WO2004108962A1 - 細胞に導入した核酸の標的オルガネラにおける局在量を定量する方法 - Google Patents

細胞に導入した核酸の標的オルガネラにおける局在量を定量する方法 Download PDF

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Hideyoshi Harashima
Hidetaka Akita
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to a method for quantifying the localization amount of a nucleic acid introduced into a cell in a target organelle, and a method for analyzing the intracellular kinetics of the nucleic acid introduced into a cell using the method.
  • the present invention provides a method for accurately quantifying the localization amount of a nucleic acid introduced into a cell in the entire target organelle, and a method for analyzing the intracellular kinetics of the nucleic acid introduced into a cell using the method. With the goal.
  • the present invention provides the following method.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram relating to a continuous X-y cross-sectional image in the Z-axis direction (direction of cell thickness) of one cell obtained by a confocal laser-microscope.
  • FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the number of X-y cross-sectional images and the ratio of the localization amount of plasmid MA in each organelle calculated based on the number of each X-y cross-sectional image.
  • FIG. 3 is a diagram showing the temporal change in intracellular kinetics of plasmid DNA.
  • cell means a cell that exists in a state separated from an organism, and does not include cells that actually constitute an organism.
  • the cells used in the present invention may be either eukaryotic cells or prokaryotic cells.
  • the species of cells from which the cells used in the present invention are derived are not particularly limited, and may be any of animals, plants, microorganisms, etc., but are preferably animals, and are mammals. Is more preferred. Examples of mammals include humans, monkeys, lions, sheep, goats, magpies, pigs, magpies, dogs, cats, rats, rats, mice, guinea pigs, and the like.
  • the type of cells used in the present invention is not particularly limited, and for example, somatic cells, germ cells, stem cells, or cultured cells thereof can be used.
  • nucleic acid includes not only DNA and RNA, but also analogs or derivatives thereof (eg, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.).
  • the base length of the nucleic acid is not particularly limited, and may be either an oligonucleotide or a polynucleotide.
  • the nucleic acid may be in a single-stranded or double-stranded state, These may be in a mixed state.
  • the type of the organelle is not particularly limited.
  • the body, vacuole, cell wall and the like can be mentioned.
  • one of these may be a target organelle, or two or more may be a target organelle.
  • polycationic substance refers to The substance is not particularly limited as long as it can form a complex with a nucleic acid, for example, a cationic lipid; a cationic lipid (for example, Lipofectamine (Invitrogen) A) a cationic ribosome formed by)); a neutral ribosome having a cationic group; a polymeric micelle having a cationic group; a single amino acid such as polylysine, polyarginine, or a copolymer of lysine and arginine.
  • a nucleic acid for example, a cationic lipid; a cationic lipid (for example, Lipofectamine (Invitrogen) A) a cationic ribosome formed by)); a neutral ribosome having a cationic group; a polymeric micelle having a cationic group; a single amino acid such as polylysine, polyarginine, or a copolymer of lysine
  • Copolymers or copolymers or derivatives thereof for example, stearylated derivatives); polycationic polymers such as polyethyleneimine;
  • the number of the cationic groups included in the cationic substance is not particularly limited, but is preferably two or more.
  • the cationic group is not particularly limited as long as it can be positively charged, and examples thereof include an amino group; a monoalkylamino group such as a methylamino group and an ethylamino group; a dialkylamino group such as a dimethylamino group and a methylamino group; an imino group; And a guanidino group.
  • the “first fluorescent dye” and the “second fluorescent dye” are different fluorescent dyes.
  • a different fluorescent dye can be selected for each type of organelle as the first fluorescent dye.
  • different fluorescent dyes can be selected for each type of nucleic acid as the second fluorescent dye.
  • the fluorescent dye that can be used as the first fluorescent dye is not particularly limited as long as it can stain the target organelle.For example, for nuclear staining, MPI, Hoechst, etc., and for endosome / lysosomal staining, Lyot racker For mitochondria, Mitot racker, MitoRed, etc. can be used.
  • the fluorescent dye that can be used as the second fluorescent dye is not particularly limited.For example, Marine Blue, Cascade Blue, Cascade Yellow> Fluorescein, Rhodamine, Phycoerythr in.
  • step (b) is usually performed after step (a).
  • steps (c) and (d) are performed after steps (a) and (b).
  • the order before and after the steps (c) and (d) is not particularly limited, but the step (d) is usually performed after the step (c).
  • Step (f) is performed after step (e).
  • the staining of the target organelle with the first fluorescent dye can be performed according to a conventional method.
  • the staining with the first fluorescent dye is preferably performed on the entire target organelle. Thereby, the localization amount of the nucleic acid in the entire target organelle can be quantified.
  • the number of complex complexes of the polycationic substance and the nucleic acid to be introduced into the cell is not particularly limited, but usually, a plurality of complexes are introduced into the cell.
  • the amount of nucleic acid contained in the complexes is preferably uniform or almost uniform in any of the complexes.
  • the amount of nucleic acid contained in the complex is uniform or almost uniform in any of the complexes, the amount of nucleic acid per unit area of the region stained by the second fluorescent dye is uniform or almost uniform between different stained regions. Since it is uniform, the quantification of the localized amount of the nucleic acid using the total area of the stained region with the second fluorescent dye as an index becomes more accurate.
  • the complex of the polycationic substance and the nucleic acid can be prepared according to a conventional method. Since the polycationic substance is positively charged and the nucleic acid is negatively charged, a complex can be easily prepared by mixing the two. To prepare a complex with uniform or nearly uniform nucleic acid content 4 006303
  • a polycationic substance cation f raw liposome formed by cationic lipid (for example, Lipoi ectamine (manufactured by Invitrogen)), polylysine, stearylated polylysine, polyethylene glycol It is preferable to use min, protamine sulfate and the like.
  • the complex of the polycationic substance and the nucleic acid is preferably in the form of particles having a particle size of 30 to 300 nm.
  • the method for introducing the complex of the polycationic substance and the nucleic acid into cells is not particularly limited. Since the complex contains a polycationic substance and is positively charged, the complex is electrostatically attracted to the surface of the negatively charged cell membrane and can be introduced into cells by a mechanism such as endocytosis. When using endocytosis, a complex of a polycationic substance and a nucleic acid can be brought into contact with a cell to introduce the complex into the cell.
  • the “plane intersecting with the cell” is a virtual plane, and can be freely selected.
  • the method for detecting the fluorescence emitted from the first fluorescent dye existing on the plane intersecting with the cells is not particularly limited.
  • the method for detecting the fluorescence using a confocal laser microscope is used. can do.
  • a confocal laser microscope it is possible to detect the fluorescence emitted by the first fluorescent dye present on the focal plane. From the two-dimensional image obtained by the confocal laser-microscope, The region where the target organelle exists can be easily determined.
  • the method for detecting the fluorescence emitted from the second fluorescent dye existing on the plane intersecting with the cells is not particularly limited.
  • a method using a confocal laser-microscope is used. Can be detected.
  • a second fluorescent dye present on the focal plane is emitted. 04 006303 can be detected, and from the two-dimensional image obtained by the confocal laser microscope, of the region where the target organelle exists, the region stained with the second fluorescent dye (the second fluorescent region) The area of the dyed area can be easily calculated.
  • the region of the target organelle that is stained with the second fluorescent dye is the fluorescent color of the first fluorescent dye and the second fluorescent dye. It is stained with the fluorescent color of the fluorescent dye. For example, when the fluorescent color of the first fluorescent dye is red and the fluorescent color of the second fluorescent dye is green, the two fluorescent dyes are dyed in yellow, which is a synthetic fluorescent color of both, and the first fluorescent dye is red. When the second fluorescent dye is blue, it is stained with pink, which is a synthetic fluorescent color of both.
  • step (e) it is preferable to select, as the plurality of planes, a plurality of planes that intersect the cell and do not intersect each other in the cell. This is to avoid calculating the area of the same staining area with the second fluorescent dye repeatedly. As a result, the total area of the staining area with the second fluorescent dye calculated in the step (; f) accurately reflects the localization amount of the nucleic acid in the target organelle.
  • a plane perpendicular to the direction of gravity ie, the direction of the thickness of the cell
  • a plane perpendicular to the direction of gravity can be selected as a plurality of planes that intersect the cell and do not intersect each other in the cell.
  • the number of the plurality of planes is not particularly limited as long as it is 2 or more, but is preferably 15 or more, and more preferably 20 or more.
  • the area accurately reflects the nucleic acid localization in the target organelle. That is, when nucleic acids labeled with a second fluorescent dye are introduced into cells without complexing with other substances, there is a possibility that the second fluorescent dyes bound to different nucleic acids may overlap. In such a case, the area of the region stained with the second fluorescent dye does not accurately reflect the amount of nucleic acid contained in the region.
  • the nucleic acid labeled with the second fluorescent dye is complexed with the polycationic substance and introduced into the cells, so that the nucleic acid labeled with the second fluorescent dye is polycationic.
  • a polycationic substance is interposed between the second fluorescent dyes that are surrounded by the substance and bound to different nucleic acids. This prevents the second fluorescent dyes bound to different nucleic acids from overlapping each other, and the area of the region stained by the second fluorescent dye accurately reflects the amount of nucleic acid contained in that region. The larger the area of the region stained by the second fluorescent dye, the larger the amount of nucleic acid contained in that region, and the smaller the area of the region stained by the second fluorescent dye, the smaller the amount of nucleic acid contained in that region Will be. Therefore, in step (f), the localization amount of the nucleic acid in the entire target organelle can be accurately quantified by calculating the total area of the staining region with the second fluorescent dye.
  • the intracellular dynamics of the nucleic acid introduced into the cell can be analyzed.
  • a plurality of planes selected in the step (e) be the same. Information on the intracellular kinetics of a nucleic acid introduced into a cell is useful for developing and optimizing a vector used for nucleic acid introduction.
  • D'MEM Dulbecco's modified eagle medium
  • FCS fetal calf serum
  • PBS phosphatebuffered saline
  • E. coli DH5a / pQBI25-63 was placed in LB amp (7 ml), and cultured at 37 ° C with shaking for half a day. Two 5 ml portions of this culture solution in LBa immediately (500 ml) were prepared and cultured with shaking at 37 ° C overnight. The culture was centrifuged at 6000Xg for 15 minutes at 4 ° C, the supernatant was removed, and the mixture was purified using QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit (manufactured by QIAGEN) according to the protocol. The purified plasmid DNA was diluted 200-fold, UV was measured, and the yield was determined (yield: 528.6 g). Confirmation by Hindlll and MI processing was also performed.
  • NIH / 3T3 cells were cultured in D'MEM supplemented with 10% immobilized FCS as a medium. 04006303
  • Plasmid DNA was fluorescently labeled using Label IT CX-Rhodamine Labeling Kit (PanVera, Medison, Wis.) According to the protocol. After labeling, plasmid DNA was purified by the ethanol precipitation method.
  • Lipofectamine Plus Reagent (Invitrogen) was used.
  • Twenty-four hours before transfection 2.5 ⁇ 10 5 cells were seeded and incubated in D'MEM containing immobilized 10% FCS.
  • the cells were replaced with D'MEM without FCS, and plasmid DNA labeled with fluorescence was added together with Lipofectamine (manufactured by Invitrogen), and the cells were incubated under cell culture conditions for a certain period of time.
  • Lipofectamine is a cationic lipid, and a cationic ribosome is formed by Lipofectamine, which forms a complex with plasmid DNA.
  • DAP I (manufactured by Molecular Probes) and Hoechs t33258 (manufactured by WA K0 Junyaku) were used as nuclear staining reagents.
  • DAPI was once dissolved in sterile water to 100 ⁇ , diluted with PBS (-) until the end, added to 1 ml cell solution, and incubated for 5 minutes under cell culture conditions.
  • Hoechst33258 is dissolved in sterile water to a concentration of lmg / ml, diluted with PBS (-) to a final concentration of 100 ig / ml, and further diluted with D'MEM containing 10% FCS to 20 g / mn. After dilution, 1 ml of that was added to the cells and incubated for 10 minutes at room temperature. '
  • Lysotracker DND-99 (Molecular Probes) and Lysosensor DND-189 (Molecular Probes) were used as staining reagents for endosome / lysosome.
  • Lysotracker was diluted 10-fold with PBS (-) to 10 M. 5ml of this 4006303 was added to 1 ml of D'MEM without FCS, added to the cells, and incubated for 30 minutes under cell culture conditions. Lysotracker was used as a stock solution [1] in 1 ml of D'MEM without FCS, added to the cells, and incubated for 30 minutes under cell doubling conditions.
  • Endosomes / lysosomes were stained with Lysotracker or Lysosensor by the method described above on the cells incubated for a certain period of time after transfection. After staining, the cells were washed with D'MEM (+ 10% FCS), and nuclei were stained with DAPI or Hoechst 33258 by the method described above. (The incubation time up to this point was set at 6 points of 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5 and 3.5 hours.) After washing the cells three times with D'MEM (+ 10% FCS), '1 ml of MEM (+ 10% FCS) was added, and the cells were observed without fixing using a Carl Zeiss LSM510 confocal laser microscope.
  • the reason for observing the cells without fixing them is that, when the cells are fixed, Lysosensor and Lysotracker are uniformly diffused into the cytoplasm by a fixing agent containing an organic compound such as daltaraldehyde.
  • the reason for the diffusion may be that the pH dependence of the staining reagent has been destroyed.
  • Plasmid MA labeled with Rhodamine exhibits a red color when present in the cytoplasm, a yellow color when mixed with the green color of Lysosensor when present in the endosomes / lysosomes, and a yellow color when present in the nucleus. It was pink in color with blue.
  • a region where 90% or more was stained with the same color was determined to be a region where plasmid DNA was present.
  • the region where plasmid DNA is present is specified, and the area of the region where plasmid DNA is present in each organelle in one X-y cross-sectional image is calculated. It was used as an indicator of the amount of plasmid DNA localized in Luganella. Furthermore, the plasmid DNA in each organelle is determined by summing the areas of the plasmid MA present areas contained in each organelle in each X-y cross-sectional image and calculating the ratio of the total area of the plasmid DNA present areas in each organelle. Was determined.
  • the measured value of the ratio of the localization amount of plasmid DNA in each organelle may be stable. found. In other words, it was found that when the number of X-y cross-sectional images is 15 or more, preferably 20 or more, the localization amount of plasmid DNA in each organelle can be accurately quantified. .
  • plasmid DNA is present in endosomes in about 80% of the cells, although the variability is large. TJP2004 / 006303 suggests that endosite lysis is one of the major cellular uptake mechanisms as reported previously. On the other hand, in some cells, 50-70% of plasmid DNA is present in the cytoplasm as quickly as 30 minutes and 1 hour, and in these cells, distribution in the endosome is hardly observed. This suggests that these cells may be introduced into the cytoplasm by a mechanism other than endocytosis.
  • STR8 similarly to R8, 100 ml of serum-free D'MEM was added to the microtube, and then 1 mg of fluorescently labeled plasmid DNA was added, followed by thorough stirring. 6.35 ml of STR8 dissolved in 100 ml of serum-free D'MEM was added thereto, stirred well, and left at room temperature for 30 minutes. Thirty minutes later, 400 ml of serum-free D'MEM was added, and the mixture was stirred well, and added to the cells prepared in the same manner as described above, followed by incubating. TJP2004 / 006303
  • the incubation time was 1 hour and 3 hours after transfection, and thereafter, observation was performed in the same manner as described above.
  • the basic peptide in human immunodeficiency virus (HIV) -l Tat proteimpos i Uons 48-69) is a peptide that has cell membrane permeability and is a carrier that efficiently transports foreign molecules (genes, proteins, etc.) into cells.
  • foreign molecules genes, proteins, etc.
  • R8 and STR8 used in this study are both arginine-rich peptides and have been reported as gene carriers. In particular, it has been reported that STR8 has a much higher expression efficiency than R8.
  • Complexes of each peptide and plasmid DNA were prepared, and the intracellular kinetics of each complex was quantitatively analyzed by this evaluation system.
  • R8 complex the complex of R8 and the plasmid DNA
  • R8 complex the complex of R8 and the plasmid DNA
  • the R8 complex observed in the cells was observed to be localized in endosomes / lysosomes for 1 hour and 3 hours. Also, no R8 complex in the nucleus could be observed at either 1 hour or 3 hours.
  • the complex of STR8 and plasmid DNA (hereinafter referred to as “STR8 complex”) aggregates around the cell membrane in 1 hour, and is localized in almost half of the cells in the endosome. Was observed.
  • the STR8 complex was localized around the nuclear envelope, which could not be observed with the R8 complex. At 3 hours, the STR8 complex present in the nucleus could be observed.
  • quantitative analysis was performed on five cells using the present evaluation system. As a result of the analysis, the R8 complex was localized in endosomes / lysosomes in more than 90% of cells for 1 hour and 3 hours, suggesting that it was taken up by endocytosis. In addition, since most of the cells were present in the endosome / lysosome even at 3 hours, it was considered that the efficiency of release into the cytoplasm was low.
  • the STR8 complex is present in the endosome / lysosome in 60% of the cells in 1 hour, suggesting that the STR8 complex is also taken up into cells by endocytosis.
  • the STR8 complex was localized in the cytoplasm and around the nuclear envelope in nearly 70% of the cells, and nuclear translocation was observed in 40% of the cells. It is considered that it was released into the cytoplasm and permeation through the nuclear membrane occurred. This suggested that the release efficiency of STR8 into the cytoplasm might be high.
  • the present invention provides a method for accurately quantifying the localization amount of a nucleic acid introduced into a cell in the entire target organelle, and a method for analyzing the intracellular kinetics of a nucleic acid introduced into a cell using the method.

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Abstract

　細胞に導入した核酸の標的オルガネラ全体おける局在量を正確に定量する方法を提供することを目的とし、この目的を達成するために、（ａ）標的オルガネラを第一の蛍光色素で染色し、（ｂ）ポリカチオン性物質と第二の蛍光色素で標識した核酸との複合体を細胞に導入し、（ｃ）細胞と交差する平面上に存在する第一の蛍光色素が発する蛍光を検出し、上記平面上における標的オルガネラの存在領域を決定し、（ｄ）上記平面上に存在する第二の蛍光色素が発する蛍光を検出し、標的オルガネラの存在領域のうち、第二の蛍光色素によって染色された領域の面積を算出し、（ｅ）細胞と交差する複数の平面に対して工程（ｃ）及び（ｄ）を行い、（ｆ）複数の平面について算出された第二の蛍光色素による染色領域の面積を総和し、第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を指標として、核酸の標的オルガネラにおける局在量を定量する。

Description

細胞に導入した核酸の標的オルガネラにおける局在量を定量する方法
技術分野
本発明は、 細胞に導入した核酸の標的オルガネラおける局在量を定量 する方法、 及び当該方法を利用明して細胞に導入した核酸の細胞内動態を 分析する方法に関する。 書
背景技術
近年、 遺伝子治療に大きな期待が寄せられており、 遺伝子導入技術の 重要性が増加している。 細胞への遺伝子導入技術は、 生化学的又は物理 的方法を利用するトランスフエクシヨンと、 ウィルスを利用するィンフ ェクシヨンとに大別される。 インフエクシヨンによる遺伝子導入は、 特 定の細胞 （ウィルスが感染できる細胞） に対する遺伝子導入効率や遺伝 子発現効率は高いものの、 トランスフエクションによりも操作が複雑で 多大な時間を要し、 利用するウィルスによっては安全性が問題となる。 このため、 現在ではトランスフエクションによる遺伝子導入技術が汎用 されており、 トランスフエクシヨンによる遺伝子導入技術としては、 リ ン酸カルシウム共沈法、 電気穿孔法 （エレクトロポレーシヨン法）、 陽電 荷を有する D E A E—デキストラン、 ポリプレン、 カチオン性脂質との 複合体形成法等が知られている。
遺伝子導入技術の評価、 開発、 改良等にあたっては、 遺伝子導入効率 や遺伝子発現効率の検討に加え、 導入遺伝子の細胞内動態の検討が重要 となる。 導入遺伝子の細胞内動態を知るためには、 導入遺伝子の各種ォ ルガネラにおける局在量の定量が必要であり、 導入遺伝子の定量法とし ては、 細胞分画法、 共焦点レーザー顕微鏡法 （共焦点走査顕微鏡法） 等 が知られている。 発明の開示
しかしながら、 細胞分画法は、 細胞の破壊が必要となるため、 オルガ ネラ間におけるコンタミネーションが生じ、 個々のオルガネラにおける 導入遺伝子の局在量を定量することは困難である。 また、 これまでの共 焦点レーザー顕微鏡法は、 導入遺伝子を標識する蛍光色素の蛍光強度を 二次元的に検出するものであったため、 オルガネラの一部分に存在する 導入遺伝子を定量することはできたが、 個々のオルガネラ全体に存在す る導入遺伝子を定量することはできず、 さらに蛍光強度の減衰の影響を 受けるため正確な定量が困難であった。
そこで、 本発明は、 細胞に導入した核酸の標的オルガネラ全体おける 局在量を正確に定量する方法、 及び当該方法を利用して細胞に導入した 核酸の細胞内動態を分析する方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、 本発明は以下の方法を提供する。
( 1 )細胞に導入した核酸の標的オルガネラおける局在量を定量する方法 であって、
( a ) 前記標的オルガネラを第一の蛍光色素で染色する工程、
( b )ポリカチオン性物質と第二の蛍光色素で標識した前記核酸との複合 体を前記細胞に導入する工程、
( c )前記細胞と交差する平面上に存在する前記第一の蛍光色素が発する 蛍光を検出し、 前記平面上における前記標的オルガネラの存在領域を決 定する工程、
( d ) 前記平面上に存在する前記第二の蛍光色素が発する蛍光を検出し、 前記標的オルガネラの存在領域のうち、 前記第二の蛍光色素によって染 色された領域の面積を算出する工程、
(e) 前記細胞と交差する複数の平面に対して前記工程 （c) 及び （d) を行う工程、 並びに
( f )前記複数の平面について算出された前記第二の蛍光色素による染色 領域の面積を総和し、 前記第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を 指標として、 前記核酸の前記標的オルガネラにおける局在量を定量する 工程を含む前記方法。
(2)前記第一の蛍光色素又は前記第二の蛍光色素が発する蛍光を共焦点 レーザ一顕微鏡によって検出する前記 （ 1) 記載の方法。
(3)前記複数の平面が、 前記細胞内において互いに交差しない平面であ る前記 （ 1) 又は （2) 記載の方法。
(4) 前記複数の平面の数が 20以上である前記 （ 1 ) 〜 （3) のいずれ かに記載の方法。
(5) 前記 （ 1) 〜 （4) のいずれかに記載の方法により、 細胞に導入し た核酸の異なる複数のオルガネラにおける局在量を定量し、 前記核酸の 細胞内動態を分析する方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 共焦点レーザ一顕微鏡によって得られる、 1つの細胞の Z軸 方向 （細胞の厚さの方向） に連続的な X— y断面画像に関する説明図で ある。
図 2は、 X— y断面画像数と、 各 X— y断面画像数に基づいて算出さ れた各オルガネラにおけるプラスミド MAの局在量の比率との関係を示 す図である。
図 3は、 プラスミ ド DNAの細胞内動態の時間的変化を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明において、 「細胞」 とは、 生物体から分離された状態で存在する 細胞を意味し、 現に生物体を構成している細胞は含まれない。
本発明で使用する細胞は真核細胞又は原核細胞のいずれであってもよ い。 また、 本発明で使用する細胞が由来する生物種は特に限定されるも のではなく、 動物、 植物、 微生物等のいずれであってもよいが、 動物で あることが好ましく、 哺乳動物であることがさらに好ましい。 哺乳動物 としては、 例えば、 ヒト、 サル、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥマ、 ブタ、 ゥ サギ、 ィヌ、 ネコ、 ラット、 マウス、 モルモット等が挙げられる。 また、 本発明で使用する細胞の種類は特に限定されるものではなく、 例えば、 体細胞、 生殖細胞、 幹細胞又はこれらの培養細胞等を使用することがで さる。
本発明において、 「核酸」 には、 D N A及び R N Aの他、 これらの類似 体又は誘導体 （例えば、 ペプチド核酸 （P N A )、 ホスホロチォエート D N A等） が含まれる。 また、 核酸の塩基長は特に限定されるものではな く、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドのいずれであってもよレ また、 核酸は一本鎖及び二本鎖のいずれの状態であってもよく、 これら の混合状態であつてもよい。
本発明において、 オルガネラの種類は特に限定されるものではなく、 例えば、 核、 細胞膜、 細胞質ゾル、 細胞骨格、 リソソーム、 エンドソー ム、 小胞体、 ゴルジ体、 ペルォキシソ一ム、 微小管、 ミトコンドリア、 葉緑体、 液胞、 細胞壁等が挙げられる。 本発明においては、 これらのう ち 1種類を標的オルガネラとしてもよいし、 2種類以上を標的オルガネ ラとしてもよい。
本発明において、 「ポリカチオン性物質」 とは、 その分子中にカチォ ン性基を有する物質を意味し、 核酸と複合体を形成し得る限り、 その種 類は特に限定されるものではないが、 例えば、 カチオン性脂質；カチォ ン性脂質 （例えば、 Lipofectamine (Invitrogen 社製） ） によって形成 されるカチオン性リボソーム ； カチオン性基を有する中性リボソーム ； カチオン性基を有する高分子ミセル； ポリリジン、 ポリアルギニン、 リ ジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは 共重合体又はこれらの誘導体 （例えばステアリル化誘導体） ；ポリェチ レンイミン等のポリカチオン性ポリマー；硫酸プロ夕ミン等が挙げられ る。 カチオン性物質が有するカチオン性基の数は特に限定されるもので はないが、 好ましくは 2個以上である。 カチオン性基は正に荷電し得る 限り特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基；メチルァミノ基、 ェチルァミノ基等のモノアルキルアミノ基； ジメチルァミノ基、 ジェチ ルァミノ基等のジアルキルアミノ基；ィミノ基； グァニジノ基等が挙げ られる。
本発明において、 「第一の蛍光色素」 と 「第二の蛍光色素」 とは異なる 蛍光色素である。 2種類以上のオルガネラを標的とする場合、 第一の蛍 光色素として、 オルガネラの種類ごとに異なる蛍光色素を選択すること ができる。 また、 2種類以上の核酸を使用する場合、 第二の蛍光色素と して、 核酸の種類ごとに異なる蛍光色素を選択することができる。
第一の蛍光色素として使用し得る蛍光色素は、 標的オルガネラを染色 し得る限り特に限定されるものではなく、 例えば、 核の染色については MPI、 Hoechst等、 エンドゾーム/リソゾームの染色については Lyot ra cker、 Lysosensor等、 ミ トコンドリアについては Mi tot racker、 MitoRe d 等を使用することができる。 また、 第二の蛍光色素として使用し得る 蛍光色素は特に限定されるものではないが、 例えば、 Marine Blue, Cas cade Blue、 Cascade Yel low> Fluorescein, Rhodamine、 Phycoerythr in. CyChrome> PerCP、 Texas Red、 Al lophycocyanin^ PharRed等の他、 Cy2， Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy7等の Cy系色素、 Alexa-488, Alexa-532, Alexa - 5 46, Alexa- 633， Alexa-680等の Alexa系色素、 BODIPY FL, BODIPY TR - 等の BODIPY系色素、 量子ドット等が挙げられる。
本発明において、 工程 （ a) 及び（b) の前後は特に限定されないが、 通常は工程 （a) の後に工程 （b) を行う。 工程 （c ) 及び （d) は、 工程 （a) 及び （b) の後に行う。 工程 （c ) 及び （d) の前後は特に 限定されないが、 通常は工程 （c ) の後に工程 （d) を行う。 工程 （ f ) は工程 （e) の後に行う。
工程 （a) において、 第一の蛍光色素による標的オルガネラの染色は 常法に従って行うことができる。 第一の蛍光色素による染色は、 標的ォ ルガネラ全体に対して行うことが好ましい。 これにより、 標的オルガネ ラ全体における核酸の局在量を定量することができる。
工程 （b) において、 細胞に導入されるポリカチオン性物質と核酸と の複合体複合体の数は特に限定されないが、 通常は複数の複合体が細胞 に導入される。 複数の複合体が細胞に導入される場合、 複合体に含まれ る核酸量は、 いずれの複合体においても均一又はほぼ均一であることが 好ましい。 複合体に含まれる核酸量がいずれの複合体においても均一又 はほぼ均一である場合、 第二の蛍光色素による染色領域の単位面積当た りの核酸量が、 異なる染色領域間で均一又はほぼ均一となるので、 第二 の蛍光色素による染色領域の総和面積を指標とした核酸の局在量の定量 がより正確なものとなる。
ポリカチオン性物質と核酸との複合体は常法に従って調製することが できる。 ポリカチオン性物質は正に荷電しており、 核酸は負に荷電して いるので、 両者を混合することにより容易に複合体を調製することがで きる。 核酸含有量が均一又はほぼ均一である複合体を調製するにあたつ 4 006303 ては、 ポリカチオン性物質として、 カチオン性脂質 （例えば、 L i po i ec t ami ne ( Inv i t rogen社製） ) によって形成されるカチオン f生リホソーム、 ポリリジン、 ステアリル化ポリリジン、 ポリエチレンィミン、 硫酸プロ タミン等を使用することが好ましい。
ポリカチオン性物質と核酸との複合体は、 粒径 3 0〜3 0 0 n mの粒 子状であることが好ましい。
工程 （b ) において、 ポリカチオン性物質と核酸との複合体を細胞に 導入する方法は特に限定されるものではない。 当該複合体はポリカチォ ン性物質を含んでおり正に荷電しているので、 負に荷電した細胞膜表面 に静電気的に引き付けられ、 エンドサイ トーシス等のメカニズムにより 細胞内に導入させることができる。 エンドサイ トーシスを利用する場合 には、 ポリカチオン性物質と核酸との複合体を細胞に接触させることに より当該複合体を細胞に導入することができる。
工程 （c ) において、 「細胞と交差する平面」 は仮想の平面であり、 自 由に選択することができる。
工程 （c ) において、 細胞と交差する平面上に存在する第一の蛍光色 素が発する蛍光を検出する方法は特に限定されるものではないが、 例え ば、 共焦点レーザー顕微鏡を利用して検出することができる。 共焦点レ —ザ一顕微鏡を利用する場合、 焦点面上に存在する第一の蛍光色素が発 する蛍光を検出することができ、 共焦点レーザ一顕微鏡により得られた 二次元像から、 焦点面上における標的オルガネラの存在領域を容易に決 定することができる。
工程 （d ) において、 細胞と交差する平面上に存在する第二の蛍光色 素が発する蛍光を検出する方法は特に限定されるものではないが、 例え ば、 共焦点レーザ一顕微鏡を利用して検出することができる。 共焦点レ 一ザ一顕微鏡を利用する場合、 焦点面上に存在する第二の蛍光色素が発 04 006303 する蛍光を検出することができ、 共焦点レーザ一顕微鏡により得られた 二次元像から、 標的オルガネラの存在領域のうち、 第二の蛍光色素によ つて染色された領域 （第二の蛍光色素による染色領域） の面積を容易に 算出することができる。 標的オルガネラの存在領域は第一の蛍光色素に よって染色されているので、 標的オルガネラの存在領域のうち、 第二の 蛍光色素によって染色された領域は、 第一の蛍光色素の蛍光色と第二の 蛍光色素の蛍光色との合成蛍光色で染色されている。 例えば、 第一の蛍 光色素の蛍光色が赤色で、 第二の蛍光色素の蛍光色が緑色である場合に は、両者の合成蛍光色である黄色で染色され、第一の蛍光色素が赤色で、 第二の蛍光色素が青色である場合には、 両者の合成蛍光色である桃色で 染色される。
工程 （e ) において、 複数の平面として、 細胞と交差し、 かつ細胞内 において互いに交差しない複数の平面を選択することが好ましい。 同一 の第二の蛍光色素による染色領域について重複して面積が算出されるこ とを避けるためである。 これにより、 工程 （； f ) で算出される第二の蛍 光色素による染色領域の総和面積が、 標的オルガネラにおける核酸の局 在量を正確に反映する。
工程 （e ) において、 細胞と交差し、 かつ細胞内において互いに交差 しない複数の平面として、 例えば、 重力方向 （すなわち細胞の厚みの方 向） に対して垂直な平面を選択することができる。
工程 （e ) において、 複数の平面の数は 2以上である限り特に限定さ れるものではないが、 1 5以上であることが好ましく、 2 0以上である ことがさらに好ましい。 平面の数が多いほど、 第二の蛍光色素による染 色領域の総和面積を指標として、 標的オルガネラにおける核酸の局在量 を正確に定量することができる。
工程 （ f ) において算出された第二の蛍光色素による染色領域の総和 面積は、 標的オルガネラにおける核酸の局在量を正確に反映する。 すな わち、 第二の蛍光色素で標識した核酸を他の物質と複合体化することな く細胞に導入した場合、 異なる核酸に結合している第二の蛍光色素同士 が重なり合う可能性があり、 その場合には第二の蛍光色素による染色領 域の面積は、 その領域に含まれる核酸量を正確に反映しない。 これに対 して、 本発明においては、 第二の蛍光色素で標識した核酸をポリカチォ ン性物質と複合体化して細胞に導入するので、 第二の蛍光色素で標識し た核酸はポリカチオン性物質で囲まれた状態にあり、 異なる核酸に結合 している第二の蛍光色素の間にはポリカチオン性物質が介在することと なる。 これにより、 異なる核酸に結合している第二の蛍光色素同士が重 なり合うことが防止され、 第二の蛍光色素による染色領域の面積は、 そ の領域に含まれる核酸量を正確に反映し、 第二の蛍光色素による染色領 域の面積が大きいほど、 その領域に含まれる核酸量が多く、 第二の蛍光 色素による染色領域の面積が小さいほど、 その領域に含まれる核酸量が 少ないということになる。 したがって、 工程 （ f ) において、 第二の蛍 光色素による染色領域の総和面積を算出することにより、 標的オルガネ ラ全体における核酸の局在量を正確に定量することができる。
異なる複数のオルガネラについて、 第二の蛍光色素による染色領域の 総和面積を算出し、 異なる複数のオルガネラ間で比較することにより、 異なる複数のオルガネラ間における核酸の局在比率を算出することがで き、 これによつて細胞に導入した核酸の細胞内動態を分析することがで きる。 第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を、 異なる複数のオル ガネラ間で比較する際には、 工程 （e ) において選択する複数の平面を 同一とすることが好ましい。 細胞に導入した核酸の細胞内動態に関する 情報は、 核酸導入に当たって使用するベクターを開発、 最適化等する上 で有用である。 以下、 実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
なお、 実施例では以下の略語を用いられる。
Amp： アンピシリン
DAPI:4' , 6 -ジアミジノ- 2-フエ二ルインドール ジヒドロクロライ ド（4 '， 6_diamidino - 2 - phenyl indole dihydrochlor ide)
D'MEM : ダリレべッコ変法ィーグリレ培地 （dulbecco's modified eagle m edium)
FCS： ゥシ胎子血清 （fetal calf serum)
LB： LB培地
Hoechst33258： ビスべンズイミ ド H33258 (bisbenziraide H33258)
PBS： リン酸緩衝化生理食塩水 (phosphatebuffered saline)
R8 : ォク夕アルギニン （octaarginine)
STR8： ステアリルォクタアルギニン （stearyl octaarginine)
1. 共焦点レーザー顕微鏡を用いた 3重染色の確立
( 1) 実験方法
①プラスミド DNA (PQBI25- 63) の調製
E. coli DH5a/pQBI25- 63を LB amp (7ml)中に入れ、 37°Cで半日振とう培 養した。この培養液 5mlを LB a即（500 ml)中に入れたものを 2本調製し、 37°Cで一晩振とう培養した。 この培養液を 4°C， 6000Xgの条件下で 15 分間遠心した後、 上清を除き、 QIAGEN EndoFree Plasmid Mega Kit (QI AGEN社製） を用いて、 プロトコ一ルに従い、 精製した。 精製したプラス ミ ド DNAは 200倍希釈して、 UVを測定し、 収量を求めた （収量： 528.6 g)。 また、 Hindlll及び M I処理による確認も行った。
② NIH/3T3細胞の培養
非動化した FCSを 10%加えた D'MEMを培地として NIH/3T3細胞を培養 した。 04006303
③プラスミド DNAの蛍光標識
Label IT CX-Rhodamine Label ing Ki t (PanVera, Medison, Wiscosin e)を用いて、 プロトコールに従い、 プラスミド DNAを蛍光標識した。 標 識後、 エタノール沈殿法によってプラスミ ド DNAを精製した。
④トランスフエクシヨン
Lipofectamine Plus Reagent (Invi trogen社製)を用レ た。 卜ランスフ ェクシヨン時には、 最も細胞がはがれにくかったディッシュである、 Po ly-D-Lysine Cellware 35mm Covers 1 ip-bBot torn Dishes (FALCON 社製） を用いた。 トランスフエクシヨン 24時間前に 2.5X105cellsを播き、 非 動化した 10%FCSを含む D' MEM中でインキュベートした。 トランスフエ クション直前に FCSを除いた D'MEMと交換し、 ここに蛍光標識をしたプ ラスミド DNAを Lipofectamine(Invitrogen社製）とともに加え、 一定時 間細胞培養条件でインキュベートした。 なお、 Lipofectamine はカチォ ン性脂質であり、 Lipofectamine よってカチオン性リボソームが形成さ れ、 これがプラスミ ド DNAと複合体を形成する。
⑤細胞内オルガネラの染色
核染色試薬として DAP I (Molecular Probes社製）及び Hoechs t33258 (WA K0純薬社製）を用いた。 DAPIは 100 ζΜとなるように一度滅菌水に溶かし、 最終的に まで PBS (-)を用いて希釈し、これを 1ml細胞溶液に加え、 5分間細胞培養条件でィンキュベートした。 Hoechst33258は lmg/ml とな るように滅菌水に溶かし、 最終的に 100 ig/ml まで PBS (-)を用いて希釈 し、 さらに 10%FCSを含む D'MEMを用いて 20 g/mnこ希釈した後、 その うち lml を細胞に加え、 10分間室温でインキュベートした。 '
エンドソ一ム /リソゾームの染色試薬として Lysotracker DND-99(Mol ecul ar Probes)及び Lysosensor DND-189 (Molecular Probes)を用レ た。 Lysotracker を PBS (-)で 10倍に希釈し 10 M とした。 これのうち 5ml 4006303 を FCS不含の lml の D' MEMに加え、 これを細胞に添加し、 30分間細胞 培養条件でィンキュベートした。 Lysotrackerについては、 FCS不含の 1 ml の D'MEMに原液のまま 1力 []え、 これを細胞に添加し、 細胞倍養条 件で 30分間ィンキュベートした。
⑥共焦点レーザ一顕微鏡による観察
トランスフエクション後一定時間ィンキュベー卜した細胞に前述した 方法で Lysotracker又は Lysosensorを用いてェンドソーム /リソゾーム を染色した。 染色後 D'MEM(+10%FCS)で細胞を洗浄し、 さらに前述した方 法で DAPI又は Hoechst 33258を用いて核を染色した。（ここまでのインキ ュべ一ト時間を 0.5, 1， 1.5, 2, 2.5, 3.5時間の 6ポイントに設定した。） D'MEM(+10%FCS)で細胞を 3回洗浄した後、 D' MEM(+10%FCS)を 1ml加え、 細胞を固定せずに Carl Zeiss LSM510 共焦点レーザー顕微鏡を用いて 観察した。 ここで、 細胞を固定せずに観察した理由は、 細胞を固定する と、 Lysosensorや Lysotrackerがダルタルアルデヒド等の有機化合物を 含む固定剤によって細胞質に一様に拡散してしまうためである。 拡散の 理由は、染色試薬の PH依存性が壊れてしまったためではないかと考えら れる。
( 2 ) 実験結果
©Lysotrackerと Lysosensorによる染色結果の比較
同時に Lyo trackerと Lysosensorを用いてエンドゾーム/リソソ一ムを 染色したときの様子を、 共焦点レーザ一顕微鏡を用いて観察した。 その 結果、 Lyotracker、 Lysosensor ともにほぼ同様の局在の様子を示すこと が確認できた。 したがって、 これらの試薬がエンドゾーム/リソソームを 正確に染色していることが明らかとなった。 また、 共焦点レーザー顕微 鏡の画像から、 Lysosensorがよりすべての細胞を均一に染色しているこ とが確認できたため、 以後の試験では、 Lysosensorを用いてエンドソー 06303 ム /リソソームの染色を行うことにした。
② DAPI と Hoechst33258による核染色結果
核染色試薬として DAPI を選択した場合、 Lysosensorが細胞質に一様 に拡散してしまうことが明らかとなった。 次に、 核染色試薬である Hoec hst33258を用いてみたところ、 Lysosensorの細胞質への拡散が観察され なくなった。 この原因は、 Lysosensorの pH依存性に DAPIのみが影響を 与えたことにあると考えられる。 したがって、 以後の試験では、 Hoechs 133258を用いて核の染色を行うことにした。
2. 3重染色画像を用いた定量的評価系の確立
共焦点レーザー顕微鏡を利用して、 1つの細胞の Z軸方向 （細胞の厚 さの方向） に連続的な X— y断面画像を取得し （図 1参照）、 コンピュー ター解析ソフトであるアクアコスモスにより定量解析した。 Rhodamine で標識したプラスミ ド MAは、 細胞質に存在するときは赤色を呈し、 ェ ンドソーム /リソソ一ムに存在するときは Lysosensorの緑色と混ざって 黄色を呈し、核内に存在するときは Hoechs 133258の青色と混ざって桃色 を呈した。 ここで、 90%以上が同一色に染色された領域をプラスミ ド DN A の存在領域と判断した。 各々のオルガネラの存在領域のうち、 プラス ミ ド DNAの存在領域を特定し、 1つの X— y断面画像において各オルガ ネラに含まれるプラスミ ド DNAの存在領域の面積を計算し、 これを各ォ ルガネラにおけるプラスミ ド DNAの局在量の指標とした。 さらに、 各 X 一 y断面画像において各オルガネラに含まれるプラスミ ド MAの存在領 域の面積を総和し、 各オルガネラにおけるプラスミド DNAの存在領域の 総和面積の比率を求めることにより、 各オルガネラにおけるプラスミド DNAの局在量の比率を求めた。
この際、 X— y断面画像数について最適化を行った。 X— y断片画像 数を 30個に設定し、 4つの細胞について、 5、 10、 15、 20、 25個の x— y断面画像を均等に抽出し、 各 X— y断面画像から各オルガネラに含ま れるプラスミド MAの存在領域の総和面積を求め、 これを指標として、 各オルガネラにおけるプラスミド DNAの局在量の比率を求めた。 結果を 図 2に示す。なお、図 2中、各プロットは 1細胞についての結果であり、 同一細胞の結果は同一形状のプロットで示す。
図 2に示すように、 X— y断面画像数が 1 5個以上、 好ましくは 20個 以上であると、 各オルガネラにおけるプラスミ ド DNAの局在量の比率に ついて、 測定値が安定することが判明した。 すなわち、 X— y断面画像 数が X— y断面画像数が 1 5個以上、 好ましくは 20個以上であると、 各 オルガネラ全体におけるプラスミド DNAの局在量を正確に定量できるこ とが判明した。
3 . 本評価系を用いたプラスミド DNAの細胞内動態の時間的追跡
L i po f e c t am i ne によるプラスミド DNA導入の所定時間後において、 各 オルガネラへのプラスミ ド DNA の分布を解析した。 各時間において 1 0 個の細胞を解析に用いた。 結果を図 3に示す。
図 3に示すように、 すべてのオルガネラにおいて非常に大きなヘテロ ジエネティが認められることが明らかとなった。 この非常に大きなへテ ロジェネティの原因の一つとして、 トランスフエクションした細胞の細 胞周期がそろっていないということが考えられたが、 同調細胞を用いた 実験においてもヘテロジエネティが認められた （データは示さず）。 プラスミド DNAの核膜透過過程は核膜消失のおこる M期に促進される ことがこれまで明らかになっているが、 図 3に示す結果から、 エンドサ ィトーシス過程及びエンドゾームから細胞質への移行過程においてもこ のような細胞同期依存性があることが示唆される。 まず、エンドゾーム/ ライソソーム及び細胞質への分布を考えると、 バラツキは大きいが約 8 0 %の細胞で、ェンドソームにおけるプラスミ ド DNAの存在が認められる TJP2004/006303 ことから、 従来の報告通り、 エンドサイ ト一シスが 1つのメジャーな細 胞内取り込みメカニズムであると考えられる。 一方で、 いくつかの細胞 においては、 30分、 1時間という速い時間で 50〜70%のプラスミド DNA が細胞質中に存在しており、 これらの細胞においてはエンドゾーム中へ の分布がほとんど確認されないことから、 これらの細胞ではエンドサイ トーシス以外のメカニズムで細胞質に導入される可能性が示唆される。 さらに核膜透過に注目すると 1.5時間後までは上昇するが、 その後減少 することから、 核内へ取り込まれた後の分解又は核外への排出、 核への 取り込みクリアランスの低下が示唆される。 多くの細胞で 3· 5時間では 核膜付近にプラスミ ド DNAが存在することからも、 核からの排出メカ二 ズムの存在が支持されると考えられる。
4. 本評価系による R8と STR8を用いたプラスミ ド DNAの核移行量の比 較実験
( 1 ) 実験方法
①トランスフエクシヨン
マイクロチューブに血清不含の D'MEMを 100ml加えた後、 蛍光標識し たプラスミ ド DNAを lmgの加え、 よく攪拌した。 そこに 100mlの血清不 含の D'MEMに溶解した 9.5ml の R8を加え、 よく攪拌し、 30分間室温で 放置した。 30分後、 血清不含の D'MEM 400ml を加え、 よく攪拌し、 これ を上記と同様にして準備した細胞に添加し、 ィンキュベートした。
STR8に関しても R8と同様にして、 マイクロチューブに血清不含の D' MEMを 100ml加えた後、 lmgの蛍光標識したプラスミ ド DNA加え、 よく攪 拌した。 そこに 100mlの血清不含の D'MEMに溶解した 6.35mlの STR8を 加え、 よく攪拌し、 30分間室温で放置した。 30分後、 血清不含の D'MEM 400mlを加え、 よく攪拌し、 これを上記と同様にして準備した細胞に添 加し、 ィンキュベートした。 TJP2004/006303
②共焦点レーザー顕微鏡による観察
インキュベート時間はトランスフエクション後 1 時間、 3時間とし、 以降、 上記と同様の方法で観察した。
(2) 実験結果
human immunodeficiency virus (HIV)-l Tat proteimpos i Uons 48-6 9)における基本的なペプチドは、 細胞膜浸透性を持つペプチドで、 外来 分子 （遺伝子， タンパク等） を効率よく細胞内に運ぶキャリア一として 知られている。 アルギニン- rich ペプチドも Tat-(48- 69)と非常によく 似た細胞内への導入が観察されることが知られている。 本研究で用いた R8及び STR8はともにアルギニン- rich ペプチドであり、 遺伝子キヤリ ァ一として報告されており、 特に STR8は R8に比較して非常に高い発現 効率をしめすことが報告されている。 それぞれのペプチドとプラスミド DNA との複合体を調製し、 各複合体の細胞内動態を本評価系によって定 量解析した。
まず、 各複合体の細胞内における局在の様子を、 共焦点レーザー顕微 鏡を用いて観察した。その画像から R8とプラスミド DNAとの複合体（以 下 「R8複合体」 という。） は、 1時間及び 3時間において細胞内にあまり 存在していなかった。 細胞内に見られた R8複合体は、 1時間及び 3時間 ともにエンドゾーム/リソゾームに局在している様子が観察された。また 1時間及び 3時間どちらにおいても核内に存在する R8複合体を観察する ことはできなかった。 一方、 STR8とプラスミ ド DNAとの複合体（以下「S TR8複合体」） は 1時間では細胞膜周辺に凝集している様子や、 エンドソ 一ムに約半数近くの細胞で局在している様子が観察された。 さらに、 R8 複合体においては観察できなかった核膜周辺に、 STR8複合体の局在して いる様子を観察できた。 3時間においては核内に存在している STR8複合 体を観察することができた。 つぎに、 より詳細に各複合体の細胞内動態を観察するために、 本評価 系を用いて 5個の細胞について定量解析を行った。解析の結果、 1時間， 3時間ともに R 8複合体はエンドゾーム/リソソ一ムに 90 %以上の細胞で局 在しており、 このことからエンドサイトーシスによって取り込まれたこ とが示唆される。 また、 3時間においてもほとんどがエンドゾーム/リソ ソ一ムに存在することから、 細胞質への放出効率が低いことが考えられ た。
一方、 STR8複合体に関しては 1時間において 60%の細胞でェンドソー ム/リソソ一ムに存在していることから、 やはりエンドサイトーシスに よる細胞内への取込が示唆される。 さらに 3時間においては 70%近くの 細胞において細胞質や核膜周辺に STR8複合体が局在していること、 40% の細胞で核内移行が観察されたことから、 STR8複合体がエンドソ一ムか ら細胞質に放出され、 核膜透過が生じたと考えられる。 このことから、 S TR8 の細胞質への放出効率が高いのではないかということが示唆された。 産業上の利用の可能性
本発明により、 細胞に導入した核酸の標的オルガネラ全体おける局在 量を正確に定量する方法、 及び当該方法を利用して細胞に導入した核酸 の細胞内動態を分析する方法が提供される。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 細胞に導入した核酸の標的オルガネラおける局在量を定量する方 法であって、
(a) 前記標的オルガネラを第一の蛍光色素で染色する工程、
(b)ポリカチオン性物質と第二の蛍光色素で標識した前記核酸との複合 体を前記細胞に導入する工程、
(c)前記細胞と交差する平面上に存在する前記第一の蛍光色素が発する 蛍光を検出し、 前記平面上における前記標的オルガネラの存在領域を決 定する工程、
(d) 前記平面上に存在する前記第二の蛍光色素が発する蛍光を検出し、 前記標的オルガネラの存在領域のうち、 前記第二の蛍光色素によって染 色された領域の面積を算出する工程、
(e) 前記細胞と交差する複数の平面に対して前記工程 （c) 及び （d) を行う工程、 並びに
( f )前記複数の平面について算出された前記第二の蛍光色素による染色 領域の面積を総和し、 前記第二の蛍光色素による染色領域の総和面積を 指標として、 前記核酸の前記標的オルガネラにおける局在量を定量する 工程を含む前記方法。
2. 前記第一の蛍光色素又は前記第二の蛍光色素が発する蛍光を共焦 点レーザ一顕微鏡によって検出する請求項 1記載の方法。
3. 前記複数の平面が、 前記細胞内において互いに交差しない平面で ある請求項 1又は 2記載の方法。
4. 前記複数の平面の数が 2 0以上である請求項 1〜 3のいずれかに 記載の方法。
5. 請求項 1〜4のいずれかに記載の方法により、 細胞に導入した核 酸の異なる複数のオルガネラにおける局在量を定量し、 前記核酸の細胞 内動態を分析する方法。
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