WO2004069855A1

WO2004069855A1 - 活性発現メカニズムを考慮した新しい糖転移酵素阻害剤およびその製造法

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Publication number: WO2004069855A1
Application number: PCT/JP2004/001092
Authority: WO
Inventors: Shinichiro Nishimura; Kenji Takaya; Nobuaki Miura
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 2003-02-04
Filing date: 2004-02-03
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2005-08-04
Also published as: JPWO2004069855A1

Abstract

　本発明の課題は、新規の酵素活性調節因子の設計機構を提供することである。本発明において、酵素の基質によるコンフォメーション変化に着目し、その変化と触媒活性との関連を酵素活性調節因子（例えば、阻害因子）の設計に応用することによって上記課題が解決された。好ましい例として、本発明は、ガラクトース転移酵素上のＵＤＰ−Ｇａｌ結合部位と相互作用し得る部分と、トリプトファンと相互作用し得る部分とを含む、化合物を提供する。

Description

活性発現メ力ニズムを考慮した新しい糖転移酵素阻害剤およびその製造法技術分野

本発明は、概して、酵素学の分野に関する。より詳細には、本発明は、酵素の阻害剤およびその設計の分野に関す明る。背景技術食曰糖鎖は、生体内において、多用で重要な役割を果たしていることが知られている。細胞表面に存在する種々のタンパク質および脂質などは、突き出した糖鎖をもっており、それら糖鎖は、各種細胞、ホルモン、あるいは感性性の細菌、ウイルス、毒素といった細胞外の環境との接着部位として働いている。

それら糖タンパク質や糖脂質は、その前駆体が細胞内の小胞体、ゴルジ体を通過する際に、糖転移酵素と呼ばれる一群の糖鎖伸長酵素によって複雑な糖鎖修飾を受け、機能を発現する。糖転移酵素は一般的に、単糖に UDP、 GDP、 CM Pなどといったヌクレオチドが結合した糖ヌクレオチドを糖ドナーとして、多様な構造を持つ糖ァクセプターへ糖を一つずつ転移させる（図 l a) 。これら多種多様の糖転移酵素の発現の場所、タイミング、活性が複雑な糖鎖の合成をコントロールし、細胞の表現形に極めて重要な影響を与えていると考えられる。

生体内において糖鎖の持つ重要性が認識されるにつれて、糖鎖合成酵素である糖転移酵素の生体内での働きを知ることが、生物の発生、分化、維持の理解のために重要であることが近年わかってきた。現在までにその由来も含め、数十種にも及ぶ糖転移酵素が発見され、多くの研究者が各々の必要とする情報を得るために、様々な手法を用いて糖転移酵素の活性測定を行ってきた（例えば、 Pa l e i c， M. M. ， Ke i k o， S. (2001) As s a y s f o r G 1 y c o s y l t r a n s f e r a s e s, T r e n d s i n G i y c o s c i e n c e a n d G l y c o t e c hn o 1 o g y, 13， 361— 370参照）。

現在では酵素活性測定の手段として、基質反応量をラジオアイソトープを用いて検出する手法、特定の糖鎖を認識して接着する抗体ゃレクチンに蛍光標識を施すことで検出する手法、などが広く用いられている。これらの手法はその感度、検体使用料の少なさにおいて非常に優秀であり、今後も広く採用されてゆくと思われる。しかしながらこれらの手法を用いるためには、ラジオアイソトープを用いる危険性、それに伴う専門の施設の必要性、特殊な抗体ゃレクチンの入手困難さ、高度な専門知識を必要とするなど、多くの欠点を伴っていることも事実である。こういった背景から、より安全、簡便で、高感度な糖転移酵素活性測定法の確立が強く望まれていた。

近年、堂光エネルギー移動 (F l u o r e s c e n c e Re s o n a n c e En e r g y T r a n s f e r ：本明細書において FRETともいう）とレ、う原理に基づいた酵素活性測定法が注目されている。この手法では上記のような従来法の欠点を克服し、安全、簡便、高感度、さらに従来法では原理的に不可能であった、連続的な酵素反応の様子を観察することができる。しかしながら、現在までにこの手法を用いた酵素活性測定は、 1基質反応を行う酵素（アミラーゼ（例えば、 Na t h a l i e, P. ， S y l v a i n, C. ， Hu g u e s. D. (1995) , An g ew. Ch em. I n t. Ed s. En g l . , 34, 1239— 1241、および K a o r u Om i c h i , T o k u j i I k e n a k a (1986) ， J. B i o c h em. 99， 291— 294参照）、ヌクレアーゼ（例えば、 S o um i t r a. e t. a l . (1994) , Nu c 1 e i c Ac i d s Re s e a r c h, 22， 3155— 3159、およぴ L e e， S， P. e t. a l . (1 995) , An a l . B i o c h em. 227,

295— 301参照）、セラミドダリカナーゼ（例えば、 Ky un g， B. L e e， Ko j i Ma t s u o k a , S h i n— I c h i r o N i s h i mu r a， Yu a n. C. L e e . (1 9 9 5) ， An a l . B i o c h e m. 2 3 0， 3 1— 3 6、および K o j i Ma t s u o k a , S h i n- I c h i r o N i s h i m r a, Yu a n C. L e e . (1 9 9 5) ， C a r b o h y d r a t e R e s e a r c h, 2 7 6, 3 1 -4 2参照），ぺプチダーゼ（例えば、

E dmu n d D. Ma t a y o s h i , G a r y T. Wa n g, G r a n t A. K r a f f t , J o h n E r i c k s o n (1 9 9 0) , S c i e n c e， 24 7, 9 54- 9 5 7, G a r y T. Wa n g, e t . a 1. (1 9 9 3) ， An a l . B i o c h e m. 2 1 0, 3 5 1— 3 5 9、および L i n d a L. M.， C l a r k W. Sm i t h, Z h o n g -Y i n Z h a n g (1

9 9 2) ， J . Me d. C h e m. 3 5， 3 7 2 7— 3 7 3 0参照））等についてのみ行われてきた。これらの例では、酵素の認識部位から外れた位置に蛍光ェネルギ一移動を行う 2種の蛍光物質を導入することにより、酵素反応によって回復する蛍光ドナーからの蛍光強度の変化を観察することでその活性を測定しており、この手法の有用性が示されてきた（図 l b) 。し力しながら、 2基質系酵素である糖転移酵素の活性測定については、酵素の重要性に関する認識不足や、基質標識困難さ、標識による酵素活性への影響を懸念して、現在まで行われていなかった。しかしながら当研究室において、最近初めて糖転移酵素について FRE T法を用いた酵素活性測定例が報告された（例えば、 K i m i t o Wa s h i y a , T e t s u y a F u r u i k e , F um i o N a k a j i ma , Yu a n C. L e e, S h i n- I c h i r o N i s h i mu r a (20 0 0) , An a l . B i o c h e m. 2 8 3, 3 9— 4 8参照）。この報告では、 a 2 , 6シアル酸転移酵素について、その手法の有用性が示されている（図 l c) 。こういったことが可能になってきた背景には、その酵素の重要性が認知されてきたことに加え、基質と酵素活性部位との結合様式についての知見が得られるようになってきたことによる。本研究では、 α 2， 6シアル酸転移酵素同様、その基質特異性について研究が進んでいるガラクトース転移酵素について F R E T法を利用して活性測定を行い、この手法の汎用性を広めることを目的とした。この手法が確立することにより、細胞抽出画分中の糖転移酵素の活性量を容易に測定できるようになるだけでなく、プレート上で酵素反応を行うことでハイスループットな酵素阻害剤の評価が可能になると期待される。

従来の阻害剤設計の研究は、酵素と基質との間の相互作用に基づき、基質との競合作用を探索することによって行われてきた。し力し、このような競合作用による相互作用の干渉では、いくらか基質が酵素と結合するということが避けられず、効率よい阻害剤の設計には限度がある。そこで、新たなメカニズムに基づく阻害剤の新たな設計方法に対する要望がある。

このような状況の下、本発明は、従来の方法とは異なる新規のメカニズムで酵素の活性調節因子（例えば、阻害因子）を設計する方法を提供することを課題とする。発明の開示

上記課題は、本発明において、酵素の基質によるコンフオメーシヨン変化に着目し、その変化と触媒活性との関連を酵素活性調節因子（例えば、阻害因子）の設計に応用することによって解決された。

本発明では、以下を提供する。

( 1 )ガラクトース転移酵素上の UD P— G a 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む、化合物。

( 2 )上記 UD P— G a 1結合部位と相互作用し得る部分が、単糖または単糖の誘 ' 導体である、項目 1に記載の化合物。

' ( 3 )上記 UD P— G a 1結合部位と相互作用し得る部分が、ガラクトース誘導体である、項目 1に記載の化合物。 (4)上記トリブトファンと相互作用し得る部分は、芳香族官能基を含む、項目 1 に記載の化合物。

(5)上記トリプトファンと相互作用し得る部分は、ナフタレンである、項目 1に記載の化合物。

(6)上記 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、上記トリブトファンと相互作用し得る部分との間の距離は、 1A〜30Aの間である、項目 1に記載の化合物。

(7)上記 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、上記トリブトファンと相互作用し得る部分との間には、一（CH₂CH₂0) _n—が連結されており、ここで、 nは 1〜 6の間の整数である、項目 1に記載の化合物。

(8) 一般式（I) または（I I) Y I

I

(II)

[式中、 Xは Oまたは NHであり、 nは 0〜6の整数であり、 mは 1〜6の整数であり、 Yは芳香族官能基であり、 Zは単結合または一 NH—C (=0) -CH ₂— O—である] で表される、項目 1に記載の化合物。上記化合物において、糖部分は、後述の「単糖の誘導体」であってもよい。また、水酸基およびアミノ基は、後述の適切な保護基により保護されていてもよい。

(9) 以下の式：

で表される化合物群から選択される、項目 1に記載の化合物。

(10)ガラクトース転移酵素上の UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを、少なくとも一方について複数含む、化合物。

(11) UDP-Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む化合物を含む、組成物。 (12) β 1, 4一ガラクトース転移酵素の活性を阻害するための、項目 1 1に記载の組成物。

(1 3) UDP-G a 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む、化合物、

を含む、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患を処置または予防するための組成物。

(14) 以下の工程：

(a) UDP— G a 1結合と相互作用し得る部分と、トリプトファンと相互作用し得る部分とを含む、化合物を被検体に投与する工程、

を包含する、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患を処置または予防するための方法。

(1 5) β 1， 4一ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患を処置または予防するための医薬を製造するための、 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリプトフアンと相互作用し得る部分とを含む化合物の使用。

(16) 以下の工程：

1) 酵素において、該酵素の基質との相互作用部位を同定する工程；

2) 該酵素の触媒反応に必要な構造変化を担う構造変化部位を同定する工程；および

3) 該相互作用部位と相互作用する A部分、およぴ該構造変化部位と相互作用する B部分を同定する工程、

を包含する、酵素の活性を調節する因子をスクリーニングする方法。

(17)酵素が、触媒反応に 2以上の分子が必要な酵素である、項目 16に記載の方法。

(18) 上記基質は、ドナーおょぴァクセプターを含み；

上記酵素は、該ドナーと該ァクセプターとの間の反応を触媒し；上記構造変化は、該ドナーにより生じ；

上記 A部分は該ドナーと相互作用し、上記 B部分は該ァクセプターの触媒部位への進入を担う部分である、項目 16に記載の方法。

(19) 上記酵素は、糖転移酵素である、項目 16に記載の方法。

(20) 上記酵素は、 β 1, 4一ガラクトース転移酵素、 1, 3—ガラクトース転移酵素， β 1, 4一ガラクトース転移酵素， β 1, 3—ガラクトース転移酵素， ]31， 6—ガラクトース転移酵素、 α 2， 6—シアル酸転移酵素、《 1, 4 一ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、 a l， 2—フコース転移酵素、 " 1， ₃—フコース転移酵素、ひ 4ーフコース転移酵素、 a l， 6—フコース転移酵素、 α 1， 3— Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 α 1，

6 _Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、）31， 4— Ν—ァセチルガラタトサミン転移酵素、ポリペプチド Ν—ァセチルガラタトサミン転移酵素、 β 1， 4一 Νァセチルグルコサミン転移酵素、 j31， 2— Nァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1 , 3— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1, 6—Νァセチルダルコサミン転移酵素、 α ΐ, 4— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 4一マンノース転移酵素、 a l， 2—マンノース転移酵秦、《 1， 3—マンノース転移酵素、 a 1, 4一マンノース転移酵素、 α 1， 6—マンノース転移酵素、ひ 1， 2—グルコース転移酵素、ひ 1， 3—グルコース転移酵素、 α 2, 3—シアル酸転移酵素、 α 2, 8—シアル酸転移酵素、 ο; 1， 6—ダルコサミン転移酵素、 a l， 6 —キシロース転移酵素、 ]3キシロース転移酵素（プロテオダリカンコア構造合成酵素）、 ]31， 3—グルクロン酸転移酵素おょぴヒアルロン酸合成酵素からなる群より選択される、項目 16に記載の方法。

(21) 上記酵素は、 P 1, 4一ガラクトース転移酵素である、項目 16に記載の方法。

(22) 上記基質は、 U D P— G a 1を含み、上記構造変化部位は、配列番号 2に示されるゥシ 1， 4—ガラクトース転移酵素のポリペプチド配列のアミノ酸 3 14位、または配列番号 4に示されるヒト 1， 4一ガラクトース転移酵素のポリペプチド配列のアミノ酸 3 14位のトリプトフアンである、項目 2 1に記載の方法。

(23) 以下の工程：

Α) 酵素において、該酵素の基質との相互作用部位を同定する工程；

Β) 該酵素の触媒反応に必要な構造変化を担う構造変化部位を同定する工程；

C) 該相互作用部位と相互作用する Α部分、およぴ該構造変化部位と相互作用する B部分を同定する工程；および

D) 該 A部分おょぴ該 B部分を含む分子を調製する工程、

を包含する、酵素の活性を調節する因子を生産する方法。

(24)酵素が、触媒反応に 2以上の分子が必要な酵素である、項目 23に記載の方法。

(25) 上記基質は、ドナーおよびァクセプターを含み；

上記酵素は、該ドナーと該ァクセプターとの間の反応を触媒し；

上記構造変化は、該ドナーにより生じ；

上記 A部分は該ドナーと相互作用し、上記 B部分は該ァクセプターの触媒部位への進入を担う部分、

項目 23に記載の方法。

(26) 上記酵素は、糖転移酵素である、項目 23に記載の方法。

(27) 上記酵素は、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素、ひ一 1， 3—ガラクトース転移酵素， /3 1， 4一ガラクトース転移酵素， /3 1， 3—ガラクトース転移酵素， β 1， 6—ガラクトース転移酵素、 α 2， 6—シアル酸転移酵素、 1， 4 一ガラクトース転移酵素、セラミドガラタトース転移酵素、 a l， 2—フコース転移酵素、 α ΐ, 3—フコース転移酵素、 _α 1， 4ーフコース転移酵素、《 1， 6—フコース転移酵素、 α 1， 3— Ν—ァセチルガラタトサミン転移酵素、 α 1，

6— Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 ]3 1， 4—Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチド N—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 0 1， 4- Nァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 2一 Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1, 3— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 j31， 6— Nァセチルダルコサミン転移酵素、 a l， 4一 Νァセチルダルコサミン転移酵素、 ]31， 4—マンノース転移酵素、 a l， 2—マンノース転移酵素、 a l， 3—マンノース転移酵素、 a 1, 4一マンノース転移酵素、 a l， 6—マンノース転移酵素、 a 1， 2—グルコース転移酵素、 _a l， 3—グルコース転移酵素、ひ 2， 3—シアル酸転移酵素、《 2， 8—シアル酸転移酵素、 a l， 6—ダルコサミン転移酵素、 a l， 6 ーキシロース転移酵素、 j3キシロース転移酵素（プロテオダリカンコア構造合成酵素）、 β 1， 3—グルクロン酸転移酵素およびヒアルロン酸合成酵素からなる群より選択される、項目 23に記載の方法。

(28) 上記酵素は、 β 1， 4—ガラクトース転移酵素である、項目 23に記載の方法。

(29) 上記基質は、 UDP— Ga 1を含み、上記構造変化部位は、配列番号 2に示されるゥシ ]31， 4—ガラクトース転移酵素のポリペプチド配列のアミノ酸 3 14位、または配列番号 4に示されるヒト /3 1， 4一ガラクトース転移酵素のポリペプチド配列のアミノ酸 314位のトリブトファンである、項目 28に記載の方法。

(30)上記同定は、コンビナトリアルケミストリライブラリーをスクリーユングすることを包含する、項目 23に記載の方法。

(31) 項目 23に記載の方法によって生産された、因子。

(32) 以下の工程：

(a) ガラクトース転移酵素上の UDP— G a 1結合部位と相互作用し得る A 部分を提供する工程；

(b) A部分において B部分またはスぺーサーを結合する部位以外を保護する工程； (c) B部分または該スぺ一サーを保護された A部分に結合させる工程；および

(d) (c) の生成物を脱保護する工程、

を包含する、ガラクトース転移酵素上の UDP— G a 1結合部位と相互作用し得る A部分と、トリブトファンと相互作用し得る B部分とを含む、化合物を合成する方法。図面の簡単な説明

図 1 aは、糖転移酵素による糖鎖伸長の模式図である。

図 l bは、 FRETを用いた H I V— 1プロテアーゼの活性測定の模式図である（E. D. Ma t a y o s h i , G. T. Wa n g, G. A. K r a f t， J. E r i c k s o n (1 9 90) S c i e n c e,. 24 7, 9 54— 9 58) 。図 1 cは、 F R E Tを用いた、 <χ 2, 6—シアル酸転移酵素の活性測定の模式図を示す（K. Wa s h i y aら（200 1) An a l . B i o c h em. 28 3, 39— 48) 。

図 I dは、転移することが報告された、ガラクトース転移酵素の基質誘導体を示す。図中の数字は、 UDP— Ga 1を 1 00としたときの比反応率を示す。図 1 eは、設計した蛍光標識 UD P— G a 1誘導体の例示を示す。

図 1 f は、設計した蛍光標識糖ァクセプターの例示を示す。

図 2 aは、計算による蛍光基間距離の例示を示す。図 2 aでは、例示として基質誘導体 3の場合を示す。

図 2 bは、計算による蛍光基間距離の例示を示す。図 2 bでは、例示として基質誘導体 4の場合を示す。

図 2 cは、 1， 4一 G a 1 Tの酵素反応を確認するために使用されるデータを示す。上のパネルでは、基質そのものが使用され、反応生成物が生成していることが示される。下のパネルでは、本発明の阻害因子の例が示され、反応生成物が生成していないことが分かる。実験条件： UDP— Ga 1 (またはアナログ）： 200 μΜ、 G 1 c NA c一 Da n (8) 50 μΜ, β 1， 4一 Ga l T (ヒト） 200 U、緩衝液 (He p e s 100 mM、 pH6. 5、 10 mM MnC 1₂, 0. 25mg/mL B S A, 37°C、 1時間インキュベーション。

図 2 dは、 j31， 3— G a 1 Tの酵素反応を確認するために使用されるデータを示す。上のパネルでは、基質そのものが使用され、反応生成物が生成していることが示される。下のパネルでは、本発明の阻害因子の例が示され、反応生成物が生成していないことが分かる。実験条件： UDP— Ga 1 (またはアナログ）： 200 / M、 L a cNAc— Da n (9) 100 μΜ、 a 1 , 3— Ga l T (ゥシ） 200 / U、緩衝液 (H e p e s 100 mM、 pH6. 5、 10 mM M n C 1_2J 0. 25mg mL B S A, 37°C, 1時間インキュベーション。図 2 eは、結晶構造より提唱される 1， 4-Ga 1 Tの反応機構の例示を示す。この例示は、 B i o c h em. B i o p h y s . Re s. Co mm. ， 20 02， 291， 11 13— 1 1 18を改変したものである。

図 2 f は、 j31， 4一 G a 1 Tの結晶構造（UDPとの複合体）を示す（コンフオメ一シヨン 1) 。

図 2 gは、 j31， 4-Ga 1 Tの結晶構造（基質誘導体 5との複合体）を示す (コンフオメーション 1)。

図 2 h— 1およぴ図 2 h— 2は、合成した基質誘導体のヒト J31， 4-G a 1 Tに対する阻害作用を示す。

図 2 iは、基質誘導体 4の阻害活性を示すグラフである。アツセィ条件は、ドナー（黒四角）は 40 μΜ、ドナー（黒三角）は 100//Mであり、ァクセプタ一は 50μΜ、サンプル物質（インヒビター）は 0〜160 Μのうち数点をとり、酵素は 400 /zUであり、インキュベーション時間は 10分、温度は 37°C であった。

図 2 jは、 1， 4-Ga I Tの結晶構造（基質誘導体 4との複合体）を示す (コンフオメーション 1) 。

図 2 kは、 1, 4一 Ga l Tの結晶構造（基質誘導体 4との複合体）のより詳細な図を示す（コンフオメーシヨン 1) 。

図 2 1は、 β 1， 4—Ga 1 Τの活性部位における UDP— Ga 1との相互作用を示す模式図である。このデータは、 J. Mo 1. B i o l . 318， 491 -502 (2002) の情報を元に作成した。

図 3 aは、合成スキーム 1を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（i) AcONaZAc₂0、 1 10°C、 48%； (i i) BF₃ · E t ₂ 0、 P h SH/CH₂C 1₂, 室温、 91% ; (i i i) (a) N a OMe/Me OH、室温；（b) T r C 1、 DMAPZピリジン、 50°C、 90°C； ( i v) CSA/ジメトキシープロパン、室温、 84%。

図 3 bは、合成スキーム 2を示す。使用した条件および収率は以下のとおりである：（i) 2—プロモメチルナフタレン、 B aO、 B a (OH) ₂ · 8Η₂θ/ DMF、室温、 94% ; ( i i ) (a) 90%AcOH、 60°C (b) A c ₂0 /ピリジン、室温、 95% ; ( i i i ) NB SZアセトン— H₂0、室温、 76%； ( i v) (a) N， N—ジァリルージイソプロピルホスホルアミダイト、 1H— テトラゾール ZCH₃CN、 - 40°C (b) t B uOOH/THF, 一 10°C、 44% (純粋な aホスフェート）。

図 3 cは、合成スキーム 3を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（ i ) テトラキストリフエ二ルホズフィン) パラジウム、 E t ₂NH/T HF、室温、 83% ; ( i i ) E t ₂NH/Me OH, 室温、 81% ; (i i i) (a) D o w e x 50W-X 8 (H+) (b) モルホリン、 DCC/DMF、流ヽ 73 %o

図 3 dは、合成スキーム 4を示す。使用した条件および収率は以下のとおりである：（i) (a) 20、 1 H—テトラゾール /ピリジン、室温（ b ) D o w e x 50W-X 8 (N a+) 、 64%。図 3 eは、合成スキーム 5を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（ i) 2—ブロモメチルナフタレン、 NaHZDMF、 0°C〜室温、 95% ;

(i i) To s— C 1/ピリジン、室温、 85% ; (i i i) (a) 22、 N a H/DMF、 0°C〜室温、（b) 90%AcOH、 60°C、 96%； ( i v) A c₂0/ピリジン、室温、 94%; (v) NB SZアセトン一 H₂0、室温、 70%。

図 3 f は、合成スキーム 6を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（i) (a) N， N—ジァリルージイソプロピルホスホルアミダイト、 1 H—テトラゾール /THF、一 40°C； (b) t B uOOH、 E t ₃N/THF、一 10°C、 38% (純粋な _αホスフェート）；（i i) テトラキス（トリフエ二ルホスフィン）パラジウム、 E t ₂NHZTHF、室温、 95% ; ( i i i ) E t ₂NH/MeOH、 95%； ( i v) (a) 20、 1H—テトラゾール Zピリジン、室温（b) Do we X 50W-X8 (N a ⁺) 、 49%。

図 4 aは、合成スキーム 7を示す。使用した条件および収率は以下のとおりである：（ i) SOC 1₂、ピリジン/ DMF、室温、 85%； (i i) p—メトキシベンジルクロリド、 NaHZDMF、 0°C〜室温、 95% ; ( i i i ) IN HC 1/MeOH— CH₂C 1₂、室温、 92%； ( i v) 29、 N a H/DM F、 0°C〜室温、 82% ; (v) (a) PhSH、 S n C 1₂/CH₂C 1₂, - 78°C (b) Ac₂OZピリジン、室温、 61%。

図 4 bは、合成スキーム 8を示す。使用した条件および収率は以下のとおりである：（ i) NB S/アセトン一 H₂0、室温、 77%； (i i) N， N—ジァリルージイソプロピルホスホルアミダイト、 1 H—テトラゾール /THF、一 4 0°C、 49% ; (i i i) t B uOOHZTHF、一 10°C、 98%； ( i v) テトラキス（トリフエ二ホスフィン）ノラジウム、 E t ₂NHZTHF、室温、 91 %。

図 4 cは、合成スキーム 9を示す。使用した条件および収率は以下のとおりである：（i) E t ₂NH/Me OH, 室温、 88% ; (i i) (a) 20、 1H ーテトラゾール Zピリジン、室温、（b) Dowe x 50W—X8 (Na+) 、 41 %。

図 5 aは、合成スキーム 10を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（i) (a) ガラクトースォキシダーゼ、カタラーゼ /5 OmMリン酸ナトリウム緩衝液、 0. 5mM CuS0₄、 pH6. 0、室温；（b) ナフチルメチルァミン T FA塩、室温；（c) NaBH₃CN、一 20°C、 31%。図 5 bは、合成スキーム 11を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（i) Bo c—ON， E t ₃NZH₂0—ジォキサン、室温、 92%; ( i i ) ナフチルメチルブ口ミド、 NaH、 TBAF/THF、 0°C、 63%。

図 5 cは、合成スキーム 12を示す。使用した条件および収率は以下のとおりである：（i) 50%TFA/ H₂C 1₂、室温、 q. y. (i i) (a) ガラクトースォキシダーゼ、カタラーゼ / 5 OmMリン酸ナトリウム緩衝液、 0. 5 mM CuSO₄、 pH6. 0、室温；（b) 42、室温；（c) N a BH₃CN, 一 20°C、 5%。

図 5 dは、合成スキーム 13を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（ i ) K₂C r ₂0₇、 H₂S0₄Zアセトン、室温、 92%； (i i) T

FA- p f p、ピリジン/ DMF、室温、 91% ; ( i i i ) B o c NHNH₂

/DMF、室温、 76%。

図 5 eは、合成スキーム 14を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（i) 50%TFA/CH₂C 1₂、室温、 q . y. ； (i i) (a) ガラクトースォキシダーゼ、カタラーゼ、 5 ΟπιΜリン酸ナトリウム緩衝液、 0.

5mM CuS0₄、 pH6. 0、室温；（b) 46/H₂0, 室温；（c) Na

BH3CN/H20, 室温、 37%。

図 6 aは、合成スキーム 15を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（ i ) Ac ₂OZピリジン、室温、 89%； ( i i ) ； ( i i) TMS

OT f 、 E t ₃N/ジクロロエタン、 60°C ; (b) Z—ァミノプロパノール、 CSAZジクロロェタン、 60°C、 79%。

図 6 bは、合成スキーム 16を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（i) (a) Na OMeZMe OH、室温；（b) 10%P d-C/M e OH, H₂，室温；（c) D a n-C K E t ₃N/Me OH. 0°C、 71%。

図 7は、合成スキーム 17を示す。使用した条件おょぴ収率は以下のとおりである：（i) β 1， 4—ガラクトース転移酵素、 UDP—ガラクトース、 50m M He p e s緩衝液 (pH6. 5) 、 10 mM Mn C 1₂、 91%。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。

(発明の要旨）

糖鎖が生体内において、細胞一細胞間、細胞一細胞外マトリックス、タンパク質間の、認識、接着に深く関与していることが近年知られてきている。生体内の多くのタンパク質には、異なった構造をもった多種類の糖鎖が含まれており、それら糖鎖はタンパク質間の情報伝達を担う情報分子であると同時に、タンパク質の正しいフォールデイング、構造維持を担う構造形成分子でもある。生体內においてそれら糖鎖を実際に合成しているのが糖転移酵素であり、現在知られているところでは、リボソームで合成されたタンパク質前駆体は小胞体、ゴ^/ジ体を通過する際に耱転移酵素によって複雑な糖鎖修飾、正しいフォールディングのサボートを受け、最終的な働きの場に運ばれる。多くの糖転移酵素は糖ヌクレオチドを糖ドナーとして、様々な糖ァクセプターに糖を一つ一つ転移する。現在までに数十種類の耱転移酵素が発見されており、生体内での多様な糠鎖合成過程の解明のために必要不可欠な情報として、酵素活性測定が行われる。一般に行われている糖転移酵素の酵素活性測定法は、酵素反応生成物に特異的に接着する抗体やレクチンに蛍光プローブを組み込み光学的に検出する、あるいはラジオァイソトープ標識した基質を酵素反応に用いて放射線量を検出する等の手法で、基質反応量から活性を算出している。これらの手法は感度の良さ、ネイティブの基質で酵素反応が行えるなどの利点がある反面、高度な知識の必要性、検出用サンプルの入手困難さ、専門の施設の必要性、原理的に酵素の連続的な振る舞いをとらえることができないなどの欠点を持つ。そこで本研究では最近初めて糖転移酵素の活性測定に応用された、蛍光エネルギー移動（以下 F R E T)という原理に基づいた、安全、簡便、高感度、違続的な酵素の挙動を観察できる酵素活性測定法を用いてガラクトース転移酵素の活性測定を行い、 F R E T法による糖転移酵素活性測定の汎用性を広げることを当初の目的とした。

F R E Tとは近距離に存在する 2つの蛍光物質間で、一方の蛍光物質からの発光波長ともう一方の蛍光物質の励起波長が重なる時、励起光によつて励起された蛍光物質の励起エネルギーが直接的にもう一方の蛍光物質に転移される現象である。 F R E Tを観測するためには蛍光基同士が極めて近傍に存在する必要があり、 F R E Tは 2物質間距離のセンサ一の役割を担うことができるため、糠転移酵素の反応によつて蛍光標識した酵素基質が結合し、それに伴い発生する F R E T現象を観察することで連続的な酵素活性測定が可能になる。

540nm

F R E T法を用いるためには、糖転移酵素の基質をそれぞれ蛍光プローブで標識する必要がある。本発明では、ガラクトース転移酵素の基質である UD P—ガラクトース、 N—ァセチルダルコサミンを蛍光標識した誘導体を、有機化学、酵素科学的手法を用いて数種類合成し、 F R E T法によるガラクトース転移酵素の活性測定を試みた。ところが合成した酵素基質全てがガラクトース転移酵素によって基質として認識されなかった。そこで、最近報告された 1， 4 - G a I Tの結晶構造をもとに、合成した基質誘導体と酵素の結合をシミュレーシヨンすると、大変興味深いことに、合成した基質誘導体はこの酵素の酵素反応途中におけるコンフオメーション変化を阻害している可能性が高いことが示唆された。合成した基質誘導体の阻害活性定数を測定した結果、現在までに考案された 1， 4 - G a I T阻害剤と比べ非常に強力な阻害作用を示した。本研究で合成した基質誘導体は、これまでの糖転移酵素酵素阻害剤の作用機構とは根本的に発想の違う新たな阻害作用を持つと考えられる。

結晶構造を利用したコンピュータシミュレーション、合成した基質誘導体の阻害定数、過去に報告された基質類似物に関するデータを参照して、 0 1， 4一 G a I Tの構造とメカニズム、基質類似物寛容性について詳細に検討することによつて本発明を完成した。

(用 Rn)

以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および/またはその誘導体）が 1つ以上連なってできた化合物をいう。この単位糖の水酸基おょぴァミノ基は、適切な保護基で保護されていてもよい。この保護基としては、ァセチル、ベンジル、ベンゾィル、 tーブトキシカルボニル、 tーブチルジメチルシリル基などが挙げられる。単位糖が 2つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、 N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノダリカン、糖脂質などの複合生体分子から分角军または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、

「炭水化物」および「糖」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。単位糖同士の結合は、その位置によって、 " 1， 2—、 a 1, 3—、 a 1, 4一、 a 1, 6—、 β 1， 2—などがあり、それらの表示は結合する単位糖における炭素の位置を併記すること、および通常その結合に関するァノマー、 β) を記载する。糖鎖の結合に関する情報は複雑であり、ポリペプチド、ポリヌクレオチドのように簡素化することが困難であるが、例えば、 T r e n d s i n r l y c o s c i e n c e a n d G l y c o t e c hn o l o g y 1 4， 1 2 7- 1 3 7 (200 2) では、リニアコードで糖鎖を表すことを提唱しており、必要に応じて、本明細書においてもそのような表示法を利用する。

本明細書において「単糠」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、一般式 C_nH_2nO_nで表される化合物をいう。ここで、 n = 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 1 0であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、へキソース、ヘプトース、オタトース、ノノースおょぴデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。

本明細書において「単糖の誘導体」とは、単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質が単糖の範囲内にないものをいう。そのような単糖の誘導体としては、カルボキシル基を有する糖（例えば、 C一 1位が酸ィ匕されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、 D—グルコースが酸化された D— ダルコン酸）、末端の C原子がカルボン酸となったゥロン酸（D—グルコースが酸化された D—グルクロン酸）、アミノ基またはァミノ基の誘導体（例えば、ァセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、 N—ァセチルー D—ダルコサミン、 N—ァセチルー D—ガラクトサミンなど）、アミノ基および力ルポキシル基を両方とも有する糖（例えば、 N—ァセチルノイラミン酸（シアル酸）、 N—ァセチルムラミン酸など）、デォキシ化された糖（例えば、 2—デォキシ一 D—リポース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖、 UD P誘導体一 G a 1誘導体などがあるがそれらに限定されない。あるいは、へミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してァセタール構造のダリコシドもまた、単糖の誘導体の範囲内にある。

本明細書中において「UD P」とは、ゥリジン一 5 '—二リン酸の略号である。本明細書において「UD P誘導体」とは、 UD P上の一つ以上の水素原子が別の置換基に置換され、結果生じる物質が UD Pの範囲内にないものをいう。そのような置換基としては、下記の（有機化学）の項で列挙される置換基または単糖もしくは単糖の誘導体などが挙げられる。代表的な UD P誘導体として、 UD P— G 1 c (ゥリジン一 5，一二リン酸グルコース）、 UD P— G a 1 (ゥリジン一 5，一二リン酸ガラクトース）、 UD P— G 1 c NA c (ゥリジン一 5，一二リン酸 N—ァセチルダルコサミン）、 UD P— G a l NA c (ゥリジンー5，一二リン酸 N—ァセチルガラクトサミン）などが挙げられる。

本明細書中において「G a 1」とは、ガラクトースの略号である。本明細書中において「G a 1誘導体」または「ガラタトース誘導体」とは、 G a 1上の一つ以上の水素原子が別の置換基に置換され、結果生じる物質が G a 1の範囲内にないものをいう。そのような置換基としては、下記の（有機化学）の項で列挙される置換基または U D Pもしくは U D P誘導体などが挙げられる。

本明細書において「糖鎖含有物質」とは、糖鎖および糖鎖以外の物質を含む物質をいう。このような糖鎖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中に含有される多糖類の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオダリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において、ある物質（例えば、酵素）またはある部分（例えば、ある 1092

酵素上の基質と相互作用する部分あるいはある酵素上の特定のアミノ酸 (例えば、トリブトファン））と「特異的に相互作用し得る」とは、その物質またはその部分に対して、その物質またはその部分以外に対する特異性よりも高い特異性をもつて相互作用することができる能力をいう。好ましくは、その物質またはその部分以外の物質または部分は、類似の物質またはあるいはある酵素の意図される部分以外の部分を含み得る。そのような能力は、その物質またはその部分以外の物質または部分との非特異的相互作甩を解離させる条件下に曝されるとき、少なくとも一定量のその物質またはその部分との特異的相互作用が残存することを判定することによって確認することができる。具体的には、例えば、そのような能力は、ある酵素上の特定の部分に対する特異的な相互作用をいう場合は、その特定の部分に対する相互作用が他の部分よりも測定可能な程度に有意に多いことによつて確認することができる。そのような相互作用は、物理学的な測定手法（例えば、 NMRなど）によって判定することができる。

本明細書において「相互作用」とは、 2つの物体について言及するとき、その 2つの物体が相互に力を及ぼしあうことをいう。そのような相互作用としては、例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非ィオン性相互作用、疎水性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定きれない。好ましくは、相互作用は、水素結合、疎水性相互作用などである。本明細書において「共有結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電子対が 2つの原子に共有されて形成する化学結合をいう。本明細書において「水素結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電気的陰性度の高い原子に一つしかない水素原子の核外電子が引き寄せられて水素原子核が露出し、これが別の電気的陰性度の高い原子を引き寄せて生じる結合をいい、例えば、水素原子と電気的陰性度の高い（フッ素、酸素、窒素などの）原子との間にできる。本明細書において相互作用などの「レベル」とは、その相互作用など強さを示す程度をいい、「強度」ともいい、ある物質（または部分）の別の物質（または部分）に対する相互作用の強さを判断するために使用され得る。そのような相互作用のレベルは、例えば、 FRETにおいて蛍光の強さなどの測定値、レクチンなどの相互作用に関して用いられる S PR (表面プラズモン共鳴）法による屈折率観測、酵素の酵素活性測定（放射性標識、 EL I S Aなどによる生化学的測定）を用いることができる。 FRET、 SPR法、酵素活性測定は、当該分野において周知であり、本明細書にぉレ、て他の場所に詳細に説明されている。

本明細書において「ガラクトース転移酵素上の UDP— G a 1結合部位」とは、ガラクトース転移酵素において、その第一基質である UDP— Ga 1が相互作用する部位をいい、例えば、図 2 f などのように結晶構造を解析することによって、その場所を特定することができる。

本明細書において「ガラタトース転移酵素上の UDP— G a 1結合部位と相互作用し得る部分」とは、上述のガラクトース転移酵素上の UDP— G a 1結合部位と、相互作用する部分（mo i e t y) をいい、通常 UDP— G a 1またはその誘導体（例えば、単糖、単糖に類似する糖、または置換基を付加した単糖など）などが含まれるがそれらに限定されない。そのような UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分としては、好ましくは、少なくとも UDP— Ga 1または U D P誘導体一 G a 1誘導体などが挙げられる。

本明細書において「トリブトファンと相互作用し得る部分」とは、トリプトフ了ン単独またはあるポリぺプチド上のトリプトファンと相互作用することができる部分をいい、通常、トリブトファンの芳香族官能基と相互作用することができる部分またはそれを含む物質が挙げられるがそれらに限定されない。このようなトリブトファンと相互作用し得る部分は、通常、芳香族官能基（すなわち'、ヒュッケル則に合致する 2 π、 6 π、 10 πなどの電子系を有する基）であることが多く、例えば、ナフタレン、フエニル、アントラセン、シクロプロべ二ルカチォン、トリプトファン、フエ二ルァラニン、チロシンなどの芳香族アミノ酸、ダンシル基、 EDANS基、 F I TC基などの一般に用いられる芳香族化合物などの部分が挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において部分（m o i e t y ) 間の「距離」は、部分双方の最短部分の距離をいう。そのような距離は、物理学的な測定方法によって原子間または分子間の距離を測定することによって確定することができる。

本明細書において「フアルマコフォアモデル」とは、ある立体配位について、目的とする相互作用などが形成されるために用いられるモデルをいう。このようなモデルは、ある作用を有する化合物を設計するために用いられる。そのような化合物の設計には、例えば、 ADAM&E V E (医薬分子設計研究所、東京）などを利用することができる。

本明細書において「糖転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患」とは、糖転移酵素の活性が通常のレベルより高いまたは低いことによって生じるかまたはそのようなレベルが伴う生体の状態、障害または疾患をいう。そのような状態、障害または疾患には、例えば、慢性関節リウマチ、免疫性疾患、エリテマト一デス、がんまたはがんの転移、細菌感染、糖尿病、代謝性疾患、ホルモン機能、ストレス、骨粗鬆症などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「]3 1， 4—ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患」とは、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素の活性が通常のレベルより高いまたは低レ、ことによって生じるかまたはそのようなレベルが伴う生体の状態、障害または疾患をいう。そのような状態、障害または疾患には、例えば、慢 1生関節リウマチ、免疫性疾患、エリテマトーデス、がんまたはがんの転移、細菌感染、糖尿病、代謝性疾患、ホルモン機能、ストレス、骨粗鬆症などが挙げられるがそれらに限定されない。

(蛍光エネルギー移動（F R E T) 法）

(m )

F R E Tは、 2つの蛍光物質間で、一方からの蛍光発光波長がもう一方の蛍光物質の吸収波長に重なった時に生じる、直接的な励起エネルギーの移動のことを示す。その現象の発見は、古くはペリンによってなされ、さらにフェルスターによってその原理が示された（F o r s t e r， Th. (1948) ， Ann. P h y s . 2 : 55_75. ) 。

蛍光物質はある波長の光を吸収し、吸収した光エネルギーによって励起する。蛍光物質は励起状態から基底状態に戻るときに蛍光を発する。励起した蛍光物質は振動励起双極子として考えることができ、その双極子からの距離 Rに依存する電場が現れる（C 1 e g g， R. M. (1996) , X. F. Wa n g a n d B. He rma n (e d s. ) , J ohn Wi l e y & S o n s, N e w Yo r k, . 179— 252. ) 。双極子の極めて近傍（R < <励起光波長）の電場においては電場の強度は 1ZR ³によって支配されており、この双極子近接電場の中に双極子相互作用によってその励起エネルギーを吸収する物質 (蛍光ァクセプター）が存在すると、蛍光発光を行うことなく励起エネルギーが直接蛍光ァクセプターに移動する。この現象を FRETと呼び、蛍光ァクセプタ一が蛍光ドナーの電場エネルギーを吸収する確立が、蛍光ドナーの電場強度の 2 乗に比例するため、 FRETが起こる確立は距離の 6乗に反比例する（C l e g g、前出、 S e l v i n， P. R. (1995) , Me t h o d s En z ym o 1. 246， 300— 334. ) 。

FRETが起こるためには 2つの蛍光物質のうち、蛍光ドナーからの発光スぺクトルと、蛍光ァクセプターの吸収スぺクトルが重なる必要がある。スぺクトルの重なりさえ存在していれば、同種の蛍光物質でも起こりえる上、蛍光ァクセプターは蛍光物質である必要もない。フェルスターによると、 FRETは通常の蛍光物質の発光、消光過程と競合して起こり、そのエネルギー移動率 k _tは次式 ( 1 ) によって支配される。ニ丄 ( )⁶ - (1 )

て D R

ここで、て _Dは蛍光ドナーの蛍光寿命、 R。はフェルスター距離である。この式によると、エネルギー移動率 k _tは 2つの蛍光物質間の距離 Rと R。値との比によ 1092

つて大きく変動することがわかる。蛍光物質の選択は FRETを観測する際に極めて重要であり、その選択の指標として R。値という値が蛍光基の種々の組み合わせについて求められている（Wu， P. , a nd B r a n d, L. (199 4) , An a l . B i o c h e m. 218， 1一 13. ) 。 R。値は次式（2) に示す FRET効率 E (蛍光ドナーが吸収したエネギ一のうち、蛍光ァクセプターに移動した量の指標として定義される。 0〜1の値を取る。 )にあるように、蛍光ドナーの吸収したエネルギーの 50%が蛍光ァクセプターに伝わる蛍光物質間距離として定義され、 2つの蛍光物質の性質により次式（3， 4) に従って求められる。

R\ - 8.79 ^ ~⁵[κ²^σ_η Α)] ι n A⁶) ― (3)

JW)- 一 (4)

ここで、分子配向係数 κ²、溶媒の屈折率 n、蛍光ドナーの量子収率 Q_D、スぺタトルの重なり積分 J (λ) 、蛍光ドナーの蛍光強度 F_D、蛍光ァクセプターのモル吸光係数 ε _Aである。 FRET効率 Eは簡単な測定実験から次式（5) によつて、相対強度（Re l a t i v e I n t e n s i t y) あるいは蛍光寿命の測定により直接求めることができる。

ここで、て _DAは FRET時の蛍光ドナーの蛍光寿命、 F_DAは同じく FRET時の蛍光ドナーの蛍光強度である。 R₀値がすでに既知の系において（2)式と（5) 式を用いることで、蛍光基間の距離 Rを測定することが可能である。一般的な蛍光物質間の R。値が数 n m程度であることから、 F R E T効率の測定は分子定規としての性格をもち、ミクロな物質間の距離を測定する手法の一つとして用いられてきた（S t r y l e r, L. (1978) ， Annu. Re v, B i o c h em. 47， 819— 846) 。

(酵素活性測定への応用）

FRETは R。値を越える距離においては急激に観測されなくなる性質をもつため（距離の 6乗に反比例することによる）、分子が結合、あるいは相互作用することを観測するセンサーとしての役割を担うことができる。

例えば加水分解酵素の活性測定に関しては、その酵素基質について分解部位を挟んだ所で 2つの蛍光物質で標識し、酵素反応を行う。加水分解が起こる前では蛍光物質間の距離が近く FRETが起こっているため、蛍光ド^ "一からの発光は弱く蛍光ァクセプタ一からの発光が強く観測される。加水分解反応が進むことによって蛍光物質間の距離が広がり、 FRETは観測されなくなる。すると蛍光ドナ一からの発光が回復し、蛍光ァクセプターからの発光は弱められる。この酵素反応を分光器のセル内で行うことで、連続的に酵素反応を観察することが可能になる（図 1 b) 。

2基質系の反応においては上記の 1基質系の逆になり、 2つの酵素基質についてそれぞれ蛍光標識を行い、酵素反応を行わせる。 2つの基質が反応し結合することによって蛍光物質間の距離が縮まり、 FRETが観測されるようになる（図 1 c) ₀

次に FRETを用いた糖転移酵素の活性量、および合成した基質に対する速度定数測定法について簡単に説明する。

1. まず蛍光標識した糖ドナーおよび糖ァクセプターを調製する。蛍光物質ぺァの選択については、より大きなスペクトルの重なりを持ち、励起、観測波長の分離が良く、酵素反応によつて生成物となったときの蛍光基質間距離の推定から適切な R₀値を持ち、また酵素反応を妨げない、といったことを考慮すべきである。

2. 酵素反応の経過を蛍光ドナー発光の減少、あるいは蛍光ァクセプター発光の増加から観察する。分光器から得られる情報はあくまで相対強度に過ぎないが、既知活性の酵素を基準に検量線を作成することでこの情報だけでも活性量測定は可能である。酵素速度定数（V_max値）の決定をするためには相対強度を絶対反応量へ変換する必要がある（K_ra値のみ決定する場合は必ずしも必要ではなレ、）。そのため酵素反応初期の生成物のない状態と、酵素反応が完全に終了した状態の間で検量線を作成し、絶対反応量を算出する。

3. 実際に酵素反応を行なう。蛍光測定であるので非常に感度がよいため、かなり希薄な基質濃度で反応を行なうことになる。これは必要な基質量が少なくて済む利点と同時に、特に 2基質系の酵素活性測定においては一方の基質の濃度を高濃度にできない欠点を合わせ持つ。そのためまず一方の基質濃度を固定し、見かけの K_m ^app、 V_max ^app値をまず求め、次に固定していた基質濃度を段階的に変化させ、それぞれの濃度について K_m ^app、 V_max ^appを求める。算出したいくつかの V_max ^appについて、固定した基質濃度に対して 2次プロットを行い、真の K_m、 V_max値を算出する。

(分子生物学）

本明細書において使用される用語「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものも包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのよう 1092

な改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、ァセチル化、リン酸ィ匕または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の 1または 2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物 (例えば、ぺプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。従って、本発明のスクリーニング方法が目的とする酵素がポリペプチドである場合、このような改変体を使用してもよい。

本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体ォリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、 2，一 O—メチルーリポヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換された誘導体オリゴヌタレォチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3， -P 5' ホスホロアミデート結合に変換された誘導体ォリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがぺプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5プロピニルゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5チアゾールゥラシルで置換された誘導体ォリゴヌクレオチド、ォリゴヌクレオチド中のシトシンが C一 5プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン (p h e n o x a z i n e— m o d i f i e d c y t o s i n e) で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、 DNA中のリボースが 2，一0—プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが 2，ーメトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重 ' コドン置換体は、 1またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの 3番目の位置が混合塩基および/またはデォキシィノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（B a t z e rら、 Nu c l e i c Ac i d Re s. 1 9 : 5081 (1991) ; Oh t s uk aら、 J. B i o l . C em. 260 ： 2605-2608 (1985) ； R o s s o 1 i n i ら、 Mo 1. Ce l l . P r o b e s 8 : 91— 98 (1 994) ) 。

用語「核酸分子」はまた、本明細書において、核酸、オリゴヌクレオチド、おょぴポリヌクレオチドと互換可能に使用され、 cDNA、 mRNA、ゲノム DN Aなどを含む。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体 (改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子の:^ レタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、ェキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリべプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。従って、本発明の方法では、このようなスプライス変異体を利用してもよい。

本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに/または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ぺプチド」をさすことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」とは、遣伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに/または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさす。本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、ァミノ酸配列など）の「相同性」とは、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある 2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。 2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によつて調べられ得る。 2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間で D NA配列が、代表的には少なくとも 5 0 %同一である場合、好ましくは少なくとも 7 0 %同一である場合、より好ましくは少なくとも 8 0 %、 9 0 %、 9 5 %、 9 6 %、 9 7 %、 9 8 %または 9 9 %同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同 ―) とみなした場合の、 2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。

本明細書では塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ッールである B L A S Tを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。

本明細書において「外来遺伝子」とは、ある生物において、その生物には天然には存在しない遺伝子をいう。そのような外来遺伝子は、その生物に天然に存在する遺伝子を改変したものであってもよく、天然において他の生物に存在する遣伝子であってもよく、人工的に合成した遺伝子であってもよい。そのような外来遺伝子を含む生物は、天然では発現しなレ、遺伝子産物を発現し得る。

人工的に合成した遺伝子を作製するための D N A合成技術およぴ核酸化学については、例えば、 Ga i t, M. J. (1985) . 01 i g o nu c l e o t i d e S yn t h e s i s : A P r a c t i c a l Ap p r o a c h, 丄 RLP r e s s ； Ga i t, M. J. (1990) . O 1 i g o nu c l e o t i d e Syn t h e s i s : A P r a c t i c a l Ap p r o a c h, I RL P r e s s ; E c k s t e i n, F. (1991) . O l i g o n c l e o t i d e s a n d An a l o g u e s ： A P r a c t i c a l A p p r o a c, I RL P r e s s iAd ams, R. L. e t a 1. (1992) . Th e B i o c h em i s t r y o f t h e Nu c l e i c Ac i d s , Ch a ma n &H a l 1 ； Sh a b a r o v a, Z. e t a 1. 、19 94) . Ad v a n c e d O r g a n i c Ch em i s t r y o f N u c l e i c Ac i d s, We i nh e im ; B l a c k b u r n, G. M. e t a 1. (1996) . Nu c l e i c Ac i d s i n Ch emi s t r y a n d B i o l o g y, Ox f o r d Un i v e r s i t y P r e s s ； He rma n s o n, G. T. (I 996) . B i o c o n j u g a t e Te c hn i qu e s, Ac a d em i c P r e s sなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸の L—異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、ァラニン、パリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチォ二ン、トレオニン、フエニノレアラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、ァスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、 γ—力ルポキシグルタミン酸、アルギニン、オル二チン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸は L体であるが、 D 体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然ァミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ一ニトロフエ二ルァラニン、ホモフエ二ノレァラニン、パラ一フルオロフェニノレアラニン、 3—アミノー 2—ペンジノレプロピオン酸、ホモアルギニンの D体または L体おょぴ D—フエ二ルァラニンが挙げられる。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および/または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、ェチォニン、カナバニン、 2—メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。

アミノ酸は、その一般に公知の 3文字記号か、または I UP AC— I UB B i o c em i c a 1 Nome n c l a t u r e Co mm i s s i o nにより推奨される 1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレォチドも同様に、一般に受け入れられた 1文字コードにより言及され得る。

本明細書において、「対応する」ヌクレオチドまたはアミノ酸とは、あるポリヌクレオチド分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける所定のヌクレオチドまたはアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるヌクレオチドまたはアミノ酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。あるいは、酵素分子のコンフオメ一シヨン変化に寄与する場合、そのような変化に寄与するアミノ酸をいう。

本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、酵素）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有する力、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。従って、ヒト 3 1， 4— ガラクトース転移酵素に対応する遺伝子は、他の種の同様の活性を担う酵素（またはその遺伝子）であり得る。

本明細書において「ヌクレオチド」は、アミノ酸をコードすることができる限り、天然のものでも非天然のものでもよい。

本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さが n ) に対して、 l〜n _ 1までの配列長さを有するポリぺプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 5， 2 0、 2 5、 3 0、 4 0、 5 0 およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、 1 1など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、 5、 6、 7、 8、 9、 1 0、 1 5， 2 0、 2 5、 3 0、 4 0、 5 0、 7 5、 1 0 0およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ (例えば、 1 1など) もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができる力上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下 1 0 %) のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。し力し、本明細書では、「約」のあるなしはその.数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質） I 生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。

本明細書において、ポリペプチドを生産する方法としては、例えば、そのポリぺプチドを産生する初代培養細胞または株化細胞を培養し、培養上清などから単離または精製することによりそのポリペプチドを得る方法が挙げられる。あるいは、遺伝子操作手法を利用して、そのポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを用いて発現宿主を形質転換し、この形質転換細胞の培養上清から組換えポリぺプチドを得ることができる。上記宿主細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来力ら遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など）を用いることが可能である。このようにして得られた細胞に由来するポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の 1以上のアミノ酸が置換、付加および Zまたは欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および/または欠失していてもよい。

あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはその D NAコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたぺプチドまたはこのペプチドをコードする対応する D NAにおいて行われ得る。

上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性ァミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ky t e. Jおよび Do o 1 i t t i e, R. F. J . Mo 1. B i o l . 157 (1) : 105— 132， 19 82) 。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、 DNA、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（+ 4. 5) ；バリン（+4. 2) ；ロイシン（+3. 8) ；フエ-ルァラニン（+ 2. 8) ；システィン Zシスチン（+2. 5) ；メチォニン（+ 1. 9) ；ァラユン（+ 1. 8) ；グリシン（一0. 4) ；スレオニン（一 0. 7) ；セリン（一

0 . 8) ；トリブトファン（一 0. 9) ；チロシン（一 1. 3) ；プロリン（一

1 . 6) ；ヒスチジン（一 3. 2) ；グルタミン酸（一 3. 5) ；グルタミン（一

3 . 5) ；ァスパラギン酸（一 3. 5) ；ァスパラギン（一 3. 5) ；リジン（一

3 . 9) ；およびアルギニン（一 4. 5) ) である。

あるァミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が ±2以内であることが好ましく、 ±1以内であることがより好ましく、および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第 4、 554、 101号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（+3. 0) ；リジン（+3. 0) ；ァスパラギン酸（+3. 0±1) ；グルタミン酸（+3. 0±1) ；セリン（+0. 3) ；ァスパラギン（+0. 2) ；グルタミン（+0. 2) ；グリシン（0) ；スレオユン（一 0. 4) ；プロリン（一0. 5土 1) ；ァラニン（一 0. 5) ；ヒスチジン（一 0. 5) ；システィン（一1. 0) ；メチォニン（一 1. 3) ；バリン（一1. 5) ；ロイシン（一1. 8) ；イソロイシン（一 1. 8) ；チロシン（一 2. 3) ；フエ二ルァラニン（一2. 5) ；ぉょぴトリブトファン（一3. 4) 。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が ± 2以内であることが好ましく、 ± 1以内であることがより好ましく、および ±0. 5以内であることがさらにより好ましい。

本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または Zおよび疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例としては、例えば、親水性指数または疎水性指数が、士 2以内のもの同士、好ましくは ± 1以内のもの同士、より好ましくは ±0. 5以内のもの同士のものが挙げられるがそれらに限定されない。従つて、保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およぴァスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよぴァスパラギン；ならびにパリン、ロイシン、およぴィソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（t r un c a t e d) 改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。置換は、上述の保存的置換でもよく、そうでなくてもよい。置換されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸であってもよい。あるいは、置換されるアミノ酸は、アミノ酸アナログでもよい。対立遺伝子（a 1 1 e 1 e) とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。そのような対立遺伝子変異体は、通常その対応する対立遺伝子と同一または非常に類似性の高い酉己列を有し、通常はほぼ同一の生物学的活性を有するが、まれに異なる生物学的活性を有することもある。「種相同体またはホモログ（h omo 1 o g) 」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、 60 %以上の相同性、より好ましくは、 80 %以上、 85 % 以上、 90%以上、 95%以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（o r t h o 1 o g) 」とは、ォノレソロガス遺伝子 (o r t h o l o g o u s g e n e) ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトおよびマウスの αヘモグロビン遺伝子はオルソログである力 ^s，ヒトの αへモグロビン遺伝子およびへモグロビン遺伝子はパラ口グ（遺伝子重複で生じた遣伝子）である。オルソログは、分子系銃樹の推定に有用である。オルソログは、通常別の種においてもとの種と同様の機能を果たしていることがあり得ることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。

本明細書において「酵素」とは、生細胞内で作用するタンパク質などの生体分子によるの生体触媒分子をいう。

本明細書において「基質」とは、酵素などの活性化物質との反応において用いられる場合、ある活性化物質（例えば、酵素）の作用を受けて反応を起す物質をいう。特に酵素反応において、例えば澱粉はアミラーゼの基質であり、過酸化水素はカタラーゼの基質である。酵素反応が可逆的なときは，生成物も逆反応の基質である。また補酵素が酵素の基質の一つであることも多い。転移酵素の場合、ドナー分子およびァクセプター分子の両方が基質である。

本明細書において「転移酵素」とは、基転移反応を触媒する酵素の総称をいう。本明細書において、「転移酵素」は「トランスフェラーゼ」と互換可能に使用され得る。基転移反応は、以下の式（6) ：

Χ-Υ+Ζ-Η Χ-Η+Ζ-Υ (6) に示すように、一つの化合物（供与体）力ら基 Yが他の化合物（受容体）に転移する形で行われる。

本明細書の基転移反応における「ドナー」とは、上記式（6) の化合物 X— Y (供与体）を意味し、「ドナー基質」と互換可能に使用され得る。本明細書の基転移反応における「ァクセプター」とは、上記式（6) の化合物 Z—H (受容体）を意味し、「ァクセプター基質」と互換可能に使用され得る。

本明細書において「糖転移酵素」とは、糖（上記式（6) の基 Yに相当；単位糖または糖鎖）をある場所（上記式（6) の化合物 X— Yに相当）から別の場所 (上記式（6) の化合物 Z_Hに相当）へと転移させるよう触媒する作用を有する酵素をいう。糖転移酵素としては、例えば、ガラクトース転移酵素、ダルコ一ス転移酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素、フコース転移酵素、キシロース転移酵素、 N—ァセチルダルコサミン転移酵素、および N—ァセチルガラクトサミン転移酵素などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような糖転移酵素としては、例えば、糖転移酵素の例としては、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素、 _α— ι， 3—ガラクトース転移酵素， β 1， 4一ガラクトース転移酵素， β 1， 3 _ガラクトース転移酵素， 0 1， 6—ガラクトース転移酵素、 α 2， 6 —シアル酸転移酵素、 α 1， 4_ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、 _α ΐ， 2—フコース転移酵素、 ct l， 3—フコース転移酵素、 1， 4ーフコース転移酵素、 a l， 6—フコース転移酵素、 α ΐ, 3— Ν—ァセチノレガラクトサミン転移酵素、 a l， 6— Ν—ァセチルガラタトサミン転移酵素、 β 1， 4— Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチド Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 3 1， 4一 Νァセチルダルコサミン転移酵素、 13 1， 2— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 3— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1, 6— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 α ΐ, 4—Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1, 4_マンノース転移酵素、 α ΐ, 2—マンノース転移酵素、 a 1 , 3—マンノース転移酵素、 α ΐ, 4—マンノース転移酵素、 a l， 6—マンノース転移酵素、 _α 1， 2—グルコース転移酵素、 α ΐ, 3—グルコース転移酵素、ひ 2， 3—シアル酸転移酵素、 _α 2， 8—シアル酸転移酵素、 α ΐ, 6— ダルコサミン転移酵素、 _α ΐ， 6—キシロース転移酵素、 ]3キシロース転移酵素 (プロテオダリカンコア構造合成酵素）、 β 1, 3—グルクロン酸転移酵素、ヒアル口ン酸合成酵素、他の糖ヌクレオチドを糖ドナーとして用いる糖転移酵素およびドルコールリン酸型糖ドナーを用いる糖転移酵素などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「ガラクトース転移酵素」（本明細書において G a 1 Tとも表記する）は、ガラクトース（以下 Ga 1 ) を UDP— Ga 1から N—ァセチル一ダルコサミンを末端に持つ多様な糖ァクセプターへ、ァノマー位の立体選択制について厳格にひ型あるいは型で転移させる酵素をいう。 α型では α 1, 2-, a 1, 3—、 a 1, 4一、 a 1, 6—結合型が存在し、型では 1， 3—、 ]3 1， 4—結合型が存在する。このほか、ガラクトースセラミド合成に関わる j3 1 一セラミド結合型が存在する。真核生物において、 G a I Tは一部の例外を除きゴルジ体内に口一カラィズして存在し、多様な糖鎖を生み出している。また i3 1， 4-G a I Tは、糖鎖合成の役割のみならず、細胞表層に存在し、授精ゃ胚発生の過程において細胞接着分子としての働きを持つことが知られている（D. A. H i n t o n, B. D. S h u r , (1 9 94) , T r e n d s G l y c o s c i . G l y c o t e c h. ， 6， 3 75— 3 8 5. ；) 。現在までに、哺乳動物においては 1 9の異なった G a 1 Tが発見されており、これらは α ΐ, 3—、 a 1， 4一、 β 1, 3—、 1, 4一結合型のガラクトース酵素である（Ch r i s t e 1 1 e B . , Emm a n u e 1 B . ， D a v i d H. J . ， R O D e r t o A. G. a n d Ann e I . (1 9 9 8) , J. B i o c h em. 1 23， 1 000- 1 009. 、 T. H e n n e t , (2002) ， C e l 1. Mo 1. L i f e S c i . 5 9， 1 08 1— 1 0 9 5· ) 。これらは 1—セラミド型酵素を除き、全てタイプ I I膜貫通型で、短い N末端細胞質側領域と膜貫通領域、幹領域を持ち酵素活性部位を含む大きな C末端活性ドメインをゴルジ内腔に向けている。

その構造、機能についてよく調べられているのはゥシ、ブタ、ヒトなど哺乳類由来のものが多く、中でも基質特異性について特に調べられているのは、 i31， 4—結合型酵素である。この酵素は比較的単離、精製が容易であり、早くに市販されるようになったことから、すでに多くの基質認識能、基質類物阻害作用についての知見が得られている（Ph i l i p p e C. ， O 1 i 1 i e r R. M. ， (2001) ， B i o o r g. Me d. C h e m. 9， 3077— 309 2. ； H i r o n o b u H. ， T s u y o s h i E. a n d Y a s u h i r o K. ， (1997) , J. Or g. Ch e m. 62, 1 914-1915. ；

S h u i c h i T. , S a n g J. C. , Ya s uh i r o I . , Y o s h i t a k a I . , A r m i n S . , Ro b e r t I . L. , J i a n g y u e W. , T a k a s h i H. , Ga r y S. a n d Ch i— Hu e y W. , (1999) ， B i o o r g. Me d. C h e m. 7, 401— 40 9. ； T a k a s h i H. ， B r i o n W. M. , R o W. a n d

Ch i -Hu e y W. , (1997) , B i o o r g. Me d. Ch em. 5, 497-500. ； S a n g J . C. , S h u i c h i T. a n d C h i -Hu e y W. ，（1998) , B i o o r g. Me d. Ch em. L e t. 8， 3359— 3364. ; 01 e H. , K a n w a 1 J . K a u r . , Ge e t a S. , Ma g d a l e n a B. , Su z a nn e C. C. , L o u i s D. H. a n d Mo n i c a M. P. ， (1991) , J . B i o 1. Ch em. 266， 1 7858— 17862. ) 。また、プタの臓器をヒトに移植する際の拒絶反応に関わる aG a 1抗原を合成する α 1， 3-Ga 1 Τ についても多くの知見が得られている。以下に上記 2系列の G a I Tについて簡単にその特徴を述べる。

(1) 1, 4-Ga I T 現在までにもっともよく研究されている G a .1 Tである。この酵素はヒトにおいてそのシークェンス相同性から、 7種類のものが発見されている。一般に巿販されているものは、ゥシ、ヒト由来（ほぼ同一の配列を有する）の β 1， 4-G a 1 Τ 1と呼ばれるもので、 UDP— Ga 1から Ga 1を N—ァセチルーダルコサミン（以下 G 1 cNAc) に転移させる。母乳中のラクト一スの生成にも深く関わり、この場合は αラクトアルブミンと相互作用して、グルコースを糖ァクセプターとして認識する。一部のこの酵素は細胞表層にも存在し、糖鎖合成のみならず、細胞接着分子としての働きを持つことがわかっている。早くから市販され容易に入手可能であるという事情から、多くの研究者が基質特異性について検証しており、糖ドナー（Th oma s B. , Th oma s S. , D a r i u s 一 J e a n N. ， R i c a r d o G. G. ， He n r i k C. a n d L ο t h e r E. ， (2001) , Ch e mB i o C h e m. 2, 884 -89

4 Y a s u h i r o K., T s uy o s h i E. , H i r o y k i o.，

Η i s a s h i K. H i r o n o b u H. ， (1995) , Ca r b o . R e s . 26 9, 273-294. ； Ge e t a S. , O 1 e H. a n d M o n i c a M. P. ，（1993) ， C a r b o . Re s. 245， 1 37-

1 4 4. E l i z a b e t h E. B. ， P e t e t y V. B. a n d P r a d m a n K. Q. , (1995) , G l y c o c o n. J. 12, 865

― 8 78 - ； L awr e n c e J . B . a n d Ro b e r t D. R. ， (1

9 8 2) B i o c h em i s t r y 21， 6340-6343. ； T s u y o s h i E. , Ya s uh i r o K. , H i s a s h i K. a n d H i r o n o b u H. ， (1 996) , B i o o r g. Me d. Ch em. 4, 1

9 3 9一 1 948. ； Wo n g C. H. , Wh i t e s i d e G. M. ， (1

9 9 4) j 「 En z yme s i n s yn t h e t i c o r g a n i c c e m i s t r y」， p p 264_269. ) 、糖ァクセプター（Y o s h i h i r o N . , H i d e a k i T. , Ka z uk i y o K. a n d J o a c h i m T . ， (2001) , Or g . l e t. 3， 1一 3. ； T o r s t e n W. ， Y o s h i h i r o N. , Vo l k e r S . a n d J o a c h i m T • ！ (1 994) , J. Or g. C h e m. 59， 6744 - -6747. ；

Y o s h i h i r o N. ， T o r s t e n W. , Vo l k e r S . a n d

J o a c h i m T. ， (1993) ， J . Am. C h e m. S o c . 1 15，

2 5 36 2 537. ； Y a s u h i r o K. , H i s a s h i K. , T s u y o s l-i i E. , H i r o n o b H. , (1998) , C a r b o . R e s . 3 0 6 , 361-3 78. ； Mo n i c a M. P. ， ( 1 987) , C a r b o - R e s . 159 ， 315-3 24. ； Y a s u h i r o K. , H i r o n o b u H. a n d H i s a s h i K. ，（1992) ， C a r b o .

Re s. 229, C5-C9.； Ya s uh i r o K., H i r o n o b u H.， S e i i c h i r o O. ， (2000) , Ca r b o. Re s. 323, 44 -48. ； Ch i -Hu e y W. , Yo s h i t a k a I . , Th oma s K. , Ch r i s t i n e G. N. , Da v i d P. D. a n d Ga r y C. L. , (1991) , J . Am. C h e m. S o c. 1 13, 8137 — 8145. ) の両方について、ネイティブな基質でなくともある程度まで基質修飾に対する寛容性があることが知られてきている。さらに最近になつて X線結晶構造解析の結果が報告され（Lo u i s N. G. , Ch r 1 s t i a n c. a n d Yv e s B. ， (1999) ， EMBO. J. 1 8 354 6 -35

57. ，； B. Rama k r i s hn a n a n d

P r a dma n K. Q. , (2001) , J . Mo 1 • B i o 1. 3 1 o，

205-218. ) 、この酵素は逐次 (s e qu e n t i a 1 o r d e r) 型の反応機構で基質と結合し（B o o p a t hy R.， E 1 i z a b e t h B. a n d P r a dma n K. Q. ， (2002) , Β i o c h e m. B i o p h y s . Re s. Comm. 291, 1 1 13— 1 1 18 - ) 、糖ドナ一の結合によって、大きな構造変化を起こすことが確認された（B o o P a t h yら、 lu i±j ; Rama k r i s hn a n, P. V. B a l a j j i a n d P r a dm a n K. Q. ， (2002) , J . Mo 1. B i o l . 318， 491一 50 2. ) 。

他の 6種類の β 1， 4-Ga I Tについては未検証な部分が多い。ァミノ酸配列全体の相同性は低いものの、 β 1， 4-Ga 1 T 1において触媒活性に関わる特徴的な配列についてはよく保存されている（Ch r i s t e l l e B. ， E mm a n e 1 B . , D a v i d H. J. , Ro b e r t o A. a n d Ann e I . (1 998) ， J . B i o c h e m. 123, 1000— 1 009. 、 (15) N. L o， J. H. S h a p e r , J. P e v s n e r, N. L. S h a p e r , (1 998) ， G l y c o b i o l o g y， 8， 517— 5 26. ) 。現在までに考えられていることには、糖ドナーである UDP— G a 1 の結合については全ての i31， 4-Ga I Tについてほぼ同様で、糖ァクセプタ一の基質特異性について大きな差があるものと考えられている（糖脂質を好むもの、ポリラタトサミンの合成に絡むもの、ラクトシルセラミドの合成を行うもの、プロテオダリカン糖鎖のコア構造の合成に関わるもの等）。

(2) a 1 , 3 -G a I T

この酵素は、 UDp_Ga 1から Ga 1を α 1， 3 _結合型で Ν—ァセチルラクトサミン（L a cNAc) の非還元末端 G a 1に転移させる。ヒトの血液型抗原の合成酵素と、ブタおよぴゥシなどの G a 1 i 1 i e i t o e と呼ばれる _aGa 1抗原を作るもの、イソグロポ系糖脂質合成を行うものが知られている（T. He nn e t, (2002) , Ce l l . Mo 1. L i f e S c i . 59， 1081— 1095. ) 。 Ga l i l i e p i t o eの合成酵素についてはすでに大腸菌の遺伝子組み換えで生成する手法が確立されており、巿販されている。基質類似物の転移活性についての報告では、糖ドナーについてはおよそ β 1， 4—結合型と類似した特異性を持つと思われる（Ke i k o S. ， T a k e t o U. ， O 1 e H. , N i n a O. L. S . ， Wa r r e n W. W. a n d Mo n i c a M. P. , (2000) , J . Am. C h e m. S

0 c. 1 22， 1 26 1— 1 269. ) 。これら a 1， 3—結合型酵素はその立体選択性が 3 1， 4一結合型と異なるが、酵素反応に重要な特徴的なアミノ酸配列は i3 1— 4結合型酵素とよく類似しており、立体構造は類似していると思われる（Ch r i s t e l l e B.前出）。 X線結晶解析の結果（L o u i s N. G. , Ch r i s t o p h e B. , An u p K. M. , O 1 e H. , J o e l H. S. a n d D a v i d H. J. ，（2001) , EMBO J . 20， 638— 649. ； E s t e r B. , G. J . Swam i n a t h a n, Y i n g n a n Z . ， Rama n a t h a n N. ， Ke i t B . a n d K. R. Ac h a r y a, (2001) , J. B i o l . Ch e m. 276，

48608— 48614. ) からも 31， 4一型酵素と同様、基質の結合によつて大きな構造変化を起こすことが確認されている（E s t e r B. , Y i n g n a n Z. ， G. J . Swami n a t h a n, Y i n g n a n Z. ， K e

1 t h B. a n d K. R. Ac h a r y a. , (2002) ， J. B i o l . Ch em. 277，' 28310— 28318. ) 。

(有機化学） ·

本発明の化合物は、（A) — (S) 一 (B) という模式図で表すことができる。ここで、（A) は、（例えば、酵素（例えば、ガラクトース転移酵素）上の第一の基質（例えば、 UDP— Ga 1) の結合部位と相互作用し得る部分（例えば、ガラクトースのような単糖と UDPのようなヌクレオチドとの複合体））であり、 (B) は、その酵素において触媒機能を発揮するために必要なコンフオメーション変化に関連する部分（例えば、トリブトファン）と相互作用し得る部分である。 (S) は、スぺーサ一部分であり、（A) 部分と（B) 部分とを結合する作用を有する部分である。（S) は、（A) 部分と（B) 部分とが直接結合する場合はなくてもよい。好ましくは、（S) としては、（A) 部分および（B) 部分のいずれかまたは好ましくは両方と、それらの意図される機能を阻害しないような部分が用いられる。ここで、「スぺーサー（部分）」とは、 2つ以上の特徴的部分の間に適切な距離をもうけさせるために導入される化学的部分をいう。そのような部分としては、例えば、アルキレン基、エーテル基、エチレングリコール、ぺプチド、脂質などが挙げられるがそれらに限定されない。当業者は、上記特徴的部分に応じて、適切なスぺーサ一部分を選択および合成することができる。

(A) 、 (B ) および（S ) は、それぞれ独立して、置換基 Rによってさらに置換されていてもよレ、。置換基 Rの数は、（A) — ( S ) 一 (B) の構造によつて変動し、 1個、 2個であり得、存在する水素の数と同一数までの任意の数であり得る。

例えば、（A) 部分が C 6の単糖を含む場合、その（S ) または（B ) との結合は、 2位であっても、 6位であってもその他の位置であってもよい。ただし、通常、 UD Pのようなヌクレオチドは 1位に結合することから、好ましくは、 1 位以外から選択される。より好ましくは、 1位の隣（例えば、 2位、あるいは C 6糖の場合 6位）部位が有利であり得る。

本明細書において、「芳香族（官能）基」または「芳香環（官能）基」とは、芳香族の特性を有する環系化合物またはその部分をいい、一般に π電子が 4 η + 2個ある環状共役系を含む安定な構造を有する。このような芳香族官能基は、他の芳香族官能基とも相互作用することができる。芳香族官能基の例としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン、アントラセン、フラン、ピリジン、ァズレン、シクロオタタテトラエンジァ二オンなどが挙げられるがそれらに限定されない。芳香族官能基は、炭素環であってもよくへテロ環であってもよい。また、芳香族官能基は、置換基 Rで置換されていてもよく、「置換された芳香族官能基」とは、下記において選択される置換基で置換されている芳香族官能基を意味する。本明細書において「アルコール」とは、脂肪族炭化水素の 1または 2以上の水素原子をヒドロキシル基で置換した有機化合物をいう。本明細書においては、 R OHとも表記される。ここで、 Rは、アルキル基である。好ましくは、 Rは、 C 1〜C 6アルキルであり得る。アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、 1一プロパノール、 2—プロパノールなどが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「アルキル」とは、メタン、ェタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C_nH_{2n + 1}—で表される（ここで、 nは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルの Hが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、 C 1〜C2アルキル、 C 1〜C3アルキル、 C 1〜C4アルキル、 C 1〜C5アルキル、 C 1〜C 6アルキル、 C 1〜C 7アルキル、 C 1〜C8ァルキル、 C 1〜C9アルキル、 C 1〜C 10アルキル、 C 1〜C 11アルキルまたは C 1〜C 12アルキル、 C 1〜C 2置換されたアルキル、 C 1〜C3置換されたアルキル、 C 1〜C 4置換されたアルキル、 C 1〜C 5置換されたアルキル、 C 1〜C 6置換されたアルキル、 C 1〜C 7置換されたアルキル、 C 1〜C8置換されたアルキル、 C 1〜C 9置換されたアルキル、 C 1〜C 10置換されたァルキル、 C 1〜C 1 1置換されたアルキルまたは C 1〜C 12置換されたアルキルであり得る。ここで、例えば C 1〜C 10アルキルとは、炭素原子を 1〜10 個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（CH₃—）、ェチル（C ₂H₅— ) 、 n—プロピル（CH₃CH₂CH₂_) 、イソプロピル（（CH₃) ₂C H-) 、 n—プチル（CH₃CH₂CH₂CH₂—）、 n—ペンチル (CH₃CH₂ CH₂CH₂CH₂-) 、 n—へキシノレ（CH₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂—）、 n—へプチル（CH₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂_) 、 n—ォクチル（C H₃CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-) 、 n—ノニル（CH₃CH₂CH₂ CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂—）、 n—デシル (CH₃ CH₂ CH₂ CH₂ C H。CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂— ) 、 _C (CH₃) ₂CH₂CH₂CH (CH₃) ₂、一 CH₂CH (CH₃) ₂などが例示される。また、例えば、 C 1〜C 10置換されたアルキルとは、 C 1〜C 10アルキルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。

本明細書において「シクロアルキル」とは、環式構造を有するアルキルをいう。「置換されたシクロアルキル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルキルの Hが置換されたシクロアルキルをいう。具体例としては、 C3〜C4シク口アルキル、 C3〜C5シクロアルキル、 C 3〜C 6シクロアルキル、 C 3〜C 7シクロアルキル、 C 3〜C 8シクロアルキル、 C 3〜C 9シクロアルキル、 C 3〜C 10シクロアルキル、 C 3〜C 1 1シクロアルキル、 C 3〜C 12シク口アルキル、 C 3〜C 4置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 5置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 6置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 7置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 8置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 9置換されたシクロアルキル、 C 3〜C 10置換されたシクロアルキル、 C3〜C 11置換されたシクロアルキルまたは C 3〜C 12置換されたシクロアルキルであり得る。例えば、シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロへキシルなどが例示される。本明細書において「ァルケニル」とは、エチレン、プロピレンのような、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる 1 価の基をいい、一般に

—で表される（ここで、 nは 2以上の正の整数である）。「置換されたァルケニル」とは、以下に規定する置換基によってアルケニルの Hが置換されたアルケニルをいう。具体例としては、 C2〜C3ァルケニル、 C2〜C4アルケニル、 C2〜C5アルケニル、 C2~C6アルケニル、 C2〜C 7アルケニル、 C2〜C8アルケニル、 C2〜C9アルケニル、 C2〜 C 10アルケニル、 C 2〜C 1 1アルケニルまたは C 2〜C 12ァルケニル、 C 2〜C 3置換されたァルケニル、 C 2〜C 4置換されたァルケニル、 C2〜C5 置換されたァルケニル、 C 2〜C 6置換されたァルケニル、 C2〜C 7置換されたァルケニル、 C 2〜C 8置換されたァルケニル、 C 2〜C 9置換されたァルケ -ル、 C 2〜C 10置換されたァルケニル、 C 2〜C 1 1置換されたアルケニルまたは C2〜C 12置換されたアルケニルであり得る。ここで、例えば C2〜C 10アルキルとは、炭素原子を 2〜10個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味し、ビニル（CH₂ = CH—）、ァリル（CH₂ = CHCH₂—）、 CH₃CH =CH—などが例示される。また、例えば、 C 2〜C 10置換されたアルケニルとは、 C 2〜C 10アルケニルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。

本明細書において「シクロアルケニル」とは、環式構造を有するアルケニルをいう。「置換されたシクロアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルケニルの Hが置換されたシクロアルケニルをいう。具体例としては、 C 3〜C 4シクロアノレケニノレ、 C 3〜C 5シクロアノレケニノレ、 C 3〜C 6シクロアノレケニノレ、 C 3〜C 7シクロアルケニル、 C 3〜C 8シクロアルケ二ノレ、 C 3〜 C 9シクロアノレケニノレ、 C 3〜C 10シクロアレケ二ノレ、 C3〜C 1 1シクロアルケニル、 C 3〜C 12シクロアルケニル、 C 3〜C4置換されたシクロアルケ -ル、 C 3〜C 5置換されたシクロアルケ-ル、 C 3〜C 6置換されたシクロアルケニル、 C 3〜C 7置換されたシクロアルケニル、 C 3〜C 8置換されたシクロアルケニル、 C 3〜C 9置換されたシクロアルケ-ル、 C3〜C10置換されたシクロアルケニル、 C3〜C 11置換されたシクロアルケニルまたは C 3〜C 12置換されたシクロアルケニルであり得る。例えば、好ましいシクロアルケ二ルとしては、 1ーシクロペンテュル、 2—シクロへキセ-ルなどが例示される。本明細書において「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C_nH_2n一 ₃—で表される（ここで、 nは 2以上の正の整数である）。「置換されたアルキニル」とは、以下に規定する置換基によってアルキニルの H が置換されたアルキニルをいう。具体例としては、 C2〜C3アルキニル、 C2 〜C 4ァノレキニノレ、 C2〜C 5ァノレキニル、 C 2〜C6アルキニル、 C 2— C 7 アルキニル、 C 2〜C 8アルキニル、 C 2〜C 9アルキニル、 C 2〜C 10アルキニル、 C2〜C 11アルキニル、 C2〜C 12アルキニル、 C2〜C3置換されたアルキニル、 C 2〜C 4置換されたアルキ -ル、 C2〜C5置換されたアルキ -ル、 C 2〜C 6置換されたアルキニル、 C 2〜C 7置換されたアルキニル、 C 2〜C 8置換されたアルキニル、 C 2〜C 9置換されたアルキニル、 C2〜C

1ひ置換されたアルキニル、 C 2〜C 11置換されたアルキニルまたは C 2〜C 12置換されたアルキニルであり得る。ここで、例えば、 C2〜C 10アルキニルとは、例えば炭素原子を 2〜10個含む直鎖または分枝状のアルキニルを意味し、ェチニル（CH≡C—）、 1一プロピニル（CH₃C≡C_) などが例示される。また、例えば、 C 2〜C 10置換されたアルキニルとは、 C2〜C 10ァルキニルであって、そのうち 1または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。

本明細書において「アルコキシ」とは、アルコール類のヒドロキシ基の水素原子が失われて生ずる 1価の基をいい、一般に C_nH_{2n + 1}0—で表される（ここで、 nは 1以上の整数である）。「置換されたアルコキシ」とは、以下に規定する置換基によってアルコキシの Hが置換されたアルコキシをいう。具体例としては、 C 1〜C2アルコキシ、 C 1〜C3アルコキシ、 C 1〜C4アルコキシ、 C l〜 C 5アルコキシ、 C 1〜C6アルコキシ、 C 1〜C7アルコキシ、 C 1〜C8ァルコキシ、 C 1〜C9アルコキシ、 C 1〜C 10アルコキシ、 C 1〜C 1 1アルコキシ、 C 1〜C 12アルコキシ、 C 1〜C 2置換されたアルコキシ、 C 1〜C 3置換されたアルコキシ、 C 1 C 4置換されたアルコキシ、 C 1〜C5置換されたアルコキシ、 C 1〜C 6置換されたアルコキシ、 C 1〜C7置換されたアルコキシ、 C 1〜C 8置換されたアルコキシ、 C 1〜C 9置換されたアルコキシ、 C 1〜C 10置換されたアルコキシ、 C 1〜C 1 1置換されたアルコキシまたは C 1〜C 12置換されたアルコキシであり得る。ここで、例えば、 C 1〜C 10 アルコキシとは、炭素原子を 1〜10個含む直鎖または分枝状のアルコキシを意味し、メトキシ（CH₃0—）、エトキシ（C₂H₅0—）、 n—プロポキシ（C H₃CH₂CH₂0—）などが例示される。

本明細書において「炭素環基」とは、炭素のみを含む環状構造を含む基であつて、上記の「シクロアルキル」、「置換されたシクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「置換されたシクロアルケニル」以外の基をいう。炭素環基は芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換された炭素環基」とは、以下に規定する置換基によって炭素環基の Hが置換された炭素環基をいう。具体例としては、 C3〜C4炭素環基、 C3〜C5炭素環基、 C3〜C6炭素環基、 C3〜C 7炭素環基、 C3〜C8炭素環基、 C3〜C9炭素環基、 C 3〜C 10炭素環基、 C3〜C 1 1炭素環基、 C3〜C 12炭素環基、 C 3〜C 4置換された炭素環基、 C 3〜C 5置換された炭素環基、 C3〜C6置換された炭素環基、 C 3〜G 7置換された炭素環基、 C 3〜C 8置換された炭素環基、 C 3〜C 9置換された炭素環基、 C3〜C 10置換された炭素環基、 C3 〜C 1 1置換された炭素環基または C 3〜C 12置換された炭素環基であり得る。炭素環基はまた、 C 4〜 C 7炭素環基または C 4〜 C 7置換された炭素環基であり得る。炭素環基としては、フヱニル基から水素原子が 1個欠失したものが例示される。ここで、水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。

本明細書において「ヘテロ環基」とは、炭素およびへテロ原子をも含む環状構造を有する基をいう。ここで，ヘテロ原子は、 0、 Sおよび Nからなる群より選択され、同一であっても異なっていてもよく、 1つ含まれていても 2以上含まれていてもよい。ヘテロ環基は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換されたへテロ環基」とは、以下に規定する置換基によってヘテロ環基の Hが置換されたへテロ環基をいう。具体例としては、 C3〜C4炭素環基、 C3〜C 5炭素環基、 C3〜C6炭素環基、 C 3〜C 7炭素環基、 C3〜C8炭素環基、 C3〜C 9炭素環基、 C3〜C 10炭素環基、 C 3〜C 1 1炭素環基、 C3〜C 12炭素環基、 C 3〜C 4置換された炭素環基、 C 3〜C 5置換された炭素環基、 C 3〜C 6置換された炭素環基、 C3〜C7置換された炭素環基、 C 3〜C 8置換された炭素環基、 C 3〜C 9置換された炭素環基、 C3〜C10置換された炭素環基、 C3〜C 1 1置換された炭素環基または C3〜C 12置換された炭素環基の 1つ以上の炭素原子をへテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基はまた、 C4〜C 7炭素環基または C4〜C 7置換された炭素環基の炭素原子を 1つ以上へテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基としては、チェニル基、ピロリル基、フリル基、イミダゾリル基、ピリジル基などが例示される。水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。

本明細書において、炭素環基またはへテロ環基は、下記に定義されるように 1 価の置換基で置換され得ることに加えて、 2価の置換基で置換され得る。そのような二価の置換は、ォキソ置換（=0) またはチォキソ置換（=S)であり得る。本明細書において「ハロゲン」とは、周期表 7 B族に属するフッ素（F) 、塩素（C 1) 、臭素（B r) 、ヨウ素（I) などの元素の 1価の基をいう。

本明細書において「ヒドロキシ」とは、一OHで表される基をいう。「置換されたヒドロキシ」とは、ヒドロキシの Hが下記で定義される置換基で置換されているものをいう。

本明細書において「チオール」とは、ヒドロキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基（メルカプト基）であり、一 SHで表される。「置換されたチオール」とは、メルカプトの Hが下記で定義される置換基で置換されている基をいう。本明細書において「シァノ」とは、一CNで表される基をいう。「ニトロ」とは、 _N0₂で表される基をいう。「ァミノ」とは、 _NH₂で表される基をいう。「置換されたァミノ」とは、ァミノの Hが以下で定義される置換基で置換されたものをいう。

本明細書において「カルボキシ」とは、一 COOHで表される基をいう。「置換されたカルボキシ」とは、カルボキシの Hが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。

本明細書において「チォ力ルポキシ」とは、カルポキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基をいい、一 C (=S) OH、一 C (=θ) SHまたは一 CSSH で表され得る。「置換されたチォカルボキシ」とは、チォカルボキシの Hが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。

本明細書において「ァシル」とは、カルボン酸から OHを除いてできる 1価の基をいう。ァシル基の代表例としては、ァセチル（CH₃CO_) 、ベンゾィル

(C₆H₅CO_) などが挙げられる。「置換されたァシル」とは、ァシルの水素を以下に定義される置換基で置換したものをいう。

本明細書において「アミド」とは、アンモニアの水素を酸基（ァシル基）で置換した基であり、好ましくは、 —CONH₂で表される。「置換されたアミド」とは、アミドが置換されたものをいう。

本明細書において「力ルポニル」とは、アルデヒドおよびケトンの特性基である一（C =〇）一を含むものを総称したものをいう。「置換されたカルボニル」は、下記において選択される置換基で置換されている力ルポニル基を意味する。本明細書において「チォカルボニル」とは、カルポニルにおける酸素原子を硫黄原子に置換した基であり、特性基一（c = s)—を含む。チォカルボニルには、チオケトンおよびチォアルデヒドが含まれる。「置換されたチォカルボ-ル」とは、下記において選択される置換基で置換されたチォカルボニルを意味する。本明細書において「スルホニル」とは、特性基である一 SO ₂—を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルホニル」とは、下記において選択される置換基で置換されたスルホニルを意味する。

本明細書において「スルフィエル」とは、特性基である一 so—を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルフィエル」とは、下記において選択される置換基で置換されているスルフィニルを意味する。本明細書において「ァリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が 1個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の 1または 2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を 1つ除去して 1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を 2つ除去して 2価の置換基に置換することも可能である。

本発明の物質または上で定義した官能基が置換基 Rによって置換されている場合、そのような置換基 Rは、単数または複数存在し、それぞれ独立して、水素、アルキノレ、シクロアノレキノレ、ァノレケニノレ、、ンクロアルケニル、ァノレキニノレ、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シァノ、二トロ、ァミノ、カルボキシ、ァシル、チォカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換された力ルポニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニルおよび置換されたスルフィエルからなる群より選択される。好ましくは、置換基

Rは、複数存在する場合それぞれ独立して、水素、アルキルおよび置換されたァルキルらなる群より選択され得る。より好ましくは、独立して、 Rは、複数存在する場合それぞれ独立して、水素おょぴ C 1〜C 6アルキルからなる群より選択され得る。 Rは、すべてが水素以外の置換基を有していても良いが、好ましくは、少なくとも 1つの水素、より好ましくは、 2〜n (ここで nは Rの個数）の水素を有し得る。置換基のうち水素の数が多いことが好ましくあり得る。大きな置換基または極性のある置換基は本発明の効果（特に、アルデヒド基との相互作用）に障害を有し得るからである。従って、水素以外の置換基としては、好ましくは、 C 1〜C 6ァノレキノレ、 C 1〜C 5ァノレキノレ、 C 1〜C 4ァノレキノレ、 C 1〜 C 3アルキル、 C 1〜C 2アルキル、メチルなどであり得る。ただし、本発明の効果を増強し得ることもあることから、大きな置換基を有することもまた好ましくあり得る。さらにより好ましくは Rのすべてが水素であり得る。

本明細書において、 C l、 C 2、、、 C nは、炭素数を表す。従って、 C 1は炭素数 1個の置換基を表すために使用される。

本明細書において、「光学異性体」とは、結晶または分子の構造が鏡像関係にあって、重ねあわせることのできない一対の化合物の一方またはその組をいう。立体異性体の一形態であり、他の性質は同じであるにもかかわらず、旋光性のみが異なる。

本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の 1または 2以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を 1つ除去して 1価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を 2つ除去して 2価の置換基に置換することも可能である。

置換基としては、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたァルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アルコキシ、置換されたアルコキシ、炭素環基、置換された炭素環基、ヘテロ環基、置換されたへテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、置換されたヒドロキシ、チオール、置換されたチオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、置換されたァミノ、カルボキシ、力ルバモイル、置換されたカルボキシ、ァシル、ァシルァミノ、置換されたァシル、チォカルボキシ、置換されたチォカルボキシ、アミド、置換されたアミド、置換されたカルボニル、置換されたチォカルボニル、置換されたスルホニルまたは置換されたスルブイニルが挙げられるがそれらに限定されない。

上記の置換基が置換された基である場合は、そのさらなる置換のための置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シァノ、ニトロ、ァミノ、力ルポキシ、カルパモイル、ァシル、ァシルァミノ、チォカルポキシおよびアミドが挙げられる。

本明細書において「保護反応」とは、 B o c ( t —ブチルォキシカルボニル）のような保護基を、保護が所望される官能基に付加する反応をいう。保護基により官能基を保護することによって、より反応性の高い官能基の反応を抑制し、より反応性の低い官能基のみを反応させることができる。

本明細書において「脱保護反応」とは、 B o cのような保護基を脱離させる反応をいう。脱保護反応としては、 P d / Cを用いる還元反応のような反応が挙げられる。

本発明の各方法において、目的とする生成物は、反応液から夾雑物（未反応減量、副生成物、溶媒など）を、当該分野で慣用される方法（例えば、抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈澱、濾過、乾燥など）によって除去した後に、当該分野で慣用される後処理方法（例えば、吸着、溶離、蒸留、沈澱、析出、クロマトグラフィーなど）を組み合わせて処理して単離し得る。

(スクリーニング）

本明細書において、「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ物質または生物などを、特定の操作および/または評価方法で多数の候補から選抜することをいう。本明細書では、本発明の装置、システム、糖鎖アレイなどを用いることによって、スクリーニングを行うことができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによつて得られた化合物もまた、本宪明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。

(コンビナトリアルケミストリ）

本明細書において「コピナトリァルケミストリ」とは、合成反応を素反応に分解して組み合わせることにより、同時に多数かつ多様な化合物を合成する技術をいう。 M e r r i f i e l d (米国）の「ペプチド固相合成法」（1 9 6 3年）を基礎とした自動合成化技術の進展と、 F u r k a (ハンガリー）らの「スプリット合成法」（1 9 9 1年）の技術などに端を発し、種々の技術が周知となっており、当業者は、適宜本発明に適用することができる。

本明細書において使用される「スプリット法」では、ビーズなどの固体支持体上にリンカ一と呼ばれる有機合成の足場となる官能基が結合されることによって反応が信仰する。このリンカーには、ビルディングブ口ックという単位構造が連鎖的に結合される。各反応の前にビーズを数等分（スプリット）し、異なるビルデイングブロックを結合させた後，再び 1つの容器に戻す。 Z等分のスプリットとプールを n回繰り返すことにより、 Z X n種類の化合物からなるライプラリーが得られる。反応を個々のスプリットごとに行うことでビルディングブロックの反応性の違いを調節し、均一なライブラリ一を得ることができる。この方法により、できるだけ多くの種類の化合物からなるライブラリーを得ることができる。

本明細書において「液相合成」は、固相合成の代わりに液相を用いて混合物ライブラリーを液相合成で作成する方法をいう。液相合成には、例えば、同じ反応条件で反応するビルディングブ口ックの混合物を利用して反応を行う混合物合成法がある。あるいは、スプリット合成のビーズを可溶性ポリマーに置き換えた、 L PCS法もまた使用可能である。この方法は、溶媒からの回収に捕捉剤を利用することで、スプリット合成と同じようにライブラリーを作製することができる。

本明細書において「パラレル合成」とは、位置を定めたレジスター（ゥエルやピン、チップまたは膜上の小区画）上で反応を行う方法をいう。この方法では、個々のレジスターで通常の有機合成が行われる。必要な化合物の種類を得るためには相当数のレジスターを調製する必要がある。固相合成では通常ピンを用いることが多いが、より多くの化合物を同じように合成するために、チップ型の合成法が開発されている。パラレル合成の組合せにより、スプリツト法同様多くの種類の化合物が合成可能である。パラレル合成は、単一化合物からなるライブラリ一が得られるため、ライブラリーの再現性や構造確認などの面で優れている。本明細書においてコンビナトリアルライブラリの調製には、「自動合成装置 (合成ロボット）」を用いることができる。自動合成装置は、パラレル合成を集積ィ匕することによって、自動合成を行う。このことにより、'スプリット合成に較べ同時に作られる化合物数が限られるという欠点を克服することができる。

(化合物設計）

従って、本発明は、分子設計技術の使用により、酵素活性調節因子（阻害化合物を含む）を効率よく同定、選択、および設計することを可能にする。従って、本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。

コンピュータモデリングを行うためのコンピュータープログラムもまた、ィ匕学物質を設計または選択するプロセスにおいて使用され得る。このようなプロダラムとしては、以下が挙げられる。

1. GR I D (P. J. Go o d f o r d, 「A Comp u t a t i o n a 1 P r o c e du r e f o r De t e rm i n i n g En e r g e t i c a 1 1 y F a v o r a b l e B i n d i n g S i t e s o n B i o l o g i c a l l y I mp o r t a n t Ma c r omo l e c u l e sJ , J. Me d. Ch e m. ， 28， 849— 857頁（1 985) ) 。 GR I Dは、 Ox f o r d Un i v e r s i t y，Ox f o r d， UKから入手可能である。

2. MCS S (A. Mi r a nk e rら，「Fun c t i o n a l i t y M a p s o f B i n d i n g S i t e s ： A M 1 t i 1 e Co y S imu l t a n e o u s S e a r c h Me t h o d」 P r o t e i n s : S t r u c t u r e， Fun c t i o n a n d Ge n e t i c s, 1 1, 29— 34頁（1991) ) 。 MCS Sは、 Mo l e c u l a r S i mu l a t i o n s , S a n D i e g o, C Aから入手可能である。

3. AUTODOCK (D. S. Go o d s e l lら，「Au t oma t e d Do c k i n g o f Sub s t r a t e s t o P r o t e i n s b y S imu l a t e d Ann e a l i n g」， P r o t e i n s : S t r u c t r e , Fun c t i o n, a n d Ge n e t i c s, 8， 195— 20 2頁（1990) ) 。 AUTODOCKは、 S c r i p p s Re s e a r c h I n s t i t u t e, L a J o 1 l a, C Aから入手可能である。

4. DOCK (I. D. Kun t zら，「A Ge ome t r i c Ap p r o a c h t o Ma c r omo 1 e c u l e— L i g a n d I n t e r a c t i o n s J , J. Mo l . B i o l . , 161, 269— 288頁（1 982))。 DOCKは、 Un i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a, S a n F r a n c i s c o, C Aから入手可能である。一旦、適切な化合物が選択されると、それらは、単一化合物または複合体にァセンプリすることができる。構築に先だって、対象となる酵素の構造座標に関連してコンピューター画面上に表示される 3次元イメージ上で、互いのフラグメントの関連性の視覚的検査が行われ得る。これに続き、 Qu a n t aまたは S y b y 1 [Tr i p o s As s o c i a t e s, S t. L o u i s, MO] のようなソフトウェアを用いるマニュアルでのモデル構築が行われ得る。

個々の化合物またはその部分を連結させる際に使用され得る有用なプロダラムは、以下を含む。

1. CAVEAT (P. A. B a r t l e t tら、「CAVEAT： A P r o g r am t o F a c i l i t a t e t h e S t r u c t u r e— De r i v e d De s i g n o f B i o l o g i c a l l y Ac t i v e Mo l e c u l e s」 (Mo l e c u l a r Re c o gn i t i o n i n Ch em i c a l a n d B i o l o g i c a l P r o b l ems, S p e c i a l Pub. , Ro y a l Ch e m. S o c. , 78， 182— 196 頁（1989) ) ； G， L a r iおよび P. A. B a r t 1 e t t , 「CAV EAT： a P r o g r am t o F a c i l i t a t e t h e D e s i g n o f Or g a n i c Mo l e c u l e s」， J. Comp u t. A i d e d Mo 1. D e s . , 8， 51— 66頁（1994) )。 CAVE ATは、 Un i v e r s i t y o f Ca l i f o r n i a, B e r k e l e y, CA から入手可能である。

2. I S I S (MD L I n f o rma t i o n Sy s t ems, S a n L e a n d r o, CA) のような 3 Dデータベースシステム。この分野は、 Y. C. Ma r t i n, 「3D Da t a b a s e S e a r c h i n g i n D r u g D e s i g n」， J. Me d. Ch e m. ， 35, 2145— 2154 頁（1 992) において概説される。

3. HOOK (M. B. E i s e nら，「HOOK : A P r o g r am f o r F i n d i n g No v e l Mo l e c u l a r Ar c h i t e c t u r e s t a t S a t i s f y t h e Ch em i c a l a n d S t e r i c Re q u i r eme n t s o f a Ma c r omo l e c u l e B i n d i n g S i t e」， P r o t e i n s : S t r u c t . ， Fun c t. ， Ge n e t. , 19， 199一 221頁（1 994) ) 。 HO OKは、

Mo l e c u l a r S imu l a t i o n s, S a n D i e g o, CA力ら入手可能である。上記のように一度に 1つの化合物またはその部分を段階的様式で対象となる酵素の阻害因子などとして構築することを進める代わりに、阻害性または他の酵素結合化合物は、空の結合部位を使用するか、または必要に応じていくつかの既知の阻害因子の部分を含める方法などにより、分子全体あるいは全く新規に化合物を設計することができる。当該分野において、以下のような多くの新規リガンド設計方法が知られている。 1. LUD I (H . — J . B o hm, 「Th e C om u t e r P r o g r am LUD I ： A New Me t h o d f o r t h e D e No V o D e s i g n o f En z y m e I n h i b i t o r s」 s J . C om p . A i d. Mo 1 e c . D e s i g n, 6 6 1 ~ 7 8頁 (1 9 9 2) ) 。 L

UD Iは、 Mo l e c u 1 a r S i mu 1 a t i o n s I n c o r p o r a t e d, S a n D i e g o， C Aから入手可能である o

2. LEGEND (Y . N i s h i b a t aら， T e t r a h e d r o n, 4

7, 8 98 5頁（1 9 9 1) ) o LEGENDは、 Mo 1 e c u 1 a r S i m u 1 a t i o n s I n c o r p o r a t e d, S a n D i e g o ，か 'ら入手可能である。

3. L e a p F r o g (T r i p o s A s s o c i a t e s ， S t . L o u i s， MOから入手可能である）。

4. S PROUT (V. G i l l e tら，「S PROUT : A P r o g r a m f o r S t r u c t u r e Ge n e r a t i o n」， J. C omp u t . A i d e d Mo 1. D e s i g n, 7， 1 2 7— 1 5 3頁（1 9 9 3) ) 。 S PROUTは、 Un i v e r s i t y o f L e e d s， UKから入手可能である。他の分子モデリング技術もまた、本発明に従って使用され得る [例えば、 N.

C. C o h e nら，「Mo l e c u l a r Mo d e l i n g S o f t wa r e a n d Me t h o d s i o r Me d i c i n a l Ch em i s t r y」， J . Me d. C h e m. , 33， 8 8 3— 8 94頁（1 9 90) を参照のこと； M. A. N a v i aおよび M. A. Mu r c k o, 「Th e U s e o f S t r u c t u r a l I n f o rma t i o n i n D r u g D e s i g n」， C r r e n t Op i n i o n s i n S t r u c t u r a l B i o l o g y, 2， 202— 210頁（1992) もまた参照のこと； L. M. B a l b e sら, 「A P e r s p e c t i v e o f Mo d e r n Me t h o d s i n Comp u t e r— A i d e d D r u g De s i g n」， (Re v i ews i n C omp u t a t i o n a l Ch em i s t r y, v o l . 5, K. B. L i p k ow i t zおよぴ D. B. B o y d編， VCH, New Yo r k， 337— 380頁（1994) ) ;W. C. Gu i d a, 「S o f twa r e F o r S t r u c t u r e— B a s e d Dr u g De s i g n」， Cu r r. O p i n. S t r u c t. B i o l o g y. ， 4， 777 — 781頁（1994) ]。一旦上記の方法により化合物が設計されるかまたは選択されると、その物質が酵素相互作用部位に結合し得る効率が、計算による評価により試験され、そして最適化され得る。例えば、有効な酵素相互作用部位阻害因子は、好ましくは、その結合状態と遊離状態との間に相対的に小さなエネルギー差（すなわち、結合の小さな変形エネルギー）を示さなければならない。従って、最も効率的な酵素阻害因子は、好ましくは、約 10 k c a 1/モル以下（より好ましくは、 7 k.c a 1/モル以下）結合の変形エネルギーを用いて設計されるべきである。酵素阻害因子は、全結合エネルギーにおいて類似する 2つ以上のコンフオメーシヨンで結合ポケットと相互作用し得る。これらの場合、結合の変形エネルギーは、遊離物質のエネルギーと阻害因子がタンパク質に結合するとき観察されるこれらのコンフオメ一ションの平均エネルギーとの間の差であると考えられる。

酵素に結合するように設計または選択される物質は、その結合状態において、好ましくは、標的酵素および周囲の水分子との静電的斥力相互作用がないように、計算によりさらに最適化され得る。このような非相補的静電的相互作用は、電荷一電荷斥力相互作用、双極子一双極子斥力相互作用および電荷一双極子斥力相互作用を含む。特定のコンピューターソフトウエアは、化合物変形エネルギーおよぴ静電的相互作用を評価する分野において入手可能である。このような使用のために設計されたプログラムの例として、以下が挙げられる： G a u s s i a n 94， r e v i s i o n C (M. J . F r i s c h, Ga u s s i a n, I n c. ， P i t t s b u r g , PA 1 995) ； AMBER, v e r s i o n 4. 1 (P. A. Ko l l ma n, Un i v e r s i t y o f Ca l i f o r n i a a t S a n F r a n c i s c o, 1995) ； QUANTA/CHARM M (Mo l e c u l a r S i mu l a t i o n s, I n c. , S a n D i e g o, CA 1995) ； I n s i gh t I I /D i s c o v e r, (Mo 1 e c u l a r S i mu l a t i o n s, I n c. ， S a n D i e g o, CA

1 995) ； De l Ph i (Mo l e c u l a r S i mu l a t i o n s, I n c. ， S a n D i e g o, CA 1995) ；および AMSOL (Qu a n t um Ch em i s t r y P r o g r am Ex c h a n g e, I n d i a n a Un i v e r s i t y) 。これらのプログラムは、例えば、 S i 1 i c o n G r a p h i c sワークステーション（例えば、「IMPACT」グラフイクスを備える I n d i g o ²) を用いて実行され得る。他のハードウヱアシステムおょぴソフトウェアパッケージもまた、当業者に公知である。

本発明により可能な別のアプローチは、酵素に全体または部分的に結合し得る化合物またはその部分についての低分子データベースの計算上のスクリーニングである。このスクリーニングにおいて、結合部位へのこのような物質の適合の質は、形状的相補性または見積もられた相互作用エネルギーのいずれかにより判定され得る [E. C. Me n gら， J. C omp. C h e m. ， 16， 505— 5 24頁（1992) ] 。

(フアルマコフォア）

本発明は、他の実施形態において、本発明の化合物に対する調節活性について P T/JP2004/001092

の有効性のスクリーニングの道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関 (qu a n t i t a t i v e s t r u c t u r e a c t i v i t y r e 1 a t i o n s h i p=QSAR) モデル化技術を使用して得られる化合物を包含する。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質铸型、フアルマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、 CATAL YS T™ フアルマコフォア法（Ek i n s e t a l . , Ph a rma c o g e n e t i c s, 9： 477~489, 1999 ; Ek i n s e t a l . 、 J . Ph a rma c o l . & Ex p. T h e r . , 288 : 21〜 29， 19 99 ; Ek i n s e t a l . 、 J. Ph a rma c o l . & Ex p. Th e r. ， 290 : 429〜 438， 1999 ; E k i n s e t a l . 、 JT. Ph a rma c o l . & Ex p. Th e r. , 291 : 424〜 433， 19 99 ) およぴ比較分子電界分析 (c omp a r a t i v e mo l e c u l a r f i e l d a n a l y s i s ； CoMFA) (J o n e s e t a l . 、 D r u g Me t a b o l i sm & D i s p o s i t i o n， 24: l〜6， 1 996) などを使用して行うことができる。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、 CATALYST"™バージョン 4 (Mo l e c u l a r S imu l a t i o n s, I n c. , ¾ a η D ι e g o, CA) など）を使用して行われ得る。

活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンビユータモデリング技術のレ、ずれかを使用してで行うことができる。視覚による検查および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、 QUANTA (M o 1 e c u 1 a r S i mu l a t i o n s, B r l i n g t o n, MA, 1 992) 、 SYBYL (Mo l e c u l a r Mo d e l i n g S o f t w a r e, T r i p o s As s o c i a t e s, I n c. , S t. L o u i s, M 1092

0， 1992) 、 AMBER (We i n e r e t a 1. , J . Am. Ch e m. S o c. ， 106 ： 765-784, 1984) 、 CHARMM (B r o o k s e t a 1. 、 J . C omp. C h e m. ， 4 : 187〜 21 7， 198 3) などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、 CHA RMM、 AMBERなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、 GR I D (Go o d f o r d e t a l . 、 J. Me d. Ch e m. ， 28 : 84 9〜857， 1 985) 、 MC S S (Mi r a nk e r a n d K a r p 1 u s , Fun c t i o n a n d Ge n e t i c s, 1 1 : 29〜 34， 1 99 1) 、 AUTODOCK (Go o d s e l l a n d O l s e n, P r o t e i n s： S t r u c t u r e, Fun c t i o n a n Ge n e t i c s, 8 : 195〜202， 1990) 、 DOCK (Kun t z e t a l . 、 J. Mo 1. B i o l . ， 161 : 269〜 288， (1982) ) などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、 LUD I (B o hm， J. C omp. A i d. Mo 1 e c . D e s i g n, 6 : 61〜 78， 1992) 、 LEGEND (N i s h i b a t a a d I t a i , Te t r a h e d r o n, 47 : 8985, 1991) 、 L e a F r o g (Tr i p o s As s o c i a t e s, S t. L o u i s, MO) などのようなコンピュータ一プログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物を設計することができる。

(医薬 ·化粧品など、およびそれを用いる治療、予防など）

別の局面において、本発明は、医薬（例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、タンパク質または脂質は抗原性を低減した医薬品）および化粧用組成物に関する。この医薬おょぴ化粧用組成物は、薬学的に受容可能なキヤリァなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。

そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキヤリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的ァジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、化合物、またはその改変体もしくは誘導体を、 1つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。

本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピェントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量おょぴ濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クェン酸塩、または他の有機酸；ァスコルビン酸、 α—トコフエ口ール；低分子量ポリぺプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビュルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、ァスパラギン、アルギニまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、 E D T A) ；糖アルコール（例えば、マン-トールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリゥム）；ならびに Ζ あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、 T w e e n、プル口ニック（p 1 u r o n i c ) またはポリエチレンダリコーノレ ( P E G) ) 。

例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、 pH7. 0— 8. 5の T r i s緩衝剤または pH4. 0-5. 5の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。

本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、 PH、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈內投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。

本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、 S武型剤または安定化剤（日本薬局方第 14版またはその最新版、 Rera i n g t o n， s P h a rma c e u t i c a 1 S c i e n c e s, 18 t h. Ed i t i o n, A. R. Ge nn a r o, e d. , Ma c k Pub l i s h i n g Comp a ny, 1990などを参照）と、所望の程度の純度を有する組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。

本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日一数ケ月に 1 回（例えば、 1週間に 1回一 1ヶ月に 1回）の投与が挙げられる。 1週間一 1ケ月に 1回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。

本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。 (農薬）

本発明の組成物は、農薬の成分としても用いることができる。農薬組成物として処方される場合、必要に応じて、農学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤などを含み得る。

本発明の組成物が、農薬として使用される場合は、除草剤（ビラゾレートなど）、殺虫 '殺ダニ剤（ダイアジノンなど）、殺菌剤（プロべナゾールなど）、植物成長調整剤（例、パク口ブトラゾールなど）、殺線虫剤（例、べノミルなど）、共力剤（例、ピぺロニルブトキサイドなど）、誘引剤（例、オイゲノールなど）、忌避剤（例、クレオソ一トなど）、色素（例、食用青色 1号など）、肥料（例、尿素など）などもまた必要に応じて混合され得る。

(保健 ·食品）

本発明はまた、保健.食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品 '健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。

本発明は上記のように、医療以外にも、食品検査、検疫、医薬品検査、法医学、農業、畜産、漁業、林業などで、生体分子の検査が必要なものに全て適応可能である。本発明においては特に、食料の安全目的のための（たとえば、 B S E検查) 使用も企図される。 (好ましい実施形態の説明）

以下に、本発明の好ましい実施形態について説明する。

一つの局面において、本発明は、酵素の活性を調節する因子をスクリーニングする方法に関する。このスクリーニング方法は、従来のような基質との競合関係を利用するのではなく、基質との相互作用によるコンフオメーション変化の阻害というメカニズムを利用する全く新しいコンセプトを利用する発明である。そのようなコンセプトを用いて設計された酵素活性調節因子（例えば、阻害因子）はかってなく、その手法自体が非常に画期的である。

ここで、本発明の方法は、目的とする酵素において、この酵素の基質との相互作用部位を同定する工程；この酵素の触媒反に必要な構造変化を担う構造変化部位を同定する工程；およぴ該相互作用部位と相互作用する A部分、およぴ該構造変化部位と相互作用する B部分を同定する工程、を包含する。

酵素におけるその酵素の基質との相互作用部位は、酵素と基質との複合体を X 線構造解析などの物理学的手法により分析することによつて同定することができる。あるいは、そのような相互作用部位は既知のデータを用いてもよい。例えば、ヒト ;31， 4_ガラクトース組成物転移酵素の場合、 J. Mo 1. B i o 1 3 18， 491 -502 (2002) に記載されるように、配列番号 2および対応するヒトの配列（配列番号 4) において As p 252、 As p 254、 G 1 y 2 92、 T r p 314, G 1 y 315、 G l u 317、 As p 318、 Me t 34 4、 H i s 347などが相互作用部位であり得る。この同定は、より精確に同定することが好ましいが、以下に説明するように、 A部分を同定することができ、それによりその部分またはその部分を含む化合物を製造することができれば、必ずしも、精確である必要はなく、同定する必要が全くない場合もあり得る。本明細書において酵素の「触媒反応に必要な構造変化」とは、基質との相互作用によりコンフオメーションが変化する酵素において、その酵素が担う触媒反応を行うのに必要とされる構造上の変化をいう。例えば、ゥシ β 1， 4ーガラクトース転移酵素（配列番号 1 (核酸配列）および 2 (アミノ酸配列））、ヒト 1， 4 _ガラクトース転移酵素（配列番号 3 (核酸配列）および 4 (アミノ酸配列） ) がその酵素である場合、ドナー基質である UD P— G a 1の上記酵素への結合により引き起こされるラージループ（3 1 4位のトリブトファン上の芳香族官能基）の移動によるコンフオメーション変化がそのような構造変化にあたる。この構造変化により、ァクセプター（G l c NA c ) 結合部位が出現する。

このような酵素の触媒反応に必要な構造変化を担う構造変化部位の同定は、当該分野において周知の物理学的手法（例えば、 X線構造解析）を用いて行うことができる。いったん構造変化を担う部位が同定されると、その部位の挙動を解析することで、以下の相互作用する B部分の同定の助けとすることができる。

本発明のスクリ一ユング方法において、相互作用部位と相互作用する A部分は、当該分野において周知の技法を用いて同定することができる。本発明のスクリーニング方法において、構造変化部位と相互作用する B部分もまた、当該分野において周知の技法を用いて同定することができる。そのような技法としては、例えば、コンピュータモデリング、生化学的手法、コンビナトリアルケミストリ、遣伝的アルゴリズムを用いたスクリーニングなどが挙げられるがそれらに限定されない。そのような技法は、例えば、本明細書において引用する文献または最新創薬化学（上 Z下） W e r m u t h編、長瀬博監訳、テクノミック（1 9 9 7 ) などの一般的な教科書に記載されており、当業者はそれら技法を適宜使用または組み合わせることによつて本発明のスクリ一ユング方法に応用することができる。通常、 A部分は、第一の基質と直接相互作用する部分であることが多いことから、単糖とヌクレオチドとの複合体のような第一の基質そのものであるかそれに類似する部分であることが多い。他方、 B部分は、通常、基質とは直接相互作用する部分でないことが多いことから、上記相互作用部位の挙動を阻害するような部分であることが多い。従って、上記相互作用部位が芳香族官能基を有するアミノ酸を含む場合、その芳香族官能基と相互作用する（例えば、干渉する）部分（例えば、芳香族官能基）であり得る。

1つの実施形態において、本発明のスクリーニング方法が対象とする酵素は、好ましくは、触媒反応に 2以上の分子が必要であるものが使用され得る。そのような酵素としては、例えば、転移酵素（例えば、ァセチル転移酵素、糖転移酵素、ァミノ基転移酵素、リン酸転移酵素、グルタミル転移酵素、 C 1化合物転移酵素、ケトン基転移酵素、アルデヒド基転移酵素、ァシル基転移酵素、アルキル基転移酵素、含窒素残 ¾転移酵素、チオール基転移酵素、ペプチド転移酵素など）、リァーゼ（除去付加酵素）、シンタ一ゼ（合成酵素、リガーゼ）などが挙げられる。あるいは、そのような 2つ以上の分子を必要とする酵素としては、捕酵素（例えば， NAD P H、 NAD P、 C o Qなど）などを触媒反応に必要とする酵素が挙げられるがそれらに限定されない。

好ましい実施形態において、本宪明のスクリーニング方法が対象とする酵素は、糖転移酵素である。糖転移酵素は、通常ドナー基質およびァクセプター基質をその触媒反応に必要とし、ドナー基質の酵素への結合により、コンフオメーシヨン変化を起こし、触媒反応が促進されることが多い。このようなメカニズムを用いて、本発明のスクリーニング方法を適用することができる。

1つの好ましい実施形態において、本発明のスクリーニング方法では、上記基質は、ド^ "一およびァクセプターを含み、酵素は、このドナーとこのァクセプタ一との間の反応を触媒するものが使用される。通常、酵素の構造変化は、該ドナ一により生じるが、これらに限定されない。この好ましい実施形態において、上記 A部分はドナーと相互作用し、上記 B部分はこのァクセプターの触媒部位への進入を担う部分であってもよいが、それらに限定されない。ここで、ァクセプタ一の触媒部位への進入を担う部分は、当該分野において周知の物理学的手法などによって当業者は容易に決定することができる。あるいは、ァクセプターの触媒部位への進入を担う部分は既知のデータを用いることもできる。重要なのは、本発明において、このようなコンフオメーシヨン変化を活性調節因子（例えば、阻害因子）の設計に用いることである。

本発明のスクリ一ユング方法の 1つの好ましい実施形態において、糖転移酵素の例としては、 β 1, 4一ガラクトース転移酵素、 α— 1， 3—ガラクトース転移酵素， J3 1, 4—ガラクトース転移酵素， ]3 1， 3—ガラクトース転移酵素， β 1, 6—ガラクトース転移酵素、 α 2， 6—シアル酸転移酵素、 ct l， 4ーガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、《 1, 2—フコース転移酵素、 a l， 3—フコース転移酵素、 a l， 4ーフコース転移酵素、 α ΐ, 6 - フコース転移酵素、ひ 1， 3— Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 a l， 6 一 Ν_ァセチルガラクトサミン転移酵素、 β 1， 4一 Ν—ァセチルガラタトサミン転移酵素、ポリペプチド Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 β 1， 4一 Ν ァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 2— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 3— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 6—Νァセチルダルコサミン転移酵素、 a l， 4一 Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 4—マンノース転移酵素、 α ΐ, 2 _マンノース転移酵素、 α ΐ, 3—マンノース転移酵素、 a 1, 4—マンノース転移酵素、 a l， 6—マンノース転移酵素、 a l， 2—グルコース転移酵素、 _α 1， 3—グルコース転移酵素、 α 2， 3—シアル酸転移酵素、 α 2， 8—シアル酸転移酵素、 ct 1， 6—ダルコサミン転移酵素、 _α 1， 6 ーキシロース転移酵素、キシロース転移酵素（プロテオダリカンコア構造合成酵素）ヽ β 1, 3—グルクロン酸転移酵素、ヒアルロン酸合成酵素、他の糖ヌクレオチドを糖ドナーとして用いる糠転移酵素おょぴドルコールリン酸型糖ドナーを用いる糖転移酵素などが挙げられるがこれらに限定されない。もっとも好ましくは、本発明のスクリーニング方法が対象とする酵素の一つは、 /3 1， 4ーガラクトース転移酵素である。

本発明のスクリーニング方法が対象とする酵素が配列番号 2および 4に示されるゥシおよびヒト 1， 4—ガラクトース転移酵素である好ましい実施形態において、その酵素の基質は、 UD P—ガラクトースを含み、上記構造変化部位は、配列番号 2または 4に示されるポリぺプチド配列のアミノ酸 3 1 4位のトリプトファンを含む部位である。当然、類似の酵素の場合、同様の部分が利用され得る。あるいは、対応する酵素の場合、対応する部分が利用され得る。

本発明のスクリーニング方法で利用される酵素は、野生型の酵素であってもよいが、その設計の便宜のために、改変体（例えば、保存的改変体、対立遺伝子改変体など）あるいはフラグメントを用いることもできる。あるいは、その設計の目的に応じて、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログを含む酵素改変体を用いることもできる。このような改変体およびフラグメントの生産は、当該分野において周知の技法を用いて行うことができ、当業者はそれら周知技術を適宜用いるか組み合わせて本発明に適用することができる。

別の局面において、本発明は、酵素の活性を調節する因子を生産する方法を提供する。このような酵素の活性調節因子（例えば、阻害因子）を生産するスキームは、従来のコンセプトからは想到し得るようなものではない、コンフオメーシヨン変化を利用したスキームである。ただし、いったん目的となる因子のモデルまたはその分子自体の高次構造が明らかになれば、本明細書の開示および当該分野において周知の技法を適宜組み合わせることによって、目的とする化合物を生産することができる。

従って、本発明の方法は、目的とする酵素において、その酵素の基質との相互作用部位を同定する工程；この酵素の触媒反応に必要な構造変化を担う構造変化部位を同定する工程；その相互作用部位と相互作用する A部分、および構造変化部位と相互作用する B部分を同定する工程；および A部分および B部分を含む分子を調製する工程、を包含する。

本発明の酵素の活性を調節する因子を生産する方法において、酵素の基質との相互作用部位を同定する工程、酵素の触媒反応に必要な構造変化を担う構造変化部位を同定する工程および相互作用部位と相互作用する A部分、およぴ構造変化部位と相互作用する B部分を同定する工程は、本努明のスクリーニング方法に関する説明において説明したように実施することができ、好ましい実施形態を採用することができる。

本発明の酵素の活性を調節する因子を生産する方法において、 A部分および B 部分を含む分子を調製する工程もまた、当該分野において公知の方法を用いる力、あるいは組み合わせることによって、実施することができる。そのような分子の調製は、化学合成、生化学的もしくは分子生物学的（遺伝子工学的）産生手法、コンビナトリアルケミストリ、遺伝アルゴリズム、コンピュータモデリング、フィッティングなどの種々の技法を用いて行うことができる。そのような技法は、例えば、岡崎進、岡本裕幸編、生体系のコンピュータシミュレーション、化学同人； B. F r a s e r r e i d、 K. T a t s u t a , J. T h ι e m, l y c o s c i e n c e, S p r i n g e rに記載される技術を用いることができる。好ましくは、 A部分が相互作用する相互作用部位と、 B部分が相互作用する構造変化部位との間の距離を考慮して本発明の分子を調製することが有利であり得る。双方への相互作用が最適に行うように設計することが好ましいからである。

好ましい実施形態において、本発明の生産方法において調節因子が対象とする酵素は、触媒反応に 2以上の分子が必要であり得る。このような酵素は、本明細書において上記したようなものが用いられ得る。

好ましい実施形態において、本発明の生産方法において用いられる酵素の基質は、 2以上であり、その基質はドナーおよびァクセプターを含み、この酵素は、ドナーとァクセプターとの間の反応を触媒する。通常、この構造変化は、該ドナ一により生じるが、必ずしもそうでなければならないことはない。従って、別の基質または分子がそのような構造変化を引き起こしてもよい。触媒反応に 2以上の分子が必要であるものが使用され得る。そのような酵素としては、例えば、転移酵素（例えば、ァセチル転移酵素、糖転移酵素、アミノ基転移酵素、リン酸転移酵素、ダルタミル転移酵素、 C 1化合物転移酵素、ケトン基転移酵素、アルデ 2004/001092

ヒド基転移酵素、ァシル基転移酵素、アルキル基転移酵素、含窒素残基転移酵素、チオール基転移酵素、ペプチド転移酵素など）、リアーゼ（除去付加酵素）、シンターゼ（合成酵素、リガーゼ）などが挙げられる。あるいは、そのような 2つ以上の分子を必要とする酵素としては、補酵素（例えば， NADPH、 NADP、 C o Qなど）などを触媒反応に必要とする酵素が挙げられるがそれらに限定されない。

ここで、 A部分はドナーと相互作用し、 B部分はァクセプターの触媒部位への進入を担う部分であり得る。この場合、 A部分は、ドナーと同一または類似する構造であってもよい。そのような構造は、基質の構造が公知であるから、その設計も公知であり、当業者は容易に生産することができる。 B部分は、好ましくは、ドナーとの相互作用によつて挙動が変動する部分であることから、その挙動を解祈し、挙動を担う具体的な部分（例えば、ヒト J3 1, 4_ガラクトース転移酵素の場合、配列番号 2または配列番号 4に示されるポリぺプチド配列の 3 14位のトリブトファンの側鎖部分）と相互作用する部分である。従って、具体的な部分が同定されると、当業者は、当該分野において周知の技術を用いて B部分を設計することができる。例えば、トリブトファンの側鎖の芳香族官能基がその部分であると同定された場合、その芳香族官能基に相互作用する部分もまた、芳香族官能基であり得る。

本発明の酵素調節因子生産方法の 1つの好ましい実施形態において、対象とする酵素は、糖転移酵素であり得る。

本発明の酵素調節因子生産方法の対象となる糖転移酵素の例としては、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素、ー 1， 3 _ガラクトース転移酵素， β 1， 4—ガラタトース転移酵素， β 1， 3—ガラクトース転移酵素， 1， 6—ガラクトース転移酵素、 α 2, 6—シアル酸転移酵素、 a l， 4一ガラクトース転移酵素、セラミドガラタトース転移酵素、 a l， 2—フコース転移酵素、 α ΐ, 3—フコース転移酵素、 a l， 4ーフコース転移酵素、 a l， 6—フコース転移酵素、 α 1， 3— N—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 " 1， 6— Ν—ァセチルガラタトサミン転移酵素、 β 1， 4一 Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、ポリぺプチド Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 β 1， 4— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 2— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 ]3 1， 3— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 6— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 1 ， 4 一 Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 4一マンノース転移酵素、ひ 1 , 2 一マンノース転移酵素、 a l， 3—マンノース転移酵素、 a l， 4 _マンノース転移酵素、 _α 1， 6—マンノース転移酵素、 a l， 2 _グルコース転移酵素、 α 1， 3—グルコース転移酵素、 α 2， 3—シアル酸転移酵素、 α 2 , 8—シアル酸転移酵素、（¾ 1， 6—ダルコサミン転移酵素、 α ΐ , 6—キシロース転移酵素、キシロース転移酵素（プロテオダリカンコア構造合成酵素）、 β 1， 3—ダルク口ン酸転移酵素、ヒアル口ン酸合成酵素、他の糖ヌクレオチドを糖ド^ "一として用いる糖転移酵素およぴドルコールリン酸型糖ドナーを用レヽる糖転移酵素などが挙げられるがこれらに限定されない。もっとも好ましくは、本発明のスクリーニング方法が対象とする酵素の一つは、 1， 4—ガラクトース転移酵素である。より好ましい実施形態において、本発明の酵素調節因子生産方法で用いられる酵素の基質は、 U D P—ガラクトースを含み、上記構造変化部位は、配列番号 2 および配列番号 4に示されるそれぞれゥシおよびヒトの ]3 1， 4—ガラクトース転移酵素のポリペプチド配列のアミノ酸 3 1 4位のトリブトファンを包含する。ここで、トリブトファンの側鎖の芳香族官能基が ]3 1， 4一ガラクトース転移酵素のァクセプターの進入のための入り口に存在し、ふたのような役割をする。従つて、この側鎖と相互作用するような部分を設計することが本発明において好ましくあり得る。この場合、相互作用する部分もまた、芳香族官能基を有する。より好ましくは、 Α部分と Β部分との距離を最適化することが有利である。 β 1， 4一ガラクトース転移酵素の場合、例えば、 1 Α〜 3 O Aの間のスぺーサ一、より好ましくは、 2 A〜 2 O Aのスぺーサ一、さらに好ましくは 2 A〜l 5 Aのスぺーサーを A部分と B部分との間にもうけることが好ましいがそれに限定されなレ、。そのようなスぺーサ一の要不要およびその長さは、対象となる酵素を特定し、その解析を行うことによって当業者は容易に同定することができる。例えば、そのような距離は、コンフオメーシヨンが 2種知られている酵素（標的タンパク質）においては、例えば、 UD P— G a 1と T r pとの間の距離が長距離であるコンフオメーシヨン 1およぴ他方は直接水素結合し得るほど短距離にあるコンフオメーシヨン 2の間の距離であることが好ましい。より長い距離をとり得る分子が好ましい。長い距離をとり得る分子であっても、折りたたみの条件などによつて、短い距離をとり得ることができるからである。例えば、 UD P— G a 1と T r pとの間の最大距離は、約 2 O A程度の距離があり、例えば、水素結合し得るほどの短距離の場合は、 2 A程度になる可能性がある。これらの事項を考慮して、 2つの部分の距離およびそれに対応するスぺーサーを設計することができる。なお、一般に酵素、レクチンなどと基質との相互作用は、糖をクラスター化することによつて飛躍的に上昇することが知られており、本発明においても適用することができる。従って、本発明の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の化合物を複数個（あるいは、一方の部分を複数個）含むような高分子を提供する。このような高分子の製造方法は、当該分野において周知であり、本明細書において引用した文献に記載の技術を用いて実施することができる。また、そのような高分子は、より好ましい阻害因子あるいは医薬として用いることができる。

A部分の好ましい例としては、ドナー基質（例えば、 UD P— G a 1 ) の全部もしくは一部またはその模倣物で挙げられ、例えば、糖転移酵素の場合、単糖または糖鎖あるレ、はその改変体と、 UD Pのようなヌクレオチドとの複合体が挙げられる。 B部分の好ましい例としては、コンフオメーシヨン変化を担う部分と相互作用することが企図されることから、芳香族官能基同士の相互作用、疎水性相互作用のような作用を有する部分（例えば、芳香族官能基、疎水性が高いアルキル基など）、あるいは担う部分の一部と強固な結合を形成する部分（例えば、ヒドロキシルァミン、ヒドラジドのような共有結合可能な部分）を含む部分などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような部分の設計は、コンフオメ一シヨン変化を担う部分が同定されれば、当業者は、当該分野において周知の技術を用いる力組み合わせることによって、容易に実施することができる。

そのような設計には、コンビナトリアルケミストリライブラリーをスクリー二ングすることが包含されていてもよい。あるいは、遺伝アルゴリズムを用いた手法、コンピュータモデリング、フィッティングなどの手法を用いることも可能である。あるいは、ブアルマコフォアモデルを設計し、それに基づいてモデリングおよび実際の生産をおこなってもよい。

実際に設計され調製された化合物は、そのいくつかは、目的とする酵素の調節活性が意図した活性よりも低いあるいは全くないかもしれない。そのような場合、さらにスクリーニングおよびノまたはモデリングならびに調製を行うことによつて、さらに改善された調節因子（例えば、阻害因子、活性化因子）を生産することができる。とはいうものの、当業者であれば、そのような工程に関わる技術は、技術常識の範囲内にあることを理解し、従って、上記工程を適切に繰り返すことなど、通常のスクリーニングに伴う作業を行うことによって、本発明の調節因子を生産することができることを理解する。

別の局面において、本発明は、本発明の酵素活性調節因子の生産方法によって生産された因子に関する。そのような因子は、上述のように、当該分野において周知の技術を用いて生産することができる。いったん生産方法がわかれば、大量生産する技術を適用することもまた、当該分野の技術常識内にあり、従って、当業者は、本明細書の記載に従って、そのような因子を生産することができる。そのような因子の生産は、従来の有機化学的手法を組み合わせることによつても達成され得、あるいは、生化学的または分子生物学的手法を利用または組み合わせることによって達成され得る。そのような因子は、好ましくは、本発明が目的とする酵素の阻害因子であり得るが、活性化因子であってもよい。このように設計 JP2004/001092

された阻害因子は、従来の設計方法からは達成できなかつた程度に阻害活性の強いものであり得る。従って、このような阻害因子は、従来存在しなかったものといえる。本発明の酵素活性調節因子は、その酵素の存在または活性のレベルの異常に関連する、生体の状態、障害または疾患の調節、予防、 '処置または予後に用いることができる。従って、このような因子の設計よぴ因子自体の有用性は計り知れない。

さらなる局面において、本発明は、本発明の酵素活性調節因子を含む組成物に関する。そのような組成物は、医薬、化粧品、農薬、食品（例えば、保健食品）、生化学研究、高分子生産など種々の分野において利用することができる。医薬であれば、本発明の組成物は、医薬に対して適用される基準おょぴ規制に適合している必要があり、他の分野においても同様の基準および規制が存在する場合、そのような基準おょぴ規制に適合している必要がある。好ましくは、このような調節因子は、阻害因子であり得るが、活性化因子であってもよい。

従って、 1つの好ましい局面において、本発明は、ガラクトース転移酵素上の UD P— G a 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む、化合物を提供する。

ここで、ガラクトース転移酵素上の UD P— G a 1結合部位と相互作用し得る部分は、ガラクトース転移酵素が基質と結合していない状態では、ドナー分子である UD P— G a 1を受け入れるコンフオメーシヨンをしている。従って、このような結合部位と相互作用し得る部分は、 UD P— G a 1そのものまたはその一部であるか、あるいはその模倣物であり得る。

従って、 UD P— G a 1結合部位と相互作用し得る部分は、単糖（例えば、ガラタトース）または単糖の誘導体（例えば、メチル基などの置換基を有する単糖) あるいはその単糖または単糖の誘導体を含む糖鎖または糖鎖含有物質単独であつてもよく、ヌクレオチド（例えば、 UD P ) またはその改変体（例えば、メチル基などの置換基を有するヌクレオチド）単独であってもよく、好ましくはその両 2004/001092

者の複合体であってもよい。好ましくは、 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分は、ガラクトースまたはガラクトースに由来する改変体と UDPまたは U D Pの改変体との複合体である。

別の好ましい実施形態において、本発明の化合物におけるトリブトファンと相互作用し得る部分は、芳香族官能基を含む。このような芳香族官能基としては、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセンなどの炭素環基、あるいはフランなどのへテロ環基が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、トリブトファンと相互作用し得る部分は、ナフタレンである。

好ましい実施形態において、 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分との間の距離は、酵素上の位置に対応し得る距離であることが有利であり得る。そのような距離は、通常 0A〜30Aであり、代表的には 1Α〜 3 OAであり、あるいはより代表的には 2 A〜 3 OAであり、好ましくは、 2 A〜 2 OAであり、より好ましくは 2 A〜l 5 Aまたは 5 A 〜15 Aであり得る。

そのような距離を保っために、 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリプトファンと相互作用し得る部分との間には、スぺーサ一部分をもうけることができる。そのようなスぺーサ一は、例えば、エチレングリコール、アルキレン基、ペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、 XJ DP-Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分との間には、一（CH₂CH₂0) _n—が連結されている（ここで、 nは 1 〜6の間の整数である）。 nは、好ましくは、 3である。このような一（CH₂ CH₂0) ₃—の距離が、 1， 4一ガラクトース転移酵素上の UDP— G a 1結合部位と、コンフオメーシヨン変化を担うアミノ酸（配列番号 2 (ゥシ）および配列番号 4 (ヒト）では 314位トリブトファン）との間の距離に適合しているからである。従って、このような距離は、対応するガラクトース転移酵素において、距離に大小がある場合、その距離に応じてスぺーサ一部分を変更することができる。そのような変更もまた、当該分野における技術常識の範囲内にある。

本発明の好ましい化合物として、一般式（I ) または（I I ) ：

[式中、 Xは Oまたは N Hであり、 nは 0〜6の整数であり、 mは 1〜6の整数であり、 Yは芳香族官能基であり、 Zは単結合または一 NH— C ( = 0) - C H ₂— O—である] で表される化合物が提供される。上記化合物において、糖部分は単糖誘導体であってもよい。また、水酸基おょぴァミノ基は、適切な保護基により保護されていてもよい。この保護基としては、ァセチル、ベンジル、ベンゾィル、 tープトキシカルボニルおよび t—ブチルジメチルシリル基などが挙げられる。

本発明の代表的な化合物としては、例えば、ゥリジン 5，一（2— O—ナフチルメチル一 α— D—ガラクトビラノシル）ジホスフェートニナトリウム塩、ゥリジン 5，一（2— Ο— { 2— （2—ナフチルメトキシエトキシ）エトキシ }ェチル）一 α—D—ガラクトビラノシル）ジホスフェートニナトリウム塩、ゥリジン 5，一（6— Ο— { 2— （2—ナフチルメトキシエトキシ）エトキシ }ェチル）一 α— D—ガラクトビラノシル）ジホスフェートニナトリウム塩などが挙げられるが、それらに限定されない。より好ましくは、そのような化合物としては、例えば、ゥリジン 5， - (2— O— {2_ (2—ナフチメトキシエトキシ）エトキシ }ェチル）一 _α— D—ガラタトピラノシル）ジホスフェートニナトリウム塩、ゥリジン 5， - (6— 0_{2— （2—ナフチルメトキシエトキシ）エトキシ }ェチル）一 α—D—ガラクトビラノシル）ジホスフヱ一トニナトリゥム塩などが挙げられるがそれらに限定されない。もっとも好ましくは、そのような化合物は、ゥリジン 5，一 (6 -0-{2 - (2—ナフチルメトキシエトキシ) エトキシ }ェチル）一 ct—D—ガラクトビラノシル）ジホスフェートニナトリゥム塩である。

別の局面において、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって提供され得るフアルマコフォアモデルに関する。そのようなフアルマコフォアモデルは、好ましくは、 β 1, 4一ガラクトース転移酵素の場合、本明細書に記載の酵素活性調節因子の設計法によつて導き出された原子の空間的配置を有するフアルマコフォアモデルであり得る。

このフアルマコフォアモデルでは、設計されたモデルに対して、回転可能な軸を有する場合は、そのような軸は、回転可能な角度全てのいずれかの点において原子配置を有する分子が本発明の範囲内に入ることが理解されるべきである。そのようなフアルマコフォアモデルについての一般的技術は、例えば、最新創薬化学（上 ·下） (Th e P r a c t i c e o f Me d i c i n a l Ch e m i s t r y) We r mu t h C. G. 編、長瀬博監訳、テクノミック（1 998) などを参照することができる。

別の好ましい局面において、本発明は、 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む化合物を含む、組成物を提供する。そのような組成物は、医薬、化粧品、農薬、食品（例えば、保健食品）、生化学研究、高分子生産など種々の分野において利用することができる。医薬であれば、本発明の組成物は、医薬に対して適用される基準および規制に適合している必要があり、他の分野においても同様の基準および規制が存在する場合、そのような基準および規制に適合している必要がある。好ましくは、このような調節因子は、阻害因子であ.り得るが、活性化因子であってもよい。

本発明の組成物は、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素が関与する状態、障害および疾患の予防、処置、診断、予後などに使用することができる。そのような状態、障害おょぴ疾患としては、例えば、がんまたはがんの転移、がんの薬剤耐性、感染疾患、慢性疾患（例えば、関節炎、慢性関節リウマチ）、糖尿病、動脈硬化のような循環器系の疾患などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明の組成物は、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素の活性を調節することによって、上記予防、処置、診断、予後などに用いることができる。調節活性は、好ましくは阻害活性であり得るが、活性化活性であってもよい。阻害活性であることが好ましい。 β 1， 4一ガラクトース転移酵素が担うガラクトースの転移が障害または疾患の発症に重大な役割を果たしている障害または疾患（例えば、ある種のがんの転移または薬剤耐性）に罹患する被検体に予防、処置（治療）または予後に適切な投与量を投与することによって、予防、処置、予後などを行うことができる。そのような投与は、経口投与であっても非経口投与であってもよい。非経口投与の場合、静脈注射、筋肉注射、皮下注射、直腸内投与、膣内投与、患部への直接投与などが挙げられるがそれらに限定されない。投与の経路に応じて、本発明の組成物は、適切な添加物を含むことができる。そのような添加物の選択および添加は、当該分野の技術範囲内にあり、例えば、日本薬局方第 1 4改正などを参照することによって当業者は容易に行うことができる。

従って、好ましい実施形態では、本発明の組成物は、 β 1 , 4 _ガラクトース転移酵素の活性を阻害するための組成物であり、より好ましくは、 β 1 , 4—ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患を処置または予防するための糸且成物である。

別の局面において、本発明は、 j3 1， 4一ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患を処置または予防するための方法に関する。この方法は、（a ) UD P— G a 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリプトフアンと相互作用し得る部分とを含む、化合物を被検体に投与する工程、を包含する。被検体は、 1， ' 4—ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患に罹患しているかまたはそのように予測されるのであれば、本発明の方法を適用することができるが、好ましくは、あらかじめ、そのような異常が原因であることを診断しておくことが有利であり得る。そのような診断は、当該分野において周知であり、例えば、被検体からサンプルを採取し、上記酵素の活性を、例えば生化学的に測定することによって判定することができる。

別の局面において、本発明は、 β 1 , 4一ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患を処置または予防するための医薬を製造するための、 U D P— G a 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリプトファンと相互作用し得る部分とを含む化合物の使用に関する。このような使用方法は、当該分野において周知であり、例えば、日本薬局方第 1 4改正などを参酌することによつて当業者は容易に実施することができる。あるいは、本発明は、本発明は、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患を処置または予防するための、 U D P— G a 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む化合物の使用に関する。このような使用方法は、上述の、予防、処置または予後の方法において詳述したとおりである。

別の局面において、本発明は、ガラクトース転移酵素上の U D P— G a 1結合部位と相互作用し得る A部分と、トリブトファンと相互作用し得る B部分とを含む、化合物を合成する方法を提供する。このような方法は、（a ) ガラクトース転移酵素上の U D P— G a 1結合部位と相互作用し得る A部分を提供する工程； ( b ) A部分において B部分またはスぺーサーを結合する部位以外を保護するェ程；（c ) B部分または該スぺ一サーを保護された A部分に結合させる工程；および（d ) ( c ) の生成物を脱保護する工程、を包含する。このような保護、脱保護は、当該分野において周知の方法を適宜選択して当業者は実施することができる。上記 A部分が糖（例えば、ガラクトース）である場合、そのような保護は、例えば、ァセチル化、 B o c化、 T r化、 S P hなどを用いて行うことができ、これらを組み合わせることによって、所望の部位（例えば、ガラクトースの 2位、 6位など）以外の部位を保護することができる。脱保護の手法は例えば、水素添加、加水分解などが挙げられるがそれらに限定されない。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載おょぴ技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。実施例

以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。以下の化合物設計の説明では、これらの G a 1 Tを例示として用いるが、これら以外の酵素であっても同様の設計が可能であることに留意するべきである。

(実施例 1 ： F R E T法による基質の改変）

β 1 , 4一 G a l T、 a 1 , 3 _ G a 1 Tについては X線結晶構造、基質特異性等、すでに多くの知見が得られている。これらの知見を基にして、 F R E T法を用いてこれらの酵素の活性測定を行うため、基質の蛍光基による改変を行うことができる。まず、選択した蛍光基は蛍光ドナーとしてナフチルメチル基、蛍光ァクセプタ一としてダンシル基である。ナフチルメチル基は 280 nmの光で励起し、 34 O nmの光を放射する。一方ダンシル基は 340 nmの光を励起し、 540 nm の光を発光する。この組み合わせでは、励起、重なり、観測波長帯がよく分離しており、さらに RO値が 2. 1 nm前後（R i c e K. G. , Wu Ρ· ， B r a n d L. , a n d L e e Y. C. ， (1 9 9 1) , B i o c h em i s t r y 30， 6 646— 6 6 5 5. )で分子動力学 (Mo l e c u l a r D y n am i c s) 計算により予想される蛍光基間距離（図 2 a、図 2 b) と比較して適当であり、また分子サイズが比較的小さいこと、安価に市販されており導入しやすいことなどから手頃であると思われる。

次に、糖ドナーである UDP— G a 1に蛍光ドナーであるナフチルメチル基を導入するが、前述の通りできるだけ蛍光基が酵素活性の邪魔にならない部位に適当な結合様式で結合させる必要がある。過去の基質類似物による酵素活性の検証についての報告によると、 Ga lの水酸基 2， 6位の修飾に関してはある程度の寛容性をもつことが示唆されている（図 I d) 。特に 6位水酸基の修飾では、ビォチンヒドラジドの様な巨大な置換基を導入したにも関わらず、転移活性があつたことが報告されている（Th oma s B. ， T h o m a s S. , D a r i u s— J e a n N. ， R i c a r d o G. G. ， He n r i k C. a n d

L o t h e r E. ，（200 1) ， Ch emB i o Ch em. 2, 884— 8 94. ) 。こういった報告を参考にして、有機合成、酵素を用いた合成の両手法を用いて、 UDP— Ga 1の Ga 1 2， 6位水酸基のナフチルメチル化について検討することができる。

まず 2位水酸基の修飾については、ナフチルメチル基を Oエーテル結合させた化合物（1) 、水素結合関与のプロトンを残すために NH結合で結合させた化合物（2) (三菱製紙（株）鷲谷博士から寄贈：参照北海道大学理学研究科平成 1 1年度博士論文 K i m i t o Wa s h i y a 「 S yn t h e s i s a n d ch a r a c t e r i z a t i o n o f Ph o t o s e n s i t i v e G l y c o c o n j g a t e s ： c h a t e r 4」 ) 、さらに巨大な置換基による酵素活性部位への影響を懸念して、水溶性スぺーサーを介して Oエーテル結合させた化合物（3) 、の 3種を設計した。次に 6位水酸基の修飾については、水溶性スぺーサーを介して Oエーテル結合させた化合物（4) 、水素結合関与のプロトンを残し、 NH結合で結合させた化合物（5) 、 NH結合型で疎水性スぺーサーを介した化合物（6) 、さらに過去の転移活性があった報告を参考にその結合様式を真似て、ヒドラジド結合型で結合させた化合物（7) の 4種を設計した（図 1 e) 。

次に、糖ァクセプターである G l cNAcのダンシル基による修飾について検討した。通常の糖ァクセプターは i3型グリコシド結合をしていることから、プロパノールスぺーサ一を介して、ダンシル基を j3ダリコシド結合させた類似物（8) を設計した。また、 a l， 3— G a 1 Τの糖ァクセプターは、 8と同様に、 L a cNAcにグリコシド結合でダンシル基を導入した化合物（9) を設計し、それぞれ合成した（図 1 f ) 。

(実施例 2 ：蛍光標識糖ドナーの合成）

(2. 1 2位水酸基の修飾）

以下に 2位水酸基 O—ナフチルメチルー UDP—ガラクトース誘導体（1) の合成について説明する（スキーム 1〜4) 。

<スキーム 1 (図 3 a) >

まず遊離のガラクトースを出発物質として、無水酢酸（Ac ₂0) 中、酢酸ナトリウム（Na OAc) を用い、ガラクトースダリコシド完全ァセチル（Ac) 体（10) を得た（48%) 。続いてガラクトースのァノマー位の保護のため、 BF₃ · E t ₂0、チォフエノール（P h SH) を用いて、チオフェニル（S P h) グリコシド体（1 1) を得た（91%) 。続いて、 11についてメタノール（MeOH) 中、 NaOMeを用いて脱 Ac 化を行い、抽出操作の後、続けてピリジン中トリフヱニルメチルクロリド（Tr 一 C 1) 、ジメチルァミノピリジン（DMAP) を用いて、ガラクトースの 6位水酸基選択的トリチル（T r ) 化を行い、水酸基 1， 6位保護のガラクトース誘導体（12) を得た（2工程： 90%) 。続いてジメトシキプロパン中、 CSA を用いて 3， 4位水酸基のイソプロピリデン化を行い、 2位水酸基のみ遊離のガラタトース誘導体（13) を得た（84%) 。

<スキーム 2 (図 3 b) >

2位水酸基のみ遊離のガラクトース誘導体（13) より、 2—プロモメチルナフタレン、水酸化バリウム {B a (OH) ₂} 、酸化バリウム（B aO) を用いて 2位水酸基をナフチルメチル化したガラクトース誘導体（14)を得た（94%)。 14の 3， 4， 6位水酸基は酸性条件で脱保護する保護基のため、後のリン酸基の導入を考えて、塩基性条件化で脱保護できるァセチル基に保護基を変換する。 14について 90%AcOH、 60°C中で脱トリチル、脱イソプロピリデン反応を行なった。続いて、ピリジン中、 Ac ₂0を用いてァセチル化を行い、目的物 (15) を得た（ 2工程： 95 %) 。

続いてアセトン一水中（20 ： 1) 、 N—ブロモスクシンィミド（NB S) を用いて SPh基を脱保護し、 1位水酸基遊離のガラクトース誘導体（16) を得た（76%) 。次に 16について、 N， N—ジァリルジイソプロピルフォスフォルアミダイト、 1H—テトラゾルを用いて 1位水酸基をリン酸ィ匕した（α ： 13 = 1 : 1) 。この反応について、 α型立体選択性を高めるため、温度（一 78°Cからー 40°C) 、溶媒 {ァセトニトリル (CH₃CN) 、テトラヒドロフラン（T HF) 、ジクロロメタン（CH₂C 1₂) 、プロピオ二トリル } について種々検討したが、改善は見られなかった。続いてこのァノマー混合物を t _ブチルハイド口ペルォキサイド（t B uOOH)を用いて酸化し、さらにトリェチルァミン（E t ₃N) を 0. 5 v%混合した溶出溶媒を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって α型、 ]3型リン酸ガラクトース誘導体を分離することに成功し、 αリン酸型ガラクトース誘導体（17) を得た（2工程： 44%) 。

<スキーム 3 (図 3 c) >

リン酸基のァリル保護基を脱保護するため、 17をテトラキストリフエニルフォスフィンパラジウム { (P h₃P) ₄P a} 、ジェチノレアミン（E t ₂NH) を用いて、脱ァリルリン酸保護を行い、リン酸基遊離のガラクトース誘導体 18を得た（83%) 。続いて 18をメタノール（MeOH) 、 E t ₂NHの 1 ： 1混合溶媒中で脱ァセチルイ匕を行い、さらにイオン交換樹脂 D o we X 50W-X 8 (N a ⁺) を用いてイオン交換を行ない、 2位水酸基を標識した "リン酸ガラクトース誘導体（19) を得た（81%) 。次に、 19とカップリング反応を行なうゥリジン 1リン酸（UMP) を活性化型 UMPへの変換を行なった。リン酸基を DCC存在下モルフォリンと反応させ、目的物である UMPモルフオリデート（20) を得た（73%) 。

ぐスキーム 4 (図 3 d) >

19、 20をピリジン中 1H—テトラゾール存在下でカップリング反応を行レ、、イオン交換樹脂 Do we X 5 OW-X 8 (N a ⁺) を用いて N a塩に変換し、最終目的物であるガラクトースの²位水酸基にナフチルメチル基を導入した UD P—ガラクトース誘導体 1を得た（ 64 %) 。

続いて 2位水酸基にトリエチレンダリコール鎖をリンカ一として介し、ナチルメチル基を導入した UDP—ガラクトース誘導体の合成を説明する。

<スキーム 5 (図 3 e) >

まず、トリエチレングリコールリンカーをナフチルメチル基とを結合させる。 3倍量のトリエチレングリコール存在下、 2—プロモメチルナフタレン、 NaH を用いてトリエチレンダリコールと反応させ、トリエチレングリコールの一方の水酸基にナフチルメチル基を導入した化合物（21) を得た（95%)。続いて、糖の水酸基との力ップリング反応を行なうため 21のもう一方の水酸基に脱離基 4001092

を導入する。 2 1を、パラトルエンスルフォエルクロリド（T o s— C 1 ) とピリジン溶媒中で反応させ、 2 1のもう一方の水酸基に脱離基（トシル（T o s y 1 ) 基）を導入した化合物（2 2) を得た（8 5%) 。次に、合成した 2 2を、 2位水酸基のみ遊離のガラクトース誘導体 1 3と、 N a Hを用いてカップリングを行い、この時点でシリカゲルカラムで精製しきれないため抽出操作の後続いて 9 0%A c OHを用いて、イソプロピリデン基、トリチル基の脱保護を行い 2位水酸基を蛍光標識した化合物（2 3) を得た（9 6%) 。次に A c ₂0、ピリジンを用いて糖水酸基のァセチル化を行い化合物（24) を得た（94%) 。次に NB S存在下、アセトンと水の混合溶媒（20 ： 1) 中で 1位水酸基のチォフエ -ル基 (S P h) の脱保護を行い、 1位水酸基遊離のガラクトース誘導体（2 5) を得た（ 7 0 %) 。

<スキーム 6 (図 3 f ) >

2 5を THF中 N， N—ジァリルジイソプロピルフォスフオルアミダイト、 1 H—テトラゾールを用いて、 1位水酸基のリン酸化を行なった。このとき、 α、グリコシドがほぼ 1 ： 1の割合で生成した。続いて、 t B uOOHを用いてリン酸アミダイトの酸ィヒ反応を行い、この段階で E t ₃N (0. 5 v%) を溶出溶媒に混合したシリカゲルカラムクロマトグラフィー用いて、純粋な αリン酸ガラクトース誘導体（2 6) を得た（3 8%) 。続いて、（P h ₃P) ₄P a、 E t ₂ NHを用いて脱ァリル反応を行い、リン酸基遊離のガラクトース誘導体（2 7) を得た（9 5%) 。続いて E t ₂NH、 Me OHの 1 ： 1混合溶媒中で脱ァセチル化を行い、 D ow e x 5 0W-X 8 (N a ⁺) を用いて N a塩とし、 2位水酸基のみ修飾した _αリン酸ガラクトース誘導体（2 8) を得た（9 5%) 。最後に、合成した化合物 2 8、 2 0を 1 H—テトラゾール存在下ピリジン中で反応させ、さらに D ow e x 5 0W-X 8 (N a +) を用いて N a塩とし、最終目的物であるガラクトース 2位水酸基にエチレングリコール鎖を介してナフチルメチル基を導入した UD P—ガラクトース誘導体（3) を得た（4 9 %)·。これらのスキーム 1〜6の詳細は、図 3にまとめられている。

(2. 2 6位水酸基の修飾）

以下に UDPガラクトースの 6位水酸基に O結合型でトリエチレンダリコールを介してナフチルメチル基を導入した誘導体（4) の合成を説明する（スキーム 7— 9) o

<スキーム 7 (図 4 a) >

まず先に調製した 21について、末端水酸基のクロリドへの変換を行なった。 21を DMF中、塩化チォニル（SOC l ₂) 、少量のピリジンを用いて末端水酸基のハロゲン化を行い、目的物（29) を得た（85%) 。次に、先に調製した 12について、 p—メトキシベンジルクロリド（MBn— C l) 、 NaHを用いて水酸基の MB n化を行い、目的物 30を得た（95%) 。次に、 IN HC 1を用いて脱トリチル保護を行い、 6位水酸基のみ遊離のガラクトース誘導体（3 1) を得た（92%) 。次に、先に調製した化合物 29と 31とを NaHを用いてカップリングし、ガラクトースの 6位水酸基にトリエチレングリコールを介してナフチルメチル基を導入したガラクトース誘導体（32) を得た（82%) 。次に、塩基性条件下で脱保護可能なァセチル基への水酸基保護基の変換を行なつた。 PhSH存在下、 2塩化スズを用いて一 78 °Cで反応を行い、 MB n保護基の脱保護を行なった。抽出操作を行なった後、 Ac₂0、ピリジン中で水酸基のァセチル化を行い、目的物（34) を得た（61%) 。

くスキーム 8 (図 4 b) >

合成した化合物 34を、アセトン一 H₂0 (20 ； 1) 中 NBSと反応させ、 1位水酸基遊離のガラクトース誘導体（35) を得た（77%) 。次に、 N， N -ジァリルジィソプロピルフォスフオルァミダイト、 1H—テトラゾールの存在下一 40°Cで反応させ、 E t ₃N (0. 5 v %) を溶出溶媒に混合したシリカゲルクロマトグラフィーによって 0；型リン酸フォスフアイトガラタトース誘導体 (36) を得た（49%) 。次に、 t B uOOHを用いてリン酸アミダイトを酸化し、 α型リン酸ガラクトース誘導体 37を得た（98%) 。次に、（Ph 3 P) 4P a、 E t ₂NHを用いて脱ァリル反応を行い、リン酸基遊離のガラクトース誘導体（38) を得た（91%) 。

<スキーム 9 (図 4 c) >

合成した化合物 38について、 E t ₂NH、

1 ： 1混合溶媒中で脱ァセチル化を行い、 6位水酸基にトリエチレングリコールを介してナフチルメチル基を導入した a型リン酸ガラクトース誘導体（39) を得た（88%) 。最後に、先に調製した化合物 20および化合物 39を、 1H—テトラゾール存在下ピリジン中でカップリングし、続いて Do we X 50W— X8 (Na+) を用いて N a塩に変換し、 6位水酸基にトリエチレングリコールを介してナフチルメチル基を導入した UDP—ガラクトース誘導体（4) を得た（41%) 。

これらのスキームは、図 4にまとめられている。 (2. 3 酵素を用いた修飾）

UDP—ガラクトースの 6位水酸基に N結合型修飾した誘導体（5， 6， 7) の合成について説明する（スキーム 10〜14) 。このスキームは図 5にまとめられている。

くスキーム 10 (図 5 a) >

UDP—ガラクトースを、 0. 5 mM硫酸銅の溶けた 5 OmMリン酸バッファ一 ( H 6. 0) に溶かし、ガラクトースォキシダーゼ（GAO) 、カタラーゼ（CAT) を加えガラクトースの 6位水酸基を酸化し、続いてナフチルメチルアミンを TF Aで処理し、 TF A塩とした後、反応溶液中に THFを用いて混合、得られるシッフ塩基を N a B H₃ C Nで還元することでガラクトース 6位水酸基をァミンへ変換し、ナフチルメチル基を導入した UDP—ガラクトース類似物 (6) を得た（31%) 。 <スキーム 11 (図 5 b) >

まずァミノへキサノールを出発物質とし、 2— t—プチルォキシカルボニル一ォキシィミノ _ 2—フエ二ルァセトニトリル（Bo c -ON) を E t ₃N存在下で反応させ、アミノ基を B o c保護した B o cーァミノへキサノール（40) を得た（92%) 。次に、 THF中で N a Hを用いて選択的に水酸基をアルコキシドィ匕し、 2—ブロモメチルナフタレン、テトラプチルアンモニゥムフルオリド（T BAF)を加え、蛍光標識 B o c—ァミノへキサノール（41)を得た（63%)。

<スキーム 12 (図 5 c) >

スキーム 10と同様にして、 GAO、 CATを用いて、 UDP—ガラクトースの 6位水酸基を酸化し、同時に先に合成した 41を 50%TF Aで処理し脱アミノ保護を行い、ァミンの TFA塩（42) を得た。 42を酸化した UDP—ガラクトース誘導体に加え、還元アミノ化により 6位水酸基にへキサノールを介してナフチルメチル基を導入した UDP—ガラクトース誘導体 7を得た（5%) 。くスキーム 13 (図 5 d) >

先に合成した 21を出発物質とし、 2クロム酸カリウム、硫酸を用いた J o h n e s酸化により、末端水酸基をカルボン酸へ変換し目的物（43) を得た (9 2%) 。次に、ペンタフルオロフェニルートリフルォロアセテート (p f p— T FA)をピリジン中で反応させ、 p f p活性エステル化物（44)を得た（91%)。次に、 tーブチルカルバゼ一ト（B o cヒドラジン）を 44と反応させ、末端ヒドラジド型の蛍光プローブ（45) を得た（76%) 。

<スキーム 14 (図 5 e) >

先に合成した 45を 50%TFAで処理し、脱ァミノ保護を行い TF A塩（4 6) を得た。スキーム 10と同様にして、 GAO、 CATを用いて UDP—ガラクトースの 6位水酸基を酸化し 46を加え、還元アミノ化により最終目的物である 6位水酸基にヒドラジド結合型で、エチレンダリコールを介してナフチルメチル基を導入した UDP—ガラクトース誘導体（5) を得た（37%) 。 (実施例 3 ：蛍光標識糖ァクセプターの合成）

(3. 1 β 1， 4型酵素基質）

以下に i31， 4型酵素基質である N—ァセチルーダルコサミンをダンシル基蛍光標識した化合物の合成について説明する（スキーム 15〜16) 。これらのスキームは図 6にまとめられている。

<スキーム 15 (図 6 a) >

遊離のダルコサミンを出発物質とし、 Ac₂0、ピリジンを用いて完全ァセチル体（47) を得た（89%) 。次に TMSOT f、 E t ₃Nを用いてォキサゾリンを経由させ、 Z—ァミノプロパノールプロパノール、 CS Aを加えて ]3型立体選択的グリコシデーシヨンを行い、 G l c NAc— Z—ァミノプロパノールグリコシド（48) を得た（79%) 。

' くスキーム 16 (図 6 b) >

合成した化合物 48を、 Me OH中 N a OMeを用いて脱ァセチル化、続いて 10%P d— C触媒を用いて水素添加反応により Z基を脱保護し、さらにダンシルクロリド（Da n_C l) 、 E t ₃Nを用いてァミンのダンシル化を行い、最終目的物であるダンシル基修飾した G 1 cNAc (8)を得た（71%: 3工程）。

(3. 2 « 1, 3型酵素基質）

以下に _α 1， 3型酵素基質である Ν—ァセチルーラクトサミンをダンシル基蛍光標識した化合物の合成について説明する（スキーム 17) 。このスキームは図 7に示される。

<スキーム 17 (図 7) >

β 1， 4—ガラクトース転移酵素を用いて、先に合成した 8にガラクトースを転移させ、目的物であるダンシル基蛍光標識した L a cNAc (9) を得た（9 2%) 。 (実施例 4 ：薄層クロマトグラフィー）

(4. 1 一般的な方法）

薄層クロマトグラフィー（TLC) 用グラスプレートは Me r c k (D a r m s t a d t, Ge rma ny)より購入し、化合物の発色にはァニスアルデヒド、カメレオン、 Mo発色液、ニンヒドリンスプレーを使用し、 150°Cのプレート上で焼成した。クロマトグラフィー用シリカゲルは関東化学（東京、日本）のシリ力ゲル 6 ON (100〜210μπι) を使用。まだ IATRON LABOL ATOR I ES社（東京、日本）からィァトロビーズ 6RS— 8060を購入し使用した。 NMRスペクトル測定には BRUKER社（茨城、日本） AVANC Ε 600 [1 Η 600 ΜΗ ζ] 、 500 [1 Η 500 ΜΗ ζ ] を使用した。 MALD I— TO F— MAS Sは BRUKER社 B I F LEXを使用した。蛍光検出には P e r k i n E lme r社（横浜、日本） Lumi n e s c e n c e s p e c t r o ph o t ome t e r L S— 50 B 使用し 7こ。限外ろ過には D e nv e r I n s t r ume n t社（A r v a d a, USA) F o r c e 200を使用した。質量分析（FAB— MAS S)には J EOL社（東京、日本） JMS—HX110を使用した（北海道大学機器分析センター質量分析室へ依頼した）。高速液体クロマトグラフィー（HPLC) は日立（東京、日本） L一 7100送液ポンプ、逆層 ODSカラム（46mmX 250mm) を用い、サンプル検出には日立 L一 7400UV検出器、蛍光検出器を使用した。全ての有機溶媒は第 1級ダレ—ド溶媒を使用した。全ての試薬は、和光純薬（大阪、日本）、東京化成（東京、日本）、 S i gma-Al d r i c (東京、日本）、純正化学（東京、日本）、 Ca r b i o c h em (S a n D i e g o, US A)、ペプチド研究所（大阪、日本）から購入した。 i31， 4-Ga 1 T (ヒト）は東洋紡績（大阪、日本）、 a l， 3— Ga l Tは Ca r b i o c h e m社から購入した。 (実施例 5 ：蛍光標識 U DP—ガラクトース類似物の合成）

(5. 1 2， 3， 4， 6—テトラ一0—ァセチルー ]3—D—ガラタトピラノシド（10) の合成）

無水酢酸（300mL) に酢酸ナトリウム（28. 46 g, 1. 25当量）を加え、 110°Cで撹拌し、遊離のガラクトース（50 g, 278mmo 1 ) を加え、 2時間撹拌した。反応終結確認後、常温に戻し蒸留水を大量に加え、 30分撹拌した後 CHC 1₃を加え、蒸留、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出、洗浄し、 Mg S0₄で脱水した。 Mg S0₄をセラィトろ過した後、減圧濃縮し、 E t OH に溶かし冷蔵庫でー晚放置して結晶化させ、目的物 10 (51. 28 g, 47%) を得た。

(5. 2 フエニル 2， 3， 4， 6—テトラー O—ァセチル _ 1ーチォ一一 £)一ガラクトピラノシド（11) の合成）

化合物 10 (5 g， 12. 8mmo 1) を CH₂C 1 2 (7 OmL) に溶かし、

Mo l e c u l a r S i e v e s 3A (2. 0 g) 、チオフエノ一ノレ (2. 6 lmL, 2当量）を加え、窒素置換した。 BF₃ · E t ₂0 (1. 6 lmL, 1 当量）を加え、温で 2時間撹拌した。 BF₃ ' E t ₂〇（0， 5mL) をさらに加え、 2時間撹拌した。反応終結確認後、氷浴中で飽和重曹水を加え、セライトろ過した後、分液ロートを用いて CH₂C 1₂層を分取した。分離した CH₂C 1₂ 層を、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出、洗浄し、 Mg S0₄で脱水した。セライトろ過、減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン： E tOAc = 4 ： 1) で精製し、目的物（11) (5. 11 g， 91%) を得た。 (5. 3 フエニル 6— O—トリフエニルメチル一 1ーチォ _ /3— D—ガラクトピラノシド（12) の合成）化合物 11 (8· 42 g, 19. 1 mmo 1) を Me OH (14 OmL) に溶かし、 NaOMe (52mg, 0. 05当量）を加え、常温で 1時間撹拌した。反応終結確認後、 Dowe x 50W-X8 (H+) で中和し、セライトろ過の後、減圧濃縮した。次にピリジン（8 OmL) を加え、 Tr— C 1 (6. 9 g, 1. 3当量）、 DMAP (1. 17 g, 0. 5当量）を加え、 50°Cで 20時間撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (CHC 13： MeOH=30 ： 1) で精製し、目的物 12 (9. 4 g, 95%) を得た。 (5. 4 フエ二ノレ 3， 4一 O—イソプロピリジデン一 1—チォー 6—0—トリフエ二ルメチルー i3—D—ガラクトピラノシド（13) )

化合物 12 (11. 5 g， 22. 3 mmo 1 ) を 2— 2—ジメトキシプロパン (30 OmL) に溶かし、 C S A (18 Omg， 0. 035当量）を加え、室温で 24時間撹拌した。反応終結確認後、 E t ₃N (110 μ L, 0. 035当量）を加え中和し減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t OAc = 6 ： 1〜4 ： 1) で精製し、 E t OHで結晶化し、目的物（13) (10. 4 g， 84%) を得た。

(5. 5 フエニル 3， 4一 O—イソプロピリジデン一2— O—ナフチルメチルー 1_チォ一 6— O—トリフエ二ルメチルー 3_D—ガラクトピラノシド（1 4) の合成）

化合物 13 (2. O g， 3. 6 mmo 1 ) を DMF (5 OmL) に溶かし、 B a O (2. 07 g, 10. 8 mmo 1 ) 、 B a (OH) ₂ (1. 74 g, 5， 4 mmo 1 ) 、 2—ブロモメチルナフタレン（1. 66 g， 7. 2 mm o 1 ) を加え、常温で 7時間撹拌した。さらに 2—ブロモメチルナフタレン（0. 83 g， 3. 6 mmo 1) を加え、常温でー晚撹拌した。 T L Cにて反応終結確認後、沈殿物をセライトろ過し、ろ液を減圧濃縮、得られた残渣を CHC 1₃に溶かし飽和食塩水で洗浄し、 CHC 1₃層を分離、 Mg S0₄を加え脱水した。 Mg S0₄ をセライトろ過し、残渣を減圧濃縮した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ一（へキサン： E t OAc = 1 2： 1) で精製し、目的物（14) (2. 35 g， 93. 8%) を得た。

14 ： ^XH-NMR (40 OMH z， CDC 1₃, 27°C) : 7. 1 7— 7. 8 3 (m， 27H, フエニル X4，ナフタレン）， 4. 98 (d， 1 H， OCHH 一ナフタレン）， 4. 84 (d, 1 H， OCHH—ナフタレン）， 4, 61 (d, 1H， J 1, 2 = 9. 8Hz， H— 1) ， 4. 22 (t， 1 H， J 3， 4 = 5. 9Hz, H- 3) ， 4. 08-4. 14 (m， 1 H， H—4) , 3. 67 (m，

1H， H- 5) ， 3. 51-3. 61 (m， 2 H， J 2， 3 = 6. 4Hz， J 6 a, b = 9. 8Hz， J 5， 6 b = 7. 1Hz, H_2, H- 6 b) ， 3. 32 (d d, 1 H, J 5, 6 a =4. 7Hz， H— 6 a) , 1. 35 (s， 3 H， C CH₃) , 1. 23 (s， 3H， CCH₃) 。 C ₄₅H₄₂ O ₅ Sについての分析計算値： C， 77. 78 H, 6. 09 S, 4. 61。実測値： C， 78. 37 H， 6. 19 S， 4. 57。 C₄₅H₄₃〇₅Sについての HRMS計算値： [M+H] + 695. 2831，実測値： 695. 2800。

(5. 6 フエニル 3， 4， 6—トリー O—ァセチノレ _ 2— O—ナフテノレメチル一 1一チォ一 j3— D—ガラクトピラノシド（15) の合成）

化合物 14 (3. 0 g， 4. 32mmo 1 ) を混合溶媒（酢酸：水 = 9 ： 1 8 OmL) に溶かし、 60 °Cで 3時間撹拌した。 T L Cで反応終結確認後、減圧濃縮した。得られた残渣をピリジン（5 OmL) に溶かし、無水酢酸（20raL) を加え、常温で一晩撹拌した。 T L Cで反応終結確認後、減圧濃縮し氷水を加え、 CHC 1₃を加えた。 IN H₂S0₄，飽和重曹水，飽和食塩水で抽出、洗浄し、 CHC 1₃層を分離、 Mg S0₄で脱水した。 Mg S0₄をセライトろ過した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t OAc = 2 ： 1) で精製し、目的物（15) (2. 21 g， 95%) を得た。

15 ： ^XH-NMR (400MHz， CDC 1₃, 27°C) ： 7. 25-7. 8

3 (m， 12H，フエ二ノレ，ナフタレン）， 5. 41 (d, 1 H, H— 4) ， 5. 05 (d d, 1H， J 3, 4 = 3. 2H z , H— 3) ， 5. 02 (d， 1 H， O

CHH—ナフタレン）， 4. 77 (d, 1H， OCHH—ナフタレン）， 4. 7

4 (d, 1H， J l， 2-9. 7Hz， H—l) ， 4. 21 (d d, 1 H, J 6 a, b = 11. 3Hz， J 5, 6 b = 7. ΟΗζ, Η— 6 b) ， 4. 10 (d d, 1H, J 5, 6 a = 6. lHz， H_6 a) ， 3. 90 ( t , 1 H， H— 5) ， 3. 80 (t, 1H， J 2, 3 = 9. 7H z , H_2) ， 2. 10 (s， 3 H， Ac) , 2. 03 (s, 3H， Ac) , 1. 88 (s， 3 H, Ac) 。 C29H 30 O 8 Sについての分析計算値： C， 64. 67 H， 5. 61 S， 5. 9 5. 実測値： C， 64. 59 H， 5. 61 S, 5. 94. C₂₉H₃₁〇₈Sについての HRMS計算値： [M+H] + 539. 1740, 実測値： 539. 1360。

(5. 7 3， 4， 6—トリー O—ァセチル _ 2—O—ナフチルメチルー D— ガラクトピラノース（16) の合成）

化合物 15を混合溶媒（アセトン：水 =19 ： 1 2 OmL) に溶かし、 N— プロモスクシンイミド（0. 993 g， 5. 58 mm o 1 ) を加え、常温で 2時間撹拌した。 TLCにて反応終結確認後、減圧濃縮し CHC 1₃に溶かし、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出、洗浄し、 CHC 1₃層を分離、 Mg S0₄を加えて脱水した。 Mg S0₄をセライトろ過した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トノレェン： E t OAc = 3 ： 1) で精製し、目的物（16) (6 20 m g , 74. 9 %) を得た。

16 ： ^ NMR (600MHz, CDC 1₃， 27°C) ： 7. 81-7. 8 4 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 4 3 - 7. 5 0 (m， 3 H，ナフタレン）， 5. 4 3 (d， 0. 6H， H-4 a) ， 5. 3 3 - 5. 3 7 (m， 1. 6 H， H - l a, H- 3 a, H-4 β) ， 5. 0 0— 5. 0 5 (m， 1 H, H- 3 β , 〇 CHH—ナフタレン一）， 4. 8 0 -4. 8 6 (m， 2H， OCHH—ナフタレン一 α， OCHH—ナフタレン一， H— 1 ）， 4. 4 2 ( t， 0. 6 H， H- 5 a) ， 4. 1 0 (d, 1 H， H— 6 j3， H— 5 i3) ， 4. 0 2 - 4. 0 8

(m， 1. 2H, H- 6 a) , 3. 8 8 - 3. 9 0 (m， 1. 2 H, H- 2 a, - 6 β) ， 3. 6 6 (m， 0. 4H， H- 2 β) ， 1. 94 - 2. 0 8 (m， 9H， A c X 3) 。

(5. 8 ジァリル一 3， 4， 6—トリ— O—ァセチル— 2— O—ナフチルメチル一 α—D—ガラクトピラノシルホスフェート（1 7) の合成）

化合物 1 6 (5 2 2mg, 1. 1 6 mm o 1 ) を CH₃CN (1 0mL) に溶かし、ジァリル一 N， N—ジイソプロピルホスホロアミダイト（0. 4 6mL， 1. 74mmo l) 、 1 H—テトラゾール（テトラゾール）（1 4 6mg， 2.

0 9 mm o 1 ) を加え、一 40 で 4時間撹拌した。 T L Cで反応終結確認後、減圧濃縮し、 E t OA cを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出、洗浄し、 E t OA c層を分離し、 Mg S0₄で脱水した。 Mg S0₄をセライトろ過した後、減圧濃縮した。続いて残渣を THF (1 OmL) に溶かし、 E t ₃N (1. 6 5m L， 1 1. 6mmo 1 ) を力 Qえた。一 1 0°Cに冷却後、 t B uOOH (0. 6 9 mL， 3. 4 8mmo 1 ) を加え、 _ 1 0 °Cで 2時間撹拌した。 TLCにて反応終結確認後、減圧濃縮し E t OA cを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出、洗浄し E t OA c層を分離、 Mg S0₄で脱水した。 Mg S O₄をセライトろ過した後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン： E t OA c = 2 0 : 1 E t ₃N 0. 5 v%含有）で精製し、目的物（1 7) (3 8 5m g, 54%) を得た。 1 7 ： ¹H— NMR (6 0 0MH z , CDC 1 ₃, 2 7°C) ： 7. 8 3 (m, 4 H，ナフタレン）， 7· 4 6 (m， 3Η，ナフタレン）， 6. 0 2 (d d, 1 H， J 1 , P= 7. 1 H z , J 1 , 2 = 3. 3H z， H— 1) ， 5. 8 0— 5. 9 6

(m, 2H， CH₂ = CHCH₂-X 2) , 5. 4 7 (d， 1 H， H— 4) ， 5. 1 2 - 5. 40 (m， 4H, CH₂ = CHCH₂— X 2) ， 5. 3 3 (d d, 1 H, J 3， 4 = 3. 3H z , H- 3) , 4. 9 3 (d， 1 H， OCHH—ナフタレン），

4. 7 9 (d, 1 H， OCHH—ナフタレン）， 4. 5 1— 4. 6 0 (m， 4H, CH₂ = CHCH₂-X 2) ， 4. 4 1 ( t， 1 H, J 5, 6 = 6. 6 H z , H— 5) ， 4. 0 8 (d， 2H， H- 6 a , H- 6 b) ， 3. 9 6 (d t , 1 H， J 2, 3 = 1 0. 5H z， H— 2) ， 2. 0 8 ( s， 3 H， A c) , 2. 0 1 ( s，

6H, A c X 2) 。 C₂₉H₃₅0₁₂Pについての分析計算値： C， 5 7. 4 2 H，

5. 8 1. 実測値： C， 5 7. 4 1 H， 6. 0 3. 。

(5. 9 3， 4， 6—トリー O—ァセチルー 2— 0_ナフチルメチルー α— D—ガラクトピラノシルホスフェート E t ₃Ν塩（1 8) の合成）

化合物 1 7 (6 7 6mg, 1. 1 1 mm o 1 ) を THF (1 OmL) に溶かし、 E t ₂NH (2. 3 2mL， 2 2. 3 mm o 1 ) とテトラキス（トリフエニノレホスフイン）パラジウム { (P h₃P) ₄P a } (2 5 7mg, 2 2 3 μπιο 1 ) を加え、常温で一晚撹拌した。 TLCにて反応終結確認後、減圧濃縮し、ィァトロビーズカラムクロマトグラフィー（CHC 1 ₃ :Me OH= 6 ： 1 E t ₃N 0. 5 v%含有）で精製し、目的物（1 8) (6 6 4mg, 9 5%) を得た。

1 8 ： ^-NMR (6 0 OMH z , CDC 1 ₃， 2 7°C) ： 7. 7 5 (m, 4 H，ナフタレン）， 7. 4 3 (m， 3H，ナフタレン）， 6 · 04 (d d， 1 H， J l, P= 7. 2H z， J l， 2 = 3. 3H z， H— l) ， 5. 4 5 (d d, 1 H, J 3, 4 = 3. 4H z , H— 3) , 5. 44 ( s， 1 H， H— 4) ， 5. 0 0 (d, 1 H， OCHH—ナフタレン）， 4. 7 0 (d， 1 H， OCHH—ナフタレン）， 4. 60 ( t , 1Η， Η- 5) ， 4. 1 8 (d d， 1 Η，· J 5, 6 b =8. 3Ηζ， J 6 a , b = 1 0. 7Η ζ , Η- 6 b) , 4. 06 (d d， 1Η， J 5， 6 a = 5. 9Ηζ， Η— 6 a) ， 3. 94 (d t , 1 Η, J 2， 3 = 9. 6Hz， H— 2)， 2. 72 (d d, 1 OH, CH₃CH₂NX 5) , 2. 07 (s, 3H， Ac)， 2. 02 (s， 3H， Ac) , 1. 9 7 (s， 3 H， Ac) ， 1.

06-1. 1 1 (d d, 1 5H， CH₃CH₂NX 5) 。 C 2 9H43NO 1 2 P についての HRMS計算値： [M+H+E t 3N] + 6 28. 25 23，実測値： 6 28. 25 2 7。 (5. 1 0 2— O—ナフチルメチルー a— D—ガラクトビラノシルホスフエ一トニナトリウム塩 (1 9) の合成）

化合物 1 8 (20 Omg, 0. 3 1 9 mm o 1 ) を Me OH (3mL) に溶かし、 E t ₂NH (2mL) を加え、常温で一晩撹拌した。 TLCで反応終結確認後、減圧濃縮した。続いて残渣を陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（DE AE S e p a c e 1 ： 50 mM 炭酸アンモニゥム）で精製、減圧濃縮し、残渣を陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（D owe X 50W-X8 [H +] と Dowe x 50W-X8 [N a ⁺] ) を用いて N a塩とし、目的物 1 9 ( 1 34 m g， 9 5%) を得た。

1 9： ^XH-NMR (6 00MH z， D₂0， 2 7°C) : 7. 5 8 (d, 2H，ナフタレン）， 7. 64 (d， 1H，ナフタレン）， 7. 9 9 (m， 4 H, ナフタレン）， 5. 76 (d d， 1 H, J 1, P= 7 · 2Hz, J 1, 2 = 3. 5H z， H— 1) , 4. 98 (d, 1H， OCHH—ナフタレン）， 4. 76 (d, 1 H, OCHH—ナフタレン）， 4. 1 5 (t， 1 H, J 5, 6 = 6. 1Hz, H- 5) ， 4. 04 (d, 1 H， H_4) ， 4. 03 (d d, 1 H, J 3, 4 = 3. 3Hz， H— 3) ， 3. 84 (d t , 1H， J 2, 3 = 9. 8Hz, H— 2) ，

3. 70-3. 7 7 (m， 2 H, J 5, 6 a = 5. 1Hz, J 5, 6 b = 7. 3 Hz, J 6 a, b = 1 1. 8Hz， H-6 a, H— 6 b) 。 0. 6当量 H₂0 を含む C₁₇H₁₉〇₉P ₁Na ₂についての分析計算値： C， 44. 87 H， 4. 47。実 |J値： C， 44. 90 H， 4. 68. C ₇H₂。0₉N a ₂ Pについての HRMS計算値： [M+H] + 445. 0640, 実測値： 445. 0651。

(5. 1 1 ゥリジン 5， _モノホスホモルホリデ一ト 4_モルホリン一 N， N，ージシクロへキシルカルポキサミジン塩（20) の合成）

UMPニナトリウム塩（50 Omg, 1. 35 mm o 1 ) を D o w e x 50 W-X 8 (H+) にかけ凍結乾燥した。 DMF (15mL) に溶かし、モルホリン（472 L， 4当量）、 DCC (1. 12 g， 4当量）を加え、常温で一晚撹拌し、さらに 5 0°Cで一晩撹拌した。反応終結確認後、セライトろ過し、減圧濃縮した。蒸留水、エーテルを加え 3回洗浄し、水槽を分取し、減圧濃縮した。残渣を Me OHに溶かし結晶化し、目的物 20 (682mg， 73%) を得た。 (5. 12 ゥリジン 5， - (2— O—ナフチルメチルー α— D—ガラクトビラノシル）ジホスフェートニナトリウム塩（1) の合成）

ィ匕合物 1 9 (2 Omg, 33 μπιο 1)を陽ィオン交換力ラム（Dowe x 5 0W-X 8 [H+] と Dowe X 50W-X 8 [E t ₃NH+] ) を用いて E t ₃ N塩とし、凍結乾燥した。得られた化合物をピリジン（lmL) に溶かし、 20 ( 45. 6mg， 66 xmo l) 、 1 H—テトラゾーノレ (9. 30mg， 1. 3

3 μπιο 1) を加え、常温でー晚撹拌した。 TLCで反応終結確認後、脱イオン水（5mL) を加え、エーテルで 3回抽出し、水層を分取し減圧濃縮した。残渣を陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（DEAE S e p h a c e K 50 〜10 OmM炭酸アンモニゥム）にて精製、減圧濃縮し、さらにゲルろ過カラムクロマトグラフィー（S e p h a d e X G— 10，溶離液 =水）によって精製し、 Dowe x 50W-X 8 (N a +) を用いて Na塩とし、目的物（1) (1 2 m g， 4 8%) を得た。

1 ： ^NMR (6 0 0MH z , D₂0， 2 7°C) : 7. 9 2 (m, 4H，ナフタレン）， 7· 6 1 (m, 2Η，ナフタレン， Η— 5) , 7. 5 5 (m， 2 H, ナフタレン）， 5. 9 1 (d d, 1 H， J 1" , P= 7. 3H z， J 1" , 2" = 3. 4 6 H z , H' ' — 1) ， 5. 7 5 (d, 1 H， J 1 ' ， 2 ' = 4. 6 H z， H' — 1) ， 5. 6 1 (d， 1 H， H— 6) ， 5. 0 3 (d, 1 H， OCH H—ナフタレン）， 4. 8 1 (d， 1 H， OCHH—ナフタレン）， 4. 2 5 (d d d, 1 H， J 5 ' a, b = 1 1. 4H z， H' — 5)， 4. 1 5 - 4. 2 1 (m, 3H, H' — 4， H， — 5， H，， _ 5) ， 4. 1 2 ( t， 1 H， J 3 ' , 4， = 5. l H z， H，— 3)， 4. 0 6 -4. 0 8 (m, 2 H， H，，一 3 , H，，一 4 )， 4. 0 2 ( t， 1 H, J 2，， 3 ' = 9. 9 H z， H， _ 2) ， 3. 8 5 (m， 1 H， J 2" , 3 " = 9. 9 H z， H" — 2 ) , 3. 7 8 (d d, 1 H， J 5" , 6 " b = 7. 3H z， J 6 ' ' a, b = l l . 7 H z , H" - 6 b) , 3. 7 3 (d d, 1 H， J 5"， 6" a = 5. 1 H z， H" — 6 a ) . 2当量の水を含有する C₂₆H₃₀O₁₇N₂P₂N a ₂についての分析計算値： C， 3 9. 7 1 H， 4 ·

3 5 N. 3. 5 6。実測値： C， 3 9. 7 5 H4. 1 0 N， 3. 6 9。

(5. 1 3 2 - [2 - ( 2 _ナフチルメトキシエトキシ）エトキシ J ェタノ —ル（2 1) の合成）

トリエチレングリコール（3 9 9 L， 3mmo 1 ) を (8mL) に溶かし、 0°Cに冷却した後、 N a H (3 6mg， l mmo l ) を加えた。 3 0分後、 2—プロモメチルナフタレン（2 7 6mg， 1. 2mmo 1 ) を加え、 0°Cで 1 時間撹拌し、さらに N a H (1 8mg， 0. 5 mm o 1 ) を加え 1時間撹拌した。 TLCで反応終結を確認後、 Me OH (3mL) を加え、減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン： E t OA c = 3： 1〜1 ： 1) で精製し、目的物 2 1 (2 0 2mg, 7 0%) を得た。 21 ： ^-NMR (60 OMH z , CDC 1₃, 27°C) ： 7. 79— 7. 8 3 (d d, 4H，ナフタレン） , 7. 46- 7. 49 (m， 3 H，ナフタレン）， 4. 73 (s， 2H, OCH₂—ナフタレン）， 3. 70 (m， 1 OH, [OC H₂CH₂] ， OCH₂CH₂OH) , 3. 61 (m, 2H， [OGH₂CH₂] ) 。

(5. 14 2- [2- (2—ナフチルメトキシエトキシ）エトキシ] ェチル ρ -トノレエンスノレホネ一ト (22) の合成)

化合物 21 (3. 6 g, 33mmo 1 ) をピリジン（11 OmL) に溶かし、 p—トノレェン一スノレホニノレクロリド（9. 46 g, 49. 5mmo l) を加え、常温で 2時間撹拌した。 TLCにて反応終結確認後、減圧濃縮し、シリカゲル力ラムクロマトグラフィー（トルエン： E t OAc = 2 ： 1) で精製し、目的物 2 2 (10. 1 g， 69%) を得た。

22 ： ^-NMR (60 ΟΜΗζ, CDC 1₃， 27°C) ： 7. 83 (m， 2 H，トルエン）， 7. 78 (m， 4H，ナフタレン）， 7· 47 (m， 3 H，ナフタレン）， 7. 30 (m, 2H，トルエン）， 4. 72 ( s , 2H, OCH₂ —ナフタレン）， 4. 15 (m， 2H， OCH₂CH₂OT o s) , 3. 66— 3. 68 (m， 1 OH, [OCH₂CH₂] ) , 2. 41 ( s , 3H， CH₃_フエ二ル）。

(5. 15 フエニル 2— O— (2— [2 - { 2—ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル）一 1—チォ __α— D—ガラクトピラノシド（23) の合成）化合物 13 (3 g， 5. 4mmo 1 ) を DMF (5 OmL) に溶かし、氷冷下で NaH (356mg， 1. 8当量）を加え、 30分間撹拌した後、化合物 21 (3. 5 g， 1. 5当量）を加え、水冷下 2時間撹拌し、さらに常温でー晚撹拌した。 TLCにて反応終結を確認後、 MeOHを加え、減圧濃縮した。残渣を混合溶媒（酢酸：水 =9 : 1 8 OmL) に溶かし、 50°Cで 2時間撹拌し、 TL Cで反応終結確認後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ一 (CHC 13 ： Me OH= 50 ： 1〜30 ： 1) で精製し、目的物 23 (2.

8 g， 95%) を得た。

'H-NMR (60 ΟΜΗζ, CDC 1₃， 27°C) : 7. 78- 7. 82 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 44-7. 51 (m， 5 H, ナフタレン，フエ二ノレ）， 7. 21-7. 29 (m， 3 H, フエニル） , 4. 72 (d, 2 H, OCH₂_ ナフタレン）， 4. 49 (d， 1 H, J l， 2 = 9. 4Hz, H—l) ， 4. 0

9 (d t , 1H， J 3， 2 = 9. 7Hz, J 3, 4 = 3. 6Hz, H_3) ， 3. 87 (d d, 1H， J 6 a, b = 11. 8Hz， H— 6) ， 3. 79 ( d , 1 H, H-4) , 3. 64-3. 71 (m, 11 H, [OCH₂CH₂] ， H— 6) ， 3.

51-3. 58 (m， 3H， [OCH₂CH₂] ， H_2) ， 3. 36 (d d d, 1H， J 5， 6 = 6. 7Hz, H— 5) . C₂₉H₃₇0₈ Sについての HRMS計算値： [M+H] + 545. 2209, 実測値： 545. 2183。 (5. 16 フエニル 3， 4， 6—トリ— O—ァセチルー 2— O— (2— [2

― {2—ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル）一1—チォー j3—D— ガラクトピラノシド (24) の合成)

化合物 23 (4. 9 g， 9mmo 1 ) をピリジン（60mL) に溶かし、無水酢酸（17mL)を加え、常温で 6時間撹拌した。 TLCにて反応終結を確認後、減圧濃縮し、 CHC 1₃を加え、 IN H₂S0₄、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出、洗浄し、 CHC 1₃層を分離し、 Mg S〇₄を加えて脱水した。 Mg S0₄をセライトろ過後、減圧濃縮して 24 (5. 7 g, 94%) を得た。

24 ： 'H-NMR (600MHz, CDC 1₃, 27°C) : 7. 80 (m， 4

H，ナフタレン）， Ί . 55 (m， 2H，フエニル）， 7. 46 (m， 3 H，ナフタレン）， 7. 28 (m， 3 H，フエ二ノレ）， 5. 37 (d， 1 H, H-4) ,

4. 97 (d d, 1H， J 3, 4 = 3. 4Hz， H— 3) ， 4. 72 (s, 2H， OCH₂—ナフタレン）， 4. 63 (d, 1 H， J l， 2 = 9. 7H z， H—l) ， 4. 1 4 (d d, 1 H， J 5, 6 b = 7. 0H z， J 6 a, b = 1 1. 3 H z， H- 6 b) , 4. 0 8 (d d, 1 H, J 5, 6 a = 6. 2H z， H— 6 a) ， 3. 9 2 (m， 1 H, OCH₂CHH-G a 1 ) ， 3. 8 3 (t , 1 H， H— 5) ， 3. 7 0 - 3. 74 (m， 1 H， OCH₂CHH-G a 1 ) ， 3. 6 5 - 3. 7 0 (m， 8H， [OCH₂CH₂] ) ， 3. 6 1 - 3. 6 5 ( t， 2H， [OCH ₂CH₂] ) ， 3. 5 7 ( t， 1 H, J 2， 3 = 9. 6 H z， H— 2) ， 2. 1 0

( s， 3H， A c) ， 2. 0 2 ( s， 3H， A c) ， 2. 00 ( s， 3H， Ac) . C^H^Ou Sについての分析計算値： C， 62. 67 H， 6. 31 S, 4. 78。実測値： C， 62. 87 H, 6. 18 S， 4. G Sc C^H On Sについての HRMS計算値： [M+H] + 6 7 1. 2 5 2 6，実測値： 6 7

(5. 1 7 3， 4， 6—トリー O—ァセチル— 2— 0_ (2— [2— { 2 _ ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル） _D_ガラクトピラノース（2 5) の合成）

化合物 24 (1 g， 1. 4 9mmo 1 ) を混合溶媒（アセトン： H₂0= 1 9 ： 1 1 5mL) に溶かし、 N—ブロモスクシンイミド（7 9 6 mg， 4. 4 7m mo 1 ) を加え、常温で 1. 5時間撹拌した。 T L Cにて反応の終結を確認後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物 2 5 (7 3 0 m g， 8 5%) を得た。

2 5 ： 'H-NMR (6 0 0MH z , CDC 1 ₃， 2 7°C) ： 7. 8 3 (m， 4 H，ナフタレン）， 7· 4 8 (m， 3 H，ナフタレン）， 5. 5 2 (d, 0. 6 H， J 1 α, 2 = 3. 0H z , H- 1 α) , 5. 3 9 (d, 0. 6 H, H-4 α) , 5. 3 2 (d, 0. 4H， H—4 j3) ， 5. 24 (d d， 0. 6 H, H- 3 a) ，

4. 8 7 (d d， 0. 4H， H- 3 β) ， 4. 7 1— 4. 7 8 (m， 2H， OC H₂—ナフタレン）， 4, 6 5 (d, 0. 4H， J 1 β, 2 = 7. 6 H z， H— 1 ) , 4. 3 6 ( t， 0. 6 H, H- 5 a) ， 4. 00— 4. 1 6 (m， 2H， H- 6 a, H- 6 β) , 3. 8 9 (m， 2 H, OCH₂CH₂— G a 1 ) ， 3. 8 0 ( t， 0. 4H， H- 5 i3) , 3. 5 0— 3. 7 0 (m， 1 1 H， [OCH₂ CH₂] , H- 2 a, H- 2 β) , 1. 9 7 - 2. 1 0 (m， 9H， A c X 3) ₀

(5. 1 8 ジァリノレー 3， 4， 6— トリ _0—ァセチル一 2— O— （2— [2 - { 2—ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル）一 a— D—ガラクトビラノシルホスフェート（2 6) の合成）

化合物 2 5 (3 6 Omg, 6 2 2 mo l ) を CH₃CN (5mL) に溶かし、一 40°Cまで冷却し、ジァリル一 N， N—ジイソプロピルホスファイト（2 9 6 μ L, 1. 1 3mmo 1 ) 、 1 H—テトラゾール（7 8mg， 1. 1 3 mm o 1 ) を加え、一 4 0 °Cで 1時間撹拌した。 T L Cにて反応終結を確認後、 E t O A c を加え、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出し、 E t OA c層を分離、 Mg S〇₄を加え脱水した。 Mg S0₄をセライトろ過後、減圧濃縮し、残渣を THF (5m L) に溶かし、 ― 1 0°Cに冷却後、 m— C P BA (1 84mg， 74 6 m o 1 ) を加え、常温で一晩撹拌した。 TLCで反応の終結を確認後、減圧濃縮し、シリ力ゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物（2 6) (1 4 5mg, 3 2%) を得た。

2 6 : ^-NMR (5 0 0MH z， CDC 1 ₃, 2 7°C) ： 7. 7 8 - 7. 8

3 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 4 5— 7. 48 (m， 3 H, ナフタレン）， 5. 9 8 (d d, 1 H, J l， P= 6. 9H z, J 1 , 2 = 3. 5 H z , H— 1) ， 5. 9 1 - 5. 9 7 (m， 2H， CH₂ = C H C H₂— X 2 ) ， 5. 4 5 (d, 1 H， H - 4) ， 5. 2 2 - 5. 4 0 (m， 4 H, CH₂ = CHCH₂- X 4) ， 5. 2 1 (d d, 1 H， J 3， 4 = 3. 3 H z， H— 3) ， 4. 7 2 ( s， 2H， O

CH₂—ナフタレン）， 4. 5 6 - 4. 6 1 (m， 4H， CH₂ = CHCH₂— X 2) ， 4. 37 (t， 1H， J 5， 6 = 6. 5Hz， H_5) ， 4. 07 (d， 2H， H— 6 a, H- 6 b) , 3. 87 (d t , 1 H, J 2, 3=10. 5Hz， H— 2) ， 3. 79-3. 83 (m， 1 H， OCH₂CHH— G a 1 ) ， 3. 7 2— 3. 76 (m， 1H， OCH₂CHH-G a 1) ， 3. 56-3. 70 (m， 1 OH, [OCH₂CH₂] ) ， 2. 12 (s， 3H, Ac) , 2. 01 (s, 6 H， Ac X 2) . C₃₅H₄₈〇₁₅Pについての HRMS計算値： [M] + 739. 2731, 実測値： 739. 2731。

(5. 19 3， 4， 6—O—トリー O—ァセチルー 2 _0— (2— [2 - { 2 —ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル）一 α—D—ガラクトビラノシルホスフェート E t ₃N塩（27) の合成）

化合物 26 (75mg, 101 πιο 1 ) を THF (2mL) に溶かし、 E t ₂NH (211 μ L, 2. 02mmo 1 ) と（Ph₃P) ₄P a (23mg, 20 /z m o 1 ) を加え、常温で 2時間撹拌した。 TLCで反応終結確認後、減圧濃縮し、残渣をィアト口ビーズカラムクロマトグラフィーで精製し、目的物 27 (6 5 m g， 84%) を得た。

27 : — NMR (500MHz, CDC 1₃, 27°C) ： 7. 78-7. 8 4 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 45-7. 49 (m， 3H，ナフタレン）， 5. 83 (d d， 1 H, J l， P= 6. 9Hz， J l， 2 = 3. 2Hz， H—l)， 5. 41 (d, 1H， H-4)， 5. 28 (d d, 1 H， J 3， 4 = 3. 4H z , H— 3) ， 4. 71 (s， 2H， OCH₂—ナフタレン）， 4. 51 (t， 1 H， H—5)， 4. 15 (d d, 1H， J 5， 6 b = 8. lHz， J 6 a, b = 10. 8Hz， H— 6 b) ， 4. 02 (d d, 1 H， J 5, 6 a = 5. 9Hz， H— 6 a) ， 3. 86 (m， 1 H， OCH₂CHH— Ga 1) ， 3. 78 (d t , 1 H, J 2, 3 = 10. 6Hz, H_2) ， 3. 56-3. 69 (m， 11 H， [OC H₂CH₂] ，〇CH₂CHH— Ga 1) , 2. 95 (m, 6 H， CH₃CH₂NX 3) ， 2. 1 2 ( s， 3H， A c) ， 2. 0 0 ( s， 6 H, Ac X 2) ， 1. 2 3— 1. 3 0 (m， 9H， CH₃CH。NX 3) 。

(5. 2 0 2— O— (2 - [2— { 2 _ナフチルメトキシェトキシ} ェトキシ] ェチル）一 α—D—ガラクトピラノシルホスフェート E t ₃N塩（2 8) の合成）

化合物 2 7 (6 5mg， 8 6 μΐηο 1 ) を Me OH (1 mL) に溶かし、 E t 2NH (l mL) を加え、常温で一晩撹拌した。 T L Cで反応終結を確認後、減圧濃縮し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（DEAE S e p h a c e 1、 5 OmM炭酸アンモユウム）で精製し、続けて陽イオン交換カラム（D o w e x 5 0W-X 8 [H⁺] と D o w e x 5 0 W— X 8 [E t ₃NH+] ) によって E t ₃N塩とし、目的物（2 8) (5 7mg, 9 5%) を得た。

2 8：ー NMR (5 0 0MH z , D₂0， 2 7°C) ： 7. 8 9— 7. 9 7 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 5 3 - 5. 6 0 (m， 3 H，ナフタレン）， 5· 7 0 (d d, 1 H， J l， P= 7. 3H z， J l， 2 = 3. 5 H z， H— 1) ， 4.

7 3 ( s， 2H， OCH₂—ナフタレン）， 4. 1 4 (d d, 1 H， J 5, 6 = 5. 0H z， H- 5)， 3. 9 1 - 3. 94 (m， 3H， J 3, 4 = 3. 2H z， H— 3， H— 4， OCH₂CHH-G a 1 ) ， 3. 6 5— 3. 7 8 (m, 1 3 H, H- 6 a , H- 6 b, [OCH₂CH₂] ， OCH₂CHH~G a 1 ) , 3. 6 4 (d t， 1 H， J 2， 3 = 9. 1 Η ζ， H— 2)。 C ₂₉H₄₉NO ₂ Pについての

HRMS計算値： [M+H + E t ₃N] + 6 34. 2 9 9 2，実測値： 6 3 4. 3 0 1 4。

(5. 2 1 ゥリジン 5， - (2 -0- [2 - { 2 - (2—ナフチルメトキシエトキシ）エトキシ } ェチル] _ α— D—ガラ'クトピラノシル）ジホスフェートニナトリウム塩 (3) の合成）化合物 28 (27mg, 39 imo 1 ) をピリジン（2mL) に溶かし、 20 (53. 6mg， 78 /zmo l) 、 1H—テトラゾール（l lmg， 156 m o 1 )を加え、常温で 2日間撹拌した。 TLCで反応終結を確認後、減圧濃縮し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（DEAE S e p h a c e l : 100 〜15 OmM炭酸アンモニゥム）で精製した。続けて、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（S e p h a d e x G_15、溶離液 =水）で精製し、陽イオン交換樹脂（Dowe x 50W-X8 [N a ⁺] ) を用い、目的物 3 (23mg， 67 %) を得た。

3： ^XH-NMR (50 OMHz, D₂0， 27°C) ： 7. 89-7. 96 (m， 5 H, ナフタレン， H— 5) ， 7. 54— 7. 59 (m， 3 H，ナフタレン），

5. 92 (d, 1H, J l，， 2， =4. 8Hz， H， —1) ， 5. 89 (d, 1H， H— 6) ， 5. 78 (d d, 1 H, J 1" , P= 7. 1Hz, J 1" , 2" =3. 5Hz, H" - 1) , 4. 75 (s， 2 H， OCH₂—ナフタレン) ， 4. 31-4. 3 6 (m， 2 H， J 2 ' ， 3， = 5. 1Ηζ， H，一 5 X 1， H， ― 2)， 4. 32-4. 31 (m， 2 H， H，— 3， H，一 5 X 1 )， 4. 22 (m，

1 H， H' — 4)， 4. 13 ( t， 1 H， J 5" , 6，， = 6， 2H z， H" — 5)， 3. 93 ( d， 1 H， H，， _ 4 ) ， 3 · 86— 3. 92 (m， 2 H， J 3" , 4" =3. 4Hz, H" —3， OCH₂CHH-G a 1) ， 3. 67-3. 76 (m， 13H， H" - 6 a , H，，一 6 b， [OCH₂CH₂]， OCH₂CHH-G a 1 )， 3. 64 (m， 1 H， J 2" , 3 " =10. 2H z , H" — 2) . C₃₂H₄₄0₂ 。N₂Na P₂についての HRMS計算値： [M+Na] + 861. 1860，実測値： 861. 1885。

(5. 22 2— （2— [2—ナフチルメトキシエトキシ] エトキシ）ェチル一 1一クロリド（29) の合成）

化合物 21 (20 Omg, 688/1 ₀ 1) を。11₂。 1₂ (31111 ) に溶力し、 DMF (200 L) ， SOC 1₂ (200 μ L, 4当量）を加え、常温で 24 時間撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン： E t OAc = 2 ： 1) で精製し、目的物 29 (1 9 Omg, 8 9%) を得た。

29 : ^XH-NMR (600MHz, CDC 1₃, 27°C) ： 7. 79- 7. 8

3 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 46 - 7. 48 (m， 3H，ナフタレン）， 4. 73 (s， 2H， OCH₂—ナフタレン）， 3. 74 ( t , 2 H， OCH₂C H₂— C l ) ， 3. 6 7-3. 72 (m, 8H， [OCH₂CH₂] ) ， 3. 6 1 ( t , 2H, [OCH₂CH₂] ) 。

(5. 23 フエニル 2， 3, 4_p—メトキシベンジル一 1—チォー 6—O 一トリフヱニルメチル _ β—Ό—ガラクトピラノシド (30) の合成)

化合物 1 2 (5. 6 6 g， 1 1 mmo 1 ) を DMF (5 OmL) に溶かし、 0°C で NaH (1. 8 g， 4. 5当量）を加え、 30分撹拌した。 MB n— C 1 (4. 9mL， 3. 3当量）を加え、 0 °Cで 24時間撹拌した。反応終結確認後、 Me

OHを加え反応を終結させ、減圧濃縮した。氷浴中で CHC 1 ₃に溶かし、飽和食塩水で抽出、洗浄し、. Mg S0₄で脱水し、 Mg S0₄をセラィトろ過後、減圧濃縮した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t OAc = 5 ： 1) で精製し、目的物 30 (9. 4 g， 98%) を得た。

30 : ^XH-NMR (500MHz， CDC 1。， 2 7°C) ： 7. 53 (m， 2

H，芳香族）， 7. 3 7- - 7. 40 (m， 6H，芳香族）， 7. 2 1 - 7. 3 1

(m， 1 7H, 芳香族）， 7. 14 (d d， 3H，芳香族）， 7 . 0 5 (d, 2

H，芳香族）， 6. 84- -6. 8 7 (d d, 4H，芳香族）， 6 . 74 (d, 2

H, 芳香族）， 4. 74 (d， 1 H, OCHH—フエニル）， 4 . 6 3-4. 7

0 (m， 4H， OCH₂-フエ:ニル X 2) ， 4. 5 7 (d， 1H, H-4) ， 4.

44 (d, 1H， OCHH—フエニル）， 3. 8 3 (t , 1 H， J 3, 4 = 9. ΙΗζ, H- 3) ， 3. 77-3. 82 (m， 10 H， H— 1， OCH₃X 3) ， 3. 53-3. 56 (d d , 1 H, J 5, 6 b = 6. 3 H z , J 6 a , b = 9. 8Hz， H- 6 b) ， 3. 46 (d d, 1 H, J 2, 3 = 9. 2Hz， H— 2) ， 3. 28 ( t , 1H， H— 5) , 3. 14 (d d, 1 H, J 5， 6 a = 6. 3H z， H-6 a) . C₅₅H₅₄0₈Na Sについての HRMS計算値： [M+Na]

+ 897. 3437, 実測値： 897. 3456。

(5. 24 フエニル 2， 3， 4_ρ—メトキシベンジル一 1ーチォ _i3_D 一ガラクトピラノシド（31) の合成）

化合物 30 (9. l g， 10. 4mmo 1 ) を混合溶媒（CH₂C 1 2 ： Me

OH=2： 1 75mL)に溶かし、 IN HC 1 /M e OHを用いて HC 1 ( 2 当量）を加え、常温で 1時間半撹拌した。反応終結確認後、氷浴中で E t 3 N ( 3. 49mL， 2. 4当量）を加え中和し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t OAc = 2 ： 1) で精製し、 £ 1; 0 。中へキサンの添加により結晶化し、目的物 31 (6. 08 g, 92%) を得た。

31 ： ^XH-NMR (500 MHz, CDC 1₃, 27°C) ： 7. 53 (d, 2 H，芳香族）， 7. 20-7. 33 (m， 9 H，芳香族）， 6. 85-6. 90 (m， 6H, 芳香族）， 4. 89 (d, 1 H， OCHH—フエニル）， 4. 75 (d, 1 H, OCHH—フエニル）， 4. 66-4. 71 (m， 3H， OCHH 一フエニル X 3) ， 4. 62 (d, 1 H, H— 4) ， 4. 56 (d, 1 H, OC HH—フエニル）， 3. 90 ( t , 1H, J 3, 4 = 9. 5Hz, H— 3) ， 3. 76-3. 84 (m， 11 H， H— 1， H— 5， OCH₃X 3) ， 3. 56 (d d， 1H， J 2, 3 = 9. 2Hz， H— 2) ， 3. 45 (d d， 1 H， J 6 a, b = 1 1. 3Hz, H- 6 b) ， 3. 39 (d d, 1 H, H— 6 a) . C₃₆H₄₁ 0₈Sについての HRMS計算値： [M+H] + 633. 2522, 実測値： 633. 2532₀ (5. 25 フエニル 2, 3， 4— p—メトキシベンジル一 6— O— （2— [2 - {2—ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル）一 1一チォー一 D— ガラクトピラノシド（32) の合成）

化合物 32 (2. 3 g, 3. 6mmo 1 ) を DMF (1 OmL) に溶かし、 0°C で NaH (262mg, 2当量）を加え、一時間撹拌した。 29 (2. 22 g, 2当量）を DMF (8mL) に溶かし、反応溶液に加え、 0°Cで 12時間撹拌した。反応終結確認後、氷浴中で Me OHを加え反応を終了し、減圧濃縮し、永浴中で CHC 1₃を加え飽和食塩水で抽出した。 Mg SO ₄で脱水し、 Mg S0₄をセライトろ過後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC 1 3： Me OH= 100 : 1) で精製し、目的物（32) (2. 8 g， 82%) を得た。

32： 'H-NMR (500MHz, CDC 1₃, 27°C) ： 7. 77— 7. 8 2 (m， 4H，芳香族）， 7. 54 (m, 2H，芳香族）， 7. 45-7. 47 (m， 3 H，芳香族）， 7. 19— 7. 31 (m， 9 H, 芳香族）， 6. 86 (m，

6H，芳香族）， 4. 87 (d, 1H， OCHH—フエニル）， 4. 56— 4. 73 (m， 9H， H— 4， OCH₂—ナフタレン， OCH₂—フエニル X 3)， 3. 88 (m, 2H, H— 3， OCH₂CHH-G a 1) ， 3. 76-3. 83 (m， 9H， OCH₃X 3) ， 3. 63-3. 67 (m， 9H, H_l， [OCH₂CH ₂] ) ， 3. 54-3. 57 (m, 6 H， H— 2， H— 5， H_6, [OCH₂C H₂] ， OCH₂CHH-G a 1) , 3. 48 (m, 1 H， H— 6) . C₅₇H₆₀ O₈N a Sについての HRMS計算値： [M+Na] + 927. 3754，実測値： 927. 3741。 (5. 26 フエニル 6— 0_ (2- [2- { 2 _ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル）一丄一チォ —ガラクトピラノシド（33) の合成）化合物 3 2 (2. 4 5 g， 2. 7mmo 1 ) を CH₂C 1 ₂ (2 5mL) に溶かし、チォフエノール（Ph SH) (9 94 ^ L, 3. 6当量）を加え、一 78°C に冷却した。 1M S nC 1₄/CH₂C 1₂を用いて S c C 1₄ (3. 1 5当量）加え、 _ 78°Cで 20分撹拌した。反応終結確認後、飽和重曹水を加え反応を終結させ、 CHC 1₃をカロえ、飽和重曹水，飽和食塩水で抽出し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC l ₃ : Me OH=40 : l) で精製し、目的物（3 3) (90 Omg, 6 1%) を得た。

3 3 ： ^-NMR (50 ΟΜΗζ, CD₃OD， 2 7°C) ： 7. 8 3- 7. 8 6 (m， 4H, ナフタレン）， 7. 45- 7. 54 (m， 5 H，ナフタレン，フ工ニル）， 7. 20- 7. 30 (m， 3H，フエニル）， 4. 73 ( s , 2H, OCH₂—ナフタレン）， 4. 58 (d, 1H， J l， 2 = 9. 7Hz， H— l) ， 3. 86 (d, 1H， H— 4) , 3. 5 9-3. 76 (m， 1 6 H, H— 2， H -5, H— 6 a， H— 6 b， [OCH₂CH₂] ) , 3. 48 (d d, 1 H， J 3, 4 = 3. 3Hz， H— 3) 。

(5. 2 7 フエニル 2， 3， 4—トリ一〇一ァセチル一 6— O— （2— [2 一 { 2 _ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル）一 1—チォー j3—D— ガラクトピラノシド（34) の合成）

化合物 33 (1. 06 g， 1. 94mmo 1 ) を無水酢酸（ 6 mL) 、ピリジン（1 OmL) に溶かし、室温で 1 2時間反応させた。反応終結確認後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t OAc==3. 5 ： 1〜2 ： 1) で精製し、目的物 34 (1. 3 g, 9 9%) を得た。

34 ： iH— NMR (50 OMHz, CDC 1 ₃, 2 7°C) ： 7. 77- 7. 8 3 (m， 4H, ナフタレン）， 7. 45- 7. 50 (m， 5H，ナフタレン，フェニル）， 7, 26- 7. 32 (m, 3H, フエニル）， 5. 44 (d, 1 H, H_4) ， 5. 23 ( t , 1H， J 2, 3 = 9. 9Hz， H— 2) ， 5. 03 (d d, 1 H, J 3, 4 = 3. 3H z， H— 3) ， 4. 7 3 ( s， 2 H, OCH₂— ナフタレン）， 4. 7 0 (d, 1 H， J 1 , 2 = 1 0. 0H z， H— 1) ， 3. 8 6 ( t , 1 H， J 5, 6 = 6. 2H z , H— 5) ， 3. 6 2— 3. 70 (m, 8 H， [OCH₂CH₂] ) , 3. 4 8 - 3. 6 1 (m， 6 H， H_ 6 a， H— 6 b, [OCH₂CH₂] ) ， 2. 1 0 ( s， 6 H， A c X 2) ， 2. 0 0 ( s， 3

H， A c)。 C₃₅H₄₃0_{1 ]L} Sについての HRMS計算値： [M+H] + 6 7 1. 2 5 2 6，実測値： 6 7 1. 2 5 4 8。

(5. 2 8 2, 3， 4 _トリー 0_ァセチルー 6— O— （2— [2— { 2— ナフチノレメトキシェトキシ} エトキシ] ェチノレ）一 D—ガラクトピラノース（3 5) の合成）

化合物 34 (5 0 Omg, 74 5 μπιο 1 ) を、混合溶媒（ァセトン： Η₂0 = 20 : 1 1 OmL) に溶かし、 NB S (3 9 8mg， 3当量）を加え、常温で 1時間半撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、 CHC 1 ₃に溶かし、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出した。 Mg S 0₄により脱水し、 Mg S 0₄をセラィトろ過後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t O A c = 3： 1〜1 ： 2) で精製し、目的物 3 5 (3 3 3mg, 7 7%) を得た。

3 5： ^XH-NMR (6 0 0MH z , CDC 1 ₃， 2 7°C) ： 7. 8 3 (m, 4 H，ナフタレン）， 7. 4 5 - 7. 4 8 (m， 3 H，ナフタレン）， 5. 4 9 (m， 0. 8 H, H- 3 α) , 5. 4 1— 5. 4 3 (m， 1 H, H- 1 a, H-4 j3) ,

5. 1 6 (d d, 0. 8H, H- 2 α) , 5. 0 9 (d d, 0. 2 H, H~ 2 β) , 5. 0 5 (d d, 0. 2H， H- 3 j3) ， 4. 74 ( s， 2H， OCH₂—ナフタレン）， 4· 6 7 ( t， 0. 2Η， Η— 1 /3) ， 4. 4 8 (d d, 0. 8H， H- 5 a) ， 4. 24 ( s， 0. 8 H， H-4 a) ， 3. 8 6 ( t , 0. 2 H, H- 5 j3) ， 3. 5 7 - 3. 7 2 (m， 1 2 H, [OCH₂CH₂] X 3) ， 3. 4 3— 3. 5 5 (m， 2H， H- 6 a, H— 6 j3) ， 1. 9 2— 2. 1 3 (m， 9H， Ac X 3) . C₂₉H₃₈0₁₂Naについの HRMS計算値： [M+Na] + 601. 2261, 実測値： 601. 2237。

(5. 29 ジァリル— 2， 3， 4 _トリ一 O—ァセチルー 6—〇ー（2— [2 一 { 2—ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチノレ）一 α— D—ガラクトビラノシルホスファイト（36) の合成）

化合物 35 (106mg, 183 zmo l) を CH₃CN (2mL) に溶かし、 1H—テトラゾール（23mg， 1. 8当量）を加え一 40 °Cに冷却し、 N， N ージァリル一ジイソプロピル一ホスホロアミダイト（73/zL， 1. 5当量）を加え、一 40〜― 30°Cで 7時間撹拌した。反応終結確認後、 E t O A cを加え、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出した。 Mg S0₄で脱水し、 Mg SO₄をセライトろ過後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトフラフィ一（へキサン： E tO Ac = 4 : l〜3 : l 0. 5 v%E t ₃N含む）で精製し、目的物（36) (6 5mg, 49%) を得た。

36 : ^XH-NMR (50 OMH z， CDC 1₃, 27°C) ： 7. 78-7. 8

3 (m， 4H, ナフタレン) ， 7. 26-7. 48 (m， 3 H，ナフタレン）， 5. 88 - 5. 96 (m， 2H， CH₂ = CHCH₂— X 2 ) 、 5. 74 (d d， 1H， J 1, P = 8. 4Hz， J l， 2 = 3. 4Hz, H_l) ， 5. 50 (d, 1H， H-4) ， 5. 36 (d d, 1H， J 2, 3 = 10. 8Hz， J 3, 4 = 3. 3Hz， H— 3) ， 5. 17-5. 33 (m， 5H， CH₂ = CHCH₂— X 2， H- 2) , 4. 73 (s， 2H, OCH₂—ナフタレン）， 4. 34-4. 41 (m， 5H， CH₂ = CHCH₂— X 2， H— 5) ， 3. 54-3. 71 (m， 12 H， [OCH₂CH₂] ) , 3. 44-3. 54 (m， 2H， J 6 a, b = 1 1. 0Hz, H-6 a, H-6 b) , 2. 12 (s, 3 H, Ac) , 2. 04 (s， 3 H， Ac) ， 1. 98 (s， 3H， Ac) 。

Π7 (5. 30 ジァリル一 2， 3， 4一トリ一 O—ァセチルー 6—O— (2— [2 - { 2—ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル）一 a— D—ガラクトビラノシルホスフヱート（3 7) の合成）

化合物 3 6 (5 9mg, 8 1. 6 ^ m o 1 ) を THF (2mL) に溶かし、 E t ₃N (1 14 x L, 1 0当量）を加え、一 1 0°Cに冷却し、 t B uOOH (4

9 μ L, 3当量）を加え、一 1 0°Cで 4時間撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、 CHC 1₃を加え、飽和重曹水、飽和食塩水で抽出した。 Mg S0₄で脱水し、 Mg S0₄をセライトろ過の後、減圧濃縮し、目的物（3 7) (6 Omg, 9 9 %) を得た。

(5. 3 1 2, 3， 4—トリー 0—ァセチルー 6— O— （2— [2— { 2 - ナフチルメトキシェトキシ} エトキシ] ェチル）一α— D—ガラクトピラノシルホスフェート E t ₃N塩（3 8) の合成）

化合物 3 7 (6 Omg, 82. 6 μτηο 1 ) を THF (2mL) に溶かし、 E t ₂NH (1 72 μ L·, 20当量）、 (P h₃P) 4 P a (1 9mg, 0. 2当量) を加え、常温で 2時間撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、ィァトロビーズカラムクロマトグラフィー（CHC 1 ₃ ·· Me OH=2： 1， 0. 5 v%の E t ₃ N含む）で精製し、目的物（38) (5 7mg, 9 1%) を得た。

38： ^-NMR (500MHz, CDC 1 ₃, 2 7°C) ： 7. 8 2— 7. 8 6 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 3 1 - 7. 5 2 (m， 3 H，ナフタレン）， 5. 79 (d d, 1 H， J l， P= 7. 7H z， J l, 2 = 3. 3Hz， H— l) ， 5. 5 3 (d, 1H, H_4) ， 5. 44 (d d, 1H， J 3， 4 = 3. 3H z， H- 3) ， 5. 1 6 (d t , 1H, J 2, 3 = 1 0. 7Hz, H— 2) ， 4. 7 6 (s， 2H， OCH₂—ナフタレン）， 4· 49 ( t , 1 H， J 5， 6 = 6. 6 Hz， H— 5) ， 3. 53— 3. 73 (m， 1 3 H， [OCH₂CH₂] ， H— 6 a) , 3. 48 (d d, 1 H， J 5, 6 b = 7. 8Hz， J 6 a, b = 9. 5 Hz, H— 6 b) ， 3. 03 (d d, 6 H， CH₃CH₂NX 3) , 2. 15 ( s， 3H, Ac) , 2. 10 (s， 3H, Ac) , 1. 99 (s， 3 H, Ac) , 1. 30 (t, 9H， CH₃CH₂NX 3) 。

(5. 32 6— O— （2— [2— {2—ナフチルメトキシェトキシ} ェトキシ] ェチル） __α— D—ガラクトピラノシルホスフェート E t ₃N塩（39) の合成）

化合物 38 (57mg, 75 Aimo 1 ) を Me OH (2mL) に溶かし、 E t ₂NH (500 L) を加え、常温で 3日間撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（DEAE S e p h a c e l、 50〜8 OmM炭酸アンモニゥム）で精製し、 Dowe x 50W—X8 (H+) と Dowe x 50W-X 8 (E t ₃NH+) を用いて E t ₃N塩に変換し、目的物（39) (44mg, 88%) を得た。

39： ^-NMR (500MHz, D₂0， 27°C) ： 7. 87- 7. 95 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 52-7. 59 (m， 3 H，ナフタレン）， 5. 52

(d d, 1H， J 1 , P= 7. 3Hz， J l， 2 = 3. 6Hz， H— 1) ， 4. 72 ( s， 2H, OCH₂—ナフタレン) ， 4. 20 ( t， 1 H， J 5, 6 = 6. 0Hz， H— 5) ， 3. 93 (d， 1 H， H— 4) ， 3. 88 (d d, 1 H， J 3， 4 = 3. 3Hz， H-3) , 3. 80 (d t , 1H， J 2, 3 = 10. 3H z， H— 2) , 3. 61-3. 71 (m， 14H， H_6 a， H— 6 b， [OC H₂CH₂] ) ， 3. 18 (d d, 8H, CH₃CH₂NX 4) ， 1. 27 (t， 1 2H， CH₃CH₂NX 4) . C ₂₉H₄₉NO ₂ Pについての HRMS計算値： [M + H + E t ₃N] + 634. 2992, 実測値： 634. 3003。

(5. 33 ゥリジン 5，一 (6 -0- [2— {2— （2—ナフチルメトキシエトキシ）エトキシ } ェチル] _ _α— D—ガラクトビラノシル）ジホスフェートニナトリウム塩（4) の合成）

化合物 39 (26mg, 39 xmo l) をピリジン（ImL) に溶かし、 3回減圧濃縮し水分を乾燥させた。その後ピリジン（ImL) を加え、 20 (53. 6mg, 2当量）のピリジン（ImL) 溶液、 1H—テトラゾール（l lmg, 4当量）を加え、室温で 2日間撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、陰ィォン交換カラムクロマトグラフィー（DEAE S e p h a c e K 100〜13 OmM炭酸アンモニゥム）で精製し、さらにゲルろ過クロマトグラフィー（S e p h a d e X G— 15、溶離液 =水）で精製し、 D o w e x 50W-X8 (N a⁺) を用いて N a +塩へ変換し、目的物（4) (14mg， 41%) を得た。

4： ^-NMR (500MHz, D₂〇， 27°C) ： 7. 87-7. 97 (m，

6 H, ナフタレン， H—5) ， 7. 55-7. 61 (m, 3H，ナフタレン）， 5. 90 (d, 1H， J 1 ' ， 2， =4. 8Hz， H， —1) ， 5. 88 (d, 1H， H_6) ， 5. 64 (d d, 1H， J l" ， P= 7. 4Hz, J l，，， 2" =3. 5Hz， H" —1) , 4. 77 (s， 2 H， OCH₂—ナフタレン）， 4. 19-4. 34 (m， 6H, H，一 2， H，一3， H，一4， H' 一 5 a， H' — 5b， H，，— 5) ， 3. 94 (d, 1H， H，，— 4) ， 3. 89 (d d, 1H， J 2" , 3" =10. 2H z , J 3" , 4" =3. 2Hz， H，，—3) ， 3. 6 1-3. 80 (m， 15H， H，， — 2， H，，一 6 a， H，，一 6 b， [OCH₂C H₂] ) . C₃₂H₄₄N₂O₂₀Na P₂についての HRMS計算値： [M+Na] + 861. 1860，実測値： 861. 1843。

(5. 34 ゥリジン 5' — （6—デォキシ一 6 _N—ナフチルメチルー α— D—ガラタトピラノシル）ジホスフェートニナトリウム塩（6) の合成）

ゥリジン 5，一ジホスホガラタトビラノース（6. 5mg, 10. 6/ mo l) を緩衝液 A (5 OmMリン酸， pH 6. 0， 0. 5 mM Cu S0₄, 1. 2 mL) に溶かし、カタラーゼ（1. 2mg， 3168 U) 、ガラクトースォキシダーゼ（30U) を加え、室温で 1時間撹拌した。ナフチノレメチノレアミン (15 mg, 9当量）を TF Aに溶かし、減圧濃縮し、ナフチルメチルァミン TF A塩とし、 THF (3mL) に溶かして酵素反応溶液へ加えた。室温で 2時間半撹拌した後、氷冷下 NaBH₃CN (3. 3mg, 5当量）を加え、一 20°Cでー晚置いた。反応終結確認後、限外ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（S e p h a d e x G—15、溶離液 =水）で精製し、 Dow e x 5 OW-X8 (Na⁺) を用いて N a塩へ変換し、目的物（6) を得た。

6： ^-NMR (50 OMHz, D₂0， 27°C) ： 8. 1 1 (d, 1 H，ナフタレン）， 8. 00 (d， 1H，ナフタレン）， 7. 55- 7. 70 (m， 5 H， H- 5, ナフタレン）， 5. 80 (d, 1 H， J 1 ' ， 2， =4. 6 H z , H， —1) ， 5. 66 (d d, 1H， J 1" , P = 6. 6Hz， J 1" , 2" = 3. 6Hz， H，，—l) ， 5. 60 (d， 1H， H_6) ， 4. 72 (s， 2H， NHCH₂) ， 4. 54 (d d, 1H， J 5" , 6" =7. 9Hz， H" _5) ， 4. 14-4. 21 (m, 3 H， H' 一 2， H' —3， H' 一 4) , 4. 09 (d d d, 1H， H， -5) , 4. 02 (d, 1 H， H" _4) ， 3. 94-3. 9

8 (m， 2H， H， — 5， H" - 3) ， 3. 85 (d t， 1 H， J 2"， 3" = 10. 3Hz， H，，一 2) ， 3. 45 (d d， 1H， J 6 b, 5= 10. OH z, J 6" a, b = 13. 3Hz， H，， _6 b) ， 3. 37 (d d， 1H， J 6 a, 5 = 2. 6Hz， H" -6 a) . C₂₆H₃₄N₃0₁₆ P ₂についての HRMS計算値： [M+H] + 706. 1418，実測値： 706. 1407。

(5. 35 6— N— ( t—ブチルォキシカルボ二ル）ァミノへキサノール (4 0) の合成）

ァミノへキサノーノレ（1. 5 g， 12. 8mmo 1 ) を H₂0 (15mL) に溶かし、 E t ₃N (2. 68mL, 1. 5当量）と B o c— ON (3. 47 g, 1. 1当量）のジォキサン（1 5mL) 溶液を加え、室温でー晚撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC 1₃ ： MeOH=60 ： 1) で精製し、目的物（40) (2. 55 g， 92%) を得た。

40 ： 'H-NMR (500MHz, CDC 1₃, 27°C) : 4. 77 (s， 1 H， NH) ， 3. 60 (t， 2H， CH₂OH) ， 3. 10 (d d, 2H， NH CH₂) ， 2. 62 (s， 1 H, OH) ， 1. 53 - 1. 59 (m， 2H， NH CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH) , 1， 41— 1. 51 (m， 11 H， B o c， NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH) ， 1. 30- 1. 40 (m， 4H， NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂OH) 。 (5. 36 1 -N- ( t—ブチルォキシカルボニル）一 6—ナフチノレメトキシーアミノへキサン（41) の合成）

化合物 40 (535mg， 2. 46 mm o 1 ) を THF (1 OmL) に溶かし、氷浴中 NaH (134mg， 1. 5当量）を加え、 30分間撹拌した。 TBAF (999mg, 1. 1当量）、ナフチルメチルーブロミド（1. 02 g， 1. 8 当量）を加え 0°Cで一晩撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、 CHC 1₃に溶かし、飽和食塩水、蒸留水で抽出、洗浄し、 Mg S0₄を加え脱水した後、 M g so₄をセライトろ過後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィ一（へキサン： E tOAc = 20 : ；!〜 16 : 1) で精製し、目的物（41) (5 55 m g， 63%) を得た。 '

41 : ^aH-NMR (500MH z, CDC 1₃, 27°C) ： 7. 76-7. 8

2 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 43-7. 47 (m, 3H，ナフタレン) ， 4. 66 (s， 2H, OCH₂—ナフタレン）， 4. 53 (s， 1 H， NH) ， 3. 48 (t， 2H, NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂0-) , 3. 08 (d, 2H， NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂0-) , 1. 59— 1. 65 (m， ₂H， NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂0-) ， 1. 41— 1. 48 (m， 11 H, B o c， NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂0-) ， 1. 25— 1. 40 (m， 4H， NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂0-)

(5. 3 7 ゥリジン 5， - (6—デォキシー 6— N— [6—ナフチノレメトキシ]へキシルー α—D—ガラクトビラノシル）ジホスフエートニナトリゥム塩（7) の合成）

ゥリジン 5，ージホスホガラタトビラノース（5mg， 8. 2 μηίο 1 ) を緩衝液 D (5 0mMリン酸， pH 6. 0 0. 5mM C u S 0₄, 1. OmL) に溶かし、カタラーゼ（1. Omg， 2 6 40U) 、ガラクトースォキシダーゼ (3 0U) を加え、室温で 1時間撹拌した。 4 1 (4. 4mg, 1. 5当量）を氷冷下 9 5%TFA/CH₂C 1 ₂に溶かし 1 5分撹拌し、減圧濃縮し、 THF (3 mL) に溶かして酵素反応溶液へ加えた。室温で 2時間半撹拌した後、氷冷下 N a BH₃CN (3. 3mg, 5当量）を加え、 0°Cでー晚置いた。反応終結確認後、限外ろ過し、ろ液を減圧濃縮し、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（S e p a d e X G— 1 5、溶離液 =水）で精製し、 D o w e x 5 0W-X 8 (N a⁺) を用いて N a塩へ変換し、目的物（7) (3 5 0 g, 5%) を得た。

7 ： ^-NMR (5 0 0MH z , D₂0， 2 7°C) ： 7. 7 7— 7. 8 5 (m, 4H，ナフタレン）， 7. 7 1 (d, 1 H， H— 5) ， 7. 4 1 - 7. 4 7 (m， 3H, ナフタレン）， 5. 7 5 (d, 1 H， J 1 ' , 2， =4. 7H z , H， - 1) ， 5. 7 1 (d, 1 H， H— 6) , 5. 5 2 (d d， 1 H, J l，，， Ρ= 6 · 3H z， J 1 " , 2" = 3. 7H z , H" _ 1 ) ， 4. 5 9 ( s， 2 H， OCH ₂—ナフタレン） .， 4. 3 1 (d d, 1 H, J 5" , 6" = 8. 1 Η ζ， H" —

5) , 4. 1 2-4. 1 9 (m， 4H, H 2, H 3 ， H 4 ， H ―

5) ， 4. 0 9 (d d, 1 H， H' - 5) 3. 8 9 (d, 1 H H" 一 4)

3. 8 3 (d d, 1 H, J 3" , 4" = 3 . 2H z , H 3) ， 3. 7 2 (d t， 1 H， J 2" , 3" = 1 0. 3H z , H 2) ， 3. 5 0 ( t , 2H N

HCH₂C ₂ H ， 3. 0 5 - 3, 1 5 (m， 2H J 6" a, b = 10. 2 H z , H" -6 a, H" -6 b) , 2. 86 (d t , 2H， NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂0-) ， 1. 49- 1. 55 (m， 4 H， NHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂0-) ， 1. 20 (m， 4 H， NHCH₂ CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂0-) 。 C ₃₂H₄₆N₃0 ₇ P ₂についての HRMS 計算値： [M+H] + 806. 2303，実測値： 806. 2319。

(5. 38 2- (2- [2—ナフチルメトキシェトキシ] ェトキシ）酢酸（ 4 3) の合成）

化合物 21 (5 Omg, 172 ^mo 1 ) をァセトン (3mL) に溶かし、 K ₂C r ₃0₇ (91 mg, 1. 8当量）、 3· 6N H₂S0₄ (358 ^ L， 7.

5当量) を加え、室温で 2時間撹拌した。反応終結確認後、セライトろ過し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC l ₃ :MeO H=25 ： 1〜15 ： 1) で精製し、目的物（43) (48mg， 92%) を得た。

43 : 'H-NMR (60 OMHz, CDC 1₃, 27°C) ： 7. 76-7. 8

5 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 26-7. 49 (m， 3 H，ナフタレン）， 4. 70 (s， 2H， OCH₂—ナフタレン) ， 4. 17 ( s， 2H, OCH₂C =0) ， 3. 62-3. 76 (m， 8 H， [OCH₂CH₂] ) 。 (5. 39 2 - (2— [2—ナフチルメトキシエトキシ] エトキシ）一ペンタフルオロフヱュルアセテート（44) の合成）

化合物 43 (185mg， 581 πιο 1 ) を DMF (2. 5mL) に溶かし、ピリジン（94 / L， 2当量）、 TFA' p f p (200 ^ L, 2当量）を加え、室温で 12時間撹拌した。反応終結確認後、シリカゲカラムクロマトグラフィ一（へキサン： E t OAc = 5： 1)で精製し、目的物 44 (222mg， 81 %) を得た。 44 ： ^XH-NMR (500MHz, CDC 1₃, 27°C) ： 7. 78-7. 8 3 (m， 4H, ナフタレン）， 7· 46-7. 49 (m， 3 Η，ナフタレン）， 4. 74 (s， 2H, OCH₂—ナフタレン）， 4. 55 ( s.， 2H， OCH₂C =0) , 3. 8.3— 3. 86 (d d, 2H， [OCH₂CH₂] ) , 3. 75-3. 77 (d d， 2H, [OCH₂CH₂] ) ， 3. 69-3. 74 (m， 4H， [O CH₂CH₂] ) 。

(5. 40 2- (2— [2—ナフチルメトキシエトキシ] エトキシ）一 N，一 t—プチルォキシカルポ-ルァセトヒドラジド（45) の合成）

化合物 44 (21 Omg, 446 ^mo 1 ) を DMF (3mL) に溶かし、 B o c NHNH₂ (61. 8mg， 1. 05当量）を加え、室温で 15分撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（へキサン： E t OAc = 3 ： 2〜1 ： 2) で精製し、目的物（45) (141 m g , 76%) を得た。

45 ： ^XH-NMR (50 OMH z， CDC 1₃, 27°C) : 8. 82 (s， 1 H， NH—B o c) ， 7. 78-7. 83 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 45 一 7. 50 (m, 3H，ナフタレン）， 6. 25 (s， 1 H， NHC = 0) ， 4. 72 ( s， 2H， OCH₂—ナフタレン) ， 4. 14 ( s， 2H， OCH₂C = 0) , 3. 66-3. 76 (m， 8 H, [OCH₂CH₂] ) ， 1. 45 (s， 9 H, B ό c ) 。

(5. 41 ゥリジン 5，一（6—デォキシ一 6— N— [2— {2_ (2—ナフチルメトキシエトキシ）エトキシ } ァセトヒドラ一N' —ィル] — α—D—ガラクトピラノシル）ジホスフェートニナトリウム塩（5) の合成）

ゥリジン 5，ージホスホガラクトビラノース（2 Omg， 32. 8/zmo I) を緩衝液 B (50mMリン酸， H 7. 0, 0. 5 mM Cu S0₄, 2mL) に溶かし、カタラーゼ（3mg， 6970U) 、ガラクトースォキシダーゼ（6 0U) を加え、室温で 2時間撹拌した。 45 (2 lmg, 1. 5当量）を氷冷下 95%TFAZCH₂C 1₂で 15分処理し、緩衝液 B (lmL) に溶かして酵素反応溶液に加え、室温で 24時間撹拌した。 NaBH₃CN (2. lmg, 1当量）を加え、さらに室温で 12時間撹拌し、反応終結確認後、限外ろ過を行い、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（DEAE S e p h a c e l、 100 mM〜l 5 OmM炭酸アンモニゥム）で精製し、続いてゲルろ過クロマトグラフィー（S e p h a d e x G— 15、溶離液 =水）で精製し、 D o w e x 50 W-X8 (Na⁺)を用いて N a +塩に塩交換し、目的物（ 5 ) ( 11 m g , 37%) を得た。

5 ： 'H-NMR (50 OMH z， D₂0， 27°C) ： 7. 91-7. 97 (m， 4H，ナフタレン）， 7. 84 (d, 1H， H— 5) ， 7. 55-7. 61 (m， 3H，ナフタレン）， 5. 88 (d, 1 H, J 1 ' ， 2， =4. 9Hz， H' - 1) ， 5. 84 (d, 1H， H— 6) ， 5. 65 (d d, 1H， J 1" ,

8 H z， J 1" , 2" =3. 6Hz, H" — 1 ) ， 4. 77 ( s， 2 H, OCH

₂—ナフタレン）， 4. 25-4. 33 (m， 4 H, H，一2， H，一3， H， -4, H，一 5) ， 4. 11-4. 23 (m， 2 H, H， — 5， H，，一 5) ， 4. 09 (s， 2H， OCH₂C = 0) ， 3. 87-3. 91 (m, 2H， J 3" , 4" =3. 3 H z， H，， _ 3， H，， — 4 ) ， 380 (d t , 1 H， J 2" , 3" =10. 2Hz, H" -2) , 3. 70-3. 77 (m, 8H, [OCH₂CH₂] ) ， 3. 05 (d d, 1 H, J 5" , 6" b = 9. lHz， J 6 " a , b = 13. 3 H z， H" -6 b) , 2. 95 (d d, 1 H， J 5" , 6" a = 3. 6 H z， H，， — 6 a) 。 C₃₂H₄₄N₄O₂₀Na P₂についての HRMS計算値： [M+Na] + 889. 1922，実測値： 889. 1943。

(実施例 6 ：蛍光標識 N—ァセチルダルコサミン類似物の合成) (6. 1 ァセチルー 3， 4， 6—トリー O—ァセチル— 2—ァセトアミド— 2—デォキシー α—D—ダルコビラノシド（47) )

遊離のダルコサミン HC 1塩（50 g， 23 lmmo 1) 、 E t ₃N (32. 5mL, 1当量）、無水酢酸（200mL) をピリジン（300mL) に加え、常温でー晚撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し蒸留水を過剰に加え、 30分撹拌した後 CHC 1₃を加え、 IN H₂S0₄、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄、抽出し、 Mg S〇₄で脱水し、 Mg S0₄をセライトろ過した後、減圧濃縮した。 E t OHに溶かし、冷蔵庫で結晶化させ、目的物（47) (80 g， 89%) を得た。

(6. 2 3— （N—ベンジルォキシカルポニルァミノ）プロピル 2—ァセトアミドー 3， 4， 6—トリ一 O—ァセチノレー 2—デォキシノレ一 —D—グノレコピラノシド（48) の合成）

化合物 47 (5 g, 12. 8mmo 1 ) をジクロロェタン（ 50 mL) に溶かし、 TMSOT f (2. 6mL， 1. 05当量）を加え、 60°Cで 5時間撹拌した。反応終結確認後、氷浴中で E t₃N (5. 4mL, 3当量）を加え、減圧濃縮した。残渣をジクロロェタン（50mL) に溶かし、 Z—ァミノへキサノール（ 5. 3 g， 2当量）、 C S A (22 Omg) を加え、 60 °Cで 1時間撹拌し、 CSA (1 O.Omg) を追加してさらに 20分撹拌した。反応終結確認後、 CH C 1₃を加え、飽和重曹水、飽和食塩水で洗浄、抽出し、 Mg S0₄を加え脱水し、 Mg S0₄をセライトろ過した後、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（CHC 1₃ :M OH= 100 : 1)で精製し、目的物 48 (5. 48 g, 79%) を得た。 (6. 3 3— （N— [5— {N, N—ジメチルァミノ } 一 1一ナフタレンスルホニル] ァミノ）プロピル 2—ァセトアミドー 2—デォキシー j3—D—ダルコビラノシド（8) の合成）

化合物 48 (30 Omg, 557 μπαο 1 ) を Me OH (8mL) に溶かし、 NaOMe (5mg, 0. 17当量）を加え、常温で 2時間撹拌した。反応終結確認後、 Dowe x 50W-X8 (H+) を用いて中和し、セライトろ過した後、減圧濃縮した。残渣を MeOH (8mL) に溶かし、 10%Pd— C (10 Omg) を加え、水素環境下、常温で 2時間撹拌した。反応終結確認後、 10% P d— Cをセライトろ過した後、減圧濃縮した。残渣を MeOH (5mL) に溶かし、 E t ₃N (100 L) を加え、氷冷下ダンシル _C 1 (15 Omg, 1 当量）を加え、 0°Cで 2時間撹拌した。反応終結確認後、減圧濃縮し、残渣をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（S e p h a d e x G— 10 ：：溶離液 =水）で精製し、目的物 8 (204mg, 71%) を得た。

8 ： ¹H— NMR (600MHz, D₂0， 27°C) ： 8. 47 (d, 1 H，ダンシル）， 8. 24 (d, 1H，ダンシル）， 8. 20 (d, 1 H, ダンシル），

7. 65- 7. 69 (m， 2 H，ダンシル）， 7. 39 ( d， 1H，タンシル），

4. 18 (d, 1 H, J l， 2 = 8. 5Hz， H_l) ， 3. 79 (d d, 1H,

J 5, 6 a = 2. 1Ηζ， J 6 a, b = 12. 3Hz， H_6 a)， 3. 67 (m，

1 H, OCHHCH₂CH₂NH) ， 3. 62 (d d, 1 H， J 5， 6 b = 5. 8

Hz, H-6 b) , 3. 50 (d d, 1H， J 2, 3 = 10. 3Hz, H— 2) ，

3. 38 (d d, 1H， J 3, 4 = 8. 6Hz， H—3) ， 3 . 34 (m， 1H,

OCHHCH₂CH₂NH) ， 3. 30 (t， 1 H, J 4， 5 =9. 7H z ， H-

4) ， 3. 26 (d d d, 1H， H— 5) ， 2. 88 (m， 2H, OCH 2 H₂

CH₂NH* 2) ， 2. 82 (s， 6 H， NCH₃X 2) , 1. 70 (s， 3 H， Ac) ， 1. 54 (m， 2H， O CH₂ CH₂ CH₂NH) . H₂0 (0. 2当量) を含有する C₂₃H₃₃0₈N₃Sについての元素分析計算値： C 53. 62H6. 5 0N8. 16 S 6. 22 :実測値： C53. 55H6. 37N 7. 92 S 6. 2 (6. 4 3— (N- [5— {N， N—ジメチルァミノ）一 1一ナフタレンスルホニル] ァミノ）プロピル 2—ァセトアミド一 2—デォキシー 4一 O— (β— D—ガラクトビラノシル）一) 3—D—ダルコビラノシド（9) の合成）

化合物 8 (5mg， 9. 8 μπιο 1) 、 UDP—ガラクトース（7. 1 6mg，

1. 2当量）を緩衝液 C (5 OmM He p e s , p H 6. 5， 1 0 mM M n C 1 ₂ l mL) に溶かし、 β 1， 4—ガラクトース転移酵素（l O OmU) を加え、 3 7 °Cで 2 2時間インキュベートした。反応終結確認後、限外ろ過を行い、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー（S e p h a d e x G— 1 0、溶離液 =水）、 HP LC (H₂0 ： Me OH= 5 0 ： 5 0から 2 5分後に 4 5 : 5 5) にて精製し、目的物（9) (6 mg， 9 1 %) を得た。

9 ： ^XH-NMR (5 0 OMH z , D₂0， 2 7°C) : 8. 54 (d, 1 H，ダンシノレ）， 8. 3 2 (d, 1 H，ダンシル）， 8. 2 8 (d, 1 H，ダンシル）， 7. 7 3 - 7. 7 7 (m， 2 H, ダンシル）， 7. 4 7 (d， 1 H, ダンシル）， 4. 9 0 (d, 1 H， J l，， 2， = 7. 8H z , G a l — 1) ， 4. 2 6 (d,

1 H， J 1 , 2= 7. 4H z, G l c NA c— l) , 3. 9 2 - 3. 9 4 (m， 2H, G a 1 - 4, 6—H) ， 3. 7 3 - 3. 8 1 (m， 5 H， G 1 c NA c— 3， 6 -H, G a l — 5， 6 _H, OCHHCH₂CH₂NH) ， 3. 6 1 - 3. 7 0 (m, 4H， G 1 c NA c - 2, 4, 6— H， G a 1 - 3) , 3. 5 5 (d d, 1 H， J 2，， 3， = 8. 8H z， G a l — 2) , 3. 4 7 (m， 1 H， G

1 c NAc - 5) , 3. 4 2 (m， 1 H, OCHHCH₂CH₂NH) , 2. 9 5 (m， 2H, OCH₂CH₂CH₂NH) , 2. 9 2 ( s， 6 H， NCH₃X 2) ， 1. 7 7 ( s， 3 H, A c) ， 1. 6 2 (m， 2 H, O CH₂ CH₂ CH₂NH) 。

(実施例 7 ：コンピュータシミュレーション）

全ての構造解析（合成した基質誘導体の安定構造、 ΐ , 4 _G a I T結晶構造との結合）シミュレーションは、 S y b y 1 6· 8ソフトウエアを使用した。基質誘導体の反応後の安定構造の解析は 30 ΟΚ、溶媒誘電率 78. 36 (水中を想定）を使用し、分子動力学（Mo l e c u l a r Dyn ami c s) によ i n sの間自由運動させ、 1 f sごとの蛍光基間距離を測定した。

(実施例 8 ：蛍光エネルギー移動法による酵素活性測定）

(8. 1 調製） ,

蛍光測定用石英セル（総容量： 600 μ L) に最終濃度で以下のように基質類似物、酵素、緩衝液を調製した。

UDP_Ga 1類似物（1〜7) ： 10 Μ

G 1 cNAc、 L a cNAc類似物（8， 9) ： 50 μΜ

Ga l T : 100/ U

緩衝液： 50mM He p e s緩衝剤， H 6. 5， 10 mM MnC l ₂、

0. 25mg/mL B S A.

酵素を加える瞬間を時間 0とし、 2， 4， 8, 16， 32， 64分にスキャンスピード 700 nm/分で測定した。

(8. 2 基質の転移活性の確認）

1. 5mLエツペンドルフチューブ中で以下の条件において酵素反応を行い、生成物を HP LC (ダンシル基蛍光検出）、 MALD I— TOF— MAS Sにて確認した。

く β 1, 4-G a 1 T>

UDP— G a 1類似物（1〜7) ： 200 Μ

G l cNAc類似物（8) ： 50 uM

β 1， 4-G a I T : 200

緩衝液： l O OmM H e p e s緩衝剤、 H 6. 5， 10 mM MnC l

₂、 0. 25mg/mL B S A. 総容量： 50 μ L

3 7°C、 1時間インキュベーションした後、続けて 1 00°C3分の熱処理、 1 5000 r pm/1 0分で遠心処理をし、 HPLCォ一トインジェクターにより、上澄み 20 μ Lをインジェクトした。

溶出条件： 0分 Me OH 50% ： H₂0 50%から 25分 Me OH 5

5% ： H₂0 45 %になる線形勾配。流速 0. 5mL/m i n、カラム温度 4 0°C。溶出 14〜1 5分。

< α 1 , 3— G a 1 Τ>

UDP— Ga 1類似物（1〜7) : 200 μΜ

L a c NAc類似物（9) : 1 00 juM

a 1， 3— G a I T : 500 μ U

緩衝液： l O OmM He p e s緩衝剤， pH 6. 5， 1 0 mM MnC l ₂、 0. 2 5mg/mL B S A.

総容量： 50 μ L

他の条件は j3 1, 4—Ga 1 Tのものと同様にした。

溶出条件： 0分 CH₃CN 25% ： H₂0 7 5 %から 20分 CH₃ CN 3 5% ： H₂0 6 5%になる線形勾配。流速 0. 5mL/m i n、カラム温度 4 0°C。溶出 14〜1 5分。

溶出ピ一クフラクションを集めて濃縮し、 MA LD I -TOF— MA S Sにより生成物確認を行った。

(8. 3 酵素阻害定数の測定）

1. 5 mLのエツペンドルフチューブ中で以下の条件にて酵素反応を行い、 D i X o nプロットにより阻害定数を算出した。 HP LC蛍光分析において、ピ一ク面積とサンプル量は検量線により 3000 pmo 1までは比例関係にあることを確認し、酵素反応量をピーク面積から算出した。その他の条件は上述の蛍光ェネルギー移動法による酵素活性測定と同様であった。

UDP-G a 1 ： 1 0 0

UDP— G a 1類似物（1〜7) ： 0~2 0 0

G l c NA c類似物（8) 5 0 μΜ

β 1 , 4 -G a 1 T ： 3 00 U

緩衝液： 5 0mM He p e s緩衝剤， H 6. 5， 1 0 mM Mn C l ₂、

総容量： 5 0 μ L

インキュベーション時間： 1 0分。

(8. 4 結果および考察）

(8. 4. 1 酵素反応物における蛍光基間距離の推定）

FRETを観測するためには、合成した基質誘導体が酵素反応によって結合したときに、蛍光基間距離がおよそ 2 OA以内にある必要がある。合成する基質誘導体（糖ドナー 1〜 7、糖ァクセプター 8， 9)を酵素反応が進行したと仮定し、その反応物について蛍光基間距離をコンピュータシミュレーションにより予測した。 α ΐ , 3— G a 1 Τの糖ァクセプター 9は 1， 4一 G a l Tの糖ァクセプター 8よりも糖が一つ多い。そのため糖ァクセプター 9をァクセプターモデルとして利用し、それぞれの糖ドナーについて蛍光基間距離をシミュレーションした。結果、スぺーサーを介さないでナフチルメチル基を導入したものは、蛍光基を最大に引き離しても約 2 OAであることがわかった。図 2 aおよび 2 bに、糖ドナ一の水酸基 2位、 6位をそれぞれスぺーサーを介して結合させた 3, 4についての結果を示す。両反応物とも、蛍光基間距離が必要とする約 2 OAの間によく収まることがわかった。以上の結果から、酵素反応が進むにつれて FRET現象が生じることは間違いないと思われる。

(8. 4. 2 F R E T法による酵素活性測定）

これまでに合成したナフチルメチル基標識 UDP— G a 1誘導体 1〜 7、およびダンシル基標識 N—ァセチルダルコサミン（G 1 cNAc) 、 N—ァセチルラクトサミン（La cNAc) を用いて、前述した FRET現象を応用した酵素活性測定法によるガラクトース転移酵素の活性測定を検討した。

ガラクトース転移酵素はその触媒活性に 2価の金属イオン（最も活性が強いのは Mn²⁺イオン）を必要とする。しかし、このイオンは酵素内での触媒活性機構と同じく UDP_Ga 1のリン酸部位と配位し、この基質の溶液中での安定性を著しく低下させる。そこで実際に酵素反応を行う前に、ネイティブな UDP— G a 1および合成した UDP— G a 1誘導体全てについて、酵素反応と同様の緩衝液中 37°Cのインキュべ一ト温度で 1時間以上分解せずに耐えられるかどうか検討した。 TLCによる観察の結果、合成した UDP— Ga 1誘導体 7を除いて全て分解は認められなかった。分解した基質誘導体はガラクトース水酸基 6位にヒドラジド経由でナフタレンが結合しているもので、この結合状態は同様の結合手法を用いた過去の報告と同様、金属イオンによる分解が激しかった。過去の報告によると Mn²⁺イオン以外の金属イオン（Mg²⁺、 Ca²⁺、 Mo²⁺等）も試されているが、同様に分解の激しいものであった（22) 。よってこの基質を用いて酵素反応を行う場合、金属イオンを加えた場合と加えない場合の二通りを行うことにした。

上記の結果、全ての合成した基質誘導体について、 1， 4一 Ga 1 Τ、 _α 1， 3— Ga 1 Tの両酵素ともに FRETの観測はできなかった。 FRETが観測されない原因として考えられることは、

(1) 酵素反応は起こり、合成した基質誘導体は転移されたが、蛍光プローブ間の距離が遠く、 FRETが観測されない。

(2) 合成した基質誘導体がこの酵素によって基質と見なされず、転移されなかった。

(1) についてはコンピュータを用いたプローブ間距離の計算結果（図 2 a， 2 b) 、並びに以前のシアル酸転移酵素による同様の FRETによる酵素活性測定実験（K i mi t o Wa s h i y a，前出、（ 2000 ) ) との比較検討から、この可能性は考えにくい。以上のようなことから、（2) の酵素反応自体が進まなかったことが F R E Tが観測できない原因であると考えた。

UDP-G a 1誘導体と N—ァセチルダルコサミン、 N—ァセチルラクトサミン誘導体のどちらが酵素によつて拒絶されたの力、本当に合成した基質誘導体はガラクトース転移酵素の基質とは成りえないのか、 HP LCを用いて反応の経過を観察することにした。コントロール実験としてネイティブの UDP— G a 1を糖ドナーとし、糖ァクセプターとして、合成した G l cNAc、 La cNAcのダンシル基標識誘導体 8， 9を用いた。反応生成物の検出には、糖ァクセプターのダンシル基からの蛍光検出を用いた。結果、ネイティブの UDP— Ga 1が十分反応している様子が観察されるのに対し、今回合成した UDP— Ga 1誘導体は全て酵素反応が進んでいない様子が観察された（図 2 c、 2 d ：基質類似物を代表して化合物 1についての結果のみ示している。他の基質類似物でも同様の結果が得られた）。検出したピークが本当に酵素反応物、あるいは原料であるかどう力、、 MALD I— TOF— MAS Sを用いて確認し、この酵素は合成した UD P-Ga 1誘導体を基質として認識しないこと、糖ァクセプター誘導体については基質として認識したことが確認できた。

(8. 4. 3 新しい糖転移酵素阻害剤）

前述のように、全ての合成した UDP— Ga 1誘導体はガラクトース転移酵素によって基質と見なされなかった。そこで、合成した UDP— Ga 1誘導体がどのように酵素と結合するのか、最近報告された /31， 4-Ga 1丁の線結晶構造（L o u i s N. ら、前出 1999) ) (図 2 f ) を用いてコンピュータ計算により結合をシミュレーションした。

この酵素は UDP— Ga 1の結合により大きな構造変化を起こすことが知られており、 UDP— Ga 1の結合の後に G 1 c N A cが結合し反応するという厳密な逐次反応（s e qu e n t i a l o r d e r) 機構が働くと考えられている (図 2 e) 。一般に構造変化が起こる前の大きな UDP— Ga 1結合部位を持つものをコンフオメーシヨン 1 (c l) 、構造変化が起こり糖ァクセプター結合部位が表面に現れたものをコンフオメーシヨン 2 (c 2) と呼んでいる。今回合成した基質誘導体を c 1に当てはめてみると、結合部位が非常に大きく開いているため、ナフタレンのような巨大な置換基を導入していても結合部位に収まることは全て可能であった。次に合成した基質誘導体を c 2に当てはめてみた。このコンフオメーシヨンでは UDP— G a 1は T r p 314によって口ックされ、結合部位奥深くに閉じこめられているため、ガラクトース付近の物理的スペースが小さい。そのため、酵素の表面に向かって伸びる 6位水酸基を置換したものは結合部位に収まることができるが、 2位水酸基を置換したものはナフタレンという巨大な置換基であるためうまく収まることができないと考えられた。よって、ガラクトースの 2位水酸基を修飾してナフタレンを導入した 1， 2， 3は基質になることは難しいと考えられ、 6位水酸基を修飾するほうが酵素にとって邪魔にならないであろうということが予想される。過去の報告において、ガラクトース 6位水酸基に大きな置換基を導入したものでも基質となることができた（Th oma s B. ，ら、前出、（2001) ) (図 1 d) こととこの考えは一致するが、同様の結合様式を持った基質誘導体 5が基質とならなかったことは非常に興味深い。スぺーサ一の構造や、わずかな長さの違いはあるにせよ、末端にピオチンという水溶性の化学物質を持つか、 5のように芳香族性の大きな化合物を持つかの違いが最も大きな違いではないかと考えた。この酵素は UDP— G a 1の結合と共に、酵素表面に存在する T r p 314が UDP— Ga 1結合部位へ反転し、側鎖ァミノ基が U D Pのリン酸部位と水素結合し、 UDP— Ga 1が酵素から離れないように蓋をしてしまう機構が考えられている（図 2 e) 。反転した T r p 314は、 UDP— Ga 1のロック、酵素活性中心からの水分子の追い出し、さらに糖ァクセプターとも結合すると考えられ、まさに酵素反応の中心となるアミノ酸である。つまり FRET法による活性測定を行うためには、 T r p 314が酵素の構造変化によって反転するのを妨げないような基質誘導体を設計する必要がある。上記のように、末端にビォチンを持つものは基質となり、芳香族を持つ化合物 5は基質とならなかったことから、末端の芳香族が、構造変化を起こそうとする T r p 314にとつて大変邪魔になるのではないかと考えられる。 Tr pは芳香族性であり、同じ芳香族であるナフタレンとは π電子相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力によって強い相互作用をすると考えられる。ここで基質誘導体 5をシミュレーションにより UD P-Ga 1結合部位に結合させると、ナフタレンがちょうど T r pと重なる位置になることがわかる（図 2 f、 2 g) 。そこで、この基質誘導体 5を含め今回合成した全ての基質誘導体について阻害活性を検討することにした。阻害作用を検討することで、上記のシミュレーション結果の合理性の判断材料になり、また酵素に基質として認識、転移させる基質誘導体設計の参考になると考えたためである。

阻害活性（K i ) を調べる手法として 2次プロット法、 D i X o nプロット法が一般的に知られているが、阻害剤濃度を変化させ容易に K i値を算出できる D i X o nプロット法を採用した。 31， 4ガラクトース転移酵素について、合成したダンシル基修飾した糖ァクセプターを用いて、 HPLCによる蛍光検出による阻害活性測定を行った。

結果、基質誘導体 5は強力な阻害活性を示し、基質誘導体 4はさらに強力な /3 1， 4一 G a 1 Tの阻害作用を持つことが分かった（図 2h、 2 i) (基質誘導体 5は前述の通り Mn ²⁺ィオン存在下で分解が激しいため、実際はさらに阻害作用は強いと考えられる）。基質誘導体 4の阻害定数 1. 9 μΜという数値は、過去に報告されたこの酵素の阻害剤の中で最高レベル（最高は 1. 35 μΜ (H i r o n o b u H. ，ら前出（1997) ) であり、基質誘導体 4よりもはるかに小さな OMe修飾を 6位水酸基に施した基質誘導体（T s u y o s h i E.，前出（1996) ) の K i値力 S44 Mと報告されていることからも、今回の阻害作用が過去の阻害剤の作用機構からは説明のつかない強力なものであることがわかる。 UDP_Ga 1の!^^値が 13. 7 μΜ (B e 1 1 J . E. , B e y e r T. A. , H i 1 1 R. L.，（1976)， J. B i o l . Ch e m. ， 251, 3003— 3013. ) 程度であることを考えると、ネイティブな基質よりも結合力が強いということである。基質誘導体 4は 5と比べて、ガラクトースとの結合部位周りの自由度が高く、また若干スぺーサーも短いため、より Tr p 314と接近することが予想される（図 2 j， 2 k) 。 2位水酸基を修飾したものでも十分な阻害作用を示したことから、大きな UDP— Ga 1結合部位を持つ c 1でのこれら基質誘導体の結合は問題ないと考えた。 6位に NH結合でナフタレンを導入した 6，疎水性スぺーサーを導入した 7はほとんど阻害作用を持たなかった。結合部位付近の電荷分布を調べると、ゥリジンの結合部位では比較的疎水度が高いものの、ガラクトースの結合部位の入り口付近は親水的な環境であると考えられた。 6位水酸基が比較的酵素の表面に向かっているため、疎水的な置換基が親水的な環境にはじかれて結合できないものと考えられる（図 2 f、 2 g、 2 j ：結晶表面の青色は親水性、緑は中性を示している） .。

(8. 4. 4 j31， 4— G a 1 Tの基質認識）

コンピュータシミュレーション、値の算出、および過去の報告（Th om a s B. ，ら、前出（2001) ； T s uy o s h i E. ，ら、前出（19

96))から基質誘導体の ]31， 4— Ga 1 Tによる基質認識条件を検討すると、 6位水酸基の修飾が最も有力であると考えられる。過去の報告では 3位 4位水酸基を修飾すると基質とならないばかりか K i値も低いことから結合力も低いと考えられる（T s u y o s h i E. ，ら、前出（1 9 9 6) ) 。 2位水酸基はメチル化修飾して基質となった報告があり、現在まで酵素による認識が最も甘いと考えられ標識部位として有力だったが、 X線結晶構造の報告と結合シミュレーション、さらに Q a s b aらの報告 (B. R a ma k i r s h n a n, P. K. Q a s b a, (2 0 0 2) ， J . B i o l . C h e m. , 2 7 7, 20 8 3 3— 2 0 8 3 9. ) により、大きな置換基の導入が難しいことが示唆された。 6位水酸基の修飾に関しては、結合シミュレーション、 K i値、過去の基質類似物の転移報告から、酵素に転移させることのできる基質誘導体を合成する望みがあると思われる。

6位水酸基の修飾に限定して考えると、結晶構造から 6位水酸基は酵素の G 1 u 3 1 7、 G 1 y 3 1 5と水素結合していると考えられている（図 2 1 ) 。結合方式について考察すると、 Oエーテル結合では基質にはならないと言い切れるものではないが、ヒドラジド結合型で基質となった過去の報告、 G l uの存在を考慮すると、水素結合を組むことのできる NH結合の方を採用する方が基質として認識される可能性が高いと思われる。またヒドラジド結合型では前述の通り金属イオン存在下で激しく分解してしまうため、 NH結合型は物質の安定性の面からも支持できる。さらに K i値、酵素表面電荷分布の計算から、水溶性プローブを導入すると良いと考えられる。また水溶性プローブを導入することはガラクトースォキシダーゼを用いて UD P— G a 1を修飾する際に疎水的なプローブを導入するよりもはるかに効率良く合成が可能であることからも合理的である。

酵素によって転移される基質誘導体合成の最大の問題はナフタレンである。その芳香族性から T r p 3 1 4と相互作用し酵素のコンフオメーション変化を妨げてしまうと考えられる。芳香族同士の相互作用は生成物の予想コンフオメーション計算からも強レ、影響を持つことが容易に想像できる。相互作用を避ける一つの方法として、スぺーサ一の長さをさらに長くする方法がある。ところが T r p 3 14のほか、 I 1 e 345〜H i s 365も大きなコンフオメーション変化を起こし、 Tr p 314と UDP— Ga 1結合部位の上を横切る（図 2 e)ことから、長いスぺーサーを介しても第 2のコンフオメーシヨン変化を妨げる恐れもある。構造変化を妨げないよう、できるだけ弱い、折り曲がりやすい構造を持ったスぺーサ一が必要になるであろうと考えられる。もう一つの解決策として、芳香族性の蛍光基を使わないことである。しかしながら、一般的に蛍光を発するものは大きな共役系を必要とし、芳香族性のものはその最たるものである。芳香族ではなくても巨大な共役系を有するものは疎水性相互作用、 π電子相互作用は十分に持つと考えられ、なおかつ FRETを観測するための適当な波長、量子収率などを考慮に入れ、蛍光基を選択することは極めて難しいと考えられる。芳香族とは全く別の蛍光現象を示すものとして、近年注目されているランタノィド系の金属がある。ランタノィド系金属は非常に蛍光寿命が長く、量子収率もよいので、免疫、. 酵素活性など.の分析において多くの実績がある（Y. C. L e e, N. Ka wa s a k i , R. T. Le e, N. Su z uk i, (1998) , G l y c o b i o l o g y, 8， 849-856. ； B. A d u 1 -R a hm a n, E. A i l o r, D. J a r v i s , M. B e t e nb a u g h, Y. C. Le e, (20 02) , Ca r b o. Re s. , 337, 2181— 2186. ； I . H e mm i 1 a, S. D a k b , V. Mu k k a 1 a , H. S i i t a r i, T. L o v g r e n, (1984) ， An a l . B i o c h e m. ， 137, 335—

343. ) 。これらを用いる欠点はキレートによって目的物質に固定する必要があることであり、キレートにしないと蛍光を十分に示さないことである。一般的にキレート物質は大きなチャージを持ち、それが酵素反応にどのような影響を及ぼすかは想像しがたいが、上手くスぺーサーを介することで活性中心アミノ酸に影響を与えなければ、十分に基質になる可能性はあると思われる。 (8. 4. 5 結論）

FRE T法を用いたガラクトース転移酵素の活性測定は本研究の範囲では実現しなかった。しかしながら研究の過程において、研究目的を達成し実用的な酵素活性測定法を確立するために有用ないくつかの知見が得られた。

1. UDP-G a 1誘導体合成法の確立

多数の UDP— Ga 1誘導体を合成することに成功した。一般的に糖転移酵素は UDP— Ga 1同様、糖ヌクレオチドを基質とするため、本研究で用いた手法は他の糖転移酵素の基質誘導体合成への応用も期待できる。

2. 酵素の基質寛容性に関する新たな知見

本研究において合成した基質誘導体を用いた酵素反応実験と酵素結合シミュレーシヨン、過去の基質誘導体の報告から、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素について、大きな置換基を持った UDP_Ga 1誘導体を基質として認識させるためにはガラクトース 6位水酸基の修飾が最も可能性が高いと考えられた。スぺーサーを置く場合、親水性のものがよく、疎水性のものは結合ポケットに入りづらいことが確認された。

3. 全く新しい糖転移酵素阻害剤についての知見

本研究で合成した基質誘導体 4は現在までに存在する糖転移酵素阻害剤とは全く異なった阻害作用を持つと考えられ、酵素のコンフオメーション変化を阻害することで酵素反応を阻害するという全く新しい阻害剤設計の道を開いた。

(実施例 9 : « 1， 3— Ga l Τの阻害因子）

別の実施例として、 α ΐ, 3— Ga 1 Tを標的酵素として用いて、阻害因子を設計した。 a l， 3—Ga 1 Τは、構造上のモチーフが i31， 4—Ga l Tと類似しており、結晶構造における解析から、基質である UDP— Ga 1の結合により構造変化を起こすことが知られている。従って、この機構を用いて阻害因子を設計した。阻害因子の候補として、実施例 8において合成したものを用いて反応条件を、実施例 8に記載のようにして（緩衝液として、 5 0 mM H e p e s緩衝剤、 H 6 . 5、 1 O mM M n C 1 ₂を使用した）アツセィを行った。

アツセィした結果、 1， 4一 G a 1 Tにおいて阻害活性のあった 5つの化合物全てが、同様の阻害活性を示した。従って、本発明の酵素活性の調節因子の新規設計法は、 β 1 , 4一 G a I Tのみならず、基質結合によるコンフオメーション変化を起こす酵素一般に適用することができることが実証された。産業上の利用可能性

本発明により、酵素のコンフオメーシヨン変化に基づく酵素調節因子のスクリ一ユング法の開発が可能となり、従来の方法よりオーダーが 1つも 2つも異なる効率の酵素調節因子（例えば、阻害因子）の開発が可能になった。本発明によつて、従来に存在しなかった強力な阻害因子が提供された。

Claims

1.ガラクトース転移酵素上の UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む、化合物。

2. 前記 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分が、単糖または単糖の誘導体である、請求項 1に記載の化合物。

求

3. 前記 UD P-Ga 1結合部位と相互作用し得る部,分が、ガラクトース誘導体の

である、請求項 1に記載の化合物。

4. 前記トリブトファンと相互作用し得る部分は、芳香族官能基を含む、請求項囲

1に記載の化合物。

5. 前記トリブトファンと相互作用し得る部分は、ナフタレンである、請求項 1 に記載の化合物。

6. 前記 UDP_Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、前記トリブトファンと相互作用し得る部分との間の距離は、 1A〜30Aの間である、請求項 1に記載の化合物。

7. 前記 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、前記トリブトファンと相互作用し得る部分との間には、一（CH₂CH₂0) _n—が連結されており、ここで、 nは 1〜6の間の整数である、請求項 1に記載の化合物。

[式中、 Xは Oまたは NHであり、 nは 0〜 6の整数であり、 mは 1〜 6の整数であり、 Yは芳香族官能基であり、 Zは単結合または一 NH— C (=θ) 一 CH ₂— Ο—である] で表される、請求項 1に記載の化合物。

9. 以下の式：

で表される化合物群から選択される、請求項 1に記載の化合物。

10. UDP— G a 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む化合物を含む、組成物。

1 1. β 1, 4一ガラクトース転移酵素の活性を阻害するための、請求項 10に記載の組成物。

12. UDP_Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む、化合物、

13. 以下の工程：

(a) UDP— Ga 1結合と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む、化合物を被検体に投与する工程、

を包含する、 β 1, 4—ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患を処置または予防するための方法。

14. β 1, 4一ガラクトース転移酵素の活性の異常に起因する状態、障害または疾患を処置または予防するための医薬を製造するための、 UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る部分と、トリブトファンと相互作用し得る部分とを含む化合物の使用。

15. 以下の工程：

16. 酵素が、触媒反応に 2以上の分子が必要な酵素である、請求項 15に記載の方法。

1 7. 前記基質は、ドナーおょぴァクセプターを含み；

前記酵素は、該ドナーと該ァクセプターとの間の反応を触媒し；

前記構造変化は、該ドナーにより生じ；

前記 A部分は該ドナーと相互作用し、前 IBB部分は該ァクセプターの触媒部位への進入を担う部分である、請求項 15に記載の方法。

1 8. 前記酵素は、糖転移酵素である、請求項 1 5に記載の方法。 .

1 9. 前記酵素は、 β 1， 4一ガラクトース転移酵素、 α— 1， 3—ガラクトース転移酵素， β 1， 4一ガラクトース転移酵素， ]3 1， 3—ガラクトース転移酵素， β 1， 6—ガラクトース転移酵素、 α 2， 6—シアル酸転移酵素、 " 1， 4 一ガラクトース転移酵素、セラミドガラタトース転移酵素、 α ΐ, 2—フコース転移酵素、《 1， ₃—フコース転移酵素、 α ΐ, 4—フコース転移酵素、 α 1，'

6—フコース転移酵素、 α 1， 3— Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 α 1， 6— Ν_ァセチルガラクトサミン転移酵素、 β 1， 4一 Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチド Ν—ァセチルガラクトサミン転移酵素、 β 1， 4- Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1 , 2—Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1, 3— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 6— Νァセチルダルコサミン転移酵素、 a l， 4—Νァセチルダルコサミン転移酵素、 β 1， 4—マンノース転移酵素、 a l， 2—マンノース転移酵素、ひ 1， 3—マンノース転移酵素、 a 1, 4一マンノース転移酵素、 a l， 6—マンノース転移酵素、 α ΐ, 2—グルコース転移酵素、 _α 1， 3—グルコース転移酵素、 O 2, 3—シアル酸転移酵素、 α 2， 8—シアル酸転移酵素、 a l， 6—ダルコサミン転移酵素、 a l， 6 ーキシロース転移酵素、キシロース転移酵素、 β 1， 3—グルクロン酸転移酵素およびヒアルロン酸合成酵素からなる群より選択される、請求項 1 5に記載の方法。

20. 前記酵素は、 β 1, 4一ガラクトース転移酵素である、請求項 1 5に記載の方法。

2 1. 前記基質は、 UDP— G a 1を含み、前記構造変化部位は、配列番号 2に示されるゥシ i3 1， 4一ガラクトース転移酵素のポリペプチド配列のアミノ酸 3 14位、または配列番号 4に示されるヒト j3 1， 4—ガラタトース転移酵素のポリぺプチド配列のァミノ酸 3 14位のトリブトファンである、請求項 20に記載の方法。

22. 以下の工程：

A) 酵素において、該酵素の基質との相互作用部位を同定する工程；

B) 該酵素の触媒反応に必要な構造変化を担う構造変化部位を同定する工程；

C) 該相互作用部位と相互作用する A部分、およぴ該構造変化部位と相互作用する B部分を同定する工程；および

D) 該 A部分おょぴ該 B部分を含む分子を調製する工程、

を包含する、酵素の活性を調節する因子を生産する方法。

23. 以下の工程：

(b) A部分において B部分またはスぺーサーを結合する部位以外を保護する工程；

(c) B部分または該スぺ一サーを保護された A部分に結合させる工程；およぴ

(d) (c) の生成物を脱保護する工程、

を包含する、ガラクトース転移酵素上の UDP— Ga 1結合部位と相互作用し得る A部分と、トリブトファンと相互作用し得る B部分とを含む、化合物を合成する方法。