WO2004081218A1 - 遺伝子トラップシステム - Google Patents

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WO2004081218A1
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Noboru Suzuki
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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
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    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Definitions

  • the present invention relates to a method for searching for a gene expressed under predetermined conditions, and more particularly, to a gene trap system for immobilizing transient gene expression as a constitutive expression of a reporter gene under predetermined conditions.
  • Conventional technology for searching for a gene expressed under predetermined conditions, and more particularly, to a gene trap system for immobilizing transient gene expression as a constitutive expression of a reporter gene under predetermined conditions.
  • the Human Genome Project has revealed almost the entire DNA base sequence of chromosomes.To open a new dimension in drug discovery and safety testing, comprehensively search for functional genes directly linked to physiological functions There is a need.
  • An object of the present invention is to provide a gene trap system capable of trapping any gene containing a gene that is transiently expressed during a state change process such as cell differentiation or canceration. Aim. Means for solving the problem
  • the recombinant enzyme C re of Pacteriophage ⁇ 1 A method was employed in which the gene was trapped by a trap vector using the gene, and the expression of the trapped gene was converted to the constitutive expression of another reporter gene.
  • the first step in which cells are transformed with a reporter vector, the second step in which the recombinant cells obtained in the previous step are further transformed with a trap vector, and the cells obtained in the previous step do not show reporter activity.
  • a system consisting of a third stage for selecting cells, a fourth stage for placing the cells selected in the previous stage under predetermined conditions, and a fifth stage for selecting cells for which the reporter activity was confirmed from the cells in the previous stage.
  • the reporter vector is a unit in which a promoter functioning in the cell, a first Lo xP sequence, a drug resistance gene, a transcription termination STOP sequence, a second Lo XP sequence, and a reporter gene are sequentially linked.
  • the trap vector has a splicing receptor (SA), an IRES (internal ribosomal entry site), a Cre (nl-Cre) with a nuclear-localized signonole, and a first splicing donor.
  • SA splicing receptor
  • IRES internal ribosomal entry site
  • Cre nl-Cre
  • SD first splicing donor
  • the system may further include a sixth step of obtaining a base sequence by cloning DNA adjacent to the trap vector of the cell selected in the fifth step.
  • the present invention provides a reporter comprising a unit in which a promoter functioning in a target cell, a first LoxP sequence, a drug resistance gene, a transcription termination STOP sequence, a second LoxP sequence, and a reporter gene are sequentially linked.
  • SA splicing sceptor
  • I RES internal ribosomal entry site
  • Cre with nuclear localization signal nl-Cre
  • SD first splice sink "donor”
  • This is a set of stickers for gene traps consisting of a trap vector having a unit in which a gene promoter, a drug resistance gene, and a second splicing donor (SD) are connected in sequence.
  • the present invention further comprises cells transformed with this set of vectors or the cells. . ⁇ -
  • Fig. 1 shows the basic unit of the trap vector.
  • FIG. 2 shows the basic cut of the reporter vector.
  • FIG. 3 shows a basic unit of the reporter vector constructed in Example 2.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing a phenomenon of each step in Example 4. Marks A and B indicate those that showed LacZ positive, and in the cells marked B, it indicates that the Cre gene of the trap vector was trapped in the ES cell differentiation process.
  • FIG. 5 shows photographs of cells showing LacZ positive only after induction of differentiation. A LacZ-positive cell population is observed in the center (arrow) of the cell mass. The color is dark blue. These cells correspond to those marked with B on the right in FIG. Embodiment of the Invention
  • the system of the present invention has two elements, a trap vector and a reporter vector.
  • Trapping vector pMIE
  • Figure 1 shows the basic unit of this trap vector. This basic unit is structurally divided into two large units.
  • SA spliced ⁇ click Scepter
  • IRES internal ribosomal entry site
  • nl-Cre nuclear localization Shigunanore C re
  • the latter half is a unit that is linked to a constitutively expressed gene promoter (eg, the PKK gene promoter), a drug resistance gene (eg, Neo), and a second splicing donor (SD).
  • a constitutively expressed gene promoter eg, the PKK gene promoter
  • a drug resistance gene eg, Neo
  • SD second splicing donor
  • SA splicing receptor
  • SD splicing donor
  • SA splicing control cis factor
  • I RES is the site of formation or entry of the ribosome complex to initiate protein synthesis.
  • IRES is a part of the human encephalomyocarditis virus gene, and a substantial portion thereof may be amplified and isolated from a commercially available vector by PCR.
  • Cre is a genetically modified enzyme.
  • the PKK gene promoter is a housekeeping gene promoter that is affected by the chromosomal integration site (trapping site).
  • the drug resistance gene is not particularly limited as long as it is a protein gene having a function of counteracting a drug action that is sensitive to mammalian cells. Neo resistance genes are the most widely used. This basic unit is introduced into a suitable vector. As a vector,
  • Bluescript SK II (STRATAGENE) or the like may be used.
  • the trap vector functionally has the following features.
  • the splicing receptor in the first half unit allows for a 5 '(upstream) exon trap in addition to the gene's promoter trap.
  • the latter unit the drug metamurai gene
  • RNA extracted from a trap ES cell clone a part of the gene trapped by 3 'RACE using the sequence of the drug resistance gene as a primer can be amplified and quickly identified.
  • this reporter vector contains a promoter that functions in the target cell, a first LoxP sequence, a drug resistance gene, a transcription termination STOP sequence, a second Lo XP system U, And a reporter gene linked in order. Note that a D N N array having no functional effect may be inserted between the constituent elements of these units.
  • the transcription termination STOP sequence may be a gene containing a stop codon (cDMA) or a polysaccharide-attached pudding signal. Some of the commercially available vectors may be diverted, including polyA addition signals and translation stop codons.
  • This basic unit is introduced into a suitable vector.
  • a vector As a vector,
  • the method of the invention comprises the following steps:
  • Stage 1 In this stage, a cell line is established by incorporating the reporter vector into a cell line to be tested, for example, a cell line that can change in two states, such as differentiation and canceration of the cell.
  • the target cell may be any cell, but particularly when used for embryonic stem cell ES cells, exhibits the following three advantages.
  • the trapped gene usually causes dysfunction (deletion or reduction), it is possible to produce a mutant animal using a trap ES cell clone. Since the structure of the trap vector according to the present invention replaces the expression of the gene in which the Cre gene is trapped, the animal produced using the trapped ES cell clone is referred to as a “Cre animal” (Animals necessary for genetic modification).
  • Step 2 In this step, the trap vector is introduced into the recombinant cells obtained in the previous step.
  • Step 3 Select cells from the cells obtained in the previous step that do not show the activity of the reporter.
  • Step 4 Put the cells obtained in the previous step under the specified conditions. It is possible to examine a gene that is expressed by placing the gene, especially a gene that is transiently expressed.
  • Step 5 Select cells for which reporter activity has been confirmed from the cells in the previous step. At this stage, its activity can be confirmed by an appropriate method according to the nature of the revoter gene.
  • Step 6 Cloning DNA near the trap vector 1 of the cell selected in the previous step to obtain a base sequence.
  • This step can be performed by a standard method. If the purpose is to obtain only the cells selected in the fifth step, this step may be omitted.
  • the present invention will be illustrated by examples, but is not intended to limit the present invention.
  • Example 1 Construction of a trap vector A splicing receptor (SA), I RES (internal ribosomal) between XbaI and Sa1I of BluescriptSKII (-), a cloning vector from STRATAGENE, USA entry site), Cre (nl-Cre) with nuclear localization signal, splicing donor (SD), PGK gene promoter, drug resistance gene (such as Neo), trap connected in order of splicing donor (SD)
  • SA splicing receptor
  • I RES internal ribosomal
  • Cre nl-Cre
  • SD splicing donor
  • PGK gene promoter PGK gene promoter
  • drug resistance gene such as Neo
  • the ceptor site of the second etherson of the ryanodine receptor type 2 gene (Bg1II-PstI fragment of about 50 base pairs, a commercially available genomic library from STRATAGENE, USA) from Lamda FIXIIJ Isolated and purified, SEQ ID NO: 1) was used.
  • IRES a fragment obtained by amplifying a corresponding portion from a commercially available pCITE expression vector (Novagen) using the primers shown in SEQ ID NOs: 2 and 3 by the PCR method was used.
  • a nuclear localization signal for the SV40 virus T antigen (SEQ ID NO: 4) was added to the Cre gene upstream of the sequence encoding the translation initiation site. ⁇ The gene (nl-C re) was used.
  • the PGK promoter used a mouse phosphoglycerokinase gene promoter that does not affect the transcriptional control of the integration site.
  • pOG44 'Gorman S, Fox DT, Wahl GM, 1991
  • a fragment obtained by amplifying the XbaI_SacII fragment by the PCR method from the synthetic intron of 251 (4999) 1351-1355) was used (SEQ ID NO: 5).
  • the reporter vector pRMIE-nlLacZ is a CAG promoter that functions in all types of cells, between the Notl and Sail of the cloning vector BluescriptSKII (—), the first Lo xP sequence, and puromycin resistance (P ac) A gene, a transcription termination STOP sequence, a second LoxP sequence, an E. coli beta-galactosidase gene, and a polyA-added signal were inserted and ligated in this order (Fig. 3).
  • the CAG promoter is a synthetic promoter consisting of the cytomegalovirus enhancer, chicken; 3 actin promoter, and 3 heron exon.
  • the STOP sequence is a Hindlll-BaMHI fragment (about 1.3 KB) derived from pBS302 (GENEB ANK number U51223).
  • the Escherichia coli beta-galactosidase II gene to which a nuclear localization signal was added was used.
  • RW4 Gene Systems, Inc. was used as ES cells.
  • the cell culturing and targeting procedures basically followed the methods described in the previous report (Suzuki N et al., Development., 122 (11), 3587-95 (1996)).
  • 500,000 ES cells and 50 ⁇ g of a reporter vector cut with NotI and Sa1I were mixed in 0.8 ml of buffer, and Gene of Bio-Rad was mixed.
  • DNA was introduced into cells by the electric pulse method using Pu 1 ser (400 V, 25 ⁇ F, electrode width 0.4 cm). After the application of an electric pulse, the cells were cultured on feeder cells that were monolayer cultured on the bottom of a 10 cm Petri dish.
  • fetal fibroblasts at 12.5 days of fetal period were treated with 0.1 mg / ml mitomycin C for 2 hours, inactivated, and mitotically stopped.
  • a puromycin-resistant ES cell clone in which the reporter vector had been integrated into the chromosome was selected.
  • coli beta-galactosidase gene in the reporter cell is silent due to the puromycin gene and the STOP sequence, which are sandwiched between the two upstream Lo XP sequences, and are not translated into protein, and therefore, do not express Cre. No E. coli beta-galactosidase activity is detected in the reporter cells.
  • Several clones were selected from the cell clones showing beta-galactosidase activity only after the introduction of the Cre expression vector, and the clones were grown as reporter ES cells for gene trapping and cryopreserved.
  • the introduction of the Cre forced expression vector pBSCAGCre into the cells was performed using a Fugene kit from Rosch.
  • Example 4 Introduction of a gene trap vector into a reporter ES cell and selection of cell traps caused by gene trap
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the phenomena of each step at this stage. ⁇
  • 50 Million Reporter ES Cells Cut Linearly with Pme I and Sa 1 I 50 g of the pMIE trap vector was introduced by an electric pulse method using GenePu1ser (400 V, 25 ⁇ F, electrode width 0.4 cm) from Bio-Rad. Gene transfer after 24 hours, the antibiotic G 418 was added at a concentration of 160 8 titer Zm 1, was started sorting. At the seventh time after the start of the culture, about 200 clones of G418-resistant Kova knee were transferred to a 96-well plate, and the culture was further continued to grow sufficiently.
  • GenePu1ser 400 V, 25 ⁇ F, electrode width 0.4 cm
  • the G418 resistance of each cell clone indicates whether the trap vector captured the etason of a gene via the second splicing donor added downstream of the Neo gene, or directly captured the polyA addition signal. It guarantees stable transcription and translation from the Neo gene.
  • replicas were prepared for each of the three 96-well plates.
  • FIG. 4 One of the above 96-well plates (in FIG. 4) was fixed with 4% paraformaldehyde and stained with LacZ to confirm the presence or absence of LacZ-positive cells.
  • the mark A indicates that the sample was positive for LacZ.
  • FIG. 4 Another one of the above 96-well plates (Fig. 4, right) was grown on a single feeder cell, treated with trypsin, and cultured in an uncoated culture dish to form an embryoid body. After 4 days, the cells were cultured in a DMEM culture solution (5% fetal bovine serum) containing 0.000 ImM retinoic acid. Thereafter, the cells were transferred to a gelatin-coated culture dish and cultured for 4 days. The embryoid body differentiates into various cell types including nerves while adhering to the surface of the culture dish and destroying its structure. Thereafter, the cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with lacZ, and the presence or absence of lacZ-positive cells was determined. It was confirmed that some of the cells attached to the culture dish were positive for LacZ activity. In the right of FIG. 4, marks A and B indicate those that showed LacZ positive.
  • Fig. 5 shows a photograph of the cells showing the (). This indicates that the gene expressed by the trap vector Cre gene during the differentiation process or after differentiation induction of the ES cell was trapped.
  • RNA was extracted from the ES cell trap clone using a Trizol kit (Invitrogen). This was designated as ⁇ , and a reverse transcription reaction was performed using a dT17 adapter primer (SEQ ID NO: 7) to synthesize cDNA.
  • cDNA synthesis was performed using a cDNA synthesis kit from Promega.
  • a first-stage PCR reaction was performed on a portion of the synthesized cDNA using an adapter primer (SEQ ID NO: 8) and a primer (NEO first primer, SEQ ID NO: 9) that is part of the Neo gene sequence.
  • the second stage PCR was performed using an adapter primer (SEQ ID NO: 10) and a NEO second primer (SEQ ID NO: 11) consisting of a sequence downstream of the first primer.
  • the identified gene was a gene having a novel sequence (not shown here) and that the system could function.

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Abstract

一過性に発現する遺伝子を含むいかなる遺伝子をもトラップすることが可能な遺伝子トラップシステムを提供する。バクテリオファージＰ１の遺伝子組み換え酵素Ｃｒｅ遺伝子を用いたトラップベクターにて遺伝子をトラップし、トラップした遺伝子の発現を別のレポーター遺伝子の構成的発現に変換する。

Description

明 細 書 遣伝子トラップシステム 技術分野
この発明は、 所定の条件下で発現する遺伝子を探索する方法に関し、 より詳細 には、 所定の条件下で一過性遺伝子発現をレポーター遺伝子の構成的発現として 固定化する遺伝子トラップシステムに関する。 従来技術
ヒトゲノム計画により、 染色体の D NA塩基配列の全容がほぼ明らかとなった 、 創薬分野、 安全性試験分野に新局面を切り開くためには、 生理機能に直結し た機能遺伝子を網羅的に探索する必要がある。
従来より特定の細胞内で転写され機能する遺伝子 （発現遺伝子） を網羅的に捕 捉 (トラップ)する方法として、ェンハンサートラップ、プロモータートラップ、 ェクソントラップの 3つの方法がある。 しカゝしながら、 これらの従来法では、 ト ラップべクター自身にレポーター機能 （遺伝子をトラップしたことを判定できる 機能） が付加されていたため、 構成的に安定して発現する遺伝子をトラップする ことは可能であつたが、 細胞の分化 ·がん化など状態変化の過程で一過性に発現 する遺伝子をトラップすることが不可能であった （Nature 1998 Apr 9 ; 392 ( 6676 )： 608 -ll) o 発明が解決しょうとする課題
本発明は、 細胞の分ィヒ ·がん化など状態変化の過程で一過性に発現する遺伝子 を含むいかなる遗伝子をもトラップすることが可能な遣伝子トラップシステムを 提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
本発明のシステムでは、 パクテリオファージ Ρ 1の遺伝子組み換え酵素 C r e 遺伝子を用いたトラップベクターにて遺伝子をトラップし、 トラップした遺伝子 の発現を別のレポーター遺伝子の構成的発現に変換する手法を採用した。 その結 果、 従来法でトラップできる遗伝子に加えて、 これまで不可能であった 「細胞が 生理状態を変化させるときに一過性に発現する遺伝子」 を網羅的に探索可能とな つた。 該システムによって、 遺伝子発現の動的変化を捉えるデータベースを構築 することができる。
本発明は、 細胞をレボータベクターで形質転換する第 1段階、 前段階で得た組 換え細胞を更にトラップベクターで形質転換する第 2段階、 前段階で得た細胞の うちレポータ活性を示さない細胞を選択する第 3段階、 前段階で選択した細胞を 所定の条件に置く第 4段階、 及び前段階の細胞の中からレポータの活性を確認し た細胞を選択する第 5段階から成るシステムであって、前記レポータベクター力 その細胞で機能するプロモーター、 1つめの Lo xP配列、 薬剤耐性遺伝子、 転 写終結 STOP配列、 二つめの L o X P配列、 及びレポ一タ一遺伝子を順に連結 したュニットを有し、前記トラップベクターが、スプライシングァクセプター (S A)、 I RES (internal ribosomal entry site), 核局在シグナノレを付カロ した C r e (nl-Cre), 一つめのスプライシングドナー （SD)、 構成的発現遺 伝子プロモーター、薬剤耐性遺伝子、及び二つめのスプライシングドナー（SD) を順に連結したュエツトを有する遺伝子トラップシステムである。
本システムは、 更に、 前記第 5段階で選択された細胞のトラップベクターの近 傍の DNAをクローユングして塩基配列を得る第 6段階を含んでもよレ、。
また、 本発明は、 対象となる細胞で機能するプロモーター、 1つめの Lo xP 配列、 薬剤耐性遺伝子、 転写終結 STOP配列、 二つめの Lo xP配列、 及びレ ポーター遺伝子を順に連結したユニットを有するレポータベクター、 及ぴ、 スプ ライシング クセプター (S A)、 I RES (internal ribosomal entry site), 核局在シグナルを付加した C r e (nl-Cre)、一つめのスプライシンク"ドナー（S D)、構成的発現遺伝子プロモーター、薬剤耐性遺伝子、及び二つめのスプライシ ングドナー (SD) を順に連結したユニットを有するトラップベクターから成る 遺伝子トラップ用の 1組のベタタ一である。
本発明は更に、 この 1組のベクターにより形質転換された細胞又は該細胞を有 .― -
する非ヒト動物である。 図面の簡単な説明
第 1図は、 トラップべクタ一の基本ュニットを示す。
第 2図は、 レポーターベクターの基本ュ-ットを示す。
第 3図は、 実施例 2で構築したレポーターベクタ一の基本ュ二ットを示す。 第 4図は、 実施例 4における各工程の現象を表す模式図を示す。 A印と B印は L a c Z陽性を示したものを表し、 B印の細胞では、 トラップべクターの C r e 遺伝子が E S細胞の分化過程で発現する遺伝子がトラップされたことを示す。 第 5図は、 分化誘導後にのみ L a c Z陽性を示す細胞の写真を示す。 細胞塊の 中心部 （矢印） に L a c Z陽性の細胞集団が認められる。 色は濃い青色である。 この細胞は、 図 4右の B印のものに相当する。 発明の実施の形態
本発明のシステムは、 トラップベクターとレポータベクターの 2要素を有する。 ( 1 ) 卜ラップベクター： p M I E
このトラップベクターの基本ュニットを図 1に示す。 この基本ュニットは構造 的に大きく 2つのュニットに分かれる。
前半部分は、 スプライシングァクセプター ( S A)、 I R E S (internal ribosomal entry site) s 核局在シグナノレを付カロした C r e (nl-Cre) , 一つ めのスプライシングドナー （S D) を順に連結したユニットである。
後半部分は、構成的発現遺伝子プロモーター（ P G K遺伝子プロモーターなど）、 薬剤耐性遺伝子 (N e oなど）、二つめのスプライシングドナー （S D) の順に連 結したュニットである。
なおこれらのュニットの各構成要素の間に機能的に影響のない D N A配列が挿 入されていてもよレ、。
S A (スプライシングァクセプタ一) は、 遺伝子の転写後制御のスプライシン グ （イントロンを切り出しアミノ酸をコードする部分を繋ぎ合わせるステップ） に必要なィントロンの下流側のシグナル配列である。 SD (スプライシングドナー) は、 S A同様 「スプライシング制御シス因子」 でイントロン上流側の機能的配列である。
I RESは、 たんぱく質合成を開始するためのリボソーム複合体の形成部位又 は進入部位である。 I RESは、 ヒト脳心筋炎ゥィルスの遗伝子の一部であり、 市販されているベクターから相当部分を PC Rで増幅、 単離したものを用いても よい。
C r eは、 遺伝子組替え酵素である。
P G K遺伝子プロモーターは、 染色体の組み込み部位 (トラップした場所) に 影響されに <いハウスキーピング遗伝子のプロモーターである。
薬剤耐性遺伝子は、 哺乳動物細胞が感受性を示す薬剤作用を打ち消す作用をも つ蛋白質の遺伝子であれば何でもよい。 N e o耐性遺伝子は最も汎用されている。 この基本ュニットを適当なベクターに導入する。 ベクターとしては、
Bluescript SK II (STRATAGENE社）等を用いてもよい。
トラップベクターは、 機能的に以下の特徴を有する。
前半ユニットのスプライシングァクセプターにより、 遺伝子のプロモータート ラップに加えて 5 ' (上流側） ェクソントラップが可能となる。
I RESにより トラップした遺伝子の中ほどのトラップした場合も、 メッセンジ ヤー RNAのキャップ構造を必要とする翻訳開始機構に依存しない C r e遺伝子 の翻訳が保証されている。
後半ユニットの薬剤而村生遺伝子は、 下流にスプラシングドナーを付カ卩されてはい るがポリ A付加シグナルを持たない。 このため、 細胞の薬剤耐性を選別指標に遺伝 子の 3' ェクソントラップとポリ A付カ卩シグナノレトラップを可能となる。 また、 ト ラップ E S細胞クローンより抽出した RNAより、 薬剤耐性遺伝子の配列をプライ マーとし 3' RACEにより トラップした遺伝子の一部を増幅し迅速に同定するこ とを可能とする。
トラップベクタ一内にボリ A付カロシグナルを含まないことは、 低パックグランド でのスクリーニングを可能とする。 また、 トラップ E S細胞クローンより抽出した RNAより、 3' RACEにより トラップした遺伝子の塩基配列の一部分を増幅し、 同定可能とする。 ( 2 ) レポーターベクター： p RM I E
このレポーターベクターは、 図 2に示すように、 対象となる細胞で機能するプ 口モーター、 1つめの L o x P配列、 薬剤耐性遺伝子、 転写終結 S T O P配列、 二つめの L o X P配歹 U、及びレポーター遺伝子を順に連結したュニットを有する。 なおこれらのュニットの各構成要素の間に機能的に影響のない D N Α配列が揷入 されていてもよい。
転写終結 S T O P配列は、 ストップコドンを含む遺伝子 ( c D MA) やポリ A 付カ卩シグナルでもよい。 市販品ベクターの一部を流用してよく、 これらはポリ A 付加シグナルや翻訳停止コドンを含んでいる。
この基本ユニットを適当なベクターに導入する。 ベクターとしては、
Bluescript SK I I ( STRATAGENEネ土） を fflレヽて よレヽ。
本発明の方法は、 以下の段階から成る：
第 1段階：この段階では、 上記レポーターベクターを検査対象の細胞株、 例え ば、 分化や細胞のがん化など 2つ状態を変化し得る細胞株、 に組み込んで細胞株 を樹立する。 対象となる細胞はいかなる細胞でもよいが、 特に、 胚性幹細胞 E S 細胞に用いる場合、 以下の三重の利点を発揮する。
E S細胞が多様な細胞型に分ィヒする条件下で一過性に発現する細胞分ィヒの鍵と なる遺伝子の探索が可能である。
トラップされた遺伝子は、 通常、 機能異常 （欠損又は低下） を来たすため、 ト ラップ E S細胞クローンを用いて突然変異動物の作製することが可能である。 本発明におけるトラップベクターの構造から、 C r e遺伝子がトラップされた 遺伝子の発現にとつて代わるため、 トラップ E S細胞クローンを用いて作製され た動物は「C r e動物」 （組織 ·細胞型特異的に遺伝子組み換えを行うのに必要な 動物） として活用することが可能である。
第 2段階：この段階では前段階で得た組換え細胞に上記トラップべクタ一を導 入する。
第 3段階：前段階で得た細胞のうちレポーター活"生を示さなレ、細胞を選択する。 第 4段階：前段階で得た細胞を所定の条件に置く。 細胞をこのような条件に置 くことにより発現する、 特に一過性に発現する遺伝子を調べることができる。 第 5段階：前段階の細胞の中からレポータの活性を確認した細胞を選択する。 この段階ではレボータ遺伝子の性質に応じた適当な方法によりその活性を確認す ればよレ、。
第 6段階：前段階で選択された細胞のトラップベクタ一の近傍の D N Aをクロ 一二ングして塩基配列を得る。 この段階も常法により行えばよレ、。 なお第 5段階 で選択された細胞のみの取得を目的とする場合には、この段階は省略してもよい。 以下、 実施例にて本発明を例証するが、 本発明を限定することを意図するもの ではない。 実施例 1 トラップべクタ一の構築 米国 STRATAGENE社のクロー-ング用べク ター BluescriptSKII(-)の Xb a I -S a 1 I間に、 スプライシングァクセプ ター （SA)、 I RES (internal ribosomal entry site)、 核局在シグナ ルを付カロした C r e (nl- Cre)、 スプライシングドナー （SD)、 PGK遺伝子 プロモーター、薬剤耐性遺伝子 （Ne oなど）、 スプライシングドナー （SD) の 順に連結したトラップベクター （pMI E- nlCre、 図 1) を作製した。
スプライシングァクセプターとして、 リアノジン受容体 2型遺伝子の第 2エタ ソンのァクセプター部位 （約 50塩基対の B g 1 I I -P s t I断片、 米国 STRATAGENE社の巿販ゲノミックライブラリー Γ L a m d a F I X I I J より単 離 ·精製したもの、 配列番号 1) を用いた。
I RE Sとしては、 市販の p C I TE発現ベクター（No v a g e n社）より相 当部分を配列番号 2及び配列番号 3に示すプライマーを用いて P C R法にて増幅 した断片を用いた。
C r e遺伝子には、 遺伝子組み換え C r eたんぱくが細胞核内で機能すること を考慮し、 その翻訳開始点をコードする配列の上流に SV40ウィルス T抗原の 核局在シグナル (配列番号 4) を付加した遗伝子 (n l—C r e) を用いた。
PGK プロモータ一は、 組み込み部位の転写制御に影響を与えないマウスのフォ スフォグリセロカイネース遺伝子のプロモーターを用いた。 スプライシングドナーとしては、 pOG44 (0 ' Gorman S, Fox DT, Wahl GM 、1991) , Recombinase - mediated gene activation and site-specific integration in mammalian cells . Science,
251(4999) 1351-1355 ) の合成イントロンより、 X b a I _ S a c I I断 片を P C R法にて増幅した断片を用いた （配列番号 5 )。
細胞導入前にトラップベクターの Bluescript SKI I (-)部分を切り離すために、 合成オリゴマー (配列番号 6 ) を用いて、 BluescriptSKII (-）の S p e Iを P me Iに変換した。 . 実施例 2 レポーターベクター （pRMIE- nlLacZ) の構築
レポーターべクター pRMIE- nlLacZ は、 クローニング用べクタ一 BluescriptSKII (—）の Notl— Sail間に、 すべてのタイプの細胞で機能する C AGプロモーター、 1つめの Lo xP配列、 ピューロマイシン耐性 (P a c) 遺 伝子、 転写終結 STOP配列、 二つめの Lo xP配列、 大腸菌ベータガラクトシ ダーゼ遺伝子、 ポリ A付カ卩シグナルの順に挿入'連結して作製した （図 3)。
CAGプロモーターは、 サイトメガロウィルスのェンハンサー、 ニヮトリ；3ァ クチンプロモーター、 ゥサギ ]3グロビンのェクソンからなる合成プロモーターで ある。 STOP配列は、 pBS 302 (GENEB ANK番号 U51223) 由来の Hindlll - BaMHI断片 （約 1.3KB)) である。
大腸菌ベータガラクトシダーゼ遗伝子には、 核局在シグナルを付加したものを 用いた。
この構造によって、 C r eたんぱく質があると、 L o X P配列間で,組換えが起 こり S T O P配列が切り出され、 下流域のベータガラタトシダーゼ遺伝子の転写 がおこる。 実施例 3 E S細胞へのレポーターベクターの導入とレボーター細胞の選別
ES細胞としては RW4 (G e n ome Sy s t ems社） を使用した。 細 胞培養及びターゲテイングの操作は基本的に既報に記載の方法 （Suzuki N et. al., Development. , 122(11), 3587-95 (1996)) に従った。 5 0 0 0万個の E S細胞と N o t Iと S a 1 Iで切断した 5 0 μ gのレポータ 一べクターを 0. 8mlの緩衝液中で混ぜ、 B i o -R a d社の G e n e P u 1 s e r (400 V, 2 5 μ F, 電極幅 0. 4 cm) を用いた電気パルス法によ り細胞に DNAを導入した。 電気パルスをかけた後、 細胞を、 1 0 cmシャーレ の底面に単層培養したフィーダー細胞上に培養した。 フィーダー細胞としては、 胎生期 1 2. 5日めの胎児の線維芽細胞を 0. 1 m g /m 1のマイトマイシン C で 2時間処理し不活性化して分裂停止状態にした細胞を用いた。 培養開始 24時 間後、 6 0時間後、 9 6時間後に、 抗生物質ピューロマイシンを 1. 3 3 g/ m 1の濃度で添加 · 1 2時間培養 ·洗浄 ·正常培地培養の操作を反復することに よって、 レポーターベクターを染色体に取り込んだピューロマイシン耐性 E S細 胞クローンの選別を行った。
培養開始 7目後、 ピューロマイシン耐性のコロニー約 200クローンを 9 6穴 プレートに移し、 さらに培養を続け、 十分に増殖したところで、 3枚の 9 6穴プ レートに分けた。 さらに増殖させ、 1枚は零下 8 5度冷凍庫で保存用に、 1枚は そのままベータガラクトシダーゼ活性検出用に、 もう 1枚は C r e発現ベクター p B S CAGCre導入後にベータガラクトシダーゼ活性検出用に使用した。 レポーター細胞における大腸菌ベータガラクトシダーゼ遺伝子は、 上流の 2つ の L o X P配列にはさまれているピューロマイシン遺伝子と STOP配列のため サイレントであり、 たんぱく質への翻訳はされず、 従って、 C r e非発現レポ一 ター細胞では大腸菌ベータガラクトシダーゼ活性は検出されない。 C r e発現べ クタ一導入後にのみベータガラクトシダーゼ活性を示す細胞クローンのうち数ク ローンを選別し遺伝子トラップ用のレポーター E S細胞として増殖して凍結保存 した。 C r e強制発現ベクター p B S CAGCreの細胞への導入は、 R o s c h 社の F u g e n eキットを用いて行った。 実施例 4 レボーター E S細胞への遺伝子トラップべクタ一導入と遺伝子トラッ プが起こつた細胞候捕の選別
この段階における各工程の現象を表す模式図を図 4に示す。 ·
レポーター E S細胞 5 000万個に、 Pme Iと S a 1 Iでリニアに切断した pMIE トラップベクター 50 gを B i o— Ra d社の Ge n e P u 1 s e r (400 V, 25 μ F, 電極幅 0. 4 cm) を用いた電気パルス法によって導入 した。 遺伝子導入 24時間後に、 抗生剤 G 418を 160 8力価 Zm 1の濃度 で添加し、 選別を開始した。 培養開始後 7目めに、 G 418耐性のコ口ニー約 2 00クローンを 96穴プレートに移し、 さらに培養を続け、 十分に増殖させた。 この段階で、 各細胞クローンの G418耐性は、 トラップベクターが Ne o遺 伝子下流に付加した 2番目のスプライシングドナーを介してある遺伝子のエタソ ンを捕らえたか、あるいは直接にポリ A付加シグナルを捕らえ、 Neo遺伝子から 安定して転写 ·翻訳が起こっていることを保証するものである。
次に、 1枚につき 3枚の 96穴プレートに分けレプリカを作製した。 さらに増 殖させ、 1枚 （図 4左） は零下 85度冷凍庫で保存用に、 1枚 （図 4中） はその ままベータガラクトシダーゼ活性検出用に、 もう 1枚 （図 4右） は分化誘導後に ベータガラクトシダーゼ活性検出用に使用した。
次に、 In vitro分化誘導と La c Z染色を、 既報に記載の方法 （Gajovic S. et. al. , Experimental Cell Research 242(1), 138-143 (1998) ) に 従って行 た
上記 96穴プレートの 1枚 （図 4中） について、 4%パラホルムアルデヒ ドで 固定し L a c Z染色を行い、 La c Z陽性細胞の有無をたしかめた。 図 4中にお いて、 A印は L a c Z陽性を示したものを表す。
次に、 上記 96穴プレートの別の 1枚 （図 4右） について、 フィーダ一細胞 上で十分に増殖させた後、かるく トリプシン処理をし、非コート培養皿で培養し、 胚様体を形成させて 4日間、 0. 00 ImMレチノイン酸を含む DMEM培養液 (5%牛胎児血清） で培養した。 後、 ゼラチンコートした培養皿に移し 4日間培 養した。胚葉体は、培養皿の表面に付着しその構造を崩しながら神経をはじめ様々 な細胞型に分化する。 その後、 4%パラホルムアルデヒドで固定し L a c Z染色 を行い、 L a c Z陽性細胞の有無をたしかめた。 培養皿に付着した細胞の一部が L a c Z活性陽性であることを確認した。 図 4右において、 A印と B印は L a c Z陽性を示したものを表す。
上記 2枚にプレート （図 4中と右） において、 分化誘導後にのみ La c Z陽性 を示す細胞 （即ち、 図 4右の B印） の写真を図 5に示す。 この細胞では、 トラッ プベクターの C r e遺伝子が E S細胞の分化過程又は分化誘導後に発現する遺伝 子がトラップされたことを示している。 実施例 5 RT— PCRによるトラップした遺伝子の同定
基本白勺 ίこ、 既幸艮こ記載の方法 (Frohman .A. et . al., Proc Natl Acad Sci USA 85 (23)： 8998-9002 (1988) ) に従った。
本トラップベクターの P G Kプロモーターは構成的転写活性を有するため、 抗 生物質 G 418耐性の細胞中には、 細胞の分化 ·未分ィ匕に関係なく、 Ne o遺伝 子の転写物が存在する。 また、 本トラップベクターの特性上、 Ne o配列とポリ A配列の間にはトラップされた遺伝子由来の配列が存在する。 従って、 大量培養 可能な未分化 E S細胞トラップクローンより RNAを抽出し、 N e o遺伝子転写 物のポリ A配列と N e o遺伝子配列間を P C Rによつて増幅することによってト ラップした遺伝子を同定 ·解析できる。
トリゾールキット （I nv i t r o g e n社） を用いて、 E S細胞トラップク ローンより RNAを抽出した。 これを鎵型とし、 dT 17アダプタープライマー (配列番号 7) を用いて逆転写反応を行ない cDN Aを合成した。 cDNA合成 は、 P r ome g a社の c DNA合成キットを用いて行なった。 合成した cDN Aの一部を、 アダプタープライマー （配列番号 8) と N e o遺伝子の配列の一部 であるプライマー （NEO第一プライマー、 配列番号 9) 用いて第一段階めの P CR反応を行なった。 さらに、 増幅効率と純度を高めるため、 第二段階めの PC Rを、 アダプタープライマー （配列番号 10) と第一プライマーの下流の配列か らなる NEO第二プライマー （配列番号 11) を用いて行なった。
以上によって、 同定された遺伝子は、 新規配列 （ここでは示さない。） を有する 遺伝子であり、 システムが機能しうることが確認された。

Claims

請 .求 の 範 囲
1. 細胞をレポ一タべクターで形質転換する段階、 前段階で得た組換え細胞を 更にトラップベクターで形質転換する段階、 前段階で得た細胞のうちレポータ活 性を示さない細胞を選択する段階、 前段階で選択した細胞を所定の条件に置く段 階、 及び前段階の細胞の中からレボータの活性を確認した細胞を選択する段階か ら成るシステムであって、 前記レポータベクターが、 その細胞で機能するプロモ 一ター、 1つめの L o x P配列、 薬剤耐性遺伝子、 転写終結 STOP配列、 二つ めの L o X P配列、 及びレポーター遺伝子を順に連結したュニットを有し、 前記 トラップベクターが、 スプライシングァクセプター、 I RE S、 核局在シグナル を付加した C r e、 一つめのスプライシングドナー、 構成的発現遺伝子プロモー ター、 薬剤耐性遺伝子、 及び二つめのスプライシングドナーを順に連結したュ- ットを有する遺伝子トラップシステム。
2. 更に、 前記選択された細胞のトラップベクターの近傍の DN Aをクロー二 ングして塩基配列を得る段階を含む請求項 1に記載のシステム。
3. 前記細胞が E S細胞である請求項 1又は 2に記載のシステム。
4. 対象となる細胞で機能するプロモーター、 1つめの L o X P配列、 薬剤耐 性遺伝子、 転写終結 STOP配列、 二つめの L o x P配列、 及ぴレポーター遺伝 子を順に連結したユニットを有するレポータベクター、 及び、 スプライシングァ クセプター、 I RE S、 核局在シグナルを付カ卩した C r e、 一つめのスプライシ ングドナー、 構成的発現遺伝子プロモーター、 薬剤耐性遺伝子、 及び二つめのス プライシングドナーを順に連結したュニットを有するトラップベクターから成る 遺伝子トラップ用の 1組のベタタ一。
5. 請求項 4に記載の 1組のベクタ一により形質転換された細胞又は該細胞を 有する非ヒト動物。
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