖 （実施例 1) は、 糖鎖ライプラリーの化学合成を達成するために必須である。 さらに、 糖鎖合 成においてダリコシル化反応における立体制御は極めて困難な問題であり、 ライ ブラリー合成において全てのダリコシルイヒ反応を制御することは不可能である。 従って、 糖鎖ライブラリ一の構築にあ ては立体非選択の方法論が適している。 このために、 保護単糖の 2位は隣接気関与の無い置換基とすることが望ましい。 本実施例では、 このように設計された保護単糖を安定なチォダリコシドとして合 成し、 必要に応じてグリコシルフルオリ ドへと変換可能とした。
このような単糖誘導体を用い、 任意の組み合わせで反応することにより糖鎖ラ イブラリ一が合成可能である。 ライブラリ一合成を行うためには適当な固相合成 法が必要であるが、 その 1つが本発明の拡散混合による固相反応方法を利用した 固相合成法である （実施例 2)。本法によれば、 固相反応の場である樹脂の膨潤に 必要最低限の量の溶媒に反応剤を溶解し、この溶液で樹脂を膨潤することにより、 反応の場である細孔内部へのすみやかな反応剤の導入を達成し、 また、 拡散に基 づいて反応が進行するため撹拌等の物理的手段による装置からも解放されること を示した。
固相におけるオルトゴナルグリコシル化法は、 糖鎖の固相合成を最短行程で達 成する方法である。 実施例 3においては、 上記実施例 2でその有用性が示された 拡散による固相反応方法を用いて、 このオルトゴナルダリコシル化反応を行い、 良好な結果を得た。
特に、 実施例 2および 3においては、 拡散混合固相反応法およぴ固相オルトゴ ナルダリコシル化法を実証するのみならず、（ひ Zj3)Fuc(l- 2/3/4/6) ( /i3)Gal(l-4) (a/i3)Glc-0ctylのライブラリー合成 (2x4x2x2=32) をも同時 に達成した。 これらの結果より、 本発明の方法によれば、 さらに大きなライブラ リーの合成が可能であることが示された。
Figure imgf000096_0001
産業上の利用可能性
本発明によりヌクレオチド、 ペプチド、 糖鎖に代表される生体分子を効率良く 化学合成する方法が提供される。 昇温率を制御して反応系の温度を変化させるこ とにより高効率で糖鎖の固相合成を行うことのできる本発明の糖鎖固相合成方法 と、 固相反応を少量の溶媒で効率良く行うことができる拡散による固相反応方法 は、 いずれも前記生体分子の化学合成に有用であり、 コンビナトリアルケミスト リー等においては特に有用である。 また、 従来合成を制御することが難しく巿販 の合成装置の無い糖鎖の合成には特に有用である。
本出願は、 2003年 6月 30 Θ付の日本特許出願（特願 2003-18787 8) に基づく優先権を主張する出願であり、その内容は本明細書中に参照として取 り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容も本明細書中に参照として取 り込まれる。

Claims

請求の範囲
1. 複数種の単糖ュニットを含む少なくとも 1以上の糖鎖合成反応系におい て複数種の糖鎖を合成する糖鎖固相合成方法において、 該糖鎖合成反応系の温度 を、 反応系中の副反応を低下させることを指標として決定した昇温率に従って変 化させることを特徴とする、 糖鎖固相合成方法。
2. 糖鎖固相合成方法が以下の工程を含む、 請求項 1に記載の糖鎖固相合成 方法。
(a) 下記式 （1)：
P— L— O— A1— X (1)
(式中、 Pは固相を示し、 Lはリンカ一を示し、 Oは単糖の非還元末端の酸素原 子を示し、 A 1は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、 Xは脱離基 Yの活性化条件下で安定な脱離基を示す。）
の単糖ュニットに、 下記式 （2) ：
HO— A2— Y (2)
(式中、 A2は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、 Yは脱離基 Xの活性化条件下で安定な脱離基を示す。 )
の単糖ユニットを脱離基 Xの活性化条件下で反応させて、 下記式 （3) ：
P— L一 O— A1— O— A2— Y (3)
の糖類を得る工程：及ぴ
(b) 上記工程 (a) で得た式 （3) の糖類に、 下記式 （4) ：
ΗΟ-Α3-Χ' (4)
(式中、 A 3は反応に関与しない水酸基が保護基で保護された単糖骨格を示し、 X' は脱離基 Yの活性化条件下で安定な脱離基あるいは 1位の水酸基または保護 基を示す。）
の単糖ュ-ットを脱離基 Yの活性ィヒ条件下で反応させて、 式 （5) ：
P— L一 O— A1— O— A2— O— A3— X， (5) の糖類を得る工程。
3. 工程 （b) において X' が 1位の水酸基または保護基である式 （4) の 単糖ユニットを使用し、 3つの糖が連結した糖鎖を合成する、 請求項 2に記載の 糖鎖固相合成方法。
4. 工程 （b) で得た式 （5) の糖類に対し、 工程 （a) と工程 （b) の反 応を繰り返すことを含む、 請求項 2に記載の糖鎖固相合成方法。
5. 式 （1)、 (2) 及ぴ （4) の単糖ユニットを一反応系に同時に反応させ て反応を行う、 請求項 2カゝら 4の何れかに記載の糖鎖固相合成方法。
6. 脱離基 Xがフ： ルチオ基又はフッ素基の片方であり、 脱離基 Yがフエ ュルチオ基又はフッ素基の他方である、 請求項 2から 5の何れかに記載の糖類固 相合成方法。
7. フエ二ルチオ基の活性化を N—ョードサクシンイミド一トリフルォロメ タンスルホン酸 （N I S— T f OH) またはジメチルメチルチオスルフォニゥム トリフラート （DMTST)により行い、フッ素基の活性化を S n (C 1 04) 2、 S n (OT f ) 2、 C p 2H f (C 1 04) 2、 または C p 2H f (OT f ) 2によ り行う、 請求項 6に記載の糖鎖固相合成方法。
8. 保護基がベンジル基である、 請求項 2から 7の何れかに記載の糖鎖固相 合成方法。
9. A\ A2及ぴ A3が示す単糖骨格が生体中に存在する単糖から選ばれる 3種類の糖の単糖骨格である、 請求項 2から 8の何れかに記載の糖鎖固相合成方 法。
1 0. A\ A 2及び A 3が示す単糖骨格が、 マンノース、 グルコース、 ガラ クトース、 キシリ トース、 ダルコサミン、 ガラクトサミン、 ダルクロン酸、 フル クトース又はシアル酸の単糖骨格である、 請求項 2から 9の何れかに記載の糖鎖 固相合成方法。
1 1. フエニル 1—チォ一 3, 4, 6—トリー O—ベンジル一 /3— D—マン ノピラノシド、 フエニル 1—チォー2， 4， 6—トリ一0—ベンジル一 ]3—D— マンノピラノシド、 フエニル 1一チォー 2 , 3， 6—トリ一 O—ベンジル一 一 D—マンノビラノシド、 フエニル 1一チォー 2， 3 , 4—トリー O—べンジルー j3—D—マンノピラノシド、 フエニル 1一チォー 3 , 4 , 6—ト リ 一 O—べンジ ルー j3— D—ガラタ トピラノシド、 フエニル 1一チォ一 2， 4， 6—トリー O— ベンジルー j3—D—ガラタトピラノシド、 フエニル 1一チォ一 2 , 3， 6—トリ 一 O—べンジルー —D—ガラタトピラノシド、 フエニル 1—チォー2， 3 , 4 一トリー O—べンジルー ]3—D—ガラクトビラノシド、 フエニル 2 , 3—ジー O 一べンジノレ一 1一チォー i3—D—キシロビラノシド、 フエニル 3 , 4—ジー O— ペンジノレー 1—チォ一 一 D—キシロビラノシド、 フエニル 2 , 4—ジ一 O—べ ンジルー 1一チォ一 i3— D—キシロビラノシド、 フエニル 1一チォー 2 , 3—ジ —O—ベンジルー 3— Lーフコピラノシド、 フエニル 2—アジドー 4， 6—ジー O—ベンジルー 2—デォキシー 1一チォー β— D—ガラクトビラノシド、 フエ二 ル 2—アジドー 3 , 6—ジー Ο—べンジルー 2—デォキシー 1一チォ一 β— D— ガラタトピラノシド、 フエニル 2—アジドー 3， 4—ジ一 Ο—べンジルー 2—デ ォキシ一 1—チォ一 J3—D—ガラクトピラノシド、 フエニル 3 , 4， 6—トリー Ο—ベンジルー 1 _チォー — D—ダルコピラノシド、 フエニル 2， 4， 6—ト リー Ο—ベンジルー 1一チォ一 j3— D—ダルコピラノシド、 フエニル 2， 3 , 6 一トリ一 O—べンジルー 1—チォ一 β一 D—ダルコビラノシド、フエ二ノレ 2 , 3 , 4一トリ一 Ο—ベンジノレ一 1一チォー β—D—グノレコピラノシド、 フエニル 2— アジドー 4， 6ージ一 Ο—べンジルー 2—デォキシー 1一チォー β— D—ダルコ ピラノシド、 フエニル 2—アジドー 3， 4ージ一 Ο—ベンジル一 2—デォキシ一 1一チォ一 /3— D—ダルコピラノシド、 フエニル 2—アジドー 3， 6—ジ一 Ο— ベンジルー 2—デォキシー 1一チォ一 β一 D—ダルコピラノシド、
メチル （フエエル 1一チォ一 2， 3—ジ一 Ο—べンジノレ一 j3—D—グノレコピラノ シド） ゥロネート、 メチル （フエニル 5—ァセトアミ ド一 4， 7 , 8， 9ーテト ラ一O—ァセチルー 3， 5—ジデォキシ一 2—チォ一 β一 D—グリセ口一 D—ガ ラタ トー 2—ノヌロビラノシド） ォネート、 メチル （フエニル 5—ァセトアミ ド 一 4， 7 , 8 , 9—テトラ一 O—ァセチルー 3， 5—ジデォキシ一 2—チォー α —D—グリセロー D—ガラクトー 2—ノヌロビラノシド） ォネート、 メチル （フ ェュル 5—ァセトアミドー 3 , 5—ジデォキシ一 2—チォー β—D—グリセ口一 D—ガラクトー 2—ノヌロビラノシド） ォネート、 メチル （フエニル 5—ァセト アミド一 3， 5—ジデォキシ一 2—チォ一 α— D—グリセロー D—ガラクトー 2 ーノヌロビラノシド） ォネート、 並びに上記化合物中のフエ二ルチオ基をフッ素 基に置換した化合物から成る群から選択される少なくとも 1以上の単糖誘導体を 含む、 請求項 1から 1 0の何れかに記載の糖鎖固相合成方法を行うための単糖ラ イブラリー。
1 2 . 毛管現象を生じる大きさの固体細孔中で固相反応を行う方法において、 固体の外表面に余剰の液相が存在しない状態で反応を行うことを特徴とする固相 反応方法。
1 3 . 反応が拡散混合により行われることを特徴とする請求項 1 2に記載の 固相反応方法。
1 4 . 固体が、 内部に細孔を有する樹脂粒子である、 請求項 1 2又は 1 3に 記載の固相反応方法。
1 5 . 固相反応が化学反応または生化学的反応である、 請求項 1 2から 1 4 の何れかに記載の固相反応方法。
1 6 . 固相反応が糖鎖合成反応である、 請求項 1 2から 1 5の何れかに記載 の固相反応方法。
1 7 . 固相反応が請求項 1から 1 0の何れかに記載の糖鎖固相合成反応であ る、 請求項 1 2から 1 6の何れかに記載の固相反応方法。
1 8 . 請求項 1カゝら 1 0の何れかに記載の糖鎖固相合成方法または請求項 1 7に記載の固相反応方法により合成された、 生体中に存在する単糖から選ばれる 3種類の糖の全ての組み合わせから成る糖鎖により構成されるライブラリー。
1 9 . 生体中に存在する単糖が、 マンノース、 グルコース、 ガラクトース、 キシリ トース、 ダルコサミン、 ガラクトサミン、 グルクロン酸、 フルクトース又 はシアル酸である、 請求項 18に記載のライブラリー。
20. 少なくとも以下の （1) と （2) とを含む、 請求項 12から 17の何 れかに記載の固相反応方法を行うための反応装置。
(1) 液相を注入又は吸引するための導入部を有し、 かつ固体を収容する空間を 有する、 固相反応を行うための反応部、 及ぴ
(2) 反応部の温度を調節するための温度調節部
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